JP2017090132A - 心筋トロポニンｉ測定試薬及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】心筋トロポニンＩの測定において、各種試料間の測定値の乖離を抑制すること。【解決手段】心筋トロポニンＩに対する抗体、及びポリアニオン性高分子を含む、心筋トロポニンＩ測定試薬、並びにポリアニオン性高分子の存在下において、心筋トロポニンＩに対する抗体を用いて心筋トロポニンＩ量を測定することを含む、心筋トロポニンＩの測定方法。【選択図】なし

Description

本発明は、心筋トロポニンＩ測定試薬及び方法に関する。

心筋トロポニンＩは、心筋収縮の調節に関与する心筋トロポニン複合体を構成する３種のサブユニットの一つである。心筋トロポニンＩは、心臓において特異的に発現しており、心筋細胞が傷害されると血中に放出されるため、心筋梗塞の血中診断マーカーとして利用されている。

心筋トロポニンＩの測定に関連する技術として、以下が報告されている。
特許文献１には、所定のアニオン性界面活性剤（１個のスルホナート基を有するアルキル基）を含むマトリクスを利用することにより心筋トロポニンＩを安定化できることが記載されている。
特許文献２には、心筋トロポニンＩの免疫学的測定において２価の陽イオンを利用できることが記載されている。

また、心筋トロポニンＩの測定に関するものではないが、タンパク質の免疫学的測定に関連して、以下が報告されている。
特許文献３には、抗原抗体反応に伴う非特異的反応を抑制するため、血清にポリアニオンを加えることが記載されている。
特許文献４には、間接免疫凝集測定における非特異的反応を抑制するため、水酸基の一部が硫酸エステル基で置換されたデキストラン化合物を利用できることが記載されている。

国際公開第２００６／１１６００５号 国際公開第２０１２／１１５２２１号 特開昭５７−１８２１６９号公報 特許第３３２７０７０号公報

心筋トロポニンＩは心筋梗塞の診断に利用されているが、心筋トロポニンＩの測定値は、血液試料の種類によって異なる値を示すことがある。例えば、血清を血液試料として用いた場合の心筋トロポニンＩの測定値、及び血漿を血液試料として用いた場合の心筋トロポニンＩの測定値は必ずしも同一の値を示さないことが知られている。また医療の現場では、種々の抗凝固剤（例、ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸）を含む採血管が血漿の調製に利用されているが、血漿中の心筋トロポニンＩの測定値は、血漿の調製に用いた抗凝固剤の種類によって異なる値を示すことがある。したがって、心筋トロポニンＩ量を測定する心筋梗塞の診断においては、心筋トロポニンＩのカットオフ値として血液試料の種類によらない一定の値を採用し難い場合があるという課題がある。

また、急性心筋梗塞に対する処置を早期に行うことは生命予後の改善に重要であることから、急性心筋梗塞の診断には迅速性が要求される。したがって、急性心筋梗塞の診断には、血餅の凝集反応及び血餅の除去という時間を消費する処理を要する血清よりも、かかる処理を要しない血漿が汎用されている。しかし、上述したとおり、血漿の調製に用いた抗凝固剤の種類によって心筋トロポニンＩの測定値は異なる値を示すことがある。したがって、心筋トロポニンＩ量を測定する心筋梗塞の診断においては、血漿の調製に用いるべき抗凝固剤の種類、ひいては採血管の種類が指定されているのが通常である。しかしながら、心筋トロポニンＩ量を採血管の種類によらず一定の値として測定できれば、採血管の種類の指定が不要になる点で汎用性に優れる上、指定外の採血管の誤用といった不注意に伴う問題も回避できることから、望ましい。したがって、血漿の調製に用いるべき採血管の種類によらず、心筋トロポニンＩ量を一定の値として測定できる方法の開発が望まれている。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ポリアニオン性高分子の存在下で心筋トロポニンＩ量を測定することにより、各種試料間における心筋トロポニンＩ量の測定値の乖離を抑制できること、ひいては上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１１］を提供する。
［１］心筋トロポニンＩに対する抗体、及びポリアニオン性高分子を含む、心筋トロポニンＩ測定試薬。
［２］ポリアニオン性高分子が、スルフェート基、スルホナート基、及びカルボキシラート基からなる群より選ばれる基を含む、［１］記載の試薬。
［３］前記試薬が、前記抗体及び前記高分子を含有する溶液を含む、［１］又は［２］記載の試薬。
［４］前記溶液中の前記高分子の濃度が０．０６ｍｇ／ｍＬ以上８５ｍｇ／ｍＬ以下である、［３］記載の試薬。
［５］前記抗体が固相化抗体である、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の試薬。
［６］心筋トロポニンＩに対する別の抗体を更に含む、［１］〜［５］のいずれか一つに記載の試薬。
［７］前記別の抗体が標識化抗体である、［６］記載の試薬。
［８］ポリアニオン性高分子の存在下において、心筋トロポニンＩに対する抗体を用いて血液試料中の心筋トロポニンＩ量を測定することを含む、心筋トロポニンＩの測定方法。
［９］血液試料が血漿である、［８］記載の方法。
［１０］以下（１）〜（３）を含む方法である、［８］又は［９］記載の方法：
（１）心筋トロポニンＩに対する抗体、ポリアニオン性高分子、及び血液試料の混合液を調製すること；
（２）混合液をインキュベートすること；及び
（３）混合液において心筋トロポニンＩ量を測定すること。
［１１］前記混合液における前記高分子の濃度が０．０５ｍｇ／ｍＬ以上５．０ｍｇ／ｍＬ以下である、［１０］記載の方法。

