JP2017148063A - メバロン酸、イソプレン及びイソプレノイドの生産量を増加させるための組み換え微生物 - Google Patents

メバロン酸、イソプレン及びイソプレノイドの生産量を増加させるための組み換え微生物 Download PDF

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Abstract

【課題】メバロン酸の生産量を増加させ、並びにイソプレン、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドなどのメバロン酸に由来する分子の生産量を増加させた改良法の提供。
【解決手段】（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ、（ｃ）酢酸キナーゼ、（ｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、（ｅ）リンゴ酸酵素、（ｆ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、（ｇ）ホスホグルコノラクトナーゼ及び（ｈ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、１つ以上の酵素活性が調節することにより、イソプレン生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されており、ｉ）メバロン酸経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸及び（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む、イソプレンの生産性を上昇させた組換え細胞。
【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年４月２９日出願の、米国特許仮出願番号第６１／４８１，１２１号の優先権を主張し、その開示の全てが本明細書に参照として組み込まれる。
（発明の分野）
本開示は、組成物、並びに組み換え微生物におけるメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド及びイソプレノイド前駆体分子の生産量を増加させる方法、並びにこれを生産及び使用するための方法、に関する。
Ｒ−メバロン酸は、アセチルＣｏＡをイソペンテニルジホスフェート及びジメチルアリールジホスフェートに変換するメバロン酸依存性生合成経路の中間体である。アセチルＣｏＡのメバロン酸への変換は、メバロン酸依存性生合成経路上流（ＭＶＡ経路）の、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性により触媒され得る。解糖によるグルコースのアセチルＣｏＡへのモル当量での変換（molar conversion）に基づき、ＭＶＡ経路上流の酵素であるチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を用いメバロン酸を生産させた場合、理論上の質量収率は５４．８％である。
商業分野では、メバロン酸は、従来、生分解性ポリマーを製造する際の添加剤として化粧品に使用されており、他の化学物質を合成する際のキラル体の構成成分としての価値を有する。
メバロン酸依存性経路の生成物は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）である。ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰは、イソプレン並びにイソプレノイドの前駆体である。イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は天然ゴムのモノマーであり、かつその他の、総じてイソプレノイドと呼ばれる非常に多様な天然化合物に一般的な構造モチーフでもある。更に、イソプレンは、各種合成ポリマー、特に合成ゴムの重要な出発物質である。
イソプレノイドは、イソプレノイド前駆体分子のＩＰＰ及びＤＭＡＰＰから誘導される化合物である。これまでに２９，０００種以上のイソプレノイド化合物が同定されており、かつ毎年新規のイソプレノイドが発見されている。イソプレノイドは、主な構成単位としてイソプレノイド前駆体分子を使用して、より複雑なイソプレノイド構造を形成する、微生物及び植物種などの天然物から単離することができる。イソプレノイドは、細胞膜の流動性及び電子輸送を維持する手だてとなるため、多くの生命体及び細胞にとって非常に重要である。天然では、イソプレノイドは、植物に含まれる天然の駆虫成分として多様な役割を果たし、桂皮、丁子及びショウガには特有の香りをもたらす。更に、製薬及び化学業界では、イソプレノイドを、薬剤、栄養補助剤、矯味矯臭剤、及び病害虫防除剤として使用する。これまでに、生態系における重要性及び広範な用途における有用性が考慮され、イソプレノイドは、科学者らによる関心を十分に集めている。
メバロン酸及びイソプレノイドを得る際の従来法としては、生物材料（例えば、植物、微生物及び動物）からの抽出、並びに製造所における部分合成又は全有機合成が挙げられる。しかしながら、このような手法は、殆どの場合十分なものではないことが判明している。特に、イソプレノイドに関しては、多くの場合その分子構造が複雑な性質を有していることを考慮すると、一般的に複数の工程が必要とされる有機合成を実施して所望の生成物を得るのは難しい。加えて、これらの化学合成の工程は、生物材料からイソプレノイドを抽出し得る毒性の溶媒を使用することを伴う。更に、一般的に、生物材料はイソプレノイド分子をほんの微量でしか含有しないことから、通常、これらの抽出及び精製方法では、所望のイソプレノイドの収率は比較的低くなる。残念なことに、イソプレノイドを比較的大量に得ることが難しいため、生物材料からのイソプレノイドの抽出の実用は限定されていた。
イソプレン、イソプレノイド前駆体分子及びイソプレノイドの生産における近年の進歩により、ロバストな商業工程に必要とされる要求を十分に満たすことのできる速度、力価及び純度でのイソプレン及びイソプレノイドの生産方法が開示されているものの（例えば、国際特許公開第２００９／０７６６７６（Ａ２）号及び米国特許第７，９１５，０２６号を参照されたい）、未だに、イソプレン及びイソプレノイドの生産性及びこれらの化合物の収率を向上させるための改良法が必要とされている。
本明細書では、メバロン酸依存性生合成経路の中間体としてのメバロン酸の生産量を増加させ、並びにイソプレン、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドなどのメバロン酸に由来する分子の生産量を増加させるための、組成物及び方法を開示することにより、このような改良法を提供する。
本明細書を通じ、各種特許、特許出願及び他の種類の刊行物（例えば、学術論文）を参照する。本明細書に引用する、本開示に関係する全ての特許、特許出願及び刊行物は、すべての目的に関し、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供される本発明は、特に、メバロン酸生産に指向する炭素の取り込みを増加させる、組み換え微生物に特異的な遺伝子操作を使用することにより、微生物におけるメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産量を増加させる組成物及び方法を開示する。
したがって、一態様では、本明細書では、イソプレンの生産量を増加させることのできる組み換え細胞が提供され、この細胞は、クエン酸シンターゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼからなる群の１種以上の酵素活性が調節されて、イソプレン生産に取り込まれる炭素量が増加するよう、遺伝子操作されており、メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸と、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸とを更に含み、イソプレン生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていないイソプレン生産細胞と比較してイソプレンの生産性が向上している。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、ＭＶＡ経路上流に由来するものであり、ＭＶＡ経路上流の核酸は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の核酸からなる群から選択される。一部の態様では、このメバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子である。一部の態様では、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は：（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．フェシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｄ）Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；並びに（ｅ）Ｅ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択される。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、ＭＶＡ経路下流に由来するものであり、ＭＶＡ経路下流の核酸は、ＭＶＫ、ＰＭＫ及びＭＶＤ核酸からなる群から選択される。一部の態様では、前記ＭＶＫは、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセス（mevalonate kinase polypeptide, Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、又はストレプトマイセス・ＣＬ１９０（Streptomyces CL190）メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。一部の態様では、細胞は、ＤＸＰ経路のポリペプチドを１つ以上（one or DXP pathway polypeptides）コードしている１つ以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種、又はこれらの変異体由来のポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、グラム陽性細菌細胞、ストレプトマイセス（Streptomyces）細胞、グラム陰性細菌細胞、大腸菌細胞、パントエア（Pantoea）細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、アスペルギルス（Aspergillus）細胞、又は酵母細胞である。一部の態様では、クエン酸シンターゼに関係する内在性遺伝子の活性を減少させることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する。一部の態様では、内在性のクエン酸シンターゼ遺伝子を、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子で置き換えることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する。一部の態様では、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子は、枯草菌（Bacillus subtilis）に由来する。一部の態様では、クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって調節される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、クエン酸シンターゼの活性の減少は、クエン酸シンターゼの発現を減少させていない微生物と比較してより多くの炭素がメバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる。一部の態様では、ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節される。一部の態様では、内在性ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は内在性酢酸キナーゼの遺伝子発現は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の欠失により減弱される。
本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、酢酸の生成量が減少している。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。一部の態様では、乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。一部の態様では、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失により減弱される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、乳酸の生成量が減少している。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることにより調節される。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、内在性遺伝子である。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性内在性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現は、ＮＡＤＰ依存性内在性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることにより、増加する。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼのポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、ピルビン酸の生成量が増加している。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることで、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子発現を増加させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する。一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルアミドデヒドロゲナーゼから構成されるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する、１種以上の遺伝子の活性を増加させることで調節される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節される。一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する遺伝子の１つ以上は内在性遺伝子である。
一部の態様では、１種以上の内在性遺伝子プロモータを、１種以上の常時発現型合成プロモータで置き換えることにより、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する１種以上の内在性遺伝子の発現を増加させる。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群の１種以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体のリプレッサーの活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の欠失により減弱される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節していない微生物と比較して、アセチルＣｏ−Ａの生産性が向上している。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性の調節は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現を調節していない微生物と比較してより多くの炭素がメバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる。一部の態様では、ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）の活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ＰＧＬの活性は、内在性ＰＧＬ遺伝子の活性を減弱させることで調節される。一部の態様では、ＰＧＬの活性は、内在性ＰＧＬ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって減弱させる。一部の態様では、内在性ＰＧＬの活性は、内在性ＰＧＬ遺伝子の欠失により減弱される。一部の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性は、内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節される。一部の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性は、内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることによって減弱させる。一部の態様では、内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性は、内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の欠失により減弱される。一部の態様では、細胞は、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプチドをコードしている核酸を更に１種以上含む。
他の態様では、本明細書では、（ａ）本明細書で開示される任意の態様で提供された任意の細胞を、イソプレン生産に好適な培養条件下で培養する工程；並びに（ｂ）イソプレンを生産させる工程、を包含する、イソプレンの生産方法を提供する。他の実施形態では、方法は、イソプレンを回収する工程、を更に含む。
他の態様では、本明細書では、メバロン酸の生産量を増加させることのできる組み換え細胞が提供され、この細胞は、クエン酸シンターゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコノラクトナーゼ、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼからなる群の１つ以上の酵素活性を調節することで、メバロン酸生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されており、かつメバロン酸（ＭＶＡ）経路上流の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含み、メバロン酸の生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作をされていないメバロン酸生産細胞と比較してメバロン酸の生産量が増加している。一部の態様では、このメバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子である。一部の態様では、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は：（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．フェシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｄ）Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；並びに（ｅ）Ｅ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択される。一部の態様では、クエン酸シンターゼに関係する内在性遺伝子の活性を減少させることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する。一部の態様では、内在性のクエン酸シンターゼ遺伝子を、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子で置き換えることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する。一部の態様では、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子は、枯草菌（Bacillus subtilis）に由来する。一部の態様では、クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって調節される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、クエン酸シンターゼの活性の減少は、クエン酸シンターゼの発現を減少させていない微生物と比較してより多くの炭素がメバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる。一部の態様では、ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節される。一部の態様では、内在性ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は内在性酢酸キナーゼの遺伝子発現は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の欠失により減弱される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、酢酸の生成量が減少している。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。一部の態様では、乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。一部の態様では、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失により減弱される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、乳酸の生成量が減少している。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることにより調節される。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、内在性遺伝子である。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性内在性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現は、ＮＡＤＰ依存性内在性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることにより増加する。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼのポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、ピルビン酸の生成量が増加している。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることで、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子発現を増加させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する。一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルアミドデヒドロゲナーゼから構成されるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する、１種以上の遺伝子の活性を増強させることで調節される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節される。一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する遺伝子の１つ以上は内在性遺伝子である。一部の態様では、１種以上の内在性遺伝子プロモータを、１種以上の常時発現型合成プロモータで置き換えることにより、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する１種以上の内在性遺伝子の発現を増加させる。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群の１種以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体のリプレッサーの活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の欠失により減弱される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節していない微生物と比較して、アセチルＣｏ−Ａの生産量が増加している。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性の調節は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現を調節していない微生物と比較して、より多くの炭素がメバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる。一部の態様では、ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）の活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ＰＧＬの活性は、内在性ＰＧＬ遺伝子の活性を減弱させることで調節される。一部の態様では、ＰＧＬの活性は、内在性ＰＧＬ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって減弱させる。一部の態様では、内在性ＰＧＬの活性は、内在性ＰＧＬ遺伝子の欠失により減弱される。一部の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性は、内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節する。一部の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性は、内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモータを、常時低発現型合成プロモータと置き換えることによって減弱させる。一部の態様では、内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性は、内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の欠失により減弱される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの活性条件下で増殖しない微生物によるものと比較して、メバロン酸生産量が増加しており、この態様では、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼ、（ｃ）乳酸デヒドロゲナーゼ、（ｄ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、並びに（ｅ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体、からなる群の１種以上の酵素の活性を調節することにより、細胞における代謝性炭素の取り込みがメバロン酸の生産に指向している。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子プロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることにより調節し、乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子の活性を減弱させることにより調節し、及び酢酸キナーゼの活性は、内在性の酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節する。
一部の態様では、本明細書では、（ａ）本明細書で開示される任意の態様で提供された任意の細胞を、イソプレン生産に好適な培養条件下で培養する工程；並びに（ｂ）メバロン酸を生産させる工程、を包含する、メバロン酸の生産方法を提供する。一実施形態では、方法は、メバロン酸を回収する工程、を更に含む。
更に他の態様では、本明細書では、イソプレノイドの生産量を増加させることのできる組み換え細胞が提供され、この細胞は、クエン酸シンターゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼからなる群の１つ以上の酵素活性を調節することで、メバロン酸生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されており、かつ（ｉ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸及び（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードしている１つ以上の核酸を更に含み、メバロン酸の生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作をされていないイソプレノイド生産細胞と比較してイソプレノイドの生産量が増加している。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、ＭＶＡ経路上流に由来するものであり、ＭＶＡ経路上流の核酸は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の核酸からなる群から選択される。一部の態様では、このメバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子である。一部の態様では、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子は：（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．フェシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｄ）Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；並びに（ｅ）Ｅ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択される。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、ＭＶＡ経路下流に由来するものであり、ＭＶＡ経路下流の核酸は、ＭＶＫ、ＰＭＫ及びＭＶＤ核酸からなる群から選択される。一部の態様では、ＭＶＫは、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、又はストレプトマイセス・ＣＬ１９０（Streptomyces CL190）メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。一部の態様では、細胞は、ＤＸＰ経路のポリペプチドを１つ以上（one or DXP pathway polypeptides）コードしている１つ以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、細胞は、グラム陽性細菌細胞、ストレプトマイセス（Streptomyces）細胞、グラム陰性細菌細胞、大腸菌細胞、パントエア（Pantoea）細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、アスペルギルス（Aspergillus）細胞、又は酵母細胞である。一部の態様では、クエン酸シンターゼに関係する内在性遺伝子の活性を減少させることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する。一部の態様では、内在性のクエン酸シンターゼ遺伝子を、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子で置き換えることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する。一部の態様では、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子は、枯草菌（Bacillus subtilis）に由来する。一部の態様では、クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって調節される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、クエン酸シンターゼの活性の減少は、クエン酸シンターゼの発現を減少させていない微生物と比較してより多くの炭素がメバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる。一部の態様では、ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節される。一部の態様では、内在性ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は内在性酢酸キナーゼの遺伝子発現は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の欠失により減弱される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、酢酸の生成量が減少している。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。一部の態様では、乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。一部の態様では、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失により減弱される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、乳酸の生成量が減少している。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する。
一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることにより調節される。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、内在性遺伝子である。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性内在性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現は、ＮＡＤＰ依存性内在性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることにより増加する。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼのポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、ピルビン酸の生成量が増加している。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることで、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子発現を増加させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する。一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルアミドデヒドロゲナーゼから構成されるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する、１つ以上の遺伝子の活性を増加させることで調節される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節される。一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する遺伝子の１つ以上は内在性遺伝子である。一部の態様では、１種以上の内在性遺伝子プロモータを、１種以上の常時発現型合成プロモータで置き換えることにより、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する１種以上の内在性遺伝子の発現を増加させる。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ及び（ｃ）ジヒドロリポイルアミドデヒドロゲナーゼからなる群の１種以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体のリプレッサーの活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の欠失により減弱される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、細胞は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節していない微生物と比較して、アセチルＣｏ−Ａの生産量が増加している。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性の調節は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現を調節していない微生物と比較してより多くの炭素がメバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる。一部の態様では、ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）の活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ＰＧＬの活性は、内在性ＰＧＬ遺伝子の活性を減弱させることで調節される。一部の態様では、ＰＧＬの活性は、内在性ＰＧＬ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって減少させる。一部の態様では、内在性ＰＧＬの活性は、内在性ＰＧＬ遺伝子の欠失により減弱される。一部の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する。一部の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性は、内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節される。一部の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性は、内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることによって減少させる。一部の態様では、内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性は、内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の欠失により減弱される。本明細書で提供される任意の態様のうち、一部の態様では、イソプレノイドは、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン（sequiterpenes）、及びポリテルペン（polyterpenes）からなる群から選択される。一部の態様では、イソプレノイドは、セスキテルペンである。一部の態様では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）及びバレンセンからなる群から選択される。一部の態様では、細胞は、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプチドをコードしている核酸を更に１種以上含む。
他の態様では、本明細書では、（ａ）本明細書で開示される任意の態様で提供された任意の細胞を、イソプレノイド生産に好適な培養条件下で培養する工程；並びに（ｂ）イソプレノイドを生産させる工程；を包含する、イソプレノイドの生産方法を提供する。一態様では、方法は更に、イソプレノイドを回収する工程、を包含する。
一態様では、本発明は、メバロン酸生産に向けた炭素取り込み量を増加させるよう遺伝子操作を施した細胞を含む、組み換え微生物、又はこれらの子孫となる微生物を提供する。遺伝子操作では、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ、（ｃ）酢酸キナーゼ、（ｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、（ｅ）ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素、及び（ｆ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される１種以上の酵素の活性が調節される。本明細書において、任意の態様では、細胞には、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子（（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．フェシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｄ）Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；並びに（ｅ）Ｅ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択されるｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子など）を更に含ませることができる。
本明細書における任意の態様では、本発明は、クエン酸シンターゼの活性を調節することにより、メバロン酸生産に指向する炭素の取り込みを増加させた、組み換え微生物又はそれらの子孫となる微生物を提供する。一部の態様では、クエン酸シンターゼに関係する内在性遺伝子の活性を減少させることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する。一部の態様では、内在性のクエン酸シンターゼ遺伝子を、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子で置き換えることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する。一部の態様では、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子は、枯草菌（Bacillus subtilis）に由来する。一部の態様では、クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって調節される。本明細書に記載の任意の態様の態様では、クエン酸シンターゼの活性の減少は、クエン酸シンターゼの発現を減少させていない微生物と比較してより多くの炭素がメバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる。
本明細書における任意の態様では、本発明は、ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性を調節することにより、メバロン酸生産に指向する炭素の取り込みを増加させた、組み換え微生物又はそれらの子孫となる微生物を提供する。一部の態様では、ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節される。一態様では、内在性ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は内在性酢酸キナーゼの遺伝子発現は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の欠失により減弱される。本明細書における任意の態様では、組み換え微生物は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、酢酸の生成量が減少している。本明細書における任意の態様では、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
本明細書における任意の態様では、本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することにより、メバロン酸生産に指向する炭素の取り込みを増加させた、組み換え微生物又はそれらの子孫となる微生物を提供する。一部の態様では、乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。一部の態様では、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失により減弱される。本明細書における任意の態様では、組み換え微生物は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、乳酸の生成量が減少している。本明細書における任意の態様では、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する。
本明細書における任意の態様では、本発明は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素の活性を調節することにより、メバロン酸生産に指向する炭素の取り込みを増加させた、組み換え微生物又はそれらの子孫となる微生物を提供する。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素の活性は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素遺伝子の活性を増加させることにより調節される。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素遺伝子は、内在性遺伝子である。
一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素遺伝子の発現は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素のプロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることにより増加する。一部の態様では、組み換え微生物は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素のポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む。本明細書における任意の態様では、組み換え微生物は、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、ピルビン酸の生産量が増加する。本明細書における任意の態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素遺伝子の活性を増加させることで、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
本明細書における任意の態様では、本発明は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することにより、メバロン酸生産に指向する炭素の取り込みを増加させた、組み換え微生物又はそれらの子孫となる微生物を提供する。一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルアミドデヒドロゲナーゼから構成されるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する、１種以上の遺伝子の活性を増加させることで調節される。本明細書における任意の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節される。一部の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する遺伝子の１つ以上は内在性遺伝子である。一部の態様では、１種以上の内在性遺伝子プロモータを、１種以上の常時発現型合成プロモータで置き換えることにより、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する１種以上の内在性遺伝子の発現を増加させる。一部の態様では、遺伝子組み換え微生物は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群の１種以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体のリプレッサーの活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の欠失により減弱される。本明細書における任意の態様では、遺伝子組み換え微生物は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節していない微生物と比較して、アセチルＣｏ−Ａの生産量が増加している。本明細書に記載の任意の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性の調節は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現を調節していない微生物と比較してより多くの炭素がメバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる。
本明細書における任意の態様では、本発明は、メバロン酸生産に指向する炭素の取り込みが増大している組み換え微生物を提供し、この微生物では、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼ、（ｃ）乳酸デヒドロゲナーゼ、（ｄ）ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素、及び（ｅ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体からなる群の１種以上の酵素について遺伝子操作を加えていない微生物と比較して、メバロン酸の生産量が増加している。
本明細書における任意の態様では、本発明は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの活性条件下で増殖しない微生物と比較して、メバロン酸の生産量が増加している組み換え微生物を提供し、組み換え微生物では、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼ、（ｃ）乳酸デヒドロゲナーゼ、（ｄ）リンゴ酸酵素、並びに（ｅ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体からなる群の１つ以上の酵素の活性を調節することで、代謝性炭素の取り込みがメバロン酸の生産に指向する。
本明細書における任意の態様では、本発明は組み換え微生物を提供し、組み換え微生物は、酵母、細菌、糸状菌、藻類、及びシアノバクテリアからなる群から選択される。一部の態様では、組み換え微生物は大腸菌（E. coli）である。一部の態様では、組み換え微生物は酵母である。
本明細書における任意の態様では、本発明は組み換え微生物を提供し、クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子プロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることにより調節し、乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、内在性の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節し、及び酢酸キナーゼの活性は、内在性の酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節する。
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の組み換え微生物を使用してメバロン酸を生産する方法を提供する。
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の組み換え微生物を使用してイソプレンを生産する方法を提供する。
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の組み換え微生物を使用してイソプレノイド前駆体を生産する方法を提供する。
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の組み換え微生物を使用してイソプレノイドを生産する方法を提供する。
グルコースからのメバロン酸の質量収率を示すグラフ。エラーバーは、２回の反復試行により示される標準偏差を表す。 ｐＤＷ３４のプラスミドマップ。 株ＤＷ３２６由来のｍｖａＥが可視化されたウェスタンブロット。第１レーン−基準マーカー、第２レーン−０．４ｕｇの精製ｍｖａＥ、第３〜７レーン−０、２５、５０、１００、２００ｕＭのＩＰＴＧにより誘導を行った株ＤＷ３２６由来の可溶化試料。 Ｓａｆｅｓｔａｉｎにより染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。各レーンは次の試料を含有している：第１レーン−基準マーカー、第２−１５レーン−Ｈｉｓ−ｔａｇ標識を利用し精製し、ニッケルカラムから溶出させたｍｖａＥタンパク質画分。 大腸菌（E. coli）の中心的な代謝。酵素の、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）、ＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸酵素（ｍａｅＢ）及びピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（Ｐｄｈ）を示す。 株ＭＤ０９−３１４、ＣＭＰ４５１、ＣＭＰ４５２及びＣＭＰ４５３のクエン酸シンターゼ活性。 株ＣＭＰ６９４、ＣＭＰ６７８、ＣＭＰ６８０、ＣＭＰ７３６、及びＣＭＰ８３２の生育曲線。ｔ＝２で１００ｕＭのＩＰＴＧを添加した。６００ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットした（ＥＦＴ＝発酵開始後経過時間（ｈ））。 振盪フラスコにおいて株ＣＭＰ６９４、ＣＭＰ８３２、ＣＭＰ６７８、ＣＭＰ６８０及びＣＭＰ７３６を発酵させた場合に１０ｇ／Ｌのグルコースから得られたメバロン酸（ｇ／Ｌ）濃度。 遺伝子ｍａｅＢを局在させた大腸菌（E. coli）ＢＬ２１のゲノムの構成。 ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ｐｄｈＲ−ａｃｅＥＦ−ｌｐｄ）を局在させた大腸菌（E. coli）Ｋ−１２のゲノムの構成。 ａｃｅＥ遺伝子上流のＰＬ．６プロモータの挿入。 ａｃｅＥ遺伝子上流のＰＬ．６プロモータを挿入する際のコンストラクトデザイン。 株ＣＭＰ６７８、ＭＤ１０−５５５、ＣＭＰ７１１及びＣＭＰ７２９の生育曲線。ｔ＝２で１００ｕＭのＩＰＴＧを添加した。６００ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットした（ＥＦＴ＝発酵開始後経過時間（ｈ））。 振盪フラスコにおいて株ＣＭＰ６７８、ＭＤ１−５５５、ＣＭＰ７１１及びＣＭＰ７２９を発酵させた場合に１０ｇ／Ｌのグルコースから得られたメバロン酸（ｇ／Ｌ）濃度。 １５Ｌスケールで発酵させた場合の、１．２ ｇｌｔＡ株（□）におけるグルコースに対するイソプレン収率を、親株（◆）のものと比較して経時的に示す。株は同一条件下で発酵させた。総収率は次の式を使用し算出した：グルコースに対する収率（重量％）＝総イソプレン（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋５０）＊０．５７）］。式中、０．５７は、グルコース供給溶液中のグルコースの割合（重量％）であり、５０は、ｔ＝０の時点で発酵槽に供給したバッチのグラム重量である。（２０１００２７８：株ＣＭＰ４５７（□）；ＧＩ１．２ｇｌｔＡ２０１００１３１：株ＭＤ０９−３１７（◆）野生型ｇｌｔＡ）。 １５Ｌスケールで発酵させた場合の、１．２ ｇｌｔＡ株（□）における力価を、親株（◆）のものと比較して経時的に示す。株は同一条件下で発酵させた。（２０１００２７８：株ＣＭＰ４５７（□）；ＧＩ１．２ｇｌｔＡ ２０１００１３１：株ＧＩ１．２ｇｌｔＡ ２０１００１３１（◆）野生型ｇｌｔＡ）。 １５Ｌスケールで発酵させた場合の、１．２ ｇｌｔＡ株（□）における容積生産量（volumetric productivity）を、親株（◆）のものと比較して経時的に示す。株は同一条件下で発酵させた。（２０１００２７８：株ＣＭＰ４５７（□）；ＧＩ１．２ｇｌｔＡ２０１００１３１：株ＭＤ０９−３１７（◆）野生型ｇｌｔＡ）。 １５Ｌスケールで発酵させた場合の、１．２ ｇｌｔＡ株（□）における細胞生産性指数を、親株（◆）のものと比較して経時的に示す。株は同一条件下で発酵させた。（２０１００２７８：株ＣＭＰ４５７（□）；ＧＩ１．２ｇｌｔＡ２０１００１３１：株ＭＤ０９−３１７（◆）野生型ｇｌｔＡ）。細胞性能指数（ＣＰＩ）：イソプレン（ｇ）／平均ＤＣＷ（ｇ）＝［総ＨＧ／［ＯＤ＊Ｆｅｒｍ Ｗｔ／１．０５）／２．７］であり、式中、１．０５は、発酵ブロスの推定比重（ｋｇ／Ｌ）であり、２．７はＯＤ＊Ｌ／ｇＤＣＷのユニット数である。 １５Ｌスケールで発酵させた場合の、１．２ ｇｌｔＡ株（□）におけるグルコースに対するメバロン酸収率を、親（◆）のものと比較して経時的に示す。株は同一条件下で発酵させた。（２０１００９１６：株ＣＭＰ６７８（□）；ＧＩ１．２ｇｌｔＡ（２０１００１５４：株ＭＣＭ１００２（◆）野生型ｇｌｔＡ）。総収率は次の式を使用し算出した：グルコースに対する収率（重量％）＝総メバロン酸（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋５０）＊０．５９）］。式中、０．５９は、グルコース供給溶液中のグルコースの割合（重量）であり、５０は、ｔ＝０の時点で発酵槽に供給したバッチのグラム重量である。 １５Ｌスケールで発酵させた場合の、１．２ ｇｌｔＡ株（□）における、グルコースに対するメバロン酸の細胞生産性指数（ＣＰＩ）を、親（◆）のものと比較して経時的に示す。これらの試験では、細胞の乾燥重量は直接測定せず、測定された吸光度をもとに求めた乾燥細胞重量変換係数を使用した。このＯＤ対ＤＣＷ係数は、同一の培地組成において、類似する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１宿主で作成される。株は同一条件下で発酵させた。（２０１００９１６：株ＣＭＰ６７８（□）；ＧＩ１．２ｇｌｔＡ（２０１００１５４：株ＭＣＭ１００２（◆）野生型ｇｌｔＡ）。 １５Ｌスケールで発酵させた場合の、１．２ｇｌｔＡ株（□）におけるメバロン酸の容積生産量を、親株（◆）のものと比較して経時的に示す。株は同一条件下で発酵させた。（２０１００９１６：株ＣＭＰ６７８（□）；ＧＩ１．２ｇｌｔＡ（２０１００１５４：株ＭＣＭ１００２（◆）野生型ｇｌｔＡ）。 １５Ｌスケールで発酵させた場合の、１．２ ｇｌｔＡ株（□）におけるメバロン酸のブロス力価を、親株（◆）のものと比較して経時的に示す。株は同一条件下で発酵させた。（２０１００９１６：株ＣＭＰ６７８（□）；ＧＩ１．２ｇｌｔＡ（２０１００１５４：株ＭＣＭ１００２（◆）野生型ｇｌｔＡ）。 １５Ｌスケールで発酵させた場合の、１．２ ｇｌｔＡ株（□）における、グルコースに対するメバロン酸の細胞生産性指数（ＣＰＩ）を、親（◆）のものと比較して経時的に示す。これらの試験では、細胞の乾燥重量は直接測定せず、測定された吸光度をもとに変換係数を使用して求めた。このＯＤ対ＤＣＷ係数は、同一の培地組成において、類似する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１宿主で作成される。下記のチャートにおいて、株は同一条件下で発酵させた。（２０１００９６７：株ＣＭＰ６８０（△）ａｃｋＡ，ｐｔａ−，ｌｄｈ−ＧＩ１．２ｇｌｔＡ；２０１００９１６：株ＣＭＰ６７８（□）ＧＩ１．２ｇｌｔＡ；２０１００１５４：株ＭＣＭ１００２（◆）野生型ｇｌｔＡ）。 １５Ｌで発酵させた場合に、「ｔｒｉｐｌｅ」宿主（ＣＭＰ６８０，△）が３６時間経過時点で示した、グルコースに対するメバロン酸収率は、１．２ ｇｌｔＡ株（ＣＭＰ６７８，□）を比較して良好であり、いずれの株も、親（ＭＣＭ１００２，◆）と比較して収率がかなり上昇していたことを示す。ＣＭＰ６８０株は、初期収率が顕著に高かった。株は同一条件下で発酵させた。（２０１００９６７：株ＣＭＰ６８０（△）ａｃｋＡ，ｐｔａ−，ｌｄｈ−ＧＩ１．２ｇｌｔＡ；２０１００９１６：株ＣＭＰ６７８（□）ＧＩ１．２ｇｌｔＡ；２０１００１５４：株ＭＣＭ１００２（◆）野生型ｇｌｔＡ）。 メバロン酸生産量（ｍｇ）／発酵ブロス（１Ｌ）／時間（１時間）／吸光度単位（５５０ｎｍでの吸光度）で記録されたメバロン酸の比生産量。１５Ｌで発酵させた場合に、「ｔｒｉｐｌｅ」宿主（ＣＭＰ６８０，△）が０〜２０時間で示したＥＦＴの比生産量は、１．２ ｇｌｔＡ株（ＣＭＰ６７８，□）と比較してかなり高かく、いずれの株も、親（ＭＣＭ１００２，◆）と比較して収率がかなり上昇していた。株は同一条件下で発酵させた。（２０１００９６７：株ＣＭＰ６８０（△）ａｃｋＡ，ｐｔａ−，ｌｄｈ−ＧＩ１．２ｇｌｔＡ；２０１００９１６：株ＣＭＰ６７８（□）ＧＩ１．２ｇｌｔＡ；２０１００１５４：株ＭＣＭ１００２（◆）野生型ｇｌｔＡ）。 メバロン酸（ｇ）／発酵ブロス（１Ｌ）／発酵開始後経過時間として記録された、メバロン酸の容積生産量。１５Ｌで発酵させた場合に、「ｔｒｉｐｌｅ」宿主（ＣＭＰ６８０，△）の示した容積生産量は、１．２ ｇｌｔＡ株（ＣＭＰ６７８，□）と比較して低かったことものの、いずれの株の容積生産量も、親（ＭＣＭ１００２，◆）と比較してかなり向上していた。株は同一条件下で発酵させた。（２０１００９６７：株ＣＭＰ６８０（△）ａｃｋＡ，ｐｔａ−，ｌｄｈ−ＧＩ１．２ｇｌｔＡ；２０１００９１６：株ＣＭＰ６７８（□）ＧＩ１．２ｇｌｔＡ；２０１００１５４：株ＭＣＭ１００２（◆）野生型ｇｌｔＡ）。 １．２ ｇｌｔＡ株（ＣＭＰ６７８，□）のメバロン酸ブロス力価（すなわちメバロン酸ブロス濃度）の方が「ｔｒｉｐｌｅ」宿主（ＣＭＰ６８０，△）のものと比較して高かったことを示す。１５Ｌスケールで発酵させた場合に、いずれの株も、試験期間を通して、親対照（ＭＣＭ１００２，◆）と比較して高かった。株は同一条件下で発酵させた。（２０１００９６７：株ＣＭＰ６８０（△）ａｃｋＡ，ｐｔａ−，ｌｄｈ−ＧＩ１．２ｇｌｔＡ；２０１００９１６：株ＣＭＰ６７８（□）ＧＩ１．２ｇｌｔＡ；２０１００１５４：株ＭＣＭ１００２（◆）野生型ｇｌｔＡ）。 それぞれＭＣＭ１６６６及びＭＣＭ１６６９株におけるＭ．バートニイ（M. burtonii）及びＭ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）の溶解度特性。 遺伝子操作し、（Ａ）Ｍ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼ又は（Ｂ）Ｍ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼを大腸菌（E. coli）染色体上で発現させた大腸菌（E. coli）株の、小規模試験における生育及びイソプレン生産量。 大腸菌（E. coli）の１５Ｌスケールでの発酵時のＭ．マゼイ（M. mazei）及びＭ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼの発現。 各１５Ｌスケールでの発酵により、経時的にグルコースに対して得られるイソプレン収率。グルコースに対して得られる収率（％）＝総イソプレン（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋８３．５）＊０．５９）］。式中、０．５９グルコース供給溶液中のグルコースの割合（重量％）であり、及び８３．５は、ｔ＝０の時点で発酵槽に供給したバッチのグラム重量である。各供給量は、独立して重量％として測定した。ＤＷ７０８：プラスミド及び染色体上にマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（◆）；ＤＷ７０８：プラスミド及び染色体上にマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（◇）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（▲）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫ（△）を存在させた。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、グルコースに対するイソプレンの瞬間的な収率を経時的に示す。イソプレンの瞬間的な収率は、次式を使用して算出した：イソプレンの瞬間的な収率（ｇ／ｇ％）＝イソプレン生産量（ｔ１−ｔ０）／グルコース消費量（ｔ１−ｔ０）＊１００。ＤＷ７０８：プラスミド及び染色体上にマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（◆）；ＤＷ７０８：プラスミド及び染色体上にマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（◇）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（▲）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫ（△）を存在させた。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、細胞生産性指数（ＣＰＩ）を経時的に示す。細胞生産性指数（ＣＰＩ）は、次式を使用して算出した：ＣＰＩ＝イソプレン総重量（ｇ）／細胞の総乾燥重量。ＤＷ７０８：プラスミド及び染色体上にマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（◆）；ＤＷ７０８：プラスミド及び染色体上にマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（◇）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（▲）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫ（△）を存在させた。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、容積生産量を経時的に示す。容積生産量は、次式を使用して算出した：［ΣＨＧＥＲ（ｔ）／１０００＊６８．１１７）］／［ｔ−ｔ０］。式中、総和はｔ０〜ｔの総和である。タンクのターンアラウンド・タイム（turnaround time）は係数に含めなかった。ＤＷ７０８：プラスミド及び染色体上にマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（◆）；ＤＷ７０８：プラスミド及び染色体上にマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（◇）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（▲）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫ（△）を存在させた。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、比生産量を経時的に示す。比生産量は、次式を使用して算出した：比生産量（ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ）＝ＨｇＥＲ＊６８．１１７ｇ／ｍｏｌ／ＯＤ。ＨｇＥＲはイソプレンの放出速度（Evolution Rate）（ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ）である。ＯＤ＝吸光度＝５５０ｎｍでの吸光度＊水への希釈倍率。ＤＷ７０８：プラスミド及び染色体上にマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（◆）；ＤＷ７０８：プラスミド及び染色体上にマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（◇）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（▲）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫ（△）を存在させた。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、グルコースに対するイソプレンの収率を経時的に示す。グルコースに対して得られる収率（％）＝総イソプレン（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋８３．５）＊０．５９）］。式中、０．５９グルコース供給溶液中のグルコースの割合（重量％）であり、及び８３．５は、ｔ＝０の時点で発酵槽に供給したバッチのグラム重量である。各供給量は、独立して重量％として測定した。ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（▲）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（△）；ＭＣＭ２１２６：染色体上にのみマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（■）；ＭＣＭ２１２７：染色体上にのみマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（＊）。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、グルコースに対するイソプレンの瞬間的な収率を経時的に示す。イソプレンの瞬間的な収率は、次式を使用して算出した：イソプレンの瞬間的な収率（ｇ／ｇ％）＝イソプレン生産量（ｔ１−ｔ０）／グルコース消費量（ｔ１−ｔ０）＊１００。ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（▲）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（△）；ＭＣＭ２１２６：染色体上にのみマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（■）；ＭＣＭ２１２７：染色体上にのみマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（＊）。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、細胞生産性指数（ＣＰＩ）を経時的に示す。細胞生産性指数（ＣＰＩ）は、次式を使用して算出した：ＣＰＩ＝イソプレン総重量（ｇ）／細胞の総乾燥重量。ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（▲）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（△）；ＭＣＭ２１２６：染色体上にのみマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（■）；ＭＣＭ２１２７：染色体上にのみマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（＊）。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、容積生産量を経時的に示す。容積生産量は、次式を使用して算出した：［ΣＨＧＥＲ（ｔ）／１０００＊６８．１１７）］／［ｔ−ｔ０］。式中、総和はｔ０〜ｔの総和である。タンクのターンアラウンド・タイムは係数に含めなかった。ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（▲）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（△）；ＭＣＭ２１２６：染色体上にのみマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（■）；ＭＣＭ２１２７：染色体上にのみマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（＊）。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、比生産量を経時的に示す。比生産量は、次式を使用して算出した：比生産量（ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ）＝ＨｇＥＲ＊６８．１１７ｇ／ｍｏｌ／ＯＤ。ＨｇＥＲはイソプレンの放出速度（ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ）である。ＯＤ＝吸光度＝５５０ｎｍでの吸光度＊水への希釈倍率。ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（▲）；ＭＣＭ２１２５：染色体上にのみバートニイ（burtonii）ＭＶＫを存在させた（△）；ＭＣＭ２１２６：染色体上にのみマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（■）；ＭＣＭ２１２７：染色体上にのみマゼイ（mazei）ＭＶＫを存在させた（＊）。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、グルコースに対するイソプレンの収率を経時的に示す。ＣＭＰ１０８２（ｐｇｌ＋）は△により示し、ＣＭＰ１１３６（ｐｇｌ−）は■により示す。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、グルコースに対するイソプレンの瞬間的な収率を経時的に示す。ＣＭＰ１０８２（ｐｇｌ＋）は△により示し、ＣＭＰ１１３６（ｐｇｌ−）は■により示す。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、細胞生産性指数（ＣＰＩ）を経時的に示す。ＣＭＰ１０８２（ｐｇｌ＋）は△により示し、ＣＭＰ１１３６（ｐｇｌ−）は■により示す。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、容積生産量を経時的に示す。ＣＭＰ１０８２（ｐｇｌ＋）は△により示し、ＣＭＰ１１３６（ｐｇｌ−）は■により示す。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、比生産量を経時的に示す。ＣＭＰ１０８２（ｐｇｌ＋）は△により示し、ＣＭＰ１１３６（ｐｇｌ−）は■により示す。 ２５ｍＬの培地を充填した２５０ｍＬ三角フラスコにおいて、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートして、イソプレン生産培養を行った場合のＯＤ６００を、時間の関数として示す。 イソプレン生産培養時のＯＤの関数として、比生産量（任意の単位）を示す。培養時には、２５ｍＬの培地を充填した２５０ｍＬ三角フラスコにおいて、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートを行った。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、グルコースに対するイソプレンの収率を経時的に示す。グルコースに対して得られる収率（％）＝総イソプレン（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋８３．５）＊０．５９）］。式中、０．５９はグルコース供給溶液中のグルコースの割合（重量％）であり、及び８３．５は、ｔ＝０の時点で発酵槽に供給したバッチのグラム重量である。各供給量は、独立して重量％として測定した。ＣＭＰ１１３６：野生型ｐｐｃプロモータ（△）；ＣＭＰ１２３７：ＧＩ１．２ｐｐｃプロモータ（■）。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、グルコースに対するイソプレンの瞬間的な収率を経時的に示す。イソプレンの瞬間的な収率は、次式を使用して算出した：イソプレンの瞬間的な収率（ｇ／ｇ％）＝イソプレン生産量（ｔ１−ｔ０）／グルコース消費量（ｔ１−ｔ０）＊１００。ＣＭＰ１１３６：野生型ｐｐｃプロモータ（△）；ＣＭＰ１２３７：ＧＩ１．２ｐｐｃプロモータ（■）。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、細胞生産性指数（ＣＰＩ）を経時的に示す。細胞生産性指数（ＣＰＩ）は、次式を使用して算出した：ＣＰＩ＝イソプレン総重量（ｇ）／細胞の総乾燥重量。ＣＭＰ１１３６：野生型ｐｐｃプロモータ（△）；ＣＭＰ１２３７：ＧＩ１．２ｐｐｃプロモータ（■）。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、容積生産量を経時的に示す。容積生産量は、次式を使用して算出した：［ΣＨＧＥＲ（ｔ）／１０００＊６８．１１７）］／［ｔ−ｔ０］。式中、総和はｔ０〜ｔの総和である。タンクのターンアラウンド・タイムは係数に含めなかった。ＣＭＰ１１３６：野生型ｐｐｃプロモータ（△）；ＣＭＰ１２３７：ＧＩ１．２ｐｐｃプロモータ（■）。 各１５Ｌスケールでの発酵により得られた、比生産量を経時的に示す。比生産量は、次式を使用して算出した：比生産量（ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ）＝ＨｇＥＲ＊６８．１１７ｇ／ｍｏｌ／ＯＤ。ＨｇＥＲはイソプレンの放出速度（ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ）であるＯＤ＝吸光度＝５５０ｎｍでの吸光度＊水への希釈倍率。ＣＭＰ１１３６：野生型ｐｐｃプロモータ（△）；ＣＭＰ１２３７：ＧＩ１．２ｐｐｃプロモータ（■）。 大腸菌（E. coli）ＭＧ１６５５ ａｒｏｕｎｄ ＦＮＲ（供給源：ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ０００９６）のゲノムの構成。 ２５ｍＬの培地を充填した２５０ｍＬ三角フラスコにおいて、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートして、イソプレン生産培養を行った場合のＯＤ６００を、時間の関数として示す。 イソプレン生産培養時のＯＤの関数として、比生産量（任意の単位）を示す。培養時には、２５ｍＬの培地を充填した２５０ｍＬ三角フラスコにおいて、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートを行った。 ２５ｍＬの培地を充填した２５０ｍＬ三角フラスコにおいて、３４℃かつ５０ｒｐｍでインキュベートして、イソプレン生産培養を行った場合のＯＤ６００を、時間の関数として示す。 イソプレン生産培養時のＯＤの関数として、比生産量（任意の単位）を示す。培養時には、２５ｍＬの培地を充填した２５０ｍＬ三角フラスコにおいて、３４℃かつ５０ｒｐｍでインキュベートを行った。 時間の関数として、イソプレン生産培養物のＯＤ６００を示す。 イソプレン生産培養時の時間の関数として、比生産量（任意の単位）を示す。 アレイ形態での、ＣＭＰ４５７（イソプレン生産株）及びＭＣＭ１０２０（対照株）のＲＮＡハイブリダイゼーションシグナルを比較して示す。 時間の関数として、培養物のＯＤ６００を示す。 イソプレン生産培養時の時間の関数として、比生産量（任意の単位）を示す。 ｐＭＣＭ１６６６−ｐＥＴ２４−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ｂＭＶＫのプラスミドマップを示す。 ｐＭＣＭ１６６９−ｐＥＴ２４−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ｍＭＶＫ（ＧＯ）のプラスミドマップ。 ２シストロン性のＭＶＫコンストラクトの概略図。 ｐＭＣＭ２０２０−ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｂＭＶＫのプラスミドマップ。 ｐＭＣＭ２０９５−ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ（ｄｅｌ）のプラスミドマップ。 時間の関数として、培養物のＯＤ６００を示す。 イソプレン生産培養時の時間の関数として、比生産量（任意の単位）を示す。
