JP2017090132A - 心筋トロポニンi測定試薬及び方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】心筋トロポニンIに対する抗体、及びポリアニオン性高分子を含む、心筋トロポニンI測定試薬、並びにポリアニオン性高分子の存在下において、心筋トロポニンIに対する抗体を用いて心筋トロポニンI量を測定することを含む、心筋トロポニンIの測定方法。
【選択図】なし
Description
特許文献1には、所定のアニオン性界面活性剤(1個のスルホナート基を有するアルキル基)を含むマトリクスを利用することにより心筋トロポニンIを安定化できることが記載されている。
特許文献2には、心筋トロポニンIの免疫学的測定において2価の陽イオンを利用できることが記載されている。
特許文献3には、抗原抗体反応に伴う非特異的反応を抑制するため、血清にポリアニオンを加えることが記載されている。
特許文献4には、間接免疫凝集測定における非特異的反応を抑制するため、水酸基の一部が硫酸エステル基で置換されたデキストラン化合物を利用できることが記載されている。
[1]心筋トロポニンIに対する抗体、及びポリアニオン性高分子を含む、心筋トロポニンI測定試薬。
[2]ポリアニオン性高分子が、スルフェート基、スルホナート基、及びカルボキシラート基からなる群より選ばれる基を含む、[1]記載の試薬。
[3]前記試薬が、前記抗体及び前記高分子を含有する溶液を含む、[1]又は[2]記載の試薬。
[4]前記溶液中の前記高分子の濃度が0.06mg/mL以上85mg/mL以下である、[3]記載の試薬。
[5]前記抗体が固相化抗体である、[1]〜[4]のいずれか一つに記載の試薬。
[6]心筋トロポニンIに対する別の抗体を更に含む、[1]〜[5]のいずれか一つに記載の試薬。
[7]前記別の抗体が標識化抗体である、[6]記載の試薬。
[8]ポリアニオン性高分子の存在下において、心筋トロポニンIに対する抗体を用いて血液試料中の心筋トロポニンI量を測定することを含む、心筋トロポニンIの測定方法。
[9]血液試料が血漿である、[8]記載の方法。
[10]以下(1)〜(3)を含む方法である、[8]又は[9]記載の方法:
(1)心筋トロポニンIに対する抗体、ポリアニオン性高分子、及び血液試料の混合液を調製すること;
(2)混合液をインキュベートすること;及び
(3)混合液において心筋トロポニンI量を測定すること。
[11]前記混合液における前記高分子の濃度が0.05mg/mL以上5.0mg/mL以下である、[10]記載の方法。
本発明は、心筋トロポニンIに対する抗体、及びポリアニオン性高分子を含む、心筋トロポニンI測定試薬を提供する。
本発明はまた、心筋トロポニンIの測定方法を提供する。本発明の方法は、ポリアニオン性高分子の存在下において、心筋トロポニンIに対する抗体を用いて血液試料中の心筋トロポニンI量を測定することを含む。心筋トロポニンI、心筋トロポニンIに対する抗体、ポリアニオン性高分子、及び血液試料の定義、例、及び好ましい例は、上述したとおりである。
(1)心筋トロポニンIに対する抗体、ポリアニオン性高分子、及び血液試料の混合液を調製すること;
(2)混合液をインキュベートすること;及び
(3)混合液において心筋トロポニンI量を測定すること。
心筋トロポニンI測定試薬として、抗体ペアの異なる以下の試薬A及び試薬Bを調製した。
<試薬A>
・抗体結合粒子溶液(固相化抗体溶液):0.025%(w/v)の、カルボキシル化磁性粒子(富士レビオ製)に心筋トロポニンIのアミノ酸配列(例えばGenBank:CAA62301.1を参照、以下同様)41〜49番目をエピトープとして認識するマウスモノクローナル抗体を結合した抗体結合磁性粒子、50mMの2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、1.0%(w/v)のウシ血清由来アルブミン(BSA)、及び50mMのNaClを含む、抗体結合粒子溶液(pH6.8)を調製した。
・標識化抗体溶液:0.5μg/mLの、心筋トロポニンIのアミノ酸配列86〜90番目をエピトープとして認識する抗体をアルカリフォスファターゼ(高比活性、糖低減の組換え体、ロシュ製)により標識して得られた標識化抗体、50mMのMES、2.5%(w/v)のBSA、100mMのNaCl、0.3mMのZnCl2、及び1.0mMのMgCl2を含む、標識化抗体溶液(pH6.8)を調製した。
これらの溶液を自動免疫測定装置(ルミパルスG1200、富士レビオ製)用のカートリッジに充填した。
・抗体結合粒子溶液(固相化抗体溶液):0.025%(w/v)の、カルボキシル化磁性粒子(富士レビオ製)に心筋トロポニンIのアミノ酸配列24〜40番目をエピトープとして認識するマウスモノクローナル抗体を結合した抗体結合磁性粒子、50mMの2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、1.0%(w/v)のBSA、及び50mMのNaClを含む、抗体結合粒子溶液(pH6.8)を調製した。
・標識化抗体溶液:0.5μg/mLの、心筋トロポニンIのアミノ酸配列41〜49番目をエピトープとして認識する抗体をアルカリフォスファターゼ(高比活性、糖低減の組換え体、ロシュ製)により標識して得られた標識化抗体、50mMのMES、2.5%(w/v)のBSA、100mMのNaCl、0.3mMのZnCl2、及び1.0mMのMgCl2を含む、標識化抗体溶液(pH6.8)を調製した。