本発明によれば、各種試料間における心筋トロポニンＩ量の測定値の乖離を抑制できる。したがって、本発明には、心筋トロポニンＩ量を測定する心筋梗塞の診断において、心筋トロポニンＩのカットオフ値として血液試料の種類によらない一定の値を採用し易いという利点がある。また、本発明には、血漿の調製に用いるべき採血管の種類によらず、心筋トロポニンＩ量を一定の値として測定できるという利点がある。

図１は、実施例１に記載される試薬Ａを用いた、デキストラン硫酸ナトリウム非存在下の心筋トロポニンＩの測定における血清と血漿の発光強度の相関性を示すグラフである。（ａ）血清とヘパリン血漿の発光強度の相関性；（ｂ）血清とＥＤＴＡ血漿の発光強度の相関性；及び（ｃ）血清とクエン酸血漿の発光強度の相関性（図２〜１１においても同様）。直線の傾きが１に近いほど、血清と血漿の測定値の差がより小さく、血清と血漿の測定値の乖離がより抑制されていることを示す（図２〜１１においても同様）。 図２は、０．７７ｍｇ／ｍＬのデキストラン硫酸ナトリウムを含有する抗体結合粒子溶液（試薬Ａ）を用いた心筋トロポニンＩの測定における血清と血漿の発光強度の相関性を示すグラフである。 図３は、１．５５ｍｇ／ｍＬのデキストラン硫酸ナトリウムを含有する抗体結合粒子溶液（試薬Ａ）を用いた心筋トロポニンＩの測定における血清と血漿の発光強度の相関性を示すグラフである。 図４は、実施例１に記載される試薬Ｂを用いた、デキストラン硫酸ナトリウム非存在下の測定における血清と血漿の発光強度の相関性を示すグラフである。 図５は、０．５ｍｇ／ｍＬのデキストラン硫酸ナトリウムを含有する抗体結合粒子溶液（試薬Ｂ）を用いた心筋トロポニンＩの測定における血清と血漿の発光強度の相関性を示すグラフである。 図６は、１．０ｍｇ／ｍＬのデキストラン硫酸ナトリウムを含有する抗体結合粒子溶液（試薬Ｂ）を用いた心筋トロポニンＩの測定における血清と血漿の発光強度の相関性を示すグラフである。 図７は、２．０ｍｇ／ｍＬのデキストラン硫酸ナトリウムを含有する抗体結合粒子溶液（試薬Ｂ）を用いた心筋トロポニンＩの測定における血清と血漿の発光強度の相関性を示すグラフである。 図８は、１．５ｍｇ／ｍＬのデキストラン硫酸ナトリウムを含有する抗体結合粒子溶液（試薬Ｂ）を用いた心筋トロポニンＩの測定における血清と血漿の発光強度の相関性を示すグラフである。 図９は、１．５ｍｇ／ｍＬのポリスチレンスルホン酸ナトリウムを含有する抗体結合粒子溶液（試薬Ｂ）を用いた心筋トロポニンＩの測定における血清と血漿の発光強度の相関性を示すグラフである。 図１０は、１．５ｍｇ／ｍＬのポリアクリル酸ナトリウムを含有する抗体結合粒子溶液（試薬Ｂ）を用いた心筋トロポニンＩの測定における血清と血漿の発光強度の相関性を示すグラフである。 図１１は、１．５ｍｇ／ｍＬのＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムを含有する抗体結合粒子溶液（試薬Ｂ）を用いた心筋トロポニンＩの測定における血清と血漿の発光強度の相関性を示すグラフである。

＜１．本発明の試薬＞
本発明は、心筋トロポニンＩに対する抗体、及びポリアニオン性高分子を含む、心筋トロポニンＩ測定試薬を提供する。

本発明の試薬で測定される心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）は、心筋収縮の調節に関与する心筋トロポニン複合体を構成する３種のサブユニット（トロポニンＩ、Ｃ及びＴ）の一つである。本発明で測定される心筋トロポニンＩは、任意の動物由来の心筋トロポニンＩであるが、好ましくは、哺乳動物（例、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；イヌ、ネコ等の愛玩動物；ブタ、ウシ等の家畜；ウマ、ヒツジ等の使役動物）由来の心筋トロポニンＩであり、より好ましくは霊長類由来の心筋トロポニンＩであり、特に好ましくは、ヒト由来の心筋トロポニンＩである。ヒト由来の心筋トロポニンＩのアミノ酸配列については、例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ６２３０１．１を参照のこと。勿論、ヒト由来の心筋トロポニンＩは、上記番号で参照されるアミノ酸配列からなるものに限定されず、その変異体（例、天然に生じる変異体）であってもよい。また、本発明で測定される心筋トロポニンＩは、遊離型、トロポニンＣ及び／又はトロポニンＴとの複合体の形態、及び自己抗体などの他の分子との複合体の形態のいずれであってもよい。

