JP2016519933A - ソルタギング可能なタンパク質を有する赤血球のｉｎｖｉｔｒｏ生成 - Google Patents

ソルタギング可能なタンパク質を有する赤血球のｉｎｖｉｔｒｏ生成 Download PDF

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Abstract

脱核赤血球のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成のための方法およびそのようにして調製される脱核赤血球が提供される。このような脱核赤血球は、ソルターゼの存在下で表面修飾を可能にするソルタギング可能な表面タンパク質を発現することができる。また、例えば、ペプチド、検出可能な標識、または化学療法剤などの目的薬剤をコンジュゲートした表面修飾脱核赤血球、および被験体への薬剤の送達におけるその使用も本明細書に記載される。【選択図】図１６Ａ−Ｆ

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２０１３年５月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／８２２，０７１号明細書に対する優先権を主張するものであり、この仮特許出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
政府の支援
本発明は、国防総省国防高等研究事業局（Ｄｅｆｅｎｓｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ Ａｇｅｎｃｙ）（ＤＡＲＰＡ）からの助成金第ＨＲ００１１−１２−２−００１５号の下で、政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
細胞表面は、表面機能を調整するために、またはそのような表面に新規機能を付与するために修飾することができる。表面の機能化としては、例えば、表面タンパク質への検出可能な標識、結合成分、または治療薬の付加が挙げられ、これにより、表面修飾細胞の検出または単離、天然には存在しない新規の細胞間相互作用の生成、または細胞表面への治療薬または診断薬のコンジュゲーションが可能になる。
細胞表面修飾は、遺伝子工学により、または細胞表面タンパク質の化学修飾により達成することができる。しかしながら、両方のアプローチとも、例えば、多くの表面タンパク質が一定の大きさを超えて挿入されるとその機能または発現が障害を受けることになるという点で、また、多くの化学修飾が非生理学的な反応条件を必要とするという点でその能力が限定されている。
本開示は、ヒトＣＤ３４＋末梢血液細胞を脱核赤血球に分化させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ多段階培養工程の開発に基づいている。このｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程は、予想外にも、動員されたヒトＣＤ３４＋末梢血液細胞の赤血球系拡大、最終分化、および脱核を同期させた。本開示はまた、赤血球の表面修飾のためのソルタギング系の開発に基づくものであり、この系では、目的薬剤を脱核赤血球の表面にコンジュゲートさせる。脱核赤血球は、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ多段階培養系により生成させることができる。このような表面修飾された脱核赤血球は、診断および治療の目的に使用することができる。
したがって、本開示の一態様は、ヒト脱核赤血球を生成させるための方法であって、（ｉ）ヒトＣＤ３４＋前駆細胞（例えば、ヒトＣＤ３４＋末梢血液細胞）の集団を準備するステップと、（ｉｉ）ヒトＣＤ３４＋前駆細胞の集団を０〜６日間（例えば、４日間）、第１の培地中で拡大させるステップであって、第１の培地がＦｌｔ−３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、およびインターロイキン６（ＩＬ−６）を含むステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）から得られる拡大したヒトＣＤ３４＋前駆細胞を４〜７日間（例えば、５日間）、第２の培地中で分化させるステップであって、第２の培地がデキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦ、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含むステップと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）から得られる細胞を３〜５日間（例えば、４日間）、第３の培地中で分化させるステップであって、第３の培地がＳＣＦおよびＥＰＯを含むステップと、（ｖ）ステップ（ｉｖ）から得られる細胞を４〜１２日間（例えば９日間）、第４の培地中で分化させてヒト脱核赤血球を生成させるステップであって、第４の培地がＥＰＯを含むステップと、（ｖｉ）ステップ（ｖ）から得られるヒト脱核赤血球を収集するステップとを含む方法を特徴とする。一部の実施形態では、上記方法のステップ（ｉｉ）〜（ｖ）の合計期間は１１〜２５日の範囲である。ステップ（ｖ）は、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックス由来成分でコーティングされた培養容器中で実施してもよい。
一部の実施形態では、第２、第３、および第４の培地の１つまたは複数は、ホロ型ヒトトランスフェリンおよびインスリンをさらに含む。必要な場合、第２、第３、および第４の培地がすべて、これらの２つのサイトカインをさらに含む。他の実施形態では、第２、第３、および／または第４の培地は、特定のサイトカイン、例えば、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはその両方を含まないことがある。
一例では、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成方法の何れにおいても、使用される第２の培地は、２５０〜１５００μｇ／ｍｌ（例えば、５００μｇ／ｍｌ）のホロ型ヒトトランスフェリン、５〜２０μｇ／ｍｌのインスリン（例えば、１０μｇ／ｍｌ）、１００ｎＭ〜５μＭ（例えば、２μＭ）のデキサメタゾン、０．５〜５μＭ（例えば、１μＭ）のβ−エストラジオール、１〜１０ｎｇ／ｍｌ（例えば、５ｎｇ）のＩＬ−３、１０〜５００ｎｇ／ｍｌ（例えば、１００ｎｇ／ｍｌ）のＳＣＦ、および／または２〜１０Ｕ（例えば、６Ｕ）のＥＰＯを含むことができる。第２の培地は、特定のサイトカイン、例えば、Ｆｌｔ−３、ＩＬ−６、またはその両方を含まないことがある。
別の例では、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成方法の何れにおいても、使用される第３の培地は、２５０〜１５００μｇ／ｍｌ（例えば、５００μｇ／ｍｌ）のホロ型ヒトトランスフェリン、５〜２０μｇ／ｍｌ（例えば、１０μｇ／ｍｌ）のインスリン、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）のＳＣＦ、および／または２〜１０Ｕ（例えば、６Ｕ）のＥＰＯを含むことができる。第３の培地は、特定のサイトカイン、例えば、Ｆｌｔ−３、ＩＬ−６、デキサメタゾン、β−エストラジオール、またはそれらの任意の組合せを含まないことがある。
さらに別の例では、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成方法の何れにおいても、使用される第４の培地は、２５０〜１５００μｇ／ｍｌ（例えば、５００μｇ／ｍｌ）のホロ型ヒトトランスフェリン、５〜２０μｇ／ｍｌ（例えば、１０μｇ／ｍｌ）のインスリン、および／または０．５〜３Ｕ（例えば、２Ｕ）のＥＰＯを含むことができる。第４の培地は、特定のサイトカイン、例えば、Ｆｌｔ−３、ＩＬ−６、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＳＣＦ、またはそれらの任意の組合せを含まないことがある。
本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成方法の何れにおいても、ヒトＣＤ３４＋前駆細胞は、本明細書に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞（天然には存在しない）の何れであっても、例えば、赤血球膜タンパク質と目的ペプチドとを含む融合タンパク質を発現するヒトＣＤ３４＋であってもよい。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｉ型赤血球膜貫通型タンパク質（例えば、グリコフォリンＡ）であって、Ｉ型赤血球膜貫通型タンパク質のＮ末端でアクセプターペプチドに融合したＩ型赤血球膜貫通型タンパク質を含む。アクセプターペプチドとしては、オリゴグリシン成分、例えば、１〜５グリシンフラグメント成分、またはオリゴアラニン（例えば、１〜５アラニンフラグメント）成分を挙げることができる。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質（例えば、ＫｅｌｌまたはＣＤ７１）であって、ＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質のＣ末端でソルターゼ（例えば、ソルターゼＡ）により認識される配列を含むペプチドに融合したＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質を含む。ソルターゼにより認識可能な配列は、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）であり得る。さらに他の実施形態では、膜タンパク質は、グルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）などのＩＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質である。
別の態様では、本開示は、第１の目的ペプチドと第１の赤血球膜タンパク質とを含む第１の融合タンパク質を表面上に発現する遺伝子操作された脱核血液細胞を提供する。一部の実施形態では、第１の赤血球膜タンパク質はＩ型赤血球膜貫通型タンパク質（例えば、ヒトグリコフォリンＡなどのグリコフォリンＡ）であり、かつ第１の目的ペプチドはＩ型赤血球膜貫通型タンパク質のＮ末端に融合されている。他の実施形態では、第１の赤血球膜タンパク質はＩＩ型膜貫通型タンパク質（例えば、ＫｅｌｌまたはＣＤ７１）であり、かつ第１の目的ペプチドはＩＩ型膜貫通型タンパク質のＣ末端に融合されている。第１の目的ペプチドは、ソルターゼＡなどのソルターゼにより認識可能な配列を含むことができる。一例では、ソルターゼにより認識可能な配列は、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）である。さらに他の実施形態では、第１の赤血球膜タンパク質は、ＧＬＵＴ１などのＩＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質である。
一部の実施形態では、第１の融合タンパク質は、目的タンパク質（例えば、診断薬または治療薬になり得る細胞質タンパク質）をさらに含む。目的タンパク質は、細胞質空間に露出される、第１の赤血球膜タンパク質の末端に融合されており、第１の目的ペプチドは、細胞外空間または管腔空間に露出される、第１の赤血球膜タンパク質の末端に融合されている。
一部の例では、第１の赤血球膜タンパク質はＩ型膜タンパク質（例えば、ＧＰＡ）であり得る。目的タンパク質はＩ型膜タンパク質のＣ末端に融合されており、かつ第１の目的ペプチドはＩ型膜タンパク質のＮ末端に融合されている。
他の例では、第１の赤血球膜タンパク質はＩＩ型膜タンパク質である。目的タンパク質はＩＩ型膜タンパク質のＮ末端に融合されており、かつ第１の目的ペプチドはＩ型膜タンパク質のＣ末端に融合されている。
さらに他の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞はさらに、第２の目的ペプチドと第２の赤血球膜タンパク質とを含む第２の融合タンパク質を表面上に発現する。
一部の例では、第１の融合タンパク質中の第１の目的ペプチドは、第１のソルターゼの認識可能部位または受容可能ペプチドを含み、かつ第２の融合タンパク質中の第２の目的ペプチドは、第２のソルターゼの認識可能部位または受容可能ペプチドを含む。第１のソルターゼおよび第２のソルターゼは、異なる認識可能部位および異なる受容可能ペプチドを使用する。一例では、第１の目的ペプチドは、モチーフＬＰＸＴＡ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）またはオリゴアラニンを含み；かつ第２の目的ペプチドは、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）モチーフまたはオリゴグリシン（例えば、１〜５個のグリシン残基からなる）を含む。別の例では、第１の融合タンパク質はＫｅｌｌを含み、そのＣ末端はモチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１）を含む第１の目的ペプチドに融合されており、かつ第２の融合タンパク質はＧＰＡを含み、そのＣ末端はオリゴアラニン（例えば、１〜５個のアラニン残基からなる）を含む第２の目的ペプチドに融合されている。
表面上の２つの融合タンパク質を発現する、本明細書に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞の何れにおいても、融合タンパク質の何れか一方またはその両方を、２つの異なる機能成分にコンジュゲートさせることができる。
上記の脱核血液細胞は、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法の何れによっても調製することができる。
一部の実例では、本明細書に記載の赤血球膜タンパク質に融合される第１の目的ペプチド、第２の目的ペプチド、またはその両方は、タンパク質性薬物（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、これは単一ドメイン抗体であってもよい）、ワクチン抗原、蛍光タンパク質、ストレプトアビジン、ビオチン、酵素、または細胞（例えば、疾患細胞）をターゲティングすることができるペプチドを含むことができる。他の実例では、目的ペプチドは検出可能な標識または化学療法剤にコンジュゲートされる。例えば、目的ペプチドは、脂質、炭水化物、核酸、結合剤、クリックケミストリーハンドル、ポリマー、ペプチド、タンパク質、金属、キレーター、放射標識、または小分子にコンジュゲートさせることができる。
さらに別の態様では、本開示は、被験体に薬剤を送達する方法であって、本明細書に記載の脱核血液細胞の何れかを被験体に投与することを含む方法を提供する。一部の例では、送達される脱核血液細胞は、その細胞が送達される被験体に由来する。
さらに、本明細書に記載の目的ペプチドの何れかを赤血球の表面にコンジュゲートするための方法も本開示の範囲内である。この方法は、（ｉ）膜タンパク質と第１のペプチドとを含む融合タンパク質を発現する赤血球を準備するステップと、（ｉｉ）ソルターゼ（例えば、ソルターゼＡ）の存在下で赤血球を目的ペプチドと、ソルターゼが目的ペプチドを融合タンパク質中の第１のペプチドにコンジュゲートさせるのに適した条件下で接触させるステップとを含む。融合タンパク質中の第１のペプチドまたは目的ペプチドの何れかがソルターゼにより認識される配列を含む。一例では、ソルターゼにより認識可能な配列はＬＰＸＴＧ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）である。
一部の実施形態では、膜タンパク質はＩ型赤血球膜貫通型タンパク質（例えば、グリコフォリンＡ）であり、かつ第１のペプチドはＩ型赤血球膜貫通型タンパク質のＮ末端に融合したアクセプターペプチド（例えば、１〜５グリシンフラグメントなどのオリゴグリシンフラグメントを含む）であり、目的ペプチドはソルターゼにより認識される配列を含む。他の実施形態では、膜タンパク質はＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質（例えば、ＫｅｌｌまたはＣＤ７１）であり、かつ第１のペプチドはＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質のＣ末端に融合されており、ソルターゼにより認識可能な配列を含む。さらに他の実施形態では、膜タンパク質はＧＬＵＴなどのＩＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法の何れにおいても、第１の融合タンパク質は、目的タンパク質（例えば、診断薬または治療薬であり得る細胞質タンパク質）をさらに含むことができ、この目的タンパク質は細胞質空間に露出される、第１の赤血球膜タンパク質の末端に融合されている。融合タンパク質中の第１の目的ペプチドは、細胞外空間または管腔空間に露出される、第１の赤血球膜タンパク質の末端に融合されている。
一部の例では、第１の赤血球膜タンパク質はＩ型膜タンパク質である。第１の目的タンパク質はＩ型膜タンパク質のＣ末端に融合されており、第１のペプチドはＩ型膜タンパク質のＮ末端に融合されている。他の例では、第１の赤血球膜タンパク質はＩＩ型膜タンパク質である。目的タンパク質はＩＩ型膜タンパク質のＮ末端に融合されており、第１のペプチドはＩ型膜タンパク質のＣ末端に融合されている。
さらに他の実施形態では、本明細書に記載の方法の何れも、第２のソルターゼの存在下、第２のソルターゼが第２の目的ペプチドを赤血球の表面上に発現される第２の融合タンパク質にコンジュゲートさせるのに適した条件下で赤血球を接触させるステップをさらに含むことができる。第２の融合タンパク質は、第２の赤血球膜タンパク質と第２の目的ペプチドがコンジュゲートする第２のペプチドとを含む。一部の例では、融合タンパク質中の第２のペプチドまたは第２の目的ペプチドの何れかが第２のソルターゼにより認識可能な配列を含む。第１のソルターゼにより認識可能な配列は、第２のソルターゼにより認識可能な配列とは異なる。
一部の例では、第１の融合タンパク質中の第１のペプチドは、第１のソルターゼにより認識可能な配列もしくは第１のソルターゼの受容可能ペプチドを含み、かつ／または第２の融合タンパク質中の第２のペプチドは、第２のソルターゼにより認識可能な配列もしくは第２のソルターゼの受容可能ペプチドを含む。第１のソルターゼの受容可能ペプチドは、第２のソルターゼの受容可能ペプチドとは異なる。第１のソルターゼはスタフィロコッカス・アレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｒｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡとすることができる。第１の融合タンパク質中の第１のペプチドおよび第１の目的ペプチドのうちの一方は、モチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含み、かつ他方は、オリゴグリシンである受容可能ペプチドを含む。第１の融合タンパク質はＫｅｌｌを含むことができ、そのＣ末端はモチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１）を含む第１のペプチドに融合されており、かつ第１の目的ペプチドはオリゴグリシン（例えば、１〜５個のグリシン残基からなる）を含む。
一部の例では、第２のソルターゼはストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のソルターゼＡである。第２の融合タンパク質中の第２のペプチドおよび第２の目的ペプチドのうちの一方は、モチーフＬＰＸＴＡ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含むことができ、かつ他方は、オリゴアラニン（例えば、１〜５個のアラニン残基からなる）であり得る受容可能ペプチドを含むことができる。第２の融合タンパク質はＧＰＡを含むことができ、そのＮ末端はオリゴグリシンを含む第２のペプチドに融合されている。第２の目的ペプチドは、モチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含むことができる。
一部の実施形態では、第１および第２の目的ペプチドは、２つの異なる機能成分を含むかまたはそれにコンジュゲートされる。代替的または追加的に、第１の目的ペプチド、第２の目的ペプチド、またはその両方は、タンパク質性薬物、ワクチン抗原、蛍光タンパク質、ストレプトアビジン、ビオチン、酵素、または細胞をターゲティングすることができるペプチドであり得る。一例では、第１および第２の目的ペプチドのうちの一方は、疾患細胞をターゲティングすることができるペプチドである。
さらに、本開示は、（ａ）診断用途または治療用途用の医薬組成物であって、本明細書に記載の目的ペプチドの何れかを担持する、本明細書に記載の脱核赤血球の何れかと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物、ならびに（ｂ）診断目的または治療目的の薬物を製造するための、この医薬組成物の使用を提供する。
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、以下の説明で示される。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面および特定の実施形態の詳細な説明から、また特許請求の範囲から明らかになるであろう。
図１は、ヒトＣＤ３４＋前駆細胞から脱核赤血球を生成させるための例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程を示す図である。 図２は、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程における拡大段階および種々の分化段階での細胞の形態を示す写真である。 図３は、ＦＡＣＳ分析により判定される、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程での拡大段階および種々の分化段階における、細胞の細胞表面マーカーであるグリコフォリンＡ（ＣＤ２３５）およびｃ−ｋｉｔの発現を示す図である。 図４は、ＦＡＣＳ分析により判定される、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程での拡大段階および種々の分化段階における、細胞の細胞表面マーカーであるグリコフォリンＡ（ＣＤ２３５）およびトランスフェリン受容体（ＣＤ７１）の発現を示す図である。 図５は、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程における拡大段階および種々の分化段階での細胞の脱核を示す図である。 図６は、種々の分化段階での細胞増殖を示すチャートである。 図７は、およそ２０日のウィンドウにおける細胞増殖を示すチャートである。 図８は、ｈＣＤ３４＋細胞分化の間に示される、グロビン遺伝子の発現を示すチャートである。 図９は、ｈＣＤ３４＋細胞分化の間に示される、種々の遺伝子の発現を示すチャートである。 図１０は、５Ｇｌｙ（配列番号３）−ｍｙｃ−ヒトグリコフォリンＡ（ｈＧＹＰＡまたはｈＧＰＡ）融合タンパク質を生成させるためのＥＦ１発現ベクターおよびＭＳＣＶ発現ベクターの構築を示す図である。 図１１は、ＥＦ１発現ベクターを使用する、ｈＣＤ３４＋の赤血球系前駆細胞（種々の分化段階にある）上のソルタギング可能なｈＧＹＰＡの表面発現を示す図である；５Ｇｌｙ：（配列番号３）。 図１２は、ＭＳＣＶ発現ベクターを使用する、ｈＣＤ３４＋の赤血球系前駆細胞（種々の分化段階にある）上のソルタギング可能なｈＧＹＰＡの表面発現を示す図である；５Ｇｌｙ：（配列番号３）。 図１３は、ウエスタンブロッティングにより判定される、ソルタギングによるｈＣＤ３４＋赤血球系前駆細胞上におけるビオチンのｈＧＹＰＡへのコンジュゲーションを示す写真である；５Ｇ：（配列番号３）。 図１４は、ソルタギングを介する、最終分化段階にあるヒトＣＤ３４＋細胞の表面へのビオチンのコンジュゲーションを示す図である；５Ｇｌｙ：（配列番号３）。 図１５は、ソルタギングを介する、最終分化段階にあるヒトＣＤ３４＋細胞の表面へのビオチンのコンジュゲーションを示す図である；５Ｇｌｙ：（配列番号３）。 図１６は、成熟マウス赤血球の表面上におけるグリコフォリンＡの発現およびソルターゼ媒介Ｎ末端標識化を示す図である。図１６Ａは、グリコフォリンＡのＮ末端ソルターゼ標識化についての概略図である。３個のグリシン残基および１個のｍｙｃタグを含むように、ＧＰＡのＮ末端を伸長させた。Ｃ末端ソルターゼ認識モチーフ、ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）を含有するプローブとソルターゼをプレインキュベートすると、ＴとＧとの間の切断およびソルターゼ上のＣｙｓとプローブ上のＴｈｒとの間でのアシル酵素中間体の形成がもたらされる。ＧＰＡ上のＮ末端グリシンの求核攻撃により中間体が分解して、プローブがＧＰＡに連結する。このプローブは、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、小分子等であり得る。ビオチンのＧＰＡへのコンジュゲーションの場合、プローブはＫ（ビオチン）ＬＰＲＴＧＧ（配列番号４５）；ＬＰＸＴＧＧ：（配列番号４６）である。図１６Ｂは、α−ＴＥＲ１１９およびα−ｍｙｃタグ抗体により、対照血液または３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡを発現するように骨髄移植を受けたマウスからの血液の何れかを染色し、フローサイトメトリーにより分析することによる、細胞表面上の３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡの存在に関する成熟ＲＢＣの評価を示す図である。