本発明は、特に、メバロン酸生産に指向する炭素の取り込みが増加するよう遺伝子操作された組み換え微生物において、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産量を増加させる、組成物及び方法を開示する。一態様では、本発明は、特に、メバロン酸生産に指向する炭素の取り込みが増加するよう遺伝子操作され、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ；（ｃ）酢酸キナーゼ；（ｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ；（ｅ）ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素；（ｆ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ；（ｇ）６−ホスホグルコノラクトナーゼ；（ｈ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ；（ｉ）マグネシウム欠乏時のＲｓｓＢ活性阻害タンパク質；（ｊ）多剤排出ポンプａｃｒＡＢ−ＴｏｌＣのａｃｒＡ成分；並びに（ｋ）フマル酸還元及び硝酸還元ｓＲＮＡ（ＦＮＲ）、からなる群の１種以上の酵素又はタンパク質の活性が調節された細胞を含む、組み換え微生物又はこれらの子孫微生物を提供する。一態様では、本明細書で開示する組み換え微生物は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドを１種以上コードしている核酸を異種発現するよう遺伝子操作された細胞である。他の態様では、組み換え微生物は、ｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子（微生物のリステリア・グレイ（Listeria grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）、及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子など）によりコードされるポリペプチドを異種発現するよう遺伝子操作された細胞（細菌細胞など）である。組み換え微生物の任意の子孫微生物も、同様に本発明の範囲内のものであることは企図される。
メバロン酸依存性生合成経路は、イソプレノイド前駆体分子のジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）及びイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の生産に特に重要である。メバロン酸経路上流の酵素は、グルコースから生成されたアセチルＣｏＡを、３つの酵素反応によりメバロン酸へと変換する。総合して、ＭＶＡ酸経路上流の遺伝子（例えば、上記細菌種に由来するｍｖａＥ及びｍｖａＳなどのｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子）は、メバロン酸経路上流の酵素活性を保有しているポリペプチドをコードしている。理論に束縛されるものではないが、メバロン酸依存性生合成経路の上流において、これら３つの酵素活性の効率及び生産性を向上させることで、メバロン酸の細胞内濃度が、ひいては下流のイソプレノイド前駆体分子（ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰなど）の濃度が実質的に上昇すると考えられる。したがって、これらの株によるメバロン酸の生産収率の増加は、商業用途に有利なものである。
本明細書で詳述するとおり、クエン酸シンターゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸酵素及び／又はピルビン酸デヒドロゲナーゼを含む酵素経路は、炭素がよりメバロン酸生産に取り込まれるよう、これらの経路において酵素活性を増加又は減少させるために調節することができる。細胞においてメバロン酸生産に取り込まれる炭素を増加させる際に調節することのできる他の因子としては、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、マグネシウム欠乏時のＲｓｓＢ活性阻害タンパク質、多剤排出ポンプａｃｒＡＢ−ＴｏｌＣのａｃｒＡ成分、及びフマル酸還元及び硝酸還元ｓＲＮＡを挙げることができる。同様に、イソプレン、イソプレノイド前駆体、及びイソプレノイド生産の際により多くの基質を取り込ませることもできる。したがって、本発明の組成物及び方法は、これまでに当該技術分野で実施されているものと比較して、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、及びイソプレノイドの生産量を増加させるのに利用可能な微生物株の数、並びにこれらの細胞（細菌細胞など）により生産されるこれらの化合物（例えば、メバロン酸）の量の両方で改善を示す。
一般的技術
本発明の実施においては、特に断らないかぎりにおいて、当業者の技能の範囲内に含まれる従来の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の技術を用いる。これらの手法は、次の文献：「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９年）；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；「動物細胞の培養（Animal Cell Culture）」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．、１９８７年）；「酵素学的実験法（Methods in Enzymology）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「分子生物学標準プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．、１９８７年、定期的に改定）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR: The Polymerase Chain Reaction）」（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４年）．Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、「微生物学及び分子生物学辞典（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology）第２版」、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４年）、及びＭａｒｃｈ「有機化学反応、機序及び構造第４版（Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed.）」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）中に十分に説明されており、これらの文献は、本出願で使用される数多くの用語の一般的な指針を当業者に提供する。
用語の定義
用語「完全なメバロン酸（ＭＶＡ）経路」又は「メバロン酸（ＭＶＡ）経路全体」は、アセチルＣｏ−Ａをジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）及びイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）へと変換し、酵素のアセトアセチルコエンザイムＡシンターゼ（例えば、チオラーゼ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡシンターゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）により触媒される、細胞内代謝経路を指す。
本明細書で使用するとき、用語「メバロン酸経路上流」又は「ＭＶＡ経路上流」は、細胞中で、酵素のアセトアセチルコエンザイムＡシンターゼ（例えば、チオラーゼ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡシンターゼ、及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素により触媒される一連の反応を指す。
用語「メバロン酸経路下流」又は「ＭＶＡ経路下流」は、細胞中で、酵素のメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）により触媒される一連の反応を指す。
用語「イソプレン」は、２−メチル−１，３−ブタジエン（ＣＡＳ＃ ７８−７９−５）を指す。３，３−ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からピロリン酸を除去することで、揮発性のＣ５炭化水素を、直接的に及び最終的に生成することができる。ＩＰＰ分子をＤＭＡＰＰ分子に結合又は重合させることは包含しない場合がある。用語「イソプレン」は、概して、本明細書に別途記載のない限り、生産方法を限定されることを意図しない。
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」には、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドが含まれる。
本明細書で使用するとき、「単離ポリペプチド」は、２、５、１０、２０、又は５０個以上の異なるポリペプチドのライブラリなどといった、ポリペプチドのライブラリの一部を意味するものではなく、天然に生じる少なくとも１つの成分から分離されたポリペプチドを意味する。例えば、ポリペプチドをコードしている組み換え核酸を発現させることで単離ポリペプチドを得ることができる。
「異種ポリペプチド」は、宿主細胞と異なる生物、種、又は株由来の核酸配列によりコードされるポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型ポリペプチドと同一ではない。
本明細書で使用するとき、「核酸」は、共有結合により単鎖又は二本鎖のいずれかの形態で連結している、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを指す。
「組換え核酸」とは、対象とする核酸が由来する生物で天然に生じるゲノムにおいて、対象とする核酸に隣接する１つ以上の核酸（例えば遺伝子）を含まない、対象とする核酸のことを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに組み込まれた、プラスミド又はウィルスに自己複製的に組み込まれた、原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、又は他の配列とは独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、又はＰＣＲにより生産された若しくは制限エンドヌクレアーゼによる消化により生産されたｃＤＮＡ断片）として存在する、組み換えＤＮＡが包含される。
「異種核酸」は、宿主細胞と異なる生物、種又は株由来の核酸配列を意味する。一部の実施形態では、異種核酸は、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型核酸と同一ではない。例えば、大腸菌（E. coli）の染色体を形質転換させる、又は大腸菌（E. coli）の染色体に組み込ませるｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）及びＥ．カセリフラブス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子など）によりコードされる核酸は、異種核酸である。
本明細書において使用するところの「発現制御配列」とは、対象とする核酸の転写を指示する核酸配列のことを意味する。発現制御配列は、常時発現型若しくは誘導型のプロモータ又はエンハンサーなどのプロモータであり得る。発現制御配列は「ネイティブ」な配列又は異種性の配列であり得る。ネイティブな発現制御配列は、遺伝子を発現させる生物、種又は株と同様の生物、種又は株に由来する配列である。異種性の発現制御配列は、遺伝子を発現させる生物、種又は株とは異なる生物、種又は株に由来する配列である。「誘導型プロモータ」は、環境下、又は発育制限下で活性であるプロモータである。
「調節可能に連結された」は、核酸発現制御配列（プロモータなど）及び第２の核酸配列間の機能的連結を意味し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。
本明細書で使用するとき、用語「最少培地（minimal medium又はminimal media）」は、細胞増殖に必要とされる最低限の栄養素を含有し、概してアミノ酸の存在していない増殖培地を指す。最少培地は、典型的には、（１）微生物（例えば、細菌）の生育用の炭素源、（２）微生物（例えば、細菌）種及び生育間で変更させ得る各種塩類、及び（３）水、を含有する。炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、他のバイオマスのより複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選択するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の生育を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選択するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
本明細書で使用するとき、用語「イソプレノイド」は、２つ以上の炭化水素単位からなり、各単位は、特定の様式で配置された５つの炭素原子からなる、天然に生じる有機化合物類の、広範にわたるかつ多様な部類を指す。本明細書で使用するとき、「イソプレン」は、明らかに「イソプレノイド」の定義から除外される。
本明細書で使用するとき、用語「テルペノイド」は、多様な様式で組み立てられ及び修飾され、構成員として使用されたイソプレノイド単位の数に基づき分類される、炭素数５のイソプレノイド単位に由来する有機分子の、広範にわたるかつ多様な部類を指す。ヘミテルペノイドは、イソプレノイド単位を１つ有する。モノテルペノイドは、イソプレノイド単位を２つ有する。セスキテルペノイドは、イソプレノイド単位を３つ有する。ジテルペノイドは、イソプレン単位を４つ有する。セステルテルペノイドは、イソプレノイド単位を５つ有する。トリテルペノイドは、イソプレノイド単位を６つ有する。テトラテルペノイドは、イソプレノイド単位を８つ有する。ポリテルペノイドは、イソプレノイド単位を８つ超有する。
本明細書で使用するとき、「イソプレノイド前駆体」は、テルペノイド又はイソプレノイドの生合成時に生物により使用される任意の分子を指す。イソプレノイド前駆体分子の非限定例としては、例えば、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「質量収率」は、細胞（細菌細胞など）により生産される生産物の質量を、細胞（細菌細胞など）により消費されたグルコースの質量より除算し、１００を乗じたものを指す。
「比生産量」は、細胞（細菌細胞など）により生産される生産物の質量を、生産物の生産にかかった時間、細胞密度及び培養体積により除したものを意味する。
「力価」は、細胞（細菌細胞など）により生産される生産物の質量を、培養体積により除したものを意味する。
本明細書で使用するとき、用語「細胞生産性指数（細胞生産性指数）（ＣＰＩ）」は、細胞（細菌細胞など）により生産される生産物の質量を、培養により生産された細胞（細菌細胞など）の質量により除したものを指す。
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈に明示されない限り、対象物が複数ある場合をも包含する。
本明細書を通じて与えられるあらゆる最大数の限定は、あらゆるより小さい数値の限定を、あたかもそのようなより小さい数値の限定が明確に書かれているかのように包含するものと理解されることが意図される。本明細書の全体を通じて与えられるすべての最小の数値的限定には、これよりも大きいすべての数値的限定が、あたかもこうしたより大きい数値的限定が本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。本明細書の全体を通じて与えられるすべての数値的範囲には、これよりも狭い数値的範囲が、あたかもこうしたより狭い数値的範囲がすべて本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。
メバロン酸の生産量を増加させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）
メバロン酸依存性生合成経路（ＭＶＡ経路）は、全ての高等真核生物及び特定種の細菌に存在する、重要な代謝経路である。メバロン酸経路は、タンパク質のプレニル化、細胞膜の維持、タンパク質の固定及びＮ−グリコシル化などの、多様な工程において使用される分子の生産に重要であり、並びにテルペン、テルペノイド、イソプレノイド、及びイソプレンの生合成時の主成分として機能するイソプレノイド前駆体分子のＤＭＡＰＰ及びＩＰＰの主要な供給源を提供する。
ＭＶＡ経路の上流において、細胞の代謝により生産されたアセチルＣｏ−Ａは、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの酵素活性を有するポリペプチドの作用により、メバロン酸に変換される。はじめに、アセチルＣｏ−Ａは、チオラーゼの作用によりアセトアセチルＣｏＡに変換される。次に、アセトアセチルＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの酵素作用により、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）へと変換される。このＣｏ−Ａ誘導体をＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素により還元してメバロン酸を生成する。この反応は、メバロン酸経路によるイソプレノイド生産の律速段階となる。次に、メバロン酸は、メバロン酸キナーゼの作用により５−ホスホメバロン酸に変換され、５−ホスホメバロン酸は、続いてホスホメバロン酸キナーゼの酵素活性により、５−ジホスホメバロン酸に変換される。最後に、酵素の５−ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの活性により、５−ジホスホメバロン酸からＩＰＰが形成される。
一部の態様では、本明細書において参照した任意の酵素の調節により、発現（例えば、転写又は翻訳）、生産、翻訳後修飾又は任意の他の酵素機能に影響を与えることができる。一部の実施形態では、組み換え細胞の酵素機能（例えば、触媒能）は、このような調整に関する遺伝子操作を行っていない細胞と比較して、上昇又は低下している。一実施形態では、酵素機能（例えば、活性）は、遺伝子操作を行っていない細胞と比較して上昇している。他の実施形態では、酵素機能（例えば、活性）は、遺伝子操作を行っていない細胞と比較して減少している。
クエン酸シンターゼによる経路
クエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸とアセチルＣｏＡを縮合させることによるクエン酸（トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の代謝生成物）の生成を触媒する（Ｎｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２：５２４３〜５２４９；Ｂｈａｙａｎａ，Ｖ．ａｎｄ Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ｈ．１９８４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：２９００〜２９０５）（図５）。大腸菌（E. coli）では、ｇｌｔＡによりコードされたこの酵素は、二量体サブユニットからなる三量体様の挙動を示す。六量体の形成により、酵素はＮＡＤＨによりアロステリックに制御されるようになる。この酵素は、これまでに広く研究されている（Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｇ．，ａｎｄ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．１９８６．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１５：９７〜１１７；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．１９８７．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｓｙｍｐ．５４：８３〜９２；Ｓｔｏｃｋｅｌｌ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３５４３５〜４３；Ｍａｕｒｕｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．２００３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４２：５５５５〜５５６５）。ＮＡＤＨによるアロステリック阻害を回避するにあたって、これまでに、枯草菌（Bacillus subtilis）ＮＡＤＨ感受性クエン酸シンターゼによる置き換え、又はこの酵素の添加が検討されている（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．２００２．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１〜１０８１；Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．７：２２９〜２３９）。
クエン酸シンターゼによる触媒反応は、メバロン酸経路の第一工程を触媒し、同様にアセチルＣｏＡを基質として使用するチオラーゼと直接的に競合する（Ｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：２１１６〜２１２２）。したがって、当業者は、クエン酸シンターゼの発現を調節して（例えば、酵素活性を減少させて）、より多量の炭素がメバロン酸経路に取り込まれるようにすることで、メバロン酸、イソプレン及びイソプレノイドの最終的な生産量を増加させることができる。クエン酸シンターゼ活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。一部の態様では、クエン酸シンターゼに関係する内在性遺伝子の活性を減少させることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する。この調節は、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子により、あるいは枯草菌（Bacillus subtilis）から誘導したＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子により、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子の染色体を置換することで実施できる。クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによっても調節（例えば、低下させる）できる。クエン酸シンターゼの活性を低下させることで、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みを、クエン酸シンターゼの発現を低下させていない微生物と比較して増加させることができる。
ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの関与する経路
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．１９６９．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９１：５５０〜５５８）は、アセチルＣｏＡとアセチルリン酸（アセチル−Ｐ）の可逆性の変換を触媒するのに対し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）（Ｋａｋｕｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：９１６〜９２２）は、アセチル−Ｐと酢酸の可逆性の変換を触媒する。これらの遺伝子は、大腸菌（E. coli）においてオペロンとして転写され得る。これらの遺伝子は共に、ＡＴＰの放出により酢酸の異化を触媒する。したがって、当業者は、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子）及び／又は酢酸キナーゼ遺伝子（例えば、内在性酢酸キナーゼ遺伝子）の活性を減弱させて、利用可能なアセチルＣｏ−Ａを増加させることができる。減弱させる手法の一つとしては、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）及び／又は酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の欠失が挙げられる。この欠失は、クロラムフェニコールカセットにより片方又はいずれもの遺伝子を置き換え、その後カセットを除去することで導入される。酢酸は多様な理由により大腸菌（E. coli）により生成される（Ｗｏｌｆｅ，Ａ．２００５．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６９：１２〜５０）。理論に束縛されるものではないが、ａｃｋＡ−ｐｔａはアセチルＣｏＡを消費することから、これらの遺伝子を欠失させると、炭素は酢酸へと変換されなくなり、メバロン酸、イソプレン又はイソプレノイドの収率が増加することになる。
一部の態様では、組み換え微生物は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、酢酸の生成量が減少している。酢酸生成量の減少は、当業者に既知の所定のアッセイ法により測定できる。酢酸の生成量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％減少する。
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）及び／又は酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性は、酵素に関係する他の分子的操作によっても低下させることができる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
一部の場合では、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
乳酸デヒドロゲナーゼの関与する経路
大腸菌（E. coli）では、Ｄ−乳酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ−図５）により、ピルビン酸から生成される（Ｂｕｎｃｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：１８７〜１９５）。乳酸の生成はＮＡＤＨの酸化によりなされるため、乳酸は、酸素制限下で、かつ還元当量のすべてを収容できない場合に生成されることになる。したがって、乳酸の生成は、炭素消費の原因となり得る。そのため、メバロン酸生産（並びに必要に応じてイソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドの生産）への炭素の取り込みを向上させるため、当業者は、酵素活性を低下させるなどして乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することができる。
したがって、一態様では、乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。このような減弱は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失により実施できる。当業者に知られている、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させる他の手法も使用できる。乳酸デヒドロゲナーゼの関与する経路を操作することで、組み換え微生物の生成する乳酸量は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、減少することになる。乳酸の生成量の減少は、当業者に知られている所定のアッセイ法により測定できる。乳酸の生成量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％減少する。
乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、酵素に関係するその他の分子操作により低下させることもできる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
したがって、一部の場合では、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みが増加する。
リンゴ酸酵素の関与する経路
リンゴ酸酵素（大腸菌（E. coli）ではｓｆｃＡ及びｍａｅＢ）は、次式に従いリンゴ酸のピルビン酸への変換を触媒する（ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を用いる）アナプレロティックな酵素である：
Figure 2017148063
したがって、この酵素の２種の基質は（Ｓ）−リンゴ酸及びＮＡＤ（Ｐ）＋であり、これらにより３種の生成物、すなわち、ピルビン酸、ＣＯ２、及びＮＡＤＰＨが生成される。
ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素（ｍａｅＢ−図５）（Ｉｗｉｋｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９７９．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５：１３５５〜１３６５）を発現させることで、１）ＴＣＡサイクル由来の炭素から、アセチルＣｏＡの直接的な前駆体であり、それ自体がメバロン酸経路の直接的な前駆体となるピルビン酸を再生成し、及び２）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素反応に使用することのできる過剰なＮＡＤＰＨを生産して、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドの収率を増加させる助けとすることができる（Ｏｈ，ＭＫ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１３１７５〜１３１８３；Ｂｏｌｏｇｎａ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５９３７〜５９４６）。
そのため、リンゴ酸酵素の活性及び／又は発現を増加させるなどして調節することにより下流でのメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイド生産に関係する開始基質（ピルビン酸又はアセチルＣｏＡ）がより多く得られる。ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子は、内在性遺伝子であってよい。非限定的な手法の１つとしては、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素の内在性遺伝子プロモータを、常時発現型の合成発現プロモータにより置き換えるというものが挙げられる。酵素活性を増加させる手法のその他の非限定例としては、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を用いるものが挙げられる。当業者は、容易に利用可能な分子生物学手技を用い、発酵又は培養する際に、ｍａｅＢ ＲＮＡの発現をモニターすることができる。
したがって、一部の実施形態では、組み換え微生物は、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、ピルビン酸の生産量が増加する。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の活性を増加させることで、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
ピルビン酸生成量の増加は、当業者に既知の所定のアッセイ法により測定できる。ピルビン酸の生産量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％増加する。
リンゴ酸酵素の活性は、酵素に関係するその他の分子操作により増加させることもできる。酵素活性を増加させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で増加させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％増加させる。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の関与する経路
ピルビン酸のアセチルＣｏＡへの脱炭酸を触媒するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、遺伝子ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及びｌｐｄＡによりコードされるタンパク質から構成される。これらの遺伝子の転写は、複数の制御因子により制御される。したがって、当業者は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を調節して、アセチルＣｏＡを増加することができる。調節により、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性及び／又は発現（例えば、常時発現）を増加させることができる。このような調節は、異なる手法により、例えば、ＰＬ．６（ａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃａｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇ−ラムダプロモータ、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１４１６）などの強力な常時発現型プロモータをオペロンの前に配置することにより、あるいは常時発現型合成プロモータを１種以上用いることにより行うことができる。
したがって、一態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼから構成されるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する、１種以上の遺伝子の活性を増加させることで調節される。これらの遺伝子のうちの任意の１つ、２つ、又は３つを操作して、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を増加させることができることは理解される。他の態様では、以降に更に説明するように、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリプレッサーの活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の欠失により減弱される。
一部の場合では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する遺伝子の１つ以上は内在性遺伝子である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を増加させるその他の方法としては、微生物に、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群に由来するポリペプチを１つ以上コードしている異種核酸を１つ以上導入することによるものが挙げられる。
これらの方法のうち任意のものを用いることで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の調節されていない微生物と比較して、組み換え微生物によるアセチルＣｏ−Ａの生産量を増加させることができる。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現を調節していない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素原子の取り込みを増加させることができる。
変異の組み合わせ
本開示の酵素及び／又は酵素経路の何れかに関し、本開示の酵素及び／又は酵素経路の任意の組み合わせ（これらのうち２、３、４、５、又は６の組み合わせ）を調節する分子的操作は、明確に企図されることは理解される。組み合わせて詳細説明することを容易にする目的で、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）はＡと表記し、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａＢ）はＢと表記し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）はＣと表記し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）はＤと表記し、リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ又はｍａｅＢ）はＥと表記し、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ａｃｅＥ、ａｃｅＦ及び／又はｌｐｄＡ）はＦと表記し、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｙｂｈＥ）はＧと表記し、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｌ）はＨと表記する。上記の通り、ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体のａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及び／又はｌｐｄＡ酵素を単独で使用して、又は３種の酵素のうち２種を、又は３種の酵素のうち３種を使用して、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性を増加させることができる。
適宜、酵素Ａ〜Ｈのうちの任意の２つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせは：ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＨ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＢＧ、ＢＨ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＨ、ＤＥ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＨ、ＥＦ、ＥＧ、ＥＨ及びＧＨである。酵素Ａ〜Ｈのうちの任意の３つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせは：ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢＥ、ＡＢＦ、ＡＢＧ、ＡＢＨ、ＢＣＤ、ＢＣＥ、ＢＣＦ、ＢＣＧ、ＢＣＨ、ＣＤＥ、ＣＤＦ、ＣＤＧ、ＣＤＨ、ＤＥＦ、ＤＥＨ、ＡＣＤ、ＡＣＥ、ＡＣＦ、ＡＣＧ、ＡＣＨ、ＡＤＥ、ＡＤＦ、ＡＤＧ、ＡＤＨ、ＡＥＦ、ＡＥＧ、ＡＥＨ、ＢＤＥ、ＢＤＦ、ＢＤＧ、ＢＤＨ、ＢＥＦ、ＢＥＧ、ＢＥＨ、ＣＥＦ、ＣＥＧ、ＣＥＨ、ＣＦＧ、ＣＦＨ及びＣＧＨである。酵素Ａ〜Ｈのうちの任意の４つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせは：ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、ＡＢＣＦ、ＡＢＣＧ、ＡＢＣＨ、ＡＢＤＥ、ＡＢＤＦ、ＡＢＤＧ、ＡＢＤＨ、ＡＢＥＦ、ＡＢＥＧ、ＡＢＥＨ、ＢＣＤＥ、ＢＣＤＦ、ＢＣＤＧ、ＢＣＤＨ、ＣＤＥＦ、ＣＤＥＧ、ＣＤＥＨ、ＡＣＤＥ、ＡＣＤＦ、ＡＣＤＧ、ＡＣＤＨ、ＡＣＥＦ、ＡＣＥＧ、ＡＣＥＨ、ＢＣＥＦ、ＢＤＥＦ、ＢＧＥＦ、ＢＨＥＦ、ＡＤＥＦである。酵素Ａ〜Ｈのうちの任意の５つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせは：ＡＢＣＤＥ、ＡＢＣＤＦ、ＡＢＣＤＧ、ＡＢＣＤＨ、ＡＢＤＥＦ、ＡＢＤＥＧ、ＡＢＤＥＨ、ＢＣＤＥＦ、ＢＣＤＥＧ、ＢＣＤＥＨ、ＡＣＤＥＦ、ＡＣＤＥＧ、ＡＣＥＤＨ、ＡＢＣＥＦ、ＡＢＣＥＧ及びＡＢＣＥＨである。酵素Ａ〜Ｈのうちの任意の６つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせは：ＡＢＣＤＥＦ、ＡＢＣＤＥＧ、ＡＢＣＤＥＨ、ＢＣＤＥＦＧ、ＢＣＤＥＦＨ及びＣＤＥＦＧＨである。酵素Ａ〜Ｈのうちの任意の７つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせは：ＡＢＣＤＥＦＧ、ＡＢＣＤＥＦＨ、ＢＣＤＥＦＧＨである。他の態様では、全８つの酵素（ＡＢＣＤＥＦＧＨ）を組み合わせて使用できる。
したがって、本開示に記載する通りの組み換え微生物は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの活性条件下で増殖しない微生物と比較して、メバロン酸生産を増加させることができ、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼ、（ｃ）乳酸デヒドロゲナーゼ、（ｄ）リンゴ酸酵素、並びに（ｅ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体からなる群の１つ以上の酵素の活性を調節することで、組み換え微生物における代謝性炭素の取り込みがメバロン酸の生産に指向する。
生産性増加に関係する他の制御因子及び要素
他の分子的操作を使用して、メバロン酸生産に指向する炭素取り込みを増加させることができる。このような方法のうちの１つは、メバロン酸経路に合流する経路に対する負の制御効果を減少させ、低下させるか、又は除去するものである。例えば、一部の場合では、遺伝子ａｃｅＥＦ−ｌｐｄＡはオペロンであり、ｐｄｈＲの上流に遺伝子を４つ有する。ｐｄｈＲは、このオペロンの転写に対する負の制御因子である。ｐｄｈＲは、ピルビン酸の非存在下で標的プロモータに結合し、転写を抑制する。この制御因子は同様の手法でｎｄｈ及びｃｙｏＡＢＣＤも制御する（Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．２００７．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５５３４〜５５４１）。一態様では、ｐｄｈＲ制御因子を欠失させることにより、ピルビン酸の供給及びそれに伴うメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、及びイソプレノイドの生産を向上させることができる。
他の態様では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド及びイソプレノイド前駆体の生産を改良させるために、ＰＧＬを欠損している微生物（各種大腸菌（E. coli）株など）に６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）を導入し、使用することができる。ＰＧＬは、染色体への組み込み、又はプラスミドなどの染色体外のビヒクルを用い、導入することができる。更に他の態様では、ＰＧＬを発現している細胞（例えば、各種大腸菌（E. coli）株などの微生物）のゲノムから、ＰＧＬを欠失させて、メバロン酸及び／又はイソプレンの生産量を増加させることもできる。他の態様では、ＰＧＬのポリペプチドをコードしている異種核酸は、内因的にＰＧＬを発現していない細胞で発現させることができる。一部の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、イソプレンの収率が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、イソプレンの瞬間的な収率が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、細胞生産性指数が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、容積生産量が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、最大比生産量が高くなる。一部の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、より長い期間、最大比生産量が維持されることになる。
他の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（大腸菌（E. coli）ではｐｐｃ）の遺伝子発現を調節して、本明細書で開示される任意の細胞におけるメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドの生産量を増加させることができる。一態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの遺伝子発現は、ｐｐｃ遺伝子のプロモータ配列を、野生型細胞と比較してｐｐｃ遺伝子の発現を減少させることになる他のプロモータと置き換えることで、減少させることができる。一部の態様では、ｐｐｃ遺伝子の発現は、野生型細胞と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）減少させることができる。一部の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現を減少させることで、イソプレンの収率は、野生型レベルでホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現を減少させることで、イソプレンの瞬間的な収率は、野生型レベルでホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現を減少させることで、細胞生産性指数は、野生型レベルでホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現を減少させることで、イソプレンの容積生産量は、野生型レベルでホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現を減少させることで、イソプレンの最大比生産量は、野生型レベルでホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。一部の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現を減少させることで、野生型レベルでホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現している微生物と比較してより長い期間、最大比生産量が維持されることになる。
他の態様では、マグネシウム欠乏時のＲｓｓＢ（大腸菌（E. coli）ではｉｒａＭ）活性阻害剤の遺伝子発現を調節して、本明細書で開示される任意の細胞におけるメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドの生産量を増加させることができる。一態様では、ｉｒａＭの遺伝子発現は、ｉｒａＭ遺伝子のプロモータ配列を、野生型細胞と比較してｉｒａＭ遺伝子の発現を増加させることになる他のプロモータと置き換えることで、減少させることができる。一部の態様では、ｉｒａＭ遺伝子の発現は、野生型細胞と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加させることができる。一部の態様では、ｉｒａＭ遺伝子の発現を増加させることで、イソプレンの収率は、野生型レベルでｉｒａＭ遺伝子を発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ｉｒａＭ遺伝子の発現を増加させることで、イソプレンの瞬間的な収率は、野生型レベルでｉｒａＭ遺伝子を発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ｉｒａＭ遺伝子の発現を増加させることで、イソプレンの細胞生産性指数は、野生型レベルでｉｒａＭ遺伝子を発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ｉｒａＭ遺伝子の発現を増加させることで、イソプレンの容積生産量（volumetric productivity）は、野生型レベルでｉｒａＭ遺伝子を発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ｉｒａＭ遺伝子の発現を増加させることで、イソプレンの最大比生産量は、野生型レベルでｉｒａＭ遺伝子を発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。一部の態様では、ｉｒａＭ遺伝子の発現を増加させることで、野生型レベルでｉｒａＭ遺伝子を発現している微生物と比較してより長い期間、最大比生産量が維持されることになる。
他の態様では、多剤排出ポンプａｃｒＡＢ−ＴｏｌＣのａｃｒＡ成分（大腸菌（E. coli）におけるａｃｒＡ）の遺伝子発現を調節することにより、本明細書で開示される任意の細胞において、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、及びイソプレノイドの生産を向上させることができる。一態様では、ａｃｒＡの遺伝子発現は、ａｃｒＡ遺伝子のプロモータ配列を、野生型細胞と比較してａｃｒＡ遺伝子の発現を減少させることになる他のプロモータと置き換えることで、減少させることができる。一部の態様では、ａｃｒＡ遺伝子の発現は、野生型細胞と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）減少させることができる。他の態様では、ａｃｒＡの発現は、もはや機能性ａｃｒＡタンパク質が生産されなくなるよう細胞のゲノム中のａｃｒＡ遺伝子を欠失させるなどして、完全に消失させることができる。一部の態様では、ａｃｒＡ遺伝子の発現を欠損又は減少させることで、イソプレンの収率は、野生型レベルでａｃｒＡ遺伝子を発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ａｃｒＡ遺伝子の発現を欠損又は減少させることで、イソプレンの瞬間的な収率は、野生型レベルでａｃｒＡ遺伝子を発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ａｃｒＡ遺伝子の発現を欠損又は減少させることで、イソプレンの細胞生産性指数は、野生型レベルでａｃｒＡ遺伝子を発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ａｃｒＡ遺伝子の発現を欠損又は減少させることで、イソプレンの容積生産量は、野生型レベルでａｃｒＡ遺伝子を発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。
他の態様では、ａｃｒＡ遺伝子の発現を欠損又は減少させることで、イソプレンの最大比生産量は、野生型レベルでａｃｒＡ遺伝子を発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。一部の態様では、ａｃｒＡ遺伝子の発現を欠損又は減少させることで、野生型レベルでａｃｒＡ遺伝子を発現している微生物と比較してより長い期間、最大比生産量が維持されることになる。
他の態様では、ＦＮＲ ＤＮＡ結合型転写制御因子（ＦＮＲ）の遺伝子発現を調節して、本明細書で開示される任意の細胞におけるメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドの生産量を増加させることができる。一態様では、ＦＮＲ遺伝子発現は、ＦＮＲをコードしている遺伝子のプロモータ配列を、野生型細胞と比較してＦＮＲ遺伝子の発現を増加させることになる他のプロモータと置き換えることで、減少させることができる。他の態様では、ＦＮＲをコードしている異種核酸を、ＦＮＲを内因的に発現していない細胞で発現させることができる。一部の態様では、ＦＮＲ発現は、ＦＮＲを内因的に発現していない野生型細胞又は細胞と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。一部の態様では、ＦＮＲの発現を増加させることで、イソプレンの収率は、ＦＮＲを内因的に発現していない野生型細胞又は細胞と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ＦＮＲの発現を増加させることで、イソプレンの瞬間的な収率は、ＦＮＲを内因的に発現していない野生型細胞又は細胞と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ＦＮＲの発現を増加させることで、イソプレンの細胞生産性指数は、ＦＮＲを内因的に発現していない野生型細胞又は細胞と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ＦＮＲの発現を増加させることで、イソプレンの容積生産量は、ＦＮＲを内因的に発現していない野生型細胞又は細胞と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。他の態様では、ＦＮＲの発現を増加させることで、イソプレンの最大比生産量は、ＦＮＲを内因的に発現していない野生型細胞又は細胞と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）増加する。一部の態様では、ＦＮＲの発現を増加させることで、最大比生産量は、野生型細胞又はＦＮＲを内因的に発現していない細胞と比較して、より長時間（時間ｉ）にわたって維持される。
本明細書に記載の各種酵素経路を調節するために、メバロン酸生産に取り込まれる炭素量を増加させる、宿主細胞（例えば、微生物）変異の他、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを発現している宿主細胞を、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドなどの所望の最終産物の生産量を増加させる宿主細胞変異と組み合わせて使用することができる。他の実施形態では、各種生物種由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳをコードしている遺伝子を、宿主細胞変異と組み合わせて使用して、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドなどの所望の最終産物の生産量を増加させることができる。
加えて、ｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子産物同様、ＭＶＡ経路の上流及び下流に由来する他の酵素も使用できる。ＭＶＡ経路に含まれる代表的なポリペプチドの非限定例としては、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を２つ以上有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。ＭＶＡ経路のポリペプチドには、ＭＶＡ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが含まれる。ＭＶＡ経路の核酸の例としては、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路のポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。
国際公開出願第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、及び同第２０１０／１４８１５０号に記載の、ＭＶＡ経路に関係するポリペプチドの非限定例を使用できる。
ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子
一部の微生物（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及びＥ．フェカリス（E. faecalis）など）では、ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼ活性及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を両方保有しているポリペプチドをコードしている。
実際に、ｍｖａＥ遺伝子産物は、真性細菌で見られる、ＩＰＰ生合成に関係する最初の二機能性酵素となるものであり、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の第一例は、天然において他のタンパク質と融合していた（Ｈｅｄｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２ Ａｐｒｉｌ；１８４（８）：２１１６〜２１２２）。それに対しｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。異なる細菌種、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を、予め大腸菌（E. coli）株に組み込み、メバロン酸を生産させた（米国特許第２００５／０２８７６５５（Ａ１）号を参照されたい。この開示は参照により本明細書に組み込まれる；Ｔａｂａｔａ，Ｋ．ａｎｄ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２６：１４８７〜１４９１，２００４）。
したがって、細胞（例えば、大腸菌（E. coli）などの細菌細胞）は、メバロン酸の生産量、ピーク力価及び細胞生産性を向上させるために、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）、及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子など）を発現するよう遺伝子操作することができる。１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子をマルチコピープラスミドで発現させることもできる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を宿主細胞の染色体に組み込むことができる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子のいずれもの異種発現に際し、遺伝子発現は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータのいずれかにより駆動できる。プロモータは、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている任意の遺伝子を本発明に使用することができる。特定の実施形態では、様々なｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）ｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子など）を、単独で、あるいはＭＶＡ経路上流関連性タンパク質をコードしている１つ以上の他のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子と組み合わせて選択することが、本発明の範囲内のものとして企図される。したがって、特定の態様では、表１において企図される任意の遺伝子の組み合わせを、上記の任意の手法において、細胞（細菌細胞など）に発現させることができる。
Figure 2017148063
ｍｖａＥポリペプチド及び核酸例
ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼ活性及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を両方保有しているポリペプチドをコードする。ｍｖａＥ遺伝子によりコードされているポリペプチドのチオラーゼ活性は、アセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換するのに対し、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ポリペプチドの酵素活性は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する。ｍｖａＥポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにｍｖａＥポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
変異型ｍｖａＥポリペプチドとしては、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けており、かつｍｖａＥポリペプチド活性（すなわち、アセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力並びに３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する能力）を保持しているものが挙げられる。アミノ酸置換は、保存的なものであっても非保存的なものであってもよく、アミノ酸残基の置換は遺伝子暗号によりコードされていてもコードされていなくてもよい。標準的な２０個のアミノ酸「記号（alphabet）」を、側鎖の類似性に基づき化学的なファミリーに分けた。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。「非保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。
ｍｖａＥポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することで、分子の官能性を改良することができる。例えば、ｍｖａＥポリペプチドの、基質に対する結合親和性を増加させるアミノ酸置換、あるいはアセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力及び／又は３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する能力を改良するアミノ酸置換を、ｍｖａＥポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、ｍｖａＥポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を含有する。
一態様では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産する際には、分解されていない又は分解しにくいｍｖａＥタンパク質を使用することができる。使用することのできる、分解されていない又は分解しにくいｍｖａＥ遺伝子産物の例としては、限定するものではないが、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）及びＬ．グレイ（L. grayi）に由来するものが挙げられる。当業者は、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）においてｍｖａＥタンパク質を発現させ、任意の標準的な分子生物学手法により断片が存在していないか調べることができる。例えば、Ｈｉｓ−ｔａｇを利用して精製した後、すなわちメバロン酸、イソプレン又イソプレノイドを生産する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１において発現させた後、本明細書に記載の検出法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをＳａｆｅｓｔａｉｎで染色することにより、断片が存在していないことを確認することができる。
Ｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２，Ａｐｒｉｌ；１８４（８）：２１１６〜２１２２）に記載のものなどの標準法を使用して、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性並びにＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を測定することにより、ポリペプチドがｍｖａＥ活性を有しているか評価することができる。代表的なアッセイでは、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性は、アセトアセチルＣｏＡの形成又はリオリシスに伴う吸光度の変化を分光光度計により３０２ｎｍにて監視することで測定できる。アセトアセチルＣｏＡ合成を判定するための各反応に関する標準的なアッセイ条件は、１ｍＭのアセチルＣｏＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリス（ｐＨ １０．５）というものであり、反応は酵素の添加により開始される。アッセイは最終用量２００μｌで実施できる。アッセイに関し、１酵素単位（ｅｕ）は、１分間で１μｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡを合成又はチオリシスすることを意味する。他の代表的なアッセイでは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、分光光度計により、３４０ｎｍでのＮＡＤＰ（Ｈ）の出現又は消失をもとに監視することもできる。ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロン酸への還元的脱アシル化について測定した各反応の標準的なアッセイ条件は、０．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、１．０ｍＭの（Ｒ，Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡ、１００ｍＭのＫＣｌ及び１００ｍＭのＫｘＰＯ４（ｐＨ ６．５）というものである。アッセイは最終用量２００μｌで実施する。反応は酵素の添加により開始される。アッセイに関し、１ｅｕは、１分間で１μｍｏｌのＮＡＤＰ（Ｈ）が代謝回転されることを意味する。これは、０．５μｍｏｌのＨＭＧ−ＣｏＡ又はメバロン酸が代謝回転することに相当する。