本発明の試薬に含まれる心筋トロポニンＩに対する抗体は、心筋トロポニンＩのアミノ酸配列の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗体である。心筋トロポニンＩに対する抗体により認識されるエピトープとしては、特異的エピトープを始めとして種々のものが知られている（例、Ｆｉｌａｔｏｖ ｖｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．１９９８，４５（６）：１１７９−１１８７；国際公開第２０１２／１１５２２１号）。したがって、心筋トロポニンＩに対する抗体は、特に限定されず、このような種々のエピトープを認識する抗体であってもよいが、好ましくは、心筋トロポニンＩに対する抗体を用いた心筋トロポニンＩの臨床検査で汎用されているエピトープであってもよい。このようなエピトープとしては、ヒト由来の心筋トロポニンＩのアミノ酸配列において、例えば、２０番目〜６０番目のアミノ酸残基からなるペプチド部分中に見出されるエピトープ（例、２４〜４０番目、又は４１〜４９番目のアミノ酸残基からなるペプチド）、６１番目〜１２０番目のアミノ酸残基からなるペプチド部分中に見出されるエピトープ（例、８６〜９０番目のアミノ酸残基からなるペプチド）、１３０番目〜１５０番目のアミノ酸残基からなるペプチド部分中に見出されるエピトープ、及び１６０番目〜２０９番目のアミノ酸残基からなるペプチド部分中に見出されるエピトープが挙げられる。好ましくは、心筋トロポニンＩに対する抗体は、心筋トロポニンＩ特異的エピトープ（特に、ヒト心筋トロポニンＩ特異的エピトープ）を認識する抗体である。

心筋トロポニンＩに対する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。心筋トロポニンＩに対する抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。心筋トロポニンＩに対する抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。心筋トロポニンＩに対する抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、定常領域欠失抗体（例、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）が挙げられる。心筋トロポニンＩに対する抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。

心筋トロポニンＩに対する抗体は、従前公知の方法を用いて作製することができる。例えば、心筋トロポニンＩに対する抗体は、上記のエピトープを抗原として用いて作製することができる。また、上述したようなエピトープを認識する心筋トロポニンＩに対する多数の抗体が市販されているので、このような市販品を使用することもできる。

心筋トロポニンＩに対する抗体は、固相に固相化されていてもよい。本明細書において、固相に固相化された抗体を、単に固相化抗体ということがある。固相としては、例えば、液相を収容または搭載可能な固相（例、プレート、メンブレン、試験管等の支持体、及びウェルプレート、マイクロ流路、ガラスキャピラリー、ナノピラー、モノリスカラム等の容器）、ならびに液相中に懸濁または分散可能な固相（例、粒子等の固相担体）が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック、金属、及びカーボンが挙げられる。固相の材料としてはまた、非磁性材料、又は磁性材料を用いることができるが、操作の簡便性等の観点から、磁性材料が好ましい。固相は、好ましくは固相担体であり、より好ましくは磁性固相担体であり、さらにより好ましくは磁性粒子である。抗体の固相化方法としては、従前公知の方法を利用することができる。このような方法としては、例えば、物理的吸着法、共有結合法、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン）を利用する方法、及びイオン結合法が挙げられる。特定の実施形態では、心筋トロポニンＩに対する抗体は、固相に固相化された抗体であり、好ましくは、磁性の固相に固相化された抗体であり、より好ましくは、磁性粒子に固相化された抗体である。

心筋トロポニンＩに対する抗体は、標識物質で標識化されていてもよい。本明細書において、標識物質で標識化された抗体を、単に標識化抗体ということがある。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質またはタンパク質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光又は吸光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウム）、放射性物質（例、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ）が挙げられる。また、本発明の方法で２次抗体（例、後述するさらなる抗体）が用いられる場合、２次抗体は、このような標識物質で標識化されていてもよい。

本発明の試薬には、ポリアニオン性高分子もまた含まれる。

本発明において、用語「ポリアニオン性高分子」とは、アニオン性部分を複数含む高分子を意味する。用語「アニオン性部分」とは、負に荷電した基又は原子を意味する。アニオン性部分としては、例えば、スルフェート基〔−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｏ⁻〕、スルホナート基〔−Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｏ⁻〕、カルボキシラート基〔−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ⁻〕、ホスフェート基〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ⁻）_２〕、ハイドロジェンホスフェート基〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）（−Ｏ⁻）〕、負に荷電した硫黄原子〔−Ｓ⁻〕、及び負に荷電した酸素原子基〔−Ｏ⁻〕が挙げられる。好ましくは、アニオン性部分は、スルフェート基、スルホナート基、及びカルボキシラート基からなる群より選ばれる基である。ポリアニオン性高分子は、１種又は２種以上のアニオン性部分を含んでいてもよい。ここで、ポリアニオン性高分子に含まれるアニオン性部分の数は、心筋トロポニンＩ量の測定値の乖離を抑制できる限り特に限定されず、アニオン性部分の種類によっても異なり得るが、通常５個以上であり、好ましくは１５個以上であり、より好ましくは３０個以上である。ポリアニオン性高分子に含まれるアニオン性部分の数はまた、５００個以下、４００個以下、又は３００個以下であってもよい。ポリアニオン性高分子の分子量は、心筋トロポニンＩ量の測定値の乖離を抑制できる限り特に限定されず、アニオン性部分の種類及び数、並びにポリアニオン性高分子の種類によっても異なり得るが、通常５００以上であり、好ましくは１０００以上であり、より好ましくは３０００以上である。また、ポリアニオン性高分子の分子量は、１０００００以下、７００００以下、又は５００００以下であってもよい。なお、ポリアニオン性高分子が後述するようにポリアニオン性ポリマーである場合、分子量は、特段の説明がない限り、重量平均分子量を意味する。