図１６Ｃは、対照血液または３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ血液をソルターゼおよびビオチン含有プローブとインキュベートし、α−ＴＥＲ１１９およびα−ビオチン抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析することによる、ソルターゼ標識化に関する成熟ＲＢＣの評価を示す図である。図１６Ｄは、免疫ブロッティングによる、ソルターゼ標識化に関するＲＢＣの評価を示す図である。対照血液または３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ血液をソルターゼ存在下または非存在下でビオチンプローブとインキュベートし、全細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、α−ｍｙｃタグおよびα−ビオチンに対して免疫ブロットした。α−ｍｙｃタグ免疫ブロットにおける、ビオチンコンジュゲーションによるＧＰＡ分子量のシフトにより、ほぼ完全な修飾が示される。ビオチンをコンジュゲートしたＧＰＡは、α−ビオチン免疫ブロットで矢印により示される。図１６Ｅは、ビオチンでコンジュゲートされたＲＢＣを、フローサイトメトリーによりソートした図を示す。免疫蛍光画像は、成熟ＲＢＣ上のｈＧＰＡ（Ｔｅｒ１１９抗体で標識、紫色）のＮ末端にあるビオチン（赤色で標識）を示す。図１６Ｆは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３Ａ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ、ｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）、またはその両方でトランスフェクトした結果を示す図である。細胞を、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼおよびビオチンプローブとインキュベートし、次いでＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼおよびＴＡＭＲＡ含有プローブとインキュベートした。ビオチンのＧＰＡへの特異的コンジュゲーションおよびＴＡＭＲＡのＫｅｌｌへの特異的コンジュゲーションが、免疫ブロッティングおよび蛍光イメージングにより示される。 図１７は、Ｎ末端にｍｙｃタグを含有する修飾ヒトＧＰＡおよびマウスＧＰＡの過剰発現が、マウス赤血球系前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化に影響を与えないことを示す図である。図１７Ａは、Ｎ末端がｍｙｃタグで伸長した修飾ヒト（ｈ）またはマウス（ｍ）ＧＰＡコンストラクト：ｍｙｃ−ｈＧＰＡおよびｍｙｃ−ｍＧＰＡを含有するレトロウイルスコンストラクトで感染された、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したマウス胎仔肝臓由来前駆細胞の分化能力に関するフローサイトメトリー分析を示す図である。これらの細胞の分化能力は、Ｔｅｒ１１９＋網状赤血球をもたらす、Ｔｅｒ１１９の発現および脱核、すなわち核排除に基づいて評価される。ｍｙｃ−ｈＧＰＡまたはｍｙｃ−ｍＧＰＡで感染された赤血球系前駆細胞により生成された網状赤血球のパーセンテージ（約２０％）は、空（対照）ベクターで感染された細胞に匹敵しており、これから、これらのコンストラクトは赤血球系の最終分化を妨害しないことが示される。脱核割合の定量は、３つの独立した実験によるものであり、平均値＋／−標準偏差として図示した。図１７Ｂは、ｍｙｃ−ｈＧＰＡまたはｍｙｃ−ｍＧＰＡの表面発現に関する、マウス最終分化赤芽球、すなわち有核赤芽球、および網状赤血球の評価を示す図である。α−ｍｙｃタグ抗体を使用するフローサイトメトリーにより測定すると、これらの最終分化細胞の６０％超が所望の修飾ＧＰＡタンパク質を発現した。細胞表面上にｍｙｃ−タグを有する赤芽球および網状赤血球のパーセンテージは、３つの独立した実験から決定し、平均値＋／−標準偏差として図示した；＊＊はｐ＜０．０１を示す。図１７Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで最終分化した赤芽球のｍｙｃタグ（赤色で標識）の表面発現および脱核能力（青色の核染色）をさらに確認する免疫蛍光画像である。 図１８は、Ｎ末端に複数（３個または５個）のグリシン（配列番号３）を有する、ｍｙｃタグ含有の操作されたヒトＧＰＡおよびマウスＧＰＡの過剰発現がマウス赤血球系前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化に影響を与えないことを示す図である。Ｎ末端にｍｙｃ−タグおよび３個のグリシンを有する、操作されたヒトＧＰＡを発現する細胞のみが、ソルタギングにより効率的にビオチン標識化することができる。図１８Ａは、Ｎ末端にｍｙｃタグおよび複数（３個または５個）のグリシン（配列番号３）（Ｇ）が伸長した修飾ヒト（ｈ）またはマウス（ｍ）ＧＰＡを含有するレトロウイルスコンストラクト：５Ｇ（配列番号３）−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ、５Ｇ（配列番号３）−ｍｙｃｍＧＰＡ、および３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡで感染された、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したマウス胎仔肝臓由来前駆細胞の分化能力に関するフローサイトメトリー分析を示す図である。これらの細胞の分化能力は、Ｔｅｒ１１９＋網状赤血球をもたらす、Ｔｅｒ１１９の発現および脱核、すなわち核排除に基づいて評価される。上部パネルを参照されたい。５Ｇ（配列番号３）−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ、５Ｇ−ｍｙｃ−ｍＧＰＡ、および３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡで感染された赤血球系前駆細胞により生成された網状赤血球のパーセンテージ（約１７．５％）は、空（対照）ベクターで感染された細胞に匹敵しており、これから、これらのコンストラクトは赤血球系の最終分化を妨害しないことが示される。脱核割合の定量は、３つの独立した実験によるものであり、平均値＋／−標準偏差として図示した。下部パネルを参照されたい。図１８Ｂは、５Ｇ（配列番号３）−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ、５Ｇ（配列番号３）−ｍｙｃｍＧＰＡ、および３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡの表面発現に関する、マウス最終分化赤芽球、すなわち有核赤芽球、および網状赤血球の評価を示す図である。α−ｍｙｃタグ抗体を使用するフローサイトメトリーにより測定すると、これらの最終分化細胞の５０％超が所望の修飾ＧＰＡタンパク質を発現していた。上部パネルを参照されたい。細胞表面上にｍｙｃ−タグを有する赤芽球および網状赤血球のパーセンテージは、３つの独立した実験から決定し、平均値＋／−標準偏差として図示した；＊＊はｐ＜０．０１を示す。下部パネルを参照されたい。図１８Ｃでは、５Ｇ（配列番号３）−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ、５Ｇ（配列番号３）−ｍｙｃ−ｍＧＰＡ、３Ｇ−ｍｙｃ−ｍＧＰＡ、および３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡを発現するように、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。次いで、これらの細胞をソルターゼ存在下または非存在下でビオチンプローブとインキュベートし、全細胞タンパク質をｍｙｃタグおよびビオチンについて免疫ブロットした。ビオチンに対する免疫ブロット染色から、ヒトＧＰＡコンストラクトである３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ（強いバンド）および５Ｇ（配列番号３）−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ（弱いバンド）へのビオチンコンジュゲーションのみが成功していることが示され、３Ｇｍｙｃ（強いバンド）についてはるかに高い効率であり、また５Ｇ（配列番号３）−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ（弱いバンド）、３Ｇｍｙｃ−ｈＧＰＡについてはるかに高い効率である。ビオチンコンジュゲーションによるｈＧＰＡ分子量のシフトによって示されるように、α−ｍｙｃタグ免疫ブロッティングにより、ビオチンプローブコンジュゲーションがさらに確認される。 図１９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した赤芽球の表面上におけるグリコフォリンＡの発現およびソルターゼ媒介Ｎ末端標識化を示す図である。図１９Ａは、α−ｍｙｃおよびα−ビオチンタグ抗体で染色することによる、細胞表面上の３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡの存在に関する、またソルターゼ標識化ビオチン３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡに関する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した赤芽球のフローサイトメトリー分析を示す図である。上部パネルを参照されたい。細胞表面上にｍｙｃタグを有する赤芽球および網状赤血球のパーセンテージおよびビオチンプローブでソルタギングされたｍｙｃタグ陽性細胞のパーセンテージは、３つの独立した実験から決定し、平均値＋／−標準偏差として図示した；＊＊はｐ＜０．０１を示す。下部パネルを参照されたい。図１９Ｂは、α−ｍｙｃタグおよびα−ビオチン抗体を用いた免疫ブロッティングによる、対照または３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ赤芽球と、ソルターゼおよびビオチン含有プローブとをインキュベートすることによるソルターゼ標識化に関する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した赤芽球の評価を示す図である。α−ｍｙｃブロットにおける、ビオチンコンジュゲーションによるｈＧＰＡ分子量のシフトにより、ｈＧＰＡの完全な修飾が示される。ビオチンをコンジュゲートしたＧＰＡは、α−ビオチン免疫ブロットにおいて矢印で示される。図１９Ｃは、分化した赤芽球の表面上にあるｈＧＰＡのＮ末端にビオチン（赤色で標識）を示す免疫蛍光を示す図である。核はヘキスト（青色）により染色した。矢印は網状赤血球を示し、一方矢頭は脱核する赤芽球を示す。スケールバーは１０μｍである。 図２０は、マウス骨髄／胎仔肝細胞移植による、操作されたＲＢＣ生成の概略図である。単離されたマウス骨髄細胞または胎仔肝細胞に、ｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡまたは３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡを担持するレトロウイルスを形質導入した。致死的な照射を受けたマウスを、形質導入された骨髄または胎仔肝細胞で再構成した。１ヶ月後以降、成熟ＲＢＣのかなりのパーセンテージが形質導入されたドナー前駆細胞に由来する。 図２１は、成熟マウス赤血球の表面上におけるＫｅｌｌの発現およびソルターゼ媒介Ｃ末端標識化を示す図である。図２１Ａは、ＫｅｌｌのＣ末端のソルターゼ標識化についての概略図である。Ｋｅｌｌは、ソルターゼ認識モチーフＬＰＥＴＧ（配列番号４４）、次いでＨＡエピトープタグを含むようにＣ末端が伸長された。Ｋｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）を含有する細胞とソルターゼをインキュベートすることにより、認識モチーフ中のＴとＧとの間でペプチド切断が起こり、ソルターゼ上のＣｙｓとＫｅｌｌ上のソルターゼモチーフとの間にアシル酵素中間体が形成される。Ｎ末端グリシン残基を有する求核性プローブ（ＧＧＧ−Ｋ（ビオチン）；配列番号４７；ビオチンコンジュゲーション用）を添加すると、中間体が分解して、ＫｅｌｌのＣ末端にプローブが連結する。このプローブは、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、小分子等であり得る；ＬＰＸＴＧ（配列番号１）。図２１Ｂは、対照血液またはＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）を発現するように骨髄移植を受けたマウスに由来する血液の何れかをα−ＨＡタグ抗体により染色し、フローサイトメトリー（成熟ＲＢＣに関してゲート制御）により分析することによる、細胞表面上のＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡの存在に関する、成熟ＲＢＣの評価を示す図である。図２１Ｃは、対照血液またはＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡ血液と、ソルターゼおよびビオチン含有プローブとをインキュベートし、α−ビオチン抗体で染色し、フローサイトメトリー（成熟ＲＢＣに関してゲート制御）により分析することによる、ソルターゼ標識化に関する成熟ＲＢＣの評価を示す図である。図２１Ｄは、免疫ブロッティングによる、ソルターゼ標識化に関するＲＢＣの評価を示す図である。対照血液またはＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡ血液を、ソルターゼ存在下または非存在下でビオチンプローブとインキュベートした。全細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、α−ＨＡタグおよびα−ビオチンに対して免疫ブロットした。ソルターゼ標識化によるＨＡタグの消失により、完全な修飾が示される。図２１Ｅは、成熟ＲＢＣ上のｈＫｅｌｌのＣ末端にコンジュゲートされたビオチンを示す免疫蛍光画像である（Ｔｅｒ１１９抗体で標識化）。 図２２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した赤芽球の表面上におけるＫｅｌｌの発現およびソルターゼ媒介Ｃ末端標識化を示す図である。図２２Ａは、α−ＨＡおよびα−ビオチンタグ抗体で染色することによる、細胞表面上のｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡの存在に関する、またソルターゼ標識化ｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ビオチンに関する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した赤芽球のフローサイトメトリーを示す図である。上部パネルを参照されたい。細胞表面上にＨＡタグを有する赤芽球および網状赤血球のパーセンテージおよびビオチンプローブでソルタギングされたＨＡタグ陽性細胞のパーセンテージは、３つの独立した実験から決定し、平均値＋／−標準偏差として図示した；＊＊はｐ＜０．０１を示す。下部パネルを参照されたい。図２２Ｂは、対照またはｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡ赤芽球と、ソルターゼおよびビオチン含有プローブとをインキュベートし、次いでビオチンおよびＫｅｌｌに対する免疫ブロッティングを行うことによる、ソルターゼ標識化に関する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した赤芽球の評価を示す図である。図２２Ｃは、分化した赤芽球の表面上のｈＫｅｌｌのＣ末端にビオチン（赤色で標識）を示す免疫蛍光を示す図である。核はヘキスト（青色）により染色した。矢印は網状赤血球を示し、一方矢頭は脱核する赤芽球を示す。スケールバーは１０μｍである。 図２３は、成熟ＲＢＣの表面上のｈＧＰＡのＮ末端およびｈＫｅｌｌのＣ末端におけるソルターゼ媒介２重標識化を示す図である。ｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡおよび３Ａ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡを発現する成熟ＲＢＣを、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のソルターゼＡおよびＫ（ビオチン）ＬＰＥＴＡＡ（配列番号４５）プローブとインキュベートして、Ｎ末端ＧＰＡ標識化を行うか（第２パネル）、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡおよびＧＧＧＣ（Ａｌｅｘａ−６４７；配列番号４８）プローブとインキュベートして、Ｃ末端Ｋｅｌｌ標識化を行うか（第３パネル）、あるいは両方のソルターゼ酵素およびその対応するプローブによる両方の連続的な標識化を行った（第４パネル）。ｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴ（配列番号４９）とビオチン−ｍｙｃ−ｈＧＰＡの両方の存在に関する、成熟ＲＢＣのフローサイトメトリー分析から２重標識化の成功が示される。 図２４は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、操作された赤血球の生存を示すいくつかのチャートである。図２４Ａは、ソルターゼの存在下もしくは非存在下での模擬Ｃ末端ソルタギング反応に供した野生型ＲＢＣ（各群、ｎ＝３）または無処理の野生型ＲＢＣ（ｎ＝３）をＣＦＳＥと反応させ、静脈内注射によりレシピエントマウスに移入した場合の結果を示すチャートである。それらのｉｎ ｖｉｖｏでの生存は、ＣＦＳＥ蛍光およびフローサイトメトリーにより追跡した。図２４Ｂは、Ｃ末端にＬＰＥＴＧ（配列番号４４）が伸長した内因性Ｋｅｌｌを有するように遺伝子操作されたマウスから得られるｍＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）ＲＢＣの結果を示すチャートである。野生型ＲＢＣ（ｎ＝６）、ｍＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）ＲＢＣ（ｎ＝６）、およびビオチンでソルタギングされたｍＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＲＢＣ（ｎ＝６）をＣＦＳＥで染色し、レシピエントに移入し、フローサイトメトリーを使用してＣＦＳＥ蛍光または抗ビオチン染色によりそれらの生存をモニターした。図２４Ｃは、ＣＦＳＥ染色の野生型ＲＢＣ（ｎ＝６）、および移植されたマウス（実施例５を参照）から単離し、ビオチンでソルターゼ標識したｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）ＲＢＣ（ｎ＝２）をレシピエントマウスに移入し、血液循環中のそれらの生存を、フローサイトメトリーを使用してＣＦＳＥ蛍光（野生型ＲＢＣ）または抗ビオチン染色（ｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ビオチンＲＢＣ）により追跡した結果を示すチャートである。図２４Ｄは、野生型ＲＢＣ（ｎ＝６）およびソルターゼ標識したビオチン−３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ ＲＢＣ（ｎ＝６）を、ＣＦＳＥ染色し、マウスに移入し、フローサイトメトリーを使用してＣＦＳＥ蛍光または抗ビオチン染色により追跡した結果を示すチャートである。内部標準ＲＢＣは、３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ移植マウスに由来し、ソルタギング反応およびＣＦＳＥ染色に供した細胞であるが、野生型である。エラーバーは標準偏差を表わす；＊はｐ＜０．０１を示す。 図２５は、操作された赤血球への単一ドメイン抗体のコンジュゲーションおよび細胞型特異的ターゲティングを示す図である。図２５Ａは、細胞表面上に３Ｇ−ｍｙｃ−ＧＰＡを含有するように操作されたマウス成熟赤血球を、ＶＨＨ７−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）の存在下または非存在下のソルターゼ、マウスＭＨＣクラスＩＩ分子に対する特異性を有する単一ドメイン抗体、および３Ｇに相補的なソルターゼモチーフとインキュベートした結果を示す図である。グリコフォリンＡ上のｍｙｃエピトープタグに対する免疫ブロットは、ＧＰＡ分子量の増加からＧＰＡへのＶＨＨ７の融合を示す。図２５Ｂは、野生型マウスＢ細胞（ＭＨＣクラスＩＩ）またはＭＨＣクラスＩＩノックアウトマウス由来Ｂ細胞の何れかを、ビオチン化α−ＣＤ１９抗体を介して磁気ストレプトアビジンビーズ上に固定化し、３Ｇ−ｍｙｃ−ＧＰＡ赤血球またはソルターゼ標識されたＶＨＨ７−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ｍｙｃ ＧＰＡをその表面上に含有する赤血球とインキュベートし、洗浄した結果を示す図である。すべての実験セットアップにおけるＢ細胞の固定化は、α−ＣＤ１９免疫ブロットにおけるＣＤ１９の存在により試験し、Ｂ細胞と赤血球との間の結合は、α−ヘモグロビン免疫ブロットにおけるヘモグロビンの存在によって評価した。図２５Ｃは、図２５Ｂに示す実験の概略図である；ＬＰＥＴＧ：（配列番号４４）。 図２６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したヒト網状赤血球の表面上におけるグリコフォリンＡの発現およびソルターゼ媒介標識化を示す図である。図２６Ａは、ヒト果粒球コロニー刺激因子により動員された末梢血ＣＤ３４＋幹細胞に、空ベクターまたは３Ｇ−ｍｙｃ−ＧＰＡ−ＧＦＰを含有するベクターをウイルス形質導入し、１８日間分化させた結果を示す図である。網状赤血球のフローサイトメトリー分析では、形質導入された細胞（ＧＦＰ＋）のパーセンテージ、および脱核細胞（下部パネル、ヘキスト染色）のパーセンテージを示す。対照または３Ｇ−ｍｙｃ−ＧＰＡ−ＧＦＰ（３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）形質導入の網状赤血球を、ソルターゼおよびビオチン含有プローブとインキュベートし、α−ビオチン−ＰＥ抗体でビオチンに対して染色し、フローサイトメトリーにより分析し、脱核細胞に関してゲート制御した。図２６Ｂは、３Ｇ−ｍｙｃ−ＧＰＡ−ＧＦＰ形質導入し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させた網状赤血球をソルターゼ存在下または非存在下でビオチンプローブとインキュベートし、全細胞タンパク質をｍｙｃタグおよびビオチンに関して免疫ブロットした結果を示す図である。３Ｇ−ｍｙｃ−ＧＰＡ−ＧＦＰの単量体および二量体（より高分子量）は両方とも、両方の免疫ブロットで視認できる。α−ｍｙｃタグ免疫ブロットにおける、ビオチンコンジュゲーションによるＧＰＡ−ＧＦＰ分子量のシフトから、完全な修飾が示される。
赤血球は血中で最多の細胞型であり、人体の総細胞数の４分の１を占める。ＲＢＣは、種々の目的、例えば天然または合成のペイロードのｉｎ ｖｉｖｏ送達のための、治療および診断における魅力的なツールにＲＢＣをする独自の特性を保有する。Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ １０（７）：５２１−５３５。例えば、成熟赤血球は核を有していない（すなわち、脱核されている）ため、外来遺伝子の残存物を宿主の中へ送達するリスクがないことになる。したがって、幹細胞ベースの療法の重要なリスクである腫瘍原性の可能性（Ｇｒｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ２４（１０）：２１６２−２１６９）は、これによって排除される。さらに、赤血球は、ｉｎ ｖｉｖｏで長い寿命、例えば、ヒト血流中で約１２０日、またはマウスで約５０日の寿命を有し、マクロおよびミクロの血液循環の全体にわたって存在する。したがって、生物が利用可能な治療法を担う赤血球の修飾により、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、効力が延長し、血液循環により灌流される全領域がカバーされる可能性がある。さらに、ＲＢＣは約１４０μｍ２の大きな細胞表面積を有し、その比表面積も好ましい値になっている。また、赤血球は、治療薬または診断薬の送達用の担体として使用される場合、良好な生体適合性を示す。最終的に、古いまたは損傷されたＲＢＣは、細網内皮系の細胞により除去され得る。このように、ＲＢＣ前駆体のＤＮＡになされたいかなる改変も、脱核に際して除去され、レシピエントへの移入後に異常成長または腫瘍原性がもたらされることはない。
したがって、診断薬または治療薬などの目的薬剤を担持する脱核赤血球を生成させるための方法を開発することは、大きな関心事である。このような脱核赤血球は、例えば、目的薬剤を被験体に送達するために使用することができる。
