JP6301827B2 - メバロン酸、イソプレン及びイソプレノイドの生産量を増加させるための組み換え微生物 - Google Patents
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01034—Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (NADPH) (1.1.1.34)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01037—Malate dehydrogenase (1.1.1.37)
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
- C12Y102/01051—Pyruvate dehydrogenase (NADP+) (1.2.1.51)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/04—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with a disulfide as acceptor (1.2.4)
- C12Y102/04001—Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring) (1.2.4.1)
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01008—Phosphate acetyltransferase (2.3.1.8)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01016—Acetyl-CoA C-acyltransferase (2.3.1.16)
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
- C12Y203/03001—Citrate (Si)-synthase (2.3.3.1)
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
- C12Y203/0301—Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (2.3.3.10)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
- C12Y207/02001—Acetate kinase (2.7.2.1)
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- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01031—6-Phosphogluconolactonase (3.1.1.31)
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- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
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Description
本出願は、2011年4月29日出願の、米国特許仮出願番号第61/481,121号の優先権を主張し、その開示の全てが本明細書に参照として組み込まれる。
本開示は、組成物、並びに組み換え微生物におけるメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド及びイソプレノイド前駆体分子の生産量を増加させる方法、並びにこれを生産及び使用するための方法、に関する。
本発明の実施においては、特に断らないかぎりにおいて、当業者の技能の範囲内に含まれる従来の分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の技術を用いる。これらの手法は、次の文献:「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」第2版(Sambrook et al.、1989年);「オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)」(M.J.Gait,ed.,1984);「動物細胞の培養(Animal Cell Culture)」(R.I.Freshney,ed.、1987年);「酵素学的実験法(Methods in Enzymology)」(Academic Press,Inc.);「分子生物学標準プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」(F.M.Ausubel et al.,eds.、1987年、定期的に改定);「PCR:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR: The Polymerase Chain Reaction)」(Mullis et al.,eds.,1994年).Singleton et al.、「微生物学及び分子生物学辞典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)第2版」、J.Wiley & Sons(New York,N.Y.1994年)、及びMarch「有機化学反応、機序及び構造第4版(Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed.)」,John Wiley & Sons(New York,N.Y.1992)中に十分に説明されており、これらの文献は、本出願で使用される数多くの用語の一般的な指針を当業者に提供する。
用語「完全なメバロン酸(MVA)経路」又は「メバロン酸(MVA)経路全体」は、アセチルCo−Aをジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)及びイソペンテニルピロリン酸(IPP)へと変換し、酵素のアセトアセチルコエンザイムAシンターゼ(例えば、チオラーゼ)、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムAシンターゼ、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素、メバロン酸キナーゼ(MVK)、ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVD)、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IDI)により触媒される、細胞内代謝経路を指す。
メバロン酸依存性生合成経路(MVA経路)は、全ての高等真核生物及び特定種の細菌に存在する、重要な代謝経路である。メバロン酸経路は、タンパク質のプレニル化、細胞膜の維持、タンパク質の固定及びN−グリコシル化などの、多様な工程において使用される分子の生産に重要であり、並びにテルペン、テルペノイド、イソプレノイド、及びイソプレンの生合成時の主成分として機能するイソプレノイド前駆体分子のDMAPP及びIPPの主要な供給源を提供する。
クエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸とアセチルCoAを縮合させることによるクエン酸(トリカルボン酸(TCA)回路の代謝生成物)の生成を触媒する(Ner,S.et al.1983.Biochemistry 22:5243〜5249;Bhayana,V.and Duckworth,H.1984.Biochemistry 23:2900〜2905)(図5)。大腸菌(E. coli)では、gltAによりコードされたこの酵素は、二量体サブユニットからなる三量体様の挙動を示す。六量体の形成により、酵素はNADHによりアロステリックに制御されるようになる。この酵素は、これまでに広く研究されている(Wiegand,G.,and Remington,S.1986.Annual Rev.Biophysics Biophys.Chem.15:97〜117;Duckworth et al.1987.Biochem Soc Symp.54:83〜92;Stockell,D.et al.2003.J.Biol.Chem.278:35435〜43;Maurus,R.et al.2003.Biochemistry.42:5555〜5565)。NADHによるアロステリック阻害を回避するにあたって、これまでに、枯草菌(Bacillus subtilis)NADH感受性クエン酸シンターゼによる置き換え、又はこの酵素の添加が検討されている(Underwood et al.2002.Appl.Environ.Microbiol.68:1071〜1081;Sanchez et al.2005.Met.Eng.7:229〜239)。
ホスホトランスアセチラーゼ(pta)(Shimizu et al.1969.Biochim.Biophys.Acta 191:550〜558)は、アセチルCoAとアセチルリン酸(アセチル−P)の可逆性の変換を触媒するのに対し、酢酸キナーゼ(ackA)(Kakuda,H.et al.1994.J.Biochem.11:916〜922)は、アセチル−Pと酢酸の可逆性の変換を触媒する。これらの遺伝子は、大腸菌(E. coli)においてオペロンとして転写され得る。これらの遺伝子は共に、ATPの放出により酢酸の異化を触媒する。したがって、当業者は、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子(例えば、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子)及び/又は酢酸キナーゼ遺伝子(例えば、内在性酢酸キナーゼ遺伝子)の活性を減弱させて、利用可能なアセチルCo−Aを増加させることができる。減弱させる手法の一つとしては、ホスホトランスアセチラーゼ(pta)及び/又は酢酸キナーゼ(ackA)の欠失が挙げられる。この欠失は、クロラムフェニコールカセットにより片方又はいずれもの遺伝子を置き換え、その後カセットを除去することで導入される。酢酸は多様な理由により大腸菌(E. coli)により生成される(Wolfe,A.2005.Microb.Mol.Biol.Rev.69:12〜50)。理論に束縛されるものではないが、ackA−ptaはアセチルCoAを消費することから、これらの遺伝子を欠失させると、炭素は酢酸へと変換されなくなり、メバロン酸、イソプレン又はイソプレノイドの収率が増加することになる。
大腸菌(E. coli)では、D−乳酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA−図5)により、ピルビン酸から生成される(Bunch,P.et al.1997.Microbiol.143:187〜195)。乳酸の生成はNADHの酸化によりなされるため、乳酸は、酸素制限下で、かつ還元当量のすべてを収容できない場合に生成されることになる。したがって、乳酸の生成は、炭素消費の原因となり得る。そのため、メバロン酸生産(並びに必要に応じてイソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドの生産)への炭素の取り込みを向上させるため、当業者は、酵素活性を低下させるなどして乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することができる。
リンゴ酸酵素(大腸菌(E. coli)ではsfcA及びmaeB)は、次式に従いリンゴ酸のピルビン酸への変換を触媒する(NAD+又はNADP+を用いる)アナプレロティックな酵素である:
ピルビン酸のアセチルCoAへの脱炭酸を触媒するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、遺伝子aceE、aceF、及びlpdAによりコードされるタンパク質から構成される。これらの遺伝子の転写は、複数の制御因子により制御される。したがって、当業者は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を調節して、アセチルCoAを増加することができる。調節により、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性及び/又は発現(例えば、常時発現)を増加させることができる。このような調節は、異なる手法により、例えば、PL.6(aattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtg−ラムダプロモータ、GenBank NC_001416)などの強力な常時発現型プロモータをオペロンの前に配置することにより、あるいは常時発現型合成プロモータを1種以上用いることにより行うことができる。
本開示の酵素及び/又は酵素経路の何れかに関し、本開示の酵素及び/又は酵素経路の任意の組み合わせ(これらのうち2、3、4、5、又は6の組み合わせ)を調節する分子的操作は、明確に企図されることは理解される。組み合わせて詳細説明することを容易にする目的で、クエン酸シンターゼ(gltA)はAと表記し、ホスホトランスアセチラーゼ(ptaB)はBと表記し、酢酸キナーゼ(ackA)はCと表記し、乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)はDと表記し、リンゴ酸酵素(sfcA又はmaeB)はEと表記し、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(aceE、aceF及び/又はlpdA)はFと表記し、6−ホスホグルコノラクトナーゼ(ybhE)はGと表記し、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppl)はHと表記する。上記の通り、ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体のaceE、aceF、及び/又はlpdA酵素を単独で使用して、又は3種の酵素のうち2種を、又は3種の酵素のうち3種を使用して、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性を増加させることができる。
他の分子的操作を使用して、メバロン酸生産に指向する炭素取り込みを増加させることができる。このような方法のうちの1つは、メバロン酸経路に合流する経路に対する負の制御効果を減少させ、低下させるか、又は除去するものである。例えば、一部の場合では、遺伝子aceEF−lpdAはオペロンであり、pdhRの上流に遺伝子を4つ有する。pdhRは、このオペロンの転写に対する負の制御因子である。pdhRは、ピルビン酸の非存在下で標的プロモータに結合し、転写を抑制する。この制御因子は同様の手法でndh及びcyoABCDも制御する(Ogasawara,H.et al.2007.J.Bact.189:5534〜5541)。一態様では、pdhR制御因子を欠失させることにより、ピルビン酸の供給及びそれに伴うメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、及びイソプレノイドの生産を向上させることができる。
一部の微生物(限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及びE.フェカリス(E. faecalis)など)では、mvaE遺伝子は、チオラーゼ活性及びHMG−CoA還元酵素活性を両方保有しているポリペプチドをコードしている。実際に、mvaE遺伝子産物は、真性細菌で見られる、IPP生合成に関係する最初の二機能性酵素となるものであり、HMG−CoA還元酵素の第一例は、天然において他のタンパク質と融合していた(Hedl,et al.,J Bacteriol.2002 April;184(8):2116〜2122)。それに対しmvaS遺伝子は、HMG−CoAシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。異なる細菌種、E.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaS遺伝子を、予め大腸菌(E. coli)株に組み込み、メバロン酸を生産させた(米国特許第2005/0287655(A1)号を参照されたい。この開示は参照により本明細書に組み込まれる;Tabata,K.and Hashimoto,S.−I.Biotechnology Letters 26:1487〜1491,2004)。
mvaE遺伝子は、チオラーゼ活性及びHMG−CoA還元酵素活性を両方保有しているポリペプチドをコードする。mvaE遺伝子によりコードされているポリペプチドのチオラーゼ活性は、アセチルCo−AをアセトアセチルCoAに変換するのに対し、HMG−CoA還元酵素ポリペプチドの酵素活性は、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoAをメバロン酸に変換する。mvaEポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにmvaEポリペプチドの活性を少なくとも1つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
mvaS遺伝子は、HMG−CoAシンターゼ活性を保有するポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、アセトアセチルCoAを、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoA(HMG−CoA)を変換させることができる。mvaSポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにmvaSポリペプチドの活性を少なくとも1つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
一態様では、本明細書に記載の任意の細胞(細菌細胞など)には、アセトアセチルCoAシンターゼのポリペプチドをコードしている1つ以上の異種核酸を含有させることができる。アセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子(nphT7としても知られる)は、マロニルCoA及びアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有し、かつ2分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性は最小限である(例えば、非活性である)酵素をコードしている遺伝子である。例えば、Okamura et al.,PNAS Vol 107,No.25,pp.11265〜11270(2010)を参照されたい。この文献中のnphT7に関する教示は、本開示に明確に組み込まれる。放線菌のストレプトマイセス(Streptomyces)属のCL190株に由来するアセトアセチルCoAシンターゼの遺伝子は、日本国特許公開第2008−61506(A)号及び米国特許出願公開第2010/0285549号に記載される。これらの各開示は、参照により本明細書に組み込まれる。アセトアセチルCoAシンターゼも、アセチルCoA:マロニルCoAアシル基転移酵素として参照され得る。使用することのできる代表的なアセトアセチルCoAシンターゼ(又はアセチルCoA:マロニルCoAアシル基転移酵素)としては、Genbank AB540131.1が挙げられる。
当業者であれば、具体的な宿主株における遺伝子発現を最適化する特定の配列を含有するよう、発現ベクターが設計されることを認識するであろう。このような最適化配列としては、限定するものではないが、複製起点、プロモータ、及びエンハンサーが挙げられる。本明細書で参照するベクター及び配列は例示目的で記載され、本発明の範囲を狭めることを意味するものではない。
本明細書で使用するとき、用語「最少培地(minimal medium又はminimal media)」は、概して細胞増殖に必要とされる最低限の栄養素を含有している増殖培地を指すが、常に1種以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10種以上のアミノ酸)が存在していないわけではない。最少培地は、典型的には、(1)微生物(例えば、細菌細胞)の生育用の炭素源、(2)微生物(例えば、細菌)種及び生育間で変更させ得る各種塩類、及び(3)水、を含有する。炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、他のバイオマスのより複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選択するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の増殖を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選択するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