ポリアニオン性高分子は、塩の形態であってもよい。塩としては、例えば、無機塩及び有機塩が挙げられる。無機塩としては、例えば、アンモニウム塩及び金属塩が挙げられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等の一価の金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の二価の金属塩が挙げられる。有機塩としては、例えば、アルキル基で置換されたアンモニウム塩、含窒素複素環化合物塩（例、ピリジニウム塩）が挙げられる。

好ましい実施形態では、ポリアニオン性高分子は、上述したような１種又は２種以上のアニオン性部分を含む繰り返し単位を含むポリマーであってもよい。本発明では、１種又は２種以上のアニオン性部分を含む繰り返し単位を含むポリマーを、「ポリアニオン性ポリマー」と称することがある。ポリアニオン性ポリマーは、１種又は２種以上のアニオン性部分を含む繰り返し単位以外の構成単位を含んでいてもよい。したがって、ポリアニオン性ポリマーは、ホモポリマーであっても、コポリマー（例、ブロックコポリマー）であってもよい。また、ポリアニオン性ポリマーは、線状ポリマー、分岐構造を有するポリマー、又はデンドリマーであってもよい。さらに、ポリアニオン性ポリマーは、アニオン性部分を含むモノマー（必要に応じて、他の構成単位とのブロック単位）の重合により得られるポリマー、又はアニオン性部分を含まないポリマーに複数のアニオン性部分を導入することにより得られるポリマー（例、特許第３３２７０７０号公報に記載される、水酸基が硫酸エステルで置換されたデキストラン化合物）であってもよいが、好ましくは、アニオン性部分を含むモノマーの重合により得られるポリマーである。ポリアニオン性ポリマーは、塩の形態であってもよい。

本発明において、ポリアニオン性ポリマーにおける繰り返し単位の数は、心筋トロポニンＩ量の測定値の乖離を抑制できる限り特に限定されないが、例えば、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、３０個以上、又は４０個以上であってもよい。ポリアニオン性ポリマーにおいて、アニオン性部分を含む繰り返し単位の数は、例えば、５００個以下、４００個以下、又は３００個以下であってもよい。

具体的には、ポリアニオン性ポリマーとしては、例えば、ポリ硫酸化合物（例、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸）、ポリスルホン酸化合物（例、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸）、ポリカルボン酸化合物（例、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリマレイン酸、ポリフマル酸）、ポリアニオン性多糖類（例、デキストラン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カラギーナン、キサンタンガム）、及びポリアニオン性タンパク質（例、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸）が挙げられる。好ましくは、ポリアニオン性ポリマーは、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、又はポリアクリル酸であってもよい。

ポリアニオン性高分子は、従前公知の方法により作製することができる。例えば、アニオン性部分を含むモノマーを重合する方法、又はアニオン性部分を含まない高分子に、アニオン性部分を導入する方法により作製することができる。ポリアニオン性高分子としては、市販品を用いてもよい。

また、本発明の試薬は、上述した心筋トロポニンＩに対する抗体、及びポリアニオン性高分子以外に、さらなる抗体を含んでいてもよい。さらなる抗体としては、例えば、上述した心筋トロポニンＩに対する抗体と異なるエピトープを認識する心筋トロポニンＩに対する別の抗体、心筋トロポニンＩに対する抗体の定常領域を認識する抗体、及び心筋トロポニンＩに対する抗体と心筋トロポニンＩとの複合体を認識する抗体が挙げられる。このようなさらなる抗体は、例えば、２次抗体として使用することができる。

特定の実施形態では、本発明の試薬は、さらなる抗体として、心筋トロポニンＩに対する抗体と異なるエピトープを認識する心筋トロポニンＩに対する別の抗体を含む。このような別の抗体が認識するエピトープの詳細は、上述した心筋トロポニンＩに対する抗体について詳述したエピトープと同様である（但し、併用される場合、エピトープの種類は異なる）。心筋トロポニンＩに対する抗体により認識されるエピトープと、心筋トロポニンＩに対する別の抗体により認識されるエピトープとの組合せは、特に限定されない。例えば、心筋トロポニンＩに対する抗体として２０番目〜６０番目のアミノ酸残基からなるペプチド部分中に見出される特定のエピトープ（例、２４〜４０番目、又は４１〜４９番目のアミノ酸残基からなるペプチド）を認識する抗体を用いる場合、心筋トロポニンＩに対する別の抗体として当該特定のエピトープ以外のエピトープ、例えば、２０番目〜６０番目のアミノ酸残基からなるペプチド部分中に見出される別のエピトープ（例、２４〜４０番目、又は４１〜４９番目のアミノ酸残基からなるペプチド）、６１番目〜１２０番目のアミノ酸残基からなるペプチド部分中に見出されるエピトープ（例、８６〜９０番目のアミノ酸残基からなるペプチド）、１３０番目〜１５０番目のアミノ酸残基からなるペプチド部分中に見出されるエピトープ、又は１６０番目〜２０９番目のアミノ酸残基からなるペプチド部分中に見出されるエピトープを認識する抗体を用いることができる。このような別の抗体の使用は、例えば、サンドイッチ法が利用される場合に好ましい。