操作されたＲＢＣは、封入を使用して（Ｂｉａｇｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＩＵＢＭＢ ｌｉｆｅ ６３（８）：６２１−６３１；Ｇｏｄｆｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ １２（１）：１２７−１３３；およびＭｕｚｙｋａｎｔｏｖ，２０１０，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ７（４）：４０３−４２７）、外来ペプチドの非共有結合によって、またはＲＢＣの表面タンパク質に特異的なモノクローナル抗体への融合によるタンパク質の設置を通して（Ｍｕｒｃｉａｎｏ，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（８）：８９１−８９６；およびＺａｉｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｌｏｏｄ １１５（２５）：５２４１−５２４８）、作製されている。修飾ＲＢＣは、ｉｎ ｖｉｖｏでの適用を意図する場合、限界に直面する。封入により、かなり多量の物質の捕捉が可能になるが、形質膜の完全性が犠牲になると同時に修飾赤血球の循環半減期が減少する。浸透駆動的な捕捉では、封入に成功し得る物質の化学的性質が限定され、放出部位の制御が困難であり、また封入された酵素は最終目的地でのみ機能し、他の部位での再利用は低くなる。Ｍｕｒｃｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３およびＺａｉｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１０。ＲＢＣ特異的抗体（例えば、抗グリコフォリン抗体）への融合によるＲＢＣへの積荷のターゲティングには限界がある。というのは、ＲＢＣへのこの結合方法は非共有結合であり、容易に解離し、そのため送達に利用可能な積荷の循環半減期および量が減少するからである。Ｍｕｒｃｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３およびＺａｉｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１０。ターゲティング送達のためにＲＢＣを利用する他の開発には、ＲＢＣ模倣膜に被覆されたナノ粒子およびＲＢＣ形状ポリマーが挙げられる。Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １０（７）：５２１−５３５。ＲＢＣに示唆されたこれらの担体は、ｉｎ ｖｉｖｏでの生存期間が短い（最大約７日）ため、その治療有用性に限界がある可能性がある。
ＲＢＳを操作することに関連した別の技術的困難は、ＲＢＣの培養および分化に適したｉｎ ｖｉｔｒｏ系がないことである。ヒトＣＤ３４＋細胞培養系が、Ｍｉｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４（１０）：１２５５−１２５６，２００６；Ｓａｎｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２（５９０９）：１８３９−１８４２，２００８、およびＧｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１８（１９）：５０７１−５０７９，２０１１に開示されている。しかしながら、これらの細胞培養系から得られる成熟脱核赤血球は、正常のヒト網状赤血球または赤血球に比較して同様のヘモグロビン含量および／または細胞サイズを示さず、培養過程中に細胞表面分化マーカーの同期した発現を示さなかった。また、Ｓａｎｋａｒａｎ ｅｔ．ａｌに教示される細胞培養系では、最終分化した赤血球系細胞または脱核赤血球を生成しなかった。
既存の技術に関連した欠点を考慮すると、体内の特定の部位に多種多様の有用な積荷を運搬できるように、ＲＢＣを操作するための新規の方法論を開発する必要がある。
本研究では、多種多様なペイロードの全身送達のための担体として役立つ修飾赤血球が開発された。これらのＲＢＣは、その形質膜上に修飾タンパク質を含有するが、この修飾タンパク質は、標的膜または標的細胞に損傷を与えることなく、天然条件下にてソルターゼ触媒反応で標識することができる。ソルターゼは、遺伝学的にコードすることができない置換基によるＲＢＣの修飾を可能にする広範囲の天然および合成のペイロードに適応する。本研究では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したマウス赤芽球および成熟マウスＲＢＣへのビオチンの部位特異的コンジュゲーションの成功が示される。予想外にも、これらの修飾赤血球は、当技術分野で公知の方法により操作された赤血球をはるかに超えた最大２８日間血流に残存する。ＲＢＣに酵素的に結合された単一ドメイン抗体により、抗体標的を発現する標的細胞にＲＢＣが特異的に結合することが可能になる。本研究はヒト赤血球に拡張され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したヒト網状赤血球の予想外の効率的なソルターゼ媒介標識化を実証する。
本明細書に記載の操作および標識化の方法は、細胞を損傷することもｉｎ ｖｉｖｏでの細胞生存に影響を与えることもない。最も重要なことには、操作された赤血球は、小分子、ペプチド、およびタンパク質を含む、多種多様な機能的プローブで標識することができ、そのため、血流への種々の治療物質の担体になる可能性がある。したがって、本明細書に記載の方法は、当技術分野で公知の浸透駆動封入方法にまさる利点を提供する。
ソルターゼ媒介細胞表面標識化は、例えば、インフルエンザ糖タンパク質の輸送を探究するために、以前利用されている。Ｐｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１２ ＰＬｏｓ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ８（３）：ｅ１００２６０４；およびＳａｎｙａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ １４（５）：５１０−５２１。この方法論は修正され、診断目的または治療目的のためのプラットフォームとしての初代細胞に適用された。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡ変異体（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１ ＰＮＡＳ １０８（２８）：１１３９９−１１４０４）は０℃で活性であり、標識化の間に細胞損傷を与えるリスクが低減している。
本明細書に提示の方法に対しては、多くの他の適用が可能であるが、ここではタンパク質およびペプチドから合成化合物および蛍光プローブに及ぶ多種多様の可能なペイロードが案内として役立ち得る。例えば、このような方法により、特定の細胞型への修飾赤血球のターゲティングが可能になろう。さらに、本明細書に記載の方法は、小分子封入の確立したプロトコール（Ｇｏｄｆｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）と組み合わせることができる。このシナリオでは、サイトゾルに治療薬が負荷され、かつ細胞型特異的認識モジュールで表面が修飾された操作された赤血球を使用して、体内の正確な組織／部位にペイロードを送達することが可能になろう。赤血球の表面への２種の異なる機能的プローブの結合が本明細書で実証されており、２種の別々のソルターゼのわずかに異なる認識特異性が利用される。したがって、赤血球表面に治療成分とターゲティングモジュールの両方を結合させて、この操作された赤血球を腫瘍または他の疾患細胞に向けることが可能になるはずである。また、このようなターゲティング成分と一緒にイメージングプローブ、すなわち放射性同位元素のコンジュゲーションにより、診断目的に使用することも可能になろう。
本明細書に記載するヒトＲＢＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの生成およびそれらの前駆体の遺伝子操作は、例えばサイトゾル修飾と組み合わせて、この表面操作方法の臨床用途への適用のための強固なプラットフォームを提供することができる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｂｌｏｏｄ １１５（１０）：２０２１−２０２７；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９−８２６；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３−８２６；Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｂｌｏｏｄ １１８（１９）：５０７１−５０７９；Ｄｏｕａｙ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｂｌｏｏｄ １０５（１）：８５−９４；およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｂｌｏｏｄ １１９（２６）：６２９６−６３０６）。さらに、輸血の安全性が確立されていることにより、これらの操作された赤血球が実際にヒトに使用される確信が得られる。
したがって、動員されたＣＤ３４＋前駆細胞（例えば、動員されたヒトＣＤ３４＋末梢血液細胞）から脱核赤血球を生成させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ多段階培養工程が本明細書に記載される。このような脱核赤血球は、目的タンパク質、例えばソルタギング可能な表面タンパク質を発現するように遺伝子操作することができる。また、ソルターゼ媒介トランスペプチド反応により、目的の１種または複数の薬剤を遺伝子操作された脱核赤血球の表面にコンジュゲートするための方法、ならびに目的の標的成分による修飾膜タンパク質のソルタギングにより目的の標的にＲＢＣを選択的にターゲティングする能力を保持させる一方、ヒトＲＢＣなどの成熟ＲＢＣ中に目的の細胞質配置タンパク質を生成させるための方法も本明細書に記載される。
Ｉ．脱核赤血球を生成させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系
ＣＤ３４＋前駆細胞（例えば、ヒト被験体由来）から成熟脱核赤血球を生成させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程が本明細書に記載される。この培養工程には、複数の分化段階（例えば、２、３、またはそれ以上の段階）および場合によっては分化段階の前の拡大段階が含まれる。本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程の合計期間は、１１〜２５日の範囲（例えば、１５〜２５日、１５〜２０日、または１８〜２１日）に及び得る。一例では、合計期間は２１日である。
ａ．ＣＤ３４＋前駆細胞
ＣＤ３４は、細胞表面糖タンパク質であり、細胞間接着因子として機能する。多くのヒト前駆細胞がこの細胞表面マーカーを発現する。Ｎｏｖｅｒｓｈｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４４：２９６−３０９，２０１１。幹細胞のような前駆細胞には、特定の細胞型に分化する傾向がある。前駆細胞は通常、幹細胞よりも特異的であり、多くの場合、標的細胞に分化するように促進される。赤血球に分化する傾向を保有する任意のＣＤ３４＋前駆細胞型を、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程で使用することができる。そのような前駆細胞は当技術分野で周知である。例えば、Ｎｏｖｅｒｓｈｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４４：２９６−３０９，２０１１を参照されたい。一部の例では、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程は、脱核赤血球への分化のための前駆細胞として、動員されたＣＤ３４＋末梢血液細胞を利用する。ＣＤ３４＋前駆細胞は、他の供給源（例えば、骨髄）に由来する場合もある。
末梢血液細胞などの適切な供給源からＣＤ３４＋細胞集団を分離または単離するために、種々の手法を使用することができる。例えば、ＣＤ３４に結合するモノクローナル抗体などの抗体を使用して、ＣＤ３４＋細胞を濃縮または単離することができる。抗ＣＤ３４抗体を固体支持体に結合させることができるため、この表面マーカーを発現する細胞を固定化して、この表面マーカーを発現しない細胞からＣＤ３４＋細胞を分離することが可能になる。使用される分離手法では、回収される生細胞の保持が最大化されるべきである。そのような分離手法により、選択された細胞の最大１０％、通常は約５％以下、好ましくは約１％以下しかＣＤ３４を発現しない細胞亜集団を得ることができる。使用される特定の手法は、分離効率、付随する細胞毒性、実施の容易さおよびスピード、ならびに精巧な装置および／または技術的熟練に対する必要性に依存することになる。
本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程で使用される、「単離された」または「精製された」ＣＤ３４＋細胞集団は、天然では付随している細胞および物質、具体的には、所望の表現型、例えばＣＤ３４の発現を欠く細胞を実質的に含まない。実質的に含まないまたは実質的に精製されたものは、少なくとも５０％のＣＤ３４＋細胞、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、一層より好ましくは少なくとも９０％のＣＤ３４＋細胞を含む。
ＣＤ３４＋細胞集団を分離するための手技としては、以下に限定されるものではないが、物理的分離、磁気分離、抗体コーティング磁気ビーズ、親和性クロマトグラフィー、モノクローナル抗体に連結したもしくはモノクローナル抗体と組み合わせて使用される、補体および細胞毒素を含むが、これらに限定されない細胞傷害性薬剤、ならびに固相マトリックス、例えばプレートに結合した抗体による「パニング」、水簸、または他の任意の好都合な手法が挙げられる。
また、物理的分離手法の使用には、物理的特性（密度勾配遠心分離および向流遠心水簸）、細胞表面特性（レクチンおよび抗体親和性）、ならびに生体染色特性（ミトコンドリア結合色素ｒｈｏ１２３およびＤＮＡ結合色素ヘキスト３３３４２）の差に基づくものが含まれる。これらの手技は当業者には周知である。
ＣＤ３４＋細胞の正確な分離を提供する手法としてはさらに、フローサイトメトリーが挙げられるが、これは、例えば複数の色チャネル、低角度および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなど、種々の精密度を有し得る。ＣＤ３４＋細胞はまた、光散乱特性に基づくフローサイトメトリーにより選択することができ、この場合、標的細胞は低側方散乱プロファイルおよび低から中の前方散乱プロファイルに基づいて選択される。
ｂ．拡大段階
場合によっては、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程は、ＣＤ３４＋前駆細胞を増殖させる拡大段階を含む。本明細書で使用される場合、拡大または増殖は、細胞数の任意の増加を含む。拡大には、例えば、培養の開始に使用される細胞集団に存在するＣＤ３４＋細胞の数を超えてＣＤ３４＋細胞の数が増加することが含まれる。拡大にはまた、既存のＣＤ３４＋細胞の生存の増大が含まれる。生存という用語は、細胞が生命を保持し続けるかまたは機能し続ける能力を指す。
ＣＤ３４＋前駆細胞の集団（例えば、動員されたＣＤ３４＋末梢血液細胞）は、ＣＤ３４＋細胞を拡大するのに適した容器に入れることができる。例えば、細胞集団の培養に適した容器としては、フラスコ、チューブ、またはプレートが挙げられる。一実施形態では、フラスコは、１２．５ｃｍ２または７５ｃｍ２のＴ型フラスコなどのＴ型フラスコとすることができる。プレートは、１０ｃｍプレート、３．５ｃｍプレート、または１２、２４、もしくは９６ウェルプレートなどの複数ウェルプレートとすることができる。ウェルは平底ウェル、ｖ底ウェルでも、ｕ底ウェルでもよい。容器には、細胞接着を促進するためにまたは容器の表面への細胞接着を阻止するために、組織培養に適した任意の処理を施すことができる。このような容器は、Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、およびＣｏｓｔａｒから市販されている。本明細書で使用される場合、「拡大容器」はまた、独立しているかまたは拡大装置に組み込まれているかに関わらず、細胞を拡大するための任意のチャンバーまたは容器を含むことを意図する。
培養されるＣＤ３４＋細胞集団の細胞密度は、少なくとも約１×１０２細胞〜約１×１０７細胞／ｍＬとすることができる。好ましくは、細胞密度は、約１×１０５〜約１×１０６細胞／ｍＬとすることができる。細胞は、約２〜２０％の酸素濃度で培養することができる。
ＣＤ３４＋前駆細胞の集団を拡大するために、以下に限定されるものではないが、ダルベッコＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｘ−Ｖｉｖｏ １５（血清枯渇）、およびＲＰＭＩ−１６４０を含む、種々の培地を使用することができる。このような培地は無血清とすることができる。一実施形態では、培地は、無血清ＳｔｅｍＳｐａｎ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であり、これには１０μｇ／ｍｌのヘパリンを添加することができる。
拡大段階に使用される培地は、１種または複数のサイトカインを含有することができる。本明細書で使用される場合、サイトカインは、細胞に対して種々の効果、例えば成長または増殖を促す因子である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程の１つまたは複数の段階（例えば、拡大段階または以下に記載の分化段階の何れか）に使用することができるサイトカインの非限定例としては、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、可溶性ＩＬ−６受容体を含むインターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン１アルファ（ＩＬ−１α）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、ＭＩＰ−１α、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド、およびｆｌｔ３リガンドが挙げられる。一部の例では、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程またはその任意の段階では、１種または複数のサイトカインが培地から特異的に排除される培養条件が含まれ得る。サイトカインは、例えば、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）などのいくつかのベンダーから市販されている。サイトカインにはまた、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ−１またはＦＧＦ−２）、インスリン様増殖因子（例えば、ＩＧＦ−２またはＩＧＦ−１）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）、またはそれらのアナログおよび均等物が含まれ得る。それらの均等物としては、野生型または精製形態（例えば、組換えで生成）で、これらの因子（例えば、ＦＧＦ、ＴＰＯ、ＩＧＦ、およびＳＣＦ）と同様の生物活性を有する分子が挙げられる。アナログとしては、所望の活性を保持するフラグメントおよび関連分子が挙げられる。例えば、ＴＰＯはｍｐ１受容体のリガンドであり、そのため、ｍｐ１受容体に結合し、ｍｐ１へのＴＰＯ結合に関連した１つまたは複数の生物作用を惹起することができる分子もまた本発明の範囲内である。ＴＰＯミメティックの一例は、Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１６９６に見出される。
一例では、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程の拡大段階は、以下のように行なうことができる。動員されたヒトＣＤ３４＋末梢血液細胞の集団を、１０×１０４〜１０×１０６（例えば、１×１０５）細胞／ｍＬの細胞密度で拡大用容器に入れる。ＣＤ３４＋細胞を、Ｆｌｔ−３リガンド、ＳＣＦ、ＩＬ−３、およびＩＬ−６のサイトカイン混合物、ならびに２％のペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した拡大培地（例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎ無血清培地）中で、適切な条件（例えば、３７℃）の下、１〜６日間（例えば、２〜５日間、３〜４日間、または４日間）培養する。拡大したＣＤ３４＋細胞を回収し、成熟脱核赤血球への分化を可能にする条件下で、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に供することができる。
Ｃ．複数の分化段階
本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程には、ＣＤ３４＋前駆細胞が成熟脱核赤血球に分化する、複数の分化段階（２、３、４、またはそれ以上）が含まれる。各分化段階では、ＣＤ３４＋前駆細胞（拡大段階から得られたものかもしくは本来の供給源から収集されたもの）または前の分化段階から得られた細胞を、適切な条件下で適切な期間、１種または複数の適切なサイトカイン（例えば、本明細書に記載のもの）を含む培地中で培養することができる。赤血球形成状態を評価するために、各分化段階の間またはその終了時に、細胞のサイズおよび表面マーカーの発現など細胞の生物学的特性をモニターすることができる。必要な場合はいつでも、最適な赤血球系分化および／または培養中の細胞集団の同期化を達成するように、各分化段階でサイトカインを適時に供給または除去することができる。
分化段階のそれぞれにおいて、本明細書に記載の拡大段階から得られたかもしくは本来の供給源（例えば、ヒト末梢血）から単離されたＣＤ３４＋前駆細胞または前の分化段階から得られた細胞を、適切な培養条件下で適切な期間、１種または複数の適切なサイトカインを添加した、本明細書に記載のものなどの適切な培地中で培養することができる。一例では、培地（例えば、ＩＭＤＭ）に、適切な濃度のホロ型ヒトトランスフェリンおよびインスリンが添加される。例えば、ホロ型ヒトトランスフェリンの濃度は、２５０〜１，５００μｇ／ｍｌ（例えば、２５０〜１，０００μｇ／ｍｌ；３００〜８００μｇ／ｍｌ、または４００〜６００μｇ／ｍｌ）の範囲であり；インスリンの濃度は、５〜２０μｇ／ｍｌ（例えば、５〜１５μｇ／ｍｌ、５〜１０μｇ／ｍｌ、または１０〜２０μｇ／ｍｌ）の範囲とすることができる。培地にはまた、細胞培養で一般に使用される他の成分、例えば、ウシ胎仔血清、グルタミン、ウシ血清アルブミン、１種もしくは複数の抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）、またはそれらの任意の組合せを添加することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程は、３つの分化段階、分化段階Ｉ（「分化Ｉ」）、分化段階ＩＩ（「分化ＩＩ」）、および分化段階ＩＩＩ（「分化ＩＩＩ」）を含む。
分化Ｉでは、細胞は、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦ、およびＥＰＯ（ヒトＥＰＯ、他の種からのＥＰＯ、またはエポエチンアルファ、エポエチンベータ、もしくはダルベポエチンアルファなどのＥＰＯアナログを含む）を含む、適切な濃度のサイトカインの混合物の存在下で、適切な期間（例えば、４〜７日間、４〜６日間、５〜７日間、または５〜６日間）培養することができる。一部の例では、デキサメタゾンの濃度は、１００ｎＭ〜５μＭ（例えば、１００ｎＭ〜２μＭ、５００ｎＭ〜５μＭ、１μＭ〜３μＭ、１μＭ〜２μＭ、または２μＭ〜５μＭ）の範囲とすることができる。β−エストラジオールの濃度は、０．５〜５μＭ（例えば、０．５〜４μＭ、１〜５μＭ、０．５〜３μＭ、０．５〜２μＭ、０．５〜１μＭ、１〜２μＭ、１〜３μＭ、または３〜５μＭ）の範囲とすることができる。ＩＬ−３の濃度は、１〜１０ｎｇ／ｍｌ（例えば、１〜８ｎｇ／ｍｌ、１〜５ｎｇ／ｍｌ、３〜６ｎｇ／ｍｌ、４〜８ｎｇ／ｍｌ、または５〜１０ｎｇ／ｍｌ）の範囲とすることができる。ＳＣＦの濃度は、１０〜５００ｎｇ／ｍｌ（例えば、１０〜３００ｎｇ／ｍｌ、５０〜５００ｎｇ／ｍｌ、５０〜２００ｎｇ／ｍｌ、５０〜１００ｎｇ／ｍｌ、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ、または１００〜４００ｎｇ／ｍｌ）の範囲とすることができる。代替的または追加的に、ＥＰＯの量は、２〜１０Ｕ（例えば、２〜８Ｕ、２〜６Ｕ、５〜１０Ｕ、または６〜１０Ｕ）の範囲とすることができる。当技術分野で周知のように、１ＥＰＯ単位は、げっ歯類（歴史的に、絶食ラット）において、５マイクロモルの塩化コバルトと同じ赤血球刺激応答を誘発する。例えば、Ｊｅｌｋｍａｎｎ，Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００９を参照されたい。一部の例では、分化Ｉで使用される培地は、ホロ型ヒトトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦ、およびＥＰＯを含有する。この培地は、Ｆｌｔ−３リガンドまたはＩＬ−６などの特定の他のサイトカインを実質的に含まないか、または他のサイトカインを実質的に含まないことがある。