本発明の組み換え細胞を維持し及び生育させるのに好適な材料及び方法は、以下、例えば、実施例の節に記載される。細胞(例えば、細菌)培養物の維持及び生育に好適な他の材料及び方法は当該技術分野において周知である。例示的な手法としては、国際公開第2009/076676号、米国特許出願第12/335,071号(同第2009/0203102号)、国際公開第2010/003007号、米国特許出願第2010/0048964号、国際公開第2009/132220号、米国特許出願第2010/0003716号、Gerhardt et al.,編の一般細菌学に関係する手法についてのマニュアル)、American Society for Microbiology,Washington,D.C.(1994)又はBrock in Biotechnology:テキスト「工業微生物学(Industrial Microbiology)」第2版(1989)Sinauer Associates,Inc.(Sunderland,MA)が挙げられる。一部の態様では、細胞は、宿主細胞に挿入する核酸にコードされた、イソプレンシンターゼ、DXP経路(例えば、DXS)、IDI、MVA経路(例えば、限定するものではないが、mvaE及び/又はmvaS)又はPGL、のポリペプチドのうちの、1種以上を発現させる条件下で、培地中で培養される。
本明細書に記載の組み換え微生物(例えば、組み換え細菌細胞)は、明細書に記載の各種酵素経路に対し何ら操作を施していない同様の細胞を上回る量及び/又は濃度でメバロン酸を生産する能力を有する。メバロン酸の生産には、メバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう本明細書に記載の各種経路を調節する遺伝子操作を施した組み換え微生物(例えば、細菌細胞)を使用することができる。遺伝子操作を施したこれらの細胞には、MVA経路上流のポリペプチドをコードしている異種核酸を1種以上含有させることもできる。一部の態様では、細胞には、mvaE及びmvaSポリペプチド(限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaSポリペプチドなど)をコードしている1つ以上の異種核酸を含有させることができる。一態様では、本明細書に記載の組み換え細胞(細菌細胞など)は、メバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作を施していない同様の細胞を上回る濃度でメバロン酸を生産する能力を有する。他の態様では、本明細書に記載の組み換え細胞は、mvaE及びmvaSポリペプチド(限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaSポリペプチドなど)をコードしている異種核酸の1つ以上のコピーを含まずかつより多量の炭素がメバロン酸の生産に取り込まれるよう遺伝子操作を受けていない同様の細胞を上回る濃度でメバロン酸を生産する能力を有する。一態様では、本明細書で開示される任意の細胞は、最少培地で培養することができる。一部の場合では、MVA経路上流のポリペプチド(例えば、限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaSポリペプチドなどの、mvaE及び/又はmvaSポリペプチド)をコードしている異種核酸の1つ以上のコピーは、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。細胞(細菌細胞など)は約85mg/L/hr/OD超のメバロン酸を生産することができる。あるいは、細胞(細菌細胞など)は、約30mg/L/hr/OD、40mg/L/hr/OD、50mg/L/hr/OD、60mg/L/hr/OD、70mg/L/hr/OD、80mg/L/hr/OD、90mg/L/hr/OD、100mg/L/hr/OD、110mg/L/hr/OD、120mg/L/hr/OD、130mg/L/hr/OD、140mg/L/hr/OD、150mg/L/hr/OD、160mg/L/hr/OD、170mg/L/hr/OD、180mg/L/hr/OD、190mg/L/hr/OD又は200 mg/L/hr/OD超で、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値で、メバロン酸を生産し得る。
本明細書では、メバロン酸の生産方法も提供する。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、(a)本明細書に記載のとおりにメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された組み換え細胞(上記の細菌細胞などの任意の細胞)、又はメバロン酸を生産できるそれらの子孫細胞を含む、組成物を培養する工程並びに(b)メバロン酸を生産する工程、を包含する。一部の態様では、メバロン酸を生産させる方法は、メバロン酸の生産に好適な条件下で、本明細書に記載の任意の組み換え細胞を培養する工程、並びに組み換え細胞にメバロン酸を生産させる工程、を含む。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
イソプレン(2−メチル−1,3−ブタジエン)は、多様な用途で使用される重要な有機化合物である。例えば、イソプレンは、合成ゴムの製造時など、数多くの化学組成物及びポリマーの合成時に、中間体又は出発物質として使用される。イソプレンはまた、多くの植物及び動物により天然に合成される重要な生体物質でもある。
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法の任意のものに記載の細胞は、メバロン酸(MVA)経路下流のポリペプチドをコードしている核酸を1つ以上更に含む。一部の態様では、MVA経路下流のポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、MVA経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。一部の態様では、MVA経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。一部の態様では、MVA経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性MVA経路下流のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。一部の態様では、MVA経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載の細胞(本明細書に記載されるとおりに炭素の取り込みを増加させるよう遺伝子操作された宿主細胞など)は、イソプレンシンターゼポリペプチド又はイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸を更に含む。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、常時発現型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、誘導型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、高発現型プロモータに調節可能なように連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、経路の内在性イソプレンシンターゼポリペプチドを過剰発現するよう遺伝子操作する。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、低発現型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属(Pueraria)又はハコヤナギ属(Populus)、又はウラジロハコヤナギ(Populus alba)xヤマナラシ(Populus tremula)などの交雑種由来のポリペプチドである。
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載の細胞(本明細書に記載されるとおりに炭素の取り込みを増加させるよう遺伝子操作された宿主細胞など)は、DXSポリペプチド又はDXP経路の他のポリペプチドをコードしている1つ以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、細胞は更に、DXSポリペプチド又は他のDXP経路ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、大腸菌(E. coli)細胞は更に、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチド又は他のDXP経路ポリペプチドをコードしている核酸を1つ以上含む。一部の態様では、1つの核酸は、イソプレンシンターゼ、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチド又は他のDXP経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、1つのプラスミドは、イソプレンシンターゼ、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチド又は他のDXP経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、マルチコピープラスミド(multiple plasmids)は、イソプレンシンターゼ、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチド又は他のDXP経路ポリペプチドをコードしている。
イソプレンシンターゼ、IDI、DXP経路及び/又はMVA経路下流の核酸(及びそれらにコードされるポリペプチド)は、イソプレンシンターゼ、IDI、DXP経路及び/又はMVA経路下流の核酸を天然に含有する任意の生物から得ることができる。イソプレンは、バクテリア、酵母、植物及び動物などの様々な生物により天然に生成される。一部の生物は、イソプレンの生産に関係するMVA経路を含有する。イソプレンシンターゼの核酸は、例えば、イソプレンシンターゼを含有する任意の生物から得ることができる。したがってMVA経路の核酸は、例えば、MVA経路を含有する任意の生物から得ることができる。IDI及びDXP経路の核酸は、例えば、IDI及びDXP経路を含有する任意の生物から得ることができる。
本発明の一部の態様では、本開示の組成物又は方法のいずれかに記載の組み換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸、又はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドを更に含む。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性の核酸を1つ以上(例えば、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性の核酸の2、3、又は4つ以上のコピー)を使用する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比べ、内在性のホスホケトラーゼポリペプチドが過剰発現するよう遺伝子操作される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。
エントナー・ドゥドロフ(ED)経路は、エムデン・マイヤーホフ・パルナス(EMP−解糖)経路とは異なる経路である。大腸菌(E. coli)などの一部の生物がED経路及びEMP経路の両方を内包するのに対し、その他の生物はいずれか1つの経路のみを有する。枯草菌(Bacillus subtilis)は、EMP経路のみを有するのに対し、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)はED経路のみを有する(Peekhaus and Conway.1998.J.Bact.180:3495〜3502;Stulke and Hillen.2000.Annu.Rev.Microbiol.54,849〜880;Dawes et al.1966.Biochem.J.98:795〜803)。
大腸菌(E. coli)は、ペントースリン酸経路を使用してヘキソース及びペントースを分解し、各種代謝経路に関係する中間体を細胞に提供する。この経路は、NADPHの主要な生成経路でもある。ペントースリン酸経路は、酸化経路(グルコース6−リン酸1−デヒドロゲナーゼ(zwf)、6−ホスホグルコノラクトナーゼ(pgl)又は6−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ(gnd)などの酵素による)及び非酸化経路(トランスケトラーゼ(tktA)、トランスアルドラーゼ(talA又はtalB)、リブロース−5−リン酸−エピメラーゼ及び(又は)リボース−5−リン酸エピメラーゼなどの酵素による)から構成される(Sprenger.1995.Arch.Microbiol.164:324〜330)。
ホスホフルクトキナーゼは、解糖系でフルクトース6−リン酸のリン酸化を触媒する重要な酵素である。大腸菌(E. coli)はpfkA及びpfkBによりコードされる2種のイソ酵素を有する。細胞におけるホスホフルクトキナーゼ活性の大部分はpfkAによるものである(Kotlarz et al.1975,Biochim.Biophys.Acta,381:257〜268)。
本明細書に記載の、イソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された組み換え細胞は、イソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない同様の細胞と比較して高濃度のイソプレンを生産することができる。一態様では、本明細書に記載の組み換え細胞(細菌細胞など)(例えば、本明細書に記載のとおりイソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された宿主細胞など)は、最小培地で培養した場合に、MVA経路上流のポリペプチド(例えば、mvaE及び/又はmvaSポリペプチド、限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaSポリペプチドなど)をコードしている異種核酸の1つ以上のコピー、MVA経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸の1つ以上のコピー並びにイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている1つ以上の異種核酸を含まない同様の細胞よりも高濃度でイソプレンを生産する能力を有する。特定の態様では、これらの細胞は、MVA経路上流のポリペプチド(例えば、限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaSポリペプチドなどの、mvaE及び/又はmvaSポリペプチド)をコードしている異種核酸の1つ以上のコピー、MVA経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸の1つ以上のコピー並びに異種核酸でありイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている1つ以上の異種核酸を含む。一態様では、1つ以上の異種核酸が宿主細胞の染色体に組み込まれる。細胞は、イソプレン生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていないイソプレン生産細胞と比較して少なくとも5%超多量にイソプレンを生産することができる。他の態様では、細胞(細菌細胞など)は、mvaE及びmvaSポリペプチド(限定するものではないがL.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaSポリペプチドなど)を含まないイソプレン生産細胞(細菌細胞など)と比較して少なくとも5%超多量にイソプレンを生産することができる。あるいは、細胞(細菌細胞など)は、約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%又は15%超、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値だけ多量にイソプレンを生産することができる。
本明細書では、本明細書で提供されるとおりにイソプレンの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された任意の組み換え微生物を培養する工程、を含む、イソプレンの生産方法も提供される。一態様では、イソプレンは、本明細書に記載の任意の酵素経路(enzymatic pathways)に対する調節を含み、かつMVA経路上流のポリペプチドをコードしている1つ以上の異種核酸(例えば、限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaSポリペプチドなどの、mvaE及び/又はmvaSポリペプチド)、MVA経路下流のポリペプチド、並びにイソプレンシンターゼポリペプチドを含む、組み換え細胞(細菌細胞など)を培養することにより生産することができる。他の態様では、イソプレンは、MVA経路上流のポリペプチドをコードしている1つ以上の異種核酸(例えば、限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaSポリペプチドなどの、mvaE及び/又はmvaSポリペプチド)、MVA経路下流のポリペプチド、並びにイソプレンシンターゼポリペプチドを含む組み換え細胞(細菌細胞など)を培養することにより生産することができる。イソプレンは、本開示の任意の方法に従い、本明細書に記載の任意の細胞から生産することができる。六炭糖(グルコースなど)などの炭水化物からイソプレンを生産する目的に際し、任意の細胞を使用することができる。
イソプレノイドは、多くの生物において、MVA経路の最終産物であるイソプレノイド前駆体分子の合成によりとができる。上記のように、イソプレノイドは、重要な部類の化合物として存在し、例えば、食品及び飼料用サプリメント、風味及び臭気化合物、並びに抗癌、抗マラリア、抗真菌及び抗菌化合物を含む。
メバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作した本発明の細胞(細菌細胞など)は、イソプレノイド並びにイソプレノイド前駆体分子DMAPP及びIPPの生産量を増加させることができる。イソプレノイドの例としては、限定するものではないが、ヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、及びより高分子量のポリテルペノイドが挙げられる。一部の態様では、ヘミテルペノイドは、プレノール(すなわち、3−メチル−2−ブテン−1−オール)、イソプレノール(すなわち、3−メチル−3−ブテン−1−オール)、2−メチル−3−ブテン−2−オール、又はイソ吉草酸である。一部の態様では、モノテルペノイドは、限定するものではないが、ゲラニルピロリン酸、オイカリプトール、リモネン、又はピネンであってよい。一部の態様では、セスキテルペノイドはファルネシルピロリン酸、アルテミシニン、又はビサボロールである。一部の態様では、ジテルペノイドは、限定するものではないが、ゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、又はアフィジコリンであってよい。一部の態様では、トリテルペノイドは、スクアレン又はラノステロールであってよい。イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン(α-famesene)、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン(terpindene)及びバレンセンからなる群から選択することもできる。
本発明の一部の態様では、本明細書において任意の組成物又は方法に記載されるように、イソプレノイドの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作した細胞は、更に、上記の通りにメバロン酸(MVA)経路下流のポリペプチドを1つ以上コードしている核酸、並びにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸を更に含む。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドであってよい。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、常時発現型プロモータに調節可能なように連結させてよく、あるいは同様に、調節可能なように誘導型プロモータに連結させてもよい。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモータと連結させてもよい。あるいは、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性の核酸は、調節可能なように低発現型プロモータと連結させてもよい。詳細には、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドを過剰発現するよう遺伝子操作することができる。
