JP2017113031A5 - - Google Patents
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Claims (25)
- 2つ以上の核酸をアセンブルするためのインビトロの方法であって、
(a)第1の核酸を第1のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、前記第1のヌクレアーゼ剤が、第1の標的部位で前記第1の核酸を切断して、第1のダイジェストされた核酸を産生する、接触させることと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸を、第2の核酸、第1の結合体オリゴ、エキソヌクレアーゼ、並びに必要に応じて、1つ以上のさらなる核酸及び/又は1つ以上のさらなる結合体オリゴと接触させることであって、前記第1の結合体オリゴは約50bp〜約400bpである、接触させることと、
(c)前記結合体オリゴを、前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸、並びに必要に応じて、前記1つ以上のさらなる核酸及び/又は前記1つ以上のさらなる結合体オリゴとアセンブルして、アセンブルされた核酸を形成することであって、ここで、アセンブルされる核酸はオーバーラップ配列を有し、前記オーバーラップ配列は互いにアニーリングし、互いの伸長の鋳型として機能する、形成することと、
を含む、方法。 - 2つ以上の2本鎖核酸をシームレスにアセンブルするためのインビトロの方法であって、
(a)第1の核酸を第1のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、前記第1のヌクレアーゼ剤が、第1の標的部位で前記第1の核酸を切断して、第1のダイジェストされた核酸を産生し、ここで、前記切断は、シームレスアセンブリが生じる前記第1の核酸の末端から2本鎖断片を除去する、接触させることと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸を、第2の核酸、第1の結合体オリゴ、及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、前記結合体オリゴは約50bp〜約400bpの直鎖状2本鎖DNAであり、かつ
(i)前記第1のダイジェストされた核酸に相補的である第1の相補的配列と、
(ii)スペーサーと、
(iii)前記第2の核酸に相補的である第2の相補的配列と
を含み、前記スペーサーは、前記断片と同一である配列を含み、
ここで、前記第1の相補的配列と、前記断片と同一である前記配列との間に核酸塩基は存在せず、前記第2の相補的配列と、前記断片と同一である前記配列との間に核酸塩基は存在せず、
ここで、前記エキソヌクレアーゼは、前記第1及び第2の相補的配列を曝露する、接触させることと、
(c)前記結合体オリゴを、前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸とアセンブルすることであって、ここで、アセンブリによって前記断片が再構築される、アセンブルすることと
を含む、方法。 - 工程(c)における前記アセンブルすることが、
(i)前記結合体オリゴの前記第1の相補的配列を前記第1のダイジェストされた核酸に、そして、前記結合体オリゴの前記第2の相補的配列を前記第2の核酸にアニーリングすることであって、必要に応じて、さらに、前記第1のダイジェストされた核酸及び/又は前記第2の核酸の3’末端を伸長することを含む、アニーリングすることと、
(ii)前記結合体オリゴを、前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸にライゲーションすることとを含む、請求項2に記載の方法。 - 工程(a)が、
(i)前記第2の核酸を第2のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、ここで、前記第2のヌクレアーゼ剤が、第2の標的部位で前記第2の核酸を切断して、前記結合体オリゴの前記第2の相補的配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第2のダイジェストされた核酸を産生し、前記第1のダイジェストされた核酸は、前記第2のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、接触させること;又は
(ii)前記第2の核酸を制限酵素と接触させることであって、ここで、前記制限酵素は、前記第2の核酸を切断して、前記結合体オリゴの第2の相補的配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第2のダイジェストされた核酸を産生し、前記第1のダイジェストされた核酸は、前記第2のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、接触させること
をさらに含む、請求項2又は3に記載の方法。 - (I)前記結合体オリゴの前記第1の相補的配列が、15〜120の相補的塩基であり、前記結合体オリゴの前記第2の相補的配列が、15〜120の相補的塩基であり、
必要に応じて、ここで、前記結合体オリゴの前記第1の相補的配列が、20〜80の相補的塩基であり、前記結合体オリゴの前記第2の相補的配列が、20〜80の相補的塩基であり;及び/又は
(II)前記断片が少なくとも20bpであり;及び/又は