分化ＩＩでは、分化Ｉから得られた細胞を、ＳＣＦおよびＥＰＯを含む、適切な濃度のサイトカインの混合物の存在下、適切な期間（例えば、３〜５日間、３〜４日間、または４〜５日間）培養することができる。一部の例では、ＳＣＦの濃度は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ（例えば、１０〜８０ｎｇ／ｍｌ、２０〜８０ｎｇ／ｍｌ、２０〜５０ｎｇ／ｍｌ、３０〜５０ｎｇ／ｍｌ、４０〜５０ｎｇ／ｍｌ、５０〜８０ｎｇ／ｍｌ、または５０〜６０ｎｇ／ｍｌ）の範囲とすることができる。代替的または追加的に、ＥＰＯの量は、２〜１０Ｕ（例えば、２〜８Ｕ、２〜６Ｕ、５〜１０Ｕ、または６〜１０Ｕ）の範囲とすることができる。一部の例では、分化ＩＩで使用される培地は、ホロ型ヒトトランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯを含有する。この培地は、Ｆｌｔ−３、ＩＬ−６、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、またはそれらの任意の組合せなどの特定のサイトカインを実質的に含まないか、または他のサイトカインを実質的に含まないことがある。
分化ＩＩＩでは、分化ＩＩから得られた細胞を、適切な濃度のＥＰＯの存在下、適切な期間（例えば、４〜１２日間、５〜１０日間、８〜１２日間、または８〜１０日間）培養することができる。一部の例では、ＥＰＯの量は、０．５〜３Ｕ（例えば、１〜３Ｕ、０．５〜２Ｕ、１〜２Ｕ、または２〜３Ｕ）の範囲とすることができる。一部の例では、分化ＩＩＩで使用される培地は、ホロ型ヒトトランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯを含有する。この培地は、特定のサイトカイン、例えば、Ｆｌｔ−３、ＩＬ−６、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦ、またはそれらの任意の組合せを実質的に含まないか、または他のサイトカインを実質的に含まないことがある。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程は、本明細書に記載の分化段階の１つまたは任意の組合せ、例えば、分化Ｉと分化ＩＩＩ、分化ＩＩと分化ＩＩＩ、または分化Ｉと分化ＩＩを含むことができる。
分化段階の前に、ＣＤ３４＋前駆細胞は、目的の表面タンパク質、例えば、ソルタギング可能な表面タンパク質を発現するように遺伝子改変することができるが、これは以下に詳細に説明される。
ＩＩ．目的の表面タンパク質を発現する赤血球の調製
ソルタギング可能な表面タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質、またはタンパク質性薬物（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）など、目的の表面タンパク質を発現することができる、遺伝子操作された赤血球を調製する方法も本明細書に記載される。
（ａ）前駆細胞の遺伝子改変
目的の表面タンパク質を生成させるための発現ベクターを、ＣＤ３４＋前駆細胞に導入することができるが、この前駆細胞は、本来の供給源から単離することも、またはルーチン的な組換え技術により上記の拡大段階から得ることもできる。一部の実例では、発現ベクターは、当技術分野で公知の方法により、相同または非相同組換えによる細胞ゲノムへの組込みができるように設計することができる。ＣＤ３４＋前駆細胞に発現ベクターを導入するための方法としては、以下に限定されるものではないが、ウイルス媒介遺伝子導入、リポソーム媒介導入、形質転換、トランスフェクション、および形質導入、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびヘルペスウイルスなどのＤＮＡウイルスに基づくベクターならびにレトロウイルスベースのベクターの使用などのウイルス媒介遺伝子導入が挙げられる。遺伝子導入方法の例としては、例えば、裸のＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクター、アジュバント支援ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルが挙げられる。一例では、ウイルスベクターが使用される。細胞への非ウイルスベクターの送達を増強するために、核酸またはタンパク質を、細胞表面抗原、例えばＣＤ３４に結合する抗体またはその結合フラグメントにコンジュゲートすることができる。ターゲティング抗体またはそのフラグメントをさらに含むリポソームを、本明細書に記載の方法で使用することができる。
本明細書に記載される「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えにより生成したウイルスまたはウイルス粒子を指す。ウイルスベクターの例としては、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のレトロウイルスベクターが挙げられる。遺伝子導入がレトロウイルスベクターにより媒介される態様では、ベクターコンストラクトは、レトロウイルスゲノムまたはその一部および治療用遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。
目的の表面タンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野で周知の方法を使用して、適切なベクター（例えば、レトロウイルスベクター）に挿入することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ。例えば、遺伝子およびベクターを適切な条件下で制限酵素と接触させて、互いと対を形成し、リガーゼで互いに連結することができる相補末端を各分子上に生成させることができる。あるいは、合成の核酸リンカーを遺伝子の末端に連結することができる。これらの合成リンカーは、ベクター中の特定の制限部位に対応する核酸配列を含有する。加えて、ベクターは、例えば、以下のうちの一部または全部を含有することができる：選択可能マーカー遺伝子、例えば、哺乳類細胞において、安定なまたは一過性のトランスフェクタントを選択するためのネオマイシン遺伝子；高レベル転写のための、ヒトＣＭＶの前初期遺伝子由来のエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡの安定性のための、ＳＶ４０由来の転写終結シグナルおよびＲＮＡプロセシングシグナル；ＳＶ４０ポリオーマの複製起点および適切なエピソーム複製のためのＣｏｌＥ１；多用途の多重クローニング部位；ならびにセンスおよびアンチセンスＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＴ７およびＳＰ６のＲＮＡプロモーター。導入遺伝子を含有するベクターの生成に適したベクターおよび方法は当技術分野で周知であり、入手可能である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ。
ＣＤ３４＋前駆細胞の修飾は、導入された遺伝子の構成的発現または誘導性発現のために作製された発現カセットの使用を含むことができる。そのような発現カセットは、プロモーター、開始コドン、停止コドン、およびポリアデニル化シグナルなどの調節エレメントを含むことができる。これらのエレメントは、好ましくは、個体に投与（例えば、点滴）後、前駆細胞または前駆細胞から生じる細胞（例えば、脱核赤血球）において作動可能である。さらに、これらのエレメントは、目的の表面タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結することができ、それによりこの遺伝子は前駆細胞またはそれに由来する赤血球で作動する（例えば、発現される）。
種々のプロモーターを目的の表面タンパク質の発現に使用することができる。タンパク質を発現するために使用することができるプロモーターは、当技術分野で周知である。プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１ ＬＴＲなどのウイルスＬＴＲ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ ＵＶ５プロモーター、および単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターが挙げられる。
調節可能なプロモーターも使用することができる。そのような調節可能なプロモーターとしては、ｌａｃオペレーターを保持する哺乳類細胞プロモーターからの転写を調節するための転写モジュレーターとして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するｌａｃリプレッサーを使用するもの［Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４９：６０３−６１２（１９８７）］、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を使用するもの［Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１（１９９２）；Ｙａｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９：１９３９−１９５０（１９９８）；Ｓｈｏｃｋｅｌｔ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：６５２２−６５２６（１９９５）］が挙げられる。他の系としては、ＦＫ５０６二量体、アストラジオールを使用するＶＰ１６もしくはｐ６５、ＲＵ４８６、ジフェノールムリスレロン（ｄｉｐｈｅｎｏｌ ｍｕｒｉｓｌｅｒｏｎｅ）、またはラパマイシンが挙げられる。誘導性の系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、およびＡｒｉａｄから入手可能である。
オペロンと共にリプレッサーを含む調節可能なプロモーターを使用することができる。一実施形態では、ｌａｃオペレーターを保持する哺乳類細胞プロモーターからの転写を調節するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｌａｃリプレッサーを転写モジュレーターとして機能させることができる［Ｍ．Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４９：６０３−６１２（１９８７）］；ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（１９９２）；［Ｍ．Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）］は、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を転写アクチベーター（ＶＰ１６）と組み合わせて、ｔｅｔＲ−哺乳類細胞転写アクチベーター融合タンパク質、ｔＴａ（ｔｅｔＲ−ＶＰ１６）を作製し、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）主要前初期プロモーターに由来する、ｔｅｔＯを保持する最小プロモーターと組み合わせて、哺乳類細胞において遺伝子発現を制御するためのｔｅｔＲ−ｔｅｔオペレーター系を作製した。一実施形態では、テトラサイクリン誘導性スイッチが使用される。テトラサイクリンオペレーターがＣＭＶＩＥプロモーターのＴＡＴＡエレメントの下流に適切に配置されると、ｔｅｔＲ−哺乳類細胞転写因子融合誘導体よりもむしろテトラサイクリンリプレッサー単独（ｔｅｔＲ）が、哺乳類細胞において強力なトランスモジュレーターとして機能して、遺伝子発現を調節することができる［Ｆ．Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、前出］。このテトラサイクリン誘導性スイッチの１つの特別な利点は、その調節可能な効果を達成するために、場合によっては細胞にとって有毒になり得るテトラサイクリンリプレッサー−哺乳類細胞トランス活性化因子またはリプレッサー融合タンパク質の使用を必要としないことである［Ｍ．Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）；Ｐ．Ｓｈｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：６５２２−６５２６（１９９５）］。
一部の誘導性プロモーターの有効性は、時間経過と共に増大することがある。そのような場合には、複数のリプレッサーを縦列に挿入する、例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によりＴｅｔＲをＴｅｔＲに連結させることによって、そのような系の有効性を増強させることができる。あるいは、所望の機能をスクリーニングする前に、少なくとも３日間待ってもよい。サイレンシングが一部起こることもあるが、これは、適切な細胞数、好ましくは少なくとも１×１０４、より好ましくは少なくとも１×１０５、さらにより好ましくは少なくとも１×１０６、一層より好ましくは１×１０７を使用することによって最小化することができる。この系の有効性を増強する公知の手段により所望のタンパク質の発現を増強することができる。例えば、Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を使用する。Ｌｏｅｂ，Ｖ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２２９５−２３０５（１９９９）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．７３：２８８６−２８９２（１９９９）；Ｄｏｎｅｌｌｏ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．７２：５０８５−５０９２（１９９８）を参照されたい。
本明細書に記載の方法を実施するのに有用なポリアデニル化シグナルの例としては、以下に限定されるものではないが、ヒトコラーゲンＩポリアデニル化シグナル、ヒトコラーゲンＩＩポリアデニル化シグナル、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが挙げられる。
調節エレメントに作動可能に連結された表面タンパク質コード化遺伝子を含む外来性遺伝物質は、機能する細胞質分子、機能するエピソーム分子として細胞内に存在し続けても、または細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。外来性遺伝物質は、細胞に導入されて、プラスミドの形態で別個の遺伝物質として留まってもよい。あるいは、染色体に組み込まれ得る直鎖状ＤＮＡを細胞に導入することもできる。細胞にＤＮＡを導入するときに、染色体へのＤＮＡ組込みを促進する試薬を加えてもよい。組込みを促進するのに有用なＤＮＡ配列をＤＮＡ分子に含めることもできる。あるいは、ＲＮＡを細胞に導入することもできる。
本明細書に記載の前駆細胞への所望の導入遺伝子の取り込みをモニターするために、選択可能マーカーを使用することができる。これらのマーカー遺伝子は、任意のプロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。これらは当技術分野で公知であり、栄養素、抗生物質等の刺激に対する細胞の感受性を変化させる遺伝子を含む。遺伝子としては、ｎｅｏ、ｐｕｒｏ、ｔｋ、多剤耐性（ＭＤＲ）等に対するものが挙げられる。他の遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ルシフェラーゼ、およびＬａｃＺなどの容易にスクリーニングできるタンパク質を発現する。
（ｂ）ソルタギング可能な表面タンパク質を発現するための遺伝子改変
一部の実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞は、赤血球膜タンパク質とペプチド（例えば、膜タンパク質に異種のペプチド）とを含む融合タンパク質などのソルタギング可能な表面タンパク質を発現できるように、本明細書に記載または当技術分野で公知の任意の方法を使用して遺伝子改変することができる。ソルタギング可能な表面タンパク質は、ソルターゼ媒介ペプチド転移反応により、別のペプチドにコンジュゲートすることができる。Ｓｔｒｉｊｂｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｆｆｉｃ １３（６）：７８０−７８９，２０１２。好ましくは、ソルタギング可能な表面タンパク質をコードする遺伝子によるＣＤ３４＋前駆細胞の形質導入は、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを介するものである（例えば、国際公開第９４／２９４３８号パンフレット、国際公開第９７／２１８２４号パンフレット、および国際公開第９７／２１８２５号パンフレットに記載のように）。
ソルタギング可能な表面タンパク質は、膜タンパク質と少なくとも１つの異種タンパク質とを含む融合タンパク質とすることができる。一部の実施形態では、成熟ＲＢＣ上に存在し得る、本明細書に記載の方法で使用される膜タンパク質は、赤血球系分化を阻害することも、脱核および後期網状赤血球段階で起こる広範な膜リモデリング中に分解の標的にされることもない。そのような膜タンパク質は当技術分野で公知である。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｌｏｏｄ，１１５（１０）：２０２１−２０２７を参照されたい。例えば、赤血球前駆体は高レベルのトランスフェリン受容体（Ｔｆｒ）、ＩＩ型膜タンパク質を発現するが、Ｔｆｒは、成熟ＲＢＣ上にはもはや存在しないため、ソルタギング可能な表面タンパク質の調製に使用される適切な標的にはなり得ない。成熟ＲＢＣに存在する任意の膜タンパク質を、本明細書に記載のソルタギング可能な表面タンパク質を構築するために使用することができる。膜タンパク質は、細胞外空間または管腔空間に露出される末端で異種ペプチドに融合することができる。一部の例では、細胞質に露出される膜タンパク質の末端も、細胞質タンパク質になり得る、第２の目的異種タンパク質に融合することができる。
膜タンパク質のＮ末端が細胞外空間または管腔空間に露出される場合（例えば、Ｉ型膜タンパク質）、異種タンパク質は、ソルターゼ触媒ペプチド転移反応により別のペプチドがコンジュゲートすることができるアクセプターペプチドを含んでもよい。典型的には、アクセプターペプチドは、１〜５グリシンフラグメントまたは１〜５アラニンフラグメントなどのオリゴグリシンまたはオリゴアラニンである。一部の例では、オリゴグリシンは３個または５個のグリシン（配列番号３）残基からなる。他の例では、オリゴアラニンは３個または５個のアラニン残基（配列番号７９）からなる。
一例では、ソルタギング可能な表面タンパク質は、グリコフォリンＡ、細胞間接着分子４（ＩＣＡＭ−４）、ルーテル（Ｌｕｔｈｅｒａｎ）糖タンパク質（ＣＤ３２９）、ベイシジン（ＣＤ１４７）、およびアクセプターペプチドを含むペプチド（例えば、１〜５グリシンフラグメントなどのオリゴグリシン成分を含むペプチド）などのＩ型赤血球膜貫通型タンパク質を含む融合タンパク質である。これらの膜タンパク質はヒトタンパク質とすることができる。アクセプターペプチドは、Ｉ型膜貫通型タンパク質のＮ末端に融合される。Ｉ型膜貫通型タンパク質は、細胞外空間または管腔空間に露出されたＮ末端を有する１回膜貫通型タンパク質である。
別の例では、ソルタギング可能な表面タンパク質は、ＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質、例えばＫｅｌｌまたはＣＤ７１とソルターゼ（例えば、ソルターゼＡ）により認識可能な配列を含むペプチドとを含む融合タンパク質である。ＩＩ型膜貫通型タンパク質は、細胞外空間または管腔空間に露出されたＣ末端を有する１回膜貫通型タンパク質である。
ソルターゼにより認識可能なモチーフは当技術分野で周知である。ソルターゼ、特にソルターゼＡにより認識可能な１つの例示的なモチーフはＬＰＸＴＧ（配列番号１）であり、ここでＸは任意のアミノ酸残基（天然または非天然）、例えば、生物に見出されるタンパク質中に最も一般的に見出される２０種の標準アミノ酸の何れかであり得る。一部の例では、認識モチーフは、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）またはＬＰＸＴ（配列番号５０）であり、ここでＸはＤ、Ｅ、Ａ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、またはＲである。他の例では、ソルターゼＡにより認識可能なＬＰＸＴＧ（配列番号１）またはＬＰＸＴ（配列番号５０）モチーフ中のＸは、Ｋ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ａから選択される。さらに他の例では、クラスＣソルターゼにより認識可能なＬＰＸＴＧ（配列番号１）またはＬＰＸＴ（配列番号５０）モチーフ中のＸは、Ｋ、Ｓ、Ｅ、Ｌ、Ａ、Ｎから選択される。例示的なソルターゼ認識モチーフとしては、以下に限定されるものではないが、ＬＰＫＴＧ（配列番号５１）、ＬＰＩＴＧ（配列番号５２）、ＬＰＤＴＡ（配列番号５３）、ＳＰＫＴＧ（配列番号５４）、ＬＡＥＴＧ（配列番号５５）、ＬＡＡＴＧ（配列番号５６）、ＬＡＨＴＧ（配列番号５７）、ＬＡＳＴＧ（配列番号５８）、ＬＰＬＴＧ（配列番号５９）、ＬＳＲＴＧ（配列番号６０）、ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）、ＶＰＤＴＧ（配列番号６１）、ＩＰＱＴＧ（配列番号６２）、ＹＰＲＲＧ（配列番号６３）、ＬＰＭＴＧ（配列番号６４）、ＬＡＦＴＧ（配列番号６５）、ＬＰＱＴＳ（配列番号６６）、ＬＰＸＴ（配列番号５０）、ＬＡＸＴ（配列番号６７）、ＬＰＸＡ（配列番号６８）、ＬＧＸＴ（配列番号６９）、ＩＰＸＴ（配列番号７０）、ＮＰＸＴ（配列番号７１）、ＮＰＱＳ（配列番号７２）、ＬＰＳＴ（配列番号７３）、ＮＳＫＴ（配列番号７４）、ＮＰＱＴ（配列番号７５）、ＮＡＫＴ（配列番号７６）、ＬＰＩＴ（配列番号７７）、またはＬＡＥＴ（配列番号７８）が挙げられる。
本明細書に記載のソルタギング可能な表面タンパク質はまた、ＩＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質と異種ペプチドとを含む融合タンパク質であってもよい。ＩＩＩ型膜タンパク質は複数回貫通構造であり、通常、細胞外空間または管腔空間に露出されたＮ末端を有する。ＩＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質の例としては、ＧＬＵＴ１、アクアポリン１、バンド３が挙げられる。一例では、ＩＩＩ型膜貫通型タンパク質は、膜貫通型タンパク質のＮ末端でアクセプターペプチドに融合することができる。
一部の実施形態では、上記のようなソルターゼ認識配列は、例えばＮ末端またはＣ末端に、１つまたは複数のアミノ酸をさらに含むことができる。例えば、天然のソルターゼ基質中の５アミノ酸認識配列のＮ末端側またはＣ末端側に直ちに見出されるアミノ酸に同一である１つまたは複数のアミノ酸（例えば、５アミノ酸以内）を組み込むことができる。そのような追加のアミノ酸は、認識モチーフの認識を改善する状況を提供することがある。
一部の実施形態では、ソルターゼ認識モチーフはマスクされていることがある。ソルターゼにより認識され得る、アンマスクされているソルターゼ認識モチーフとは対照的に、マスクされているソルターゼ認識モチーフは、ソルターゼにより認識されないが、容易に修飾する（アンマスクする）ことができ、その結果得られるモチーフはソルターゼにより認識されるモチーフになる。例えば、一部の実施形態では、マスクされているソルターゼ認識モチーフの少なくとも１つのアミノ酸は、目的のソルターゼ、例えばＳｒｔＡアウレウスによる配列の認識を阻害する、例えば妨げる成分を含む側鎖を含む。そこで、阻害する成分を除去すると、ソルターゼによるモチーフの認識が可能になる。特定の実施形態では、マスキングにより、例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、またはそれ以上（例えば、検出不可能なレベルに）認識が低下する。例として、特定の実施形態では、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）などのソルターゼ認識モチーフ中のスレオニン残基がリン酸化されて、モチーフがＳｒｔＡによる認識および切断に抵抗性になる。マスクされている認識配列は、ホスファターゼによる処理によりアンマスクすることができ、それによってＳｒｔＡ触媒アミド基転移反応に使用することが可能になる。
必要な場合、ＣＤ３４＋前駆細胞の遺伝子改変膜タンパク質は、以下に限定されるものではないが、アミノ酸、核酸、ポリヌクレオチド、糖、炭水化物、ポリマー、脂質、脂肪酸、および小分子を含む、追加の適切なタグをさらに含むことができる。他の適切なタグは当業者には明らかであり、本発明はこの点において限定されない。
一部の実施形態では、そのようなタグは、ポリペプチドの精製、発現、可溶化、および／または検出に有用な配列を含む。一部の実施形態では、タグは複数の機能を果たすことができる。一部の実施形態では、タグは比較的小さく、例えば、少数のアミノ酸から約１００アミノ酸長の範囲である。一部の実施形態では、タグは、約１００アミノ酸長を超えており、例えば、最大約５００アミノ酸長、またはそれ以上である。一部の実施形態では、タグは、少数の例を挙げると、ＨＡ、ＴＡＰ、Ｍｙｃ、６ｘＨｉｓ、Ｆｌａｇ、ストレプトアビジン、ビオチン、またはＧＳＴタグを含む。一部の実施形態では、タグは、溶解性増強タグ（例えば、ＳＵＭＯタグ、ＮＵＳ Ａタグ、ＳＮＵＴタグ、またはバクテリオファージＴ７のＯｃｒタンパク質の単量体突然変異体）を含む。例えば、Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ｄ ａｎｄ Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ＤＫ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；１７（４）：３５３−８（２００６）を参照されたい。一部の実施形態では、タグは、例えプロテアーゼにより、切断可能であり、そのため除去することができる。一部の実施形態では、これは、例えばタグの機能部分に隣接してまたはそれに連結して、タグ中にプロテアーゼ切断部位を含ませることによって達成される。例示的なプロテアーゼとしては、例えば、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ等が挙げられる。一部の実施形態では、「自己切断」タグが使用される。例えば、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、２００５年２月２４日に出願され、２００５年９月２２日に国際公開第２００５／０８６６５４号パンフレットとして公開された国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０５７６３号明細書を参照されたい。