さらに、本発明の試薬は、上述した物質以外の成分を含んでいてもよい。このような成分としては、例えば、緩衝液又は希釈液（例、ＭＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、炭酸緩衝液）、上述したような標識物質、及び標識物質と反応する基質（例、標識物質が酵素である場合、酵素の基質）が挙げられる。緩衝液のｐＨは抗体を含有する緩衝液のｐＨとして通常採用されているｐＨと同様であるが、心筋トロポニンＩに対する抗体を含む緩衝液を用いる場合、当該緩衝液のｐＨとして、ポリアニオン性高分子中のアニオン性部分が負に荷電した状態を維持できるようなｐＨであることが必要である。このようなｐＨは、ポリアニオン性高分子の種類によっても異なるが、例えば５〜９、好ましくは５．６〜７．６である。

本発明の試薬は、心筋トロポニンＩに対する抗体を使用するイムノアッセイにおいて利用することができる。このようなイムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、及びサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）（例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ））、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、及びサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及びイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。

本発明の試薬は、互いに隔離された形態または組成物の形態において各構成成分を含む。具体的には、各構成成分はそれぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容された形態で提供されてもよいが、一部の構成成分が組成物の形態（例、同一溶液中）で提供されてもよい。あるいは、本発明の試薬は、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、構成成分の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。

特定の実施形態では、心筋トロポニンＩに対する抗体、及びポリアニオン性高分子を含む本発明の試薬は、心筋トロポニンＩに対する抗体についての溶液又は粉末、及びポリアニオン性高分子についての溶液又は粉末を、同一又は異なる容器に含むキットの形態で提供されてもよいが、用事調製の手間を省く等の観点から、心筋トロポニンＩ、及び心筋トロポニンＩに対する抗体を同一溶液に含む形態（プレミックス）で提供されてもよい。本発明の試薬においてポリアニオン性高分子が溶液として提供される場合、溶液中のポリアニオン性高分子の濃度は、分析されるべき試料との混合比率、及び希釈倍率等の使用条件によっても異なるが、例えば０．０６ｍｇ／ｍＬ以上８５ｍｇ／ｍＬ以下である。溶液中のポリアニオン性高分子の濃度は、好ましくは０．０８ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．２ｍｇ／ｍＬ以上、更により好ましくは０．８ｍｇ／ｍＬ以上であってもよい。溶液中のポリアニオン性高分子の濃度はまた、好ましくは８．５ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは４．０ｍｇ／ｍＬ以下、更により好ましくは３．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。

好ましい実施形態では、本発明の試薬は、採用されるべきイムノアッセイの種類に応じた構成を有していてもよい。例えば、サンドイッチ法が採用される場合、本発明の試薬は、必須の構成成分として、ｉ）心筋トロポニンＩに対する抗体、及びｉｉ）ポリアニオン性高分子、並びに任意の構成成分として、ｉｉｉ）心筋トロポニンＩに対する別の抗体、ｉｖ）標識物質、ｖ）希釈液（緩衝液）、及び、必要に応じて、ｖｉ）標識物質と反応する基質を含んでいてもよい。ｉ）及びｉｉ）の構成成分は、同一溶液に含まれていてもよい。ｉｉｉ）の構成成分は、ｉｖ）標識物質で標識化されていてもよい。好ましくは、心筋トロポニンＩに対する抗体は、磁性粒子に固相化されていてもよい。本発明の試薬の構成の具体例は、ｉ’）心筋トロポニンＩに対する抗体が固相化された磁性粒子、及びポリアニオン性高分子を含む緩衝液、ｉｉ’）心筋トロポニンＩに対する別の抗体（標識物質で標識化）を含む緩衝液、及びｉｉｉ’）希釈液（緩衝液）である。

本発明の試薬は、血液試料中の心筋トロポニンＩ量を血液試料の種類によらない一定の値として測定できることから、例えば、血液試料を利用する検査薬として有用である。本発明の試薬はまた、血液試料中の心筋トロポニンＩ量を血液試料の種類によらない一定の値として測定できるという事実からも明らかであるように、試料中に混入している多種多様な夾雑物の影響を排除することにより心筋トロポニンＩと抗体との相互作用を安定化できると考えられることから、多種多様な夾雑物が混入している、血液試料以外の試料中の心筋トロポニンＩ量の測定にも優れると考えられる。血液試料等の試料としては、予備処理に付されたものを用いてもよい。このような予備処理としては、例えば、遠心分離、分画、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、及び攪拌が挙げられる。

好ましい実施形態では、本発明の試薬は、疾患（例、急性心筋梗塞、心筋炎）の診断薬として使用することができる。試料としては、血液試料が好ましい。

血液試料としては、任意の種類の血液試料を利用することができるが、例えば、血清及び血漿が挙げられる。血漿としては、抗凝固剤で処理されたもの（例、抗凝固剤を含む採血管中に採取されたもの）を利用することができる。このような抗凝固剤としては、例えば、ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸及びそれらの塩、並びにフッ化ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。また、血液試料としては、任意の動物由来の血液試料を利用することができるが、好ましくは、上述したような哺乳動物の血液試料であり、より好ましくは、上述したような霊長類の血液試料である。ヒトへの臨床応用の観点からは、ヒトの血液試料が特に好ましい。