本明細書に記載の組み換え微生物(例えば、組み換え細菌細胞)は、本明細書に記載の各種酵素経路に対し何ら操作を施していない同様の細胞と比較して、多量に及び/又は高濃度でイソプレノイド前駆体及び/又はイソプレノイドを生産する能力を有する。加えて、本明細書に記載の細胞は、イソプレノイド生成に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されておらずかつMVA経路上流のポリペプチドをコードしている異種核酸の1つ以上のコピー、MVA経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸の1つ以上のコピー及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている1つ以上の異種核酸を含まない同様の細胞と比較して、多量に及び/又は高濃度でイソプレノイド前駆体及び/又はイソプレノイドを生産する能力を有する。一部の態様では、本明細書に記載の細胞は、最小培地で培養した場合に、mvaE及びmvaSポリペプチドをコードしている異種核酸(限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaSポリペプチドなど)の1つ以上のコピー、MVA経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸の1つ以上のコピー及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている1つ以上の異種核酸を含まない同様の細胞と比較して、多量に及び/又は高濃度でイソプレノイド前駆体及び/又はイソプレノイドを生産する能力を有する。一部の場合では、MVA経路上流のポリペプチドをコードしている異種核酸の1つ以上のコピー(例えば、限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaSポリペプチドなどの、mvaE及び/又はmvaSポリペプチド)、MVA経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸の1つ以上のコピー及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている1つ以上の異種核酸は、宿主細胞の染色体に組み込まれている異種核酸である。細胞は、イソプレノイド及び/又はイソプレノイド前駆体を生産する、イソプレノイドの生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞(細菌細胞など)と比較して、少なくとも5%を超える量のイソプレノイド前駆体及び/又はイソプレノイドを生産することができる。他の態様では、細胞(細菌細胞など)は、イソプレノイド及び/又はイソプレノイド前駆体を生産する、mvaE及びmvaSポリペプチド(限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaSポリペプチドなど)を含まない細胞(細菌細胞など)と比較して、少なくとも5%を超える量のイソプレノイド前駆体及び/又はイソプレノイドを生産することができる。あるいは、細胞(細菌細胞など)約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%又は15%超、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値だけイソプレノイド前駆体及び/又はイソプレノイドを生産することができる。
本明細書に記載の各種酵素経路に対し遺伝子操作を行った組み換え微生物(例えば、組み換え細菌細胞)を培養する工程を含み、及び/又は限定するものではないが、mvaE及びmvaSポリペプチド(限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaSポリペプチドなど)などのMVA経路上流のポリペプチド、MVA経路下流のポリペプチド及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている1つ以上の異種核酸を含む、イソプレノイド前駆体分子及び/又はイソプレノイドの生産方法も、本明細書において提供される。イソプレノイド前駆体分子及び/又はイソプレノイドは、本明細書に記載の任意の細胞から、及び本開示の任意の方法に従って、生産することができる。グルコースなどの六炭糖といった炭水化物から、イソプレノイド前駆体分子及び/又はイソプレノイドを生産する目的で、任意の細胞を使用することができる。
本明細書に記載の任意の組成物及び方法には好適なベクターを使用することができる。例えば、好適なベクターを使用して、嫌気性菌での、MVA経路上流のポリペプチド(例えば、mvaEポリペプチド及び/又はmvaSポリペプチド限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaSポリペプチドなど)、イソプレンシンターゼ、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ及び/又は1つ以上のMVA経路ポリペプチドをコードしている遺伝子の1つ以上のコピーの発現を、最適化することができる。一部の態様では、ベクターには選択マーカーを含有させる。選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗生物質耐性核酸(例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、フェロマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン又はクロラムフェニコール)、及び/又はホスト細胞に栄養的な利点などの代謝的な利点を与える核酸が挙げられる。一部の態様では、選択マーカーは用いずに、MVA経路上流のポリペプチド(例えば、限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis))由来のmvaE及びmvaSポリペプチドなどの、mvaEポリペプチド、及び/又はmvaSポリペプチド、イソプレンシンターゼ、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ及び/又は1つ以上のMVA経路下流のポリペプチドの核酸の1つ以上のコピーを宿主細胞のゲノムに組み込む。
MVA経路上流のポリペプチド(例えば、限定するものではないが、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE及びmvaS核酸などの、mvaE及び/又はmvaS核酸)、イソプレンシンターゼ及び/又はMVA経路下流のポリペプチドのうちの、1つ以上のコピーをコードしている核酸を、適切な手法により微生物に挿入することができる。更に、イソプレンシンターゼ、IDI、DXP経路及び/又はポリプレニルピロリン酸シンターゼの核酸、又はこれらを含むベクターは、形質転換、電気穿孔法、核マイクロインジェクション、形質導入、形質移入(例えばリポフェクション介在型若しくはDEAE−デキストラン介在型トランスフェクション、又は組換えファージウイルスを使用した形質移入)、リン酸カルシウムDNA沈殿物とのインキュベーション、DNAコーティングした微粒子を用いる高速遺伝子銃照射、及びプロトプラスト融合などの、宿主細胞内にDNAコンストラクト又はベクターを導入するための標準的な技術を使用して宿主細胞(例えば本明細書において述べられるような植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は細菌細胞)内に挿入することができる。一般的な形質転換法は、当該技術分野で既知である(例えば、分子生物学領域の現行のプロトコル(F.M.Ausubel et al.(eds.)Chapter 9,1987;Sambrook et al.,「分子クローニング(Molecular Cloning)」:「実験室マニュアル(A Laboratory Manual)第2版」,Cold Spring Harbor,1989;及びCampbell et al.,Curr.Genet.16:53〜56,1989を参照されたい)。導入された核酸は、染色体DNAに組み込むことができ、又は染色体外の複製配列として維持することができる。形質転換体は、当該技術分野において既知の任意の方法により選択することができる。形質転換体を選択するのに好適な手法としては、国際公開第2009/076676号、米国特許出願第12/335,071号(米国特許公開第2009/0203102号)、国際公開第2010/003007号、米国特許公開第2010/0048964号、国際公開第2009/132220号及び米国特許公開第2010/0003716号が挙げられる。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、生産された化合物を回収する工程を包含する。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、イソプレンを回収する工程を包含する。一部の態様では、イソプレンは、吸着ストリッピング法(例えば、米国特許第2011/0178261(A1)号を参照されたい。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる)により回収される。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、イソプレノイドを回収する工程を包含する。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、テルペノイド又はカロチノイドを回収する工程を含む。
BL21(Novagen)中でクエン酸シンターゼ遺伝子(gltA)の前に位置するプロモータを、常時発現型低発現プロモータ、すなわちGI1.2(米国特許第7,371,558号)により置き換えた。gltAに関して報告されている2種の野生型プロモータ(Wilde,R及びJ.Guest.1986.J.Gen.Microbiol.132:3239〜3251)及び合成プロモータを、遠位プロモータの−35領域の直後に挿入した。プライマーUpgltACm−F(5’−TATTTAATTTTTAATCATCTAATTTGACAATCATTCAACAAAGTTGTTACAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG−3’)及びDngltA1.xgiCm−R(5’−TCAACAGCTGTATCCCCGTTGAGGGTGAGTTTTGCTTTTGTATCAGCCATATATTCCACCAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATHGTCAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCG−3’)、並びにテンプレートとしてGene Bridges(Heidelberg,Germany)のプラスミドFRT−gb2−Cm−FRTを使用し、PCR産物を得た。PCR産物を精製し、λredを用いる組み換えに製造元(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)による記載の通りに使用した。更なる評価にあたって、複数種のコロニーを選択した。プロモータ領域は、プライマーgltAPromSeqF:5’−GGCAGTATAGGCTGTTCACAAAATC−3’及びgltApromSeqR:5’−CTTGACCCAGCGTGCCTTTCAGC−3’と、テンプレートとしてコロニーから抽出したDNA(コロニーを30uLのH2Oに再懸濁し、95℃で4分加熱し、スピンダウンしたもの。50uLのPCR反応には、この溶液のうち2uLをテンプレートとして使用する)とを使用しPCR増幅させた。得られたPCR産物の配列決定結果を観察した後、3種の異なるプロモータGI1.2、GI1.5及びGI1.6(米国特許第7,371,558号)を保有しているコロニーを、更なる使用のため保存した(CMP141、CMP142及びCMP143;表3)。
クロラムフェニコールマーカーにより破壊させたackA−pta遺伝子を含有しているDNA断片を、クロラムフェニコールマーカーを含有しているTriple Triple株(米国特許第7,745,184(B2)号)をテンプレートとして使用し、及びプライマーackACF(5’−GTGCAAATTCACAACTCAGCGG)及びptaCR(CACCAACGTATCGGGCAT TGCC−3’)を使用して、PCRにより増幅させた。得られたPCR産物を、製造元(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)の推奨する通りに組み換え反応に使用し、CMP258株のackA−pta座に組み入れた(米国特許出願第12/978,324号を参照されたい)。LB+5ug/mlのクロラムフェニコールにてコロニーを選択した。コロニーを1つ選択し、MD491と名づけた。MD491のP1可溶化液を調製し、CMP451株の形質導入に使用した。LB+5ug/mlのクロラムフェニコールにてコロニーを選択した。コロニーを1つ選択し、CMP604と名づけた。
テンプレートとしてKeio collection(Baba et al.2006.Mol.Syst.Biol.2:2006.0008)のJW 1375株を使用し、プライマーはldhAseqR(5’−GGCTTACCGTTTACGCTTTCCAGC−3’)及びldhAseqF2(5’−CTAATGCAATACGTGTCCCGAGC−3’)と、を使用し、カナマイシンマーカーにより破壊されているldhA遺伝子を含有しているDNA断片をPCRにより増幅させた。得られたPCR産物を、製造元(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)の推奨する通りに組み換え反応に使用し、MD09−313株のldhA座に組み入れた。LB+20ug/mlのカナマイシンにてコロニーを選択した。コロニーを1つ選択し、CMP374と名づけた。CMP374のP1可溶化液を調製し、CMP604株の形質導入に使用した。LB+20ug/mlのカナマイシンにてコロニーを選択した。コロニーを1つ選択し、CMP620と名づけた。株に電気穿孔法によりpCP20を導入して、クロラムフェニコール及びカナマイシンマーカーを同時に除去し(Datsenko及びWanner.2000.PNAS 97:6640〜5)、30℃下でLB+50ug/mlのカルベニシリンで2つのコロニーを選択し、次に、これらのコロニーを、42℃下でLBプレートに再画線した。これらのプレートからCmS及びKanSコロニーを選択し、CMP635と名づけた。
λ挿入部位attBの上流及び下流に対するDNA相同体と隣接しているクロラムフェニコールマーカーを含有しているDNA断片を、プラスミドpKD3(Datsenko & Wanner,2000,PNAS 97:6640〜5)をテンプレートとして使用し、及びプライマーCMP171(5’−AAAATTTTCATTCTGTGACAGAGAAAAAGTAGCCGAAGATGACGGTTTGTCACATGGAGTTGGCAGGATGTTTGATTACATGGGAATTAGCCATGGTCC−3’)及びCMP172(5’−GACCAGCCGCGTAACCTGGCAAAATCGGTTACGGTTGAGTAATAAATGGATGCCCTGCGTAAGCGGGGCATTTTTCTTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG−3’)を使用して、PCRにより増幅させた。得られたPCR産物を、製造元(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)の推奨する通りにBL21(Novagen)における組み換え反応に使用し、λ挿入部位attBに組み入れた。これにより生成されたCMP646株を、LB+5ug/mlのクロラムフェニコールにて選択した。CMP646のP1可溶化液を調製し、CMP635株に対する形質導入反応に使用し、この株の染色体からメバロン酸経路下流(メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ)を除去した。形質導入反応物をLB+クロラムフェニコール5ug/mlに播種し、1つのコロニーを選択しCMP676と名づけた。
電気穿孔法により、プラスミドpCHL276(実施例6(iii)を参照されたい)をCMP676に導入する。コロニーをLB+50ug/mLのスペクチノマイシンにて選択した。1つのコロニーを採取し、CMP680と命名した。
50μg/mLのスペクチノマイシン(Novagen)を添加した2mLのLBブロスを入れた振盪チューブに、上記の株の一晩培養物を接種した。次に、培養物を、34℃下250rpmで14時間インキュベートした。次に、1%グルコース、最終濃度0.1%の酵母エキス及び200μMのIPTGを添加した2mLのTM3培地を入れた5mLの48ウェルプレート(Axygen Scientific)中で、最終的なODが0.2となるまで培養物を希釈した。プレートを、Breath Easier membrane(Diversified Biotech)でシールし、Shel Lab振とう/恒温器で、34℃にて、600rpmで24時間インキュベートした。各培養物1mLを3,000×gで5分遠心分離した。250μlの上清に、19μLの20%硫酸を添加し、氷上で5分間インキュベートした。次に、混合物を3000×gで5分遠心分離し、HPLC解析のため上清を回収した。200μlの上清を、HPLCに適した96ウェル円錐底ポリプロピレンプレート(Nunc)に移した。メバロン酸(Sigma)の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定した。製造元(Pointe Scientific,Inc.)の指定に従ってグルコースオキシダーゼアッセイを実施し、グルコース濃度を測定した。
50℃でインキュベートし、BioRad−マイクロガードCarbo−H詰め替えカートリッジ30mm×4.6mm(カタログ番号125−0129)を取り付けた300mm×7.8mm BioRad−Aminex HPX−87Hイオン排除カラム(カタログ番号125−0140)を使用し、屈折率検出器を系に包含させたAgilent 1100シリーズのHPLC系でHPLC解析を実施した。移動相に0.01N硫酸を使用し、流速0.6ml/minで試料のHPLC解析を実施した。屈折率検出器によりメバロン酸を検出した。
(i)遺伝子の同定及び選択
E.フェカリス(E. faecalis)mvaE遺伝子産物をクエリーとして使用する一次配列相同性検索を、NCBIウェブサイトに存在するBLASTpプログラムにより実施した(Stephen F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller及びDavid J.Lipman(1997)、「ギャップ考慮型ブラスト及びPSI−BLAST:新規タンパク質データベース検索プログラムの作成(Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs)」、Nucleic Acids Res.25:3389〜3402)。対象とする配列は検索結果から選択した。
エンテロコッカス・カセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)EC10由来のmvaE及びmvaSのコード配列を大腸菌(Escherichia coli)(GeneOracle)での発現のため最適化させ、発現ベクターMCM82にサブクローニングし(米国特許出願公開番号第2010/0196977号、[1023]段落)、pDW83を生成した。具体的には、制限酵素BglII及びPmeI(Roche)を使用し、一般的な分子生物学的手法により、クローニングベクターGcD126(GeneOracle)から、mvaESオペロンを包含しているカセットを切り出した。次にこの断片を、酵素BamHI及びPmeI(Roche)を用い予め制限酵素により消化しておいたMCM82に連結し(Roche、ラピッド・ライゲーション)、続いてアガロースゲルにより分離し(Invitrogen、E−ゲル)、一般的な分子生物学的手法により、mvaESをコードしている発現カセットをエンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)から除去した。製造元の推奨するプロトコルに従って、ライゲーション混合物によりケミカルコンピテントセルTop10(Invitrogen)を形質転換させた。スペクチノマイシン耐性陽性形質転換体を、液体LB培地で生育させ、プラスミドを精製し(Qiagen Miniprep)、プライマーEc Seq 1F〜4R(表6)を使用して配列決定(Quintara Biosciences)を行い、確認した。