あるいは、細胞（細菌細胞など）におけるメバロン酸の生産量は、限定するものではないが、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開番号第２００５／０２８７６５５（Ａ１）号を参照されたい）又はＨＰＬＣ（米国特許出願第１２／９７８，３２４号を参照されたい）で測定することができる。代表的なアッセイの際には、１種以上の抗生物質を添加したＬＢブロスを含有させた振とうチューブに培養物を接種し、３４℃にて、２５０ｒｐｍで１４時間インキュベートする。次に、１％グルコース、０．１％酵母エキス及び２００μＭのＩＰＴＧを添加したＴＭ３培地を入れたウェルプレート中で、最終的なＯＤが０．２になるよう培養物を希釈する。次に、プレートを、Ｂｒｅａｔｈ Ｅａｓｉｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。次に各培養物１ｍＬを３，０００×ｇで５分遠心分離する。次に、上清に２０％硫酸を添加し、氷上で５分インキュベートする。次に、混合物を３０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収する。メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定する。更に、当該技術分野において既知の任意の手法によりグルコースオキシダーゼアッセイを実施し、グルコース濃度を測定する。ＨＰＬＣを使用し、各試料により得られた屈折率を、濃度既知の各種メバロン酸溶液のＨＰＬＣをもとに作成した検量線に対し比較して、メバロン酸濃度を定量することができる。
ｍｖａＥ核酸の例としては、ｍｖａＥポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ｍｖａＥポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。ｍｖａＥ核酸の例としては、例えば、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２及び／又はエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）から単離したｍｖａＥ核酸が挙げられる。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号１に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％配列同一性を有し得る。他の態様では、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号１に対し、８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号３に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。他の態様では、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号３に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２ ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号５に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。他の態様では、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２ ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号５に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号７に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。他の態様では、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号７に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。本明細書における任意の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、配列番号１〜８のうちのいずれか１つと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有する核酸によりコードされ得る。本明細書における任意の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、配列番号１〜８のうちのいずれか１つを有する核酸によりコードされ得る。
ｍｖａＥポリペプチドの例としては、ｍｖａＥポリペプチドに関する活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ペプチド又は融合ポリペプチド断片が挙げられる。ｍｖａＥポリペプチドの例としては（andinclude）、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体変異体が挙げられる。ｍｖａＥポリペプチドの例としては、例えば、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２及び／又はエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）から単離したｍｖａＥポリペプチドが挙げられる。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号１３に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％配列同一性を有し得る。
他の態様では、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号１３に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号１５に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。他の態様では、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号１５に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２ ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号１１に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。他の態様では、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２ ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号１１に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号１７に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。他の態様では、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥポリペプチドは、配列番号１７に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。本明細書における任意の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、配列番号１１〜１８のうちのいずれか１つと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有するポリペプチドによりコードされ得る。本明細書における任意の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドは、配列番号１１〜１８のうちのいずれか１つを有するポリペプチドによりコードされ得る。
ｍｖａＥ核酸は、細胞（バクテリア細胞など）において、マルチコピープラスミド上で発現させることができる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、ｍｖａＥ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込むこともできる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、ｍｖａＥ核酸の異種発現に際し、核酸の発現は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータのいずれかにより駆動できる。プロモータは、ｍｖａＥ核酸の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
ｍｖａＳポリペプチド及び核酸例
ｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を保有するポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、アセトアセチルＣｏＡを、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を変換させることができる。ｍｖａＳポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにｍｖａＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
変異型ｍｖａＳポリペプチドとしては、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けており、かつｍｖａＳポリペプチド活性（すなわち、アセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する能力）を保持しているものが挙げられる。ｍｖａＳポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することで、分子の官能性を改良することができる。例えば、ｍｖａＳポリペプチドの、基質に対する結合親和性を増加させるアミノ酸置換、あるいはアセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換する能力を改良するアミノ酸置換を、ｍｖａＳポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、ｍｖａＳポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を含有する。
Ｑｕａｎｔ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，１９８９，２６２：１５９〜１６４）に記載のものなどの標準法を使用して、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性を測定することにより、ポリペプチドがｍｖａＳ活性を有するか評価することもできる。代表的なアッセイでは、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性は、３０３ｎｍでの吸光度の変化を監視することにより、エノール形態のアセトアセチルＣｏＡの消失を、分光光度を元に評価することで、検定できる。３０℃下で、５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．２ｍＭのジチオスレイトールを含有する標準的な１ｍｌのアッセイ系に、５ｍＭのアセチルリン酸、１０，Ｍ−アセトアセチル−ＣｏＡ及び５ｕｌ（5ul）の抽出試料を加え、続いてアセチルＣｏＡ（１００ｕＭ）及び１０ユニットのＰＴＡを同時に加えることができる。次に、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性を、アセチルＣｏＡ添加前及び添加後の速度（rate）の差として測定する。使用した条件下（ｐＨ ８．０、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２）での、アセトアセチルＣｏＡの吸収係数は、１２．２×１０３Ｍ−１ ｃｍ−１である。定義によると、１ユニットの酵素活性により、１分当たり１ｕｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡが変換されることになる。
あるいは、細胞（細菌細胞など）におけるメバロン酸の生産量は、限定するものではないが、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開番号第２００５／０２８７６５５（Ａ１）号を参照されたい）又はＨＰＬＣ（米国特許出願第１２／９７８，３２４号を参照されたい）で測定することができる。代表的なアッセイの際には、１種以上の抗生物質を添加したＬＢブロスを含有させた振とうチューブに培養物を接種し、３４℃にて、２５０ｒｐｍで１４時間インキュベートする。次に、１％グルコース、０．１％酵母エキス及び２００μＭのＩＰＴＧを添加したＴＭ３培地を入れたウェルプレート中で、最終的なＯＤが０．２になるよう培養物を希釈する。次に、プレートを、Ｂｒｅａｔｈ Ｅａｓｉｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。次に各培養物１ｍＬを３，０００×ｇで５分遠心分離する。次に、上清に２０％硫酸を添加し、氷上で５分インキュベートする。次に、混合物を３０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収する。メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定する。更に、当該技術分野において既知の任意の手法によりグルコースオキシダーゼアッセイを実施し、グルコース濃度を測定する。ＨＰＬＣを使用し、各試料により得られた屈折率を、濃度既知の各種メバロン酸溶液のＨＰＬＣをもとに作成した検量線に対し比較して、メバロン酸濃度を定量することができる。
ｍｖａＳ核酸の例としては、ｍｖａＳポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ｍｖａＳポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。核酸の例としては、例えば、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２及び／又はエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）から単離したｍｖａＳが挙げられる。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号２に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号２に対しても、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号４に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号４に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２ ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号６に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２ ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号６に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号８に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号８に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。
ｍｖａＳポリペプチドの例としては、ｍｖａＳポリペプチドに関する活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ペプチド又は融合ポリペプチド断片が挙げられる。ｍｖａＳポリペプチドの例としては、天然に生じるポリペプチド、並びに本明細書に記載の任意の生物資源由来のポリペプチド並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体が挙げられる。ｍｖａＳポリペプチドの例としては、例えば、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２及び／又はエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）から単離したｍｖａＳポリペプチドが挙げられる。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１４に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１４に対しても、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１６に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１６に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２ ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１２に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２ ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１２に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１８に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳポリペプチドは、配列番号１８に対し、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％又は８０％配列同一性を有し得る。
ｍｖａＳ核酸は、細胞（バクテリア細胞など）において、マルチコピープラスミド上で発現させることができる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、ｍｖａＳ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込むこともできる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、ｍｖａＳ核酸の異種発現に際し、核酸の発現は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータのいずれかにより駆動できる。プロモータは、ｍｖａＳ核酸の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
アセトアセチルＣｏＡシンターゼのポリペプチドをコードしている核酸
一態様では、本明細書に記載の任意の細胞（細菌細胞など）には、アセトアセチルＣｏＡシンターゼのポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含有させることができる。アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ｎｐｈＴ７としても知られる）は、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有し、かつ２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性は最小限である（例えば、非活性である）酵素をコードしている遺伝子である。例えば、Ｏｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｖｏｌ １０７，Ｎｏ．２５，ｐｐ．１１２６５〜１１２７０（２０１０）を参照されたい。この文献中のｎｐｈＴ７に関する教示は、本開示に明確に組み込まれる。放線菌のストレプトマイセス（Streptomyces）属のＣＬ１９０株に由来するアセトアセチルＣｏＡシンターゼの遺伝子は、日本国特許公開第２００８−６１５０６（Ａ）号及び米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号に記載される。これらの各開示は、参照により本明細書に組み込まれる。アセトアセチルＣｏＡシンターゼも、アセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素として参照され得る。使用することのできる代表的なアセトアセチルＣｏＡシンターゼ（又はアセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素）としては、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ５４０１３１．１が挙げられる。
一態様では、本発明のアセトアセチルＣｏＡシンターゼは、不可逆反応を介し、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡから、アセトアセチルＣｏＡを合成する。アセトアセチルＣｏＡシンターゼを使用してアセチルＣｏＡを生成することで、この作用は不可逆的なものであり、かつアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ酵素の２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する作用は可逆的なものであるという、更なる利点が提供される。
これらを踏まえると、アセトアセチルＣｏＡシンターゼを使用して、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することで、チオラーゼを使用して同様の最終産物を生産した場合と比較して、イソプレンの生産量において有意な向上が得られる。
これに加え、アセトアセチルＣｏＡシンターゼを使用してイソプレンを生成した場合には、アセトアセチルＣｏＡシンターゼが、マロニルＣｏＡの脱炭酸によりマロニルＣｏＡをアセチルＣｏＡへと変換し得るという更なる利点も提供する。したがって、開始基質の貯蔵量は、アセチルＣｏＡの開始量により制限されない。アセトアセチルＣｏＡシンターゼによるアセトアセチルＣｏＡの合成酵素は、開始基質がマロニルＣｏＡのみである場合にのみ引き続き生じ得る。一態様では、開始時のマロニルＣｏＡのプール量は、よりマロニルＣｏＡを有する宿主株を使用することにより増加する。このようなプール量の増加は、天然に生じ得るものであり又は分子操作により設計され得るものである。例えば、Ｆｏｗｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７５，Ｎｏ．１８，ｐｐ．５８３１〜５８３９（２００９）を参照されたい。
本開示に記載の任意の態様又は実施例では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する能力を有する酵素を使用できる。このような酵素の非限定例を本明細書に記載する。本開示に記載の特定の実施形態では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する能力を有する放線菌のストレプトマイセス属から誘導されるアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子を使用できる。
このようなアセトアセチルＣｏＡシンターゼの遺伝子の一例としては、配列番号１９のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている遺伝子が挙げられる。このような、配列番号１９のアミノ酸配列を有するタンパク質は、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有し、２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性は有さないアセトアセチルＣｏＡシンターゼに相当する。
一実施形態では、配列番号１９のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている遺伝子は、放線菌のストレプトマイセス種（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株から得られるゲノムＤＮＡをテンプレートとして、これと、日本国特許公開第２００８−６１５０６（Ａ）号を参照して設計することのできるプレマー対と、を使用して核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ）により得ることができる。
本明細書に記載するとき、本発明での使用に関し、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、ストレプトマイセス種（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株の放線菌に由来する配列番号１９のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている遺伝子に限定されない。
マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することができかつ２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することはできないタンパク質をコードしている任意の遺伝子を本発明に記載の方法に使用することができる。特定の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、配列番号１９のアミノ酸配列と類似性が高く又は実質的に同一であるアミノ酸配列を有しかつマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードしている遺伝子であり得る。表現「類似性の高い」又は「実質的に同一」は、例えば、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、及び少なくとも約９９%同一であることを意味する。上記で使用した通り、同一度の値は、異なるアミノ酸配列及び配列番号１９のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基間の同一度（％）に相当するものであり、配列類似性について検索するためのプログラムを使用し、配列番号１９のアミノ酸配列と、異なるアミノ酸配列とを整列させることで算出される。
他の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入により、配列番号１９のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有しかつマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードしている遺伝子であってよい。本明細書において、表現「１つ以上のアミノ酸（more amino acids）」は、例えば、２〜３０個のアミノ酸、好ましくは２〜２０個のアミノ酸、より好ましくは２〜１０個のアミノ酸及び最も好ましくは２〜５個のアミノ酸を指す。
更に他の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、厳密な条件下で配列番号１９のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列と相補的であり、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを一部又は完全に加水分解することのできる、並びにマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードすることのできる、ポリヌクレオチドからなる場合がある。本明細書において、厳密な条件下でのハイブリダイゼーションは、６０℃で２回ＳＳＣで洗浄するという条件下で結合を維持させることに相当する。ハイブリダイゼーションは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）に記載の手法などの、既知の従来法により実施することができる。
本明細書に記載されるとおり、配列番号１９のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルＣｏＡシンターゼをコードしている遺伝子は、任意の生物から単離できる可能性があり、例えば、ストレプトマイセス種（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株ではない放線菌から得ることもできる。加えて、本明細書で用いるアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、配列番号１９のアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドを、当該技術分野において既知の手法により改変することで得ることもできる。ヌクレオチド配列への変異導入は、Ｋｕｎｋｅｌ法又はｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法あるいはこれらのいずれかに類似の手法などの既知の手法により実施することができる。例えば、変異導入は、部位特異的変異導入については、変異導入キット（例えば、製品名；Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ及びＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ））及び製品名ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズのキット（タカラバイオ）などを使用することで実施できる。
配列番号１９のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルＣｏＡシンターゼの活性は、以下に記載のとおりに評価することができる。具体的には、評価されることになるタンパク質をコードしている遺伝子は、遺伝子を細胞中で発現させ、続いてクロマトグラフィーなどの手法によりタンパク質を精製することができるような様式で、まずは宿主細胞に導入される。得られた評価すべきタンパク質を含有させた緩衝液に、基質としてマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡを加え、続いて例えば、所望の温度（例えば、１０℃〜６０℃）でインキュベートする。反応の完了後、基質の減少量及び／又は生成物量（アセトアセチルＣｏＡ）を測定する。したがって、試験したタンパク質がマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するか評価すること、並びに合成度を評価することができる。このような場合では、このタンパク質が、２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有しているか否かは、得られた評価すべきタンパク質を含有させた緩衝液に、アセチルＣｏＡのみを基質として加え、基質の減少量及び／又は同様の方法において生産された生産物量を測定することにより、試験することができる。
宿主細胞例
当業者であれば、具体的な宿主株における遺伝子発現を最適化する特定の配列を含有するよう、発現ベクターが設計されることを認識するであろう。このような最適化配列としては、限定するものではないが、複製起点、プロモータ、及びエンハンサーが挙げられる。本明細書で参照するベクター及び配列は例示目的で記載され、本発明の範囲を狭めることを意味するものではない。
メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイド（例えば、クエン酸シンターゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸酵素、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、マグネシウム欠乏時にＲｓｓＢ活性を阻害するタンパク質、多剤排出ポンプａｃｒＡＢ−ＴｏｌＣ及び／又はＦＮＲのａｃｒＡ成分）の生産量を増加させる際に、遺伝子の異種発現に使用することのできる任意の微生物又はそれらの子孫微生物を使用して、本明細書に記載の任意の遺伝子を調節することができる。同様に、遺伝子の異種発現に使用することのできる任意の微生物又はそれらの子孫微生物を使用して、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現させることができる。一部の態様では、遺伝子の異種発現に使用することのできる任意の微生物又はそれらの子孫微生物を使用して、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）、及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）などのｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子）を発現させることができる。グラム陽性又はグラム陰性細菌などの細菌細胞を使用して、上記のＭＶＡ経路上流の任意の遺伝子（ｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子など）を発現させることもできる。詳細には、ＭＶＡ経路上流の遺伝子（ｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子など）は、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞のうちの任意のもので発現させることができる。一部の態様では、宿主細胞は、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）又はラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）などのラクトバチルス菌種（Lactobacilis spp.）であり得る。
本発明の組成物及び方法には、数多くの種類の嫌気生細胞を宿主細胞として使用することができる。本発明の一態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に関し記載される細胞は、絶対嫌気性細胞及びその子孫細胞である。絶対嫌気性菌は、典型的には、条件下に酸素が存在する場合には良好に増殖しない。絶対嫌気性菌が低濃度の酸素に対しある程度の耐性を示す場合には、少量の酸素が存在してもよいことは理解されるであろう。
一態様では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産するよう遺伝子操作を行った絶対嫌気性菌を、本明細書に記載のいずれかの方法及び／又は組成物用の宿主細胞として提供し、実質的に無酸素条件下で増殖させることができる。この場合、存在する酸素量は嫌気性菌の増殖、維持、及び／又は発酵に有害なものではない。
本発明の他の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法のいずれかにおいて記載され及び／又は使用される宿主細胞は、通性嫌気性細胞及びその子孫細胞である。酸素が存在する場合、通性嫌気性菌は、好気呼吸により（例えば、ＴＣＡサイクルを利用するなどして）細胞ＡＴＰを生成し得る。しかしながら、通性嫌気性菌も、酸素の非存在下で増殖させることができる。絶対嫌気性菌とは対照的に、通性嫌気性菌はより多量の酸素の存在下で死滅し、又は増殖性が乏しくなる。したがって、一態様では、通性嫌気性菌は、本明細書で提供される組成物及び／又は方法のいずれかにおいて、宿主細胞として使用でき、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生成するよう遺伝子操作を行うことができる。通性嫌気性の宿主細胞は、実質的に無酸素（存在する酸素量が、増殖、嫌気性菌の維持、及び／又は発酵に有害なものではないことを意味する）条件下で増殖させることができ、あるいは酸素がより多量に存在している場合にも増殖することができる。
宿主細胞は、糸状真菌細胞及びその子孫細胞であってもよい。（例えば、Ｂｅｒｋａ ＆ Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ，（１９８９），７（２）：１２７〜１５４を参照されたい）。一部の態様では、糸状菌細胞はトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、Ｔ．ビリデ（T. viride）、Ｔ．コニンギ（T. koningii）、Ｔ．ハルジアナム（T. harzianum）、ペニシリウム属（Penicillium sp）、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ヒュミコラ・ラヌギノス（H. lanuginose）、Ｈ．グリセア（H. grisea）、クリソスポリウム属（Chrysosporium sp.）、Ｃ．ラックノウエンス（C. lucknowense）、グリオクラジウム属（Gliocladium sp.）、アスペルギルス属（Aspergillus sp.）（例えば、Ａ．オリゼ（A. oryzae）、Ａ．ニガー（A. niger）、ショウユコウジカビ（A sojae）、Ａ．ジャポニクス（A. japonicus）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）、又はアワモリコウジカビ（A. awamori））、フザリウム属（Fusarium sp.）（例えば、Ｆ．ロゼウム（F. roseum）、Ｆ．グラミニウム（F. graminum）、Ｆ．セレアリス（F. cerealis）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporuim）、又はＦ．ベネナタム（F. venenatum））、ニューロスポラ属（Neurospora sp.）（例えば、Ｎ．クラッサ（N. crassa））、ヒポクレア属（Hypocrea sp.）、ムコール属（Mucor sp.）（例えば、Ｍ．ミエヘイ（M. miehei））、リゾプス属（Rhizopus sp.）又はエメリセラ属（Emericella sp.）のいずれか由来のものであってよい。一部の態様では、真菌は、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）、アワモリコウジカビ（A. awamori）、Ａ．オリゼ（A. oryzae）、Ａ．アクレタス（A. aculeatus）、Ａ．ニガー（A. niger）、Ａ．ジャポニクス（A. japonicus）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）、Ｔ．ビリデ（T. viride）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）又はＦ．ソラニ（F. solani）である。特定の実施形態では、本明細書で使用するためのプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。
宿主細胞は、サッカロマイセス属（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）、又はカンジダ属（Candida sp.）などの酵母であってもよい。一部の態様では、サッカロマイセス属（Saccharomyces sp.）は、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，（１９９２），８（６）：４２３〜４８８を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で使用するプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許第７，６５９，０９７号、及び米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。
宿主細胞は、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類などの藻類であってもよい。（例えば、Ｓａｕｎｄｅｒｓ及びＷａｒｍｂｒｏｄｔ、「藻類及び酵母などの菌類における遺伝子発現（Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast）」（１９９３年），Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤを参照されたい）。
特定の実施形態では、本明細書で使用するためのプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。一部の態様では、宿主細胞は、形態学に基づき次の群：クロオコッカス目（Chroococcales）、プレウロカプサ目（Pleurocapsales）、ユレモ目（Oscillatoriales）、ネンジュモ目（Nostocales）、又はスティゴネマ目（Stigonematales）（例えば、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，（２０１０）１２（１）：７０〜７９を参照されたい）のいずれかに分類されるラン藻などの、ラン藻である。特定の実施形態では、本明細書で使用するプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１０／０２９７７４９号、同第２００９／０２８２５４５号、及び国際公開第２０１１／０３４８６３号に記載のものが包含される。
メバロン酸生成に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作した大腸菌（E. coli）宿主細胞を使用して、本明細書に記載のＭＶＡ経路上流の任意のポリペプチドなどの、ＭＶＡ経路上流の１種以上のポリペプチドを発現させることができる。一部の態様では、本明細書に記載の組成物及び方法において、大腸菌（E. coli）宿主細胞を使用して、１種以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）を発現させることができる。一態様では、宿主細胞は、メバロン酸を生産することができ、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド）をコードしている１つ以上の核酸を発現する大腸菌（E. coli）組み換え細胞株又はそれらの子孫細胞である。大腸菌（E. coli）宿主細胞（本明細書に記載のとおりにメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作された細胞など）は、ＭＶＡ経路上流（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド）のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞を上回る量、ピーク力価及び細胞生産性でメバロン酸を生産する能力を有する。加えて、大腸菌（E. coli）において異種発現させる、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、染色体のコピーであってよい（例えば、大腸菌（E. coli）染色体に組み込まれる）。他の態様では、大腸菌（E. coli）において異種発現させる、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている１つ以上の核酸は、染色体のコピーであってよい（例えば、大腸菌（E. coli）染色体に組み込まれている）。他の態様では、大腸菌（E. coli）細胞は培養物である。
細胞培養培地例
本明細書で使用するとき、用語「最少培地（minimal medium又はminimal media）」は、概して細胞増殖に必要とされる最低限の栄養素を含有している増殖培地を指すが、常に１種以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種以上のアミノ酸）が存在していないわけではない。最少培地は、典型的には、（１）微生物（例えば、細菌細胞）の生育用の炭素源、（２）微生物（例えば、細菌）種及び生育間で変更させ得る各種塩類、及び（３）水、を含有する。炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、他のバイオマスのより複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選択するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の増殖を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選択するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
宿主細胞を培養するにあたり、任意の最少培地処方を使用することができる。最少培地の処方例としては、例えば、Ｍ９最少培地及びＴＭ３最少培地が挙げられる。Ｍ９最少培地は、１Ｌにつき（１）２００ｍｌの滅菌Ｍ９塩類（１Ｌ当たり６４ｇのＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、１５ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのＮａＣｌ及び５．０ｇのＮＨ４Ｃｌ）；（２）２ｍＬの１ＭのＭｇＳＯ４（滅菌）；（３）２０ｍＬの２０％（ｗ／ｖ）グルコース（又は他の炭素源）；及び（４）１００μｌの１ＭのＣａＣｌ２（滅菌）を含有する。
ＴＭ３最少培地は、１Ｌ中に（１）Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ）；（２）ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）；（３）ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）；（４）クエン酸一水和物（２ｇ）；（５）クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）；（６）（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ）；（７）酵母エキス（０．２ｇ）；及び（８）１０００×微量元素溶液（１ｍＬ）を含有する。ｐＨは約６．８に調整し、溶液は濾過滅菌する。１０００×微量元素は、１Ｌ中に（１）のクエン酸一水和物（４０ｇ）；（２）ＭｎＳＯ４ ＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）；（３）ＮａＣｌ（１０ｇ）；（４）ＦｅＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（４）ＣｏＣｌ２ ＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（５）ＺｎＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（６）ＣｕＳＯ４ ＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）；（７）Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）；及び（８）ＮａＭｏＯ４ ＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）を含有する。ｐＨは約３．０に調節する。
その他の最小培地の例は、（１）リン酸カリウムＫ２ＨＰＯ４、（２）硫酸マグネシウムＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ、（３）クエン酸一水和物Ｃ６Ｈ８Ｏ７ ＊Ｈ２Ｏ、（４）クエン酸鉄アンモニウムＮＨ４ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ７、（５）酵母エキス（ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ）、（６）１０００×改変微量金属溶液、（７）硫酸５０％（ｗ／ｖ）、（８）ｆｏａｍｂｌａｓｔ ８８２（Ｅｍｅｒａｌｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）及び（９）微量塩溶液を３．３６ｍｌ含有する。成分のすべてを一緒に加え、脱イオン水に溶解させ、次に加熱滅菌する。続いて室温に冷却し、水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調節し、用量に調整する。滅菌後にビタミン溶液及びスペクチノマイシンを加え、ｐＨを調整する。
宿主細胞を培養するにあたり任意の炭素源を使用することができる。用語「炭素源」は、宿主細胞又は微生物により代謝させることのできる、１つ以上の炭素を含有している化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するにあたり使用される細胞培地には、宿主細胞の生存能を維持させる又は宿主細胞を増殖させるのに好適な任意の炭素源を包含させることができる。一部の態様では、炭素源は炭水化物（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、又は多糖など）、又は転化糖（例えば、酵素により処理したスクロースシロップ）である。
一部の態様では、炭素源としては、酵母エキス又は酵母エキスの１つ以上の成分が挙げられる。一部の態様では、酵母エキスの濃度は、酵母エキスの０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）、又は０．０１％（重量／体積）である。一部の態様では、炭素源には、酵母エキス（又は酵母エキスの１つ以上の成分）及び他の炭素源、例えばグルコースの両方を含む。
単糖の例としては、グルコース及びフルクトースが挙げられ、オリゴ糖の一例としては、ラクトース及びスクロースが挙げられ、並びに多糖の例としては、デンプン及びセルロースが挙げられる。炭水化物の例としては、Ｃ６糖（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、又はグルコース）及びＣ５糖（例えば、キシロース又はアラビノース）が挙げられる。
細胞培養条件例
本発明の組み換え細胞を維持し及び生育させるのに好適な材料及び方法は、以下、例えば、実施例の節に記載される。細胞（例えば、細菌）培養物の維持及び生育に好適な他の材料及び方法は当該技術分野において周知である。例示的な手法としては、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（同第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国特許出願第２０１０／０００３７１６号、Ｇｅｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，編の一般細菌学に関係する手法についてのマニュアル）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）又はＢｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：テキスト「工業微生物学（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）が挙げられる。一部の態様では、細胞は、宿主細胞に挿入する核酸にコードされた、イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路（例えば、ＤＸＳ）、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路（例えば、限定するものではないが、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳ）又はＰＧＬ、のポリペプチドのうちの、１種以上を発現させる条件下で、培地中で培養される。
細胞を培養するにあたり、標準的な細胞培養条件を使用することができる（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号及び該当特許中に引用される参考文献を参照されたい）。一部の態様では、細胞は適切な温度、気体混合物、及びｐＨ（例えば、約２０℃〜約３７℃、約６％〜約８４％のＣＯ２、及び約５〜約９のｐＨ）にて増殖及び維持される。
一部の態様では、細胞は適切な細胞培地中で３５℃で増殖する。一部の態様では、発酵の際のｐＨ範囲は約ｐＨ ５．０〜約ｐＨ ９．０（例えば、約ｐＨ ６．０〜約ｐＨ ８．０、又は約６．５〜約７．０）である。細胞は、宿主細胞に必要とされる条件に基づき、好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で生育させることができる。加えて、細胞を培養するにあたり、より特異的な細胞培養条件を使用することができる。例えば一部の実施形態では、細胞（例えば、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞）に、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている１つ以上の異種核酸を、高発現型プロモータの調節下の低〜中間コピー数のプラスミドにおいて発現させ、３４℃にて培養する。
使用することのできる標準的な培養条件、並びにバッチ式、フェドバッチ式、又は連続式発酵などの発酵様式は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に記載されている。回分式発酵及び流加式発酵は一般的かつ当該技術分野では周知のものであり、その例は、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．に見ることができる。
一部の態様では、細胞はグルコース制限条件下で培養される。「グルコース制限条件」は、添加されるグルコースの量が、細胞により消費されるグルコース量の約１０５％以下（例えば、約１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％）であることを意味する。特定の態様では、培養培地に添加されるグルコース量は、特定の期間中に細胞により消費されるグルコース量とほぼ同様である。一部の態様では、細胞の増殖速度は、細胞培地中のグルコースの量により維持することのできる速度で細胞が増殖するよう、添加するグルコース量を制限することで制御される。一部の態様では、グルコースは細胞培養時に蓄積しない。様々な態様で、細胞はグルコース制限条件下で、約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、又は７０時間以上培養される。様々な態様で、細胞は、細胞を培養する合計時間の長さの約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は１００％以上の時間にわたって、グルコース制限条件下で培養される。任意の特定の理論に束縛されることを意図するものではないが、グルコース制限条件は、細胞をより都合よく制御し得るものであると考えられる。
一部の態様では、細胞（細菌細胞など）は回分式培養で生育させる。細胞（細菌細胞など）は、流加式培養又は連続式培養により生育させることもできる。加えて、細胞（細菌細胞など）は、限定するものではないが、上記のいずれかの最少培地などの最少培地で培養することができる。最少培地には、更に１．０％（重量／体積）グルコース又は任意の他の６単糖以下の糖などを添加してもよい。具体的には、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）、又は０．１％（重量／体積）のグルコースが添加される。加えて、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキスを添加してもよい。具体的には、最少培地には０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスを添加してもよい。あるいは、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）又は０．１％（重量／体積）のグルコース及び０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスを添加してもよい。
メバロン酸の生産量を増加させることのできる組み換え細胞
本明細書に記載の組み換え微生物（例えば、組み換え細菌細胞）は、明細書に記載の各種酵素経路に対し何ら操作を施していない同様の細胞を上回る量及び／又は濃度でメバロン酸を生産する能力を有する。メバロン酸の生産には、メバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう本明細書に記載の各種経路を調節する遺伝子操作を施した組み換え微生物（例えば、細菌細胞）を使用することができる。遺伝子操作を施したこれらの細胞には、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている異種核酸を１種以上含有させることもできる。一部の態様では、細胞には、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている１つ以上の異種核酸を含有させることができる。一態様では、本明細書に記載の組み換え細胞（細菌細胞など）は、メバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作を施していない同様の細胞を上回る濃度でメバロン酸を生産する能力を有する。他の態様では、本明細書に記載の組み換え細胞は、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まずかつより多量の炭素がメバロン酸の生産に取り込まれるよう遺伝子操作を受けていない同様の細胞を上回る濃度でメバロン酸を生産する能力を有する。一態様では、本明細書で開示される任意の細胞は、最少培地で培養することができる。一部の場合では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）をコードしている異種核酸の１つ以上のコピーは、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。細胞（細菌細胞など）は約８５ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ超のメバロン酸を生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、約３０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、４０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、５０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、６０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、７０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、８０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、９０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１００ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１１０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１２０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１３０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１４０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１５０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１６０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１７０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１８０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１９０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ又は２００ ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ超で、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値で、メバロン酸を生産し得る。
本明細書に記載の宿主細胞（細菌細胞など）には、ＭＶＡ経路に取り込まれる炭素量を増加させかつ同様の遺伝子操作を施していない細胞と比較して、より高いピーク力価でメバロン酸を生産させることのできる１つ以上の変異を有するよう遺伝子操作を施す。加えて、本明細書に記載の細胞は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも高いピーク力価でメバロン酸を生産する。他の態様では、本明細書に記載の細胞（細菌細胞など）は、最少培地で培養した場合に、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも高いピーク力価でメバロン酸を生産する。細胞（細菌細胞など）は、４８時間にわたる発酵後に、約１０５ｇ／Ｌのピーク力価でメバロン酸を生産し得る。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、４８時間の発酵後に、約５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２１０ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２３０ｇ／Ｌ、２４０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、２６０ｇ／Ｌ、２７０ｇ／Ｌ、２８０ｇ／Ｌ、２９０ｇ／Ｌ、３００ ｇ／Ｌ超のピーク力価で、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値のピーク力価で、メバロン酸を生産し得る。
本明細書に記載の宿主細胞（細菌細胞など）には、ＭＶＡ経路に取り込まれる炭素量を増加させかつ同様の遺伝子操作を施していない細胞と比較して、メバロン酸に関しより高い細胞生産性指数（ＣＰＩ）をもたらす１つ以上の変異（mutation）を有するよう遺伝子操作を施す。加えて、本明細書に記載の細胞は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも高いＣＰＩを有する。
他の態様では、本明細書に記載の細胞（細菌細胞など）は、最少培地で培養した場合に、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも高いＣＰＩを有する。一態様では、細胞は、最少培地で培養できる。細胞（細菌細胞など）は、メバロン酸に関し少なくとも約４．５（ｇ／ｇ）のＣＰＩを有し得る。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、メバロン酸に関し少なくとも約１（ｇ／ｇ）、２（ｇ／ｇ）、３（ｇ／ｇ）、４（ｇ／ｇ）、５（ｇ／ｇ）、６（ｇ／ｇ）、７（ｇ／ｇ）、８（ｇ／ｇ）、９（ｇ／ｇ）、１０（ｇ／ｇ）、１１（ｇ／ｇ）、１２（ｇ／ｇ）、１３（ｇ／ｇ）、１４（ｇ／ｇ）、１５（ｇ／ｇ）、２０（ｇ／ｇ）、２５（ｇ／ｇ）又は３０（ｇ／ｇ）のＣＰＩ並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値のＣＰＩを有し得る。
本明細書に記載の宿主細胞（細菌細胞など）には、ＭＶＡ経路に取り込まれる炭素量を増加させかつ同様の遺伝子操作を施していない細胞と比較して、メバロン酸に関しより高い質量収率（mass yield）をもたらす１つ以上の変異を有するよう遺伝子操作を施す。加えて、本明細書に記載の細胞は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも高い質量収率でグルコースからのメバロン酸を生産する。他の態様では、本明細書に記載の細胞（細菌細胞など）は、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも、グルコースからのメバロン酸の質量収率が高い。一態様では、細胞は、最少培地で培養できる。細胞（細菌細胞など）は、少なくとも約３８％の質量収率でグルコースからメバロン酸を生産できる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、少なくとも約２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％又は５５％並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値の質量収率でグルコースからメバロン酸を生産できる。
組み換え細胞（例えば、組み換え細菌細胞）を使用してメバロン酸を多量に生産する方法
本明細書では、メバロン酸の生産方法も提供する。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、（ａ）本明細書に記載のとおりにメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された組み換え細胞（上記の細菌細胞などの任意の細胞）、又はメバロン酸を生産できるそれらの子孫細胞を含む、組成物を培養する工程並びに（ｂ）メバロン酸を生産する工程、を包含する。一部の態様では、メバロン酸を生産させる方法は、メバロン酸の生産に好適な条件下で、本明細書に記載の任意の組み換え細胞を培養する工程、並びに組み換え細胞にメバロン酸を生産させる工程、を含む。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
メバロン酸の生産方法は、（ａ）ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現している細胞を培養する工程、並びに（ｂ）メバロン酸を生産させる工程も含んでよい。他の態様では、メバロン酸の生産方法は、（ａ）ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子）を内因的には有さず、ｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）、及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現する細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞など）を、最少培地で培養する工程、並びに（ｂ）メバロン酸を生産させる工程、を含んでもよい。加えて、細胞は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている異種遺伝子の１つ以上のコピーを含まずかつより多量の炭素がメバロン酸の生産に取り込まれるよう遺伝子操作を受けていない同様の細胞よりも高濃度で、メバロン酸を生産できる。他の態様では、細胞（細菌細胞など）は、細胞を最少培地で培養した場合に、ｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている異種遺伝子の１つ以上のコピーを含まない同様の細胞よりも高濃度でメバロン酸を生産できる。一部の場合では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーは、宿主細胞の染色体に組み込まれている異種核酸である。一態様では、ｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている異種核酸の１つ以上のコピーは、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。
メバロン酸の生産にあたり、本開示の方法では、約８５ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ超でメバロン酸を生産できる。あるいは、メバロン酸は、約３０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、４０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、５０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、６０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、７０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、８０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、９０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１００ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１１０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１２０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１３０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１４０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１５０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１６０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１７０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１８０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１９０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ又は２００ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ超のメバロン酸で、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値で、生産させることができる。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
メバロン酸の生産方法は、同様に、（ａ）本明細書に記載のとおりにメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されており、のＭＶＡ経路上流の１種以上のポリペプチドをコードしているＭＶＡ経路上流の遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現する細胞を、培養する工程、並びに（ｂ）メバロン酸を生産させる工程、を含んでもよく、本方法の細胞は、ＭＶＡ経路上流の１種以上のポリペプチドをコードしているＭＶＡ経路上流の遺伝子の１つ以上のコピーを含まずかつメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作を受けていない同様の細胞と比較して、発酵開始から４８時間後のピーク力価が高い。他の態様では、メバロン酸の生産方法は、同様に、（ａ）本明細書に記載の通りにメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されており、ｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来）を内因的に有さず、ｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のものなど）をコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現している細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞）を、最少培地で培養する工程、並びに（ｂ）メバロン酸を生産させる工程、を含んでもよく、本方法の細胞は、ｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている異種遺伝子の１つ以上のコピーを含まずかつメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作を受けていない同様の細胞と比較して、最少培地で培養した場合に発酵開始から４８時間後のピーク力価が高い。
メバロン酸生産にあたり、本開示の方法では、発酵開始後４８時間で約１０５ｇ／Ｌを超えるピーク力価でメバロン酸を生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、４８時間の発酵後に、約５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ又は２００ｇ／Ｌ超のピーク力価で、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値のピーク力価で、メバロン酸を生産し得る。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