(III)前記スペーサーが、約20bp〜約120bpであり;及び/又は
(IV)前記結合体オリゴが、約100bp〜約300bpである、
請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1の結合体オリゴが、同じ反応において、又は連続的に、前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸にアセンブルされる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも3つの核酸がアセンブルされる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 2つ以上の核酸をアセンブルするためのインビトロの方法であって、
(a)第1の核酸を少なくとも第1のヌクレアーゼ剤及び第2のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、前記第1のヌクレアーゼ剤は、第1の標的部位で前記第1の核酸を切断し、そして、前記第2のヌクレアーゼ剤は第2の標的部位で前記第1の核酸を切断して、第1のダイジェストされた核酸を産生する、接触させることと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸を、第1の結合体オリゴ、第2の核酸、第2の結合体オリゴ、及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、
前記第1の結合体オリゴ及び/又は前記第2の結合体オリゴが、約50bp〜約400bpであり、
前記第1の結合体オリゴが、
(i)前記第1のダイジェストされた核酸に相補的である第1の相補的配列と、
(ii)前記第2の核酸に相補的である第2の相補的配列と、を含み、
前記第2の結合体オリゴが、
(i)前記第2の核酸に相補的である第1の相補的配列と、
(ii)前記第1のダイジェストされた核酸に相補的である第2の相補的配列と、を含み、
前記エキソヌクレアーゼが、前記第1の結合体オリゴ、前記第2の結合体オリゴ、前記第1のダイジェストされた核酸及び第2の核酸の相補的配列を曝露する、接触させることと、
(c)前記第1のダイジェストされた核酸、前記第1の結合体オリゴ、前記第2の核酸、及び前記第2の結合体オリゴをアセンブルすることと、を含む、方法。 - 工程(c)における前記アセンブルすることが、
(i)前記第1の結合体オリゴの前記第1の相補的配列を前記第1のダイジェストされた核酸にアニーリングすること、前記第1の結合体オリゴの前記第2の相補的配列を前記第2の核酸にアニーリングすること、前記第2の結合体オリゴの前記第1の相補的配列を前記第2の核酸にアニーリングすること、及び前記第2の結合体オリゴの前記第2の相補的配列を前記第1のダイジェストされた核酸にアニーリングすることであって、
ここで、必要に応じて、前記アニーリングされた相補的配列の3’末端を伸長することをさらに含む、アニーリングすることと、
(ii)前記第1の結合体オリゴを前記第1のダイジェストされた核酸にライゲーションすること、前記第1の結合体オリゴを前記第2の核酸にライゲーションすること、前記第2の核酸を前記第2の結合体オリゴにライゲーションすること、及び前記第2の結合体オリゴを前記第1のダイジェストされた核酸にライゲーションすることと
を含む、請求項8に記載の方法。 - 前記2つ以上の核酸が、2本鎖核酸であり、前記第1のヌクレアーゼ剤は、前記第1の核酸を第1の標的部位で切断して第1の2本鎖破断を産生し、前記第2のヌクレアーゼ剤は、前記第1の核酸を第2の標的部位で切断して第2の2本鎖破断を産生する、請求項8又は9に記載の方法。
- (I)前記第1の結合体オリゴが、直鎖状2本鎖DNAであり、及び/又は前記第2の結合体オリゴが、直鎖状2本鎖DNAである;及び/又は
(II)前記第1の結合体オリゴの前記第1の相補的配列及び前記第2の相補的配列が、それぞれ15〜120の相補的塩基であり、及び/又は前記第2の結合体オリゴの前記第1の相補的配列及び前記第2の相補的配列が、それぞれ15〜120の相補的塩基であり、必要に応じて、ここで、前記第1の結合体オリゴの前記第1の相補的配列及び前記第2の相補的配列が、それぞれ20〜80の相補的塩基であり、及び/又は前記第2の結合体オリゴの前記第1の相補的配列及び前記第2の相補的配列が、それぞれ20〜80の相補的塩基である、
請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1の結合体オリゴが、約50bp〜約400bpの直鎖状2本鎖DNAであり、及び/又は前記第2の結合体オリゴが、約50bp〜約400bpの直鎖状2本鎖DNAであり、
ここで、必要に応じて、前記第1の結合体オリゴが、約100bp〜約300bpであり、及び/又は前記第2の結合体オリゴが、約100bp〜約300bpである、
請求項8〜11のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1の結合体オリゴが、前記第1の相補的配列及び前記第2の相補的配列の間にスペーサーをさらに含み、及び/又は前記第2の結合体オリゴが、前記第1の相補的配列及び前記第2の相補的配列の間にスペーサーをさらに含み、
ここで、必要に応じて、
(I)前記第1の結合体オリゴの前記スペーサー、前記第2の結合体オリゴの前記スペーサー、又は両方が、アセンブリの成功を確認するための、薬物耐性遺伝子、レポーター遺伝子、検出のための配列、PCRに好適な配列、又は1つ以上の制限酵素部位を含む;及び/又は