MCM82プラスミドのpCL_pTrc−Upper(E.フェカリス(E.faecalis))から余分なRBSを除去するべくプライマー(CL483F:5’−AGGAGGAATAAACCATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGCATTAC−3’;CL484R:5’−ACTACTGTTTTCATGGTTTATTCCTCCTTATTTAATCGATAC−3’)を設計した。PCR反応液の組成は、テンプレートDNAのMCM82(100ng)、50uMの各順方向及びリバースプライマー、1ulの10mMのdNTP(Roche)、5ulの10XのPfuII反応緩衝液(Agilent)、1ulのPfu II融合酵素(Agilent)及び40ulの水から構成された。Bio−Radサーマルサイクラーにより、95℃で50秒、60℃で50秒及び68℃で9分、更に68℃で10分の処理を行う温度プロファイルで、18サイクルを実施した。PCR反応の実施後にDpnI(1ul)を添加し、37℃で2時間インキュベートしてテンプレートDNAを除去した。更に1ulのDpnIを加え、37℃で一晩インキュベートした。2μLの反応液によりTOP10 cells(Invitrogen)を形質転換させ、LB+50μg/mLスペクチノマイシンに播種した。配列決定により適切なクローンであることが確認された。
pDW83プラスミドのpCL_pTrc−Upper(E.カセリフラブス(E. casseliflavus))から余分なRBSを除去するべくプライマー(CL485F:5’−AGGAGGAATAAACCATGGAAGAAGTTGTCATCATTGACGCAC−3’;CL486R:5’−ACTTCTTCCATGGTTTATTCCTCCTTATTTAATCG−3’)を設計した。PCR反応液の組成は、テンプレートDNAのpDW83(100ng))、50uMの各順方向(CL483F)及びリバースプライマー(CL484R)、1ulの10mMのdNTPs(Roche)、5ulの10xPfu II反応緩衝液(Agilent)、1ulのPfu II融合酵素(Agilent)及び40ulの水から構成された。Bio−Radサーマルサイクラーにより、95℃で50秒、60℃で50秒及び68℃で9分、更に68℃で10分の処理を行う温度プロファイルで、18サイクルを実施した。PCR反応後にDpnI(1ul)を添加し、37℃で2時間インキュベートしてテンプレートDNAを除去した。更に1ulのDpnIを添加し、37℃で一晩インキュベートした。2μLの反応液によりTOP10 cell(Invitrogen)及びLA/spec50を形質転換した。配列決定により適切なクローンであることが確認された。
宿主CMP676を対数増殖期の中期まで37℃にてLBで生育させ、電気穿孔に備え、培養物の1/2当量の氷冷ddH2Oにより3回洗浄し、培養物の1/10当量の氷冷ddH2Oに再懸濁した。100uLの細胞懸濁液と1uLのプラスミドDNAを組み合わせ、2mmの電気穿孔法キュベットに移し、25uFD、200ohms、2.5kVで電気穿孔を行い、直ちに500uLのLBによりクエンチした。37℃で1時間振盪して細胞を回復させ、次に、50ug/mLのスペクチノマイシンを添加したLBプレートにより、37℃で一晩形質転換体を選択した。37℃下で、LB+50ug/mLのスペクチノマイシンにより、OD600がおよそ1になるまで単一のコロニーを生育させた。500uLのブロスに1mLの50%グリセロールを混合し、ドライアイス上で凍結させた。凍結させた保存液を−80℃で保管した。
(i)材料
培地組成(発酵培地1L当たり):
リン酸カリウム(K2HPO4)(7.5g)、硫酸マグネシウム(MgSO4 *7H2O)(2g)、クエン酸一水和物(C6H8O7 *H2O)(2g)、クエン酸鉄アンモニウム(NH4FeC6H5O7)(0.34g)、酵母エキス(biospringer)(0.5g)、1000X改変微量金属溶液(1.5ml)、硫酸50% w/v(2.26ml)、foamblast 882(Emerald Performance Materials)(0.83ml)、微量塩溶液(3.36ml)。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した(123℃で20分)。試験温度に冷却した後、水酸化アンモニウム(28%)によりpHを7.0に調節し、用量に調整する。滅菌後に、供給溶液(Feed solution)#1(16.7g)、ビタミン溶液(11.9mL)及びスペクチノマイシン溶液(5ml)を加え、pHを調整した。
クエン酸*H2O(40g)、MnSO4 *H2O(30g)、NaCl(10g)、FeSO4 *7H2O(1g)、CoCl2 *6H2O(1g)、ZnSO4 *7H2O(1g)、CuSO4 *5H2O(100mg)、H3BO3(100mg)、NaMoO4 *2H2O(100mg)。各成分を1成分ずつ脱イオン水に溶解させ、HCl/NaOHによりpH 3.0に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径0.22μmのフィルタを用いろ過滅菌した。
MgSO4 *7H2O(296g)、クエン酸一水和物(296g)、クエン酸鉄アンモニウム(49.6g)。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、0.22μmのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
チアミン塩酸塩(1.0g)、D−(+)−ビオチン(1.0g)、ニコチン酸(1.0g)、塩酸ピリドキシン(4.0g)。各成分を1つずつ脱イオン水に溶解させ、HCl/NaOHによりpHを3.0に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径0.22μmのフィルタを用いろ過滅菌した。
脱イオン水により50gスペクチノマイシンを適量にし、0.22μmのフィルタによりろ過滅菌した。
グルコース(0.590kg)、脱イオン水(0.394kg)、K2HPO4(7.4g)及びFoamblast882(8.94g)。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。
表8に記載の大腸菌(E. coli)BL21株により15Lのバイオリアクタで発酵を行った。各株には同一の条件で発酵を2回実施し、すなわち生産性についての結果は2回の試行の平均として記録することができた。
2mLのLBブロスに凍結保存品由来の50μg/mLのスペクチノマイシン(Novagen)及び50μg/mLのカルベニシリン(Novagen)を含有させたものを入れた振盪チューブに、一晩培養物を接種した。次に培養物を、34℃にて250rpmで14時間インキュベートした。次に、1%グルコース、最終濃度1%の酵母エキス及び200μMのIPTGを添加した2mLのTM3培地を入れた5mLの48ウェルプレート(Axygen Scientific)中で、最終的なODが0.2となるまで培養物を希釈した。プレートを、Breath Easier membrane(Diversified Biotech)でシールし、Shel Lab振とう/恒温器で、34℃にて、600rpmで24時間インキュベートした。各培養物1mLを3,000×gで5分遠心分離した。250μlの上清に、19μLの20%硫酸を添加し、氷上で5分間インキュベートした。次に、混合物を3000×gで5分遠心分離し、HPLC解析のため上清を回収した。200μlの上清を、HPLCに適した96ウェル円錐底ポリプロピレンプレート(Nunc)に移した。メバロン酸(Sigma)の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定した。製造元(Pointe Scientific,Inc.)の指定に従ってグルコースオキシダーゼアッセイを実施し、グルコース濃度を測定した。
50℃でインキュベートし、BioRad−マイクロガードCarbo−H詰め替えカートリッジ30mm×4.6mm(カタログ番号125−0129)を取り付けた300mm×7.8mm BioRad−Aminex HPX−87Hイオン排除カラム(カタログ番号125−0140)を使用し、Knauer K2301屈折率検出器を系に包含させたWaters 2695 AllianceのHPLC系でHPLC解析を実施した。移動相に0.01N硫酸を使用し、流速0.6ml/minで試料のHPLC解析を実施した。各試料の屈折率を、濃度既知の各種メバロン酸溶液により作成した検量線に対し比較して、いずれものメバロン酸濃度を定量する。
MCM521可溶化液を使用し、CMP676にメバロン酸経路の下流を形質導入することができる(表3を参照されたい)。製造元に従いカナマイシンマーカーを除去する(Gene Bridges、Heidelberg、Germany)。MCM521の下流の経路は、別の遺伝子を使用することにより各遺伝子の前に位置するrbsを改変し、オペロン上流のプロモータを変更することで改変することができる。プラスミドpMCM1223(L.グレイ(L. grayi))、pMCM1224(E.フェシウム(E. faecium))、pMCM1225(E.ガリナラム(E. gallinarum))、pCHL276(E.フェカリス(E. faecalis))又はpCHL277(E.カセリフラブス(E. casseliflavus))を、プラスミドpDW34変異体と同時に電気穿孔した(米国特許出願公開第2010/0196977号;図2を参照されたい)。pDW34変異体のプラスミドは、活性の向上しているイソプレンシンターゼ変異体を含有している。LB+スペクチノマイシン50ug/mL+カルベニシリン50ug/mLでコロニーを選択することができる。
(i)材料
TM3培地の組成(発酵培地1L当たり):
K2HPO4(13.6g)、KH2PO4(13.6g)、MgSO4 *7H2O(2g)、クエン酸一水和物(2g)、クエン酸鉄アンモニウム(0.3g)、(NH4)2SO4(3.2g)、酵母エキス(0.2g)、1000X微量金属溶液(1mL)。すべての成分を共に加え、diH2Oに溶解させる。水酸化アンモニウム(30%)によりpHを6.8に調整し、及び容量を調整する。0.22μmフィルタで培地を濾過滅菌する。滅菌及びpH調整後にグルコース10.0g及び抗菌剤を添加する。
クエン酸*H2O(40g)、MnSO4 *H2O(30g)、NaCl(10g)、FeSO4 *7H2O(1g)、CoCl2 *6H2O(1g)、ZnSO4 *7H2O(1g)、CuSO4 *5H2O(100mg)、H3BO3(100mg)、NaMoO4 *2H2O(100mg)。各成分を1成分ずつdiH2Oに溶解する。pHをHCl/NaOHで3.0に調整した後、溶液を用量に調整し、0.22μmフィルタでフィルタ滅菌する。
ルリア・ベルターニブロス+抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、OD600が0.05になるよう細胞を20mLのTM3培地(50ug/mlのスペクチノマイシン及び50ug/mLのカルベニシリンを含有(250mLのバッフル付き三角フラスコ))により希釈し、34℃かつ200rpmでインキュベートする。2時間生育させた後、OD600を測定し、200uMのIPTGを加える。発酵工程の間、規則的に試料を採取する。各時点でOD600を測定する。また、ガスクロマトグラフ−マススペクトロメータ(GC−MS)(Agilent)によるヘッドスペースアッセイによりイソプレンのオフガス分析を行う。100μLの全ブロスをGCバイアルに入れ密閉し、34℃かつ200rpmで30分間インキュベートする。70℃で5分のインキュベーションからなる熱殺菌工程後、試料をGCに装填する。記録される比生産量は、イソプレン量のGCによる読み取り値(ug/L)を、インキュベート時間(30分)及びOD600測定値で除算した値である。
株が1つ以上の宿主変異を含有する場合、pCHL276(E.フェカリス(E. faecalis))を含有している同様のバックグラウンドをもつ株と比較して、イソプレンの比生産量、収率、CPI及び/又は力価の上昇が観察される。
MCM521可溶化液を使用し、CMP676にメバロン酸経路の下流を形質導入する(表3を参照されたい)。製造元に従いカナマイシンマーカーを除去する(Gene Bridges、Heidelberg、Germany)。MCM521の下流の経路は、別の遺伝子を使用することにより各遺伝子の前に位置するrbsを改変し、オペロン上流のプロモータを変更することで改変することができる。染色体上のプロモータ及び/又はrbsを変更させるか、又はプラスミドから発現させるかのいずれかにより、ファルネシル二リン酸合成酵素(ispA)を過剰発現させる。プラスミドpMCM1223(L. grayi)、pMCM1224(E. faecium)、pMCM1225(E.ガリナラム(E. gallinarum))、pCHL276(E.フェカリス(E. faecalis))又はpCHL277(E.カセリフラブス(E. casseliflavus))を、プラスミドpDW34変異体と同時電気穿孔した(米国特許出願公開第2010/0196977号;図2を参照されたい)。pDW34変異体のプラスミドは、大腸菌(E. coli)用にコドンを最適化させたファルネセン合成酵素又は大腸菌(E. coli)用にコドンを最適化させたアモルファジエン合成酵素を、イソプレンシンターゼの代わりに含有する。LB+スペクチノマイシン50ug/mL+カルベニシリン50ug/mLでコロニーを選択する。
(i)材料
TM3培地の組成(発酵培地1L当たり):
K2HPO4(13.6g)、KH2PO4(13.6g)、MgSO4 *7H2O(2g)、クエン酸一水和物(2g)、クエン酸鉄アンモニウム(0.3g)、(NH4)2SO4(3.2g)、酵母エキス(0.2g)、1000X微量金属溶液(1mL)。すべての成分を共に加え、diH2Oに溶解させる。水酸化アンモニウム(30%)によりpHを6.8に調整し、及び容量を調整する。次に、0.22μmのフィルタを用い培地を濾過滅菌した。滅菌及びpH調整後にグルコース10.0g及び抗菌剤を添加する。
クエン酸*H2O(40g)、MnSO4 *H2O(30g)、NaCl(10g)、FeSO4 *7H2O(1g)、CoCl2 *6H2O(1g)、ZnSO4 *7H2O(1g)、CuSO4 *5H2O(100mg)、H3BO3(100mg)、NaMoO4 *2H2O(100mg)。各成分を1成分ずつdiH2Oに溶解する。pHをHCl/NaOHで3.0に調整した後、溶液を用量に調整し、0.22μmフィルタでフィルタ滅菌する。
ルリア・ベルターニブロス+抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、OD600が0.05になるよう、250mLのバッフル付き三角フラスコにおいて細胞を20mLのTM3培地(50ug/mlのスペクチノマイシン及び50ug/mLのカルベニシリンを含有)により希釈し、34℃かつ200rpmでインキュベートする。接種前に、各培養フラスコには20%(v/v)ドデカン(Sigma−Aldrich)を積層し、これまでに記載のとおり、揮発性セスキテルペン産物を捕捉する(Newman et.al.,2006)。
株が1つ以上の宿主変異を含有する場合、pCHL276(E.フェカリス(E. faecalis))を含有している同様のバックグラウンドをもつ株と比較して、アモルファジエン又はファルネセンの比生産量、収率、CPI及び/又は力価の上昇が観察される。
Newman,J.D.,Marshal,J.L.,Chang,M.C.Y.,Nowroozi,F.,Paradise,E.M.,Pitera,D.J.,Newman,K.L.,Keasling,J.D.,2006.「代謝系に遺伝子操作を行った大腸菌(E. coli)による二相分画バイオリアクタにおけるアモルファ−4,11−ジエンの高濃度生産(High-level production of amorpha-4,11-diene in a two-phase partitioning bioreactor of metabolically engineered E. coli)」。Biotechnol.Bioeng.95,684〜691。
細胞で異種発現させたタンパク質が分解することで、タンパク質の合成及び分解という無駄なサイクルによりATPの損失が生じる、分解するタンパク質の触媒活性が減少する、対象とするタンパク質の定常状態の細胞内濃度が減少する、細胞生理を変更し得るストレス応答を誘導する、及び生物に由来する市販の製品に有害となる可能性のあるその他の効果が生じる恐れがある(S.−O.Enfors,2004)。したがって、分解しにくい完全長のタンパク質を発現させることは、代謝工学の面から有益である。ウェスタンブロットにより検出される断片により示される通り、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)由来のmvaE遺伝子産物は、大腸菌(E. coli)BL21で発現させた場合に部分的に分解する(図3)。Hisタグ生成した試料を泳動したSDS−PAGEゲルのSafestain染色により、E.フェカリス(E. faecalis)MvaEの切断断片も検出された(図4)。分解耐性のあるmvaE遺伝子産物の同定及び使用は、メバロン酸、イソプレン及びイソプレノイドの生産量を増加させるのに有用である。
Hisタグを付した、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.フェシウム(E. faecium)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)及びL.グレイ(L. grayi)由来のMvaEをコードしているDNAを含有するプラスミドを構築する。MvaEを大腸菌(E. coli)BL21(DE3)で発現させ、Ni−樹脂クロマトグラフィーで精製する。精製した試料をSDS−PAGEにより解析する。アニオン交換クロマトグラフィーにより、及び一部の場合ではゲルろ過により試料を更に精製する。均一性が95%以上になるよう精製した試料を、ポリクローナル抗体の作製に使用する。ウェスタンブロットにより生産株を解析し、対象とするMvaEに対し作製したポリクローナル抗体を用い標識した。
Enfors,S.O.,Scheper,T.「バイオプロセスにおける生理的なストレス応答(Physiological Stress Responses in Bioprocesses)」Springer−Verlag Berlin Heidelberg 2004。
BL21(Novagen)中のクエン酸シンターゼ遺伝子(gltA)の前に位置するプロモータを、常時低発現型プロモータ、すなわちGI1.2(米国特許第7,371,558号)により置き換えた。gltAに関して報告されている2種の野生型プロモータ(Wilde,R及びJ.Guest.1986.J.Gen.Microbiol.132:3239〜3251)及び合成プロモータを、遠位プロモータの−35領域の直後に挿入した。プライマーUpgltACm−F(5’−TATTTAATTTTTAATCATCTAATTTGACAATCATTCAACAAAGTTGTTACAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG−3’)及びDngltA1.xgiCm−R(5’−TCAACAGCTGTATCCCCGTTGAGGGTGAGTTTTGCTTTTGTATCAGCCATATATTCCACCAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATHGTCAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCG−3’)、並びにテンプレートとしてGene Bridges(Heidelberg,Germany)のFRT−gb2−Cm−FRTテンプレートDNAを使用し、PCR産物を得た。PCR産物を精製し、製造元(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)による記載に従って、λredを用いる組み換えに使用した。更なる評価にあたって、複数種のコロニーを選択した。プロモータ領域は、プライマーgltAPromSeqF(5’−GGCAGTATAGGCTGTTCACAAAATC−3’)及びgltApromSeqR(5’−CTTGACCCAGCGTGCCTTTCAGC−3’)と、テンプレートとしてコロニーから抽出したDNA(コロニーを30uLのH2Oに再懸濁し、95℃で4分加熱し、スピンダウンしたもの。50uLのPCR反応には、この溶液のうち2uLをテンプレートとして使用する)とを使用しPCR増幅させた。得られたPCR産物の配列決定結果を観察した後、3種の異なるプロモータGI1.2、GI1.5及びGI1.6(米国特許第7,371,558号)をそれぞれ保有しているコロニーを、更なる使用のため保存した。これらのコロニーは、それぞれCMP141、CMP142及びCMP143と名づけた(表14)。