メバロン酸の生産方法は、同様に、（ａ）本明細書に記載のとおりにメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されており、ＭＶＡ経路上流の１種以上のポリペプチドをコードしているＭＶＡ経路上流の遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現する細胞を、培養する工程、並びに（ｂ）メバロン酸を生産させる工程、を含んでもよく、ＭＶＡ経路上流の１種以上のポリペプチドをコードしているＭＶＡ経路上流の遺伝子の１つ以上のコピーを含まずかつメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作を受けていない同様の細胞と比較して、本方法の細胞は、メバロン酸のＣＰＩが高い。他の態様では、メバロン酸の生産方法は、同様に、（ａ）本明細書に記載のとおりに炭素の取り込みを増加させるよう遺伝子操作され、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子など）を内因的には有さず、ｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現している細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞）を、最少培地で培養する工程、並びに（ｂ）メバロン酸を生産させる工程、を含んでもよく、本方法の細胞は、ｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている異種遺伝子の１つ以上のコピーを含まずかつメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作を受けていない同様の細胞と比較して、細胞を最少培地で培養した場合のメバロン酸のＣＰＩが高い。
メバロン酸生産に関する本方法は、メバロン酸のＣＰＩが少なくとも４．５（ｇ／ｇ）である細胞を使用することによりメバロン酸を生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、少なくとも約１（ｇ／ｇ）、２（ｇ／ｇ）、３（ｇ／ｇ）、４（ｇ／ｇ）、５（ｇ／ｇ）、６（ｇ／ｇ）、７（ｇ／ｇ）、８（ｇ／ｇ）、９（ｇ／ｇ）、１０（ｇ／ｇ）、１１（ｇ／ｇ）、１２（ｇ／ｇ）、１３（ｇ／ｇ）、１４（ｇ／ｇ）、１５（ｇ／ｇ）、２０（ｇ／ｇ）、２５（ｇ／ｇ）又は３０（ｇ／ｇ）のＣＰＩ並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値のＣＰＩを有し得る。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
本明細書では、メバロン酸の生産量を増加させるために上記の任意の細胞を使用する方法を提供する。細胞によるメバロン酸の生産量は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチドなどのｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド）をコードしている１つ以上の異種核酸を発現させることにより増加させることができる。メバロン酸の生産量は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）をコードしている１つ以上の異種核酸を発現しておらずかつＭＶＡ生成に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞によりメバロン酸を生産させた場合と比較して、約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍又は約５０〜約２００倍）に増加させることができる。
本開示の任意の方法による、細胞によるメバロン酸の生産量は増加させることができる（例えば、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現させることで増加させることができる）。一部の態様では、本開示の任意の方法による、細胞によるメバロン酸生産量は増加させることができる（例えば、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている１つ以上の異種核酸の発現を増加させることにより）。メバロン酸の生産量は、天然に生じる細胞（例えば、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド、例えば、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている１つ以上の異種核酸を発現していない細胞）によりメバロン酸を生産させた場合と比較して、約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍又は約５０〜約２００倍）に増加させることができる。
メバロン酸の生産量は、天然に生じる細胞により、あるいはＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどのｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド）をコードしている１つ以上の異種核酸を発現しておらずＭＶＡ生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞によりメバロン酸を生産させた場合と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍又は１，０００，０００倍増加させることもできる。
加えて、より具体的な細胞培養条件を使用して、本明細書に記載の方法により細胞を培養することができる。例えば、メバロン酸の生産方法には、（ａ）低〜中間コピー数のプラスミドにおいて高発現型プロモータの調節下で、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現する細胞（本明細書に記載のとおりにメバロン酸生成に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された任意の細胞など）を、最少培地中で３４℃で培養する工程、並びに（ｂ）メバロン酸を生産させる工程、を包含させることができる。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、（ａ）ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子など）を内因的に有さず、ｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを低〜中間コピー数のプラスミドにおいて高発現型プロモータの調節下で発現する細胞（限定するものではないが、大腸菌（E．coli）細胞などの細菌細胞など）を、最少培地中で３４℃で培養する工程、並びに（ｂ）メバロン酸を生産させる工程、を含む。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
イソプレンの生産性を向上させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、多様な用途で使用される重要な有機化合物である。例えば、イソプレンは、合成ゴムの製造時など、数多くの化学組成物及びポリマーの合成時に、中間体又は出発物質として使用される。イソプレンはまた、多くの植物及び動物により天然に合成される重要な生体物質でもある。
イソプレンは、イソプレンシンターゼの触媒作用によりＤＭＡＰＰから製造される。したがって、理論に束縛されるものではないが、上記の任意の組成物及び方法により、細胞（細菌細胞など）におけるメバロン酸生産量を増加させることは、より多量のイソプレンを生産させるのと同様であると考えられる。グルコースからのメバロン酸生産量のモル収率を上昇させ、適切な酵素活性濃度で、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ並びにイソプレン及びイソプレノイド生産に好適な他の酵素と組み合わせると、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイド（イソプレンを含む）のモル収率の上昇につながる。
イソプレンの生産量は、本明細書に記載の任意の組み換え宿主細胞を使用して行うことができ、生産時には、酵素活性が調節されイソプレノイド生産に取り込まれる炭素量が増加するよう、１つ以上の酵素経路が操作されている。本明細書に記載の、メバロン酸生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された各種酵素経路を有する組み換え微生物は、イソプレン生産に使用することができる。上記の、メバロン酸の生産量を増加させることのできる、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（限定するものではないが、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど））をコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを発現している任意の組み換え宿主細胞は、イソプレンの生産量を増加させることもできる。一部の態様では、これらの細胞は、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、及びイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む。ｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子など）を使用する代わりに、任意の既知のＭＶＡ経路ポリペプチド（ＭＶＡ経路上流及び下流）も同様に使用することができる。ＭＶＡ経路ポリペプチドは当業者に周知である。
ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法の任意のものに記載の細胞は、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチドをコードしている核酸を１つ以上更に含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ＭＶＡ経路下流のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。
メバロン酸生合成経路の下流は、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）及びジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）を含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路の下流は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）を更に含む。本明細書に提供される細胞は、イソプレンシンターゼ、ＭＶＡ経路上流の１種以上のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路下流の１種以上のポリペプチドをコードしている核酸を含み得る。ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素、（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換する酵素、のうちの任意の酵素であり得る。本開示における任意の態様では、メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を生成する酵素は、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）・メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択できる。他の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸へとリン酸化する酵素はＭ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼである。
一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。一部の態様では、異種ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のポリペプチドである。
ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸は、細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸は更に、ベクター上に存在させてもよい。
ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの例としては、次の（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）も挙げられる。詳細には、下流のＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ（Methanosarcina）属由来のものであってよく、更に詳細には、下流のＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のものであってよい。他の態様では、下流のＭＶＫポリペプチドは、Ｍ．バートニィ（M. burtonii）由来のものであってよい。
ＭＶＡ経路下流のポリペプチドのその他の例は、米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号に見出すことができ、この内容は、ＭＶＫ経路下流のポリペプチド及びＭＶＫ経路下流のポリペプチド変異体に関し参照によりその全文が明示的に本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の細胞のうち任意のものは、ＩＤＩ核酸（例えば、ＩＤＩをコードしている内在性又は異種核酸）を含み得る。イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼポリペプチド（イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ又はＩＤＩ）は、イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する（例えば、ＩＰＰをＤＭＡＰＰへと変換し及び／又はＤＭＡＰＰをＩＰＰヘと変換する）。ＩＤＩポリペプチドの例としては、ＩＤＩポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを相互変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＩＤＩ核酸の例としては、ＩＤＩポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ＩＤＩポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
特に、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＭＶＡ経路下流の核酸の例としては、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路下流のポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。更に、イソプレンの生産量を増加させるような、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド変異体も、良好に使用することができる。
一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のポリペプチドである。
一部の態様では、前記ＭＶＫは、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces mevalonate）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）・メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。本開示のプロモータのうちのいずれか（例えば、本開示に記載され、本開示の実施例において識別される、誘導型プロモータ及び常時発現型プロモータなどのプロモータ）を使用して、本開示のいずれかのＭＶＡポリペプチドの発現を駆動させることができる。
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている核酸
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載の細胞（本明細書に記載されるとおりに炭素の取り込みを増加させるよう遺伝子操作された宿主細胞など）は、イソプレンシンターゼポリペプチド又はイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、常時発現型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、誘導型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、高発現型プロモータに調節可能なように連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、経路の内在性イソプレンシンターゼポリペプチドを過剰発現するよう遺伝子操作する。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、低発現型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種由来のポリペプチドである。
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、常時発現型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、誘導型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、高発現型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、低発現型プロモータに調節可能なように連結される。
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、更にベクターに組み込むこともできる。
イソプレンシンターゼの核酸の例としては、イソプレンシンターゼポリペプチドの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。イソプレンシンターゼポリペプチドは、ジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。イソプレンシンターゼポリペプチドの例としては、イソプレンシンターゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、並びに融合ポリペプチドが挙げられる。イソプレンシンターゼポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。加えて、イソプレンシンターゼ変異体は、酵素活性が向上しているなどして、活性が向上されていてよい。一部の態様では、イソプレンシンターゼ変異体は、安定性（例えば、熱安定性）が改良されている、及び／又は溶解性が改良されているなどして、その他の特性が改良されている。
インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボで、ポリペプチドがＤＭＡＰＰをイソプレンへと変換する能力を測定して、ポリペプチドがイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するか否かを判定する際には、標準法を使用できる。細胞抽出物中のイソプレンシンターゼポリペプチド活性は、例えば、Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０〜１３０１６，１９９５に記載のとおりに測定することができる。代表的なアッセイでは、ＤＭＡＰＰ（Ｓｉｇｍａ）は窒素流下で濃縮させ、乾燥させ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ８．２）を用い１００ｍＭに再水和し、−２０℃で保存する。アッセイを実施するために、金属製スクリューキャップと、テフロンコーティングのなされたシリコン製隔壁（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを取り付けた２０ｍＬヘッドスペースバイアル内で、５μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ（２５０μｇ／ｍｌ）ＤＭＡＰＰ、６５μＬの植物抽出緩衝液（ＰＥＢ）（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、及び２ｍＭ ＤＴＴ）に、２５μＬ細胞抽出物を加え、振盪させながら３７℃で１５分間培養した。２００μＬの２５０ｍＭ ＥＤＴＡを加えて反応をクエンチさせ、ＧＣ／ＭＳにより定量することができる。
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物のイソプレンシンターゼポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア（Pueraria）に由来するイソプレンシンターゼ又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ハコヤナギ属（Populus）由来のイソプレンシンターゼ又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ポプラ（poplar）のイソプレンシンターゼポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドはクズのイソプレンシンターゼポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種、又はこれらの（変異体（variant）由来のポリペプチドである。
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド又は核酸は、マメ科、例えば、マメ亜科（Faboideae）由来のものである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド又は核酸は、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）（クズ）（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １３７：７００〜７１２，２００５）、プエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ポプラ（ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、コットンウッド（Populus trichocarpa）、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘトレムラ（tremula）（ＣＡＣ３５６９６）（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔａ ２１３：４８３〜４８７，２００１）、アスペン（aspen）（ヤマナラシなど）（Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２７０（２２）：１３０１０〜１３１６，１９９５）、又はヨーロッパナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｒｏｂｕｒ）（Ｚｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際特許出願公開第９８／０２５５０号）に由来するポリペプチド又は核酸である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）、プエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ポプラ・トレムロイド（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、ポプラ・ニグラ（Populus nigra）又はポプラ・トリコカルパ（Populus trichocarpa）由来のイソプレンシンターゼ、又はこれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼであるか、又はこれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）又はこれらの変異体由来のイソプレンシンターゼ）をコードしている核酸は、コドンを最適化されている。
一部の態様では、イソプレンシンターゼ核酸又はポリペプチドは、天然に生じるポリペプチド又は核酸である（例えば、ハコヤナギ属（Populus）から天然に生じるポリペプチド又は核酸）。一部の態様では、イソプレンシンターゼ核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸ではない。一部の態様では、イソプレンシンターゼ核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体である（例えば、ハコヤナギ属（Populus）の野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体）。
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの変異体である。一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼと比較して触媒活性が向上しているなど、活性が向上している。活性（例えば、触媒活性）の向上は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のうちのいずれかの程度であり得る。一部の態様では、触媒活性などの活性の向上は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のいずれかである。一部の態様では、触媒活性などの活性の向上は、約１０％〜約１００倍である（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、又は約５倍〜約２０倍）。一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼと比較して可溶性が向上している。
可溶性の向上は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のうちのいずれかの程度であり得る。可溶性の向上は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のうちのいずれかの程度であり得る。一部の態様では、溶解性の向上は、約１０％〜約１００倍のうちのいずれかの程度であり得る（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、又は約５倍〜約２０倍）。
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、天然型イソプレンシンターゼ変異体であり、かつ天然型イソプレンシンターゼと比較して安定性が向上している（熱安定性など）。
一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの活性の、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％の活性を有する。変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼとの配列類似性を保有し得る。一部の態様では、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼのアミノ酸配列と、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％のうちのいずれかの程度で配列相同性を有する。一部の態様では、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼのアミノ酸配列と、約７０％〜約９９．９％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８５％〜約９７％、又は約９０％〜約９５％のうちのいずれかの程度で配列相同性を有する。
一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼ内に変異を持つ。
一部の態様では、変異体は、少なくとも１箇所にアミノ酸置換、少なくとも１箇所にアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１箇所にアミノ酸欠失を有する。一部の態様では、変異体は、少なくとも１箇所にアミノ酸置換を有する。一部の態様では、変異体と、野生型又は天然型イソプレンシンターゼとの間で異なっているアミノ酸残基の数は、１以上であってよく、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０以上のアミノ酸残基が異なっていてよい。天然型イソプレンシンターゼとしては、植物由来の任意のイソプレンシンターゼを挙げることができ、例えば、クズ（kudzu）イソプレンシンターゼ、ポプラ（poplar）イソプレンシンターゼ、ヨーロッパナラ（English oak）イソプレンシンターゼ、及びヤナギ（willow）イソプレンシンターゼが挙げられる。一部の態様では、変異体は、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼの変異体である。一部の態様では、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼ変異体は、少なくとも一箇所にアミノ酸置換、少なくとも１箇所にアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１箇所にアミノ酸欠失を有する。一部の態様では、変異体は、切断型のウラジロハコヤナギ（Populus alba）イソプレンシンターゼである。一部の態様では、変異体（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼの変異体）をコードしている核酸は、コドンを最適化させたものである（例えば、異種イソプレンシンターゼを発現させる宿主細胞に基づきコドンを最適化している）。他の態様では、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼ変異体は、表２に掲載されるアミノ酸残基において、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸の挿入及び／又は少なくとも１つのアミノ酸の欠失を有する。他の態様では、イソプレンシンターゼの変異体は、表２に掲載されるアミノ酸残基において、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸の欠失及び少なくとも１つのアミノ酸の挿入を含む。表中のアミノ酸残基数は、ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレンシンターゼのアミノ酸残基数に対応する。一態様では、ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレンシンターゼは、切断型イソプレンシンターゼであり、例えば、イソプレンシンターゼ全長からアミノ酸残基１６残基分短いＭＥＡイソプレンシンターゼである。
Figure 2017148063
一実施形態では、ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレンシンターゼＭＥＡは切断型であり、ウラジロハコヤナギ（P. alba）のイソプレンシンターゼの全長よりもアミノ酸残基１６残基分短い。
本開示のイソプレンシンターゼポリペプチドは、国際公開第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／１２４１４６号、米国特許出願第２０１０／００８６９７８号に記載のいずれかのイソプレンシンターゼ又はイソプレンシンターゼ変異体であってよい。これらの文献に記載される、イソプレンシンターゼ及びイソプレンシンターゼ変異体に関係するすべての内容は、参照により本開示に明示的に組み込む。
本開示のプロモータのうちのいずれか（例えば、本開示に記載され、本開示の実施例において定義される、誘導型プロモータ及び常時発現型プロモータなどのプロモータ）を使用して、本開示のいずれかのイソプレンシンターゼの発現を駆動させることができる。
好適なイソプレンシンターゼとしては、限定するものではないが、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０、及びＡＹ１８２２４１として識別されるものが挙げられる。本開示のイソプレンシンターゼをコードしている微生物の製造法を含む組成物又は方法のうちのいずれか１つに使用することのできるイソプレンシンターゼの種類は、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０１３０７７号、同第２０１０／０３１０７９号、同第２０１０／１４８１５０号、同第２０１０／１２４１４６号、同第２０１０／０７８４５７号、及び同第２０１０／１４８２５６号にも記載されている。
ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている核酸
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載の細胞（本明細書に記載されるとおりに炭素の取り込みを増加させるよう遺伝子操作された宿主細胞など）は、ＤＸＳポリペプチド又はＤＸＰ経路の他のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、細胞は更に、ＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、大腸菌（E. coli）細胞は更に、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている核酸を１つ以上含む。一部の態様では、１つの核酸は、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、１つのプラスミドは、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、マルチコピープラスミド（multiple plasmids）は、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。
ＤＸＳポリペプチドの例としては、ＤＸＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸ヘと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＤＸＳポリペプチド及び核酸の例並びにＤＸＳ活性の測定法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドの例としては、限定するものではないが、次の任意のポリペプチド：ＤＸＳポリペプチド、ＤＸＲポリペプチド、ＭＣＴポリペプチド、ＣＭＫポリペプチド、ＭＣＳポリペプチド、ＨＤＳポリペプチド、ＨＤＲポリペプチド、及びＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を１つ、又は２つ以上有するＤＸＰ経路ポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）、が挙げられる。特に、ＤＸＰ経路ポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＤＸＰ経路に関する核酸の例としては、ＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。ＤＸＰ経路のポリペプチド及び核酸の例としては、並びにＤＸＰ経路のポリペプチド活性を測定する方法については、国際公開第２０１０／１４８１５０号に、より詳細に記載されている。
ＤＸＳポリペプチドの例としては、ＤＸＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸ヘと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＤＸＳポリペプチド及び核酸の例並びにＤＸＳ活性の測定法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
特に、ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）ヘと変換する。標準法を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
ＤＸＲポリペプチドは、１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでＤＸＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
ＭＣＴポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）を４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）ヘと変換する。標準法を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＴポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
ＣＭＫポリペプチドは、４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでＣＤＰ−ＭＥを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＣＭＫポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
ＭＣＳポリペプチドは、２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェート（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでＣＤＰ−ＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
ＨＤＳポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートを（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェート（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでＭＥ−ＣＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
ＨＤＲポリペプチドは、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェートをイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでＨＭＢＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
ＭＶＡ経路下流、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ及びＤＸＰ経路のポリペプチドに関する生物資源
イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路及び／又はＭＶＡ経路下流の核酸（及びそれらにコードされるポリペプチド）は、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路及び／又はＭＶＡ経路下流の核酸を天然に含有する任意の生物から得ることができる。イソプレンは、バクテリア、酵母、植物及び動物などの様々な生物により天然に生成される。一部の生物は、イソプレンの生産に関係するＭＶＡ経路を含有する。イソプレンシンターゼの核酸は、例えば、イソプレンシンターゼを含有する任意の生物から得ることができる。
したがってＭＶＡ経路の核酸は、例えば、ＭＶＡ経路を含有する任意の生物から得ることができる。ＩＤＩ及びＤＸＰ経路の核酸は、例えば、ＩＤＩ及びＤＸＰ経路を含有する任意の生物から得ることができる。
イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路の核酸の核酸配列は、細菌、真菌、植物、藻類、又はシアノバクテリアから単離することができる。生物資源の例としては、例えば、酵母、例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）種（例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）、バクテリア、例えば、エシェリキア（Escherichia）種（例えば、大腸菌（E. coli））、又はメタノサルシナ（Methanosarcina）種（例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei））、植物、例えばクズ又はポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、又はウラジロハコヤナギｘヤマナラシＣＡＣ３５６９６（Populus alba x tremula CAC35696））又はアスペン（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））が挙げられる。イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドに関係し、使用することのできる資源例は、同様に、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０１３０７７号、同第２０１０／０３１０７９号、同第２０１０／１４８１５０号、同第２０１０／０７８４５７号、及び同第２０１０／１４８２５６号に記載されている。
一部の態様では、生物資源は酵母であり、例えば、サッカロマイセス属（Saccharomyces sp）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）又はカンジダ属（Candida sp）である。
一部の態様では、宿主細胞は、Ｂ．リケノフォルミス（B. lichenoformis）又は枯草菌（B. subtilis）などのバチルス株、Ｐ．シトレア（P. citrea）などのパントエア（Pantoea）株、Ｐ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）などのシュードモナス属（Pseudomonas）株、Ｓ．リビダンス（S. lividans）又はＳ．ルビギノーサス（S. rubiginosus）などのストレプトマイセス（Streptomyces）株、大腸菌（E. coli）などのエシェリキア（Escherichia）株、エンテロバクター株（Enterobacter）、ストレプトコッカス（Streptococcus）株、又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）などの古細菌株である。
本明細書で使用するとき、「バチルス（Bacillus）」属としては、当業者に既知の「バチルス（Bacillus）属」のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロデュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアグランス（B. coagulans）、Ｂ．サークランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、及びバチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が挙げられる。バチルス属は分類上の再編成を受け続けるものと認識される。したがって、属には、これまでに再分類された種、限定するものではないが、現在では「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）」と命名されているＢ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）などの生物を包含するものと意図される。酸素存在下での、耐久性の高い内生胞子の形成は、バチルス属を定義する特性であると考慮されるものの、この特性は、現在、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、アムピバチルス（Amphibacillus）、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、フィロバチルス（Filobacillus）、グラシリバチルス（Gracilibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、サリバチルス（Salibacillus）、サーモバチルス（Thermobacillus）、ウレイバチルス（Ureibacillus）、及びバルジバチルス（Virgibacillus）と命名されている属にも当てはまる。
一部の態様では、生物資源はグラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトマイセス株（例えば、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、又はＳ．グリセウス（S. griseus））及びバチルス株が挙げられる。一部の態様では、生物資源は、大腸菌（E. coli）又はシュードモナス属（Pseudomonas sp.）などのグラム陰性細菌である。
一部の態様では、微生物源は植物であり、例えば、マメ科（Fabaceae）、例えばマメ亜科（Faboideae）などの植物である。一部の態様では、生物資源はクズ、ポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘトレムラ（tremula）ＣＡＣ３５６９６など）、アスペン（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））、又はヨーロッパナラ（Quercus robur）である。
一部の態様では、微生物源は、藻類、例えば緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ミドリムシ目、クロミスタ、又は渦鞭毛藻類である。
一部の態様では、生物資源は、形態に基づき次の群：クロオコッカス（Chroococcales）、プレウロカプサ（Pleurocapsales）、ユレモ（Oscillatoriales）、ネンジュモ（Nostocales）、又はスティゴネマ（Stigonematales）のいずれかに分類される、ラン藻である。
ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている核酸
本発明の一部の態様では、本開示の組成物又は方法のいずれかに記載の組み換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、又はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドを更に含む。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性の核酸を１つ以上（例えば、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性の核酸の２、３、又は４つ以上のコピー）を使用する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比べ、内在性のホスホケトラーゼポリペプチドが過剰発現するよう遺伝子操作される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。
ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換、並びに／又はフルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。他の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、フルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。したがって、理論に束縛されるものではないが、本明細書で説明されるとおりホスホケトラーゼを発現させることにより、炭水化物資源から生成されるアセチルリン酸量を増加させることができる。
このアセチルリン酸をアセチルＣｏＡへと変換させ、更にこれを利用して、ＭＶＡ経路に関係する酵素活性により、メバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、イソプレン及び／又はイソプレノイドを生成させることができる。したがって、炭水化物基質より生成されるこれらの化合物量を増加させることができる。あるいは、細胞内濃度の上昇という形式で生成性の向上が反映されずとも、アセチル−Ｐ及びＡｃＣｏＡの生成量を増加させることができる。特定の実施形態では、細胞内アセチル−Ｐ又はアセチルＣｏＡ濃度は、ホスホケトラーゼによる反応が生じた場合でさえ変化せず一定であり、又は減少する場合すらある。
ホスホケトラーゼの核酸の例としては、ホスホケトラーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ホスホケトラーゼのポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
標準法を使用し、ペプチドがＤ−フルクトース６−リン酸又はＤ−キシルロース５−リン酸をアセチル−Ｐへと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがホスホケトラーゼペプチド活性を有するかを判断できる。次に、アセチル−Ｐはフェリルアセチルヒドロキサム酸（ferryl acetyl hydroxamate）へと変換され得る。この変換は、分光測定により検出可能である（Ｍｅｉｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３：２９２９〜２９３６，２００１）。本発明での使用には、本明細書に記載されるとおりホスホケトラーゼペプチド活性を有するとして判定された任意のポリペプチドが好適である。
他の態様では、ホスホケトラーゼの核酸の例としては、限定するものではないが、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルディオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離したホスホケトラーゼが挙げられる。本明細書において使用することのできるホスホケトラーゼ酵素のその他の例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７８５，８５８号に記載されている。
エントナー・ドゥドロフ経路に関与する経路
エントナー・ドゥドロフ（ＥＤ）経路は、エムデン・マイヤーホフ・パルナス（ＥＭＰ−解糖）経路とは異なる経路である。大腸菌（E. coli）などの一部の生物がＥＤ経路及びＥＭＰ経路の両方を内包するのに対し、その他の生物はいずれか１つの経路のみを有する。枯草菌（Bacillus subtilis）は、ＥＭＰ経路のみを有するのに対し、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）はＥＤ経路のみを有する（Ｐｅｅｋｈａｕｓ ａｎｄ Ｃｏｎｗａｙ．１９９８．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０：３４９５〜３５０２；Ｓｔｕｌｋｅ ａｎｄ Ｈｉｌｌｅｎ．２０００．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４，８４９〜８８０；Ｄａｗｅｓ ｅｔ ａｌ．１９６６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．９８：７９５〜８０３）。
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）は、６−ホスホ−Ｄ−グルコネートから一分子のＨ２Ｏを除去して２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネート６−リン酸を生成するのに対し、２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）はアルドール縮合を触媒する（Ｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．１９９２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１７４：４６３８〜４６４６）。２つの遺伝子はオペロンの関係である。
ホスホケトラーゼ経路に指向する代謝経路をＥＤ経路に迂回させることもできる。ＥＤ経路に取り込まれる代謝産物が損失することを回避するため、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコナーゼ６−リン酸アルドラーゼ遺伝子（例えば、内在性２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子）活性を減弱させる。１つの手法としては、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）を欠失させることで減弱を行うことができる。この欠失は、クロラムフェニコール又はカナマイシンカセットにより片方又はいずれもの遺伝子を置き換え、その後カセットを除去することで導入される。これらの酵素活性を存在させずとも、ホスホケトラーゼ酵素によってより多くの炭素を取り込むことができ、ひいてはメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、及び／又はイソプレノイドの収率を増加させることができる。
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）の活性は、酵素に関係する他の分子操作により減少させることもできる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
一部の場合では、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子及び／又は内在性２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子の発現を減弱させていない細胞と比較して多量の炭素がメバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることになる。
ペントースリン酸経路の酸化経路に関与する経路
大腸菌（E. coli）は、ペントースリン酸経路を使用してヘキソース及びペントースを分解し、各種代謝経路に関係する中間体を細胞に提供する。この経路は、ＮＡＤＰＨの主要な生成経路でもある。ペントースリン酸経路は、酸化経路（グルコース６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｇｌ）又は６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）などの酵素による）及び非酸化経路（トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡ又はｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼなどの酵素による）から構成される（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ．１９９５．Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６４：３２４〜３３０）。
ホスホケトラーゼ酵素を炭素に直接作用させるために、ペントースリン酸経路の非酸化分岐経路（トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ）の発現を調節して（例えば、酵素の活性を増強させて）、より多量の炭素をフルクトース６−リン酸及びキシルロース５−リン酸へと変換させ、以降に続くメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、及び／又はイソプレノイドの生産量を増加させることもできる。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ活性を増加させることで、活性を操作しなかった場合と比較して比活性又は総活性を任意の量で増加させることができる。一部の例では、酵素活性は少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％上昇する。一部の態様では、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性は、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性を増強させることにより調節される。このような上昇は、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ遺伝子のプロモータを常時高発現型の合成プロモータにより置き換えることで得られる。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼをコードしている遺伝子を、プラスミド上の適切なプロモータの後にクローン化させてもよい。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性を増加させることにより、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの発現を増加させていない細胞と比較して多量の炭素をメバロン酸依存型の生合成経路に取り込ませることができる。
ホスホフルクトキナーゼに関与する経路
ホスホフルクトキナーゼは、解糖系でフルクトース６−リン酸のリン酸化を触媒する重要な酵素である。大腸菌（E. coli）はｐｆｋＡ及びｐｆｋＢによりコードされる２種のイソ酵素を有する。細胞におけるホスホフルクトキナーゼ活性の大部分はｐｆｋＡによるものである（Ｋｏｔｌａｒｚ ｅｔ ａｌ．１９７５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，３８１：２５７〜２６８）。
ホスホケトラーゼ酵素を炭素に直接作用させるために、ホスホフルクトキナーゼの発現を調節（例えば、酵素活性を低下させるなど）して、より多量の炭素をフルクトース６−リン酸及びキシルロース５−リン酸へと変換させ、以降に続くメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、及び／又はイソプレノイドの生産量を増加させることもできる。ホスホフルクトキナーゼ活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％低下させる。一部の態様では、内在性ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させることにより、ホスホフルクトキナーゼの活性を調節する。このような調節は、内在性ホスホフルクトキナーゼ遺伝子プロモータを常時低発現型合成プロモータと置き換えることにより行うことができる。ホスホフルクトキナーゼをコードしている遺伝子を欠失させてもよい。ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させることで、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みを、ホスホフルクトキナーゼの発現を低下させていない細胞と比較して増加させることができる。
イソプレンの生産量を増加させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）
本明細書に記載の、イソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された組み換え細胞は、イソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない同様の細胞と比較して高濃度のイソプレンを生産することができる。一態様では、本明細書に記載の組み換え細胞（細菌細胞など）（例えば、本明細書に記載のとおりイソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された宿主細胞など）は、最小培地で培養した場合に、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている異種核酸の１つ以上のコピー、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピー並びにイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含まない同様の細胞よりも高濃度でイソプレンを生産する能力を有する。特定の態様では、これらの細胞は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）をコードしている異種核酸の１つ以上のコピー、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピー並びに異種核酸でありイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含む。一態様では、１つ以上の異種核酸が宿主細胞の染色体に組み込まれる。細胞は、イソプレン生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていないイソプレン生産細胞と比較して少なくとも５％超多量にイソプレンを生産することができる。他の態様では、細胞（細菌細胞など）は、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないがＬ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）を含まないイソプレン生産細胞（細菌細胞など）と比較して少なくとも５％超多量にイソプレンを生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％超、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値だけ多量にイソプレンを生産することができる。
本発明の一態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、並びにイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含み、イソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された細胞が提供される。本発明の他の態様では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド）をコードしている１つ以上の異種核酸、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸並びにイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含む細胞（細菌細胞など）が提供される。細胞には、ＩＤＩポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含ませてもよい。１つ以上の異種核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結させることができ、調節可能なように誘導型プロモータに連結させることができ、あるいは調節可能なように誘導型及び常時発現型プロモータと組み合わせて連結させることができる。１つ以上の異種核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモータ、低発現型プロモータ及び／又は強度が発現が中程度のプロモータに連結させることができる。ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド、並びにイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞において安定的に発現させることができる。加えて、１つ以上の異種核酸は、ベクター上に存在させることもできる。
一部の態様では、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）ＭＶＫのポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、並びにイソプレンシンターゼポリペプチド又はこれらの変異体をコードしている１つ以上の核酸を含み、イソプレンを生産することができる細胞が提供される。
本明細書に記載の任意の組成物又は方法に従ってイソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された細胞によるイソプレンの生産量は増加させることができる（例えば、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路上流のポリペプチドの発現を増加させることにより）。他の態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法によるイソプレンの生産量は増加させることができる（例えば、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド及び／又はｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）の発現を増加させることにより）。本明細書で使用するとき、イソプレン生産量の「増加」は、本明細書に記載の任意の組成物及び方法により表される細胞による、イソプレンに関する細胞生産性指数（ＣＰＩ）、イソプレンの力価、イソプレンの質量収率及び／又はイソプレンの比生産量が、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド及び／又はｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）を有さずかつイソプレン生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞によるものと比較して、増加していることを指す。イソプレンの生産量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレンの生産量は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）を発現しておらず、かつイソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞によりイソプレンを生産させた場合と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍又は約５０〜約２００倍）増加させることができる。
イソプレンの生産量は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍又は１，０００，０００倍のうちの任意の割合だけ増加させることもできる。
組み換え細胞を使用してイソプレンを生産する方法
本明細書では、本明細書で提供されるとおりにイソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された任意の組み換え微生物を培養する工程、を含む、イソプレンの生産方法も提供される。一態様では、イソプレンは、本明細書に記載の任意の酵素経路（enzymatic pathways）に対する調節を含み、かつＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、並びにイソプレンシンターゼポリペプチドを含む、組み換え細胞（細菌細胞など）を培養することにより生産することができる。他の態様では、イソプレンは、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、並びにイソプレンシンターゼポリペプチドを含む組み換え細胞（細菌細胞など）を培養することにより生産することができる。イソプレンは、本開示の任意の方法に従い、本明細書に記載の任意の細胞から生産することができる。六炭糖（グルコースなど）などの炭水化物からイソプレンを生産する目的に際し、任意の細胞を使用することができる。
したがって、本明細書では、イソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されており、かつＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含む細胞を、培養する工程；並びに（ｂ）イソプレンを生産させる工程、を含む、イソプレンの生産方法も提供される。他の態様では、本明細書では、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている１つ以上の異種核酸を含む細胞（細菌細胞など）を、イソプレンの生産に好適な条件で培養する工程、並びに（ｂ）イソプレンを生産させる工程、を含む、イソプレンの生産方法が提供される。細胞は、上記のＭＶＡ経路下流のポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及び／又はＩＤＩ）及び上記の任意のイソプレンシンターゼポリペプチド（例えば、プエラリア（Pueraria）のイソプレンシンターゼ）をコードしている１つ以上の核酸分子を含み得る。一部の態様では、細胞（細菌細胞など）は、本明細書に記載の任意の細胞であってよい。本明細書に記載の任意のイソプレンシンターゼ又はこれらの変異体、本明細書に記載の任意の微生物（例えば、細菌）又は植物株、本明細書に記載の任意のプロモータ及び／又は本明細書に記載の任意のベクターも、本明細書に記載の任意のエネルギー源（例えば、グルコース又は任意のその他の六炭糖）を使用するイソプレンの生産に使用することができる。一部の態様では、イソプレンの生産方法は更に、イソプレンを回収する工程を含む。
一部の態様では、（ａ）Ｍ．バートニイ（M. burtonii）ＭＶＫ及びイソプレンシンターゼをコードしている１つ以上の異種核酸を含む細胞を培養する工程；並びに（ｂ）イソプレンを生産させる工程、を含む、イソプレンの生産方法が提供される。
一部の態様では、生産されるイソプレン量は、純生産量（absolute productivity）が最大となった時点で測定されたものである。一部の態様では、細胞に関し純生産量が最大であるとは、本明細書で開示される任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。一部の態様では、生産されたイソプレンの量は、比生産量が最大となった時点で測定されたものである。一部の態様では、細胞に関し比生産量が最大であるとは、本明細書で開示される、細胞あたりの任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。一部の態様では、生産されたイソプレンの総量は累積値として測定される。一部の態様では、細胞の累積生産量は、本明細書で開示される任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。
一部の態様では、本明細書に記載の、イソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された任意の細胞（例えば、培養物中の細胞）は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００又は５，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｎｍｏｌｅ）／細胞湿潤重量（ｇ）／時間（ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）値で、イソプレンを生産する。一部の態様では、イソプレンの量は約２〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒであり、例えば、約２〜約１００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１５０〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ又は約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。一部の態様では、イソプレンの量は約２０〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約３００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ又は約４００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。