一部の実施形態では、遺伝子改変赤血球は、本明細書に記載の赤血球膜タンパク質と、細胞外空間または管腔空間に露出される膜タンパク質末端に融合した第１の異種ペプチドと、細胞質空間に露出される膜タンパク質末端に融合した第２の異種タンパク質とを含む融合タンパク質を表面上に発現することができる。第１の異種ペプチドは、膜タンパク質（例えば、Ｉ型膜タンパク質）のＮ末端に融合される場合、ソルターゼのアクセプターペプチド（本明細書に記載の任意のアクセプターペプチド）を含むことができる。あるいは、第１の異種ペプチドは、膜タンパク質（例えば、ＩＩ型膜タンパク質）のＣ末端に融合される場合、ソルターゼにより認識可能な配列（例えば、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）またはＬＰＸＴ（配列番号５０））を含むことができる。
膜タンパク質がＩ型（例えば、ＧＰＡ）またはＩＩＩ型の膜タンパク質である場合、第２の異種タンパク質は、膜タンパク質のＣ末端に融合される。そのような融合タンパク質を生成させるための発現カセットは、第２の異種タンパク質をコードする配列を２コピー含有することができ、一方は膜タンパク質にインフレームで融合されるが、他方は２コピー間に位置するＩＲＥＳ部位に対して３’側下流に位置する。この設計によれば、第２の異種タンパク質の生成が、遊離形態および膜タンパク質との融合形態で可能になろう。例えば、以下の実施例を参照されたい。あるいは、膜タンパク質がＩＩ型膜タンパク質（例えば、Ｋｅｌｌ）である場合、第２の異種タンパク質は膜タンパク質のＮ末端に融合される。そのような融合タンパク質を生成させるための発現カセットは、第２の異種タンパク質をコードする配列を２コピー含有することができ、それらは、第２の異種タンパク質が遊離および融合の両形態で生成するように、ＩＲＥＳ部位によって分離される。
第２の異種タンパク質は細胞質タンパク質であってもよい。一部の例では、異種タンパク質は、診断用タンパク質、例えば適切な条件下で検出可能なシグナルを放出することができる蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）などのタンパク質である。他の例では、異種タンパク質は、治療用タンパク質、例えばタンパク質性薬物である。
必要な場合、ソルターゼ反応により、上記の第１の異種ペプチドにターゲティング薬剤をコンジュゲートすることができる。そのような標的薬剤（例えば、単一ドメイン抗体などの抗体）は、特定の細胞型（例えば、癌細胞などの疾患細胞）に特異的に結合することができる。得られる遺伝子改変赤血球は、細胞質に配置される目的タンパク質（第２の異種タンパク質）を標的薬剤により認識可能な標的細胞に送達するのに有用である。
代替的または追加的に、本開示は、異なる基質特異性を有するソルターゼ酵素による触媒反応により、異なる機能成分にコンジュゲートされ得る、２種のソルタギング可能な表面タンパク質を発現する遺伝子操作された赤血球を提供する。以下の議論を参照されたい。一例では、２種のソルタギング可能な表面タンパク質は両方とも、Ｉ型膜タンパク質（例えば、ＧＰＡ）を含む。一方のソルタギング可能な表面タンパク質では、Ｉ型膜タンパク質のＮ末端は、オリゴグリシン（例えば、Ｇ３またはＧ５（配列番号３））に融合され；他方のソルタギング可能な表面タンパク質では、Ｉ型膜タンパク質のＮ末端は、オリゴアラニン（例えば、Ａ３またはＡ５（配列番号７９））に融合される。別の例では、２種のソルタギング可能な表面タンパク質は両方とも、ＩＩ型膜タンパク質（例えば、ＫｅｌｌまたはＣＤ７１）を含む。一方のソルタギング可能な表面タンパク質では、ＩＩ型膜タンパク質のＣ末端は、モチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１）に融合され；他方のソルタギング可能な表面タンパク質では、ＩＩ型膜タンパク質のＣ末端は、モチーフＬＰＸＴＡ（配列番号２）に融合される。さらに別の例では、ソルタギング可能な表面タンパク質の一方は、Ｉ型膜タンパク質（例えば、ＧＰＡ）を含み、そのＮ末端はアクセプターペプチドに融合され、他方のソルタギング可能な表面タンパク質は、ＩＩ型膜タンパク質（例えば、ＫｅｌｌまたはＣＤ７１）を含み、そのＣ末端はソルターゼにより認識可能な配列に融合される。アクセプターペプチドがオリゴグリシン（例えば、Ｇ３またはＧ５（配列番号３））である場合、ソルターゼにより認識可能な配列は、ＬＰＸＴＡ（配列番号２）のモチーフとすることができる。アクセプターペプチドがオリゴアラニン（例えば、Ａ３またはＡ５（配列番号７９））である場合、ソルターゼにより認識可能な配列は、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）のモチーフとすることができる。
本明細書に記載の遺伝子改変ＣＤ３４＋前駆細胞は何れも、成熟脱核赤血球に分化させることができる適切な条件下、例えば本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程で培養することができる。得られる脱核赤血球は、本明細書に記載のソルタギング可能な表面タンパク質などの目的の表面タンパク質を発現することができるが、これは、ルーチン的な方法論（例えば、ウエスタンブロッティングまたはＦＡＣＳ分析）により評価および確認することができる。
ＩＩＩ．ソルタギングによる、細胞発現のソルタギング可能な表面タンパク質への薬剤のコンジュゲーション
ソルタギング可能な表面タンパク質を発現する遺伝子改変細胞（例えば、ＣＤ３４＋前駆細胞または成熟脱核赤血球）は何れも、ソルターゼの存在下で修飾して、目的薬剤を細胞の表面にコンジュゲートさせることができる。これはソルタギングとして知られるプロセスである。本明細書で使用される「ソルタギング」という用語は、ソルターゼ媒介ペプチド転移反応により、標的分子、例えば赤血球の表面上の標的タンパク質に、タグ、例えば成分または分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、検出可能な標識、結合剤、またはクリックケミストリーハンドル）を付加するプロセスを指す。
（ａ）ソルターゼ
ソルターゼは、アミド基転移を介してタンパク質のＣ末端を別のタンパク質のＮ末端にコンジュゲートさせるペプチド転移反応を行うことができる酵素のファミリーである。ソルターゼは、トランスアミダーゼとも呼ばれ、典型的にはプロテアーゼとペプチド転移活性の両方を示す。原核生物由来の種々のソルターゼが同定されている。例えば、グラム陽性細菌由来の一部のソルターゼは、タンパク質を切断して無傷細胞壁のプロテオグリカン成分に転位置させる。スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）から単離されたソルターゼの中に、ソルターゼＡ（Ｓｒｔ Ａ）およびソルターゼＢ（Ｓｒｔ Ｂ）がある。そこで、特定の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲーション方法に従って使用されるトランスアミダーゼは、例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来で、本明細書でＳｒｔＡアウレウスとも呼ばれるソルターゼＡである。他の実施形態では、トランスアミダーゼは、例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来で、本明細書でＳｒｔＢアウレウスとも呼ばれるソルターゼＢである。
ソルターゼは、グラム陽性細菌ゲノム由来の６１種のソルターゼの配列アライメントおよび系統発生分析に基づいて、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ（すなわち、それぞれソルターゼＡ、ソルターゼＢ、ソルターゼＣ、およびソルターゼＤ）と称される、４つのクラスに分類されている（Ｄｒａｍｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５６（３）：２８９−９７，２００５；この文献の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。ソルターゼはさらに、ＣｏｍｆｏｒｔおよびＣｌｕｂｂによりサブファミリーに分類されており、これらのクラスは、以下のサブファミリーに対応している（Ｃｏｍｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．，７２（５）：２７１０−２２，２００４；この文献の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）：クラスＡ（サブファミリー１）、クラスＢ（サブファミリー２）、クラスＣ（サブファミリー３）、クラスＤ（サブファミリー４および５）。前述の参考文献は、数多くのソルターゼおよびその認識モチーフを開示している。Ｐａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，９（３），９７−１０１も参照されたい；この文献の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。当業者は、Ｄｒａｍｉ，ｅｔ ａｌ．前出、に記載のものなど、ソルターゼの配列および／または他の特性に基づいて、ソルターゼを正確なクラスに容易に帰属させることができる。
「ソルターゼＡ」という用語は、クラスＡソルターゼを指すために本明細書で使用され、通常、特定の任意の細菌種のＳｒｔＡ、例えばＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＳｒｔＡと命名される。同様に、「ソルターゼＢ」は、クラスＢソルターゼを指すために本明細書で使用され、通常、特定の任意の細菌種のＳｒｔＢ、例えばＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＳｒｔＢと命名される。本開示は、当技術分野で公知のソルターゼクラスの何れに関連する実施形態も包含する（例えば、任意の細菌種または細菌株由来のソルターゼＡ、任意の細菌種または細菌株由来のソルターゼＢ、任意の細菌種または細菌株由来のクラスＣソルターゼ、および任意の細菌種または細菌株由来のクラスＤソルターゼ）。
ＳｒｔＡおよびＳｒｔＢのアミノ酸配列、ならびにそれらをコードするヌクレオチド配列は、当業者に公知であり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、本明細書に引用のいくつかの参考文献に開示されている。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＳｒｔＡとＳｒｔＢのアミノ酸配列は相同性があり、例えば、２２％の配列同一性および３７％の配列類似性を共有する。スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼ−トランスアミダーゼのアミノ酸配列はまた、他のグラム陽性細菌由来の酵素の配列と実質的な相同性を有し、そのようなトランスアミダーゼは本明細書に記載の連結プロセスで利用することができる。例えば、ＳｒｔＡの場合、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の翻訳領域の配列決定領域全体にわたって最も良好にアライメントすると、約３１％の配列同一性（および約４４％の配列類似性）がある。Ａ．ネスルンディ（Ｓ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）の翻訳領域の配列決定領域全体にわたって最も良好にアライメントすると、約２８％の配列同一性がある。異なる細菌株は特定のポリペプチドの配列において相違を示す可能性があり、本明細書の配列は例示的であることを認識されよう。
特定の実施形態では、ソルターゼをコードする、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ａ．ネスルンディ（Ｓ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｅ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、またはＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の翻訳領域と１８％以上の配列同一性、２０％以上の配列同一性、または３０％以上の配列同一性を有するトランスアミダーゼをスクリーニングすることができ、Ｓ．アウレアス（Ｓ．ａｕｒｅａｓ）由来のＳｒｔＡまたはＳｒｔＢに匹敵するトランスアミダーゼ活性を有する酵素を利用することができる（例えば、匹敵する活性は、場合によってはＳｒｔＡまたはＳｒｔＢ活性の１０％以上である）。
一部の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲーション方法は、ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）を使用する。ＳｒｔＡはモチーフＬＰＸＴＸ（配列番号８０；Ｘの各存在は独立して任意のアミノ酸残基を表わす）を認識し、一般的な認識モチーフは、例えば、ＬＰＫＴＧ（配列番号８１）、ＬＰＡＴＧ（配列番号８２）、ＬＰＮＴＧ（配列番号８３）である。一部の実施形態では、ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）がソルターゼ認識モチーフとして使用される。しかしながら、このコンセンサスから外れるモチーフも認識されることがある。例えば、一部の実施形態では、モチーフは、位置４で「Ｔ」ではなく「Ａ」を含み、例えばＬＰＸＡＧ（配列番号８４）、例えばＬＰＮＡＧ（配列番号８５）である。一部の実施形態では、モチーフは、位置５で「Ｇ」ではなく「Ａ」を含み、例えばＬＰＸＴＡ（配列番号２）、例えばＬＰＮＴＡ（配列番号８６）である。一部の実施形態では、モチーフは、位置２で「Ｐ」ではなく「Ｇ」を含み、例えばＬＧＸＴＧ（配列番号８７）、例えばＬＧＡＴＧ（配列番号８８）である。一部の実施形態では、モチーフは、位置１で「Ｌ」ではなく「Ｉ」を含み、例えばＩＰＸＴＧ（配列番号８９）、例えばＩＰＥＴＧ（配列番号９１）である。さらなる適切なソルターゼ認識モチーフが当業者に明らかであり、本発明はこの点において限定されない。トランスアミダーゼまたはソルターゼにより認識される配列に関する「認識モチーフ」および「認識配列」という用語は、互換的に使用されることを認識されよう。このようなソルターゼ認識モチーフは、本明細書に記載のソルタギング可能な表面タンパク質を構築するために使用することができる。
本発明の一部の実施形態では、ソルターゼは、ソルターゼＢ（ＳｒｔＢ）、例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｂ．アンスラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、またはＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のソルターゼＢである。Ｂクラスのソルターゼ（ＳｒｔＢ）により認識されるモチーフは、多くの場合、コンセンサス配列ＮＰＸＴＸ（配列番号９２）の範囲内に入り、例えば、ＮＰＱＴＮ（配列番号９４）またはＮＰＫＴＧ（配列番号９５）などのＮＰ［Ｑ／Ｋ］−［Ｔ／ｓ］−［Ｎ／Ｇ／ｓ］（配列番号９３）である。例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＢ．アンスラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のソルターゼＢは、それぞれの細菌のＩｓｄＣのＮＰＱＴＮ（配列番号９４）またはＮＰＫＴＧ（配列番号９５）モチーフを切断する（例えば、Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８９（１７）：６４２５−６４３６，２００７を参照のこと）。クラスＢソルターゼの推定基質に見出される他の認識モチーフは、ＮＳＫＴＡ（配列番号９６）、ＮＰＱＴＧ（配列番号９７）、ＮＡＫＴＮ（配列番号９８）、およびＮＰＱＳＳ（配列番号９９）である。例えば、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）由来のＳｒｔＢは、ＮＡＫＴＮ（配列番号９８）およびＮＰＱＳＳ（配列番号９９）など、位置２にＰを欠き、かつ／または位置３にＱもしくはＫを欠く特定のモチーフを認識する（Ｍａｒｉｓｃｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００９ Ｊａｎ ７）。このようなソルターゼ認識モチーフも、本明細書に記載のソルタギング可能な表面タンパク質を構築するために使用することができる。
別々の基質特異性を有するソルターゼを使用して、Ｎ末端標識化戦略とＣ末端標識化戦略とを組み合わせて（Ａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３１（３１）：１０８００−１０８０１）、多重標識ＲＢＣを生成させることが可能である。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡと異なり、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のソルターゼＡは、ＬＰＸＴＡ（配列番号２）モチーフを認識し、求核試薬としてオリゴアラニンプローブを受容する。したがって、両酵素のソルターゼ反応は、直交型反応として行なうことができる。適切なソルターゼによる、このようなソルターゼ反応の利用も、本開示の範囲内である。
一部の実施形態では、ソルターゼはソルターゼＣ（ＳｒｔＣ）である。ソルターゼＣは、認識モチーフとしてＬＰＸＴＸ（配列番号８０）を利用することができ、Ｘの各存在は、独立して任意のアミノ酸残基を表わす。この認識モチーフは本明細書に記載のソルタギング可能な表面タンパク質を構築するために使用することができる。
さらに他の実施形態では、ソルターゼはソルターゼＤ（ＳｒｔＤ）である。このクラスのソルターゼは、コンセンサス配列ＮＡ−［Ｅ／Ａ／Ｓ／Ｈ］−ＴＧ（配列番号１００；Ｃｏｍｆｏｒｔ Ｄ、前出）を有するモチーフを認識すると予測される。ソルターゼＤは、例えば、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、トロフェリマ・ウィッペリ（Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｌｅｉ）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）、およびビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）で見出されている。ＬＰＸＴＡ（配列番号２）またはＬＡＸＴＧは、例えば、それぞれサブファミリー４および５のクラスＤソルターゼの認識配列として機能することができ、サブファミリー−４およびサブファミリー−５酵素はそれぞれ、モチーフＬＰＸＴＡ（配列番号２）およびＬＡＸＴＧ（配列番号１０１）を処理する。例えば、Ｂ．アンスラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のソルターゼＣは、Ｂ．アンスラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のＢａｓＩおよびＢａｓＨにおけるＬＰＮＴＡ（配列番号１０２）モチーフを特異的に切断することが示されている（Ｍａｒｒａｆｉｎｉ、前出を参照のこと）。
さらなるソルターゼ認識モチーフを認識するソルターゼを含むが、これに限定されないさらなるソルターゼも、本発明の一部の実施形態で使用するのに適している。例えば、その内容全体が本明細書に組み込まれるＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１ Ｊｕｌ １２；１０８（２８）：１１３９９に記載されるソルターゼ；およびその内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＢａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８４，Ｎｏ．８，ｐ．２１８１−２１９１，２００２に記載されるＱＶＰＴＧＶ（配列番号１０３）モチーフを認識するソルターゼ）。
本明細書および／または本明細書に引用の参考文献（データベースを含む）に記載のものなど、任意のグラム陽性菌で見出されるソルターゼの使用が、本発明の一部の実施形態に関連して企図される。グラム陰性菌、例えば、コルウェリア・サイクレリスラエ（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ）、ミクロブルビファー・デグラダンス（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｄｅｇｒａｄａｎｓ）、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、シェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）、およびシュワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）に見出されるソルターゼの使用も企図される。このようなソルターゼは、ＬＰＸＴＸ（配列番号８０）コンセンサスを超えた配列モチーフ、例えばＬＰ［Ｑ／Ｋ］Ｔ［Ａ／Ｓ］Ｔ（配列番号１０４）を認識する。グラム陽性菌由来のソルターゼにおいて位置３で許容される変異と一致して、配列モチーフＬＰＸＴ［Ａ／Ｓ］（配列番号１０５）、例えば、ＬＰＸＴＡ（配列番号２）またはＬＰＳＴＳ（配列番号１０６）を使用することができる。
（ｂ）細胞表面へのコンジュゲーション用の薬剤
ソルタギングにより（直接的または間接的に）細胞表面にコンジュゲートさせることができる薬剤は、以下に限定されるものではないが、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、検出可能な標識、結合剤、タグ、金属原子、造影剤、触媒、非ポリペプチドポリマー、合成ポリマー、認識エレメント、脂質、リンカー、または小分子などの化学物質を含む、任意の分子、実体、または成分であり得る。一部の実施形態では、薬剤は、結合剤、例えば、リガンドまたはストレプトアビジン／ビオチンなどのリガンド結合分子および抗体または抗体フラグメントである。
薬剤がポリペプチドの場合、ソルターゼの存在下でソルタギング可能な表面タンパク質を発現する細胞に直接コンジュゲートさせることができる。「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ペプチド（アミド）結合により相互に連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも３アミノ酸長である。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質を指しても、タンパク質の集合を指してもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドの中の１つまたは複数のアミノ酸は、例えば、コンジュゲーション、官能基化、または他の修飾等のために、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、リンカーなどの化学実体を付加することによって修飾してもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドはまた、単一分子であっても、複数分子複合体であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、単に天然のタンパク質またはペプチドの断片であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然、組換え、もしくは合成、またはそれらの任意の組合せであってもよい。
本明細書に記載のコンジュゲーション方法により細胞表面にコンジュゲートされるタンパク質は、所望の生物活性を有する、例えば、診断用または治療用の任意のタンパク質とすることができる。一部の例では、タンパク質は、タンパク性薬物（例えば、抗体またはそのフラグメント）、特定の細胞型（例えば、癌細胞などの疾患細胞）をターゲティングすることができるペプチド、または所望の免疫応答（例えば、Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答）を誘発することができる抗原性ペプチドである。このようなタンパク質はまた、タンパク質ベースの結合剤（例えば、ストレプトアビジン）であってもよい。