ＥＤＴＡ血漿としては、通常、全血試料中にＥＤＴＡ塩を適量（例、ＥＤＴＡ二ナトリウムであれば約１．５ｍｇ／ｍＬ若しくは約２．０ｍｇ／ｍＬ、または、ＥＤＴＡ二カリウムであれば約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．８５ｍｇ／ｍＬ、若しくは約１．９ｍｇ／ｍＬ）を加え、転倒混和した後、遠心分離により血球成分を除去したものが使用される。クエン酸血漿としては、通常、全血試料中にクエン酸塩を適量（例、クエン酸ナトリウムであれば約３．２ｍｇ／ｍＬ）加え、転倒混和した後、遠心分離により血球成分を除去したものが使用される。ヘパリン血漿としては、通常、全血試料中にヘパリン塩を適量（例、ヘパリンナトリウムであれば約１３ＩＵ／ｍＬ）加え、転倒混和した後、遠心分離により血球成分を除去したものが使用される。

本発明の試薬は、その心筋トロポニンＩ測定値の各種血液試料間での乖離を抑制し得るものである。各種血液試料間での測定値の乖離割合（基準となる血液試料（例、血清）の測定値をａとし、基準となる血液試料と比較される血液試料（例、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿、ヘパリン血漿）の測定値をｂとした場合に、測定値ａと測定値ｂとの差の絶対値｜ａ−ｂ｜の、測定値ａに対する百分率であり、（｜ａ−ｂ｜／ａ）×１００（％）で算出される。）は、１５％未満であることが好ましく、１０％未満であることがより好ましく、５％未満であることが更に好ましく、１％未満であることが更により好ましく、０．５％未満であることが特に好ましい。

＜２．本発明の方法＞
本発明はまた、心筋トロポニンＩの測定方法を提供する。本発明の方法は、ポリアニオン性高分子の存在下において、心筋トロポニンＩに対する抗体を用いて血液試料中の心筋トロポニンＩ量を測定することを含む。心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＩに対する抗体、ポリアニオン性高分子、及び血液試料の定義、例、及び好ましい例は、上述したとおりである。

本発明の方法で用いられるポリアニオン性高分子は、血液試料の種類による心筋トロポニンＩ量の測定値の乖離を抑制できる量において存在すればよい。

心筋トロポニンＩ量の測定は、例えば、上述したイムノアッセイにより行うことができる。特に限定されるものではないが、なかでもサンドイッチ法及び／又は化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）が好ましい。

具体的には、本発明の方法は、以下（１）〜（３）を含んでいてもよい。
（１）心筋トロポニンＩに対する抗体、ポリアニオン性高分子、及び血液試料の混合液を調製すること；
（２）混合液をインキュベートすること；及び
（３）混合液において心筋トロポニンＩ量を測定すること。

工程（１）では、混合液は、心筋トロポニンＩに対する抗体についての溶液又は粉末、ポリアニオン性高分子についての溶液又は粉末、及び血液試料、並びに必要に応じて希釈液を適宜混合することにより調製することができる。溶液又は希釈液としては、例えば、水（例、蒸留水、滅菌水、滅菌蒸留水、及び純水）、並びに上述したような緩衝液が挙げられるが、緩衝液が好ましい。好ましくは、心筋トロポニンＩに対する抗体、及びポリアニオン性高分子を含む溶液を予め調製し、次いで、このようにして調製された溶液を、血液試料、及び必要に応じて希釈液と混合してもよい。

混合液中のポリアニオン性高分子の濃度は、血液試料の種類による心筋トロポニンＩ量の測定値の乖離を抑制できる濃度である限り特に限定されず、試料の種類によっても異なり得るが、例えば、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上５．０ｍｇ／ｍＬ以下である。混合液中のポリアニオン性高分子の濃度は、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／ｍＬ以上、更により好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ以上であってもよい。混合液中のポリアニオン性高分子の濃度はまた、好ましくは２．０ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１．５ｍｇ／ｍＬ以下、更により好ましくは１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。

工程（２）では、混合液のインキュベーションは、血液試料中に存在し得る心筋トロポニンＩと、心筋トロポニンＩに対する抗体との複合体が形成されるのに十分な時間において適切な温度で行うことができる。このような時間は、通常のイムノアッセイで採用されるのと同様の時間であり、例えば、１分間〜２４時間である。このような温度は、通常のイムノアッセイで採用されるのと同様の温度であり、例えば、５〜４０℃である。

工程（３）では、混合液における心筋トロポニンＩ量の測定は、心筋トロポニンＩに対する抗体を利用することにより、上述したようなイムノアッセイにおいて行うことができる。混合液中の心筋トロポニンＩ量を測定することにより、血液試料中に存在していた心筋トロポニンＩ量を評価することができる。

本発明の方法は、予備処理の工程を含んでいてもよい。このような工程としては、例えば、遠心分離、分画、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、及び攪拌が挙げられる。

本発明の方法は、血液試料中の心筋トロポニンＩ量を血液試料の種類によらない一定の値として測定できることから、例えば、血液試料を利用する検査に有用である。好ましくは、本発明の方法は、上述したような疾患の診断に有用である。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。