一部の態様では、培養時にイソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された細胞は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００又は１００，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｎｍｏｌｅ）／細胞湿潤重量（ｇ）／時間（ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）値で、イソプレンを生産する。一部の態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈであり、例えば、約２〜約１００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約５００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１，０００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ又は約２，０００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。一部の態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約３００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ又は約４００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。
一部の態様では、培養時にイソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された細胞は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｍｇ）／ブロス（Ｌ）（ｍｇ／Ｌブロス、ブロス体積には、細胞及び細胞培地の体積を含む）値の累積力価（総量）で、イソプレンを生産する。一部の態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロスであり、例えば、約２〜約１００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌブロス、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、又は約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロスなどである。一部の態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約３００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、又は約４００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロスである。
一部の態様では、イソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された細胞により、培養時に生産されるイソプレンは、発酵時排出気体（fermentation offgas）の体積の少なくとも約１、２、５、１０、１５、２０又は２５％を構成する。一部の態様では、イソプレンは、排出気体の体積の約１〜約２５％を構成し、例えば、約５〜約１５％、約１５〜約２５％、約１０〜約２０％又は約１〜約１０％を構成する。
本明細書では、イソプレンの生産性を向上させた細胞が提供される。細胞によるイソプレンの生産量は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピー、並びにイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、を発現させることにより増加させることができる。本明細書で使用するとき、イソプレン生産量の「増加」は、本明細書に記載の任意の組成物及び方法により表される細胞による、イソプレンに関する細胞生産性指数（ＣＰＩ）、イソプレンの力価、イソプレンの質量収率（mass yield）及び／又はイソプレンの比生産量が、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド、及び／又はＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）を有さずかつイソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞によるものと比較して、増加していることを指す。イソプレンの生産量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレンの生産量は、異種のイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）を有さずかつイソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞によりイソプレンを生産させた場合と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約５０％〜約１，０００，０００倍、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、又は約５０〜約２００倍）増加させることができる。
本明細書に記載の任意の方法に従ってイソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された細胞によるイソプレンの生産量は増加させることができる（例えば、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸の発現を増加させることにより）。イソプレンの生産量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレンの生産は、天然に生じる細胞（例えば、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現していない細胞）によりイソプレンを生産させた場合と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約５０％〜約１，０００，０００倍、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、又は約５０〜約２００倍）に増加させることができる。イソプレンの生産量は、天然に生じる細胞、あるいはＬ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現しておらずかつイソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞によりイソプレンを生産させた場合と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、又は１，０００，０００倍のうちの任意の割合だけ増加させることもできる。
イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量を増加させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）
イソプレノイドは、多くの生物において、ＭＶＡ経路の最終産物であるイソプレノイド前駆体分子の合成によりとができる。上記のように、イソプレノイドは、重要な部類の化合物として存在し、例えば、食品及び飼料用サプリメント、風味及び臭気化合物、並びに抗癌、抗マラリア、抗真菌及び抗菌化合物を含む。
分子の部類の際には、イソプレノイドは、化合物を構成しているイソプレン単位の数に基づき分類される。モノテルペンは１０個の炭素原子又は２個のイソプレン単位を含み、セスキテルペンは１５個の炭素原子又は３個のイソプレン単位を含み、ジテルペンは２０個の炭素原子又は４個のイソプレン単位を含み、セステルテルペンは２５個の炭素原子又は５個のイソプレン単位を含む。ステロイド（一般的に、炭素原子を約２７個含む）は、イソプレノイドを分解又は再構成した生成物である。
イソプレノイドは、イソプレノイド前駆体分子のＩＰＰ及びＤＭＡＰＰから生成することができる。これらの多様な化合物は、これらのより単純で一般的な前駆体から誘導され、及び保存されているポリプレニルピロリン酸シンターゼ群により合成される（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１ Ｍａｒ；１５５（３）：１０７９〜９０）。多様な鎖長を有するこれらの直鎖プレニルピロリン酸はそれぞれに特有の生理機能を示し、及びポリプレニルピロリン酸シンターゼの非常に発達した活性部位により、一般的にアリル基（ジメチルアリル二リン酸（Ｃ５−ＤＭＡＰＰ）、ゲラニルピロリン酸（Ｃ１０−ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（Ｃ１５−ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（Ｃ２０−ＧＧＰＰ））と、相当する数のイソペンテニルピロリン酸との縮合反応を介し、認識される（Ｃ５−ＩＰＰ）（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１ Ｍａｒ；１５５（３）：１０７９〜９０）。
イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産は、酵素活性の調節により、イソプレノイド生産に取り込まれる炭素量が増加するよう、１つ以上の酵素経路が操作されている本明細書に記載の任意の組み換え宿主細胞を使用して行うことができる。加えて、これらの細胞には、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産性を向上させるために、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを発現させることができる。他の態様では、これらの細胞には、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産させるために、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを発現させることができる。メバロン酸生産への炭素の取り込みが増加するよう遺伝子操作されており、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）をコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを発現しており、上記のメバロン酸又はイソプレンの生産性を向上させることのできる任意の組み換え宿主細胞は、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産性を向上させることができるものであってもよい。一部の態様では、これらの細胞は、上記のように、ＭＶＡ経路下流、ＩＤＩ及び／又はＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、並びにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む。理論に束縛されるものではないが、上記の任意の組成物及び方法により、細胞（細菌細胞など）におけるメバロン酸の生産量を増加させることで、同様に、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドなどのより高分子量の生成物の生産量も増加するものと考えられる。グルコースからのメバロン酸生産量のモル収率を上昇させ、適切な酵素活性濃度で、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ並びにイソプレン及びイソプレノイド生産に好適な他の酵素と組み合わせると、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイド（イソプレンを含む）のモル収率の上昇につながる。
イソプレノイドの種類
メバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作した本発明の細胞（細菌細胞など）は、イソプレノイド並びにイソプレノイド前駆体分子ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰの生産量を増加させることができる。イソプレノイドの例としては、限定するものではないが、ヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、及びより高分子量のポリテルペノイドが挙げられる。一部の態様では、ヘミテルペノイドは、プレノール（すなわち、３−メチル−２−ブテン−１−オール）、イソプレノール（すなわち、３−メチル−３−ブテン−１−オール）、２−メチル−３−ブテン−２−オール、又はイソ吉草酸である。一部の態様では、モノテルペノイドは、限定するものではないが、ゲラニルピロリン酸、オイカリプトール、リモネン、又はピネンであってよい。一部の態様では、セスキテルペノイドはファルネシルピロリン酸、アルテミシニン、又はビサボロールである。一部の態様では、ジテルペノイドは、限定するものではないが、ゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、又はアフィジコリンであってよい。一部の態様では、トリテルペノイドは、スクアレン又はラノステロールであってよい。イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン（α-famesene）、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）及びバレンセンからなる群から選択することもできる。
一部の態様では、テトラテルペノイドは、リコピン又はカロチン（カロチノイド）である。本明細書で使用するとき、用語「カロチノイド」は、クロロプラスト中で、並びに植物、何らかの他の光合成生物、例えば藻類、ある種の真菌、ある種のバクテリア、のクロロプラスト中で生産される、天然に生じる有機色素群を指す。カロチノイドとしては、酸素を含有しているキサントフィル及び酸素を含有していないカロテンが挙げられる。一部の態様では、カロチノイドはキサントフィル及びカロテンからなる群から選択される。一部の態様では、キサントフィルはルテイン又はゼアキサンチンである。一部の態様では、カロチノイドは、α−カロチン、β−カロチン、γ−カロチン、β−クリプトキサンチン又はリコピンである。
ポリプレニルピロリン酸シンターゼのポリペプチドをコードしている異種核酸
本発明の一部の態様では、本明細書において任意の組成物又は方法に記載されるように、イソプレノイドの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作した細胞は、更に、上記の通りにメバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチドを１つ以上コードしている核酸、並びにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドであってよい。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、常時発現型プロモータに調節可能なように連結させてよく、あるいは同様に、調節可能なように誘導型プロモータに連結させてもよい。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモータと連結させてもよい。あるいは、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性の核酸は、調節可能なように低発現型プロモータと連結させてもよい。詳細には、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドを過剰発現するよう遺伝子操作することができる。
一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含む。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結されている。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結されている。
一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結されている。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結されている。
ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、更にベクター上に存在させてもよい。
ポリプレニルピロリン酸シンターゼの核酸の例としては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、イソプレノイド前駆体分子をより複雑なイソプレノイド化合物に変換する。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドの例としては、イソプレンシンターゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、並びに融合ポリペプチドが挙げられる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼのポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。加えて、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、酵素活性が向上しているなどして、活性が向上されていてよい。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、安定性（例えば、熱安定性）が改良されている、及び／又は溶解性が改良されているなどして、その他の特性が改良されている。ポリプレニルピロリン酸シンターゼの核酸の例としては、限定するものではないが、ゲラニルジホスフェート（geranyl diphosposphate）（ＧＰＰ）合成酵素、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）合成酵素、及びゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）合成酵素、又はその他の任意の既知のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドなど、ポリプレニルピロリン酸シンターゼのポリペプチドをコードしている核酸を挙げることができる。
本発明の一部の態様では、本明細書において任意の組成物又は方法に記載されるように、イソプレノイドの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作した細胞は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）合成酵素をコードしている１つ以上の核酸を更に含む。
ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドは、内在性遺伝子によりコードされている内在性ポリペプチドであってもよい。一部の態様では、ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドは、大腸菌（E. coli）において内在性ｉｓｐＡ遺伝子によりコードされている。ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性の核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結させることができ、あるいは同様に調節可能なように誘導型プロモータに連結させることができる。ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性の核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモータに連結させることができる。特に、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドを過剰発現するよう遺伝子操作することができる。
一部の態様では、ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドは異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含み得る。一部の態様では、ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸は、常時発現型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸は、誘導型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結されている。
ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドをコードしている核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドをコードしている核酸は、更にベクターに組み込むこともできる。
インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボで、ポリペプチドがＩＰＰをイソプレノイドへと変換する能力を測定して、ポリペプチドがポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド活性を有するか否かを判定する際には、標準法を使用できる。これらの手法は当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第７，９１５，０２６号；Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１ Ｍａｒ；１５５（３）：１０７９〜９０；Ｄａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１１ Ａｐｒ １２ ［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１１ Ｍａｒ ２４ ［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；Ｋｅｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．２０１１ Ｍａｒ ７；１１：４３；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｏｃｔ ２１；１０：２２６；Ｋｕｍｅｔａ ＆ Ｉｔｏ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０ Ｄｅｃ；１５４（４）：１９９８〜２００７；ａｎｄ Ｋｏｌｌｎｅｒ ＆ Ｂｏｌａｎｄ，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．２０１０ Ａｕｇ ２０；７５（１６）：５５９０〜６００に記載されている。
イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産性を向上させることのできる組み換え細胞（細菌細胞など）
本明細書に記載の組み換え微生物（例えば、組み換え細菌細胞）は、本明細書に記載の各種酵素経路に対し何ら操作を施していない同様の細胞と比較して、多量に及び／又は高濃度でイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産する能力を有する。加えて、本明細書に記載の細胞は、イソプレノイド生成に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されておらずかつＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピー、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピー及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含まない同様の細胞と比較して、多量に及び／又は高濃度でイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産する能力を有する。一部の態様では、本明細書に記載の細胞は、最小培地で培養した場合に、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）の１つ以上のコピー、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピー及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含まない同様の細胞と比較して、多量に及び／又は高濃度でイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産する能力を有する。一部の場合では、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピー（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピー及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸は、宿主細胞の染色体に組み込まれている異種核酸である。細胞は、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体を生産する、イソプレノイドの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞（細菌細胞など）と比較して、少なくとも５％を超える量のイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産することができる。他の態様では、細胞（細菌細胞など）は、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体を生産する、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）を含まない細胞（細菌細胞など）と比較して、少なくとも５％を超える量のイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％超、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値だけイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産することができる。
本発明の一態様では、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されており、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸及びポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードしている１つ以上の異種核酸を含む、細胞が提供される。本発明の他の態様では、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている１つ以上の異種核酸、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸及びポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードしている１つ以上の異種核酸を含む細胞（細菌細胞など）が提供される。細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む。更に、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、ＦＰＰ合成酵素ポリペプチドであってよい。１つ以上の異種核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結させることができ、調節可能なように誘導型プロモータに連結させることができ、又は調節可能なように誘導型及び常時発現型プロモータに連結させることができる。１つ以上の異種核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモータ、低発現型プロモータ及び／又は発現が中程度のプロモータに連結させることができる。ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチド、及びＤＸＰ経路ポリペプチド、及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、すなわち細胞で安定的に発現させることができる。１つ以上の異種核酸は更にベクター上に存在させてもよい。
一部の態様では、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）ＭＶＫポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸及びポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードしている１つ以上の核酸を含む細胞が提供され、この細胞は、イソプレノイドを生産することができる。
上記の、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量を増加させるために、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作した任意の細胞の使用法が、本明細書において提供される。細胞によるイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現させることにより増加させることができる。他の態様では、細胞によるイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量は、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現させることにより増加させることができる。本明細書で使用するとき、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量の「増加」は、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）をコードしている１つ以上の異種核酸を有しておらずかつイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞と比較して、本明細書に記載の任意の組成物及び方法のいずれかにより記載される細胞による、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量に関係する細胞生産性指数（ＣＰＩ）が上昇していること、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの力価が上昇していること、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの質量収率が上昇していること、並びに／あるいは細胞によるイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの比生産量が上昇していることを指す。イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド）を発現しておらずかつイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞により、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体を生産させた場合と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍又は約５０〜約２００倍）増加させることができる。
本開示の任意の方法による、細胞によるイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量は増加させることができる（例えば、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸の発現を増加させることにより）。他の態様では、本開示の任意の方法による、細胞によるイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量は増加させることができる（例えば、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸の発現を増加させることにより）。イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量は、天然に生じる細胞（例えば、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドを発現しておらずかつイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体生産量に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞）によりイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産させた場合と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍又は約５０〜約２００倍）増加させることができる。
イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量は、天然に生じる細胞により、あるいはＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）を発現しておらずかつイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞によりイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産させた場合と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍又は１，０００，０００倍のうちの任意の割合だけ増加させることもできる。
組み換え細胞を使用してイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体分子を生産する方法
本明細書に記載の各種酵素経路に対し遺伝子操作を行った組み換え微生物（例えば、組み換え細菌細胞）を培養する工程を含み、及び／又は限定するものではないが、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）などのＭＶＡ経路上流のポリペプチド、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含む、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産方法も、本明細書において提供される。イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドは、本明細書に記載の任意の細胞から、及び本開示の任意の方法に従って、生産することができる。
グルコースなどの六炭糖といった炭水化物から、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを生産する目的で、任意の細胞を使用することができる。
したがって、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作した細胞を培養する工程；並びに（ｂ）イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを生産する工程、を含む、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの製造方法が本明細書で提供される。他の態様では、本明細書では、イソプレンの生産に好適な条件下で、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている１つ以上の異種核酸を含む細胞（細菌細胞など）を培養する工程、並びに（ｂ）イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを生産する工程、を含む、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの製造方法が提供される。細胞には、上記のＭＶＡ経路下流のポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及び／又はＩＤＩ）及び上記の任意のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸分子を更に含ませることができる。一部の態様では、細胞（細菌細胞など）は、本明細書に記載の任意の細胞であり得る。本明細書に記載の任意のポリプレニルピロリン酸シンターゼ又はこれらの変異体、任意の微生物（例えば、細菌）又は本明細書に記載の植物株、本明細書に記載の任意のプロモータ及び／又は本明細書に記載の任意のベクターを使用し、本明細書に記載の任意のエネルギー源（例えば、グルコース又は任意の他の六炭糖）を利用して、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを生産することもできる。一部の態様では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産方法は、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを回収する工程を更に含む。
イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産方法は、（ａ）イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作した細胞を培養する工程、細胞は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現する；並びに（ｂ）イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを生産する工程、細胞は、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体を生産する、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている異種遺伝子の１つ以上のコピーを含んでおらずかつイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞と比較して、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを多量に生産する、を含み得る。他の態様では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産方法は、同様に、（ａ）内在するｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子など）を有しておらず、ｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現する細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞など）を、培養する工程；並びに（ｂ）イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体を生産するもののｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）を含んでいない細胞（細菌細胞など）と比較して多量にイソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを生産する工程、を含み得る。
イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産に関係する本発明の方法により、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体を生産する、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されておらずかつＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含まない細胞と比較して、少なくとも５％超の量でイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産することができる。他の態様では、本明細書で提供されるイソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産方法では、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体を生産する、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）を含まずかつ及びイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞（細菌細胞など）と比較して、少なくとも約５％超の量でイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産することができる。あるいは、細胞（細菌細胞など）は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％超、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値だけイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産することができる。一部の態様では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産方法は、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを回収する工程を更に含む。
本明細書では、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体分子の生産量を増加させるために、上記の、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作した任意の細胞を使用する方法が提供される。細胞によるイソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産量は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現させることにより増加させることができる。
他の態様では、細胞によるイソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産量は、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている１つ以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現させることにより増加させることができる。本明細書で使用するとき、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイド生産量の「増加」は、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）をコードしている１つ以上の異種核酸を含まずかつイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞と比較して、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイド生産に関する細胞生産性指数（ＣＰＩ）が上昇していること、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの力価が上昇していること、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの質量収率が上昇していること、並びに／あるいは本明細書に記載の任意の組成物及び方法により記載される細胞による、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの比生産量が上昇していること、を指す。イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産量は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）を発現しておらずかつイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞によりイソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを生産させた場合と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍又は約５０〜約２００倍）増加させることができる。
イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産量は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳポリペプチド）を発現しておらずかつイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体生産量に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞によりイソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを生産させた場合と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍又は１，０００，０００倍のうちの任意の割合だけ増加させることもできる。
更に、より特異的な細胞培養条件を使用して、本明細書に記載の方法に処理細胞を培養させることができる。例えば、一部の場合では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産方法は、（ａ）イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されており、内在するｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子など）を有していない細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などの細菌細胞）を、３４℃下で培養する工程、細胞（細菌細胞など）は、ｍｖａＥポリペプチド及びｍｖａＳポリペプチド（限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）をコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを、低〜中間コピー数のプラスミドにおいて高発現型プロモータの調節下で異種発現する；並びに（ｂ）イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体を生産する工程、を含む。一部の態様では、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の生産方法は、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを回収する工程を更に含む。
ベクター
本明細書に記載の任意の組成物及び方法には好適なベクターを使用することができる。
例えば、好適なベクターを使用して、嫌気性菌での、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、ｍｖａＥポリペプチド及び／又はｍｖａＳポリペプチド限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）、イソプレンシンターゼ、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ及び／又は１つ以上のＭＶＡ経路ポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーの発現を、最適化することができる。一部の態様では、ベクターには選択マーカーを含有させる。選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、フェロマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン又はクロラムフェニコール）、及び／又はホスト細胞に栄養的な利点などの代謝的な利点を与える核酸が挙げられる。一部の態様では、選択マーカーは用いずに、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis））由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなどの、ｍｖａＥポリペプチド、及び／又はｍｖａＳポリペプチド、イソプレンシンターゼ、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ及び／又は１つ以上のＭＶＡ経路下流のポリペプチドの核酸の１つ以上のコピーを宿主細胞のゲノムに組み込む。
本開示の実施例において特徴づけられ又は使用される任意の１つのベクターを使用することができる。
形質転換法
ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（例えば、限定するものではないが、Ｌ．グレイ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ核酸などの、ｍｖａＥ及び／又はｍｖａＳ核酸）、イソプレンシンターゼ及び／又はＭＶＡ経路下流のポリペプチドのうちの、１つ以上のコピーをコードしている核酸を、適切な手法により微生物に挿入することができる。更に、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼの核酸、又はこれらを含むベクターは、形質転換、電気穿孔法、核マイクロインジェクション、形質導入、形質移入（例えばリポフェクション介在型若しくはＤＥＡＥ−デキストラン介在型トランスフェクション、又は組換えファージウイルスを使用した形質移入）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＮＡコーティングした微粒子を用いる高速遺伝子銃照射、及びプロトプラスト融合などの、宿主細胞内にＤＮＡコンストラクト又はベクターを導入するための標準的な技術を使用して宿主細胞（例えば本明細書において述べられるような植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は細菌細胞）内に挿入することができる。
一般的な形質転換法は、当該技術分野で既知である（例えば、分子生物学領域の現行のプロトコル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｈａｐｔｅｒ ９，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，「分子クローニング（Molecular Cloning）」：「実験室マニュアル（A Laboratory Manual）第２版」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；及びＣａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６，１９８９を参照されたい）。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込むことができ、又は染色体外の複製配列として維持することができる。形質転換体は、当該技術分野において既知の任意の方法により選択することができる。形質転換体を選択するのに好適な手法としては、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号及び米国特許公開第２０１０／０００３７１６号が挙げられる。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
精製方法例
一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、生産された化合物を回収する工程を包含する。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、イソプレンを回収する工程を包含する。一部の態様では、イソプレンは、吸着ストリッピング法（例えば、米国特許第２０１１／０１７８２６１（Ａ１）号を参照されたい。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）により回収される。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、イソプレノイドを回収する工程を包含する。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、テルペノイド又はカロチノイドを回収する工程を含む。
好適な精製方法は、米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７（Ａ１）号においてより詳細に記載されており、この開示は、参照により組み込まれる。
本発明は、実例として提供され、制限することを意味するものではない以降の実施例を参照することにより更に理解することができる。
実施例１：大腸菌（E. coli）株ＣＭＰ４５１（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ ｇｌｔＡを含有）、ＣＭＰ４５２及びＣＭＰ４５３の構築
ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）中でクエン酸シンターゼ遺伝子（ｇｌｔＡ）の前に位置するプロモータを、常時発現型低発現プロモータ、すなわちＧＩ１．２（米国特許第７，３７１，５５８号）により置き換えた。ｇｌｔＡに関して報告されている２種の野生型プロモータ（Ｗｉｌｄｅ，Ｒ及びＪ．Ｇｕｅｓｔ．１９８６．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３２３９〜３２５１）及び合成プロモータを、遠位プロモータの−３５領域の直後に挿入した。プライマーＵｐｇｌｔＡＣｍ−Ｆ（５’−ＴＡＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＣＡＴＣＴＡＡＴＴＴＧＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧＧ−３’）及びＤｎｇｌｔＡ１．ｘｇｉＣｍ−Ｒ（５’−ＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＴＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＴＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＴＨＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧ−３’）、並びにテンプレートとしてＧｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のプラスミドＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴを使用し、ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物を精製し、λｒｅｄを用いる組み換えに製造元（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による記載の通りに使用した。更なる評価にあたって、複数種のコロニーを選択した。プロモータ領域は、プライマーｇｌｔＡＰｒｏｍＳｅｑＦ：５’−ＧＧＣＡＧＴＡＴＡＧＧＣＴＧＴＴＣＡＣＡＡＡＡＴＣ−３’及びｇｌｔＡｐｒｏｍＳｅｑＲ：５’−ＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＴＣＡＧＣ−３’と、テンプレートとしてコロニーから抽出したＤＮＡ（コロニーを３０ｕＬのＨ２Ｏに再懸濁し、９５℃で４分加熱し、スピンダウンしたもの。５０ｕＬのＰＣＲ反応には、この溶液のうち２ｕＬをテンプレートとして使用する）とを使用しＰＣＲ増幅させた。得られたＰＣＲ産物の配列決定結果を観察した後、３種の異なるプロモータＧＩ１．２、ＧＩ１．５及びＧＩ１．６（米国特許第７，３７１，５５８号）を保有しているコロニーを、更なる使用のため保存した（ＣＭＰ１４１、ＣＭＰ１４２及びＣＭＰ１４３；表３）。
Figure 2017148063
ＣＭＰ２５８（米国特許出願第１２／９７８，３２４号を参照されたい）にＭＣＭ５２１株（米国特許出願第１２／９７８，３２４号）のＰ１可溶化液を形質導入し、ＭＤ０９−３１３株を構築し、２０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有させたルリア・ベルターニ培地のプレートにてコロニーを選択した。Ｐ１可溶化液は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃに記載の方法に従って調製した。製造元により推奨されるプロトコルを用い、株ＭＤ０９−３１４からカナマイシンマーカーを除去した（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
株ＣＭＰ１４１、ＣＭＰ１４２、及びＣＭＰ１４３からＰ１可溶化液を調製し、これらを株ＭＤ０９−３１４に形質導入し、それぞれＣＭＰ４４０、ＣＭＰ４４１及びＣＭＰ４４２を生成した（表３）。製造元（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により推奨されるプロトコルを用い、クロラムフェニコールマーカーを除去し、それぞれ株ＣＭＰ４５１、ＣＭＰ４５２、及びＣＭＰ４５３を生成した（表３）。
実施例２：大腸菌（E. coli）株ＣＭＰ６０４（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ １．２ ｇｌｔＡ ＭＬ ａｃｋＡ−ｐｔａ：：Ｃｍを含有）の構築
クロラムフェニコールマーカーにより破壊させたａｃｋＡ−ｐｔａ遺伝子を含有しているＤＮＡ断片を、クロラムフェニコールマーカーを含有しているＴｒｉｐｌｅ Ｔｒｉｐｌｅ株（米国特許第７，７４５，１８４（Ｂ２）号）をテンプレートとして使用し、及びプライマーａｃｋＡＣＦ（５’−ＧＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＣＡＡＣＴＣＡＧＣＧＧ）及びｐｔａＣＲ（ＣＡＣＣＡＡＣＧＴＡＴＣＧＧＧＣＡＴ ＴＧＣＣ−３’）を使用して、ＰＣＲにより増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、製造元（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の推奨する通りに組み換え反応に使用し、ＣＭＰ２５８株のａｃｋＡ−ｐｔａ座に組み入れた（米国特許出願第１２／９７８，３２４号を参照されたい）。ＬＢ＋５ｕｇ／ｍｌのクロラムフェニコールにてコロニーを選択した。
コロニーを１つ選択し、ＭＤ４９１と名づけた。ＭＤ４９１のＰ１可溶化液を調製し、ＣＭＰ４５１株の形質導入に使用した。ＬＢ＋５ｕｇ／ｍｌのクロラムフェニコールにてコロニーを選択した。コロニーを１つ選択し、ＣＭＰ６０４と名づけた。
実施例３：大腸菌（E. coli）株ＣＭＰ６２０（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ １．２ ｇｌｔＡ ＭＬ ａｃｋＡ−ｐｔａ：：Ｃｍ ｌｄｈＡ：：Ｋａｎを含有）及びＣＭＰ６３５（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ １．２ ｇｌｔＡ ＭＬ ａｃｋＡ−ｐｔａ ｌｄｈＡを含有）の構築
テンプレートとしてＫｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：２００６．０００８）のＪＷ １３７５株を使用し、プライマーはｌｄｈＡｓｅｑＲ（５’−ＧＧＣＴＴＡＣＣＧＴＴＴＡＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＣ−３’）及びｌｄｈＡｓｅｑＦ２（５’−ＣＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＣＣＧＡＧＣ−３’）と、を使用し、カナマイシンマーカーにより破壊されているｌｄｈＡ遺伝子を含有しているＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、製造元（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の推奨する通りに組み換え反応に使用し、ＭＤ０９−３１３株のｌｄｈＡ座に組み入れた。ＬＢ＋２０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンにてコロニーを選択した。コロニーを１つ選択し、ＣＭＰ３７４と名づけた。ＣＭＰ３７４のＰ１可溶化液を調製し、ＣＭＰ６０４株の形質導入に使用した。ＬＢ＋２０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンにてコロニーを選択した。コロニーを１つ選択し、ＣＭＰ６２０と名づけた。株に電気穿孔法によりｐＣＰ２０を導入して、クロラムフェニコール及びカナマイシンマーカーを同時に除去し（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ．２０００．ＰＮＡＳ ９７：６６４０〜５）、３０℃下でＬＢ＋５０ｕｇ／ｍｌのカルベニシリンで２つのコロニーを選択し、次に、これらのコロニーを、４２℃下でＬＢプレートに再画線した。これらのプレートからＣｍＳ及びＫａｎＳコロニーを選択し、ＣＭＰ６３５と名づけた。
実施例４：大腸菌（E. coli）株ＣＭＰ６７６（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ １．２ ｇｌｔＡ ＭＬ ａｃｋＡ−ｐｔａ ｌｄｈＡ ａｔｔＢ：：Ｃｍを含有）の構築
λ挿入部位ａｔｔＢの上流及び下流に対するＤＮＡ相同体と隣接しているクロラムフェニコールマーカーを含有しているＤＮＡ断片を、プラスミドｐＫＤ３（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ＆ Ｗａｎｎｅｒ，２０００，ＰＮＡＳ ９７：６６４０〜５）をテンプレートとして使用し、及びプライマーＣＭＰ１７１（５’−ＡＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＴＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＡＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＡＣＧＧＴＴＴＧＴＣＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣ−３’）及びＣＭＰ１７２（５’−ＧＡＣＣＡＧＣＣＧＣＧＴＡＡＣＣＴＧＧＣＡＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡＣＧＧＴＴＧＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＧＣＧＧＧＧＣＡＴＴＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ−３’）を使用して、ＰＣＲにより増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、製造元（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の推奨する通りにＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）における組み換え反応に使用し、λ挿入部位ａｔｔＢに組み入れた。これにより生成されたＣＭＰ６４６株を、ＬＢ＋５ｕｇ／ｍｌのクロラムフェニコールにて選択した。ＣＭＰ６４６のＰ１可溶化液を調製し、ＣＭＰ６３５株に対する形質導入反応に使用し、この株の染色体からメバロン酸経路下流（メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ）を除去した。形質導入反応物をＬＢ＋クロラムフェニコール５ｕｇ／ｍｌに播種し、１つのコロニーを選択しＣＭＰ６７６と名づけた。
実施例５：大腸菌（E. coli）株ＣＭＰ６８０（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ １．２ ｇｌｔＡ ＭＬ ａｃｋＡ−ｐｔａ ｌｄｈＡ ａｔｔＢ：：Ｃｍ，ｐＣＨＬ２７６）の構築及びメバロン酸の探知
電気穿孔法により、プラスミドｐＣＨＬ２７６（実施例６（ｉｉｉ）を参照されたい）をＣＭＰ６７６に導入する。コロニーをＬＢ＋５０ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシンにて選択した。１つのコロニーを採取し、ＣＭＰ６８０と命名した。
（ｉ）メバロン酸収率アッセイ
５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加した２ｍＬのＬＢブロスを入れた振盪チューブに、上記の株の一晩培養物を接種した。次に、培養物を、３４℃下２５０ｒｐｍで１４時間インキュベートした。次に、１％グルコース、最終濃度０．１％の酵母エキス及び２００μＭのＩＰＴＧを添加した２ｍＬのＴＭ３培地を入れた５ｍＬの４８ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、最終的なＯＤが０．２となるまで培養物を希釈した。プレートを、Ｂｒｅａｔｈ Ｅａｓｉｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、Ｓｈｅｌ Ｌａｂ振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。各培養物１ｍＬを３，０００×ｇで５分遠心分離した。２５０μｌの上清に、１９μＬの２０％硫酸を添加し、氷上で５分間インキュベートした。次に、混合物を３０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収した。２００μｌの上清を、ＨＰＬＣに適した９６ウェル円錐底ポリプロピレンプレート（Ｎｕｎｃ）に移した。メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定した。製造元（Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）の指定に従ってグルコースオキシダーゼアッセイを実施し、グルコース濃度を測定した。
（ｉｉ）ＨＰＬＣによるメバロン酸の検出：
５０℃でインキュベートし、ＢｉｏＲａｄ−マイクロガードＣａｒｂｏ−Ｈ詰め替えカートリッジ３０ｍｍ×４．６ｍｍ（カタログ番号１２５−０１２９）を取り付けた３００ｍｍ×７．８ｍｍ ＢｉｏＲａｄ−Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（カタログ番号１２５−０１４０）を使用し、屈折率検出器を系に包含させたＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズのＨＰＬＣ系でＨＰＬＣ解析を実施した。移動相に０．０１Ｎ硫酸を使用し、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで試料のＨＰＬＣ解析を実施した。屈折率検出器によりメバロン酸を検出した。
実施例６：リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２及びエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を発現している大腸菌（E. coli）株ＭＣＭ１３７３−１３７７の構築
（ｉ）遺伝子の同定及び選択
Ｅ．フェカリス（E. faecalis）ｍｖａＥ遺伝子産物をクエリーとして使用する一次配列相同性検索を、ＮＣＢＩウェブサイトに存在するＢＬＡＳＴｐプログラムにより実施した（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ及びＤａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）、「ギャップ考慮型ブラスト及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新規タンパク質データベース検索プログラムの作成（Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２）。対象とする配列は検索結果から選択した。
概して、ｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子に関し対象とする配列は、それぞれ野生型Ｅ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ核酸及びタンパク質配列に対し、５９〜６６％ヌクレオチド配列同一性（コドン最適化済み；表４を参照されたい）及び５９〜７１％アミノ酸配列同一性（表５）を示した。
Figure 2017148063
Figure 2017148063
（ｉｉ）プラスミドｐＤＷ８３、ｐＭＣＭ１２２３〜ｐＭＣＭ１２２５
エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ＥＣ１０由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳのコード配列を大腸菌（Escherichia coli）（ＧｅｎｅＯｒａｃｌｅ）での発現のため最適化させ、発現ベクターＭＣＭ８２にサブクローニングし（米国特許出願公開番号第２０１０／０１９６９７７号、［１０２３］段落）、ｐＤＷ８３を生成した。具体的には、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＰｍｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、一般的な分子生物学的手法により、クローニングベクターＧｃＤ１２６（ＧｅｎｅＯｒａｃｌｅ）から、ｍｖａＥＳオペロンを包含しているカセットを切り出した。次にこの断片を、酵素ＢａｍＨＩ及びＰｍｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用い予め制限酵素により消化しておいたＭＣＭ８２に連結し（Ｒｏｃｈｅ、ラピッド・ライゲーション）、続いてアガロースゲルにより分離し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅ−ゲル）、一般的な分子生物学的手法により、ｍｖａＥＳをコードしている発現カセットをエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）から除去した。製造元の推奨するプロトコルに従って、ライゲーション混合物によりケミカルコンピテントセルＴｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させた。スペクチノマイシン耐性陽性形質転換体を、液体ＬＢ培地で生育させ、プラスミドを精製し（Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）、プライマーＥｃ Ｓｅｑ １Ｆ〜４Ｒ（表６）を使用して配列決定（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を行い、確認した。
Figure 2017148063
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、リステリア・グレイ（Listeria grayi）及びエンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳをコードしているプラスミドを、表７に記載の設計を使用しＧｅｎｅＯｒａｃｌｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により構築した。ｍｖａＥ−ＲＢＳ−ｍｖａＳをコードしている合成ＤＮＡを作成し、次にｐＭＣＭ８２のＮｃｏＩ及びＰｓｔＩ認識部位間に存在しているオペロンと置き換えてクローン化した。ベクターによりｍｖａＥ用のＲＢＳを提供した。
Figure 2017148063
（ｉｉｉ）ｐＣＬ＿ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ（Ｅ．フェカリス（E. faecalis））−リーダーレスコンストラクト（ｐＣＨＬ２７６）
ＭＣＭ８２プラスミドのｐＣＬ＿ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ（Ｅ．フェカリス（E．faecalis））から余分なＲＢＳを除去するべくプライマー（ＣＬ４８３Ｆ：５’−ＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＡＴＴＡＣ−３’；ＣＬ４８４Ｒ：５’−ＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＡＴＧＧＴＴＴＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＴＴＡＡＴＣＧＡＴＡＣ−３’）を設計した。ＰＣＲ反応液の組成は、テンプレートＤＮＡのＭＣＭ８２（１００ｎｇ）、５０ｕＭの各順方向及びリバースプライマー、１ｕｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、５ｕｌの１０ＸのＰｆｕＩＩ反応緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ）、１ｕｌのＰｆｕ ＩＩ融合酵素（Ａｇｉｌｅｎｔ）及び４０ｕｌの水から構成された。Ｂｉｏ−Ｒａｄサーマルサイクラーにより、９５℃で５０秒、６０℃で５０秒及び６８℃で９分、更に６８℃で１０分の処理を行う温度プロファイルで、１８サイクルを実施した。ＰＣＲ反応の実施後にＤｐｎＩ（１ｕｌ）を添加し、３７℃で２時間インキュベートしてテンプレートＤＮＡを除去した。更に１ｕｌのＤｐｎＩを加え、３７℃で一晩インキュベートした。２μＬの反応液によりＴＯＰ１０ ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、ＬＢ＋５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンに播種した。