本開示を何ら限定することなく、このセクションでは特定の標的タンパク質について論じる。一般に、任意のタンパク質またはポリペプチドを、クリックケミストリーハンドルを担持するように、かつ／または本明細書に提供の方法に従ってクリックケミストリーにより別の分子にコンジュゲートするように修飾することができる。一部の実施形態では、標的タンパク質は、天然のタンパク質またはポリペプチドに対して、少なくとも８０％または少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、８６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるポリペプチドを含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、標的タンパク質は、天然の配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸の相違を有する。一部の実施形態では、天然タンパク質は、例えばヒト起源の哺乳類タンパク質である。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質を指す。抗体および免疫グロブリンという用語は、互換的に使用される。一部の例外を除いて、哺乳類の抗体は、典型的には、それぞれが２つの大きな重鎖および２つの小さな軽鎖を有する基本構造単位からなる。いくつかの異なるタイプの抗体重鎖、および保有する重鎖に基づいて異なるアイソタイプに分類される、いくつかの異なる種類の抗体がある。５つの異なる抗体アイソタイプ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびＩｇＭが哺乳類で公知であり、これらは、異なる役割を担い、遭遇する異なるタイプの異物それぞれに対して適切な免疫応答を導く助けとなる。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体、例えば、ＩｇＧ１、２、３、または４のヒトサブクラスの抗体である。哺乳類の種（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、ラクダ）に由来する抗体は、この用語の範囲内であり、哺乳類以外の種に由来する（例えば、鳥類、爬虫類、両生類に由来する）抗体、例えば、ＩｇＹ抗体も、この用語の範囲内である。
抗体の一部のみが、抗原の結合に関与し、抗原結合抗体フラグメント、その調製および使用は、当業者に周知である。当技術分野で周知のように、抗体分子の小部分、パラトープのみが、エピトープへの抗体の結合に関与する（一般的には、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７ｔｈ Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄを参照のこと）。本発明の一部の実施形態に関連して使用される適切な抗体および抗体フラグメントとしては、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、ドメイン抗体、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｃ、およびＦｄフラグメント、Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置き換えられている抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖抗体ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置き換えられている抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖抗体ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置き換えられている抗体；ならびにＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置き換えられている抗体が挙げられる。一部の実施形態では、いわゆる一本鎖抗体（例えば、ＳｃＦｖ）、（単一）ドメイン抗体、および他の細胞内抗体を、本発明に関連して使用することができる。ドメイン抗体（単一ドメイン抗体）、ラクダ抗体およびラクダ化抗体、ならびにそれらのフラグメント、例えば、ＶＨＨドメインまたはナノボディ、例えばＡｂｌｙｎｘ ＮＶおよびＤｏｍａｎｔｉｓの特許および特許出願公開に記載のものも、抗体という用語に包含される。単一ドメイン抗体は、単一単量体可変抗体ドメインからなり得るもので、抗原に特異的に結合することができる。さらに、キメラ抗体、例えば、異なる抗原に結合する２つの抗原結合ドメインを含む抗体も、本発明の一部の実施形態に関連して使用するのに適している。
本明細書で使用される「抗原結合抗体フラグメント」という用語は、パラトープを含む抗体のフラグメントまたはインタクト抗体と同様の特異性および親和性で、抗体が結合する抗原に結合する抗体のフラグメントを指す。抗体、例えば完全ヒトモノクローナル抗体は、ファージディスプレイ（または酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイなどの他のディスプレイ方法）を使用して同定することができる。ディスプレイライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーは入手可能であり（かつ／または当業者により生成させることができ）、これを、例えばパニングを使用してスクリーニングし、目的の抗原に結合する抗体を同定することができる。例えば、Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．（ｅｄ．）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；１ｓｔ ｅｄ．，２００５；Ａｉｔｋｅｎ，Ｒ．（ｅｄ．）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ ｅｄ．，２００９を参照されたい。
例示的な抗体としては、以下に限定されるものではないが、アブシキシマブ（糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ；心血管疾患）、アダリムマブ（ＴＮＦ−α、種々の自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ）、アレムツズマブ（ＣＤ５２；慢性リンパ球性白血病）、バシリキシマブ（ＩＬ−２Ｒα受容体（ＣＤ２５）；移植拒絶反応）、ベバシズマブ（血管内皮増殖因子Ａ；種々の癌、例えば、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、腎臓癌；滲出型加齢黄斑変性症）、カツマキソマブ、セツキシマブ（ＥＧＦ受容体、種々の癌、例えば結腸直腸癌、頭頸部癌）、セルトリズマブ（例えば、セルトリズマブペゴル）（ＴＮＦアルファ；クローン病、関節リウマチ）、ダクリズマブ（ＩＬ−２Ｒα受容体（ＣＤ２５）；移植拒絶反応）、エクリズマブ（補体タンパク質Ｃ５；発作性夜間血色素尿症）、エファリズマブ（ＣＤ１１ａ；乾癬）、ゲムツズマブ（ＣＤ３３；急性骨髄性白血病（例えばカリチアマイシンとの併用））、イブリツモマブ・チウキセタン（ＣＤ２０；非ホジキンリンパ腫（例えば、イットリウム９０またはインジウム１１１との併用））、インフリキシマブ（ＴＮＦアルファ；種々の自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ）、ムロモナブ−ＣＤ３（Ｔ細胞ＣＤ３受容体；移植拒絶反応）、ナタリズマブ（アルファ−４（α４）インテグリン；多発性硬化症、クローン病）、オマリズマブ（ＩｇＥ；アレルギー関連喘息）、パリビズマブ（ＲＳＶ Ｆタンパク質のエピトープ；呼吸合包体ウイルス感染症）、パニツムマブ（ＥＧＦ受容体；癌、例えば、結腸直腸癌）、ラニビズマブ（血管内皮増殖因子Ａ；滲出型加齢黄斑変性症）、リツキシマブ（ＣＤ２０；非ホジキンリンパ腫）、トシツモマブ（ＣＤ２０；非ホジキンリンパ腫）、トラスツズマブ（ＥｒｂＢ２；乳癌）、およびそれらの任意の抗原結合フラグメントが挙げられる。
本明細書で使用される「結合剤」という用語は、別の分子に高親和性で結合する任意の分子を指す。一部の実施形態では、結合剤はその結合相手に高特異性で結合する。結合剤の例としては、限定されるものではないが、抗体、抗体フラグメント、受容体、リガンド、アプタマー、およびアドネクチンが挙げられる。
一部の実施形態では、赤血球にコンジュゲートされる目的タンパク質は、サイトカイン、例えばＩ型サイトカインである。特定の目的の一部の実施形態では、標的タンパク質は、４ヘリックスバンドルタンパク質、例えば４ヘリックスバンドルサイトカインである。例示的な４ヘリックスバンドルサイトカインとしては、例えば、特定のインターフェロン（例えばＩ型インターフェロン、例えばＩＦＮ−α）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２）、およびコロニー刺激因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ）が挙げられる。ＩＦＮは、例えばインターフェロンアルファ−２ａまたはインターフェロンアルファ−２ｂであり得る。例えば、Ｍｏｔｔ ＨＲ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＩＤ．“Ｆｏｕｒ−ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．”Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１９９５ Ｆｅｂ；５（１）：１１４−２１；Ｃｈａｉｋｅｎ ＩＭ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＷＶ．“Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ ｆｏｕｒ−ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：ｔｏｗａｒｄｓ ｄｅ ｎｏｖｏ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｄｅｓｉｇｎ．”Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６ Ｏｃｔ；１４（１０）：３６９−７５；Ｋｌａｕｓ Ｗ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｐｈａ−２ａ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ”を参照されたい。これらのサイトカインの特定のものに関するさらなる議論については、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２７４（４）：６６１−７５，１９９７。
目的タンパク質はまた、前述のサイトカインの１種または複数に類似の構造を有するサイトカインタンパク質であってもよい。例えば、サイトカインは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）またはオンコスタチンＭなどのＩＬ−６クラスサイトカインであり得る。一部の実施形態では、サイトカインは、ＧＰ１３０シグナル伝達サブユニットを含む受容体に天然で結合するサイトカインである。他の目的４ヘリックスバンドルタンパク質としては、成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、および胎盤性ラクトゲンが挙げられる。一部の実施形態では、標的タンパク質は、赤血球形成刺激剤、例えば（ＥＰＯ）であり、これも４ヘリックスバンドルサイトカインである。一部の実施形態では、赤血球形成刺激剤は、ＥＰＯ変異体、例えば、５つのＮ連結炭水化物鎖を含有するように操作されている、新規赤血球形成刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）とも称されるダルベポエチンアルファである（３つ以上の組換えＨｕＥＰＯ）。一部の実施形態では、タンパク質は５ヘリックスを含む。例えば、タンパク質は、インターフェロンベータ、例えばインターフェロンベータ１ａ、インターフェロンベータ１ｂであり得、これは、（認識されるように）４ヘリックスバンドルサイトカインとして分類されることが多い。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、またはＩＬ−１５である。特定のサイトカインの議論については、例えば、Ｈｕｎｔｅｒ，ＣＡ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，５２１−５３１，２００５を参照されたい。Ｐａｕｌ，ＷＥ（ｅｄ．），Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；６ｔｈ ｅｄ．，２００８も参照されたい。本明細書に引用の参考文献に記載の任意のタンパク質を、これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれるが、標的タンパク質として使用することができる。
加えて、目的タンパク質は、ヒトの疾患または障害の処置に使用するために、米国食品医薬品局（ＵＳ Ｆｏｏｄ＆Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（または欧州医薬品審査庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ）などの同等の規制当局）により認可されているタンパク質である場合もある。そのようなタンパク質は、ＰＥＧ化バージョンが臨床試験で判定され、かつ／または市販について認可されたタンパク質であっても、そうでなくてもよい。
目的タンパク質はまた、神経栄養因子、すなわち、神経系統細胞（本明細書に使用される用語としては、神経前駆細胞、神経細胞、およびグリア細胞、例えば、星状細胞、乏突起膠細胞、ミクログリアが挙げられる）の生存、発生、および／または機能を促進する因子であってもよい。例えば、一部の実施形態では、標的タンパク質は神経突起伸長を促進する因子である。一部の実施形態では、タンパク質は、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ；４ヘリックスバンドルタンパク質）またはアキソカインなどのそのアナログであり、アキソカインは、Ｃ末端の１５アミノ酸の短縮および２つのアミノ酸置換を有するヒト毛様体神経栄養因子の改変バージョンであって、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのアッセイでＣＮＴＦよりも３〜５倍強力であり、安定性も改善されている。
別の例では、目的タンパク質は、ホモ二量体またはヘテロ二量体（または３つ以上のサブユニットを含むホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマー、例えば四量体）を形成するタンパク質である。特定の実施形態では、ホモ二量体、ヘテロ二量体、またはオリゴマーの構造は、第１のサブユニットの末端が第２のサブユニットの末端に近接しているような構造である。例えば、第１のサブユニットのＮ末端は、第２のサブユニットのＣ末端に近接している。特定の実施形態では、ホモ二量体、ヘテロ二量体、またはオリゴマーの構造は、第１のサブユニットの末端および第２のサブユニットの末端が、受容体との相互作用に関与しないような構造であり、そのため生物活性にあまり影響を与えることなく、非遺伝学的にコードされたペプチドエレメントを介して末端を連結させることができる。一部の実施形態では、ホモ二量体、ヘテロ二量体、またはオリゴマーの２つのサブユニットの末端が、本明細書に記載の方法を使用して、クリックケミストリーによりコンジュゲートされ、それによって、少なくとも２つのサブユニットが共有結合で連結される二量体（またはオリゴマー）が生成する。例えば、ニューロトロフィン神経成長因子（ＮＧＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン３（ＮＴ３）；およびニューロトロフィン４（ＮＴ４）は、約５０％の配列同一性を共有し、二量体の形態で存在する二量体分子である。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＲＣ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ／ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ３ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ．”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３４（１３）：４１３９−４６，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＲＣ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ４ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ／ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ４ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｒｅｖｅａｌ ａ ｃｏｍｍｏｎ Ｔｒｋ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．８（１２）：２５８９−９７，１９９９、およびその中の参考文献を参照されたい。一部の実施形態では、二量体タンパク質は、サイトカイン、例えばインターロイキンである。
あるいは、目的タンパク質は、酵素、例えば、代謝または他の生理学的プロセスで重要な酵素である。当技術分野で公知のように、酵素または他のタンパク質の欠損は、種々の疾患をもたらし得る。そのような疾患としては、炭水化物代謝、アミノ酸代謝、有機酸代謝、ポルフィリン代謝、プリンまたはピリミジン代謝、リソソーム蓄積症、血液凝固等の欠陥に関連した疾患が挙げられる。例としては、ファブリ病、ゴーシェ病、ポンペ病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、アスパラギナーゼ欠損症、ポルフィリン症、血友病、および遺伝性血管浮腫が挙げられる。一部の実施形態では、タンパク質は、凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇまたはｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、または第ＩＸ因子）である。他の実施形態では、タンパク質は、炭水化物代謝、アミノ酸代謝、有機酸代謝、ポルフィリン代謝、プリンもしくはピリミジン代謝、および／またはリソソーム蓄積に役割を担う酵素であり、この酵素の外部からの投与は疾患を少なくとも部分的に緩和する。
さらに、目的タンパク質は、受容体または受容体フラグメント（例えば、細胞外ドメイン）であってもよい。一部の実施形態では、受容体はＴＮＦα受容体である。特定の実施形態では、標的タンパク質は尿酸オキシダーゼを含む。
一部の実施形態では、目的タンパク質は、病原体（例えば、ウイルスまたは細菌）に由来し得る抗原性タンパク質である。抗原性タンパク質は、種々の実施形態において、天然または合成であり得る。抗原性タンパク質は、病原体、感染細胞、または新生物細胞（例えば、癌細胞）により天然に生成され得るものであり、かつ／またはそれらにより遺伝的にコードされるポリペプチドまたはペプチドを含む。一部の例では、抗原性タンパク質は、自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）（「自己抗原（ｓｅｌｆ ａｎｔｉｇｅｎ）」）であり、自己免疫反応を惹起または増強する能力を有する。他の例では、抗原性タンパク質は、ウイルス、細菌、菌類、または一部の実施形態では、病原体である寄生生物により生成されるかまたは遺伝的にコードされる。一部の実施形態では、病原体（例えば、ウイルス、細菌、菌類、寄生生物）は感染し、一部の実施形態では、少なくとも１つの哺乳類または鳥類の種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、および／またはブタの種に疾患を引き起こす。一部の実施形態では、病原体は、少なくともその生活環の一部では細胞内にある。一部の実施形態では、病原体は細胞外にある。特定の供給源に由来する抗原は、種々の実施形態では、例えば、抗原を使用する目的のために、例えば、抗原に対する抗体を同定、生成、試験、または使用するために、その供給源から単離するか、または任意の適切な手段（例えば、組換え、合成等）を使用して生成させることができることを認識されよう。抗原は、例えば、別の分子または実体（例えば、アジュバント）へのコンジュゲーション、化学的または物理的な変性等により修飾することができる。一部の実施形態では、抗原は、エンベロープタンパク質、カプシドタンパク質、分泌タンパク質、構造タンパク質、細胞壁のタンパク質もしくは多糖、カプセルのタンパク質もしくは多糖、または酵素である。一部の実施形態では、抗原は毒素、例えば細菌毒素である。
例示的なウイルスとしては、例えば、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ−Ｉなどのレンチウイルス）；カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラウイルス科（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａ ｖｉｒｉｄａｅ）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉ ｒｉｄａｅ）（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（パルボウイルス）；パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢＶ、ＫＳＶ）；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）が挙げられる。
例示的な細菌としては、例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジュネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリア（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（ビリダンス群）、糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボヴィス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、キャンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、バシラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシラス・モリニフオルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ・ペルニュ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、アクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、およびフランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）が挙げられる。