［実施例１］心筋トロポニンＩ測定試薬の調製、測定法及び被検試料の調製
心筋トロポニンＩ測定試薬として、抗体ペアの異なる以下の試薬Ａ及び試薬Ｂを調製した。
＜試薬Ａ＞
・抗体結合粒子溶液（固相化抗体溶液）：０．０２５％（ｗ／ｖ）の、カルボキシル化磁性粒子（富士レビオ製）に心筋トロポニンＩのアミノ酸配列（例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ６２３０１．１を参照、以下同様）４１〜４９番目をエピトープとして認識するマウスモノクローナル抗体を結合した抗体結合磁性粒子、５０ｍＭの２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１．０％（ｗ／ｖ）のウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ）、及び５０ｍＭのＮａＣｌを含む、抗体結合粒子溶液（ｐＨ６．８）を調製した。
・標識化抗体溶液：０．５μｇ／ｍＬの、心筋トロポニンＩのアミノ酸配列８６〜９０番目をエピトープとして認識する抗体をアルカリフォスファターゼ（高比活性、糖低減の組換え体、ロシュ製）により標識して得られた標識化抗体、５０ｍＭのＭＥＳ、２．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．３ｍＭのＺｎＣｌ_２、及び１．０ｍＭのＭｇＣｌ_２を含む、標識化抗体溶液（ｐＨ６．８）を調製した。
これらの溶液を自動免疫測定装置（ルミパルスＧ１２００、富士レビオ製）用のカートリッジに充填した。

＜試薬Ｂ＞
・抗体結合粒子溶液（固相化抗体溶液）：０．０２５％（ｗ／ｖ）の、カルボキシル化磁性粒子（富士レビオ製）に心筋トロポニンＩのアミノ酸配列２４〜４０番目をエピトープとして認識するマウスモノクローナル抗体を結合した抗体結合磁性粒子、５０ｍＭの２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１．０％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、及び５０ｍＭのＮａＣｌを含む、抗体結合粒子溶液（ｐＨ６．８）を調製した。
・標識化抗体溶液：０．５μｇ／ｍＬの、心筋トロポニンＩのアミノ酸配列４１〜４９番目をエピトープとして認識する抗体をアルカリフォスファターゼ（高比活性、糖低減の組換え体、ロシュ製）により標識して得られた標識化抗体、５０ｍＭのＭＥＳ、２．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．３ｍＭのＺｎＣｌ_２、及び１．０ｍＭのＭｇＣｌ_２を含む、標識化抗体溶液（ｐＨ６．８）を調製した。
これらの溶液を自動免疫測定装置（ルミパルスＧ１２００、富士レビオ製）用のカートリッジに充填した。

自動免疫測定装置（ルミパルスＧ１２００、富士レビオ製）を用いて、以下の手順に従って、被検試料の心筋トロポニンＩ量を測定した。
（１）抗体結合粒子溶液１５０μＬに被検試料１００μＬが分注されて、第１反応液が調製される。第１反応液は撹拌後３７℃で１０分間インキュベートされて、磁性粒子に結合した抗心筋トロポニンＩ抗体と被検試料に含まれる心筋トロポニンＩ抗原との免疫複合体が形成される。
（２）インキュベーション後、磁性粒子は磁石によって管壁に集められ、磁性粒子に未結合の物質が除去される。その後、洗浄液（ルミパルス（登録商標）洗浄液、富士レビオ社製）の注入及び洗浄液の除去が繰り返され、磁性粒子が洗浄される。
（３）洗浄後、標識化抗体溶液２５０μＬ及び磁性粒子が混合され、第２反応液が調製される。第２反応液は３７℃で１０分間インキュベートされて、磁性粒子に固相化された抗心筋トロポニンＩ抗体−心筋トロポニンＩ抗原−アルカリフォスファターゼにより標識された抗心筋トロポニンＩ抗体から構成される免疫複合体が形成される。
（４）インキュベーション後、磁性粒子は再び磁石によって管壁に集められ、磁性粒子に未結合の物質が除去される。その後、洗浄液の注入及び洗浄液の除去が繰り返され、磁性粒子が洗浄される。
（５）ＡＭＰＰＤ（３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩）を含む基質液（ルミパルス（登録商標）基質液、富士レビオ社製）２００μＬが磁性粒子に加えられ、撹拌後３７℃で５分間インキュベートされる。基質液に含まれるＡＭＰＰＤが、磁性粒子に間接的に結合したアルカリフォスファターゼの触媒作用により分解し、波長４７７ｎｍに発光極大を持つ光が放出される。発光強度は磁性粒子に結合した心筋トロポニンＩ量を反映するため、波長４７７ｎｍの発光強度を測定することで心筋トロポニンＩ量を測定することができる。

被検試料として、４例又は５例の心筋トロポニンＩ高値検体（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社製）及び４例又は５例の血清血漿ペア検体（同一ドナーより得られた血清、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿及びヘパリン血漿）を準備し、心筋トロポニンＩ高値検体を血清血漿ペア検体に１／１０容量以下となるように添加して調製した。

［実施例２］心筋トロポニンＩ測定におけるデキストラン硫酸ナトリウムの血清血漿相関性への影響
デキストラン硫酸ナトリウム（デキストラン硫酸ナトリウム５０００、和光純薬工業製）を、試薬Ａの抗体結合粒子溶液中に０、０．７７、１．５５、又は２．３２ｍｇ／ｍＬ（第１反応液中の濃度は、それぞれ０、０．４６２、０．９３０、又は１．３９２ｍｇ／ｍＬ）となるように添加し、被検試料を測定した。結果を表１及び図１〜図３に示す。各測定値は、波長４７７ｎｍの発光強度（カウント値）である。対血清カウント値（平均）は、各検体につき、血清のカウント値に対する各血漿のカウント値の百分率を算出し、次いで、それらの平均値を算出することにより得た。実施例３及び実施例４における対血清カウント値（平均）も同様にして得られた値である。