配列決定により適切なクローンであることが確認された。
（ｉｖ）ｐＣＬ＿ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ（Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus））−リーダーレスコンストラクト（ｐＣＨＬ２７７）
ｐＤＷ８３プラスミドのｐＣＬ＿ｐＴｒｃ−Ｕｐｐｅｒ（Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus））から余分なＲＢＳを除去するべくプライマー（ＣＬ４８５Ｆ：５’−ＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＡＴＣＡＴＴＧＡＣＧＣＡＣ−３’；ＣＬ４８６Ｒ：５’−ＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＴＴＡＡＴＣＧ−３’）を設計した。ＰＣＲ反応液の組成は、テンプレートＤＮＡのｐＤＷ８３（１００ｎｇ））、５０ｕＭの各順方向（ＣＬ４８３Ｆ）及びリバースプライマー（ＣＬ４８４Ｒ）、１ｕｌの１０ｍＭのｄＮＴＰｓ（Ｒｏｃｈｅ）、５ｕｌの１０ｘＰｆｕ ＩＩ反応緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ）、１ｕｌのＰｆｕ ＩＩ融合酵素（Ａｇｉｌｅｎｔ）及び４０ｕｌの水から構成された。Ｂｉｏ−Ｒａｄサーマルサイクラーにより、９５℃で５０秒、６０℃で５０秒及び６８℃で９分、更に６８℃で１０分の処理を行う温度プロファイルで、１８サイクルを実施した。ＰＣＲ反応後にＤｐｎＩ（１ｕｌ）を添加し、３７℃で２時間インキュベートしてテンプレートＤＮＡを除去した。更に１ｕｌのＤｐｎＩを添加し、３７℃で一晩インキュベートした。２μＬの反応液によりＴＯＰ１０ ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＬＡ／ｓｐｅｃ５０を形質転換した。配列決定により適切なクローンであることが確認された。
（ｖ）高収率のＭＶＡ生産株ＭＣＭ１３７３−１３７７の構築
宿主ＣＭＰ６７６を対数増殖期の中期まで３７℃にてＬＢで生育させ、電気穿孔に備え、培養物の１／２当量の氷冷ｄｄＨ２Ｏにより３回洗浄し、培養物の１／１０当量の氷冷ｄｄＨ２Ｏに再懸濁した。１００ｕＬの細胞懸濁液と１ｕＬのプラスミドＤＮＡを組み合わせ、２ｍｍの電気穿孔法キュベットに移し、２５ｕＦＤ、２００ｏｈｍｓ、２．５ｋＶで電気穿孔を行い、直ちに５００ｕＬのＬＢによりクエンチした。３７℃で１時間振盪して細胞を回復させ、次に、５０ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを添加したＬＢプレートにより、３７℃で一晩形質転換体を選択した。３７℃下で、ＬＢ＋５０ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシンにより、ＯＤ６００がおよそ１になるまで単一のコロニーを生育させた。
５００ｕＬのブロスに１ｍＬの５０％グリセロールを混合し、ドライアイス上で凍結させた。凍結させた保存液を−８０℃で保管した。
実施例７：遺伝子操作を受け、メバロン酸経路の遺伝子を発現している大腸菌（E. coli）株を、１５Ｌスケールの流加式培養により増殖させた場合の、メバロン酸生産量の調査
（ｉ）材料
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（７．５ｇ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ）（２ｇ）、クエン酸一水和物（Ｃ６Ｈ８Ｏ７ ＊Ｈ２Ｏ）（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（ＮＨ４ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ７）（０．３４ｇ）、酵母エキス（ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ）（０．５ｇ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１．５ｍｌ）、硫酸５０％ ｗ／ｖ（２．２６ｍｌ）、ｆｏａｍｂｌａｓｔ ８８２（Ｅｍｅｒａｌｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）（０．８３ｍｌ）、微量塩溶液（３．３６ｍｌ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。試験温度に冷却した後、水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調節し、用量に調整する。滅菌後に、供給溶液（Feed solution）＃１（１６．７ｇ）、ビタミン溶液（１１．９ｍＬ）及びスペクチノマイシン溶液（５ｍｌ）を加え、ｐＨを調整した。
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４ ＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２ ＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４ ＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４ ＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１成分ずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨ ３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：
ＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：
チアミン塩酸塩（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
スペクチノマイシン溶液（１Ｌ当たり）：
脱イオン水により５０ｇスペクチノマイシンを適量にし、０．２２μｍのフィルタによりろ過滅菌した。
供給溶液＃１（１キログラム当たり）：
グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９４ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）及びＦｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９４ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。
（ｉｉ）実験法
表８に記載の大腸菌（E. coli）ＢＬ２１株により１５Ｌのバイオリアクタで発酵を行った。各株には同一の条件で発酵を２回実施し、すなわち生産性についての結果は２回の試行の平均として記録することができた。
Figure 2017148063
大腸菌（E. coli）株を凍結したバイアルを解凍し、２．８Ｌの三角フラスコ内でトリプトン−酵母エキス培地（ＬＢ培地（ミラー））に接種し、バイオリアクタ用の接種菌液として使用した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。
本実験は、所望の発酵ｐＨ ７．０及び温度３４℃でのグルコースからのメバロン酸発酵をモニターするために実施した。培養を行っている間、８標準リットル／分の速度で空気を吹き込み、測定値７０ｋＰａ（０．７ｂａｒ）の背圧を保持し、インペラにより８５０ｒｐｍで撹拌を行い、かつ液体培地に伝わる力を調節して、好気性条件を維持した。
グルコース供給溶液はパルス様供給プログラムにより供給した。バッチのグルコースが枯渇するとすぐに、ｐＨの上昇（ｐＨ＞＝７．０５）によりシグナルを受け、３ｇ／ｍｉｎ分のパルスを２０分供給した。以降、グルコースの供給はｐＨの上昇（ｐＨ＞＝７．０５）に応じ実施した。パルスは３０分持続させ、規模（ｇ／ｍｉｎ）は、ブロス中に残留するグルコースを過剰な状態に保つのに必要とされる既定の係数により、総二酸化炭素放出速度（ｍｍｏｌ／ｈｒ）を除したものに等しかった。５２時間の発酵期間にバイオリアクタに供給されたグルコースの供給総量は株によって異なった。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施した。細胞のＯＤ５５０が４になったなら、４００μＭの濃度になるようＩＰＴＧを反応槽に添加した。バイオリアクタからの放出気体中の酸素、窒素及び二酸化炭素濃度は、Ｈｉｄｅｎ質量分析器により測定した。実験工程の間、各バイオリアクタから４時間おきにブロス試料を採取した。
ブロスのグルコース、クエン酸及びメバロン酸濃度はＨＰＬＣにより測定した。吸光度は、希釈したブロス懸濁液の５５０ｎｍでの吸光度を測定し、希釈係数をかけて決定し、得られた値（ＯＤ５５０）を記録した。ＯＤ５５０読み取り値は、予め、発酵の時間経過にわたってＯＤ５５０と細胞の乾燥重量を比較することで生成した係数を用い、乾燥細胞質量へと変換した。上記所定の定義を使用し、質量収率に関係する生産指数、比生産量、力価及び細胞生産性指数を、各２回の試行時の相当する時間で得られた結果の平均として記録した（「定義」の項を参照されたい）。
（ｉｉｉ）小規模メバロン酸収率アッセイ
２ｍＬのＬＢブロスに凍結保存品由来の５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン（Ｎｏｖａｇｅｎ）及び５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含有させたものを入れた振盪チューブに、一晩培養物を接種した。次に培養物を、３４℃にて２５０ｒｐｍで１４時間インキュベートした。次に、１％グルコース、最終濃度１％の酵母エキス及び２００μＭのＩＰＴＧを添加した２ｍＬのＴＭ３培地を入れた５ｍＬの４８ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、最終的なＯＤが０．２となるまで培養物を希釈した。プレートを、Ｂｒｅａｔｈ Ｅａｓｉｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、Ｓｈｅｌ Ｌａｂ振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。各培養物１ｍＬを３，０００×ｇで５分遠心分離した。２５０μｌの上清に、１９μＬの２０％硫酸を添加し、氷上で５分間インキュベートした。次に、混合物を３０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収した。２００μｌの上清を、ＨＰＬＣに適した９６ウェル円錐底ポリプロピレンプレート（Ｎｕｎｃ）に移した。メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定した。製造元（Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）の指定に従ってグルコースオキシダーゼアッセイを実施し、グルコース濃度を測定した。
（ｉｖ）ＨＰＬＣによるメバロン酸の検出：
５０℃でインキュベートし、ＢｉｏＲａｄ−マイクロガードＣａｒｂｏ−Ｈ詰め替えカートリッジ３０ｍｍ×４．６ｍｍ（カタログ番号１２５−０１２９）を取り付けた３００ｍｍ×７．８ｍｍ ＢｉｏＲａｄ−Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（カタログ番号１２５−０１４０）を使用し、Ｋｎａｕｅｒ Ｋ２３０１屈折率検出器を系に包含させたＷａｔｅｒｓ ２６９５ ＡｌｌｉａｎｃｅのＨＰＬＣ系でＨＰＬＣ解析を実施した。移動相に０．０１Ｎ硫酸を使用し、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで試料のＨＰＬＣ解析を実施した。各試料の屈折率を、濃度既知の各種メバロン酸溶液により作成した検量線に対し比較して、いずれものメバロン酸濃度を定量する。
生物のリステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を含有している大腸菌（E. coli）の回分式培養において、メバロン酸は、質量収率３４．８％〜４１．１％でグルコースから生成された（図１、表９）。
Figure 2017148063
１５Ｌ発酵槽での、生物のリステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を含有している大腸菌（E. coli）の流加式培養において、メバロン酸は、質量収率３９．１％〜４３．４％でグルコースから生成された（表１０）。
Figure 2017148063
生物のリステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を含有している大腸菌（E. coli）の、１５Ｌ発酵槽による流加式培養では、メバロン酸は、最大比生産量８７．５〜１００．１ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤでグルコースから生成された（表１１）。
Figure 2017148063
最終的に、生物のリステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を含有している大腸菌（E. coli）の、メバロン酸力価１０８．２〜１１５．４ｇ／Ｌの範囲であり（表１２）、かつＣＰＩは４．８６〜５．８０メバロン酸（ｇ）／グルコース（ｇ）の範囲であった（表１３）。
Figure 2017148063
Figure 2017148063
実施例８：宿主に対する変異を有するイソプレン生産株の構築
ＭＣＭ５２１可溶化液を使用し、ＣＭＰ６７６にメバロン酸経路の下流を形質導入することができる（表３を参照されたい）。製造元に従いカナマイシンマーカーを除去する（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＭＣＭ５２１の下流の経路は、別の遺伝子を使用することにより各遺伝子の前に位置するｒｂｓを改変し、オペロン上流のプロモータを変更することで改変することができる。プラスミドｐＭＣＭ１２２３（Ｌ.グレイ（L. grayi））、ｐＭＣＭ１２２４（Ｅ．フェシウム（E. faecium））、ｐＭＣＭ１２２５（Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum））、ｐＣＨＬ２７６（Ｅ．フェカリス（E. faecalis））又はｐＣＨＬ２７７（Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus））を、プラスミドｐＤＷ３４変異体と同時に電気穿孔した（米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７号；図２を参照されたい）。ｐＤＷ３４変異体のプラスミドは、活性の向上しているイソプレンシンターゼ変異体を含有している。ＬＢ＋スペクチノマイシン５０ｕｇ／ｍＬ＋カルベニシリン５０ｕｇ／ｍＬでコロニーを選択することができる。
得られた株を更に遺伝子操作して、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節する。この株は更に遺伝子操作して、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の１つ以上の遺伝子活性を向上させることができる。この株を更に遺伝子操作して、ピルビン酸デカルボキシラーゼ受容体タンパク質の活性を低下させることもできる。あるいは、得られる株を遺伝子操作して、クエン酸シンターゼの活性を調節することもできる。得られる株におけるクエン酸シンターゼの活性は、クエン酸シンターゼの活性を低下させることにより調節することもできる。あるいは、得られる株を遺伝子操作して、ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性を調節することもできる。ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性は、ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性を低下させることにより調節することができる。あるいは、得られる株を遺伝子操作して、乳酸デヒドロゲナーゼの活性の活性を調節することもできる。乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、乳酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させることにより調節することができる。あるいは、得られる株を遺伝子操作して、リンゴ酸酵素の活性を調節することもできる。乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、リンゴ酸酵素の活性を上昇させることにより調節することもできる。
実施例９：野生型Ｅ．フェカリス（E. faecalis）と比較して宿主に変異を有するプラスミドを含有している株におけるイソプレン生産量の増加
（ｉ）材料
ＴＭ３培地の組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）、ＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ）、酵母エキス（０．２ｇ）、１０００Ｘ微量金属溶液（１ｍＬ）。
すべての成分を共に加え、ｄｉＨ２Ｏに溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。０．２２μｍフィルタで培地を濾過滅菌する。滅菌及びｐＨ調整後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を添加する。
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌ当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４ ＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２ ＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４ ＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４ ＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１成分ずつｄｉＨ２Ｏに溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を用量に調整し、０．２２μｍフィルタでフィルタ滅菌する。
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、ＯＤ６００が０．０５になるよう細胞を２０ｍＬのＴＭ３培地（５０ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシン及び５０ｕｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有（２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコ））により希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。２時間生育させた後、ＯＤ６００を測定し、２００ｕＭのＩＰＴＧを加える。発酵工程の間、規則的に試料を採取する。各時点でＯＤ６００を測定する。また、ガスクロマトグラフ−マススペクトロメータ（ＧＣ−ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるヘッドスペースアッセイによりイソプレンのオフガス分析を行う。１００μＬの全ブロスをＧＣバイアルに入れ密閉し、３４℃かつ２００ｒｐｍで３０分間インキュベートする。７０℃で５分のインキュベーションからなる熱殺菌工程後、試料をＧＣに装填する。記録される比生産量は、イソプレン量のＧＣによる読み取り値（ｕｇ／Ｌ）を、インキュベート時間（３０分）及びＯＤ６００測定値で除算した値である。
（ｉｉｉ）結果：
株が１つ以上の宿主変異を含有する場合、ｐＣＨＬ２７６（Ｅ．フェカリス（E. faecalis））を含有している同様のバックグラウンドをもつ株と比較して、イソプレンの比生産量、収率、ＣＰＩ及び／又は力価の上昇が観察される。
実施例１０：アモルファジエン又はファルネセン生産株の構築
ＭＣＭ５２１可溶化液を使用し、ＣＭＰ６７６にメバロン酸経路の下流を形質導入する（表３を参照されたい）。製造元に従いカナマイシンマーカーを除去する（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＭＣＭ５２１の下流の経路は、別の遺伝子を使用することにより各遺伝子の前に位置するｒｂｓを改変し、オペロン上流のプロモータを変更することで改変することができる。染色体上のプロモータ及び／又はｒｂｓを変更させるか、又はプラスミドから発現させるかのいずれかにより、ファルネシル二リン酸合成酵素（ｉｓｐＡ）を過剰発現させる。プラスミドｐＭＣＭ１２２３（L. grayi）、ｐＭＣＭ１２２４（E. faecium）、ｐＭＣＭ１２２５（Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum））、ｐＣＨＬ２７６（Ｅ．フェカリス（E. faecalis））又はｐＣＨＬ２７７（Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus））を、プラスミドｐＤＷ３４変異体と同時電気穿孔した（米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７号；図２を参照されたい）。
ｐＤＷ３４変異体のプラスミドは、大腸菌（E. coli）用にコドンを最適化させたファルネセン合成酵素又は大腸菌（E. coli）用にコドンを最適化させたアモルファジエン合成酵素を、イソプレンシンターゼの代わりに含有する。ＬＢ＋スペクチノマイシン５０ｕｇ／ｍＬ＋カルベニシリン５０ｕｇ／ｍＬでコロニーを選択する。
得られた株を更に遺伝子操作して、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節する。この株は更に遺伝子操作して、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の１つ以上の遺伝子活性を向上させることができる。この株を更に遺伝子操作して、ピルビン酸デカルボキシラーゼ受容体タンパク質の活性を低下させることもできる。あるいは、得られる株を遺伝子操作して、クエン酸シンターゼの活性を調節することもできる。得られる株におけるクエン酸シンターゼの活性は、クエン酸シンターゼの活性を低下させることにより調節することもできる。あるいは、得られる株を遺伝子操作して、ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性を調節することもできる。ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性は、ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性を低下させることにより調節することができる。あるいは、得られる株を遺伝子操作して、乳酸デヒドロゲナーゼの活性の活性を調節することもできる。乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、乳酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させることにより調節することができる。あるいは、得られる株を遺伝子操作して、リンゴ酸酵素の活性を調節することもできる。乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、リンゴ酸酵素の活性を上昇させることにより調節することもできる。
実施例１１：野生型Ｅ．フェカリス（E. faecalis）と比較して宿主変異を有するプラスミドを含有している株におけるアモルファジエン又はファルネセンの生産量の増加
（ｉ）材料
ＴＭ３培地の組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）、ＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ）、酵母エキス（０．２ｇ）、１０００Ｘ微量金属溶液（１ｍＬ）。
すべての成分を共に加え、ｄｉＨ２Ｏに溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。次に、０．２２μｍのフィルタを用い培地を濾過滅菌した。滅菌及びｐＨ調整後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を添加する。
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌ当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４ ＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２ ＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４ ＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４ ＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１成分ずつｄｉＨ２Ｏに溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を用量に調整し、０．２２μｍフィルタでフィルタ滅菌する。
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、ＯＤ６００が０．０５になるよう、２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコにおいて細胞を２０ｍＬのＴＭ３培地（５０ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシン及び５０ｕｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有）により希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。接種前に、各培養フラスコには２０％（ｖ／ｖ）ドデカン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を積層し、これまでに記載のとおり、揮発性セスキテルペン産物を捕捉する（Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ．ａｌ．，２００６）。
２時間生育させた後、ＯＤ６００を測定し、０．０５〜０．４０ｍＭのイソプロピルβ−ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えた。発酵工程の間、規則的に試料を採取する。各時点でＯＤ６００を測定する。また、積層したドデカンを酢酸エチルに希釈し、有機層中のアモルファジエン又はファルネセン濃度を分析する。ドデカン／エチルアセテート抽出物を、従来記載されている通りの（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１：９６〜８０２）ＧＣ−ＭＳ法により、アモルファジエンの分子イオン（２０４ｍ／ｚ）及び１８９ｍ／ｚフラグメントイオン又はファルネセンの分子イオン（２０４ｍ／ｚ）の観察により解析する。濃度既知のアモルファジエン又はファルネセン試料を装填して、それぞれアモルファジエン又はファルネセンの標準曲線を生成する。試料中のアモルファジエン又はファルネセンの量は、それぞれアモルファジエン又はファルネセンの標準曲線を使用し算出する。
（ｉｉｉ）結果
株が１つ以上の宿主変異を含有する場合、ｐＣＨＬ２７６（Ｅ．フェカリス（E. faecalis））を含有している同様のバックグラウンドをもつ株と比較して、アモルファジエン又はファルネセンの比生産量、収率、ＣＰＩ及び／又は力価の上昇が観察される。
（ｉｖ）引用文献：
Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｍａｒｓｈａｌ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｃ．Ｙ．，Ｎｏｗｒｏｏｚｉ，Ｆ．，Ｐａｒａｄｉｓｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｐｉｔｅｒａ，Ｄ．Ｊ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．，２００６．「代謝系に遺伝子操作を行った大腸菌（E. coli）による二相分画バイオリアクタにおけるアモルファ−４，１１−ジエンの高濃度生産（High-level production of amorpha-4,11-diene in a two-phase partitioning bioreactor of metabolically engineered E. coli）」。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５，６８４〜６９１。
Ｍａｒｔｉｎ，Ｖ．Ｊ．，Ｐｉｔｅｒａ，Ｄ．Ｊ．，Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｓ．Ｔ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．，２００３．「テルペノイド生産のための大腸菌（E. coli）のメバロン酸経路の遺伝子操作（Engineering a mevalonate pathway in E. coli for production of terpenoids.）」Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，７９６〜８０２。
実施例１２：大腸菌（E. coli）ＢＬ２１又は大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた時に分解しないＭｖａＥタンパク質の同定
細胞で異種発現させたタンパク質が分解することで、タンパク質の合成及び分解という無駄なサイクルによりＡＴＰの損失が生じる、分解するタンパク質の触媒活性が減少する、対象とするタンパク質の定常状態の細胞内濃度が減少する、細胞生理を変更し得るストレス応答を誘導する、及び生物に由来する市販の製品に有害となる可能性のあるその他の効果が生じる恐れがある（Ｓ．−Ｏ．Ｅｎｆｏｒｓ，２００４）。したがって、分解しにくい完全長のタンパク質を発現させることは、代謝工学の面から有益である。ウェスタンブロットにより検出される断片により示される通り、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子産物は、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１で発現させた場合に部分的に分解する（図３）。Ｈｉｓタグ生成した試料を泳動したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＳａｆｅｓｔａｉｎ染色により、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）ＭｖａＥの切断断片も検出された（図４）。分解耐性のあるｍｖａＥ遺伝子産物の同定及び使用は、メバロン酸、イソプレン及びイソプレノイドの生産量を増加させるのに有用である。
大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをＳａｆｅｓｔａｉｎで染色して同定した後、Ｈｉｓタグにより精製を行ったところ、すなわちメバロン酸、イソプレン又はイソプレノイドを生産する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させて記載の検出方法を使用したところ、識別可能な断片は存在していないことが示されたことから、生物のＥ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及びＬ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥの遺伝子産物は分解していないことが立証された。
（ｉ）方法
Ｈｉｓタグを付した、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）及びＬ．グレイ（L. grayi）由来のＭｖａＥをコードしているＤＮＡを含有するプラスミドを構築する。ＭｖａＥを大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、Ｎｉ−樹脂クロマトグラフィーで精製する。精製した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析する。アニオン交換クロマトグラフィーにより、及び一部の場合ではゲルろ過により試料を更に精製する。均一性が９５％以上になるよう精製した試料を、ポリクローナル抗体の作製に使用する。ウェスタンブロットにより生産株を解析し、対象とするＭｖａＥに対し作製したポリクローナル抗体を用い標識した。
（ｉｉ）引用文献：
Ｅｎｆｏｒｓ，Ｓ．Ｏ．，Ｓｃｈｅｐｅｒ，Ｔ．「バイオプロセスにおける生理的なストレス応答（Physiological Stress Responses in Bioprocesses）」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ２００４。
実施例１３：ＣＭＰ４５１（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ ｇｌｔＡ）、ＣＭＰ４５２及びＣＭＰ４５３の構築
ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）中のクエン酸シンターゼ遺伝子（ｇｌｔＡ）の前に位置するプロモータを、常時低発現型プロモータ、すなわちＧＩ１．２（米国特許第７，３７１，５５８号）により置き換えた。ｇｌｔＡに関して報告されている２種の野生型プロモータ（Ｗｉｌｄｅ，Ｒ及びＪ．Ｇｕｅｓｔ．１９８６．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３２３９〜３２５１）及び合成プロモータを、遠位プロモータの−３５領域の直後に挿入した。プライマーＵｐｇｌｔＡＣｍ−Ｆ（５’−ＴＡＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＣＡＴＣＴＡＡＴＴＴＧＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧＧ−３’）及びＤｎｇｌｔＡ１．ｘｇｉＣｍ−Ｒ（５’−ＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＴＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＴＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＴＨＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧ−３’）、並びにテンプレートとしてＧｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴテンプレートＤＮＡを使用し、ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物を精製し、製造元（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による記載に従って、λｒｅｄを用いる組み換えに使用した。更なる評価にあたって、複数種のコロニーを選択した。プロモータ領域は、プライマーｇｌｔＡＰｒｏｍＳｅｑＦ（５’−ＧＧＣＡＧＴＡＴＡＧＧＣＴＧＴＴＣＡＣＡＡＡＡＴＣ−３’）及びｇｌｔＡｐｒｏｍＳｅｑＲ（５’−ＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＴＣＡＧＣ−３’）と、テンプレートとしてコロニーから抽出したＤＮＡ（コロニーを３０ｕＬのＨ２Ｏに再懸濁し、９５℃で４分加熱し、スピンダウンしたもの。５０ｕＬのＰＣＲ反応には、この溶液のうち２ｕＬをテンプレートとして使用する）とを使用しＰＣＲ増幅させた。得られたＰＣＲ産物の配列決定結果を観察した後、３種の異なるプロモータＧＩ１．２、ＧＩ１．５及びＧＩ１．６（米国特許第７，３７１，５５８号）をそれぞれ保有しているコロニーを、更なる使用のため保存した。これらのコロニーは、それぞれＣＭＰ１４１、ＣＭＰ１４２及びＣＭＰ１４３と名づけた（表１４）。
Figure 2017148063
Figure 2017148063
ＣＭＰ２５８（米国特許出願第１２／９７８，３２４を参照されたい）をＭＣＭ５２１株のＰ１可溶化液（米国特許出願第第１２／９７８，３２４号を参照されたい）により形質導入し、２０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したルリア・ベルターニプレートでコロニーを選択して、ＭＤ０９−３１３株を構築した。Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃに記載の方法に従ってＰ１可溶化液を調製した。製造元により推奨されるプロトコルを用い（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）カナマイシンマーカーを除去し、ＭＤ０９−３１４株を作製した。
株ＣＭＰ１４１、ＣＭＰ１４２、及びＣＭＰ１４３から可溶化液を調製し、これらを株ＭＤ０９−３１４に形質導入し、ＣＭＰ４４０、ＣＭＰ４４１及びＣＭＰ４４２をそれぞれ作製した（表３）。製造元（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により推奨されるプロトコルを用い、クロラムフェニコールマーカーを除去し、株ＣＭＰ４５１、ＣＭＰ４５２及びＣＭＰ４５３をそれぞれ作製した（表１４）。
実施例１４：クエン酸シンターゼのアッセイ及び結果
Ｓｕｄｇｅｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｎｅｗｓｈｏｌｍ，Ｅ．１９７５．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１５０：１０５〜１１１における記載と同様の方法により、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）の活性を測定した。要約すると、ＤＴＮＢとの反応により、アセチルＣｏＡからのＣｏＡＳＨの生成が４１２ｎｍで測定される。
株ＭＤ０９−３１３、ＣＭＰ４５１、ＣＭＰ４５２及びＣＭＰ４５３を、３４℃かつ２００ｒｐｍで、５ｍｌのＬＢにおいて一晩生育させた。１０ｇ／Ｌのグルコースを添加した２０ｍＬのＴＭ３培地を用い、ＯＤ６００が０．０５になるようこれらの株を希釈した（これまでに米国特許第７，７４５，１８４号、第３２段、第４６〜６１行に記載）。ＯＤ６００がおよそ２〜３になるまで、３４℃及び２００ｒｐｍで細胞を生育させた。ブロスを遠心分離し、得られたペレットを−８０℃で保存した。アッセイ当日にペレットをアッセイ用緩衝液に再懸濁し、圧力式細胞破砕機を使用して細胞を破壊した。したがって、得られた可溶化液をクエン酸シンターゼアッセイに使用した。
アッセイ結果を図６に示す。株４５１及び４５２は野生型と比較して約半分の活性を有していたのに対し、株ＣＭＰ４５３は、野生型のおよそ１．５倍の活性を有していた。
実施例１５：ＭＣＭ１００２株の構築
電気穿孔法により株ＣＭＰ２５８にプラスミドｐＭＣＭ８２（ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒ）を導入し、コロニーをＬＢ＋スペクチノマイシン５０ｕｇ／ｍＬで選択した。１つのコロニーを選択し、電気穿孔法によりｐＴｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を導入し、形質転換体をＬＢ＋スペクチノマイシン５０ｕｇ／ｍｌ及びカルベニシリン５０ｕｇ／ｍＬで選択した。１つのコロニーを採取し、ＭＣＭ１００２２と命名した。
実施例１６：株ＣＭＰ６０４（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ ｇｌｔＡ ａｃｋＡ−ｐｔａ：：Ｃｍ）、ＣＭＰ７２３（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ｇｌｔＡ ａｃｋＡ−ｐｔａ）及びＣＭＰ７３５（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ｇｌｔＡ ａｃｋＡ−ｐｔａ ａｔｔＢ：：Ｃｍ）の構築
クロラムフェニコールマーカーにより破壊されたａｃｋＡ−ｐｔａ遺伝子を含有しているＤＮＡ断片を、テンプレートしてクロラムフェニコールマーカーが存在しているＴｒｉｐｌｅ Ｔｒｉｐｌｅ株を使用し（米国特許第７，７４５，１８４（Ｂ２）号）プライマーａｃｋＡＣＦ（５’−ＧＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＣＡＡＣＴＣＡＧＣＧＧ−３’）及びｐｔａＣＲ（５’−ＣＡＣＣＡＡＣＧＴＡＴＣＧＧＧＣＡＴ ＴＧＣＣ−３’）を使用して、ＰＣＲにより増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、製造元（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の推奨する通りに組み換え反応に使用し、ＣＭＰ２５８株のａｃｋＡ−ｐｔａ座に組み入れた（米国特許出願第１２／９７８，３２４号を参照されたい）。ＬＢ＋５ｕｇ／ｍｌのクロラムフェニコールにてコロニーを選択した。コロニーを１つ選択し、ＭＤ４９１と名づけた。ＭＤ４９１のＰ１可溶化液を調製し、ＣＭＰ４５１株の形質導入に使用した。ＬＢ＋５ｕｇ／ｍｌのクロラムフェニコールにてコロニーを選択した。コロニーを１つ選択し、ＣＭＰ６０４と名づけた。製造元により推奨されるプロトコルを用い（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）クロラムフェニコールマーカーを除去して株ＣＭＰ７２３を作製した。ＣＭＰ７２３に株ＣＭＰ６４６のＰ１可溶化液により形質導入を行った（実施例１８を参照されたい）。ＬＢ＋５ｕｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有させたプレートでコロニーを選択した。１つのコロニーを採取し、ＣＭＰ７３５と命名した。
実施例１７：株ＣＭＰ５９６（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ ｇｌｔＡ ｌｄｈＡ：：Ｋａｎ）、ＣＭＰ８１２（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ ｇｌｔＡ ｌｄｈＡ：：Ｋａｎ ａｔｔＢ：：Ｃｍ）及びＣＭＰ８２８（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ ｇｌｔＡ ｌｄｈＡ ａｔｔＢ）の構築
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）中にカナマイシンマーカーを含有しているＣＭＰ３７４株（下記を参照）のＰ１可溶化液により、ＣＭＰ４５１株に形質導入を行った。コロニーをＬＢ＋２０ｕｇ／ｍｌカナマイシンに播種した。１つのコロニーを採取し、ＣＭＰ５９６と命名した。株ＣＭＰ５９６のＰ１可溶化液によりＣＭＰ６４６に形質導入を行った（実施例１８を参照されたい）。ＬＢ＋５ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコールで形質導入体を選択した。１つのコロニーを採取し、ＣＭＰ８１２と命名した。製造元により推奨されるプロトコルを用いカナマイシン及びクロラムフェニコールマーカーを一工程で除去し（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＣＭＰ８２８株を作製した。
実施例１８：株ＣＭＰ６２０（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ ｇｌｔＡ ａｃｋＡ−ｐｔａ：：Ｃｍ ｌｄｈＡ：：Ｋａｎ）及びＣＭＰ６３５（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ ｇｌｔＡ ａｃｋＡ−ｐｔａ ｌｄｈＡ）の構築
テンプレートとしてＫｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：２００６．０００８）のＪＷ １３７５株を使用し、プライマーはｌｄｈＡｓｅｑＲ（５’−ＧＧＣＴＴＡＣＣＧＴＴＴＡＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＣ−３’）及びｌｄｈＡｓｅｑＦ２（５’−ＣＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＣＣＧＡＧＣ−３’）を使用し、カナマイシンマーカーにより破壊されているｌｄｈＡ遺伝子を含有しているＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、製造元（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の推奨する通りに組み換え反応に使用し、ＭＤ０９−３１３株のｌｄｈＡ座に組み入れた。ＬＢ＋２０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンにてコロニーを選択した。コロニーを１つ選択し、ＣＭＰ３７４と名づけた。ＣＭＰ３７４のＰ１可溶化液を調製し、ＣＭＰ６０４株の形質導入に使用した。ＬＢ＋２０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンにてコロニーを選択した。コロニーを１つ選択し、ＣＭＰ６２０と名づけた。株に電気穿孔法によりｐＣＰ２０を導入して、クロラムフェニコール及びカナマイシンマーカーを同時に除去し（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ．２０００．ＰＮＡＳ ９７：６６４０〜５）、３０℃下でＬＢ＋５０ｕｇ／ｍｌのカルベニシリンで２つのコロニーを選択し、次に、これらのコロニーを、４２℃下でＬＢプレートに再画線した。これらのプレートからクロラムフェニコール及びカナマイシン感受性のコロニーを選択し、ＣＭＰ６３５と名づけた。
実施例１９：株ＣＭＰ６７４（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ ｇｌｔＡ ａｔｔＢ：：Ｃｍ）及びＣＭＰ６７６（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ ｇｌｔＡ ａｃｋＡ−ｐｔａ ｌｄｈＡ ａｔｔＢ：：Ｃｍ）の構築
テンプレートとしてプラスミドｐＫＤ３（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．，及びＷａｎｎｅｒ，Ｂ．２０００．ＰＮＡＳ ９７：６６４０〜６６４５）を使用し、プライマーＣＭＰ１７１（５’−ＡＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＴＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＡＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＡＣＧＧＴＴＴＧＴＣＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣ−３’）及びＣＭＰ１７２（５’−ＧＡＣＣＡＧＣＣＧＣＧＴＡＡＣＣＴＧＧＣＡＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡＣＧＧＴＴＧＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＧ ＣＧＧ ＧＧＣＡＴＴ ＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ−３’）を使用して、ＤＮＡホモログによりλ挿入部位ａｔｔＢの上流及び下流部位に隣接しているクロラムフェニコールマーカーを含有しているＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ産物を、製造元（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の推奨する通りにＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）における組み換え反応に使用し、λ挿入部位ａｔｔＢに組み入れた。これにより生成されたＣＭＰ６４６株を、ＬＢ＋５ｕｇ／ｍｌのクロラムフェニコールにて選択した。ＣＭＰ６４６のＰ１可溶化液を調製し、株ＣＭＰ４５１及びＣＭＰ６３５に対する形質導入反応に使用し、この株の染色体からメバロン酸経路下流（メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ）を除去した。形質導入物をＬＢ＋クロラムフェニコール５ｕｇ／ｍｌに播種し、各形質導入からコロニーを１つずつ選択し、それぞれＣＭＰ６７４及びＣＭＰ６７６と名づけた。
実施例２０：株ＣＭＰ６７８（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ １．２ ｇｌｔＡ，ｐＣＨＬ２７６）、ＣＭＰ６８０（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ １．２ ｇｌｔＡ ａｃｋＡ−ｐｔａ ｌｄｈＡ ａｔｔＢ：：Ｃｍ）、ＣＭＰ６９４（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ，ｐＣＨＬ２７６）、ＣＭＰ７３６（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ ｇｌｔＡ ａｃｋＡ−ｐｔａ ａｔｔＢ：：Ｃｍ，ｐＣＨＬ２７６）及びＣＭＰ８３２（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ ｇｌｔＡ ｌｄｈＡ ａｔｔＢ，ｐＣＨＬ２７６）の構築
電気穿孔法により、プラスミドｐＣＨＬ２７６を株ＣＭＰ６７４、ＣＭＰ６７６、ＣＭＰ２５８、ＣＭＰ７３５及びＣＭＰ８２８に導入した。コロニーをＬＢ＋５０ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシンにて選択した。各形質転換物からコロニーを１つずつ選択し、それぞれＣＭＰ６７８、ＣＭＰ６８０、ＣＭＰ６９４、ＣＭＰ７３６及びＣＭＰ８３２と名づけた。
実施例２１：ＧＩ１．２ｇｌｔＡコンストラクトを含有している株におけるメバロン生産量は親株と比較して増加し、かつａｃｋＡ−ｐｔａ ｌｄｈＡを含有している株におけるメバロン生産量は親株又は同時に１つのみの変異を含有している株と比較して増加した 本例では、株ＣＭＰ６７８、ＣＭＰ６８０、ＣＭＰ６９４、ＣＭＰ７３６及びＣＭＰ８３２でのメバロン酸の生産を示す。
（ｉ）材料
ＴＭ３培地の組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）、ＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ）、酵母エキス（０．２ｇ）、１０００Ｘ微量金属溶液（１ｍＬ）。
すべての成分を共に加え、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整した。０．２２μｍフィルタで培地を濾過滅菌した。滅菌及びｐＨ調整後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を添加した。
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌ当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４ ＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２ ＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４ ＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４ ＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１成分ずつｄｉＨ２Ｏに溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を用量に調整し、０．２２μｍフィルタでフィルタ滅菌する。
（ｉｉ）実験手順
細胞をルリア・ベルターニブロスで一晩生育させた。翌日、ＯＤ６００が０．０５になるよう、２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコにおいて細胞を２０ｍＬのＴＭ３培地（５０ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有）により希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。２時間生育させた後、ＯＤ６００を測定し、１００ｕＭのＩＰＴＧを加える。発酵工程の間、規則的に試料を採取した。各時点でＯＤ６００を測定し、かつＨＰＬＣによりメバロン酸濃度を測定した。次の様式でＨＰＬＣ解析を実施した：５００ｕＬのブロスに１５ｕＬの７０％（ｗ／ｖ）過塩素酸を加え、混合物を氷上で５分インキュベートした。次に、試料を１４，０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収し、次の条件でＨＰＬＣ解析を実施した：（１）ＢｉｏＲａｄ−ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）（カタログ番号１２５−０１４０）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；（２）カラム温度＝５０℃；（３）ＢｉｏＲａｄ−マイクロガードＣａｒｂｏ−Ｈ詰め替えカートリッジ（３０ｍｍ×４．６ｍｍ）（カタログ番号１２５−０１２９）（ＢｉｏＲａｄ）；（４）移動相＝０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４；（５）流速＝０．６ｍｌ／ｍｉｎ；（６）およその圧力＝約６５５０．０ｋＰａ（９５０ｐｓｉ）；（７）装填量＝１００μＬ；（８）実施時間＝２６分。
（ｉｉｉ）結果
ＣＭＰ６９４株（親株）を対照として用い、ＣＭＰ６７８（ＧＩ１．２ｇｌｔＡ）株を評価した。
この試験により、ｇｌｔＡプロモータが下方調節されている株ＣＭＰ６７８では、野生型ｇｌｔＡプロモータ（ＣＭＰ６９４）を有する株と比較して、同量のグルコースから得られる力価が上昇していたことが示された（図８）。ｇｌｔＡプロモータが下方調節されている株は、野生型プロモータを有する株と比較して、わずかにＯＤが低くなるような速度で生育した（図７）。
株ＣＭＰ６７８（親株）を対照として使用して、株ＣＭＰ６８０（ａｃｋＡ−ｐｔａ ｌｄｈＡ）、ＣＭＰ７３６（ａｃｋＡ−ｐｔａ）及びＣＭＰ８３２（ｌｄｈＡ）を評価した。ａｃｋＡ−ｐｔａ変異は、生育を遅くし、株の最終的なＯＤを低くするという影響を与えたのに対し、ｌｄｈＡ変異は生育に影響を与えなかった（図７）。ａｃｋＡ−ｐｔａ変異及びｌｄｈＡ変異の組み合わせでは、生育が遅くなり、更に最終的なバイオマスも減少したことが示された（図７）。ａｃｋＡ−ｐｔａ又はｌｄｈＡ変異は、それぞれ単独ではメバロン酸の最終濃度の上昇には寄与しなかったものの、組み合わせた場合には力価を（及び小規模では、力価に関連するため収率も）２５０％も上昇させた（図８）。
実施例２２：ＣＭＰ６６２（ＢＬ２１ ＦＲＴ−Ｃｍ−ＦＲＴ−ＧＩ１．２ ｍａｅＢ）の構築
ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素（ｍａｅＢ）の前にあるネイティブプロモータを、常時発現型プロモータ、すなわちＧＩ１．２と置き換えた（米国特許第７，３７１，５５８号）。新しいプロモータの挿入部位は、すぐ上流にあリ逆向きに翻訳される遺伝子（ｔａｌＡ）の発現に影響を与えないよう注意深く選択した（図９）。ｍａｅＢプロモータについては報告があるが、ｔａｌＡプロモータについては実験により特定した（Ｌａｃｏｕｒ ＆ Ｌａｎｄｉｎｉ，２００４，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８６：７１８６〜７１９５）。
プライマーｍａｅＢ＿ＧＩ１．ｘｐＫＤ３（５’−ＡＣＴ ＧＧＡ ＡＡＴ ＴＣＡ ＴＧＧ ＡＡＡ ＴＣＡ ＡＧＴ ＧＣＡ ＣＴＴ ＴＧＴ ＴＴＴ ＡＡＣ ＴＧＧ ＴＣＡ ＴＣＣ ＡＴＴ ＡＴＡ ＴＡＣ ＣＴＣ ＣＴＧ ＣＴＡ ＴＴＴ ＧＴＴ ＡＧＴ ＧＡＡ ＴＡＡ ＡＡＧ ＴＧＧ ＴＴＧ ＡＡＴ ＴＡＴ ＴＴＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＡＴＧ ＴＧＧ ＣＡＴ ｎ ＧＴ ＣＡＡ ＧＧＧ ＣＧＴ ＧＴＡ ＧＧＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＴＧＣ ＴＴＣ−３’）及びｍａｅＢＵｐ＿ｐＫＤ３（５’−ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＧＧ ＡＣＴ ＴＧＣ ＴＣＡ ＡＡＧ ＴＣＴ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＣＣ ＧＧＣ ＡＧＧ ＧＴＡ ＡＴＡ ＡＴＧ ＴＧＣ ＧＣＣ ＡＣＧ ＴＴＧ ＴＧＧ ＧＣＡ ＧＧＧｇのＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣ−３’）と、テンプレートとしてプラスミドｐＫＤ３（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ＆ Ｗａｎｎｅｒ ２０００，ＰＮＡＳ ９７：６６４０〜６６４５）とを使用し、ＰＣＲ産物を得た。製造元に従い酵素ヘルクラーゼＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＵＳ）を使用した。ＰＣＲ産物を精製し、製造元の記載に従って（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）λｒｅｄを用いる組み換えに使用した。更なる評価にあたって、複数種のコロニーを選択した。プロモータ領域は、プライマーｍａｅＢＰｒｏｍｓｅｑＦ：ＧＴＧＡＡＣＴＧＴＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＣ及びｍａｅＢＰｒｏｍＳｅｑＲ：ｃｃｇｔａｃｃｇｔｔａｇａｇａｔｃａｃｃと、テンプレートとしてコロニーから抽出したＤＮＡ（コロニーを３０ｕＬのＨ２Ｏに再懸濁し、９５℃で４分加熱し、スピンダウンしたもの。
５０ｕＬのＰＣＲ反応には、この溶液のうち２ｕＬをテンプレートとして使用する）とを使用しＰＣＲ増幅させた。得られたＰＣＲ産物の配列決定結果を観察した後、ＧＩ１．２プロモータ（米国特許第７，３７１，５５８号）を保有しているコロニーを、更なる使用のため保存した。このコロニーをＣＭＰ６６２と名づけた（表３）。株ＣＭＰ６６２のＰ１可溶化液を調製し、ＣＭＰ４５１の形質導入に使用した。ＬＢ＋５ｕｇ／ｍｌのクロラムフェニコールにてコロニーを選択した。コロニーを１つ選択し、ＭＤＣＭＰ６７１と名づけた。製造元により推奨されるプロトコルを用い（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）クロラムフェニコールマーカーを除去して株ＣＭＰ６８を作製した。株ＣＭＰ６４６のＰ１可溶化液によりＣＭＰ６８１に形質導入を行った（実施例１８を参照されたい）。ＬＢ＋５ｕｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有させたプレートでコロニーを選択した。１つのコロニーを採取し、ＣＭＰ７０６と命名した。
実施例２３：株ＭＤ１０−４３２（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ Ｇｉ１．２−ｇｌｔＡ ｐｄｈＲ：：Ｋａｎ）、ＭＤ１０−４３５（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ Ｇｉ１．２−ｇｌｔＡ ｐｄｈＲ）及びＣＭＰ７２５（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ Ｇｉ１．２−ｇｌｔＡ ｐｄｈＲ ａｔｔＢ：：Ｃｍ）−ｐｄｈＲ変異細胞株の構築
カナマイシンマーカーにより破壊されたｐｄｈＲ遺伝子を含有しているＤＮＡ断片を、Ｋｅｉｏコレクション（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：２００６．０００８）の株ＪＷ０１０９を使用し、プライマーＭＱ１０−８２Ｆ（５’−ＧＧＴＡＡＧＴＧＡＡＴＣＧＧＴＴＣＡＡＴＴＣＧＧ−３’）及びＭＱ１０−８２Ｒ（５’−ＣＧＣＴＣＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＧＧＡＴＧ−３’）を使用して、ＰＣＲ増幅させた。得られたＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）により精製し、製造元の推奨に従い組み換え反応を行って（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＰＣＲ産物を株ＭＤ０９−２７３のｐｄｈＲ座に組み込んだ。ＬＡ＋Ｋａｎ １２．５ｕｇ／ｍｌプレートにおいて３７℃にてインキュベートし、形質転換体を選択した。コロニーを１つ選択し、ｐｄｈＲ遺伝子領域の約２５０ｂｐ上流及び下流のプライマーＭＱ１０−８３Ｆ（５’−ＣＣＴＧＴＡＴＧＧＡＣＡＴＡＡＧＧＴＧＡＡＴＡＣ−３’）及びＭＱ１０−８３Ｒ（５’−ＣＣＴＧＴＣＣＣＡＴＴＧＡＡＣＴＣＴＣＧＣＣＧＧ−３’）を使用して確認した。正しい変異株をＭＤ１０−４２９と名づけた。
株ＭＤ１０−４２９のＰ１可溶化液を調製し、ＣＭＰ４５１の形質導入に使用した。コロニーをＬＢ＋Ｋａｎ １２．５ｍｇ／ｍｌで選択した。外側のプライマーＭＱ１０−８３Ｆ（５’−ＣＣＴＧＴＡＴＧＧＡＣＡＴＡＡＧＧＴＧＡＡＴＡＣ−３’）及びＭＱ１０−８３Ｒ（５’−ＣＣＴＧＴＣＣＣＡＴＴＧＡＡＣＴＣＴＣＧＣＣＧＧ−３’）を使用するＰＣＲにより、形質導入体のコロニーのうちのいくつかを選択した。ＣＭＰ４５１バックグラウンド株のうち、正しい変異を有する株をＭＤ１０−４３２と名付ける。
ｐＣＰ２０の電気穿孔によるＦＲＴ組み換えによりカナマイシンマーカーを除去し（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ，２０００，ＰＮＡＳ ９７：６６４０〜５）、３０℃下で、ＬＡ＋５０ｕｇ／ｍｌカルベニシリンにおいて２種のコロニーを選択し、次に対象とするコロニーを３７℃下でＬＡプレートに画線した。得られた、マーカーを不含有の株をＭＤ１０−４３５と名付けた。株ＣＭＰ６４６から調製したＰ１可溶化液により株ＭＤ１０−４３５に形質導入を行った（実施例１８を参照されたい）。ＬＢ＋５ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコールで形質導入体を選択した。１つのコロニーを採取し、ＣＭＰ７２５と命名した。
実施例２４：株ＭＤ１０−４３４（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．６−ｒｂｓ−ｙＩＤＩ−ａｓｐＡ ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ＋Ｃｍ：：ＰＬ．６−ｐｄｈ）、ＭＤ１０−４４０（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ Ｇｉ１．２−ｇｌｔＡ＋Ｃｍ：：ＰＬ．６−ｐｄｈ）及びＭＤ１０−４４６（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ Ｇｉ１．２−ｇｌｔＡ＋ＰＬ．６−ｐｄｈ）−ＰＬ．６−ｐｄｈ変異細胞株の構築
天然のプロモータを常時高発現型のプロモータ、すなわちＰＬ．６により置き換え、ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）においてＰｄｈオペロン（ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体）の前に存在するプロモータを改変した。ｐＫＤ３プラスミド由来のＦＲＴ部位と隣接させたクロラムフェニコール遺伝子をプライマーＭＱ１０−８４Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＡＣＧＴＴＡＴＴＡＧＡＴＡＧＡＴＡＡＧＧＡＡＴＡＡＣＣＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ−３’）及びＭＱ１０−８４Ｒ（５’−ＣＧＴＣＡＴＴＴＧＧＧＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧＡＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＧＣＴＣＡＧＴＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＴＧＧＴＡＴＴＴＡＴＧＴＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧＡＴＡＡＴＴＴＡＴＣＡＣＣＧＣＡＧＡＴＧＧＴＴＡＴＣＴＧＴＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡ−３’）を使用して増幅させ、ＰＣＲ産物を得た（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ．２０００，ＰＮＡＳ ９７：６６４０〜５）。完全なＰＤＨオペロン（ａｃｅＥ、ａｃｅＦ及びｌｐｄＡ）を増幅させるため、テンプレートとしてＢＬ２１を使用し、プライマーＭＱ１０−８５Ｆ（５’−ＡＴＧＴＣＡＧＡＡＣＧＴＴＴＣＣＣＡＡＡＴＧＡＣＧ−３’）及びＭＱ１０−８５Ｒ（５’−ＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＴＡＧＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＣＣＧＧＡＴＧＴＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＣＴＴＴＣＧＧＧＴＴＣ−３’）を使用して、第２段階のＰＣＲ産物を生成した。融合ＰＣＲを使用し、プライマーＭＱ１０−８４Ｆ ＆ ＭＱ１０−８５Ｒにより両方のＤＮＡ断片を一緒に融合させた。約１．６ＫｂｐのＰＣＲ産物を得て、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用して精製した。株ＭＤ０９−２７３において、ＰＤＨプロモータを標的とし、約３００〜４００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を使用して、製造元による記載に従いλ−ｒｅｄ介在型（lambda red-mediated）組み換えを行った（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
この組み込み操作での組み込みがうまく行かなかった場合には、ＰＣＲ産物は、より短いリバースプライマー（ＭＱ１０−９１Ｒ５’−ＧＡＡＧＴＧＧＴＴＡＡＡＧＣＡＣＡＣ−３’）を使用して再増幅させた。結果として、約１．６ｋｂｐのＰＣＲ産物を良好にＭＤ０９−２７３に組み込んだ。形質転換体をＬＡ＋クロラムフェニコール５ｕｇ／ｍｌで選択した。いくつかのコロニーを選択し、プライマーＭＱ１０−８４Ｆ ＆ ＭＱ１０−８４Ｒを使用して更に評価した。更に検証を行うため、他のプライマーＭＱ１０−８４Ｆ ＆ ＭＱ１０−９１Ｒを使用しプロモータ領域をＰＣＲで増幅した。得られたＰＣＲ産物に対し配列決定を行ったところ、配列は正しかったことが示されたため、ＭＤ１０−４３４と名づけた。
ＭＤ１０−４３４のＰ１可溶化液を調製し、ＣＭＰ４５１株の形質導入に使用した。形質導入体をＬＢ＋クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌで選択した。プライマーＭＱ１０−８４Ｆ ＆ ＭＱ１０−８４Ｒを使用し、ＰＣＲによりいくつかのコロニーを確認した。
１つの変異体を選択し、ＭＤ１０−４４０と名づけた。
プラスミドｐＣＰ２０を使用し、ＦＲＴ組み換えによりクロラムフェニコールマーカーを除去した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ＆ Ｗａｎｎｅｒ．２０００．ＰＮＡＳ ９７：６６４０〜５）。３０℃下、ＬＡ＋５０ｕｇ／ｍｌカルベニシリンで形質転換体が得られたならば、２つのコロニーをＬＢプレートに再画線し、３７℃でインキュベートした。これらのプレートからクロラムフェニコール感受性のコロニーを選択し、ＭＤ１０−４４６と名づけた。
株ＭＤ１０−４４６のＰ１可溶化液によりＣＭＰ６４６に形質導入を行った（実施例１８を参照されたい）。ＬＢ＋５ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコールで形質導入体を選択した。１つのコロニーを採取し、ＭＤ１０−５５１と命名した。プラスミドｐＣＰ２０を使用し、ＦＲＴ組み換えによりクロラムフェニコールマーカーを除去した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ＆ Ｗａｎｎｅｒ．２０００．ＰＮＡＳ ９７：６６４０〜５）。３０℃下、ＬＡ＋５０ｕｇ／ｍｌカルベニシリンで形質転換体が得られたならば、２つのコロニーをＬＢプレートに再画線し、３７℃でインキュベートした。これらのプレートからクロラムフェニコール感受性のコロニーを選択し、ＭＤ１０−５５４と名づけた。
実施例２５：株ＭＤ１０−５５５（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ １．２ ｇｌｔＡ ＰＬ．６ｐｄｈ ａｔｔＢ：：Ｃｍ，ｐＣＨＬ２７６）、ＣＭＰ７１１（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ ｇｌｔＡ ＧＩ１．２ ｍａｅＢ ａｔｔＢ：：Ｃｍ，ｐＣＨＬ２７６）、ＣＭＰ７２９（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ Ｇｉ１．２−ｇｌｔＡ ｐｄｈＲ ａｔｔＢ：：Ｃｍ，ｐＣＨＬ２７６）の構築
電気穿孔法によりプラスミドｐＣＨＬ２７６（実施例６（ｉｉｉ）を参照されたい）を株ＭＤ１０−４４６、ＣＭＰ７０６及びＣＭＰ７２５に導入した。コロニーをＬＢ＋５０ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシンにて選択した。各形質転換用に１つのコロニーを選択し、それぞれＭＤ１０−５５５、ＣＭＰ７１１及びＣＭＰ７２９と名づけた。
実施例２６：ＧＩ１．２ｍａｅＢ、ｐｄｈＲ及びＰＬ．６ ｐｄｈ変異を含有している株は親株と比較してメバロン酸の生産量が増加した
本例では、株ＣＭＰ６７８、ＭＤ１０−５５５、ＣＭＰ７１１及びＣＭＰ７２９でのメバロン酸の生産を示す。
（ｉ）材料
ＴＭ３培地の組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）、ＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ）、酵母エキス（０．２ｇ）、１０００Ｘ微量金属溶液（１ｍＬ）。
すべての成分を共に加え、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整した。０．２２μｍフィルタで培地を濾過滅菌した。滅菌及びｐＨ調整後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を添加した。
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌ当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４ ＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２ ＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４ ＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４ ＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１成分ずつｄｉＨ２Ｏに溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を用量に調整し、０．２２μｍフィルタでフィルタ滅菌する。
（ｉｉ）実験手順