Sudgen,P.and Newsholm,E.1975.Biochem.J.150:105〜111における記載と同様の方法により、クエン酸シンターゼ(gltA)の活性を測定した。要約すると、DTNBとの反応により、アセチルCoAからのCoASHの生成が412nmで測定される。
電気穿孔法により株CMP258にプラスミドpMCM82(pCLPtrcUpper)を導入し、コロニーをLB+スペクチノマイシン50ug/mLで選択した。1つのコロニーを選択し、電気穿孔法によりpTcHis2B(Invitrogen,Carlsbad,CA)を導入し、形質転換体をLB+スペクチノマイシン50ug/ml及びカルベニシリン50ug/mLで選択した。1つのコロニーを採取し、MCM10022と命名した。
クロラムフェニコールマーカーにより破壊されたackA−pta遺伝子を含有しているDNA断片を、テンプレートしてクロラムフェニコールマーカーが存在しているTriple Triple株を使用し(米国特許第7,745,184(B2)号)プライマーackACF(5’−GTGCAAATTCACAACTCAGCGG−3’)及びptaCR(5’−CACCAACGTATCGGGCAT TGCC−3’)を使用して、PCRにより増幅させた。得られたPCR産物を、製造元(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)の推奨する通りに組み換え反応に使用し、CMP258株のackA−pta座に組み入れた(米国特許出願第12/978,324号を参照されたい)。LB+5ug/mlのクロラムフェニコールにてコロニーを選択した。コロニーを1つ選択し、MD491と名づけた。MD491のP1可溶化液を調製し、CMP451株の形質導入に使用した。LB+5ug/mlのクロラムフェニコールにてコロニーを選択した。コロニーを1つ選択し、CMP604と名づけた。製造元により推奨されるプロトコルを用い(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)クロラムフェニコールマーカーを除去して株CMP723を作製した。CMP723に株CMP646のP1可溶化液により形質導入を行った(実施例18を参照されたい)。LB+5ug/mLクロラムフェニコールを含有させたプレートでコロニーを選択した。1つのコロニーを採取し、CMP735と命名した。
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ldhA)中にカナマイシンマーカーを含有しているCMP374株(下記を参照)のP1可溶化液により、CMP451株に形質導入を行った。コロニーをLB+20ug/mlカナマイシンに播種した。1つのコロニーを採取し、CMP596と命名した。株CMP596のP1可溶化液によりCMP646に形質導入を行った(実施例18を参照されたい)。LB+5ug/mlクロラムフェニコールで形質導入体を選択した。1つのコロニーを採取し、CMP812と命名した。製造元により推奨されるプロトコルを用いカナマイシン及びクロラムフェニコールマーカーを一工程で除去し(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)、CMP828株を作製した。
テンプレートとしてKeio collection(Baba et al.2006.Mol.Syst.Biol.2:2006.0008)のJW 1375株を使用し、プライマーはldhAseqR(5’−GGCTTACCGTTTACGCTTTCCAGC−3’)及びldhAseqF2(5’−CTAATGCAATACGTGTCCCGAGC−3’)を使用し、カナマイシンマーカーにより破壊されているldhA遺伝子を含有しているDNA断片をPCRにより増幅させた。得られたPCR産物を、製造元(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)の推奨する通りに組み換え反応に使用し、MD09−313株のldhA座に組み入れた。LB+20ug/mlのカナマイシンにてコロニーを選択した。コロニーを1つ選択し、CMP374と名づけた。CMP374のP1可溶化液を調製し、CMP604株の形質導入に使用した。LB+20ug/mlのカナマイシンにてコロニーを選択した。コロニーを1つ選択し、CMP620と名づけた。株に電気穿孔法によりpCP20を導入して、クロラムフェニコール及びカナマイシンマーカーを同時に除去し(Datsenko及びWanner.2000.PNAS 97:6640〜5)、30℃下でLB+50ug/mlのカルベニシリンで2つのコロニーを選択し、次に、これらのコロニーを、42℃下でLBプレートに再画線した。これらのプレートからクロラムフェニコール及びカナマイシン感受性のコロニーを選択し、CMP635と名づけた。
テンプレートとしてプラスミドpKD3(Datsenko,K.,及びWanner,B.2000.PNAS 97:6640〜6645)を使用し、プライマーCMP171(5’−AAAATTTTCATTCTGTGACAGAGAAAAAGTAGCCGAAGATGACGGTTTGTCACATGGAGTTGGCAGGATGTTTGATTACATGGGAATTAGCCATGGTCC−3’)及びCMP172(5’−GACCAGCCGCGTAACCTGGCAAAATCGGTTACGGTTGAGTAATAAATGGATGCCCTGCGTAAG CGG GGCATT TTTCTTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG−3’)を使用して、DNAホモログによりλ挿入部位attBの上流及び下流部位に隣接しているクロラムフェニコールマーカーを含有しているDNA断片をPCRにより増幅した。得られたPCR産物を、製造元(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)の推奨する通りにBL21(Novagen)における組み換え反応に使用し、λ挿入部位attBに組み入れた。これにより生成されたCMP646株を、LB+5ug/mlのクロラムフェニコールにて選択した。CMP646のP1可溶化液を調製し、株CMP451及びCMP635に対する形質導入反応に使用し、この株の染色体からメバロン酸経路下流(メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ)を除去した。形質導入物をLB+クロラムフェニコール5ug/mlに播種し、各形質導入からコロニーを1つずつ選択し、それぞれCMP674及びCMP676と名づけた。
電気穿孔法により、プラスミドpCHL276を株CMP674、CMP676、CMP258、CMP735及びCMP828に導入した。コロニーをLB+50ug/mLのスペクチノマイシンにて選択した。各形質転換物からコロニーを1つずつ選択し、それぞれCMP678、CMP680、CMP694、CMP736及びCMP832と名づけた。
本例では、株CMP678、CMP680、CMP694、CMP736及びCMP832でのメバロン酸の生産を示す。
TM3培地の組成(発酵培地1L当たり):
K2HPO4(13.6g)、KH2PO4(13.6g)、MgSO4 *7H2O(2g)、クエン酸一水和物(2g)、クエン酸鉄アンモニウム(0.3g)、(NH4)2SO4(3.2g)、酵母エキス(0.2g)、1000X微量金属溶液(1mL)。すべての成分を共に加え、diH2Oに溶解させた。水酸化アンモニウム(30%)によりpHを6.8に調整し、及び容量を調整した。0.22μmフィルタで培地を濾過滅菌した。滅菌及びpH調整後にグルコース10.0g及び抗菌剤を添加した。
クエン酸*H2O(40g)、MnSO4 *H2O(30g)、NaCl(10g)、FeSO4 *7H2O(1g)、CoCl2 *6H2O(1g)、ZnSO4 *7H2O(1g)、CuSO4 *5H2O(100mg)、H3BO3(100mg)、NaMoO4 *2H2O(100mg)。各成分を1成分ずつdiH2Oに溶解する。pHをHCl/NaOHで3.0に調整した後、溶液を用量に調整し、0.22μmフィルタでフィルタ滅菌する。
細胞をルリア・ベルターニブロスで一晩生育させた。翌日、OD600が0.05になるよう、250mLのバッフル付き三角フラスコにおいて細胞を20mLのTM3培地(50ug/mlのスペクチノマイシンを含有)により希釈し、34℃かつ200rpmでインキュベートする。2時間生育させた後、OD600を測定し、100uMのIPTGを加える。発酵工程の間、規則的に試料を採取した。各時点でOD600を測定し、かつHPLCによりメバロン酸濃度を測定した。次の様式でHPLC解析を実施した:500uLのブロスに15uLの70%(w/v)過塩素酸を加え、混合物を氷上で5分インキュベートした。次に、試料を14,000×gで5分遠心分離し、HPLC解析のため上清を回収し、次の条件でHPLC解析を実施した:(1)BioRad−AminexHPX−87Hイオン排除カラム(300mm×7.8mm)(カタログ番号125−0140)(BioRad,Hercules,California);(2)カラム温度=50℃;(3)BioRad−マイクロガードCarbo−H詰め替えカートリッジ(30mm×4.6mm)(カタログ番号125−0129)(BioRad);(4)移動相=0.01N H2SO4;(5)流速=0.6ml/min;(6)およその圧力=約6550.0kPa(950psi);(7)装填量=100μL;(8)実施時間=26分。
CMP694株(親株)を対照として用い、CMP678(GI1.2gltA)株を評価した。
NADP依存性リンゴ酸酵素(maeB)の前にあるネイティブプロモータを、常時発現型プロモータ、すなわちGI1.2と置き換えた(米国特許第7,371,558号)。新しいプロモータの挿入部位は、すぐ上流にあリ逆向きに翻訳される遺伝子(talA)の発現に影響を与えないよう注意深く選択した(図9)。maeBプロモータについては報告があるが、talAプロモータについては実験により特定した(Lacour & Landini,2004,J.Bact.186:7186〜7195)。
カナマイシンマーカーにより破壊されたpdhR遺伝子を含有しているDNA断片を、Keioコレクション(Baba et al.2006 Mol.Syst.Biol.2:2006.0008)の株JW0109を使用し、プライマーMQ10−82F(5’−GGTAAGTGAATCGGTTCAATTCGG−3’)及びMQ10−82R(5’−CGCTCAACACCTTCTTCACGGATG−3’)を使用して、PCR増幅させた。得られたPCR産物をQiagen PCR精製キット(Qiagen,Germantown,MD)により精製し、製造元の推奨に従い組み換え反応を行って(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)、PCR産物を株MD09−273のpdhR座に組み込んだ。LA+Kan 12.5ug/mlプレートにおいて37℃にてインキュベートし、形質転換体を選択した。コロニーを1つ選択し、pdhR遺伝子領域の約250bp上流及び下流のプライマーMQ10−83F(5’−CCTGTATGGACATAAGGTGAATAC−3’)及びMQ10−83R(5’−CCTGTCCCATTGAACTCTCGCCGG−3’)を使用して確認した。正しい変異株をMD10−429と名づけた。
天然のプロモータを常時高発現型のプロモータ、すなわちPL.6により置き換え、BL21(Novagen)においてPdhオペロン(ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体)の前に存在するプロモータを改変した。pKD3プラスミド由来のFRT部位と隣接させたクロラムフェニコール遺伝子をプライマーMQ10−84F(5’−AGAGTTCAATGGGACAGGTTCCAGAAAACTCAACGTTATTAGATAGATAAGGAATAACCCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC−3’)及びMQ10−84R(5’−CGTCATTTGGGAAACGTTCTGACATGTTTTTTTACCTCCTTTGCACCTTCATGGTGGTCAGTGCGTCCTGCTGATGTGCTCAGTATCACCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGATAATTTATCACCGCAGATGGTTATCTGTATGTTTTTTATATGAATTCATATGAATATCCTCCTTA−3’)を使用して増幅させ、PCR産物を得た(Datsenko及びWanner.2000,PNAS 97:6640〜5)。完全なPDHオペロン(aceE、aceF及びlpdA)を増幅させるため、テンプレートとしてBL21を使用し、プライマーMQ10−85F(5’−ATGTCAGAACGTTTCCCAAATGACG−3’)及びMQ10−85R(5’−GCGGCGTGGTTAGCCGCTTTTTTAATTGCCGGATGTTCCGGCAAACGAAAAATTACTTCTTCTTCGCTTTCGGGTTC−3’)を使用して、第2段階のPCR産物を生成した。融合PCRを使用し、プライマーMQ10−84F & MQ10−85Rにより両方のDNA断片を一緒に融合させた。約1.6KbpのPCR産物を得て、Qiagen PCR精製キット(Qiagen,Germantown,MD)を使用して精製した。株MD09−273において、PDHプロモータを標的とし、約300〜400ngの精製PCR産物を使用して、製造元による記載に従いλ−red介在型(lambda red-mediated)組み換えを行った(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)。この組み込み操作での組み込みがうまく行かなかった場合には、PCR産物は、より短いリバースプライマー(MQ10−91R5’−GAAGTGGTTAAAGCACAC−3’)を使用して再増幅させた。結果として、約1.6kbpのPCR産物を良好にMD09−273に組み込んだ。形質転換体をLA+クロラムフェニコール5ug/mlで選択した。いくつかのコロニーを選択し、プライマーMQ10−84F & MQ10−84Rを使用して更に評価した。更に検証を行うため、他のプライマーMQ10−84F & MQ10−91Rを使用しプロモータ領域をPCRで増幅した。得られたPCR産物に対し配列決定を行ったところ、配列は正しかったことが示されたため、MD10−434と名づけた。
電気穿孔法によりプラスミドpCHL276(実施例6(iii)を参照されたい)を株MD10−446、CMP706及びCMP725に導入した。コロニーをLB+50ug/mLのスペクチノマイシンにて選択した。各形質転換用に1つのコロニーを選択し、それぞれMD10−555、CMP711及びCMP729と名づけた。
本例では、株CMP678、MD10−555、CMP711及びCMP729でのメバロン酸の生産を示す。
TM3培地の組成(発酵培地1L当たり):
K2HPO4(13.6g)、KH2PO4(13.6g)、MgSO4 *7H2O(2g)、クエン酸一水和物(2g)、クエン酸鉄アンモニウム(0.3g)、(NH4)2SO4(3.2g)、酵母エキス(0.2g)、1000X微量金属溶液(1mL)。すべての成分を共に加え、diH2Oに溶解させた。水酸化アンモニウム(30%)によりpHを6.8に調整し、及び容量を調整した。0.22μmフィルタで培地を濾過滅菌した。滅菌及びpH調整後にグルコース10.0g及び抗菌剤を添加した。
クエン酸*H2O(40g)、MnSO4 *H2O(30g)、NaCl(10g)、FeSO4 *7H2O(1g)、CoCl2 *6H2O(1g)、ZnSO4 *7H2O(1g)、CuSO4 *5H2O(100mg)、H3BO3(100mg)、NaMoO4 *2H2O(100mg)。各成分を1成分ずつdiH2Oに溶解する。pHをHCl/NaOHで3.0に調整した後、溶液を用量に調整し、0.22μmフィルタでフィルタ滅菌する。
細胞をルリア・ベルターニブロスで一晩生育させた。翌日、OD600が0.05になるよう、250mLのバッフル付き三角フラスコにおいて細胞を20mLのTM3培地(50ug/mlのスペクチノマイシンを含有)により希釈し、34℃かつ200rpmでインキュベートする。2時間生育させた後、OD600を測定し、100uMのIPTGを加える。発酵工程の間、規則的に試料を採取した。各時点でOD600を測定し、かつHPLCによりメバロン酸濃度を測定した。次の様式でHPLC解析を実施した:500uLのブロスに15uLの70%(w/v)過塩素酸を加え、混合物を氷上で5分インキュベートした。次に、試料を14,000×gで5分遠心分離し、HPLC解析のため上清を回収し、次の条件でHPLC解析を実施した:(1)BioRad−AminexHPX−87Hイオン排除カラム(300mM×7.8mm)(カタログ番号125−0140)(BioRad,Hercules,California);(2)カラム温度=50℃;(3)BioRad−マイクロガードCarbo−H詰め替えカートリッジ(30mm×4.6mm)(カタログ番号125−0129)(BioRad);(4)移動相=0.01N H2SO4;(5)流速=0.6ml/min;(6)およその圧力=約6550.0kPa(950psi);(7)装填量=100μL;(8)実施時間=26分。
株CMP678(親)を対照として使用し、株MD10−555(PL.6pdh)、CMP711(GI1.2maeB)及びCMP729(pdhR)を評価した。
(i)材料
培地組成(発酵培地1L当たり):
K2HPO4(7.5g)、MgSO4*7H2O(2g)、クエン酸一水和物(2g)、クエン酸鉄アンモニウム(0.3g)、酵母エキス(0.5g)、50%硫酸(1.6mL)、1000X改変微量金属溶液(1ml)。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した(123℃で20分)。水酸化アンモニウム(28%)によりpHを7.0に調整し、用量に調整した。滅菌及びpH調製後にグルコース10g、ビタミン溶液8mL、及び抗生物質を加えた。
クエン酸*H2O(40g)、MnSO4*H2O(30g)、NaCl(10g)、FeSO4*7H2O(1g)、CoCl2*6H2O(1g)、ZnSO*7H2O(1g)、CuSO4*5H2O(100mg)、H3BO3(100mg)、NaMoO4*2H2O(100mg)。各成分を1つずつ脱イオン水に溶解させ、HCl/NaOHによりpHを3.0に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径0.22μmのフィルタを用いろ過滅菌した。
チアミン塩酸塩(1.0g)、D−(+)−ビオチン(1.0g)、ニコチン酸(1.0g)、D−パントテン酸(4.8g)、塩酸ピリドキシン(4.0g)。各成分を1つずつ脱イオン水に溶解させ、HCl/NaOHによりpHを3.0に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径0.22μmのフィルタを用いろ過滅菌した。
グルコース(0.57kg)、脱イオン水(0.38kg)、K2HPO4(7.5g)、及び100% Foamblast(10g)。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。溶液を25℃に冷却した後、マクロ塩溶液(3.4mL)、1000×改変微量金属溶液(0.8mL)、及びビタミン溶液(6.7mL)を加えた。
MgSO4*7H2O(296g)、クエン酸水和物(296g)、クエン酸鉄アンモニウム(49.6g)。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、0.22μmのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
ウラジロハコヤナギ(P. alba)(pTrcAlba(MEA))のMVA経路上流(pCLUpper−MCM82)、MVA経路下流(PL.2−mKKDyI)及び切断型イソプレンシンターゼを過剰発現しており、かつ染色体にpgl遺伝子が回復しており、GI1.2プロモータの後ろにあるgltA遺伝子がノックダウンされている大腸菌(E. coli)BL21細胞を用い、15Lのバイオリアクタで発酵を行った(株名CMP457)。対照とする発酵に使用した親株はgltA遺伝子をノックダウンさせていなかった。
gltAの前に存在するGI1.2gltAプロモータによる発酵では、対照となる親株と比較して収率が高かった(図15)。イソプレン力価、容積生産量及び細胞生産性指数もGI1.2gltA株の方がより高かった。結果を表15(下記)に要約する。
(i)材料
培地組成(発酵培地1L当たり):
K2HPO4(7.5g)、MgSO4*7H2O(2g)、クエン酸一水和物(2g)、クエン酸鉄アンモニウム(0.3g)、酵母エキス(0.5g)、50%硫酸(1.6mL)、1000X改変微量金属溶液(1ml)。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した(123℃で20分)。水酸化アンモニウム(28%)によりpHを7.0に調整し、用量に調整した。滅菌及びpH調製後にグルコース10g、ビタミン溶液8mL、及び抗生物質を加えた。