その結果、デキストラン硫酸ナトリウム非存在下における測定では、被検試料の測定値が、血清、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿、及びヘパリン血漿間で大きく異なっていた（表１、及び図１〜３）。他方、デキストラン硫酸ナトリウムを含有する抗体結合粒子溶液を用いて、心筋トロポニンＩの測定をデキストラン硫酸ナトリウムの存在下で行うことにより、被検試料の測定値が、血清、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿、及びヘパリン血漿間で概ね一致した（表１、及び図１〜３）。

以上より、心筋トロポニンＩの測定をデキストラン硫酸ナトリウムの存在下で行うことにより、血清と血漿の測定値の乖離が抑制されることが明らかとなった。

［実施例３］デキストラン硫酸ナトリウム存在下の心筋トロポニンＩ測定における血清血漿相関性への抗体エピトープの種類の影響
デキストラン硫酸ナトリウム（デキストラン硫酸ナトリウム５０００、和光純薬工業製）を試薬Ｂの抗体結合粒子溶液中に０、０．５、１．０、又は２．０ｍｇ／ｍＬ（第１反応液中の濃度は、それぞれ０、０．３、０．６、１．２ｍｇ／ｍＬ）となるように添加し、その他の条件は実施例２と同様として、被検試料を測定した。結果を表２及び図４〜図７に示す。各測定値は、波長４７７ｎｍの発光強度（カウント値）である。

その結果、実施例２で用いられた試薬Ａで使用された抗体ペア（固相化抗体及び標識化抗体）とは異なる心筋トロポニンＩ抗原の部位を認識する抗体ペア（固相化抗体及び標識化抗体）を用いた試薬Ｂを用いた場合においても、デキストラン硫酸ナトリウムを含有する抗体結合粒子溶液を用いて、心筋トロポニンＩの測定をデキストラン硫酸ナトリウムの存在下で行うことにより、被検試料の測定値が、血清、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿、及びヘパリン血漿間で概ね一致した（表２、及び図４〜７）。

以上より、心筋トロポニンＩの測定をデキストラン硫酸ナトリウムの存在下で行うことにより、抗体が認識する心筋トロポニンＩのエピトープ位置によらず、血清と血漿の測定値の乖離が抑制されることが明らかとなった。

［実施例４］心筋トロポニンＩ測定における各種ポリアニオン性高分子の血清血漿相関性への影響
デキストラン硫酸ナトリウム（デキストラン硫酸ナトリウム５０００、和光純薬工業製）、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（重量平均分子量：〜７００００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製）、ポリアクリル酸ナトリウム（重量平均分子量：〜５１００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製）、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム（分子量２７１、ナカライテスク製）又はＬ−アスパラギン酸（分子量１３３、和光純薬工業製）を試薬Ｂの抗体結合粒子溶液中に１．５ｍｇ／ｍＬ（第１反応液中の濃度は、０．９ｍｇ／ｍＬ）となるように添加し、その他の条件は実施例２及び３と同様として、被検試料を測定した。結果を表３及び図８〜図１１に示す。各測定値は、波長４７７ｎｍの発光強度（カウント値）
である。

その結果、心筋トロポニンＩの測定をデキストラン硫酸ナトリウム、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、又はポリアクリル酸ナトリウム（ポリアニオン性高分子）の存在下で行うことにより、被検試料の測定値が、血清、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿、及びヘパリン血漿間で概ね一致した（表３、及び図８〜１１）。一方、低分子アニオン性化合物（アニオン性部分を含む低分子化合物）である、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｌ−アスパラギン酸の存在下では、血清と各種血漿との測定値の乖離は軽減されなかった。

以上より、心筋トロポニンＩの測定をポリアニオン性高分子の存在下で行うことにより、血清と各種血漿の測定値の乖離が抑制されることが明らかとなった。

Claims (11)

1. 心筋トロポニンＩに対する抗体、及びポリアニオン性高分子を含む、心筋トロポニンＩ測定試薬。
2. ポリアニオン性高分子が、スルフェート基、スルホナート基、及びカルボキシラート基からなる群より選ばれる基を含む、請求項１記載の試薬。
3. 前記試薬が、前記抗体及び前記高分子を含有する溶液を含む、請求項１又は２記載の試薬。
4. 前記溶液中の前記高分子の濃度が０．０６ｍｇ／ｍＬ以上８５ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項３記載の試薬。
5. 前記抗体が固相化抗体である、請求項１〜４のいずれか一項記載の試薬。
6. 心筋トロポニンＩに対する別の抗体を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の試薬。
7. 前記別の抗体が標識化抗体である、請求項６記載の試薬。
8. ポリアニオン性高分子の存在下において、心筋トロポニンＩに対する抗体を用いて血液試料中の心筋トロポニンＩ量を測定することを含む、心筋トロポニンＩの測定方法。
9. 血液試料が血漿である、請求項８記載の方法。
10. 以下（１）〜（３）を含む方法である、請求項８又は９記載の方法：
    （１）心筋トロポニンＩに対する抗体、ポリアニオン性高分子、及び血液試料の混合液を調製すること；
    （２）混合液をインキュベートすること；及び
    （３）混合液において心筋トロポニンＩ量を測定すること。
11. 前記混合液における前記高分子の濃度が０．０５ｍｇ／ｍＬ以上５．０ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１０記載の方法。

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