細胞をルリア・ベルターニブロスで一晩生育させた。翌日、ＯＤ６００が０．０５になるよう、２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコにおいて細胞を２０ｍＬのＴＭ３培地（５０ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有）により希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。２時間生育させた後、ＯＤ６００を測定し、１００ｕＭのＩＰＴＧを加える。発酵工程の間、規則的に試料を採取した。各時点でＯＤ６００を測定し、かつＨＰＬＣによりメバロン酸濃度を測定した。次の様式でＨＰＬＣ解析を実施した：５００ｕＬのブロスに１５ｕＬの７０％（ｗ／ｖ）過塩素酸を加え、混合物を氷上で５分インキュベートした。次に、試料を１４，０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収し、次の条件でＨＰＬＣ解析を実施した：（１）ＢｉｏＲａｄ−ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍＭ×７．８ｍｍ）（カタログ番号１２５−０１４０）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；（２）カラム温度＝５０℃；（３）ＢｉｏＲａｄ−マイクロガードＣａｒｂｏ−Ｈ詰め替えカートリッジ（３０ｍｍ×４．６ｍｍ）（カタログ番号１２５−０１２９）（ＢｉｏＲａｄ）；（４）移動相＝０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４；（５）流速＝０．６ｍｌ／ｍｉｎ；（６）およその圧力＝約６５５０．０ｋＰａ（９５０ｐｓｉ）；（７）装填量＝１００μＬ；（８）実施時間＝２６分。
（ｉｉｉ）結果
株ＣＭＰ６７８（親）を対照として使用し、株ＭＤ１０−５５５（ＰＬ．６ｐｄｈ）、ＣＭＰ７１１（ＧＩ１．２ｍａｅＢ）及びＣＭＰ７２９（ｐｄｈＲ）を評価した。
この実験により、株ＭＤ１０−５５５及びＣＭＰ７２９は恐らくより多くのピルビン酸をアセチルＣｏＡ生成に取り込むことから、ＣＭＰ７１１はＴＣＡサイクルから回収された炭素をピルビン酸に再取込しかつＮＡＤＰＨを生成することから、親株（ＣＭＰ６７８）と比較して同量のグルコースから得られる力価が上昇するのだと実証された（図１４）。ｐｄｈＲ変異を有するＣＭＰ７２９では、親細胞と比較して生育速度が遅くなった（図１３）。ＰＬ．６ｐｄｈ及びＧＩ１．２ｍａｅＢ変異は生育に影響を及ぼさなかった（図１３）。
実施例２７：メバロン酸経路及びイソプレンシンターゼの遺伝子を発現している大腸菌（E. coli）の１５Ｌスケールの流加式培養によるイソプレン生産
（ｉ）材料
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍｌ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、用量に調整した。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：
チアミン塩酸塩（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、Ｄ−パントテン酸（４．８ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
供給溶液（１ｋｇ当たり）：
グルコース（０．５７ｋｇ）、脱イオン水（０．３８ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、及び１００％ Ｆｏａｍｂｌａｓｔ（１０ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。溶液を２５℃に冷却した後、マクロ塩溶液（３．４ｍＬ）、１０００×改変微量金属溶液（０．８ｍＬ）、及びビタミン溶液（６．７ｍＬ）を加えた。
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
（ｉｉ）方法
ウラジロハコヤナギ（P. alba）（ｐＴｒｃＡｌｂａ（ＭＥＡ））のＭＶＡ経路上流（ｐＣＬＵｐｐｅｒ−ＭＣＭ８２）、ＭＶＡ経路下流（ＰＬ．２−ｍＫＫＤｙＩ）及び切断型イソプレンシンターゼを過剰発現しており、かつ染色体にｐｇｌ遺伝子が回復しており、ＧＩ１．２プロモータの後ろにあるｇｌｔＡ遺伝子がノックダウンされている大腸菌（E. coli）ＢＬ２１細胞を用い、１５Ｌのバイオリアクタで発酵を行った（株名ＣＭＰ４５７）。対照とする発酵に使用した親株はｇｌｔＡ遺伝子をノックダウンさせていなかった。
本実験は、所望の発酵ｐＨ ７．０及び温度３４℃でのグルコースからのイソプレン発酵をモニターするために実施した。大腸菌（E. coli）株を凍結したバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス及び適切な抗生物質を添加した培地を入れたフラスコに接種した。
５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。
最高供給速度が６ｇ／分に達するまで、指数関数的な速度で供給溶液を添加した。この時間後、６ｇ／分以下の速度にて、代謝に必要とされる量のグルコースを供給した。５２時間の発酵期間にバイオリアクタに供給したグルコースの総量は６．８ｋｇであった。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施した。細胞のＯＤ５５０が６に達した時に、濃度が１００ｕＭになるようにして反応槽にＩＰＴＧを添加し１回目の誘導を行い、細胞のＯＤ５５０が１００に達した時に、濃度が１００ｕＭになるようにして反応槽にＩＰＴＧを添加し２回目の誘導を行った。
生物反応器から発生した気体に含まれるイソプレン濃度を、ｉＳＣＡＮ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓｕｎｄｓｔｒａｎｄ）質量分析計を用い測定した。
（ｉｉｉ）結果
ｇｌｔＡの前に存在するＧＩ１．２ｇｌｔＡプロモータによる発酵では、対照となる親株と比較して収率が高かった（図１５）。イソプレン力価、容積生産量及び細胞生産性指数もＧＩ１．２ｇｌｔＡ株の方がより高かった。結果を表１５（下記）に要約する。
Figure 2017148063
実施例２８：メバロン酸経路の遺伝子を発現している大腸菌（E. coli）の１５Ｌスケールの流加式培養によるメバロン酸（ＭＶＡ）生産
（ｉ）材料
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍｌ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、用量に調整した。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：
チアミン塩酸塩（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
供給溶液（１ｋｇ当たり）：
グルコース（０．５９０ｋｇ）、Ｄｉ Ｈ２Ｏ（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）及び１００％ Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。追試Ａ（ＧＩ１．２ｇｌｔＡでの実施）：１６．８ｍｌを滅菌前に反応槽内の培地に直接添加し、それ以上の添加は行わない。追試Ｂ：（野生型ｇｌｔＡでの実施）１Ｌ当たり６．８９５ｍｌｓのグルコース供給溶液を添加する。
（ｉｉ）方法
ＭＶＡ経路上流（ｐＣＬＵｐｐｅｒ）を発現しており、かつ染色体にｐｇｌ遺伝子が復元されている大腸菌（E. coli）ＢＬ２１細胞を用い、１５Ｌのバイオリアクタで発酵を行った。したがって、３種のメバロン酸生産株を比較した。
ＭＣＭ１００２（ｇｌｔＡの前にはＥ．ファエカリス（E. faecalis）の上流の野生型プロモータが存在する）（実施例１２を参照されたい）
ＣＭＰ６７８（ｇｌｔＡの前に存在するの前にはＥ．ファエカリス（E. faecalis）の上流のＧＩ１．２プロモータが存在する）（表３を参照されたい）
ＣＭＰ６８０（ａｃｋＡ−ｐｔａ−，ｌｄｈＡ−ｈｏｓｔ，ＧＩ１．２ｇｌｔＡ，Ｅ．ファエカリス（E. faecalis）の上流）（実施例５を参照されたい）
本実験は、所望の発酵ｐＨ ７．０及び温度３４℃でのグルコースからのメバロン酸発酵をモニターするために実施した。大腸菌（E. coli）株を凍結させたバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス及び適切な抗生物質を添加した培地を入れたフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。
１回分の培地には、グルコースを９．９ｇ／Ｌ入れた。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施した。細胞のＯＤ５５０が４になったなら、４００μＭの濃度になるようＩＰＴＧを反応槽に添加した。培養によるグルコースの消費がｐＨの上昇により示されたなら、代謝に必要とされる量に足りるよう、１０ｇ／ｍｉｎ以下の速度でグルコース供給溶液を供給した。グルコースに対するメバロン酸の最大質量収率を測定するのに十分な時間、すなわち発酵の開始から少なくとも３６時間にわたって発酵を行った。
（ｉｉｉ）結論
ＧＩ１．２ｇｌｔＡをノックダウンさせた場合（ＣＭＰ６７８）の発酵では、対照となる親株（ＭＣＭ１００２）と比較して、グルコースに対するメバロン酸の収率が高かった。加えて、細胞生産性指数、容積生産量及びメバロン酸力価の上昇が観察された（それぞれ図２０、２１及び２４。表１６に要約）。
Figure 2017148063
「ｔｒｉｐｌｅ」宿主（ＣＭＰ６８０）の細胞生産性指数及びグルコースに対するメバロン酸の総質量収率は、ＣＭＰ６７８株と比較して高かった（それぞれ図２３及び図２４）。ＣＭＰ６８０による発酵の非常に初期の期間では、グルコースに対するメバロン酸の質量収率及びメバロン酸の比生産量（ｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ）は、ＣＭＰ６７８又はＭＣＭ１００２のものと比較してかなり高かった。（それぞれ、図２４及び図２５）。ＣＭＰ６８０による発酵では、メバロン酸の容積生産量及びブロス中濃度は、ＣＭＰ６７８と比較して低かった（それぞれ、図２６及び図２７）。結果を表１７に要約する。ＣＭＰ６８０株（すなわち、ｔｒｉｐｌｅ変異を有する宿主、すなわちｔｒｉｐｌｅ宿主）は、１５Ｌ発酵試験でグルコースに対する最大メバロン酸質量収率及び最大比生産量を測定するのに有用である。
Figure 2017148063
メバロン酸の質量収率を読み取るには発酵には３６時間かければ十分であるものの、発酵時間を延長して、メバロン酸のブロス濃度を上昇させてもよい。表には、これらの試験により観察されたピーク力価を示す。ピーク力価で観察された結果を、下記表１８に要約する。
Figure 2017148063
（ｉｖ）ブロス解析
４時間間隔でブロス試料を回収し、発酵ブロス中のメバロン酸濃度をＨＰＬＣ分析により測定した。高純度のメバロン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液を調整してＨＰＬＣを行い予め作成しておいた較正曲線と、屈折率応答とを比較して、ブロス試料中のメバロン酸濃度を測定した。
ＨＰＬＣ情報：
系：Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５；カラム：ＢｉｏＲａｄ−ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム３００ｍｍ×７．８ｍｍカタログ番号１２５−０１４０；カラム温度：５０℃；ガードカラム：ＢｉｏＲａｄ−マイクロガードＣａｒｂｏ−Ｈ詰め替えカートリッジ３０ｍｍ×４．６ｍｍ（カタログ番号１２５−０１２９）；移動相：０．０１ＮのＨ２ＳＯ４；移動相の流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ；およその圧力：約７５８４．２〜８２７３．７ｋＰａ（１１００〜１２００ｐｓｉ）；注入量：２０μＬ；検出器：屈折計（Ｋｎａｕｅｒ Ｋ−２３０１）；実施時間：２６分。
実施例２９：メタノコッカイドバートニイ（Methanococcoides burtonii）ＤＳＭ６２４２由来のメバロン酸キナーゼ遺伝子を発現している大腸菌（E. coli）株の生産
本実施例は、大腸菌（E. coli）において、異種メバロン酸経路によりイソプレノイド、イソプレノイド前駆体及びイソプレンを生産させるために、メタン生成菌のＭ．バートニイ（M. burtonii）由来のメバロン酸キナーゼを含む、細菌株の構築について詳述する。
Ｉ．遺伝子の同定及び経路の構築
Ｅ．フェカリス（E. faecalis）ｍｖａＥ遺伝子産物をクエリーとして使用する一次配列相同性検索を、ＮＣＢＩウェブサイトに存在するＢＬＡＳＴｐプログラムにより実施した（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ及びＤａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）、「ギャップ考慮型ブラスト及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新規タンパク質データベース検索プログラムの作成（Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２）。検索結果から対象とする配列を選択する。Ｍ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼは、Ｍ．マゼイのメバロン酸キナーゼに対し６１％配列同一性を有する。
ＭＶＫの発現用プラスミド：Ｎ−末端にＨＩＳ−タグを付与したｍＭＶＫ及びｂＭＶＫの発現用プラスミドはＧｅｎｅＯｒａｃｌｅが合成した。タグ化したＭＶＫ遺伝子を、Ｔ７プロモータの調節下でｐＥＴ２４ｂにクローン化させた。製造元のプルトコルに従いＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｎｅＳｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（＃Ｃ６０００−０３）にプラスミドを導入し、３７℃下でＬＡ ｋａｎ５０プレートで一晩選択を行なった。
イソプレノイド経路の下流は異なるレベルでｍＭＶＫ及びｂＭＶＫを発現する：ＭＶＡ経路の下流（ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、ＩＤＩ）を発現している既存のコンストラクト（ＰＬ．２−ｍＫＫＤｙＩ、米国特許第２０１１／０１５９５５７号）を、ｍＭＶＫを異なるレベルで発現するように改変し、あるいはｍＭＶＫの代わりにｂＭＶＫを発現するよう改変した。新しいコンストラクトは、ＦＲＴに隣接しているクロラムフェニコール耐性マーカー、ＰＬ．２プロモータ、２シストロン性の翻訳開始配列、２種のＭＶＫ遺伝子のうちの１つ、並びにＰＭＫ、ＭＶＤ及びＩＤＩ遺伝子から構成される。ＰＣＲ産物は、既存のプロモータ、翻訳開始配列及びＭＶＫ遺伝子を、除外可能なｃｍｐＲマーカー、プロモータ、翻訳開始配列及びＭＶＫ遺伝子により置き換えるための２つの部位から構成された。このＰＣＲ産物を、２重乗換えさせて染色体に導入した後、ｃｍｐＲ細胞を選択した。
２シストロン性の翻訳開始配列を使用して、ＭＶＫ配列とは独立してｍＲＮＡの翻訳を開始することにより、ＭＶＫの発現を増加させる。Ｓｃｈｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，「２シストロン性（b-cistron）合成ｍＲＮＡの大腸菌（Escherichia coli）における翻訳（Translation of a synthetic b-cistron mRNA in Escherichia coli）」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８３，ｐｐ．８５０６〜８５１０，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９８６）を参照されたい。ＭＶＫ ＯＲＦの翻訳は、２シストロン性コンストラクトにおいて上流のＲＢＳの強度を調節することにより制御される。ＲＢＳ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを使用し、各種強度のＲＢＳを設計した（Ｓａｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９ Ｏｃｔｏｂｅｒ；２７（１０）：９４６〜９５０．）。Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡパッケージｖ．１．８．４（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／〜ｉｖｏ／ＲＮＡ／、Ａｎｄｒｅａｓ Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ、Ｒｏｎｎｙ Ｌｏｒｅｎｚ、Ｓｔｅｐｈａｎ Ｈ．Ｂｅｒｎｈａｒｔ、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｎｅｕｂｕｃｋ及びＩｖｏ Ｌ．Ｈｏｆａｃｋｅｒ（ＮＡＲ、２００８））により算出された、ＲＮＡの熱力学的パラメーターと、ＲＢＳ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ用のＶｉｅｎｎａＲＮＡモジュールを利用し、ＲＢＳ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒの最適化ソフトウェアを使用した。ＲＢＳは、ＬｉｎｕｘサーバーでＰｙｔｈｏｎ ｖを起動させ算出した。２．４．３．ＲＢＳの上流の５’ＵＴＲ（５０ｎｔまで）及び５０ｎｔのＯＲＦ配列を使用しＲＢＳを設計した。所定の目標強度をもつ複数のＲＢＳを算出し、１つ以上を合成して試験した。
ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓのクロラムフェニコールテンプレート（＃Ａ１０５）をテンプレートとして使用し、プライマーＭＣＭ５４５及びＭＣＭ７７０を使用し、コンストラクトの上流半分を増幅させた。１４０μＬのｄｄＨ２Ｏ、４μＬのプラスミドＤＮＡ（約１００ｎｇ／μＬ）、５μＬの１０μＭの各プライマー、２μＬのｄＮＴＰ、４０μＬの緩衝液及び４μＬのポリメラーゼを組み合わせ、５０μＬのアリコートを４つ作製した。製造元のプロトコルに従って、これらの反応物を（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合キット、＃６００６７７）、次のサイクル：９５℃で２：００、（９５℃で０：２０、５５℃で０：２０、７２℃で１：１５）ｘ３０、７２℃で３：００、試料が冷めるまで４℃、から構成されるＰＣＲプログラムにかけた。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップカラム（＃２８１０６）で反応物を精製し、５０μＬで溶出させ、プールした。
テンプレートとしてＭＶＫ遺伝子を使用し、下表２２に記載のプライマーを使用し、コンストラクトの下流半分を増幅させた。３５μＬのｄｄＨ２０、１μＬのプラスミドＤＮＡ（約１００ｎｇ／μＬ）、１．２５μＬの１０μＭの各プライマー、０．５μＬのｄＮＴＰ、１０μＬの緩衝液及び１μＬのポリメラーゼを組み合わせ、次の通りのサイクルにかけた：９５℃で２：００、（９５℃で０：２０、５５℃で０：２０、７２℃で０：３０（ｍＭＶＫ）又は７２℃で１：００（ｂＭＶＫ））ｘ３０、７２℃で３：００、試料が冷めるまで４℃。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップカラムで反応物を精製し、５０μＬを溶出した。
５μＬの上流断片及び下流断片を、１０μＬの緩衝液、０．５μＬのｄＮＴＰ及び２７μＬのｄｄＨ２Ｏと混合し、ＰＣＲサイクル：９５℃で２：００、（９５℃で０：２０、５５℃で０：２０、７２℃で２：００）ｘ５、室温、にかけた。１．２５μＬのプライマーＭＣＭ１２０と、プライマーＭＣＭ１６２（ｍＭＶＫ）又はＭＣＭ７９０（ｂＭＶＫ）の何れかとを加え、更に２５サイクル実施した。ＰＣＲ反応物を４℃に冷ました後、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲカラムで精製し、３０μＬのＥＢに溶出した。
精製した融合ＰＣＲ産物を、電気穿孔法によりＭＣＭ１３３２（ｍＭＶＫの場合）又はＭＣＭ１８５９細胞（ｂＭＶＫの場合）に導入した。ＭＣＭ１３３２は、ＣＭＰ５２２（ｐＲｅｄ／ＥＴ−ｃａｒｂを保持しているＣＭＰ４５１（ＩＤＮ ３１５８８），ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）の継代培養物であり、ＣＭ１８５９はＣＭＰ１１０３（ｐＲｅｄ／ＥＴ−ｃａｒｂを保持しているＣＭＰ１０７５（ＩＤＮ ３１３０８），ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）の継代培養物である。培養物を、ＬＢ ｃａｒｂ５０で、３０℃にて一晩生育させた。５ｍＬのＬＢ ｃａｒｂ５０に１００μＬの培養物を接種して、３０℃にて、目に見えて濁りが生じるまで培養物を生育させた（約２時間）。１５０μＬの１Ｍのアラビノースを添加し、培養物を３７℃にて約２時間生育させた。細胞をペレット化し、滅菌冷ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄し、培養物の１／１０倍量を滅菌冷ｄｄＨ２Ｏに再懸濁した。１００μＬの細胞を３μＬのＰＣＲ産物と混合し、２ｍｍの電気穿孔用キュベットで、２５μＦＤ、２００ｏｈｍｓ、２．５ｋＶにて電気穿孔を行い、直ちに５００μＬのＬＢによりクエンチした。形質転換させた細胞を３７℃で約３時間振盪して回復させ、ＬＢ ｃｍｐ５プレートで３７℃にて一晩選択を行った。
複数のｃｍｐＲコロニーを単独のコロニーとして画線し、ＰＣＲによる組み込みが見込まれる細胞を選択し、配列決定を行った。コロニーから精製した株をＬＡ ｃｍｐ５で生育させた後、３３％グリセロール溶液として−８０℃で保存した。
Figure 2017148063
ＩＩ．ｍＭＶＫ及びｂＭＶＫを異なるレベルで使用するイソプレン生産宿主
改変したＭＶＡ経路下流をＭＣＭ２０２９（ＣＭＰ１１３３の継代培養、ＩＤＮ ３１３０８）に形質導入し、イソプレン生産宿主を生成した。
株ＭＣＭ１７４２、１７５３、１７４５、１７４７及び１８６１（経路が形質導入されている）のＰ１可溶化液を次の通りに調製した。ＬＢ ｃｍｐ５での一晩培養物１００μＬを、１０ｍＬのＬＢ＋５ｍＭ ＣａＣｌ２／０．２％グルコース／ｃｍｐ５に希釈し、２５０ｒｐｍにて３７℃で３０分振盪した。ＭＧ１６５５細胞から調製した１００μＬのＰ１可溶化液を加え、培養物を、培地が透明になり可溶化させた細胞成分が沈殿するまで少なくとも３時間振盪した。可溶化液を１００μＬのクロロホルムとともにボルテックスにかけ、３０００ｒｐｍで５分スピンし、上清を１００μＬのクロロホルムにより回収（stored over）し４℃で保管した。
ＭＣＭ２０２９（形質導入用のレシピエント）の一晩培養物を、１／２量の１０ｍＭの滅菌ＭｇＳＯ４、５ｍＭのＣａＣｌ２で洗浄した。２００μＬの細胞懸濁液を１００μＬの可溶化液と混合し、３０℃で３０分間インキュベートした。１５０μＬの１Ｍのクエン酸ナトリウム及び５００μＬのＬＢを添加し、３７℃で１〜２時間振盪して反応物を回収した。希釈液をＬＡ ｃｍｐ５に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。平行して陰性対照（細胞を不含有又は形質導入した可溶化液を非添加）も実施した。クロラムフェニコール耐性コロニーを選択し、再画線し、新しい経路が存在しているかについてＰＣＲにより単一のコロニーを試験した。得られた株、すなわちマーカーを有する宿主を対数増殖期の中期までＬＡで生育させ、−８０℃にて３３％グリセロール中で保管した。
プラスミドｐＣＰ２０（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）により発現させたＦｌｐリコンビナーゼを使用して、マーカーを有する宿主からクロラムフェニコール耐性マーカーを除去した。細胞を３７℃にて対数増殖期の中期までＬＢ ｃｍｐ５で生育させ、１μＬのｐＣＰ２０（約１００ｎｇ／μｌ）を用い電気穿孔法を行い、ＬＡで３０℃にて１〜３時間回復させ、形質転換体をＬＡ ｃａｒｂ５０で３０Ｃにて一晩又は室温にて３日間選択した。
単一のコロニーを選択し、目に見えて濁りが生じるまで３０℃にてＬＡ ｃａｒｂ５０で生育させ、次に３７℃に温度を上昇させて数時間生育させた。この培養物を画線し、３７℃で一晩生育させた。単一のコロニーを選択し、ＬＡ、ＬＡ ｃａｒｂ５０及びＬＡ ｃｍｐ５に割り付けた。ｃａｒｂ及びｃｍｐに感受性を示すクローンをそれぞれ親株に選択した。得られたイソプレン生産宿主（表２０）を、対数増殖期の中期までＬＢで生育させ、−８０℃で３３％グリセロール中で保管した。
Figure 2017148063
ＩＩＩ．ｍＭＶＫ以外のイソプレンシンターゼを発現させるためのプラスミド
プラスミドｐＤＷ１６６（Ｔｒｃウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ変異体ＭＥＡ（Ｃａｒｂ５０））を、ｍＭＶＫではなくｂＭＶＫを発現するよう改変した。プライマーＭＣＭ８１０及びＭＣＭ８１１及びｐＤＷ１６６ベクター（−ｍＭＶＫ遺伝子）を使用し、ｐＭＣＭ１６６６からｂＭＶＫ遺伝子を増幅し、プライマーＭＣＭ８０８及びＭＣＭ８０９を使用しこの遺伝子を増幅させた（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合キット、３５μＬのｄｄＨ２Ｏ、１μＬのテンプレート（約１００ｎｇ／μＬ）、０．５μＬのｄＮＴＰ、１．２５μＬの１０μＭの各プライマー、１μＬのポリメラーゼ）。次の通りに反応を実施した：９５℃で２：００、３０ｘ（９５℃で０：２０、５５℃で０：２０、７２℃で０：４５（インサート）又は３：００（ベクター））、７２℃で３：００、試料が冷めるまで４℃。ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲカラムで精製し、３０μＬのＥＢで溶出した。ＧｅｎｅＡｒｔシームレスクローニング及びアセンブリキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ａ１３２８８）を使用し、インサートをベクターにクローン化した。反応液は、２μＬの各ＰＣＲ産物、４μＬの緩衝液、１０μＬのｄｄＨ２Ｏ及び２μＬの酵素から構成された。反応物を室温で３０分インキュベートし、次に４μＬをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセルを形質転換させた。２５０μＬのＬＢで３７℃で１時間回復させた後、形質転換体をＬＡ ｃａｒｂ５０プレートで３７℃で一晩選択した。
プラスミドにミニプレップ処理を行い、配列決定した。
プラスミドｐＤＷ１６６（ｐＴｒｃＡｌｂａ（ＭＥＡ，ＩｓｐＳ変異体）−ｍＭＶＫを改変し、ｍＭＶＫ遺伝子のほとんどを欠失させた。プライマーＭＣＭ８１４及び８１５を使用して、ＰＣＲ反応でプラスミドを増幅させた（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合キット、３５μＬのｄｄＨ２Ｏ、１μＬのテンプレート（約１００ｎｇ／μＬ）、０．５μＬのｄＮＴＰ、１．２５μＬの１０μＭの各プライマー、１μＬのポリメラーゼ）。次の通りに反応を実施した：９５℃で２：００、３０ｘ（９５℃で０：２０、５５℃で０：２０、７２℃で３：３０（ベクター））、７２℃で３：００、試料が冷めるまで４℃。ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＶＳＷＰ０２５００ディスクにより、約１５分間約１０ｍＬのｄｄＨ２に浮遊させてＰＣＲ産物を脱塩し、次に電気穿孔法により５μＬをＭＣＭ２０６５細胞に導入した。５００μＬのＬＢで３７℃で１時間回復させた後、形質転換体をＬＡ ｃａｒｂ５０プレートで３７℃で一晩選択した。ＤＮＡをミニプレップ処理し、配列決定を行った。
ＩＶ．異なるレベルのｍＭＶＫ及びｂＭＶＫによりイソプレンを生産するための株
宿主株（表２０）を、５ｍＬのＬＢにより、３７℃にて２５０ｒｐｍで対数増殖期の中期まで生育させた。培養物を氷冷し、滅菌冷ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄し、培養物の１／１０倍量で再懸濁した。エッペンドルフチューブ中で、１００μＬの細胞懸濁液を１μＬのプラスミドＤＮＡ（約１００ｎｇ／ｕＬ）と混合した。全ての株をｐＭＣＭ２０９５により形質転換させた。ＭＣＭ２０６５も各々１μＬのｐＭＣＭ２０２０及びｐＭＣＭ１２２５で形質転換させた（ＩＤＮ ３１５５２）。反応物を２ｍｍの電気穿孔用キュベットに移し、２５ｕＦＤ、２００ｏｈｍｓ、２．５ｋＶで電気穿孔を行い、直ちに５００μＬのＬＢでクエンチした。反応物を３７℃で少なくとも１時間回復させ、３７℃で、ｃａｒｂ５０を添加したＬＡプレート（及び同様にｐＭＣＭ２０２０及びｐＭＣＭ１２２５によりＭＣＭ２０６５同時形質転換させる場合にはｓｐｅｃ５０を添加したＬＡプレート）で一晩、形質転換体を選択した。抗生物質を添加したＬＢで各形質転換コロニーを対数増殖期の中期まで生育させ、３３％グリセロール中で−８０℃で保管した（ＩｓｐＳを有する宿主）。株ＭＣＭ２１３１を同様の様式で保管した。ＩｓｐＳを有する宿主株をＬＢ ｃａｒｂ５０で生育させ、電気穿孔法により、ＬＡ ｃａｒｂ５０ ｓｐｅｃ５０で選択した形質転換体を有するｐＭＣＭ１２２５を導入した。再度、単一のコロニーをＬＢ ｃａｒｂ５０ ｓｐｅｃ５０で生育させ、−８０℃で３３％グリセロール中で保管した（生産株、表２１）。
Figure 2017148063
Figure 2017148063
Ｖ．タンパク質精製
タンパク質の発現及び精製：Ｍ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼ遺伝子を有する大腸菌（E. coli）株ＭＣＭ１６６６を、３４℃下で、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを添加した１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロスで生育させた。ＯＤ６００＝０．６の時点で５０μＭのＩＰＴＧにより細胞に誘導を行い、誘導から５時間後に遠心分離により細胞を回収した。凍結溶解サイクル後、細胞ペレットを０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、０．３Ｍの塩化ナトリウム、０．２ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩを含有している０．０２Ｍのイミダゾール（ｐＨ ８．０）緩衝液及び０．５ｍＭの４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド（ＡＥＢＳＦ）に再懸濁した。１３７．９ＭＰａ（２０，０００ｐｓｉ）でフレンチプレスセルを繰り返し通過させて溶解を行った。２２９，０００×ｇで１時間の超遠心により細胞可溶化液を清澄化させた。上清を０．２μフィルタによりろ過し、硫酸ニッケルを０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、０．３Ｍの塩化ナトリウム、０．０２Ｍのイミダゾール（ｐＨ ８．０）により平衡化したＨｉＴｒａｐ ＩＭＡＣ ＨＰカラムに装填した。０．０２〜０．５Ｍのイミダゾールの直線勾配を使用し、メバロン酸キナーゼを単離した。メバロン酸キナーゼを含有している画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により特定し、Ｈｉ Ｐｒｅｐ ２６／１０脱塩カラムを使用して０．０５ＭのＴｒｉｓ、０．０５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ ７．４）に脱塩した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色により評価した結果、最終的なメバロン酸キナーゼ画分は９５％であった。分光光度計により２８０ｎｍにて読み取りを行い、定量化を行った（変換率は０．３ＯＤ／ｍｇ／ｍｌに相当、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ）。
Ｍ．マゼイ（M. mazei）のＭＶＫの単離、精製及び動態解析については、これまでに米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号に記載されている。
実施例３０：ｐＥＴ２４ｂプラスミド由来のＭ．バートニイ（M. burtonii）及びＭ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼのＭＣＭ１６６６及びＭＣＭ１６６９株における溶解度
本実施例では、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）及びＭ．マゼイ（M. mazei）に由来するメバロン酸キナーゼのそれぞれの溶解度を試験する。
（ｉ）材料及び方法
５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有させた５ｍＬのＬＢ培地により、株ＭＣＭ１６６６及びＭＣＭ１６６９を３４℃で生育させた。ＯＤ（６００）＝０．６の時点で５０μＭのＩＰＴＧにより細胞に誘導を行い、誘導から４時間後に遠心分離により回収した。５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．２ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩを添加した５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ ７．４）及び０．５ｍＭのＡＥＢＳＦにより細胞可溶化液を調製し、４８２６．３ｋＰａ（７００ｐｓｉ）に設定したフレンチプレスセルに２回通過させ可溶化を行った。タンパク質の溶解度をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより解析した。
（ｉｉ）結果：
ｐＥＴ２４ｂベクターＭ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼを発現させた際、溶解度は７０％であったのに対し、Ｍ．マゼイ（M. mazei）のメバロン酸キナーゼの溶解度は約５％であり、これら以外のタンパク質はペレット画分に含まれた（図２８）。
実施例３１：Ｍ．バートニイ（M. burtonii）及びＭ．マゼイ（M. mazei）由来のメバロン酸キナーゼの動態解析及び阻害
本実施例は、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）及びＭ．マゼイ（M. mazei）に由来するメバロン酸キナーゼの触媒活性及び阻害に関係する各動態解析について詳述する。
（ｉ）材料及び方法
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して動態解析を実施した。全ての動態解析データは、Ｓｙｎｅｒｇｙ ｓｏｆｔｗａｒｅの、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ ４．０によるグラフ作成プログラムを使用し解析した。アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、ＮＡＤＨ、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥ、ＤＮａｓｅ Ｉ並びにＭＶＰ及びＭＶＰＰをＳｉｇｍａから購入した。ジチオスレイトールをフルカから購入した。乳酸デヒドロゲナーゼをカルビオケムから購入し、ピルビン酸キナーゼをＭＤバイオメディカルズから購入した。ＤＭＡＰＰ、ＩＰＰ及びＧＰＰは社内で合成した。
ＡＤＰ形成をピルビン酸合成及び乳酸への還元と結びつけて分光光度アッセイに修正を加え、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）及びＭ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼのいずれもの触媒活性を測定した。ＮＡＤＨの消失の初期速度は、ＭＶＫによるメバロン酸のリン酸化を測定することで得た。アッセイは、９６ウェルの非結合性プレート（コースターカタログ＃９０１７）フォーマットで、３０℃にて３つ組で実施した。各１００μＬの反応液には、０．４ｍＭのＰＥＰ、０．０５ｍＭのＤＴＴ、０．３２ｍＭのＮＡＤＨ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ユニットのＬＤＨ及び２．５ユニットのＰＫ／５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ ７．４）を含有させた。
Ｍ．バートニイ（M. burtonii）及びＭ．マゼイ（M. mazei）由来のメバロン酸キナーゼの速度定数は、メバロン酸及びＡＴＰ基質の両方の量を変化させて用いるランダム二反応種動態モデル（random bireactant system kinetics）を用い評価した。次の濃度で試験を行った：０．４ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ及び０．０５ｍＭのメバロン酸、並びに２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ及び０．２５ｍＭのＡＴＰ。４０ｎＭの精製Ｍ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼ又は８０ｎＭ（０．２５μｇ）の精製Ｍ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼを添加し、反応を開始した。ＮＡＤＨのＮＡＤ＋への酸化に伴う吸光度の変化を持続的に３４０ｎｍで監視し、時間に対してプロットしてメバロン酸キナーゼの結合反応速度を測定した。テルペン化二リン酸（ＤＭＡＰＰ、ＩＰＰ、ＧＰＰ、ＭＶＰＰ）並びにテルペン化一リン酸ＭＶＰを各種濃度で反応混合物に加え、タンパク質阻害試験を実施した。精製済みのサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼを、ＤＭＡＰＰ、ＩＰＰ及びＧＰＰ阻害についての陽性対照として使用し、肺炎球菌（S. pneumoniae）メバロン酸キナーゼは、ＭＶＰ及びＭＶＰＰ阻害についての陽性対照として使用した。
（ｉｉ）結果：
メバロン酸及びＡＴＰを両方用いるランダム二反応種モデルによりＭ．バートニイ（M. burtonii）及びＭ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼの速度定数を評価した（表２３）。３４℃下で、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼは、メバロン酸に対しては４４．４ｓ−１のｋｃａｔを有し、ＡＴＰに対しては７４．３ｓ−１のｋｃａｔを有するのに対し、Ｍ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼは、メバロン酸に対しては１８．３ｓ−１のｋｃａｔを有し、ＡＴＰに対しては２６．８ｓ−１のｋｃａｔを有する。Ｍ．バートニイ（M. burtonii）及びＭ．マゼイ（M. mazei）のメバロン酸キナーゼのＫａ（Ｍｅｖ）値は非常に類似しており、それぞれ３９１μＭ及び３９７μＭであった。Ｋｂ（ＡＴＰ）は、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼについては２１２μＭであり、Ｍ．マゼイ（M. mazei）については４６０μＭであった。
Figure 2017148063
実施例３２：Ｍ．バートニイ（M. burtonii）又はＭ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼを大腸菌（E. coli）染色体上で発現している大腸菌（E. coli）株の生育及びイソプレン生産
本実施例は、遺伝子操作し、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼ又はＭ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼを大腸菌（E. coli）染色体上で発現させた大腸菌（E. coli）株の、生育及びイソプレン生産量に関する小規模試験を詳述する。
材料及び方法
生育アッセイ：冷凍保存品からカルベニシリン５０μｇ／ｍＬ（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びスペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加したＬＢブロス２ｍＬを入れた振盪チューブに一晩培養物を接種した。次に、培養物を、３４℃下２４０ｒｐｍで１４時間インキュベートした。次に、１％グルコース、０．０２％酵母エキス、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを添加した２ｍＬのＴＭ３培地を入れた、５ｍＬ４８ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、最終的なＯＤが０．２になるよう培養物を希釈した。プレートを、Ｂｒｅａｔｈ Ｅａｓｉｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、Ｓｈｅｌ Ｌａｂ振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍでインキュベートした。
ＯＤ０．４の時点で、２００μＭのＩＰＴＧにより培養物に誘導を行った。誘導の１時間後に、最終濃度が０、２、４、８、１６、３２ｍＭになるよう培地にメバロン酸を加えた。ＩＰＴＧによる誘導の直後、１、２、３、４、及び５時間後にＯＤを測定した。
Figure 2017148063
イソプレンの生産量：遺伝子操作型大腸菌（E. coli）のＧＣ／ＭＳによりイソプレン生産量を解析するための試料を、誘導から１、２、３、４及び５時間後に回収した。１００μＬの培養ブロスを９８ウェルガラス製深底ブロックに回収し、アルミニウム製シーラー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によりシールした。ガラスブロックを３４℃の水浴で３０分間インキュベートした後、８０℃の水浴に移し、２分間加熱滅菌した。ガラスブロックを冷却し、イソプレンを測定するためにＧＣ／ＭＳに移した。
ＧＣ／ＭＳによるイソプレンの検出：ヘッドスペースモードで作動するＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）ＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラーと適合させたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ ＧＣ／ＭＳシステムを使用し、ＧＣ／ＭＳを実施した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ−５ＭＳ ＧＣ／ＭＳカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ；０．２５μｍフィルム厚）を使用して分析物を分離した。ＧＣ／ＭＳ法では、キャリアガスとして、流速１ｍＬ／分でヘリウムを使用した。注入部は、分割比５０：１に設定し、２５０℃で保持した。炉の温度は、解析中３７℃で２分保持した。Ａｇｉｌｅｎｔ ５７９３Ｎ質量検出器は、ｍ／ｚ６７で単一イオン検出（ＳＩＭ）モードで作動させた。１．４〜１．７分経過時点で検出器のスイッチを切り、永久ガスを溶出させた。これらの条件下で、イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）が１．７８分で溶出することを観察した。較正表を使用して、イソプレンの絶対量を定量したところ、１μｇ／Ｌ〜２０００μｇ／Ｌであることが判明した。この手法から、検出限界は５０〜１００ｎｇ／Ｌであると推定された。
（ｉｉ）結果：
ＭＣＭ２１３１の生育は、０〜１６ｍＭ濃度のメバロン酸では阻害されなかった。ＭＣＭ２１３１は、３２ｍＭのメバロン酸を加えた場合に最も比生産量が高くなったことから（３０〜４２ｍｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤ）、上流経路からの非常に多量の取り込みを支持し得る。
染色体にメバロン酸キナーゼのコピーを１つ有する、遺伝子操作株ＭＣＭ２１２５、ＭＣＭ２１２７及びＭＣＭ２１３０は、１６ｍＭのメバロン酸を供給した場合に４０ｍｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤの比生産量を実現することができる。メバロン酸濃度が０〜１６ｍＭである場合にも、株の生育は阻害されなかった（図２９）。
実施例３３：大腸菌（E. coli）におけるＭ．マゼイ（M. mazei）及びＭ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼのプラスミド及び染色体による発現
株ＭＣＭ２１２６及びＭＣＭ２１２７を試験し、染色体のみでマゼイ（Mazei）ＭＶＫ ｏｆｆを発現させた場合に何らかの効果が得られるか評価した。
材料及び方法
（ｉ）溶液
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸１．６ｍＬ、１０００Ｘ改変微量金属溶液１ｍｌ。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、用量に調整した。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４ ＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２ ＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４ ＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨ ３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍ径のフィルタによりろ過滅菌した。
供給溶液＃１（１キログラム当たり）：グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）、及び１００％Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブにより処理した後、滅菌フード中で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に供給溶液に添加するものは（供給溶液１キログラム当たり）マクロ塩溶液５．５４ｍｌ、ビタミン溶液６．５５ｍｌ、１０００Ｘ改変微量金属溶液０．８２ｍｌである。
（ｉｉ）方法
試料を解凍し、１００ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ ７．６）、０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、及び０．５ｍＭのＡＥＢＳＦ（４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド）によりＯＤ＝２０に規格化した。ＯＤを規格化した細胞懸濁液を、４８２６．３ｋＰａ（７００ｐｓｉ）に設定したフレンチプレスセルに繰り返し通過させて、溶解させた。１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、可溶化液を清澄化させた。清澄化させた可溶化液に含まれる総タンパク質量を、ブラッドフォードアッセイ（ＢｉｏＲａｄ，５００−０００６）を使用し評価した。次に試料を規格化し、４〜１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で泳動した。ｉＢｌｏｔ転写装置（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、ニトロセルロース膜にタンパク質を転写した。ＢｅｎｃｈＰｒｏ（商標）４１００ウェスタンカード・プロセッシング・ステーション（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＰｒｏＳｃｉ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄの生成酵素に対するウサギ一次ポリクローナル抗体、並びにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８により蛍光標識した抗ウサギＩｇＧヤギ２次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａ−１１００８）により、ニトロセルロース膜上でＭ．マゼイ（M. mazei）及びＭ．バートニイ（M. burtonii）ＭＶＫを検出した。イメージャーのＳｔｏｒｍ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、特異的なタンパク質定量化を行った。
（ｉｉｉ）結果
ウェスタンブロット解析によるタンパク質定量に基づくと、ＭＣＭ２１２５におけるＭ．バートニイ（M. burtonii）のメバロン酸キナーゼの発現は、ＤＷ７０８株におけるＭ．マゼイ（M. mazei）のメバロン酸キナーゼの発現と比較して少なくとも１／１５以下であった（図３０）。
実施例３４：大腸菌（E. coli）におけるイソプレン生産
本実施例は、導入したメバロン酸経路由来の遺伝子を発現させ、１５Ｌスケールで流加式培養により生育させた大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）におけるイソプレン生産量を評価する。以下に記載の標準的なイソプレン生産工程によりイソプレン生産を実施した。本試験では、株ＤＷ７０８の生産指数（グルコースに対する累積イソプレン収率、グルコースに対する瞬間的なイソプレン収率、イソプレンの容積生産量、比生産量及び細胞生産性指数）を、試験株ＭＣＭ２１２５、ＭＣＭ２１２６及びＭＣＭ２１２７と比較する。これらの株を同一の条件で試験し、株ＭＣＭ２１２５においてバートニイ（burtonii）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）を使用することによりマゼイ（Mazei）ＭＶＫのみを使用した株（ＤＷ７０８）と比較して何らかの収率向上が得られるかどうかを評価した。加えて、株ＭＣＭ２１２６及びＭＣＭ２１２７を同一の条件で試験し、染色体のみでマゼイ（Mazei）ＭＶＫ ｏｆｆを発現させた場合に何らかの効果が得られるか評価した。
Figure 2017148063
（ｉｉ）溶液
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍｌ）。
すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、用量に調整した。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４ ＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
供給溶液（１キログラム当たり）：グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）、及び１００％ Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブにより処理した後、滅菌フード中で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に供給溶液に添加するものは（供給溶液１キログラム当たり）、マクロ塩溶液（５．５４ｍｌ）、ビタミン溶液（６．５５ｍｌ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（０．８２ｍｌ）である。
（ｉｉ）方法
大腸菌（E. coli）株を凍結させたバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス及び適切な抗生物質を添加した培地を入れたフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。
ガスを注入してバイオリアクタの背圧を７０ｋＰａ（０．７ｂａｒ）程度に維持し、Ｍａｔｈｅｓｏｎ Ｔｒｉ−Ｇａｓ，Ｉｎｃの圧縮ガスシリンダにより生産細菌に酸素を供給した。
各バッチの培地には、グルコースを９．７ｇ／Ｌ含有させた。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施した。細胞のＯＤ５５０が６になったなら、２００μＭの濃度になるようＩＰＴＧを反応槽に添加した。培養によるグルコースの消費がｐＨの上昇により示されたなら、代謝に必要とされる量に足りるよう、１０ｇ／ｍｉｎ以下の速度でグルコース供給溶液を供給した。グルコースに対するイソプレンの最大質量収率を測定するのに十分な時間、すなわち発酵の開始から合計５２〜６９時間にわたって発酵を行った。
（ｉｉｉ）解析
イソプレンは揮発性であり、注入ガスにより槽から効率的に回収することができる。バイオリアクタのオフガス中のイソプレン濃度は、２つの質量分析器ｉＳＣＡＮ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓｕｎｄｓｔｒａｎｄ）及びＨｉｄｅｎ ＨＰＲ２０（Ｈｉｄｅｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）質量分析器を使用して測定した。オフガス中の酸素、窒素及びＣＯ２濃度は、同様の質量分析ユニットにより測定した。
発酵ブロス中の溶存酸素は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙにより提供された光学センサーを備えた衛生的であり滅菌可能なプローブにより測定した。
４時間間隔でブロス試料にＨＰＬＣ解析を行い、発酵ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸及びメバロン酸濃度を測定した。屈折計による測定値と、濃度既知の標準を使用して予め作成した検量線とを比較して、ブロス試料中の濃度を測定した。
ＨＰＬＣ情報：系：Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５；カラム：ＢｉｏＲａｄ−Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム、３００ｍｍ×７．８ｍｍ、カタログ番号１２５−０１４０；カラム温度：５０℃；ガードカラム：ＢｉｏＲａｄ−マイクロガードＣａｒｂｏ−Ｈ詰め替えカートリッジ３０ｍｍ×４．６ｍｍ（カタログ番号１２５−０１２９）；移動相：０．０１ＮのＨ２ＳＯ４；移動相流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ；およその圧力：約７５８４．２〜８２７３．７ｋＰａ（１１００〜１２００ｐｓｉ）；注入量：２０μＬ；検出器：屈折計（Ｋｎａｕｅｒ Ｋ−２３０１）；実施時間：２６分。
（ｉｖ）結果
結果を表２６に要約する。バートニイ（burtonii）ＭＶＫ（ＭＣＭ２１２５）を発現している株は、マゼイ（mazei）ＭＶＫを発現している株（ＤＷ７０８）と比較して、グルコースに対する累積イソプレン収率（％）が同程度であり（図３１）、グルコースに対するイソプレン瞬間収率（％）が同程度であり（図３２）、細胞性能指数が同程度であり（ＣＰＩ；図３３）、総容積生産量が同程度であり（図３４）、及び比生産量（図３５）が同程度であった。
Figure 2017148063
染色体のみでＭＶＫ ｏｆｆを発現させた株を比較した場合、株ＭＣＭ２１２５（バートニイ（burtonii）ＭＶＫを発現）は、マゼイ（mazei）ＭＶＫを発現させた株ＭＣＭ２１２７と比較して、グルコースに対する累積イソプレン収率（％）がより良好であり（図３６）、グルコース対するイソプレンの瞬間収率（％）は同程度であり（図３７）、細胞性能指数は高く（ＣＰＩ；図３８）、容積生産量はわずかに良好であり（図３９）、比生産量はわずかに高い（図４０）。
実施例３５：株ＣＭＰ１１３６（−ＰＧＬ）の構築
ｐｇｌ座にカナマイシンカセットを含有しているＫｅｉｏ株ＪＷ０７５０（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：１〜１１）と、プライマーｐｇｌＡｍｐＦ（５’−ｃａｇｃａａａｔａｇｃａｇｇｔｇｔａｔｃｃａｇｃ−３’）及びｐｇｌＡｍｐＲ（５’−ＧＣＡ ＡＣＣ ＧＡＣ ＴＧＴ ＴＧＡ ＴＡＧ ＡＡＣ ＡＡＣ−３’）とを使用し、実施例４に記載のＰＣＲ法により、ＦＲＴ部位並びにｐｇｌ（ｙｂｈＥ）の上流及び下流と相同領域と隣接させたカナマイシンカセットを含有しているＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物を使用して、大腸菌（E. coli）ＣＭＰ１０７５の組み換え反応を行った（プロトコルについては上記を参照されたい）。コロニーをＬＢ＋カナマイシン１０ｍｇ／Ｌで選択し、ＣＭＰ１１２５と名づけた。製造元により推奨されるプロトコルを用い、株ＣＭＰ１１３３からカナマイシンマーカーを除去した（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
プライマーｐｇｌＡｍｐＦ及びｐｇｌＲｅｃＣｈｅｃｋ（５’−ＧＧＴ ＴＡＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＡＴＴ ＧＧＣ ＧＴＡ ＣＧＣ−３’）を使用してＰＣＲを行い、ＣＭＰ１１３３がｐｇｌ遺伝子を欠失していることを確認した。電気穿孔法により、プラスミドＭＣＭ８２及びｐＣＨＬ２４３をＣＭＰ１１３３に同時に導入した。ＬＢ＋カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ及びスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌで生育したコロニーを選択し、ＣＭＰ１１３６と名づけた。
実施例３６：ＣＭＰ１１３６の大規模発酵
本試験を実施して、導入したメバロン酸経路由来遺伝子を発現させかつ１５Ｌスケールの流加式培養で生育させた大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）によるイソプレン生産を評価した。下記の通りイソプレン生産株ＣＭＰ１０８２（ＨＭＢ ＧＩ１．２ｇｌｔＡ、ＰｙｄｄＶＩｓｐＡ＿ＧＯ、ｔｒｕｎｃＩｓｐＡ、ｐＭＣＭ８２、ｐＤＷ７２）を使用し、標準的なイソプレン生産工程を実施した。同一条件での試験株ＣＭＰ１１３６（ＨＭＢ ＧＩ１．２ｇｌｔＡ、ＰｙｄｄＶＩｓｐＡ＿ＧＯ、ｔｒｕｎｃＩｓｐＡ，ｐｇｌ−、ｐＭＣＭ８２、ｐＤＷ７２）の生産指数（グルコースに対する累積イソプレン収率、グルコースに対する瞬間的なイソプレン収率、イソプレンの容積生産量、比生産量及び細胞生産性指数）を比較して、ＣＭＰ１１３６においてｐｇｌ遺伝子を欠失させたことによる収率の向上を確認した。
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍｌ）。
すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、用量に調整した。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
供給溶液（１キログラム当たり）：グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）、及び１００％ Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブにより処理した後、滅菌フード中で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に供給溶液に添加するものは（供給溶液１キログラム当たり）マクロ塩溶液５．５４ｍｌ、ビタミン溶液６．５５ｍｌ、１０００Ｘ改変微量金属溶液０．８２ｍｌである。
本実験は、所望の発酵ｐＨ（７．０）及び温度（３４℃）でのグルコースからのイソプレン発酵をモニターするために実施した。大腸菌（E. coli）株を凍結したバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス及び適切な抗生物質を添加した培地を入れたフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。
各バッチの培地には、グルコースを９．７ｇ／Ｌ含有させた。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施した。細胞のＯＤ５５０が６になったなら、２００μＭの濃度になるようＩＰＴＧを反応槽に添加した。培養によるグルコースの消費がｐＨの上昇により示されたなら、代謝に必要とされる量に足りるよう、１０ｇ／ｍｉｎ以下の速度でグルコース供給溶液を供給した。グルコースに対するメバロン酸の最大質量収率を測定するのに十分な時間、すなわち発酵の開始から合計６８〜７２時間にわたって発酵を行った。
結果
ｐｇｌ−株（ＣＭＰ１１３６）は、ｐｇｌ＋株（ＣＭＰ１０８２）と比較して、グルコースに対するイソプレンの収率（％）が高かった。表２７及び図４１を参照されたい。ｐｇｌ−株（ＣＭＰ１１３６）は、ｐｇｌ＋株（ＣＭＰ１０８２）と比較して、グルコースに対するイソプレンの瞬間的な収率（％）が高く、かつこの生産性の高さをより長時間維持した（ｐｇｌ−は最大約２４時間維持したのに対し、ｐｇｌ＋は最大約１２時間維持した）。表２７及び図４２を参照されたい。ｐｇｌ−株（ＣＭＰ１１３６）の細胞生産性指数はｐｇｌ＋株（ＣＭＰ１０８２）よりも高かった。６８〜７２時間の発酵終了時に、ｐｇｌ−株はかなり高いＣＰＩを有していた。また、グルコースに対するイソプレンの累積生産性が最大となる時（ｐｇｌ＋株については４４時間及びｐｇｌ−株については５６時間）のＣＰＩはｐｇｌ−株の方が高かった。表２７及び図４３を参照されたい。ｐｇｌ−株（ＣＭＰ１１３６）の総容積生産量はｐｇｌ＋株（ＣＭＰ１０８２）のものとおおよそ同程度であった。表２７及び図４４を参照されたい。ｐｇｌ−株（ＣＭＰ１１３６）の最大比生産量はｐｇｌ＋株（ＣＭＰ１０８２）のものとおおよそ同程度であった。しかしながら、ｐｇｌ−株（ＣＭＰ１１３６）は、この生産性の高さをｐｇｌ＋株（ＣＭＰ１０８２）よりも長時間維持し、かつ発酵速度が顕著に良好であった。表２７及び図４５を参照されたい。
Figure 2017148063
実施例３７：ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）プロモータに遺伝子操作を施した株ＣＭＰ１２３７及びＣＭＰ１２３８の構築
プライマー１．２ｐｐｃＲ２（５’−ｃｇｇｇｃｔｔｔｇｃｔｔｔｔｃｇｔＣＡＧＴＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧ−３’）及びｐｐｃＦ（５’−ｇｔｔａｃｔｔｇｇｇｇｃｇａｔｔｔｔｔｔａａｃａｔｔｔｃｃａｔａａｇｔｔａｃｇｃｔｔａｔｔｔａａａｇｃＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧＧ−３’）により、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のクロラムフェニコールカセットＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴを増幅させた。このようにして得られたＰＣＲ産物を精製し、製造元（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）の推奨に従い組み換え反応に使用して、株ＭＧ１６５５ １．６ｐｐｃにコンストラクトを導入した（米国特許第７，７４５，１８４号、２０１０年６月２９日発行を参照されたい）。得られた株（ＣＭＰ３＿４９）から、プライマーＣＭＰ７９（５’−ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＣＧ ＧＴＴ ＴＡＴ ＣＡＡ ＧＣＣ ＣＡＣ Ｃ−３’）及びＣＭＰ８０（５’−ｃｇｔｇａａｇａｔｔｔｃｇａｃａａｃｔｔａｃｇｇ−３’）によりＰＣＲ産物を増幅させ、製造元の推奨に従い（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）組み換え反応に使用して、ＢＬ２１にコンストラクトを導入した（ＤＥ３）。ＤＥ３株からＰ１可溶化液を調製し、ＣＭＰ１１３３（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｄｏｃｋｅｔ＃４０１０９）に形質導入した。Ｐ１可溶化液を調製し、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃに記載の方法に従って使用した。コロニーをＬＢ＋クロラムフェニコール５ｍｇ／Ｌで選択し、ＣＭＰ１２３０と名づけた。製造元により推奨されるプロトコルを用い（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）クロラムフェニコールマーカーを除去して株ＣＭＰ１２３４を作製した。電気穿孔法により、プラスミド対ｐＭＣＭ８２（米国特許第２０１１／０１５９５５７号）及びｐＤＷ７２（米国特許出願第１３／２８３，５６４号を参照されたい）並びにｐＭＣＭ１２２５（表２５を参照されたい）及びｐＤＷ２４０を導入し、ＬＢ＋５０ｍｇ／Ｌカルベニシリン＋５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンで選択した。このようにして得られた株を、それぞれＣＭＰ１２３７及びＣＭＰ１２３８と名づけた。
実施例３８：ｐｐｃプロモータに遺伝子操作を施したＣＭＰ１２３７及びＣＭＰ１１３６株におけるイソプレン生産の比較
本実施例は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）プロモータに遺伝子操作を施した株におけるイソプレン生産を評価する。
（ｉ）溶液
ＴＭ３培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ）、酵母エキス（０．２ｇ）、１０００ｘ微量金属溶液（１ｍｌ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。孔径０．２２μｍのフィルタで培地を濾過滅菌する。ｐＨ調整及び滅菌後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を添加する。
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１成分ずつ脱イオン水に溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を用量に調整し、０．２２μｍフィルタでフィルタ滅菌する。
（ｉｉ）方法
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、ＯＤ６００が０．１になるよう、２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコにおいて細胞を２０ｍＬのＴＭ３培地（５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン及び５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有）により希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。２時間生育させた後、ＯＤ６００を測定し、２００ｕＭのＩＰＴＧを加える。発酵工程の間、規則的に試料を採取する。各時点でＯＤ６００を測定する。また、ガスクロマトグラフ−質量分析器（ＧＣ−ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるヘッドスペースアッセイにより、イソプレンのオフガス解析を行った（米国特許出願公開番号第２００５／０２８７６５５号を参照されたい。この特許文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。１００μＬの全ブロスをＧＣバイアルに入れ密閉し、３４℃かつ２００ｒｐｍで３０分間インキュベートする。７０℃で７分のインキュベーションからなる加熱殺菌工程後、試料をＧＣに装填する。記録される比生産量は、イソプレン量のＧＣによる読み取り値（μｇ／Ｌ）を、インキュベート時間（３０分）及びＯＤ６００測定値で除算した値である。
（ｉｉｉ）結果
ｐｐｃプロモータに遺伝子操作を施した株（ＣＭＰ１２３７）の生育は、野生型ｐｐｃを有する株ＣＭＰ１１３６と比較してわずかに遅かった（図４６）。ＣＭＰ１２３７株の比生産量は、ＣＭＰ１１３６の比生産量よりも高かった（図４７）。
実施例３９：ｐｐｃプロモータに遺伝子操作を施した株における１５Ｌスケールでのイソプレン生産
本試験を実施して、導入したメバロン酸経路由来の遺伝子を発現させかつ１５Ｌスケールの流加式培養で生育させた大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）によるイソプレン生産を評価した。下記の通りイソプレン生産株ＣＭＰ１１３６（ＨＭＢ ＧＩ１．２ｇｌｔＡ，ＰｙｄｄＶＩｓｐＡ＿ＧＯ，ｔｒｕｎｃＩｓｐＡ，ｐｇｌ−，ｐＭＣＭ８２，ｐＤＷ７２）を使用し、標準的なイソプレン生産工程を実施した。同一条件下での、試験株の生産指数（グルコースに対する累積イソプレン収率、グルコースに対する瞬間的なイソプレン収率、イソプレンの容積生産量、比生産量及び細胞生産性指数）を比較して、試験株ＣＭＰ１２３７（ＨＭＢ ＧＩ１．２ｇｌｔＡ，ＧＩ１．２ｐｐｃ，ＰｙｄｄＶＩｓｐＡ＿ＧＯ，ｔｒｕｎｃＩｓｐＡ，ｐｇｌ−，ｐＭＣＭ８２，ｐＤＷ７２）において、ＧＩ１．２プロモータ下でホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を発現させることで、何らかの収率の向上が観察されるかを確認した。
（ｉ）溶液
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍｌ）。
すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、用量に調整した。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
供給溶液（１キログラム当たり）：グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）、及び１００％ Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブにより処理した後、滅菌フード中で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に供給溶液に添加するものは（供給溶液１キログラム当たり）マクロ塩溶液５．５４ｍｌ、ビタミン溶液６．５５ｍｌ、１０００Ｘ改変微量金属溶液０．８２ｍｌである。
（ｉｉ）方法
本実験は、所望の発酵ｐＨ（７．０）及び温度（３４℃）でのグルコースからのイソプレン発酵をモニターするために実施した。大腸菌（E. coli）株を凍結したバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス及び適切な抗生物質を添加した培地を入れたフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。
ガスを注入してバイオリアクタの背圧を７０ｋＰａ（０．７ｂａｒ）程度に維持し、生産物には、酸素を体積比で酸素濃度８〜１０％で提供し、この際ガスの残部は窒素とした。
各バッチの培地には、グルコースを９．７ｇ／Ｌ含有させた。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施した。細胞のＯＤ５５０が６になったなら、２００μＭの濃度になるようＩＰＴＧを反応槽に添加した。培養によるグルコースの消費がｐＨの上昇により示されたなら、代謝に必要とされる量に足りるよう、６ｇ／ｍｉｎ以下の速度でグルコース供給溶液を供給した。グルコースに対するメバロン酸の最大質量収率を測定するのに十分な時間、すなわち発酵の開始から合計６８〜７２時間にわたって発酵を行った。
（ｉｉｉ）解析
イソプレンは揮発性であり、注入ガスにより槽から効率的に回収することができる。バイオリアクタのオフガス中のイソプレン濃度は、２つの質量分析器ｉＳＣＡＮ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓｕｎｄｓｔｒａｎｄ）及びＨｉｄｅｎ ＨＰＲ２０（Ｈｉｄｅｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）質量分析器を使用して測定した。オフガス中の酸素、窒素及びＣＯ２濃度は、同様の質量分析ユニットにより測定した。
発酵ブロス中の溶存酸素は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙにより提供された光学センサーを備えた衛生的であり滅菌可能なプローブにより測定した。
４時間間隔でブロス試料にＨＰＬＣ解析を行い、発酵ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸及びメバロン酸濃度を測定した。屈折計による測定値と、濃度既知の標準を使用して予め作成した検量線とを比較して、ブロス試料中の濃度を測定した。
（ｉｉｉ）結果
結果を表２８に要約する。ＧＩ１．２ｐｐｃ株（ＣＭＰ１２３７）は、野生型ｐｐｃプロモータ株（ＣＭＰ１１３６）と比較して、グルコースに対するイソプレン収率（％）が高く（図４８）、グルコースに対するイソプレンの瞬間的な収率（％）が高く（図４９）、細胞生産性指数が高く（図５０）、総容積生産量が高く（図５１）、かつイソプレンの最大比生産量はおよそ等しかった（図５２）。
Figure 2017148063
実施例４０：ＧＩ１．２ｐｐｃコンストラクトの有するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性は野生型ｐｐｃプロモータのものよりも低い
（ｉ）材料及び方法
株ＣＭＰ１２３７（ｐｐｃプロモータを遺伝子操作）及びＤＷ７１９（野生型ｐｐｃ）の１５Ｌ規模の発酵により得られた細胞を遠心分離により回収した。上清を廃棄し、ペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ８）、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、１ｍＭのＤＴＴ、１０μｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅ、１ｍＭのＰＭＳＦ）に再懸濁した。
細胞を一度凍結／解凍した後、遠心分離をして細胞残屑を除去した。上清を回収し、氷上で保管した。