例示的な菌類としては、例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、例えば、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、例えば、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・ギリエルモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、例えば、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、エピデルモフィトン属（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ヒストプラスマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、例えば、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、マラセジア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）、例えば、マラセジア・フルフール（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ）、ミクロスポルム属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、パラコクシディオイデス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、例えば、パラコクシディオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、例えば、ペニシリウム・マルネフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えば、ピチア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ）、ピチア・ギリエルモンジ（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、ニューモシスティス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）、例えば、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、シューダレシェリア属（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ）、例えば、シューダレシェリア・ボイジ（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、例えば、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、例えば、ロドトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ）、シェドスポリウム属（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、例えば、シェドスポリウム・アピオスペルマム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｐｉｏｓｐｅｒｍｕｍ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、例えば、シゾフィラム・コミュネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）、スポロトリックス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、例えば、スポロトリックス・シェンキ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、トリコフィトン属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、例えば、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、トリコフィトン・ルブラム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）、トリコフィトン・ベルコサム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、トリコフィトン・ビオラセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、例えば、トリコスポロン・アサヒ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ）、トリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）、トリコスポロン・インキン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｉｎｋｉｎ）、およびトリコスポロン・ムコイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｍｕｃｏｉｄｅｓ）が挙げられる。
一部の実施形態では、抗原は腫瘍抗原（ＴＡ）である。一般に、腫瘍抗原は、腫瘍細胞（例えば、腫瘍原性細胞、または一部の実施形態では、腫瘍間質細胞、例えば、癌関連繊維芽細胞などの腫瘍関連細胞）により生成される任意の抗原性物質であり得る。多くの実施形態では、腫瘍抗原は、非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞により差次的に発現される分子（またはその一部）である。腫瘍抗原としては、例えば、通常はごく少量で生成されるが、腫瘍細胞により大量に発現されるタンパク質、通常は特定の発生段階でのみ生成されるタンパク質、腫瘍細胞における突然変異によりその構造（例えば、配列または翻訳後修飾）が修飾されているタンパク質、または（正常状態下では）免疫系から隔離されている正常タンパク質が挙げられる。腫瘍抗原は、例えば、腫瘍細胞の同定もしくは検出において（例えば、診断目的のため、かつ／もしくは腫瘍について処置を受けた被験体を、例えば再発について検査するためにモニターする目的のため）、かつ／または種々の薬剤（例えば、治療薬）を腫瘍細胞にターゲティングする目的に対して、有用となり得る。例えば、一部の実施形態では、腫瘍抗原に結合する抗体フラグメントの抗体を含み、かつクリックケミストリーにより治療薬、例えば細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされているキメラ抗体が提供される。一部の実施形態では、ＴＡは、突然変異遺伝子、例えば、癌遺伝子または突然変異癌抑制遺伝子の発現産物、過剰発現または異常発現の細胞タンパク質、癌ウイルス（例えば、ＨＢＶ；ＨＣＶ；ＥＢＶ、ＫＳＶなどのヘルペスウイルスファミリーメンバー；パピローマウイルス等）によりコードされた抗原、または腫瘍胎児性抗原である。腫瘍胎児性抗原は、通常、胚発生の初期段階で生成され、免疫系が完全に発生する時期までに大部分または完全に消失する。例としては、αフェトプロテイン（ＡＦＰ、例えば胚細胞腫瘍および肝細胞癌で見出される）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ、例えば腸癌および時として肺癌または乳癌に見出される）がある。チロシナーゼは、通常はごく少量で生成されるが、特定の腫瘍細胞（例えば、メラノーマ細胞）でその生成が大幅に増大するタンパク質の例である。他の例示的なＴＡとしては、例えば、ＣＡ１２５（例えば卵巣癌に見出される）；ＭＵＣ‐１（例えば乳癌に見出される）；上皮性腫瘍抗原（例えば乳癌に見出される）；メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ；例えば悪性メラノーマに見出される）；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ、前立腺癌で見出される）が挙げられる。一部の実施形態では、ＴＡは、腫瘍細胞の細胞表面に少なくとも部分的に露出される。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、異常修飾されたポリペプチドまたは脂質、例えば異常修飾された細胞表面糖脂質、糖タンパク質を含む。ＴＡは、特定タイプの腫瘍サブセットおよび／または腫瘍中の細胞サブセットによって発現されることがあることを認識されよう。
下記の表１に、例示的な目的タンパク質およびそのアミノ酸配列を記載する。
Figure 2016519933
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本明細書に記載の目的タンパク質は何れも、修飾することができ、（ｉ）Ｎ末端にグリシンなどの１つまたは複数の求核性残基（例えば、１〜１０残基の間）および場合によっては、切断認識配列、例えば、求核性残基をマスクするプロテアーゼ切断認識配列；または（ｉｉ）Ｃ末端またはＣ末端近辺のソルターゼ認識モチーフを含むことができる。一部の実施形態では、標的タンパク質は、（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。このような修飾タンパク質は、本明細書に記載のタンパク質コンジュゲーション方法に使用することができる。
当業者であれば、特定のタンパク質、例えば、分泌型の真核生物（例えば、哺乳類）タンパク質は、多くの場合、細胞内プロセシング（例えば、分泌に先立つ分泌シグナルの切断および／または生物活性に必要としない他の部分の除去）を受けて、成熟形態を生成することを認識されよう。標的タンパク質のそのような成熟した生物活性バージョンが、本開示の特定の実施形態で使用される。
他の目的タンパク質は、例えば、米国特許出願第１０／７７３，５３０号明細書；同第１１／５３１，５３１号明細書；米国特許出願第１１／７０７，０１４号明細書；同第１１／４２９，２７６号明細書；同第１１／３６５，００８号明細書に見出すことができる。これらの特許出願はすべて参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、本明細書に記載のタンパク質の何れに対しても、また当業者に公知の何れのタンパク質に対しても、本発明の方法を適用することを包含する。
薬剤がタンパク質でない場合、そのような薬剤は、タンパク質骨格にコンジュゲートすることができ、ソルターゼの存在下で表面のソルタギング可能なタンパク質に連結することができる。非タンパク質性薬剤としては、以下に限定されるものではないが、脂質、炭水化物、クリックケミストリーハンドルもしくは化学療法剤などの小分子、検出可能な標識（例えば、イメージング剤）、または化学療法剤を挙げることができる。本開示の実施形態で使用するのに適したさらなる薬剤は、当業者に明らかであろう。
一部の例では、非タンパク質性薬剤は、免疫応答を誘発できるような抗原性がある。そのような抗原性薬剤としては、例えば、多糖、炭水化物、脂質、核酸、またはそれらの組合せを挙げることができ、またそれは病原体、例えば、本明細書に記載のものに由来するものであってもよい。
「コンジュゲートされた」または「コンジュゲーション」という用語は、直接的または間接的な共有結合的または非共有結合的な相互作用によって連結されるような、２つの分子、例えば、２つのタンパク質またはタンパク質と薬剤、例えば小分子との相互の結合を指す。特定の実施形態では、結合は共有結合であり、実体が相互に「コンジュゲートされている」と言う。一部の実施形態では、タンパク質は、タンパク質が形成された後に、また一部の実施形態では、タンパク質が単離された後に、タンパク質と他の分子との間に共有結合を形成させることにより、別の分子、例えば、第２のタンパク質、小分子、検出可能な標識、クリックケミストリーハンドル、結合剤に、翻訳後コンジュゲートされる。一部の実施形態では、２つの分子が両方の分子を連結するリンカーを介してコンジュゲートされる。例えば、２つのタンパク質が相互にコンジュゲートしてタンパク質融合体を形成する一部の実施形態では、２つのタンパク質は、ポリペプチドリンカー、例えば、一方のタンパク質のＣ末端を他方のタンパク質のＮ末端に連結するアミノ酸配列を介してコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、２つのタンパク質が、それぞれのＣ末端でコンジュゲートされて、Ｃ−Ｃコンジュゲートされたキメラタンパク質が生成する。一部の実施形態では、２つのタンパク質が、それぞれのＮ末端でコンジュゲートされて、Ｎ−Ｎコンジュゲートされたキメラタンパク質が生成する。一部の実施形態では、ペプチドへのタンパク質のコンジュゲーションは、ソルターゼを使用するペプチド転移により達成される。例えば、ソルターゼ媒介ペプチド転移のための例示的なソルターゼ、タンパク質、認識モチーフ、試薬、および方法については、それぞれの内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｌｏｅｇｈ ｅｔ ａｌ、２０１０年２月１日に出願され、２０１０年８月５日に国際公開第２０１０／０８７９９４号パンフレットとして公開された国際ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０００２７４号明細書、およびＰｌｏｅｇｈ ｅｔ ａｌ、２０１１年４月２０日に出願され、２０１１年１０月２７日に国際公開第２０１１／１３３７０４号パンフレットとして公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３３０３号明細書を参照されたい。
クリックケミストリーは、Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＫ．Ｂａｒｒｙ Ｓｈａｒｐｌｅｓｓにより導入された化学原理であり、反応性基を含む小さな単位を相互に連結させることにより、迅速かつ信頼性高く共有結合を生成する目的に適った化学が記載される（Ｈ．Ｃ．Ｋｏｌｂ，Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ ａｎｄ Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ（２００１）．Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ Ｆｅｗ Ｇｏｏｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ４０（１１）：２００４−２０２１を参照のこと）。クリックケミストリーは、具体的な反応を指すものではないが、これに限定されるものではないが、天然に見出される反応を模倣する反応を含む概念を指す。一部の実施形態では、クリックケミストリー反応は、モジュール式であり、範囲が広く、高い化学収率を与え、無害の副産物を生成し、立体特異的であり、単一反応生成物を伴う反応を促進するように８４ｋＪ／ｍｏｌを超える大きな熱力学的推進力を示し、かつ／または生理学的条件下で行うことができる。一部の実施形態では、クリックケミストリー反応は、高い原子経済性を示し、簡単な反応条件下で行うことができ、容易に入手可能な出発物質および試薬を使用し、有毒な溶媒を使用しないかまたは無害もしくは除去が容易な溶媒（好ましくは水）を使用し、かつ／または非クロマトグラフ法（結晶化または蒸留）による簡単な生成物単離を提供する。
クリックケミストリーハンドルは、クリックケミストリー反応に参加することができる反応物であっても反応性基であってもよい。例えば、歪みのあるアルキン、例えばシクロオクチンは、歪み促進の環化付加に参加することができるため、クリックケミストリーハンドルである。一般に、クリックケミストリー反応は、相互に反応することができるクリックケミストリーハンドルを含む、少なくとも２つの分子を必要とする。相互に反応するそのようなクリックケミストリーハンドルペアは、本明細書でパートナークリックケミストリーハンドルと呼ばれることもある。例えば、アジドは、シクロオクチンまたは他の任意のアルキンに対するパートナークリックケミストリーハンドルである。本発明の一部の態様による使用に適した例示的なクリックケミストリーハンドルは、本明細書、例えば表ＡおよびＢに記載されている。他の適切なクリックケミストリーハンドルは当業者に公知である。クリックケミストリーによりコンジュゲートされる２つの分子の場合、例えば、クリックケミストリーハンドルのうちの一方の反応性成分が、もう一方のクリックケミストリーハンドルの反応性成分と反応して共有結合を形成するという点で、分子のクリックケミストリーハンドルは相互に反応しなければならない。クリックケミストリーハンドルのこのような反応ペアは、当業者に周知であり、以下に限定されるものではないが、表２に記載されるものが含まれる：
Figure 2016519933
表２に、クリックケミストリーハンドルおよび反応の例を提供する。Ｒ、Ｒ１、およびＲ２は、ソルターゼ認識モチーフを含む任意の分子を表すことができる。一部の実施形態では、Ｒ、Ｒ１、およびＲ２の各存在は独立して、ＲＲ−ＬＰＸＴ（配列番号５０）−［Ｘ］ｙ−または−［Ｘ］ｙ−ＬＰＸＴ（配列番号５０）−ＲＲ（式中、Ｘの各存在は独立して、任意のアミノ酸残基を表し、ｙの各存在は、０〜１０の間の０と１０を含む整数である）であり、ＲＲの各存在は独立して、タンパク質または薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、検出可能な標識、結合剤、小分子等）および場合によってはリンカーを表す。
一部の実施形態では、金属触媒の非存在下で反応して共有結合を形成することができるクリックケミストリーハンドルが使用される。このようなクリックケミストリーハンドルは当業者に周知であり、Ｂｅｃｅｒ，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ａｎｄ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｅｙｏｎｄ Ｍｅｔａｌ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００９）４８：４９００−４９０８に記載されるクリックケミストリーハンドルを含む。下記の表３を参照されたい。
Figure 2016519933
検出可能な標識は、標識を結合する分子、例えば、タンパク質もしくはペプチドまたは他の実体の検出を可能にする、成分に組み込まれた少なくとも１つの元素、同位体、または官能基を有する成分である。標識は直接結合（すなわち結合を介して）させることも、リンカー（例えば、リンカーを構築することができる、置換されていてもよいアルキレン；置換されていてもよいアルケニレン；置換されていてもよいアルキニレン；置換されていてもよいヘテロアルキレン；置換されていてもよいヘテロアルケニレン；置換されていてもよいヘテロアルキニレン；置換されていてもよいアリーレン；置換されていてもよいヘテロアリーレン；もしくは置換されていてもよいアシレン、またはそれらの任意の組合せなど）により結合させることもできる。標識は、分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、または他の実体に、任意の位置で結合させるかまたは組み込むことができることは認識されよう。一般に、検出可能な標識は、以下の５つのクラスの何れか１つ（またはそれ以上）に分類することができる：ａ）同位体成分を含有する標識、これは放射性同位元素であっても重同位元素であってもよく、以下に限定されるものではないが、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、６７Ｇａ、７６Ｂｒ、９９ｍＴｃ（Ｔｃ−９９ｍ）、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、および１８６Ｒｅが含まれる；ｂ）免疫成分を含有する標識、これは、抗体であっても抗原であってもよく、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼなど）に結合している場合もある；ｃ）着色性、発光性、リン光性、または蛍光性の成分（たとえば、蛍光性標識フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である標識；ｄ）１つまたは複数の光親和性成分を有する標識；およびｅ）１つまたは複数の公知の結合パートナー（例えば、ビオチンストレプトアビジン、ＦＫ５０６−ＦＫＢＰ）に対するリガンドである標識。特定の実施形態では、標識は、放射性同位体、好ましくはβ粒子などの検出可能な粒子を放射する同位体を含む。特定の実施形態では、標識は蛍光性成分を含む。特定の実施形態では、標識は、蛍光性標識フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。特定の実施形態では、標識は、１つまたは複数の公知の結合パートナーを有するリガンド成分を含む。特定の実施形態では、標識はビオチンを含む。一部の実施形態では、標識は、蛍光性ポリペプチド（例えば、ＧＦＰもしくは改良型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）などのその誘導体）またはルシフェラーゼ（例えば、ホタル、ウミシイタケ、またはガウシアのルシフェラーゼ）である。特定の実施形態では、標識は、適切な基質（例えば、ルシフェリン）と反応して検出可能なシグナルを生成し得ることを認識されよう。蛍光タンパク質の非限定例としては、ＧＦＰおよびその誘導体、赤色、黄色、およびシアン色の蛍光タンパク質など、異なる色の光を放射するフルオロフォアを含むタンパク質が挙げられる。例示的な蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ｍＵｋＧ１、ｍＡＧ１、ＡｃＧＦＰ１、ＴａｇＧＦＰ２、ＥＧＦＰ、ｍＷａｓａｂｉ、ＥｍＧＦＰ、ＴａｇＹＰＦ、ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、ＳＹＦＰ２、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＫＯ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ｍＫｅｉｍａが挙げられる。例えば、ＧＦＰおよび数多くの他の蛍光または発光タンパク質の議論については、Ｃｈａｌｆｉｅ，Ｍ．ａｎｄ Ｋａｉｎ，ＳＲ（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ，ｖ．４７ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．，２００６；およびＣｈｕｄａｋｏｖ，ＤＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ．９０（３）：１１０３−６３，２０１０を参照されたい。一部の実施形態では、標識は、ダーククエンチャー、例えば、フルオロフォアからの励起エネルギーを吸収し、このエネルギーを熱として散逸する物質を含む。
「小分子」とは、天然に存在するかまたは人為的に作製されたか（例えば、化学合成により）に関わらず、比較的低分子量を有する分子を指す。典型的には、小分子は有機化合物（すなわち、それは炭素を含有する）である。小分子は、複数の炭素間結合、立体中心、および他の官能基（例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボニル、複素環等）を含有することができる。一部の実施形態では、小分子は、単量体であり、約１５００ｇ／モル未満の分子量を有する。特定の実施形態では、小分子の分子量は、約１０００ｇ／モル未満または約５００ｇ／モル未満である。特定の実施形態では、小分子は、薬物、例えば、適切な政府機関または規制団体によりヒトまたは動物での使用が安全かつ効果的であるとすでに認められた薬物である。
本明細書に記載の非タンパク質性薬剤は何れも、当業者に公知の方法によりタンパク質骨格にコンジュゲートさせることができる。
（ｃ）ソルターゼ触媒ペプチド転移反応
ソルターゼ触媒アシル基転移反応、およびタンパク質工学のためのペプチド転移（場合によってはアシル基転移とも呼ばれる）におけるその使用は、当業者に周知である（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｌｏｅｇｈ ｅｔ ａｌ．、国際公開第２０１０／０８７９９４号パンフレットおよびＰｌｏｅｇｈ ｅｔ ａｌ．、国際公開２０１１／１３３７０４号パンフレットを参照のこと）。一般に、ソルターゼにより触媒されるペプチド転移反応により、Ｃ末端ソルターゼ認識モチーフ、例えばＬＰＸＴＸ（配列番号８０；Ｘの各存在は独立して、任意のアミノ酸残基を表わす）を含有する第１のタンパク質がＮ末端ソルターゼアクセプターペプチド、例えば、１つまたは複数のＮ末端グリシン残基を含む第２のタンパク質とコンジュゲートする。一部の実施形態では、ソルターゼ認識モチーフは、本明細書に記載のソルターゼ認識モチーフである。特定の実施形態では、ソルターゼ認識モチーフは、ＬＰＸＴ（配列番号５０）モチーフまたはＬＰＸＴＧ（配列番号１）である。
ソルターゼアシル基転移反応は、アシルドナーを求核性アシルアクセプターと効率的に連結する手段を提供する。この原理は、多くのアシルドナーおよび多数の異なるアシルアクセプターに広く適用可能である。これまで、ソルターゼ反応は、タンパク質および／またはペプチドを相互に連結するために、合成ペプチドを組換えタンパク質に連結するために、レポーティング分子をタンパク質またはペプチドに連結するために、核酸をタンパク質またはペプチドに連結するために、タンパク質またはペプチドを固体支持体またはポリマーにコンジュゲートするために、またタンパク質またはペプチドを標識に連結するために使用された。このような生成物およびプロセスは、連結生成物の合成に関連した費用および時間を節約し、アシルドナーをアシルアクセプターに好都合に連結するのに有用である。しかしながら、本明細書に提供される、ソルタギングによる、ウイルス粒子表面上のタンパク質の修飾および機能化は、これまでに記載されていない。
ソルターゼ媒介ペプチド転移反応（場合によってはアシル基転移反応とも呼ばれる）は、ソルターゼのトランスアミダーゼ活性により触媒され、アシルドナー化合物とＮＨ２−ＣＨ２成分を含有する求核性アシルアクセプターとの間にペプチド結合（アミド結合）が形成される。一部の実施形態では、ソルターゼ媒介ペプチド転移反応を行なうために使用されるソルターゼはソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）である。しかしながら、本発明はソルターゼＡの使用に限定されるものではないため、アシル基転移反応を触媒する任意のソルターゼまたはトランスアミダーゼを、本発明の一部の実施形態では使用することができることに留意するべきである。
典型的には、目的薬剤（例えば、タンパク質またはタンパク質骨格にコンジュゲートされる非タンパク質性薬剤）は、タンパク質性薬剤または目的薬剤がコンジュゲートされているタンパク質骨格を、ペプチド転移反応の発生を可能にする適切な条件下で細胞と接触させることにより、ソルタギング可能な表面タンパク質を発現する細胞の表面に連結することができる。一部の例では、目的薬剤は、最初に、ソルターゼ認識部位での切断が可能になる適切な時間、適切な条件下でソルターゼとインキュベートすることができる。次いで、目的薬剤が細胞上で表面のソルタギング可能なタンパク質にコンジュゲートされるように、この混合物を適切な条件下で細胞と接触させる。
一部の実例では、ＣＤ４＋前駆細胞または脱核赤血球などの細胞は、Ｃ末端にソルターゼ認識モチーフを含む融合タンパク質（例えば、Ｃ末端にソルターゼ認識モチーフが融合したＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質）を発現する。目的タンパク質または目的薬剤をコンジュゲートしたタンパク質骨格は、ソルターゼの存在下で融合タンパク質のＣ末端にコンジュゲートさせることができる。他の実例では、細胞は、膜タンパク質と、膜タンパク質（例えば、Ｉ型またはＩＩＩ型の膜貫通型タンパク質）のＮ末端に融合したアクセプターペプチド（例えば、グリシンポリマー）とを含む融合タンパク質を発現する。細胞表面融合タンパク質にコンジュゲートされるタンパク質は、上記のソルターゼ認識モチーフをＣ末端に含み、表面融合タンパク質のＮ末端にコンジュゲートさせることができる。