(II)前記第1の結合体オリゴの前記スペーサーが、約20bp〜約120bpであり、及び/又は前記第2の結合体オリゴの前記スペーサーが、約20bp〜約120bpである、
請求項8〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 同じ反応において、又は連続的に、前記第1のダイジェストされた核酸が前記第1の結合体オリゴにアセンブルされ、前記第1の結合体オリゴが、前記第2の核酸にアセンブルされ、前記第2の核酸が、前記第2の結合体オリゴにアセンブルされ、前記第2の結合体オリゴが、前記第1のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、請求項8〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のダイジェストされた核酸が、前記第2の核酸にシームレスにアセンブルされる、請求項8〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のヌクレアーゼ剤及び/又は前記第2のヌクレアーゼ剤による前記切断が、シームレスアセンブリが生じる前記第1の核酸の末端から2本鎖断片を除去し、
ここで、前記第1の結合体オリゴは、前記第1の相補的配列及び前記第2の相補的配列の間にスペーサーをさらに含むか、又は前記第2の結合体オリゴは、前記第1の相補的配列及び前記第2の相補的配列の間にスペーサーをさらに含み、
ここで、前記スペーサーは、前記断片と同一である配列を含み、ここで、前記第1の相補的配列と、前記断片と同一である前記配列との間に核酸塩基は存在せず、前記第2の相補的配列と、前記断片と同一である前記配列との間に核酸塩基は存在しない、請求項15に記載の方法。 - 工程(a)が、前記第2の核酸を第3のヌクレアーゼ剤と接触させることをさらに含み、ここで、前記第3のヌクレアーゼ剤は、第3の標的部位で前記第2の核酸を切断して第2のダイジェストされた核酸を産生する、請求項8〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)が、前記第2の核酸を第3のヌクレアーゼ剤及び第4のヌクレアーゼ剤と接触させることをさらに含み、前記第3のヌクレアーゼ剤は第3の標的部位で前記第2の核酸を切断し、前記第4のヌクレアーゼ剤は第4の標的部位で前記第2の核酸を切断して、第2のダイジェストされた核酸を産生する、請求項8〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の結合体オリゴが、1本鎖DNAである、請求項1及び8〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のヌクレアーゼ剤が、Casタンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のヌクレアーゼ剤が、Casタンパク質及びgRNAを含み、前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質であり、前記gRNAが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復(CRISPR)RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)をコードする核酸配列を含み、前記第1のヌクレアーゼ剤は、プロトスペーサー近接モチーフ(PAM)配列に直ぐ隣接している標的部位を標的とし、
必要に応じて、前記Cas9タンパク質は、RuvCドメインと、HNHドメインと、を含み、これらのうちの少なくとも1つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、請求項20に記載の方法。 - (I)前記第1の核酸、前記第2の核酸、又は両方の核酸が、約20kb〜約400kbの長さのベクターである;及び/又は
(II)アセンブルされた核酸が、30kb〜1Mbの長さである、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1の核酸、前記第2の核酸、又は両方の核酸が、少なくとも10kbである、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- (I)前記第1の核酸、前記第2の核酸、又は両方の核酸が、細菌人工染色体を含む;及び/又は
(II)前記第1の核酸、前記第2の核酸、又は両方の核酸が、ヒトDNA、ゲッ歯類DNA、合成DNA、又はこれらの組み合わせを含む;及び/又は
(III)前記第1の核酸が、第1の細菌人工染色体を含み、前記第2の核酸が、第2の細菌人工染色体を含み、目的の遺伝子が、前記第1及び第2の細菌人工染色体に及んでおり、前記アセンブリは、前記目的の遺伝子の配列を形成する、
請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。 - (I)前記第1の核酸が、環状核酸又は直鎖状核酸である;及び/又は
(II)前記アセンブルされた核酸が、環状核酸又は直鎖状核酸である、
請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
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