アッセイでは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）によるＯＡＡのリンゴ酸への変換と結びつけて、かつＮＡＤＨのＮＡＤ＋への酸化をモニターして、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）のオキサロ酢酸（ＯＡＡ）への変換をモニターする。
次の試薬：０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８）、０．１ｍＭのＮＡＤＨ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、１０ｍＭのＭｇＣＬ２、５ｍＭのＰＥＰ、０．５ｍＭのアセチルＣｏＡ、５ｕ／ｍｌのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、１０〜２０μＬの試料、を入れたマイクロタイタープレートで、アッセイを実施した。１００秒以降に３４０ｎｍでの吸光度の低下が観察された。
（ｉｉ）結果：
発酵開始からおよそ４８時間の時点で、ＤＷ７１９のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性は４９活性／ＯＤ２６０であったのに対し、ＣＭＰ１２３７の活性は３４活性／ＯＤ２６０であった。
実施例４１：ＦＮＲタンパク質を回復させた株ＣＭＰ１１８９及びＣＭＰ１１９１、並びに株ＣＭＰ１１９１によるイソプレン生産
Ｋｅｉｏコレクション（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：２００６．０００８）の株ＪＷ１３２６からＰ１可溶化液を調製し、これを使用してＣＭＰ１１３３（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｄｏｃｋｅｔ ＃４０１０９）に形質導入した。Ｐ１可溶化液を調製し、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ，Ｉｎｃに記載の方法に従って使用した。コロニーをＬＢ＋カナマイシン１０ｍｇ／Ｌで選択し、ＣＭＰ１１８０と名づけた。Ｐ１形質導入により最大で１００ｋＢまでのＤＮＡを形質導入することができる。ｙｎａＪがＦＮＲとごく近接していることから（図５３）、ｙｎａＪにおける変異を選択する場合、可溶化液を調製した株由来のＦＮＲをコードしているＤＮＡも有している可能性が高い。Ｋｅｉｏコレクションは、機能的ＦＮＲを有するＫ−１２株で構築された。すなわち、ＦＮＲがタンパク質中に終止コドンを含有する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１とは異なる（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９４：６５３−６８０）。プライマーＣＭＰ５１（５’−ＣＡＧ ＧＴＡ ＡＴＧ ＣＡＴ ＴＡＣ ＧＧＣ ＣＡＡ ＣＴＧ−３’）及びＣＭＰ５２（５’−ｃａｇｇｃｔｇｔａｃｇｃｔｇｇｃｔｇａｔｇａｃ−３’）によりＣＭＰ１１８０からＦＮＲを増幅させ、ＣＭＰ５３（５’−ＡＴＧ ＡＴＣ ＣＣＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＴＴ ＡＴＡ ＣＧ−３’）により配列決定した。この配列は、機能的ＦＮＲの対立遺伝子を保有している可能性があった。製造元により推奨されるプロトコルを用い、株ＣＭＰ１１８９からカナマイシンマーカーを除去した（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。電気穿孔法により、プラスミド対ｐＭＣＭ８２（米国特許第２０１１／０１５９５５７号）及びｐＤＷ７２（米国特許出願第１３／２８３，５６４号を参照されたい）を導入し、ＬＢ＋５０ｍｇ／Ｌカルベニシリン＋５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンで選択した。このようにして得られた株をＣＭＰ１１９１と名づけた。
実施例３８に記載のプロトコルを使用し、株ＣＭＰ１１９１によるイソプレン生産を、ＣＭＰ１１３６のものと比較した。ＦＮＲが酸素センサーとなることから、同様の培地により、但し２００ｒｍではなく５０ｒｐｍでインキュベートし、更なる試験を行った。これにより酸素濃度を制限した培養を実施した。
結果
機能的ＦＮＲを有する株の生育は、変異を導入したＦＮＲを有する株を、よく通気を行いフラスコにおいて生育させた場合と同様であった（図５４）。撹拌を抑えて酸素濃度を制限させた場合、機能的ＦＮＲを有する株の生育はやや遅くなった（図５５）。フラスコにおいてよく通気を行った場合、ＣＭＰ１１３６（変異型ＦＮＲ）及びＣＭＰ１１９１（機能的ＦＮＲ）の比生産量は類似していた（図５６）。撹拌を抑えて酸素濃度を制限させた場合、機能的ＦＮＲを有する株の比生産量は増加した（図５７）。
実施例４２：ＭＤ１２−７４６（ａｃｋＡ−ｐｔａ変異を有する）の構築
テンプレートとして株ＭＧ１６５５ ΔａｃｋＡ−ｐｔａ：：Ｃｍ（米国特許第７，７４５，１８４号、２０１０年６月２９日出願を参照されたい）を使用し、及びプライマーａｃｋＡＣＦ（５’−ｇｔｇｃａａａｔｔｃａｃａａｃｔｃａｇｃｇｇ−３’）及びｐｔａＣＲ（５’−ＣＡＣ ＣＡＡ ＣＧＴ ＡＴＣ ＧＧＧ ＣＡＴ ＴＧＣ−３’）を使用してＰＣＲを行い、クロラムフェニコールマーカーにより破壊されたａｃｋＡ−ｐｔａ遺伝子を含有しているＤＮＡ断片を増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、製造元（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の推奨する通りに組み換え反応に使用し、ＣＭＰ２５８株のａｃｋＡ−ｐｔａ座に組み入れた（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｄｏｃｋｅｔ ＃３１５８８）。ＬＢ＋５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールにてコロニーを選択した。コロニーを１つ選択し、ＭＤ１０−４９１と名づけた。この株からＰ１可溶化液を調製し、これを使用してＣＭＰ１１３３に形質導入した。株に電気穿孔法によりｐＣＰ２０を導入して、クロラムフェニコールマーカーを除去し（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ．２０００．ＰＮＡＳ ９７：６６４０〜５）、３０℃下でＬＢ＋５０ｕｇ／ｍｌのカルベニシリンで２つのコロニーを選択し、次に、これらのコロニーを、４２℃下でＬＢプレートに再画線した。これらのプレートからクロラムフェニコール感受性のコロニーを選択し、ＭＤ１２−７４６と名づけた。
実施例３８に記載のプロトコルを使用し、株ＭＤ１２−７４６によるイソプレン生産を、ＤＷ７１９のものと比較した。
結果
ＭＤ１２−７４６とＤＷ７１９とを比較したところ、イソプレンの比生産量の増加が観察された（図５８〜５９）。
実施例４３：ｉｒａＭを過剰発現させた株ではイソプレンの比生産量は増加した
本実施例は、下記の手法により実施した、１５Ｌ発酵物のマイクロアレイ解析を詳述する。
（ｉ）方法
このゲノム・ワイドな翻訳試験には、株ＣＭＰ４５７及びＭＣＭ１０２０を使用した。
電気穿孔法によりプラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びｐＣＬ１９２０（米国特許出願公開番号第２００９／０２０３１０２号を参照されたい。この出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。）を株ＣＭＰ２５８（国際公開第２０１１／０５８１８８号を参照されたい。この出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。）に導入し、ＬＢ＋５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン＋５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリンでコロニーを選択して、株ＭＣＭ１０２０を構築した。
発酵試料をＲＮＡＬａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により手早く１：５希釈し、−２０℃で凍結させた。細胞を回収し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解し、室温で５分インキュベートした。２０％氷冷クロロホルムを添加して抽出を行い、核酸を単離した。溶液を混合し、室温で５分インキュベートした後、４℃にて１３，０００ｒｐｍで１５分遠心分離した。頂部の水相を単離し、当量の氷冷エタノールを加えた。ＲＮＥａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、ＲＮＡを単離した。製造元の指示に従って、ＤＮａｓｅ溶液（１０μＬのＤＮａｓｅ Ｉストック／７０μＬのＲＤＤ緩衝液）（Ｑｉａｇｅｎ）を添加し、室温で３０分インキュベートする手順を行い、ＤＮＡを分解した。ヌクレアーゼフリーの水により、ＲＮｅａｓｙカラムからＲＮＡを溶出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ装置を使用し測定を行い、各試料から最低で２０μｇのＲＮＡを回収した。３Ｍの酢酸ナトリウムの場合には１／１０容量を添加して沈殿させ、ＲＮＡを更に精製した。最終濃度１ｕｇ／μＬとなるようグリコーゲン（発酵物由来のＲＮＡ等級）を添加した後、２．５倍量の氷冷エタノールを添加した。溶液を−８０℃で６０分インキュベートし、次に１０，０００ｒｐｍで１５分遠心分離した。上清を廃棄し、ＲＮＡペレットを氷冷７０％エタノールにより簡単に洗浄した。ＲＮＡペレットを２０分風乾させ、濃度μｇ／μＬでヌクレアーゼフリー水に溶解した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ装置及びゲル電気泳動を使用し、品質及び濃度を測定した。大腸菌（E. coli）ＢＬ２１専用に設計した３８５Ｋ ４−ｐｌｅｘマイクロアレイを使用して、Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ（Ｉｃｅｌａｎｄ）によるｃＤＮＡの合成、標識及び転写解析を実施した。得られたデータを、ＧｅｎｅｐｒｉｎｇＧＸ Ｖｅｒｓｉｏｎ １１（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して解析した。
（ｉｉ）結果：
データを解析したところ、イソプレン生産株において、タンパク質の加水分解阻害物質ｉｒａＭが誘導されていたことが判明した（図６０）。
実施例４４：株ＭＤ１１−６１０及びＭＤ１１−６１２の構築
ＭＤ１１−６１０：ｉｒａＭの前に存在するＰＬ．６プロモータプライマーＭＱ１０−１２７Ｆ（５’−ＧＴＴ ＡＡＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＣＡＧ ＴＣＡ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＧＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＡＡ ＧＴＴ ＣＡＴ ＴＴＧ ＴＡＡ ＡＡＡ ＴＧＧ ＡＧＡ ＴＡＡ ＴＴＧ ＴＧＴ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＴＴ Ｃ−３’）及びＭＱ１０−１２７Ｒ（５’−ＴＣＧ ＴＧＴ ＣＡＡ ＴＴＡ ＣＴＡ ＴＣＣ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＡＣＣ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＣＡ ＣＣＴ ＴＣＡ ＴＧＧ ＴＧＧ ＴＣＡ ＧＴＧ ＣＧＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＡＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＡＧＴ ＡＴＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＧＴ ＧＧＴ ＡＴＴ ＴＡＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＧＡ ＧＡＴ ＡＡＴ ＴＴＡ ＴＣＡ ＣＣＧ ＣＡＧ ＡＴＧ ＧＴＴ ＡＴＣ ＴＧＴ ＡＴＧ ＴＴＴ ＴＴＴ ＡＴＡ ＴＧＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＡＴ ＡＴＣ ＣＴＣ ＣＴＴ Ａ−３’）と、テンプレートとしてプラスミドｐＫＤ３（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ．２０００．ＰＮＡＳ９７：６６４０−５）とを使用し、ＰＣＲ産物（＃１）を生成した。ＰＣＲ産物＃２は、プライマーＭＱ１０−１２８Ｆ（５’−ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＴＡ ＡＴＴ ＧＡＣ ＡＣＧ Ａ−３’）及びＭＱ１１−１２８Ｒ（５’−ＧＣＡ ＴＴＣ ＴＴＴ ＣＡＡ ＴＡＧ ＣＴＴ ＴＧＣ ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＡＡ ＣＧＴ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＧＣ ＡＡＡ ＧＧＴ ＧＧＴ ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＴＴ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＣＴ ＴＡＧ ＴＣＡ ＴＴＡ ＣＴＴ ＧＡＧ ＣＣＣ ＡＴＡ ＴＧＧ ＧＣＡ ＴＡＴ Ｔ−３’）と、テンプレートとしてＢＬ２１の染色体ＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して生成した。プライマーＭＱ１０−１２７Ｆ及びＭＱ１１−１２８Ｒ−ｔｅｒｍ（５’−ＧＣＡＴＴＣＴＴＴＣＡＡＴＡＧＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＣＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＡＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＴＣＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＧＡＣＴＴＴＡＣＴＴＧＡＧＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＴＡＴＴ−３’）を使用し、ＰＣＲ＃１及びＰＣＲ＃２フラグメントの混合物をテンプレートとして使用して、第３のＰＣＲ産物（ＰＣＲ＃３）を増幅させた。このようにして得られたＰＣＲ産物を、製造元のプロトコルに従って、組み換え反応に使用して（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）株ＣＭＰ４５１（ＢＬ２１ ｐｇｌ＋ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ ＧＩ１．２ ｇｌｔＡ）のキル座に組み込み、株ＭＤ１１−５９７を作製した。クロラムフェニコールマーカーをｐＣＰ２０により除去し、株ＭＤ１１−６０４を作製した。株ＭＤ１１−６０４に、電気穿孔法によりプラスミドｐＭＣＭ８２及びｐＤＷ１６６を導入し、形質転換を行った。コロニーをＬＢ＋５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン＋５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンで単離し、ＭＤ１１−６１０と名づけた。
ＭＤ１１−６１２：ｉｒａＭの前に存在するＧＩ１．６プロモータプライマーＭＱ１１−１２７Ｆ（５’−ＧＴＴ ＡＡＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＣＡＧ ＴＣＡ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＧＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＡＡ ＧＴＴ ＣＡＴ ＴＴＧ ＴＡＡ ＡＡＡ ＴＧＧ ＡＧＡ ＴＡＡ ＴＴＧ ＴＧＴ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＴＴ Ｃ−３’）及びＭＱ１１−１２９Ｒ（５’−ＴＣＧ ＴＧＴ ＣＡＡ ＴＴＡ ＣＴＡ ＴＣＣ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＴＴ ＴＡＴ ＡＴＡ ＣＣＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＡＴＴ ＴＧＴ ＴＡＧ ＴＧＡ ＡＴＡ ＡＡＡ ＧＴＧ ＧＴＴ ＧＡＡ ＴＴＡ ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＡＧ ＧＡＴ ＧＴＧ ＧＣＡ ＴＴＧ ＴＣＡ ＡＧＧ ＧＣＣ ＡＴＡ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＴＡ−３’）と、テンプレートとしてプラスミドｐＫＤ３（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ．２０００．ＰＮＡＳ ９７：６６４０〜５）を使用し、ＰＣＲ産物（＃４）を生成した。プライマーＭＱ１１−１２７Ｆ及びＭＱ１１−１２８Ｒ−ｔｅｒｍを使用し、テンプレートとしてＰＣＲ＃４及びＰＣＲ＃２断片の混合物を使用して新しいＰＣＲ産物（ＰＣＲ＃５）を増幅させた。このようにして得られたＰＣＲ産物を、製造元のプロトコルに従って、組み換え反応に使用して（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）株ＣＭＰ４５１のキル座に組み込み、株ＭＤ１１−５９９を生成した。クロラムフェニコールマーカーをｐＣＰ２０により除去し、株ＭＤ１１−６０６を生成した。株ＭＤ１１−６０６に、電気穿孔法によりプラスミドｐＭＣＭ８２及びｐＤＷ１６６を導入し、形質転換を行った。コロニーをＬＢ＋５０ｍｇ／ｍＬのカルベニシリン＋５０ｍｇ／ｍＬのスペクチノマイシンで単離し、ＭＤ１１−６１２と名づけた。
実施例３８（上記）に記載のプロトコルを使用し、ＭＤ１１−６０８（プラスミドｐＭＣＭ８２及びｐＤＷ１６６を含有しているＣＭＰ４５１）を対照として比較し、株ＭＤ１１−６１０及びＭＤ１１−６１２を小規模（振盪フラスコ）で試験した。全ての株は類似した生育プロファイルを有していた（図６１）。遺伝子操作を施したｉｒａＭプロモータを有する株は比生産量が上昇していた（図６２）。
実施例４５：ａｃｒＡを欠失させた株ＭＤ１１−６０７ではイソプレンの比生産量は向上していた
ａｃｒＡは、多剤排出ポンプａｃｒＡＢ−ＴｏｌＣの構成要素である。この複合体は、溶媒、染料及び洗剤に対する耐性と関係する。直感的には、このポンプを過剰発現させると、ブタノール又はイソプレンなどの化学物質によるストレスに対する耐性が上昇し得る。直感には反するが、ａｃｒＡの変異により、ブタノール耐性が上昇すると考えられている（Ａｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌ Ｓｙｓ Ｂｉｏｌ．，６：４４９）。
イソプレンは、ブタノール同様毒性効果を有する可能性があることから、ａｃｒＡの欠失がイソプレンの比生産量に対し及ぼす影響について試験した。
テンプレートとしてＫｅｉｏコレクション（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：２００６．０００８）由来の株ＪＷ０４５２を使用し、プライマーＭＱ１０−１２１Ｆ（５’−ＧＴＴ ＣＧＴ ＧＡＡ ＴＴＴ ＡＣＡ ＧＧＴ ＧＴＴ ＡＧＡ ＴＴＴ ＡＣ−３’）及びＭＱ１０−１２１Ｒ（５’−ＧＴＧ ＣＡＡ ＴＣＧ ＴＡＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＣＧ ＣＣＡ ＣＣＧ ＧＣ−３’）を使用して、ＰＣＲにより、カナマイシンマーカーにより破壊されたａｃｒＡ遺伝子を含有しているＤＮＡ断片を増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、製造元（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の推奨する通りに組み換え反応に使用し、ＣＭＰ４５１株のａｃｒＡ座に組み入れた（米国特許出願第１３／２８３，５６４号を参照されたい）。ＬＢ＋１０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンにてコロニーを選択した。コロニーを１つ選択し、ＭＤ１１−５８９と名づけた。株に電気穿孔法によりｐＣＰ２０を導入して、カナマイシンマーカーを除去し（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ．２０００．ＰＮＡＳ ９７：６６４０−５）、３０℃下でＬＢ＋５０ｕｇ／ｍｌのカルベニシリンで２つのコロニーを選択し、次に、これらのコロニーを、４２℃下でＬＢプレートに再画線した。
これらのプレートからＫａｎＳを選択し、ＭＤ１１−６０２と名づけた。電気穿孔法により、プラスミドｐＭＣＭ８２（米国特許第２０１１／０１５９５５７号）及びｐＤＷ１６６を導入し、ＬＢ＋５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリン＋５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンで選択した。このようにして得られた株を、ＭＤ１１−６０７と名づけた。
実施例３８（上記）に記載のプロトコルを使用し、ＭＤ１１−６０８（プラスミドｐＭＣＭ８２及びｐＤＷ１６６を含有しているＣＭＰ４５１）を対照として比較し、株ＭＤ１１−６０７を小規模（振盪フラスコ）で試験した。発酵の初期には生育は類似していたが、発酵の後期にはａｃｒＡ変異株の生育は鈍化し始めた（図６８）。ＭＤ１１−６０７の比生産量は、ＭＤ１１−６０８と比較して上昇していた（図６９）。
配列
Ｌ．グレイ（L. grayi）ｍｖａＥ：
Figure 2017148063
Ｌ．グレイ（L. grayi）ｍｖａＳ：
Figure 2017148063
Ｅ．フェシウム（E. faecium）ｍｖａＥ：
Figure 2017148063
Ｅ．フェシウム（E. faecium）ｍｖａＳ：
Figure 2017148063
Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）ｍｖａＥ：
Figure 2017148063
Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）ｍｖａＳ：
Figure 2017148063
Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）ｍｖａＥ：
Figure 2017148063
Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）ｍｖａＳ：
Figure 2017148063
Ｅ．フェカリス（E. faecalis）ｍｖａＥ：
Figure 2017148063
Ｅ．フェカリス（E. faecalis）ｍｖａＳ：
Figure 2017148063
Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）のＥＧ２（ｍｖａＥ）：
Figure 2017148063
Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）のＥＧ２（ｍｖａＳ）
Figure 2017148063
Ｌ．グレイ（L. grayi）（ｍｖａＥ）：
Figure 2017148063
Ｌ．グレイ（L. grayi）（ｍｖａＳ）：
Figure 2017148063
Ｅ．フェシウム（E. faecium）（ｍｖａＥ）：
Figure 2017148063
Ｅ．フェシウム（E. faecium）（ｍｖａＳ）
Figure 2017148063
Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）（ｍｖａＥ）：
Figure 2017148063
Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）（ｍｖａＳ）
Figure 2017148063
アセトアシル−ＣｏＡ−シンターゼ：
Figure 2017148063
イソプレンシンターゼ：
Figure 2017148063
ｉｓｐＡ：
Figure 2017148063
大腸菌（E. coli）用にコドン最適化したアモルファジエン合成酵素：
Figure 2017148063
大腸菌（E. coli）用にコドン最適化したファルネセン合成酵素：
Figure 2017148063
ｐＭＣＭ１２２３−ｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−Ｕｐｐｅｒ＿ＧｃＭＭ＿１６１（リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ ２０６０１）：
Figure 2017148063
Figure 2017148063
ｐＭＣＭ１２２４−ｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−Ｕｐｐｅｒ＿ＧｃＭＭ＿１６２（エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium））
Figure 2017148063
Figure 2017148063
ｐＭＣＭ１２２５−ｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−Ｕｐｐｅｒ＿ＧｃＭＭ＿１６３（エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２）：
Figure 2017148063
Figure 2017148063
ｐＭＣＭ１６６６−ｐＥＴ２４−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ｂＭＶＫ
Figure 2017148063
ｐＭＣＭ１６６９−ｐＥＴ２４−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ｍＭＶＫ（ＧＯ）
Figure 2017148063
Figure 2017148063
ＭＣＭ１７４２
Figure 2017148063
ＭＣＭ１７４３
Figure 2017148063
ＭＣＭ１７４５
Figure 2017148063
ＭＣＭ１７４７
Figure 2017148063
ＭＣＭ１８６１
Figure 2017148063
ｐＭＣＭ２０２０−ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｂＭＶＫ
Figure 2017148063
Figure 2017148063
Figure 2017148063
ｐＭＣＭ２０９５−ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ（ｄｅｌ）
Figure 2017148063
Figure 2017148063

Claims (150)

  1. イソプレンの生産性を上昇させることのできる組み換え細胞であって、次のものからなる群：
    （ａ）クエン酸シンターゼ、
    （ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ、
    （ｃ）酢酸キナーゼ、
    （ｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｅ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｆ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｇ）ホスホグルコノラクトナーゼ及び
    （ｈ）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
    のうちの１つ以上の酵素活性を調節することで、イソプレン生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されており、（ｉ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸及び（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含み、かつイソプレンに取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されていないイソプレン生産細胞と比較してイソプレンの生産量が増加している、細胞。
  2. 前記ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸が、前記ＭＶＡ経路上流に由来するものであり、前記ＭＶＡ経路上流の核酸は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の核酸からなる群から選択される、請求項１に記載の細胞。
  3. 前記メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸が、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子である、請求項２に記載の細胞。
  4. 前記ｍｖａＥ遺伝子及び前記ｍｖａＳ遺伝子が：（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．フェシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｄ）Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；並びに（ｅ）Ｅ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択される、請求項３に記載の細胞。
  5. 前記ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸が、前記ＭＶＡ経路下流に由来するものであり、前記ＭＶＡ経路下流の核酸が、ＭＶＫ、ＰＭＫ及びＭＶＤ核酸からなる群から選択される、請求項１に記載の細胞。
  6. 前記ＭＶＫが、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、又はストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される、請求項５に記載の細胞。
  7. 前記細胞が、ＤＸＰ経路の１種以上のポリペプチド（one or DXP pathway polypeptides）をコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む、請求項１に記載の細胞。
  8. 前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種、又はこれらの変異体（variant）由来のポリペプチドである、請求項１に記載の細胞。
  9. 前記細胞が、グラム陽性細菌細胞、ストレプトマイセス（Streptomyces）細胞、グラム陰性細菌細胞、大腸菌（Escherichia cells）細胞、パントエア（Pantoea）細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、アスペルギルス（Aspergillus）細胞、又は酵母細胞である、請求項１に記載の細胞。
  10. 前記クエン酸シンターゼに関係する内在性遺伝子の活性を減少させることにより、前記クエン酸シンターゼの活性を調節する、請求項１に記載の細胞。
  11. 染色体上の、前記内在性のクエン酸シンターゼ遺伝子を、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子で置き換えることにより、前記クエン酸シンターゼの活性を調節する、請求項１０に記載の細胞。
  12. 前記ＮＡＤＨ感受性のクエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子が、枯草菌（Bacillus subtilis）に由来する、請求項１１に記載の細胞。
  13. 前記クエン酸シンターゼの活性が、前記内在性クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって調節される、請求項１０に記載の細胞。
  14. 前記クエン酸シンターゼの活性の減少が、クエン酸シンターゼの発現を減少させていない微生物と比較してより多くの炭素が前記メバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
  15. 前記ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する、請求項１に記載の細胞。
  16. 前記ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性が、前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節される、請求項１５に記載の細胞。
  17. 前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は内在性酢酸キナーゼの遺伝子発現が、前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は前記内在性酢酸キナーゼ遺伝子の欠失により減弱される、請求項１６に記載の細胞。
  18. 前記細胞の酢酸の生成量が、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して減少している、請求項１５又は１６に記載の細胞。
  19. 前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は前記内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、前記メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する、請求項１〜９又は１５〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
  20. 前記炭素の取り込みが、前記乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項１に記載の細胞。
  21. 前記乳酸デヒドロゲナーゼの活性が、前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節できる、請求項２０に記載の細胞。
  22. 内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が、前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠失させることによって減弱させられる、請求項２１に記載の細胞。
  23. 前記細胞の乳酸の生成量が、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して減少している、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
  24. 前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、前記メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
  25. 前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することで、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する、請求項１のいずれか一項に記載の細胞。
  26. 前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性が、前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることにより調節される、請求項２５に記載の細胞。
  27. 前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が内在性遺伝子である、請求項２６に記載の細胞。
  28. 前記ＮＡＤＰ依存性内在性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が、前記ＮＡＤＰ依存性内在性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータを、前記常時発現型合成プロモータと置き換えることにより増加する、請求項２７に記載の細胞。
  29. 前記細胞が、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む、請求項２５又は２６に記載の細胞。
  30. 前記細胞のピルビン酸の生成量が、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して増加している、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の細胞。
  31. 前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることで、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子発現を増加させていない微生物と比較して、前記メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の細胞。
  32. 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することで、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する、請求項１のいずれか一項に記載の細胞。
  33. 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼから構成される前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する、１種以上の遺伝子の活性を増加させることで調節される、請求項３２に記載の細胞。
  34. 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性が、前記内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節される、請求項３２又は３３に記載の細胞。
  35. 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の１つ以上の遺伝子が、内在性遺伝子である、請求項３４に記載の細胞。
  36. 前記１種以上の内在性遺伝子プロモータを、１種以上の常時発現型合成プロモータで置き換えることにより、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する１種以上の内在性遺伝子の発現を増加させる、請求項３５に記載の細胞。
  37. 前記細胞が、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群の１種以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む、請求項３２又は３３に記載の細胞。
  38. 前記内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体のリプレッサーの活性が、前記内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子を欠失させることにより減弱させられる、請求項３４に記載の細胞。
  39. 前記細胞のアセチルＣｏ−Ａ生産量が、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節していない微生物と比較して増加している、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の細胞。
  40. 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性の調節が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現を調節していない微生物と比較してより多くの炭素が前記メバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の細胞。
  41. 前記炭素の取り込みが、前記ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）の活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項１に記載の細胞。
  42. 前記ＰＧＬの活性が、前記内在性ＰＧＬ遺伝子の活性を減弱させることで調節できる、請求項４１に記載の細胞。
  43. 前記ＰＧＬの活性が、前記内在性ＰＧＬ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって減弱させられる、請求項４２に記載の細胞。
  44. 前記内在性ＰＧＬの活性が、前記内在性ＰＧＬ遺伝子の欠失により減弱させられる、請求項４３に記載の細胞。
  45. 前記炭素の取り込みが、前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項１に記載の細胞。
  46. 前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節される、請求項４５に記載の細胞。
  47. 前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることによって減弱させられる、請求項４６に記載の細胞。
  48. 前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を欠失させることで減弱させられる、請求項４７に記載の細胞。
  49. イソプレンの生産方法であって、（ａ）イソプレン生産に好適な培養条件下で請求項１に記載の細胞を培養する工程と、（ｂ）前記イソプレンを生産する工程と、を含む、方法。
  50. メバロン酸の生産性を上昇させることのできる組み換え細胞であって、次のものからなる群：
    （ａ）クエン酸シンターゼ、
    （ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ、
    （ｃ）酢酸キナーゼ、
    （ｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｅ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｆ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｇ）ホスホグルコノラクトナーゼ及び
    （ｈ）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
    のうちの１つ以上の酵素活性を調節することで、メバロン酸生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されており、メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含み、かつメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されていないメバロン酸生産細胞と比較してメバロン酸の生産量が増加している、細胞。
  51. 前記メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸が、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子である、請求項５０に記載の細胞。
  52. 前記ｍｖａＥ遺伝子及び前記ｍｖａＳ遺伝子が：（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．フェシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｄ）Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；並びに（ｅ）Ｅ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択される、請求項５０に記載の細胞。
  53. 前記クエン酸シンターゼに関係する内在性遺伝子の活性を減少させることにより、前記クエン酸シンターゼの活性を調節する、請求項５０に記載の細胞。
  54. 染色体上の、前記内在性のクエン酸シンターゼ遺伝子を、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子で置き換えることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する、請求項５３に記載の細胞。
  55. 前記ＮＡＤＨ感受性のクエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子が、枯草菌（Bacillus subtilis）に由来する、請求項５４に記載の細胞。
  56. 前記クエン酸シンターゼの活性が、前記内在性クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって調節される、請求項５３に記載の細胞。
  57. 前記クエン酸シンターゼの活性の減少が、クエン酸シンターゼの発現を減少させていない微生物と比較してより多くの炭素が前記メバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる、請求項５３〜５４のいずれか一項に記載の細胞。
  58. 前記ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する、請求項５０に記載の細胞。
  59. 前記ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性が、前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節される、請求項５８に記載の細胞。
  60. 前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は内在性酢酸キナーゼの遺伝子発現が、前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は前記内在性酢酸キナーゼ遺伝子の欠失により減弱される、請求項５９に記載の細胞。
  61. 前記細胞の酢酸の生成量が、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して減少している、請求項５８又は５９に記載の細胞。
  62. 前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は前記内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、前記メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する、請求項５０〜５２又は５８〜６１のいずれか一項に記載の細胞。
  63. 前記炭素の取り込みが、前記乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項５０に記載の細胞。
  64. 前記乳酸デヒドロゲナーゼの活性が、前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節できる、請求項６３に記載の細胞。
  65. 内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が、前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠失させることによって減弱させられる、請求項６４に記載の細胞。
  66. 前記細胞の乳酸の生成量が、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して減少している、請求項６４〜６５のいずれか一項に記載の細胞。
  67. 前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、前記メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の細胞。
  68. 前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することで、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する、請求項５０に記載の細胞。
  69. 前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性が、前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることにより調節される、請求項６８に記載の細胞。
  70. 前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、内在性遺伝子である、請求項６９に記載の細胞。
  71. 前記ＮＡＤＰ依存性内在性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が、前記ＮＡＤＰ依存性内在性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータを、前記常時発現型合成プロモータと置き換えることにより増加する、請求項７０に記載の細胞。
  72. 前記細胞が、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む、請求項６８又は６９に記載の細胞。
  73. 前記細胞のピルビン酸の生成量が、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して増加している、請求項６８〜７２のいずれか一項に記載の細胞。
  74. 前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることで、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子発現を増加させていない微生物と比較して、前記メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する、請求項６８〜７３のいずれか一項に記載の細胞。
  75. 前記炭素の取り込みが、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項５０に記載の細胞。
  76. 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルアミドデヒドロゲナーゼから構成される前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する、１種以上の遺伝子の活性を増加させることで調節される、請求項７５に記載の細胞。
  77. 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性が、前記内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節される、請求項７５又は７６に記載の細胞。
  78. 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の１つ以上の遺伝子が、内在性遺伝子である、請求項７７に記載の細胞。
  79. 前記１つ以上の内在性遺伝子プロモータを、１種以上の常時発現型合成プロモータで置き換えることにより、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する１つ以上の内在性遺伝子の発現を増加させる、請求項７８に記載の細胞。
  80. 前記細胞が、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ及び（ｃ）ジヒドロリポイルアミドデヒドロゲナーゼからなる群の１種以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む、請求項７５又は７６に記載の細胞。
  81. 前記内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリプレッサーの活性が、前記内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子を欠失させることにより減弱させられる、請求項７７に記載の細胞。
  82. 前記細胞のアセチルＣｏ−Ａ生産量が、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節していない微生物と比較して増加している、請求項７５〜８１のいずれか一項に記載の細胞。
  83. 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性の調節が、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現を調節していない微生物と比較してより多くの炭素がメバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる、請求項７５〜８２のいずれか一項に記載の細胞。
  84. 前記炭素の取り込みが、前記ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）の活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項５０に記載の細胞。
  85. 前記ＰＧＬの活性が、前記内在性ＰＧＬ遺伝子の活性を減弱させることで調節できる、請求項８４に記載の細胞。
  86. 前記ＰＧＬの活性が、前記内在性ＰＧＬ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって減弱させられる、請求項８５に記載の細胞。
  87. 前記内在性ＰＧＬの活性が、前記内在性ＰＧＬ遺伝子の欠失により減弱させられる、請求項８５に記載の細胞。
  88. 前記炭素の取り込みが、前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項５０に記載の細胞。
  89. 前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節される、請求項８８に記載の細胞。
  90. 前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることによって減弱させられる、請求項８９に記載の細胞。
  91. 前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を欠失させることで減弱させられる、請求項８９に記載の細胞。
  92. メバロン酸の生産方法であって、（ａ）イソプレン生産に好適な培養条件下で請求項５０に記載の細胞を培養する工程と、（ｂ）前記メバロン酸を生産する工程と、を含む、方法。
  93. トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの活性条件下で増殖しない微生物と比較して、メバロン酸生産量が増加しており、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼ、（ｃ）乳酸デヒドロゲナーゼ、（ｄ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、並びに（ｅ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体、からなる群の１種以上の酵素の活性を調節することにより、細胞における代謝性炭素の取り込みがメバロン酸の生産に指向している、請求項５０〜９２のいずれか一項に記載の細胞。
  94. 前記クエン酸シンターゼの活性が、前記内在性クエン酸シンターゼ遺伝子プロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることにより調節され、前記乳酸デヒドロゲナーゼの活性が、前記内在性の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節され、及び前記酢酸キナーゼの活性が、前記内在性の酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節される、請求項５０〜９２のいずれか一項に記載の細胞。
  95. イソプレノイドの生産性を上昇させることのできる組み換え細胞であって、次のものからなる群：
    （ａ）クエン酸シンターゼ、
    （ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ、
    （ｃ）酢酸キナーゼ、
    （ｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｅ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｆ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｇ）ホスホグルコノラクトナーゼ及び
    （ｈ）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
    のうちの１つ以上の酵素活性を調節することで、メバロン酸に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されており、（ｉ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸及び（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードしている１つ以上の核酸を更に含み、かつメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作をされていないイソプレノイド生産細胞と比較してイソプレノイドの生産量が増加している、細胞。
  96. 前記ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸が、前記ＭＶＡ経路上流に由来するものであり、前記ＭＶＡ経路上流の核酸は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の核酸からなる群から選択される、請求項９５に記載の細胞。
  97. 前記メバロン酸（ＭＶＡ）経路上流のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸が、ｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子である、請求項９６に記載の細胞。
  98. 前記ｍｖａＥ遺伝子及び前記ｍｖａＳ遺伝子が：（ａ）Ｌ．グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）Ｅ．フェシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｄ）Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；並びに（ｅ）Ｅ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択される、請求項９７に記載の細胞。
  99. 前記ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸が、前記ＭＶＡ経路下流に由来するものであり、前記ＭＶＡ経路下流の核酸が、ＭＶＫ、ＰＭＫ及びＭＶＤ核酸からなる群から選択される、請求項９５に記載の細胞。
  100. 前記ＭＶＫが、Ｍ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼ、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセス（Streptomyces）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、又はストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される、請求項９９に記載の細胞。
  101. 前記細胞が、ＤＸＰ経路の１種以上のポリペプチド（one or DXP pathway polypeptides）をコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む、請求項９５に記載の細胞。
  102. 前記細胞が、グラム陽性細菌細胞、ストレプトマイセス（Streptomyces）細胞、グラム陰性細菌細胞、大腸菌（Escherichia）細胞、パントエア（Pantoea）細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、アスペルギルス（Aspergillus）細胞、又は酵母細胞である、請求項９５に記載の細胞。
  103. 前記内在性遺伝子の活性を減少させることにより、前記クエン酸シンターゼの活性を調節する、請求項９５に記載の細胞。
  104. 染色体上の、前記内在性のクエン酸シンターゼ遺伝子を、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子で置き換えることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する、請求項１０３に記載の細胞。
  105. 前記ＮＡＤＨ感受性のクエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子が、枯草菌（Bacillus subtilis）に由来する、請求項１０４に記載の細胞。
  106. 前記クエン酸シンターゼの活性が、前記内在性クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって調節される、請求項１０３に記載の細胞。
  107. 前記クエン酸シンターゼの活性の減少が、クエン酸シンターゼの発現を減少させていない微生物と比較してより多くの炭素が前記メバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる、請求項１０３〜１０６のいずれか一項に記載の細胞。
  108. 前記ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性を調節することにより、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する、請求項９５に記載の細胞。
  109. 前記ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの活性が、前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節される、請求項１０８に記載の細胞。
  110. 前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は内在性酢酸キナーゼの遺伝子発現が、前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は前記内在性酢酸キナーゼ遺伝子の欠失により減弱される、請求項１０９に記載の細胞。
  111. 前記細胞の酢酸の生成量が、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して減少している、請求項１０８又は１０９に記載の細胞。
  112. 前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は前記内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、前記メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する、請求項９５〜１０２又は１０８〜１１１のいずれか一項に記載の細胞。
  113. 前記炭素の取り込みが、前記乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項９５に記載の細胞。
  114. 前記乳酸デヒドロゲナーゼの活性が、前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節できる、請求項１１３に記載の細胞。
  115. 前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が、前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠失させることによって減弱させられる、請求項１１４に記載の細胞。
  116. 前記細胞の乳酸の生成量が、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して減少している、請求項１１３〜１１５のいずれか一項に記載の細胞。
  117. 前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、前記メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する、請求項１１３〜１１６のいずれか一項に記載の細胞。
  118. 前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することで、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する、請求項９５のいずれか一項に記載の細胞。
  119. 前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性が、前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることにより調節される、請求項１１８に記載の細胞。
  120. 前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、内在性遺伝子である、請求項１１９に記載の細胞。
  121. 前記ＮＡＤＰ依存性内在性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が、前記ＮＡＤＰ依存性内在性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータを、前記常時発現型合成プロモータと置き換えることにより増加する、請求項１１９に記載の細胞。
  122. 前記細胞が、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む、請求項１１８又は１１９に記載の細胞。
  123. 前記細胞のピルビン酸の生成量が、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して増加している、請求項１１８〜１２２のいずれか一項に記載の細胞。
  124. 前記ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることで、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現を増加させていない微生物と比較して、前記メバロン酸依存性生合成経路への炭素の取り込みが増加する、請求項１１８〜１２３のいずれか一項に記載の細胞。
  125. 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することで、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する、請求項９５のいずれか一項に記載の細胞。
  126. 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼから構成されるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する、１種以上の遺伝子の活性を増加させることで調節される、請求項１２５に記載の細胞。
  127. 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性が、前記内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節される、請求項１２５又は１２６に記載の細胞。
  128. 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の１つ以上の遺伝子が、内在性遺伝子である、請求項１２７に記載の細胞。
  129. 前記１種以上の内在性遺伝子プロモータを、１種以上の常時発現型合成プロモータで置き換えることにより、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する１種以上の内在性遺伝子の発現を増加させる、請求項１２８に記載の細胞。
  130. 前記細胞が、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群の１種以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む、請求項１２５又は１２６に記載の細胞。
  131. 前記内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体のリプレッサーの活性が、前記内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子を欠失させることにより減弱させられる、請求項１３０に記載の細胞。
  132. 前記細胞のアセチルＣｏ−Ａ生産量が、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節していない微生物と比較して増加している、請求項１２５〜１３１のいずれか一項に記載の細胞。
  133. 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性の調節が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現を調節していない微生物と比較してより多くの炭素が前記メバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることにより生じる、請求項１２５〜１３２のいずれか一項に記載の細胞。
  134. 前記炭素の取り込みが、前記ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）の活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項９５に記載の細胞。
  135. 前記ＰＧＬの活性が、前記内在性ＰＧＬ遺伝子の活性を減弱させることで調節できる、請求項１３４に記載の細胞。
  136. 前記ＰＧＬの活性が、前記内在性ＰＧＬ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって減少している、請求項１３５に記載の細胞。
  137. 前記内在性ＰＧＬの活性が、前記内在性ＰＧＬ遺伝子の欠失により減弱させられる、請求項１３６に記載の細胞。
  138. 前記炭素の取り込みが、前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項９５に記載の細胞。
  139. 前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節される、請求項１３８に記載の細胞。
  140. 前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることによって減少している、請求項１３９に記載の細胞。
  141. 前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を欠失させることで減弱させられる、請求項１４０に記載の細胞。
  142. 前記イソプレノイドが、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン（sequiterpenes）及びポリテルペンからなる群から選択される、請求項９３〜１４１のいずれか一項に記載の細胞。
  143. 前記イソプレノイドが、セスキテルペンである、請求項１４２に記載の細胞。
  144. 前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）及びバレンセンからなる群から選択される、請求項１４２に記載の細胞。
  145. イソプレノイドの生産方法であって、（ａ）イソプレン生産に好適な培養条件下で請求項１に記載の細胞を培養する工程と、（ｂ）前記イソプレノイドを生産する工程と、を含む、方法。
  146. （ｃ）前記イソプレンを回収する工程、を更に含む、請求項４９に記載の方法。
  147. （ｃ）前記メバロン酸を回収する工程、を更に含む、請求項９２に記載の方法。
  148. （ｃ）前記イソプレノイドを回収する工程、を更に含む、請求項１４５に記載の方法。
  149. 前記細胞が、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプチドをコードしている核酸を更に１種以上含む、請求項１に記載の細胞。
  150. 前記細胞が、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を更に含む、請求項９５に記載の細胞。
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