クエン酸*H2O(40g)、MnSO4*H2O(30g)、NaCl(10g)、FeSO4*7H2O(1g)、CoCl2*6H2O(1g)、ZnSO*7H2O(1g)、CuSO4*5H2O(100mg)、H3BO3(100mg)、NaMoO4*2H2O(100mg)。各成分を1つずつ脱イオン水に溶解させ、HCl/NaOHによりpHを3.0に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径0.22μmのフィルタを用いろ過滅菌した。
チアミン塩酸塩(1.0g)、D−(+)−ビオチン(1.0g)、ニコチン酸(1.0g)、塩酸ピリドキシン(4.0g)。各成分を1つずつ脱イオン水に溶解させ、HCl/NaOHによりpHを3.0に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径0.22μmのフィルタを用いろ過滅菌した。
グルコース(0.590kg)、Di H2O(0.393kg)、K2HPO4(7.4g)及び100% Foamblast882(8.9g)。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。
MgSO4*7H2O(296g)、クエン酸水和物(296g)、クエン酸鉄アンモニウム(49.6g)。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、0.22μmのフィルタを用い、ろ過滅菌した。追試A(GI1.2gltAでの実施):16.8mlを滅菌前に反応槽内の培地に直接添加し、それ以上の添加は行わない。追試B:(野生型gltAでの実施)1L当たり6.895mlsのグルコース供給溶液を添加する。
MVA経路上流(pCLUpper)を発現しており、かつ染色体にpgl遺伝子が復元されている大腸菌(E. coli)BL21細胞を用い、15Lのバイオリアクタで発酵を行った。したがって、3種のメバロン酸生産株を比較した。
GI1.2gltAをノックダウンさせた場合(CMP678)の発酵では、対照となる親株(MCM1002)と比較して、グルコースに対するメバロン酸の収率が高かった。加えて、細胞生産性指数、容積生産量及びメバロン酸力価の上昇が観察された(それぞれ図20、21及び24。表16に要約)。
4時間間隔でブロス試料を回収し、発酵ブロス中のメバロン酸濃度をHPLC分析により測定した。高純度のメバロン酸(Sigma−Aldrich)溶液を調整してHPLCを行い予め作成しておいた較正曲線と、屈折率応答とを比較して、ブロス試料中のメバロン酸濃度を測定した。
系:Waters Alliance 2695;カラム:BioRad−AminexHPX−87Hイオン排除カラム300mm×7.8mmカタログ番号125−0140;カラム温度:50℃;ガードカラム:BioRad−マイクロガードCarbo−H詰め替えカートリッジ30mm×4.6mm(カタログ番号125−0129);移動相:0.01NのH2SO4;移動相の流速:0.6mL/min;およその圧力:約7584.2〜8273.7kPa(1100〜1200psi);注入量:20μL;検出器:屈折計(Knauer K−2301);実施時間:26分。
本実施例は、大腸菌(E. coli)において、異種メバロン酸経路によりイソプレノイド、イソプレノイド前駆体及びイソプレンを生産させるために、メタン生成菌のM.バートニイ(M. burtonii)由来のメバロン酸キナーゼを含む、細菌株の構築について詳述する。
E.フェカリス(E. faecalis)mvaE遺伝子産物をクエリーとして使用する一次配列相同性検索を、NCBIウェブサイトに存在するBLASTpプログラムにより実施した(Stephen F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller及びDavid J.Lipman(1997)、「ギャップ考慮型ブラスト及びPSI−BLAST:新規タンパク質データベース検索プログラムの作成(Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs)」、Nucleic Acids Res.25:3389〜3402)。検索結果から対象とする配列を選択する。M.バートニイ(M. burtonii)メバロン酸キナーゼは、M.マゼイのメバロン酸キナーゼに対し61%配列同一性を有する。
改変したMVA経路下流をMCM2029(CMP1133の継代培養、IDN 31308)に形質導入し、イソプレン生産宿主を生成した。
プラスミドpDW166(Trcウラジロハコヤナギ(P. alba)IspS変異体MEA(Carb50))を、mMVKではなくbMVKを発現するよう改変した。プライマーMCM810及びMCM811及びpDW166ベクター(−mMVK遺伝子)を使用し、pMCM1666からbMVK遺伝子を増幅し、プライマーMCM808及びMCM809を使用しこの遺伝子を増幅させた(Herculase II融合キット、35μLのddH2O、1μLのテンプレート(約100ng/μL)、0.5μLのdNTP、1.25μLの10μMの各プライマー、1μLのポリメラーゼ)。次の通りに反応を実施した:95℃で2:00、30x(95℃で0:20、55℃で0:20、72℃で0:45(インサート)又は3:00(ベクター))、72℃で3:00、試料が冷めるまで4℃。PCR産物をQiagen PCRカラムで精製し、30μLのEBで溶出した。GeneArtシームレスクローニング及びアセンブリキット(Invitrogen #A13288)を使用し、インサートをベクターにクローン化した。反応液は、2μLの各PCR産物、4μLの緩衝液、10μLのddH2O及び2μLの酵素から構成された。反応物を室温で30分インキュベートし、次に4μLをInvitrogen TOP10ケミカルコンピテントセルを形質転換させた。250μLのLBで37℃で1時間回復させた後、形質転換体をLA carb50プレートで37℃で一晩選択した。プラスミドにミニプレップ処理を行い、配列決定した。
宿主株(表20)を、5mLのLBにより、37℃にて250rpmで対数増殖期の中期まで生育させた。培養物を氷冷し、滅菌冷ddH2Oで3回洗浄し、培養物の1/10倍量で再懸濁した。エッペンドルフチューブ中で、100μLの細胞懸濁液を1μLのプラスミドDNA(約100ng/uL)と混合した。全ての株をpMCM2095により形質転換させた。MCM2065も各々1μLのpMCM2020及びpMCM1225で形質転換させた(IDN 31552)。反応物を2mmの電気穿孔用キュベットに移し、25uFD、200ohms、2.5kVで電気穿孔を行い、直ちに500μLのLBでクエンチした。反応物を37℃で少なくとも1時間回復させ、37℃で、carb50を添加したLAプレート(及び同様にpMCM2020及びpMCM1225によりMCM2065同時形質転換させる場合にはspec50を添加したLAプレート)で一晩、形質転換体を選択した。抗生物質を添加したLBで各形質転換コロニーを対数増殖期の中期まで生育させ、33%グリセロール中で−80℃で保管した(IspSを有する宿主)。株MCM2131を同様の様式で保管した。IspSを有する宿主株をLB carb50で生育させ、電気穿孔法により、LA carb50 spec50で選択した形質転換体を有するpMCM1225を導入した。再度、単一のコロニーをLB carb50 spec50で生育させ、−80℃で33%グリセロール中で保管した(生産株、表21)。
タンパク質の発現及び精製:M.バートニイ(M. burtonii)メバロン酸キナーゼ遺伝子を有する大腸菌(E. coli)株MCM1666を、34℃下で、50mg/Lのカナマイシンを添加した1LのTerrificブロスで生育させた。OD600=0.6の時点で50μMのIPTGにより細胞に誘導を行い、誘導から5時間後に遠心分離により細胞を回収した。凍結溶解サイクル後、細胞ペレットを0.05Mのリン酸ナトリウム、0.3Mの塩化ナトリウム、0.2mg/mlのDNaseIを含有している0.02Mのイミダゾール(pH 8.0)緩衝液及び0.5mMの4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド(AEBSF)に再懸濁した。137.9MPa(20,000psi)でフレンチプレスセルを繰り返し通過させて溶解を行った。229,000×gで1時間の超遠心により細胞可溶化液を清澄化させた。上清を0.2μフィルタによりろ過し、硫酸ニッケルを0.05Mのリン酸ナトリウム、0.3Mの塩化ナトリウム、0.02Mのイミダゾール(pH 8.0)により平衡化したHiTrap IMAC HPカラムに装填した。0.02〜0.5Mのイミダゾールの直線勾配を使用し、メバロン酸キナーゼを単離した。メバロン酸キナーゼを含有している画分をSDS−PAGE(Invitrogen)により特定し、Hi Prep 26/10脱塩カラムを使用して0.05MのTris、0.05Mの塩化ナトリウム(pH 7.4)に脱塩した。SDS−PAGE及びクマシー染色により評価した結果、最終的なメバロン酸キナーゼ画分は95%であった。分光光度計により280nmにて読み取りを行い、定量化を行った(変換率は0.3OD/mg/mlに相当、VectorNTI)。
本実施例では、M.バートニイ(M. burtonii)及びM.マゼイ(M. mazei)に由来するメバロン酸キナーゼのそれぞれの溶解度を試験する。
50mg/Lのカナマイシンを含有させた5mLのLB培地により、株MCM1666及びMCM1669を34℃で生育させた。OD(600)=0.6の時点で50μMのIPTGにより細胞に誘導を行い、誘導から4時間後に遠心分離により回収した。50mMのTris、0.2mg/mlのDNaseIを添加した50mMのNaCl(pH 7.4)及び0.5mMのAEBSFにより細胞可溶化液を調製し、4826.3kPa(700psi)に設定したフレンチプレスセルに2回通過させ可溶化を行った。タンパク質の溶解度をSDS−PAGEゲルにより解析した。
pET24bベクターM.バートニイ(M. burtonii)メバロン酸キナーゼを発現させた際、溶解度は70%であったのに対し、M.マゼイ(M. mazei)のメバロン酸キナーゼの溶解度は約5%であり、これら以外のタンパク質はペレット画分に含まれた(図28)。
本実施例は、M.バートニイ(M. burtonii)及びM.マゼイ(M. mazei)に由来するメバロン酸キナーゼの触媒活性及び阻害に関係する各動態解析について詳述する。
SpectraMax 190プレートリーダー(Molecular Devices)を使用して動態解析を実施した。全ての動態解析データは、Synergy softwareの、Kaleidagraph 4.0によるグラフ作成プログラムを使用し解析した。アデノシン三リン酸(ATP)、ホスホエノールピルビン酸(PEP)、NADH、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、Tris、HEPE、DNase I並びにMVP及びMVPPをSigmaから購入した。ジチオスレイトールをフルカから購入した。乳酸デヒドロゲナーゼをカルビオケムから購入し、ピルビン酸キナーゼをMDバイオメディカルズから購入した。DMAPP、IPP及びGPPは社内で合成した。
メバロン酸及びATPを両方用いるランダム二反応種モデルによりM.バートニイ(M. burtonii)及びM.マゼイ(M. mazei)メバロン酸キナーゼの速度定数を評価した(表23)。34℃下で、M.バートニイ(M. burtonii)メバロン酸キナーゼは、メバロン酸に対しては44.4s−1のkcatを有し、ATPに対しては74.3s−1のkcatを有するのに対し、M.マゼイ(M. mazei)メバロン酸キナーゼは、メバロン酸に対しては18.3s−1のkcatを有し、ATPに対しては26.8s−1のkcatを有する。M.バートニイ(M. burtonii)及びM.マゼイ(M. mazei)のメバロン酸キナーゼのKa(Mev)値は非常に類似しており、それぞれ391μM及び397μMであった。Kb(ATP)は、M.バートニイ(M. burtonii)メバロン酸キナーゼについては212μMであり、M.マゼイ(M. mazei)については460μMであった。
本実施例は、遺伝子操作し、M.バートニイ(M. burtonii)メバロン酸キナーゼ又はM.マゼイ(M. mazei)メバロン酸キナーゼを大腸菌(E. coli)染色体上で発現させた大腸菌(E. coli)株の、生育及びイソプレン生産量に関する小規模試験を詳述する。
生育アッセイ:冷凍保存品からカルベニシリン50μg/mL(Novagen)及びスペクチノマイシン50μg/mL(Novagen)を添加したLBブロス2mLを入れた振盪チューブに一晩培養物を接種した。次に、培養物を、34℃下240rpmで14時間インキュベートした。次に、1%グルコース、0.02%酵母エキス、50μg/mLのカルベニシリン及び50μg/mLのスペクチノマイシンを添加した2mLのTM3培地を入れた、5mL48ウェルプレート(Axygen Scientific)で、最終的なODが0.2になるよう培養物を希釈した。プレートを、Breath Easier membrane(Diversified Biotech)でシールし、Shel Lab振とう/恒温器で、34℃にて、600rpmでインキュベートした。OD0.4の時点で、200μMのIPTGにより培養物に誘導を行った。誘導の1時間後に、最終濃度が0、2、4、8、16、32mMになるよう培地にメバロン酸を加えた。IPTGによる誘導の直後、1、2、3、4、及び5時間後にODを測定した。
MCM2131の生育は、0〜16mM濃度のメバロン酸では阻害されなかった。MCM2131は、32mMのメバロン酸を加えた場合に最も比生産量が高くなったことから(30〜42mg/L/h/OD)、上流経路からの非常に多量の取り込みを支持し得る。
株MCM2126及びMCM2127を試験し、染色体のみでマゼイ(Mazei)MVK offを発現させた場合に何らかの効果が得られるか評価した。
(i)溶液
培地組成(発酵培地1L当たり):K2HPO4(7.5g)、MgSO4 *7H2O(2g)、クエン酸一水和物(2g)、クエン酸鉄アンモニウム(0.3g)、酵母エキス(0.5g)、50%硫酸1.6mL、1000X改変微量金属溶液1ml。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した(123℃で20分)。水酸化アンモニウム(28%)によりpHを7.0に調整し、用量に調整した。滅菌及びpH調製後にグルコース10g、ビタミン溶液8mL、及び抗生物質を加えた。
試料を解凍し、100mMのTris、100mMのNaCl(pH 7.6)、0.1mg/mlのDNaseI、1mg/mlのリゾチーム、及び0.5mMのAEBSF(4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド)によりOD=20に規格化した。ODを規格化した細胞懸濁液を、4826.3kPa(700psi)に設定したフレンチプレスセルに繰り返し通過させて、溶解させた。14,000rpmで10分間遠心分離し、可溶化液を清澄化させた。清澄化させた可溶化液に含まれる総タンパク質量を、ブラッドフォードアッセイ(BioRad,500−0006)を使用し評価した。次に試料を規格化し、4〜12% SDS−PAGEゲル(Life Technologies)で泳動した。iBlot転写装置(Life Technologies)を使用し、ニトロセルロース膜にタンパク質を転写した。BenchPro(商標)4100ウェスタンカード・プロセッシング・ステーション(Life Technologies)を使用して、ProSci incorporatedの生成酵素に対するウサギ一次ポリクローナル抗体、並びにAlexa Fluor 488により蛍光標識した抗ウサギIgGヤギ2次抗体(Life Technologies,A−11008)により、ニトロセルロース膜上でM.マゼイ(M. mazei)及びM.バートニイ(M. burtonii)MVKを検出した。イメージャーのStorm及びImageQuant TLソフトウェア(GE Healthcare)を使用し、特異的なタンパク質定量化を行った。
ウェスタンブロット解析によるタンパク質定量に基づくと、MCM2125におけるM.バートニイ(M. burtonii)のメバロン酸キナーゼの発現は、DW708株におけるM.マゼイ(M. mazei)のメバロン酸キナーゼの発現と比較して少なくとも1/15以下であった(図30)。
本実施例は、導入したメバロン酸経路由来の遺伝子を発現させ、15Lスケールで流加式培養により生育させた大腸菌(E. coli)(BL21)におけるイソプレン生産量を評価する。以下に記載の標準的なイソプレン生産工程によりイソプレン生産を実施した。本試験では、株DW708の生産指数(グルコースに対する累積イソプレン収率、グルコースに対する瞬間的なイソプレン収率、イソプレンの容積生産量、比生産量及び細胞生産性指数)を、試験株MCM2125、MCM2126及びMCM2127と比較する。これらの株を同一の条件で試験し、株MCM2125においてバートニイ(burtonii)メバロン酸キナーゼ(MVK)を使用することによりマゼイ(Mazei)MVKのみを使用した株(DW708)と比較して何らかの収率向上が得られるかどうかを評価した。加えて、株MCM2126及びMCM2127を同一の条件で試験し、染色体のみでマゼイ(Mazei)MVK offを発現させた場合に何らかの効果が得られるか評価した。
培地組成(発酵培地1L当たり):K2HPO4(7.5g)、MgSO4 *7H2O(2g)、クエン酸一水和物(2g)、クエン酸鉄アンモニウム(0.3g)、酵母エキス(0.5g)、50%硫酸(1.6mL)、1000X改変微量金属溶液(1ml)。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した(123℃で20分)。水酸化アンモニウム(28%)によりpHを7.0に調整し、用量に調整した。滅菌及びpH調製後にグルコース10g、ビタミン溶液8mL、及び抗生物質を加えた。
大腸菌(E. coli)株を凍結させたバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス及び適切な抗生物質を添加した培地を入れたフラスコに接種した。550nm(OD550)での吸光度が1.0になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち500mLを15Lのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を5Lに調整した。
イソプレンは揮発性であり、注入ガスにより槽から効率的に回収することができる。バイオリアクタのオフガス中のイソプレン濃度は、2つの質量分析器iSCAN(Hamilton Sundstrand)及びHiden HPR20(Hiden Analytical)質量分析器を使用して測定した。オフガス中の酸素、窒素及びCO2濃度は、同様の質量分析ユニットにより測定した。
結果を表26に要約する。バートニイ(burtonii)MVK(MCM2125)を発現している株は、マゼイ(mazei)MVKを発現している株(DW708)と比較して、グルコースに対する累積イソプレン収率(%)が同程度であり(図31)、グルコースに対するイソプレン瞬間収率(%)が同程度であり(図32)、細胞性能指数が同程度であり(CPI;図33)、総容積生産量が同程度であり(図34)、及び比生産量(図35)が同程度であった。
pgl座にカナマイシンカセットを含有しているKeio株JW0750(Baba et al.2006.Mol.Syst.Biol.2:1〜11)と、プライマーpglAmpF(5’−cagcaaatagcaggtgtatccagc−3’)及びpglAmpR(5’−GCA ACC GAC TGT TGA TAG AAC AAC−3’)とを使用し、実施例4に記載のPCR法により、FRT部位並びにpgl(ybhE)の上流及び下流と相同領域と隣接させたカナマイシンカセットを含有しているPCR産物を得た。このPCR産物を使用して、大腸菌(E. coli)CMP1075の組み換え反応を行った(プロトコルについては上記を参照されたい)。コロニーをLB+カナマイシン10mg/Lで選択し、CMP1125と名づけた。製造元により推奨されるプロトコルを用い、株CMP1133からカナマイシンマーカーを除去した(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)。
本試験を実施して、導入したメバロン酸経路由来遺伝子を発現させかつ15Lスケールの流加式培養で生育させた大腸菌(E. coli)(BL21)によるイソプレン生産を評価した。下記の通りイソプレン生産株CMP1082(HMB GI1.2gltA、PyddVIspA_GO、truncIspA、pMCM82、pDW72)を使用し、標準的なイソプレン生産工程を実施した。同一条件での試験株CMP1136(HMB GI1.2gltA、PyddVIspA_GO、truncIspA,pgl−、pMCM82、pDW72)の生産指数(グルコースに対する累積イソプレン収率、グルコースに対する瞬間的なイソプレン収率、イソプレンの容積生産量、比生産量及び細胞生産性指数)を比較して、CMP1136においてpgl遺伝子を欠失させたことによる収率の向上を確認した。