これらの溶液を自動免疫測定装置(ルミパルスG1200、富士レビオ製)用のカートリッジに充填した。
(1)抗体結合粒子溶液150μLに被検試料100μLが分注されて、第1反応液が調製される。第1反応液は撹拌後37℃で10分間インキュベートされて、磁性粒子に結合した抗心筋トロポニンI抗体と被検試料に含まれる心筋トロポニンI抗原との免疫複合体が形成される。
(2)インキュベーション後、磁性粒子は磁石によって管壁に集められ、磁性粒子に未結合の物質が除去される。その後、洗浄液(ルミパルス(登録商標)洗浄液、富士レビオ社製)の注入及び洗浄液の除去が繰り返され、磁性粒子が洗浄される。
(3)洗浄後、標識化抗体溶液250μL及び磁性粒子が混合され、第2反応液が調製される。第2反応液は37℃で10分間インキュベートされて、磁性粒子に固相化された抗心筋トロポニンI抗体−心筋トロポニンI抗原−アルカリフォスファターゼにより標識された抗心筋トロポニンI抗体から構成される免疫複合体が形成される。
(4)インキュベーション後、磁性粒子は再び磁石によって管壁に集められ、磁性粒子に未結合の物質が除去される。その後、洗浄液の注入及び洗浄液の除去が繰り返され、磁性粒子が洗浄される。
(5)AMPPD(3−(2’−スピロアダマンタン)−4−メトキシ−4−(3’−ホスホリルオキシ)フェニル−1,2−ジオキセタン・2ナトリウム塩)を含む基質液(ルミパルス(登録商標)基質液、富士レビオ社製)200μLが磁性粒子に加えられ、撹拌後37℃で5分間インキュベートされる。基質液に含まれるAMPPDが、磁性粒子に間接的に結合したアルカリフォスファターゼの触媒作用により分解し、波長477nmに発光極大を持つ光が放出される。発光強度は磁性粒子に結合した心筋トロポニンI量を反映するため、波長477nmの発光強度を測定することで心筋トロポニンI量を測定することができる。
デキストラン硫酸ナトリウム(デキストラン硫酸ナトリウム5000、和光純薬工業製)を、試薬Aの抗体結合粒子溶液中に0、0.77、1.55、又は2.32mg/mL(第1反応液中の濃度は、それぞれ0、0.462、0.930、又は1.392mg/mL)となるように添加し、被検試料を測定した。結果を表1及び図1〜図3に示す。各測定値は、波長477nmの発光強度(カウント値)である。対血清カウント値(平均)は、各検体につき、血清のカウント値に対する各血漿のカウント値の百分率を算出し、次いで、それらの平均値を算出することにより得た。実施例3及び実施例4における対血清カウント値(平均)も同様にして得られた値である。
デキストラン硫酸ナトリウム(デキストラン硫酸ナトリウム5000、和光純薬工業製)を試薬Bの抗体結合粒子溶液中に0、0.5、1.0、又は2.0mg/mL(第1反応液中の濃度は、それぞれ0、0.3、0.6、1.2mg/mL)となるように添加し、その他の条件は実施例2と同様として、被検試料を測定した。結果を表2及び図4〜図7に示す。各測定値は、波長477nmの発光強度(カウント値)である。
デキストラン硫酸ナトリウム(デキストラン硫酸ナトリウム5000、和光純薬工業製)、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム(重量平均分子量:〜70000、Sigma Aldrich製)、ポリアクリル酸ナトリウム(重量平均分子量:〜5100、Sigma Aldrich製)、N−ラウロイルサルコシンナトリウム(分子量271、ナカライテスク製)又はL−アスパラギン酸(分子量133、和光純薬工業製)を試薬Bの抗体結合粒子溶液中に1.5mg/mL(第1反応液中の濃度は、0.9mg/mL)となるように添加し、その他の条件は実施例2及び3と同様として、被検試料を測定した。結果を表3及び図8〜図11に示す。各測定値は、波長477nmの発光強度(カウント値)
である。
Claims (11)
- 心筋トロポニンIに対する抗体、及びポリアニオン性高分子を含む、心筋トロポニンI測定試薬。
- ポリアニオン性高分子が、スルフェート基、スルホナート基、及びカルボキシラート基からなる群より選ばれる基を含む、請求項1記載の試薬。
- 前記試薬が、前記抗体及び前記高分子を含有する溶液を含む、請求項1又は2記載の試薬。
- 前記溶液中の前記高分子の濃度が0.06mg/mL以上85mg/mL以下である、請求項3記載の試薬。
- 前記抗体が固相化抗体である、請求項1〜4のいずれか一項記載の試薬。
- 心筋トロポニンIに対する別の抗体を更に含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の試薬。
- 前記別の抗体が標識化抗体である、請求項6記載の試薬。
- ポリアニオン性高分子の存在下において、心筋トロポニンIに対する抗体を用いて血液試料中の心筋トロポニンI量を測定することを含む、心筋トロポニンIの測定方法。
- 血液試料が血漿である、請求項8記載の方法。
- 以下(1)〜(3)を含む方法である、請求項8又は9記載の方法:
(1)心筋トロポニンIに対する抗体、ポリアニオン性高分子、及び血液試料の混合液を調製すること;
(2)混合液をインキュベートすること;及び
(3)混合液において心筋トロポニンI量を測定すること。 - 前記混合液における前記高分子の濃度が0.05mg/mL以上5.0mg/mL以下である、請求項10記載の方法。
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