pgl−株(CMP1136)は、pgl+株(CMP1082)と比較して、グルコースに対するイソプレンの収率(%)が高かった。表27及び図41を参照されたい。pgl−株(CMP1136)は、pgl+株(CMP1082)と比較して、グルコースに対するイソプレンの瞬間的な収率(%)が高く、かつこの生産性の高さをより長時間維持した(pgl−は最大約24時間維持したのに対し、pgl+は最大約12時間維持した)。表27及び図42を参照されたい。pgl−株(CMP1136)の細胞生産性指数はpgl+株(CMP1082)よりも高かった。68〜72時間の発酵終了時に、pgl−株はかなり高いCPIを有していた。また、グルコースに対するイソプレンの累積生産性が最大となる時(pgl+株については44時間及びpgl−株については56時間)のCPIはpgl−株の方が高かった。表27及び図43を参照されたい。pgl−株(CMP1136)の総容積生産量はpgl+株(CMP1082)のものとおおよそ同程度であった。表27及び図44を参照されたい。pgl−株(CMP1136)の最大比生産量はpgl+株(CMP1082)のものとおおよそ同程度であった。しかしながら、pgl−株(CMP1136)は、この生産性の高さをpgl+株(CMP1082)よりも長時間維持し、かつ発酵速度が顕著に良好であった。表27及び図45を参照されたい。
プライマー1.2ppcR2(5’−cgggctttgcttttcgtCAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATCGTCAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCG−3’)及びppcF(5’−gttacttggggcgattttttaacatttccataagttacgcttatttaaagcAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG−3’)により、GeneBridges(Heidelberg,Germany)のクロラムフェニコールカセットFRT−gb2−Cm−FRTを増幅させた。このようにして得られたPCR産物を精製し、製造元(GeneBridges)の推奨に従い組み換え反応に使用して、株MG1655 1.6ppcにコンストラクトを導入した(米国特許第7,745,184号、2010年6月29日発行を参照されたい)。得られた株(CMP3_49)から、プライマーCMP79(5’−GGA AAC ACG GTT TAT CAA GCC CAC C−3’)及びCMP80(5’−cgtgaagatttcgacaacttacgg−3’)によりPCR産物を増幅させ、製造元の推奨に従い(GeneBridges)組み換え反応に使用して、BL21にコンストラクトを導入した(DE3)。DE3株からP1可溶化液を調製し、CMP1133(internal docket#40109)に形質導入した。P1可溶化液を調製し、Ausubel,et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Incに記載の方法に従って使用した。コロニーをLB+クロラムフェニコール5mg/Lで選択し、CMP1230と名づけた。製造元により推奨されるプロトコルを用い(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)クロラムフェニコールマーカーを除去して株CMP1234を作製した。電気穿孔法により、プラスミド対pMCM82(米国特許第2011/0159557号)及びpDW72(米国特許出願第13/283,564号を参照されたい)並びにpMCM1225(表25を参照されたい)及びpDW240を導入し、LB+50mg/Lカルベニシリン+50mg/Lスペクチノマイシンで選択した。このようにして得られた株を、それぞれCMP1237及びCMP1238と名づけた。
本実施例は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)プロモータに遺伝子操作を施した株におけるイソプレン生産を評価する。
TM3培地組成(発酵培地1L当たり):K2HPO4(13.6g)、KH2PO4(13.6g)、MgSO4*7H2O(2g)、クエン酸一水和物(2g)、クエン酸鉄アンモニウム(0.3g)、(NH4)2SO4(3.2g)、酵母エキス(0.2g)、1000x微量金属溶液(1ml)。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム(30%)によりpHを6.8に調整し、及び容量を調整する。孔径0.22μmのフィルタで培地を濾過滅菌する。pH調整及び滅菌後にグルコース10.0g及び抗菌剤を添加する。
ルリア・ベルターニブロス+抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、OD600が0.1になるよう、250mLのバッフル付き三角フラスコにおいて細胞を20mLのTM3培地(50μg/mlのスペクチノマイシン及び50μg/mLのカルベニシリンを含有)により希釈し、34℃かつ200rpmでインキュベートする。2時間生育させた後、OD600を測定し、200uMのIPTGを加える。発酵工程の間、規則的に試料を採取する。各時点でOD600を測定する。また、ガスクロマトグラフ−質量分析器(GC−MS)(Agilent)によるヘッドスペースアッセイにより、イソプレンのオフガス解析を行った(米国特許出願公開番号第2005/0287655号を参照されたい。この特許文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。100μLの全ブロスをGCバイアルに入れ密閉し、34℃かつ200rpmで30分間インキュベートする。70℃で7分のインキュベーションからなる加熱殺菌工程後、試料をGCに装填する。記録される比生産量は、イソプレン量のGCによる読み取り値(μg/L)を、インキュベート時間(30分)及びOD600測定値で除算した値である。
ppcプロモータに遺伝子操作を施した株(CMP1237)の生育は、野生型ppcを有する株CMP1136と比較してわずかに遅かった(図46)。CMP1237株の比生産量は、CMP1136の比生産量よりも高かった(図47)。
本試験を実施して、導入したメバロン酸経路由来の遺伝子を発現させかつ15Lスケールの流加式培養で生育させた大腸菌(E. coli)(BL21)によるイソプレン生産を評価した。下記の通りイソプレン生産株CMP1136(HMB GI1.2gltA,PyddVIspA_GO,truncIspA,pgl−,pMCM82,pDW72)を使用し、標準的なイソプレン生産工程を実施した。同一条件下での、試験株の生産指数(グルコースに対する累積イソプレン収率、グルコースに対する瞬間的なイソプレン収率、イソプレンの容積生産量、比生産量及び細胞生産性指数)を比較して、試験株CMP1237(HMB GI1.2gltA,GI1.2ppc,PyddVIspA_GO,truncIspA,pgl−,pMCM82,pDW72)において、GI1.2プロモータ下でホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を発現させることで、何らかの収率の向上が観察されるかを確認した。
培地組成(発酵培地1L当たり):K2HPO4(7.5g)、MgSO4*7H2O(2g)、クエン酸一水和物(2g)、クエン酸鉄アンモニウム(0.3g)、酵母エキス(0.5g)、50%硫酸(1.6mL)、1000X改変微量金属溶液(1ml)。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した(123℃で20分)。水酸化アンモニウム(28%)によりpHを7.0に調整し、用量に調整した。滅菌及びpH調製後にグルコース10g、ビタミン溶液8mL、及び抗生物質を加えた。
本実験は、所望の発酵pH(7.0)及び温度(34℃)でのグルコースからのイソプレン発酵をモニターするために実施した。大腸菌(E. coli)株を凍結したバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス及び適切な抗生物質を添加した培地を入れたフラスコに接種した。550nm(OD550)での吸光度が1.0になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち500mLを15Lのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を5Lに調整した。
イソプレンは揮発性であり、注入ガスにより槽から効率的に回収することができる。バイオリアクタのオフガス中のイソプレン濃度は、2つの質量分析器iSCAN(Hamilton Sundstrand)及びHiden HPR20(Hiden Analytical)質量分析器を使用して測定した。オフガス中の酸素、窒素及びCO2濃度は、同様の質量分析ユニットにより測定した。
結果を表28に要約する。GI1.2ppc株(CMP1237)は、野生型ppcプロモータ株(CMP1136)と比較して、グルコースに対するイソプレン収率(%)が高く(図48)、グルコースに対するイソプレンの瞬間的な収率(%)が高く(図49)、細胞生産性指数が高く(図50)、総容積生産量が高く(図51)、かつイソプレンの最大比生産量はおよそ等しかった(図52)。
(i)材料及び方法
株CMP1237(ppcプロモータを遺伝子操作)及びDW719(野生型ppc)の15L規模の発酵により得られた細胞を遠心分離により回収した。上清を廃棄し、ペレットを溶解緩衝液(50mMのTris HCl(pH 8)、1mg/mlのリゾチーム、1mMのDTT、10μg/mLのDNAse、1mMのPMSF)に再懸濁した。細胞を一度凍結/解凍した後、遠心分離をして細胞残屑を除去した。上清を回収し、氷上で保管した。
発酵開始からおよそ48時間の時点で、DW719のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性は49活性/OD260であったのに対し、CMP1237の活性は34活性/OD260であった。
Keioコレクション(Baba et al.2006.Mol.Syst.Biol.2:2006.0008)の株JW1326からP1可溶化液を調製し、これを使用してCMP1133(internal docket #40109)に形質導入した。P1可溶化液を調製し、Ausubel,et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley及びSons,Incに記載の方法に従って使用した。コロニーをLB+カナマイシン10mg/Lで選択し、CMP1180と名づけた。P1形質導入により最大で100kBまでのDNAを形質導入することができる。ynaJがFNRとごく近接していることから(図53)、ynaJにおける変異を選択する場合、可溶化液を調製した株由来のFNRをコードしているDNAも有している可能性が高い。Keioコレクションは、機能的FNRを有するK−12株で構築された。すなわち、FNRがタンパク質中に終止コドンを含有する大腸菌(E. coli)BL21とは異なる(Studier et al.2009.J.Mol.Biol.394:653−680)。プライマーCMP51(5’−CAG GTA ATG CAT TAC GGC CAA CTG−3’)及びCMP52(5’−caggctgtacgctggctgatgac−3’)によりCMP1180からFNRを増幅させ、CMP53(5’−ATG ATC CCG GAA AAG CGA ATT ATA CG−3’)により配列決定した。この配列は、機能的FNRの対立遺伝子を保有している可能性があった。製造元により推奨されるプロトコルを用い、株CMP1189からカナマイシンマーカーを除去した(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)。電気穿孔法により、プラスミド対pMCM82(米国特許第2011/0159557号)及びpDW72(米国特許出願第13/283,564号を参照されたい)を導入し、LB+50mg/Lカルベニシリン+50mg/Lスペクチノマイシンで選択した。このようにして得られた株をCMP1191と名づけた。
機能的FNRを有する株の生育は、変異を導入したFNRを有する株を、よく通気を行いフラスコにおいて生育させた場合と同様であった(図54)。撹拌を抑えて酸素濃度を制限させた場合、機能的FNRを有する株の生育はやや遅くなった(図55)。フラスコにおいてよく通気を行った場合、CMP1136(変異型FNR)及びCMP1191(機能的FNR)の比生産量は類似していた(図56)。撹拌を抑えて酸素濃度を制限させた場合、機能的FNRを有する株の比生産量は増加した(図57)。
テンプレートとして株MG1655 ΔackA−pta::Cm(米国特許第7,745,184号、2010年6月29日出願を参照されたい)を使用し、及びプライマーackACF(5’−gtgcaaattcacaactcagcgg−3’)及びptaCR(5’−CAC CAA CGT ATC GGG CAT TGC−3’)を使用してPCRを行い、クロラムフェニコールマーカーにより破壊されたackA−pta遺伝子を含有しているDNA断片を増幅させた。得られたPCR産物を、製造元(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)の推奨する通りに組み換え反応に使用し、CMP258株のackA−pta座に組み入れた(internal docket #31588)。LB+5μg/mlのクロラムフェニコールにてコロニーを選択した。コロニーを1つ選択し、MD10−491と名づけた。この株からP1可溶化液を調製し、これを使用してCMP1133に形質導入した。株に電気穿孔法によりpCP20を導入して、クロラムフェニコールマーカーを除去し(Datsenko及びWanner.2000.PNAS 97:6640〜5)、30℃下でLB+50ug/mlのカルベニシリンで2つのコロニーを選択し、次に、これらのコロニーを、42℃下でLBプレートに再画線した。これらのプレートからクロラムフェニコール感受性のコロニーを選択し、MD12−746と名づけた。
MD12−746とDW719とを比較したところ、イソプレンの比生産量の増加が観察された(図58〜59)。
本実施例は、下記の手法により実施した、15L発酵物のマイクロアレイ解析を詳述する。
このゲノム・ワイドな翻訳試験には、株CMP457及びMCM1020を使用した。電気穿孔法によりプラスミドpTrcHis2B(Invitrogen,Carlsbad,CA)及びpCL1920(米国特許出願公開番号第2009/0203102号を参照されたい。この出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。)を株CMP258(国際公開第2011/058188号を参照されたい。この出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。)に導入し、LB+50mg/Lのスペクチノマイシン+50mg/Lのカルベニシリンでコロニーを選択して、株MCM1020を構築した。
データを解析したところ、イソプレン生産株において、タンパク質の加水分解阻害物質iraMが誘導されていたことが判明した(図60)。
MD11−610:iraMの前に存在するPL.6プロモータプライマーMQ10−127F(5’−GTT AAC TGG TTG CAG TCA CCT GGA GGC ACC AGG CAC CGC ATC AAC AAA GTT CAT TTG TAA AAA TGG AGA TAA TTG TGT AGG CTG GAG CTG CTT C−3’)及びMQ10−127R(5’−TCG TGT CAA TTA CTA TCC ACT TCA TGT TTT TTT ACC TCC TTT GCA CCT TCA TGG TGG TCA GTG CGT CCT GCT GAT GTG CTC AGT ATC ACC GCC AGT GGT ATT TAT GTC AAC ACC GCC AGA GAT AAT TTA TCA CCG CAG ATG GTT ATC TGT ATG TTT TTT ATA TGA ATT CAT ATG AAT ATC CTC CTT A−3’)と、テンプレートとしてプラスミドpKD3(Datsenko及びWanner.2000.PNAS97:6640−5)とを使用し、PCR産物(#1)を生成した。PCR産物#2は、プライマーMQ10−128F(5’−ATG AAG TGG ATA GTA ATT GAC ACG A−3’)及びMQ11−128R(5’−GCA TTC TTT CAA TAG CTT TGC TTT CTT CAA CGT CTT TTT TGC AAA GGT GGT AAG CAC ATT TTA TTT TCT TAG TCA TTA CTT GAG CCC ATA TGG GCA TAT T−3’)と、テンプレートとしてBL21の染色体DNA(Novagen)を使用して生成した。プライマーMQ10−127F及びMQ11−128R−term(5’−GCATTCTTTCAATAGCTTTGCTTTCTTCAACGTCTTTTTTGCAAAGGTGGTAAGCACATTTTATTTTCTTAGTCAAGTCAAAAGCCTCCGGTCGGAGGCTTTTGACTTTACTTGAGCCCATATGGGCATATT−3’)を使用し、PCR#1及びPCR#2フラグメントの混合物をテンプレートとして使用して、第3のPCR産物(PCR#3)を増幅させた。このようにして得られたPCR産物を、製造元のプロトコルに従って、組み換え反応に使用して(GeneBridges,Heidelberg,Germany)株CMP451(BL21 pgl+PL.2 mKKDyI GI1.2 gltA)のキル座に組み込み、株MD11−597を作製した。クロラムフェニコールマーカーをpCP20により除去し、株MD11−604を作製した。株MD11−604に、電気穿孔法によりプラスミドpMCM82及びpDW166を導入し、形質転換を行った。コロニーをLB+50μg/mLのカルベニシリン+50μg/mLのスペクチノマイシンで単離し、MD11−610と名づけた。
acrAは、多剤排出ポンプacrAB−TolCの構成要素である。この複合体は、溶媒、染料及び洗剤に対する耐性と関係する。直感的には、このポンプを過剰発現させると、ブタノール又はイソプレンなどの化学物質によるストレスに対する耐性が上昇し得る。直感には反するが、acrAの変異により、ブタノール耐性が上昇すると考えられている(Atsumi et al.,2010,Mol Sys Biol.,6:449)。
L.グレイ(L. grayi)mvaE:
Claims (55)
- イソプレンの生産性を上昇させることのできる細菌の組み換え細胞であって、
(a)クエン酸シンターゼ、
(b)ホスホトランスアセチラーゼ、
(c)酢酸キナーゼ、及び
(d)乳酸デヒドロゲナーゼ、
の酵素活性を調節することで、イソプレン生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されており、前記調節において、(a)の活性が減弱されており、(b)の活性が減弱されており、(c)の活性が減弱されており、及び(d)の活性が減弱されていることを特徴とし、
前記細胞は、
(i)メバロン酸経路全体のポリペプチドをコードしている核酸の1つ以上、ここで、前記核酸は、メバロン酸経路上流のポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸(当該核酸は、(a)L.グレイ(L. grayi)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子、(b)E.フェシウム(E. faecium)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子、(c)E.ガリナラム(E. gallinarum)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子、(d)E.カセリフラブス(E. casseliflavus)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子、又は(e)E.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子を含む)を含む、及び
(ii)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸の1つ
を更に含み、
かつイソプレンに取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されていないイソプレン生産細胞と比較してイソプレンの生産量が増加している、
細胞。 - メバロン酸の生産性を上昇させることのできる細菌の組み換え細胞であって、
(a)クエン酸シンターゼ、
(b)ホスホトランスアセチラーゼ、
(c)酢酸キナーゼ、及び
(d)乳酸デヒドロゲナーゼ、
の酵素活性を調節することで、メバロン酸生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されており、前記調節において、(a)の活性が減弱されており、(b)の活性が減弱されており、(c)の活性が減弱されており、及び(d)の活性が減弱されていることを特徴とし、
前記細胞は、メバロン酸経路上流のポリペプチドをコードしている核酸(当該核酸は、(a)L.グレイ(L. grayi)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子、(b)E.フェシウム(E. faecium)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子、(c)E.ガリナラム(E. gallinarum)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子、(d)E.カセリフラブス(E. casseliflavus)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子、又は(e)E.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子を含む)の1つ以上を更に含み、
かつメバロン酸の生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されていないメバロン酸生産細胞と比較してメバロン酸の生産量が増加している、
細胞。 - イソプレノイドの生産性を上昇させることのできる細菌組み換え細胞であって、
(a)クエン酸シンターゼ、
(b)ホスホトランスアセチラーゼ、
(c)酢酸キナーゼ、及び
(d)乳酸デヒドロゲナーゼ、
の酵素活性を調節することで、イソプレノイドの生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作されており、前記調節において、(a)の活性が減弱されており、(b)の活性が減弱されており、(c)の活性が減弱されており、及び(d)の活性が減弱されていることを特徴とし、
前記細胞は、
(i)メバロン酸経路全体のポリペプチドをコードしている核酸の1つ以上、ここで、前記核酸は、メバロン酸経路上流のポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸(当該核酸は、(a)L.グレイ(L. grayi)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子、(b)E.フェシウム(E. faecium)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子、(c)E.ガリナラム(E. gallinarum)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子、(d)E.カセリフラブス(E. casseliflavus)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子、又は(e)E.フェカリス(E. faecalis)由来のmvaE遺伝子及びmvaS遺伝子を含む)を含む、
及び
(ii)ポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードしている1つの核酸
を更に含み、
かつイソプレノイドの生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作をされていないイソプレノイド生産細胞と比較してイソプレノイドの生産量が増加している、
細胞。 - 前記メバロン酸経路全体のポリペプチドをコードしている核酸の1つ以上が、メバロン酸経路下流に由来するポリペプチドをコードしている核酸の1つ以上を更に含み、前記メバロン酸経路下流に由来するポリペプチドをコードしている核酸が、MVK、PMK及びMVD核酸を含む、請求項1または3に記載の細胞。
- 前記MVKが、M.マゼイ(M. mazei)・メバロン酸キナーゼ、M.バートニイ(M. burtonii)・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス(Lactobacillus)・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス(Streptococcus)・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス(Streptomyces)・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセスCL190(Streptomyces CL190)メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される、請求項4に記載の細胞。
- 前記細胞が、DXP経路の1種以上のポリペプチド(one or DXP pathway polypeptides)をコードしている1つ以上の異種核酸を更に含む、請求項1または3に記載の細胞。
- 前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、クズ属(Pueraria)又はハコヤナギ属(Populus)、又は交雑種ウラジロハコヤナギ(Populus alba)xヤマナラシ(Populus tremula)、又はこれらの変異体(variant)に由来のポリペプチドである、請求項1に記載の細胞。
- 前記細胞が、グラム陽性細菌細胞、ストレプトマイセス(Streptomyces)細胞、グラム陰性細菌細胞、大腸菌(Escherichia cells)細胞、又はパントエア(Pantoea)細胞である、請求項1、2、および3のいずれか一項に記載の細胞。
- 内在性クエン酸シンターゼ遺伝子の活性を減少させることにより、前記クエン酸シンターゼの活性を調節する、請求項1、2、および3のいずれか一項に記載の細胞。
- 染色体上の、前記内在性クエン酸シンターゼ遺伝子を、NADH非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子で置き換えることにより、前記クエン酸シンターゼの活性を調節する、請求項9に記載の細胞。
- 前記NADH非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子が、枯草菌(Bacillus subtilis)に由来する、請求項10に記載の細胞。
- 前記クエン酸シンターゼの活性が、前記内在性クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって調節される、請求項9に記載の細胞。
- 前記クエン酸シンターゼの活性の減少が、クエン酸シンターゼの発現を減少させていない微生物と比較してより多くの炭素がメバロン酸経路に取り込まれることにより生じる、請求項9〜12のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記ホスホトランスアセチラーゼ及び/又は前記酢酸キナーゼの活性が、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び/又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節される、請求項1、2、および3のいずれか一項に記載の細胞。
- 内在性ホスホトランスアセチラーゼ及び/又は内在性酢酸キナーゼの遺伝子発現が、前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び/又は前記内在性酢酸キナーゼ遺伝子の欠失により減弱される、請求項14に記載の細胞。
- 前記細胞の酢酸の生成量が、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び/又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して減少している、請求項14に記載の細胞。
- 前記内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び/又は前記内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び/又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸経路への炭素原子の取り込みが増加する、請求項14〜16のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記乳酸デヒドロゲナーゼの活性が、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節される、請求項1、2、および3のいずれか一項に記載の細胞。
- 内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が、前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠失させることによって減弱させられる、請求項18に記載の細胞。
- 前記細胞の乳酸の生成量が、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して減少している、請求項18又は19に記載の細胞。
- 前記内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸経路への炭素の取り込みが増加する、請求項18〜20のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、更に、(e)NADP依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を調節するよう遺伝子操作されており、前記調節において(e)の活性が増加されており、前記NADP依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することで、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する、請求項1、2、および3のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記NADP依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性が、内在性NADP依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることにより調節される、請求項22に記載の細胞。
- 前記内在性NADP依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が、前記内在性NADP依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータを、常時発現型合成プロモータと置き換えることにより増加する、請求項23に記載の細胞。
- 前記細胞が、NADP依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む、請求項22又は23に記載の細胞。
- 前記細胞のピルビン酸の生成量が、NADP依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して増加している、請求項22〜25のいずれか一項に記載の細胞。
- NADP依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を増加させることで、NADP依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子発現を増加させていない微生物と比較して、メバロン酸経路への炭素の取り込みが増加する、請求項22〜26のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、更に、(f)ピルビン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を調節するよう遺伝子操作されており、前記調節において(f)の活性が増加されており、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することで、炭素の取り込みがメバロン酸生産に指向する、請求項1、2、および3のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が、(a)ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(E1)、(b)ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び(c)ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼから構成されるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のそれぞれのポリペプチドをコードする遺伝子の1種以上の活性を増加させることで調節される、請求項28に記載の細胞。
- 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性が、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節される、請求項29に記載の細胞。
- 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を構成するポリペプチドをコードする遺伝子の1種以上が、内在性遺伝子である、請求項29に記載の細胞。
- 前記内在性遺伝子のプロモータの1種以上を、1種以上の常時発現型合成プロモータで置き換えることにより、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を構成するポリペプチドをコードする内在性遺伝子の1種以上の発現を増加させる、請求項31に記載の細胞。
- 前記細胞が、(a)ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(E1)、(b)ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ及び(c)ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群から選択される1種以上のポリペプチドをコードしている1つ以上の異種核酸を更に含む、請求項28又は29に記載の細胞。
- 内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリプレッサーの活性が、前記内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子を欠失させることにより減弱させられる、
請求項30に記載の細胞。 - 前記細胞のアセチルCo−A生産量が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節していない微生物と比較して増加している、請求項28〜34のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性の調節により、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現を調節していない微生物と比較してより多くの炭素がメバロン酸経路に取り込まれる、請求項28〜35のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、更に、(g)ホスホグルコノラクトナーゼの酵素活性を調節するよう遺伝子操作されており、前記調節において(g)の活性が減弱されており、炭素の取り込みが、前記ホスホグルコノラクトナーゼ(PGL)の活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項1、2、および3のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記ホスホグルコノラクトナーゼ(PGL)の活性が、内在性ホスホグルコノラクトナーゼ(PGL)遺伝子の活性を減弱させることで調節される、請求項37に記載の細胞。
- 前記ホスホグルコノラクトナーゼ(PGL)の活性が、前記内在性ホスホグルコノラクトナーゼ(PGL)遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによって減弱させられる、請求項38に記載の細胞。
- 内在性ホスホグルコノラクトナーゼ(PGL)の活性が、前記内在性ホスホグルコノラクトナーゼ(PGL)遺伝子の欠失により減弱させられる、請求項39に記載の細胞。
- 前記細胞が、更に、(h)ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性を調節するよう遺伝子操作されており、前記調節において(h)の活性が減弱されており、炭素の取り込みが、前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を調節することでメバロン酸生産に指向する、請求項1、2、および3のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の活性を減弱させることで調節される、請求項41に記載の細胞。
- 前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のプロモータを、常時低発現型合成プロモータと置き換えることによって減弱させられる、請求項42に記載の細胞。
- 内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性が、前記内在性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を欠失させることで減弱させられる、請求項42に記載の細胞。
- イソプレンの生産方法であって、(a)イソプレン生産に好適な培養条件下で請求項1、および4〜44のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程と、(b)前記イソプレンを生産する工程と、を含む、方法。
- メバロン酸の生産方法であって、(a)メバロン酸生産に好適な培養条件下で請求項2、および8〜44のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程と、(b)前記メバロン酸を生産する工程と、を含む、方法。
- 前記クエン酸シンターゼの活性が、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子プロモータを、常時低発現型合成プロモータと置き換えることにより調節され、前記乳酸デヒドロゲナーゼの活性が、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節され、及び前記酢酸キナーゼの活性が、内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより調節される、請求項1、2、および3のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記イソプレノイドが、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン(sequiterpenes)及びポリテルペンからなる群から選択される、請求項3〜6および8〜44のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記イソプレノイドが、セスキテルペンである、請求項48に記載の細胞。
- 前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン(terpindene)及びバレンセンからなる群から選択される、請求項48に記載の細胞。
- イソプレノイドの生産方法であって、(a)イソプレノイド生産に好適な培養条件下で請求項3〜6、8〜44、および48〜50のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程と、(b)前記イソプレノイドを生産する工程と、を含む、方法。
- (c)前記イソプレンを回収する工程、を更に含む、請求項45に記載の方法。
- (c)前記メバロン酸を回収する工程、を更に含む、請求項46に記載の方法。
- (c)前記イソプレノイドを回収する工程、を更に含む、請求項51に記載の方法。
- 前記細胞が、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ(IDI)のポリペプチドをコードしている核酸を更に1種以上含む、請求項1または3に記載の細胞。
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