本明細書に記載のコンジュゲーション方法における特定のソルターゼの使用は、細胞上の表面ソルタギング可能なタンパク質または表面タンパク質にコンジュゲートされるタンパク質の何れかに含まれるソルターゼ認識モチーフに依存することになる。これは当業者の知識の十分範囲内である。例えば、種々のソルターゼの認識部位に関しては上記の説明を参照されたい。
一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞またはそれに由来する脱核赤血球は、複数の異なる表面ソルタギング可能なタンパク質（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上）を発現することができる。一部の実施形態では、複数の表面ソルタギング可能なタンパク質の１つまたは複数の特定の修飾には、１つまたは複数のソルタギング可能なタンパク質に含まれる異なるソルターゼ認識モチーフをそれぞれが特異的に認識する異なるソルターゼの使用が含まれる。例えば、第１のソルタギング可能なタンパク質は、Ｃ末端ソルターゼ認識モチーフＬＰＥＴＧＧ（配列番号１０７）およびＮ末端ソルターゼ認識モチーフ（Ｇ）ｎを認識するＳｒｔＡアウレウスで修飾することができ、第２のソルタギング可能なタンパク質は、Ｃ末端ソルターゼ認識モチーフＬＰＥＴＡＡ（配列番号１０８）およびＮ末端ソルターゼ認識モチーフ（Ａ）ｎを認識するＳｒｔＡピオゲネスで修飾することができる。この例のソルターゼは、それぞれの認識モチーフを認識するが、他のソルターゼの認識モチーフを有意な程度に認識することはなく、したがって、それぞれの認識モチーフを「特異的に」認識する。一部の実施形態では、ソルターゼは、異なるモチーフに結合する親和性よりも、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、または１０００倍を超えて高い親和性でソルターゼ認識モチーフに結合する場合に、ソルターゼ認識モチーフに特異的に結合する。このような直交したソルターゼおよびそれぞれの認識モチーフの組合せ、例えば、直交したソルターゼＡ酵素であるＳｒｔＡアウレウスとＳｒｔＡピオゲネスの組合せは、２つの異なる表面ソルタギング可能なタンパク質上に２つの異なる成分を部位特異的にコンジュゲートさせるために使用することができる。
他の実施形態では、複数の異なるタンパク質のソルタギングは、異なるソルタギング可能な表面タンパク質を含む細胞を、第１のソルタギング可能なタンパク質のソルターゼ認識モチーフを認識する第１のソルターゼおよび適切な第１の目的タンパク質と、次いで第２のソルタギング可能なタンパク質のソルターゼ認識モチーフを認識する第２のソルターゼおよび第２の目的タンパク質と等々、逐次的に接触させることにより、達成される。あるいは、例えば、第１のソルタギング可能なタンパク質のソルターゼ認識モチーフを認識する第１のソルターゼおよび適切な第１の目的タンパク質と、第２のソルタギング可能なタンパク質のソルターゼ認識モチーフを認識する第２のソルターゼおよび第２の目的タンパク質と等々、細胞を複数のソルターゼと並行して接触させてもよい。
例えば、一部の実施形態では、第１のソルタギング可能なタンパク質、例えば、オリゴグリシンが融合したＩ型膜貫通型タンパク質は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡ（ＳｒｔＡアウレウス）を使用して修飾され、第２のソルタギング可能なタンパク質、例えば、適切なソルターゼ認識モチーフが融合したＩＩ型膜貫通型タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のソルターゼＡ（ＳｒｔＡピオゲネス）を使用して修飾される。ＳｒｔＡアウレウスは、モチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１）（Ｘは任意のアミノ酸残基である）を認識し、アクセプターペプチドとしてオリゴグリシンを使用する。これとは異なり、ＳｒｔＡピオゲネスは、モチーフＬＰＸＴＡ（配列番号２）（Ｘは任意のアミノ酸残基である）を認識し、アクセプターペプチドとしてオリゴアラニンを使用する。
十分に異なるソルターゼ認識モチーフを十分な特異性で認識する任意のソルターゼは、赤血球上に発現される複数のソルタギング可能なタンパク質のソルタギングに適している。それぞれのソルターゼ認識モチーフは、当業者に公知の組換え技術を使用して、ソルタギング可能なタンパク質またはソルタギング可能なタンパク質にコンジュゲートされるタンパク質に挿入することができる。一部の実施形態では、適切なソルターゼ認識モチーフは、野生型膜タンパク質に存在し得る。当業者であれば、例えば、ソルタギング可能なタンパク質が、そのＣ末端またはＮ末端に、公知の任意のソルターゼにより基質として認識され得る配列を含むか否かにかかわらず、所与のタンパク質のコンジュゲーションに適したソルターゼの選択はソルタギング可能なタンパク質の配列に依存し得ることを理解されよう。一部の実施形態では、標的タンパク質のさらなる操作を回避することができるため、天然のＣ末端またはＮ末端認識モチーフを認識するソルターゼの使用が好ましい。
ＩＶ．目的薬剤のｉｎ ｖｉｖｏ送達用の担体としての赤血球の使用
遺伝子改変のＣＤ３４＋前駆細胞、およびこれも記載されるように遺伝子改変することができる脱核赤血球（本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程から得られるものを含む）は何れも、本開示の範囲内である。
本明細書に記載される、目的薬剤の表面修飾を有する脱核赤血球は、種々の目的のために、例えば、目的薬剤が治療薬である場合に特定疾患を処置するために、目的薬剤が標的細胞を認識することができる場合に特定の細胞型の存在を検出するために、また目的薬剤が免疫原性である場合に所望の免疫応答を惹起するために、それを必要とする被験体（例えば、ヒト患者）に投与することができる。任意の適切な送達ルート、例えば細胞点滴を本明細書に記載の方法で使用することができる。
一部の例では、赤血球は、この細胞が由来する被験体に送達される。例えば、末梢血液細胞をヒト患者などの被験体から入手し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大し、ソルタギング可能な表面タンパク質を発現するように遺伝子改変し、脱核赤血球に分化させ、そして目的薬剤をコンジュゲートさせることができる。次いで、修飾脱核赤血球を、同じ被験体に投与することができる。
他の例では、ＣＤ３４＋前駆細胞を、適切な被験体から入手し、本明細書に記載のように分化させ遺伝子改変した後、得られた脱核赤血球を、好ましくはドナーと免疫適合性がある（例えば、脱核血液細胞の投与により望ましくない免疫応答が誘発されないであろう）異なる被験体に投与する。
脱核赤血球は、赤血球欠乏、例えば、貧血、外科手術または外傷による失血と関連した症状を有するかまたはその疑いのある被験体に投与することができる。脱核赤血球はまた、脱核赤血球の表面上にコンジュゲートされた目的薬剤により達成することができる処置または診断を必要とする被験体に投与することができる。例えば、脱核赤血球は、癌抗原または病原体に由来する抗原にコンジュゲートさせることができる。そのような細胞は、予防処置または治療処置を必要とする被験体（例えば、癌または病原体による感染症に罹患しているかまたはそのリスクがあるヒト被験体）に送達することができる。
別の例では、有核赤血球は、酵素欠損に関連した疾患または障害、例えば、ファブリ病、ゴーシェ病、ポンペ病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、アスパラギナーゼ欠損症、ポルフィリン症、血友病、および遺伝性血管浮腫の処置に有効な酵素にコンジュゲートさせることができる。
他の例では、脱核赤血球は、凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇまたはｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、または第ＩＸ因子）を担持し、異常な血液凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇまたはｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）に関連した症状を有するかまたはその疑いのあるヒト被験体に送達することができる。
Ｖ．キット
本開示の一部の態様は、赤血球の遺伝子改変およびソルタギングによる表面修飾に有用なキットを提供する。このようなキットは、それぞれが赤血球膜タンパク質と本明細書に記載のペプチドとを含む１つまたは複数の融合タンパク質をコードする１つまたは複数の発現ベクターを含む。キットが記載のように複数の発現ベクターを含む場合、発現ベクターは異なるソルターゼ認識モチーフをコードする配列を含むことができる。一部の実施形態では、異なるソルターゼ認識モチーフは、直交したソルターゼにより認識され、例えば、ＳｒｔＡアウレウスによりあるモチーフが、ＳｒｔＡピオゲネスにより別のモチーフが認識される。
代替的または追加的に、本明細書に記載のキットは、脱核赤血球を生成させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程で使用される培地成分の１つまたは複数、例えば、そこで使用されるサイトカインの１つまたは複数、およびそこで使用される培地の１つまたは複数、および／または細胞培養の他の成分を含むことができる。
さらに、キットは１つまたは複数の適切なソルターゼを含むことができる。典型的には、キットに含まれるソルターゼは、キットに含まれる核酸によりコードされるソルターゼ認識モチーフを認識する。一部の実施形態では、ソルターゼは、保存溶液中に、ソルターゼの構造完全性および／または活性を保持する条件下で提供される。一部の実施形態では、２つ以上の直交したソルターゼ認識モチーフがキットに含まれる核酸によりコードされる場合、核酸によりコードされる異なるソルターゼ認識モチーフをそれぞれが認識する複数のソルターゼが提供される。一部の実施形態では、キットはＳｒｔＡアウレウスおよび／またはＳｒｔＡピオゲネスを含む。
一部の実施形態では、キットは、目的薬剤、例えば、目的タンパク質または非タンパク質性薬剤にコンジュゲートされたタンパク質骨格をさらに含む。一部の実施形態では、目的タンパク質またはタンパク質骨格は、ソルターゼ認識モチーフを含み、両方のモチーフが同じソルターゼにより触媒されるソルターゼ媒介ペプチド転移反応に参加することができるという点で、キット中の核酸によりコードされる融合タンパク質中のペプチドと適合し得る。例えば、キットがＳｒｔＡアウレウスＮ末端認識配列を含む融合膜タンパク質をコードする核酸を含む場合、キットはまた、ＳｒｔＡアウレウスと、Ｃ末端ソルターゼ認識モチーフを含む目的タンパク質またはタンパク質骨格とを含むことができる。
一部の実施形態では、キットは、ソルターゼ媒介ペプチド転移反応を行うために有用な緩衝剤または試薬、例えば、実施例の部に記載の緩衝剤または試薬をさらに含む。
さらなる詳細な説明がなくとも、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明をその最大限度まで利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単に説明のためのものとして解釈されるべきであり、本開示のその他の部分を決して限定するものではない。本明細書に引用の刊行物はすべて、本明細書で言及された目的または対象のために、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１：ヒト成熟脱核赤血球のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成
ＣＤ３４＋について濃縮されたヒト末梢血Ｇ−ＣＳＦ動員造血幹／前駆細胞を、Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＦＨＣＲＣ），Ｓｅａｔｔｌｅから購入する。ＦＨＣＲＣプロトコールに従って、細胞を解凍する。ヒトＣＤ３４＋（ｈＣＤ３４＋）血液細胞は、２１日の間に、図１に示され、また以下に記載される４段階：（ａ）拡大、（ｂ）分化Ｉ（「分化Ｉ」）、（ｃ）分化ＩＩ（「分化ＩＩ」）、および分化ＩＩＩ（「分化ＩＩＩ」）で構成される方法により、成熟脱核赤血球に分化させた。
拡大段階では、ヒトＣＤ３４＋血液細胞を、拡大培地（ＳｔｅｍｓｐａｎＳＦＥＭ、Ｆｌｔ−３リガント（ｌｉｇａｎｔ）、ＳＣＦ、ＩＬ−３、およびＩＬ−６を含むＣＣ１００サイトカイン混合物、ならびに２％ペニシリン−ストレプトマイシン）中、１０５細胞／ｍＬで１〜４日目の間培養した。拡大後、続いて、分化Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩにおいて、種々のサイトカインを添加したＩＭＤＭベースの赤血球系分化培地中で、細胞を培養する。３つの分化段階すべてに対する基礎培地は、ＩＭＤＭ、１５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１％ＢＳＡ、５００μｇ／ｍＬホロ型ヒトトランスフェリン、１０μｇ／ｍＬ組換え体ヒトインスリン、および２％ペニシリン−ストレプトマイシンを含む。５〜９日目では、赤血球系基礎培地、２μＭデキサメタゾン、１μＭ ｂ−エストラジオール、５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、および６Ｕ Ｅｐｏを含有する分化Ｉ培地で細胞を培養する。１０〜１３日目では、赤血球系基礎培地、５０ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、および６Ｕ Ｅｐｏを含有する分化ＩＩ培地中で細胞を増殖させる。１４〜２１日目では、２Ｕ Ｅｐｏを添加した赤血球系基礎培地である分化ＩＩＩ培地中、フィブロネクチンでコーティングされたプレートで細胞を培養した。分化Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩの最初に再播種した細胞数はそれぞれ、１０５、２×１０５、および３×１０５／ｍＬであった。
上記の４段階工程中の種々の時点の赤血球を、ベンジジン−ギムザ染色に供し、その細胞形態を顕微鏡下で観察した。図２に示すように、細胞サイズの減少が赤血球系成熟と共に観察され、脱核赤血球が分化ＩＩＩの８日目に観察された。本明細書に記載の４段階法から得られる脱核赤血球のサイズは、正常ヒト網状赤血球または赤血球のサイズと同様であることが見出された。下記の表４。

Figure 2016519933
分化Ｉ、分化ＩＩ、および分化ＩＩＩでの赤血球のヘモグロビン含量は、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬により測定した。結果から、分化工程の終了時に得られた脱核血液細胞では、約３０ｐｇ／細胞であることが示される。
ＣＤ２３５ａ（グリコフォリンＡ）、ｃ−Ｋｉｔ、およびＣＤ７１を含む種々の赤血球表面タンパク質の発現レベルを検討した。ＦＡＣＳ分析から、ＣＤ２３５ａ発現が赤血球形成（赤血球分化）の間に上昇することが示された。分化工程の種々の段階における、ＣＤ２３５ａの発現レベル対ｃ−ｋｉｔまたはＣＤ７１（トランスフェリン）の発現レベルを図４および５に示す。ヘキストおよびグリコフォリンＡの染色から、赤血球の約４０〜５０％が、分化工程の終了時に脱核を受けていることが示された。図５。脱核％＝３２．５／（３７．８＋３２．５）＝４６．２％。
分化工程中の細胞数をカウントし、その結果から、分化Ｉ〜分化ＩＩＩの間、ほぼ毎日、細胞数が２倍になることが示された。図６および７。ｈＣＤ３４＋細胞分化における、グロビン遺伝子および他の遺伝子（ｈｃ−ｋｉｔ、ｈＧＡＴＡ２、ｈＧＡＴＡ１、ｈＧＹＰＡ、ｈＡＬＡＳ２、およびｈＳＬＣＡ１）の発現レベルも、ＦＡＣＳ分析により検討した。結果を図８および９に示す。
要約すると、上記の試験から、４段階のｈＣＤ３４＋細胞培養および分化の工程の開発に成功したことが示される。この工程により、２１日間の培養後に約１７，０００〜３２，０００倍の細胞拡大（１４〜１５回の倍加）が得られ、細胞の約４０〜５０％が脱核を受けることが見出された。この培養工程から得られた脱核赤血球は、細胞のサイズ、ヘモグロビン含量（約３０ｐｇ／細胞）、および細胞表面マーカーの発現において、正常ヒト網状赤血球または正常赤血球に類似している。
実施例２：ソルターゼ反応による、操作された赤血球への機能的プローブのコンジュゲーション
ＲＢＣは核を欠いており、その成熟段階では遺伝子改変することができない。そこで、赤血球系前駆体を、成熟ＲＢＣの形質膜上に保持される、ソルターゼ修飾可能なタンパク質を発現するように遺伝子操作した。この試験では、２つのソルターゼ修飾可能な膜タンパク質、ＫｅｌｌおよびグリコフォリンＡ（ＧＰＡ）を、赤血球系前駆細胞で発現させた：
（１）血液型抗原Ｋｅｌｌは、細胞外に露出したＣ末端を有するＩＩ型膜タンパク質であり、Ｃ末端標識化の標的として選択された。
（２）細胞外に配置されたＮ末端を有するＩ型膜タンパク質であるＧＰＡは、ＲＢＣ表面上で最も豊富なタンパク質であり、Ｎ末端修飾のために選択された。
材料および方法
（ｉ）プラスミド
ヒト、マウスのグリコフォリンＡ（ＧＰＡ）およびＫｅｌｌのコード配列はそれぞれ、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００２０９９．６、ＮＭ＿０１０３６９．３、およびＮＭ＿０００４２０．２から入手した。細胞表面の発現を検出するために、Ｍｙｃタグコード配列（ＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧ；配列番号１０９）をシグナルペプチドと成熟ＧＰＡとの間に挿入した。ＧＰＡのＮ末端にソルターゼタグを結合させるために、５個のグリシン（配列番号３）または３個のグリシンタグコード配列（ＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡ；配列番号１１０またはＧＧＴＧＧＣＧＧＡ）を、シグナルペプチドの直後に挿入した。完全長の操作されたヒトおよびマウスＧＰＡは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより合成され、次いでＭＳＣＶレトロウイルスベクターにクローニングされた。ヒトＫｅｌｌは、Ｍｙｃタグ（ＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧ；配列番号１１２）、ＬＰＥＴＧＧ（配列番号１０７）（ＣＴＧＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡ；配列番号１１３）、次いでＨＡエピトープタグ（ＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＴ；配列番号１１４）のコード配列をそのＣ末端に伸長してＭＳＣＶレトロウイルスベクターにクローニングした。
（ｉｉ）タンパク質の発現および精製
ｐＥＴ３０における、Ｋｃａｔの改善（１）（Ｐ９４Ｒ、Ｄ１６０Ｎ、Ｄ１６５Ａ、Ｋ１９０Ｅ、Ｋ１９６Ｔ）およびＣａ２＋非依存性活性（Ｈｉｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ １０９（１２）：２９５５−２９６１）（Ｅ１０５Ｋ、Ｅ１０８Ｑ）のために突然変異させたスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Δ５９由来のソルターゼＡならびにストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のソルターゼＡを両方とも、以前に記載のように発現させ精製した。Ｇｕｉｍａｒａｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ８（９）：１７８７−１７９９。ｐＨＥＮ中の、ＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号１１５）がＣ末端に伸長したＶＨＨ７も、以前に（４）記載のように発現させ精製した。ソルターゼプローブの設計および合成も同様に以前に記載されている。Ｇｕｉｍａｒａｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；およびＴｈｅｉｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８（９）：１８００−１８０７。
（ｉｉｉ）ソルターゼ標識化反応
ビオチンによりＧＰＡのＮ末端を標識化するために、８３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中の５００μＭ Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼおよび１ｍＭ Ｋ（ビオチン）ＬＰＲＴＧＧ（配列番号１１６）ペプチド３０μｌを、氷上で１５分間プレインキュベートし、（ＤＭＥＭで前洗浄した）ＤＭＥＭ中の約１×１０６個の培養細胞（網状赤血球またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞）または最大５×１０７個の赤血球（全血１０μｌ）７０μｌに加えた。ＶＨＨ７によりＧＰＡのＮ末端を標識化するために、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中の１００μＭ Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼ、１００μＭ ＶＨＨ−ＬＰＥＴＧ−Ｈｉｓ６（配列番号１２６）５０μｌを、氷上で１５分間プレインキュベートし、ＤＭＥＭ中の最大５×１０７個の赤血球５０μｌに加えた。ビオチンによりＫｅｌｌのＣ末端を標識化するために、８３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中の５００μＭ Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼ、１．４ｍＭ ＧＧＧＫ（ビオチン）（配列番号４７）ペプチド３０μｌを、（ＤＭＥＭで前洗浄した）ＤＭＥＭ中の約１×１０６個の培養細胞（網状赤血球またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞）または最大５×１０７個の赤血球に加えた。すべてのソルターゼと細胞の混合物は、随時緩やかに混合しながら３０分間、氷上でインキュベートした。これらの混合物を４℃で２分間、２０００ＲＰＭで遠心して緩衝液／ＤＭＥＭを除去し、氷冷ＰＢＳ１ｍｌで３回洗浄した。ＧＰＡとＫｅｌｌの連続した２重標識化のために、８３ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１６．７ｍＭ ＣａＣｌ２緩衝液中の３３３μＭ Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼ、１．３３ｍＭ Ｋ（ビオチン）ＬＰＥＴＡＡ（配列番号４５）ペプチド３０μｌを、３７℃で１５分間、プレインキュベートし、（ＤＭＥＭで前洗浄した）ＤＭＥＭ中の１×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞７０μｌに加え、時々緩やかに混合しながら３７℃で２５分間インキュベートした。細胞を４℃で２分間、２０００ＲＰＭで遠心し、氷冷ＰＢＳ１ｍｌで２回洗浄し、最後に氷冷ＤＭＥＭ７０μｌに再懸濁した。８３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中の３３３μＭ Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼ、１．６７ｍＭ ＧＧＧＫ（Ａｌｅｘａ６４７；配列番号１１７）ペプチド３０μｌを細胞に加え、時々緩やかに混合しながら氷上で３０分間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳ１ｍｌで３回洗浄した。
（ｉｖ）ウエスタンブロッティング
全血をソルターゼ標識化する場合、赤血球を最初に、塩化アンモニウム溶液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５００μｌで、氷上５分間のインキュベーションにより溶解し、４℃で１０分間、１４０００ＲＰＭで遠心沈殿させた。ＰＢＳ５００μｌで膜を１回洗浄した。コンプリートミニプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（Ｒｏｃｈｅ）を添加した２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．５％ＮＰ４０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で細胞を可溶化し、撹拌し、氷上で１０分間インキュベートし、４℃で１０分間、１４，０００ＲＰＭで遠心した。上清をＳＤＳ試料緩衝液とインキュベートし、８分間煮沸した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質をＰＶＤＦ膜上に転写し、ビオチン（ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用）、ｍｙｃタグ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＃２０４０）、ＨＡタグ（Ｒｏｓｈ ３Ｆ１０）、ヘモグロビン、またはＣＤ１９（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＃３５７４）について免疫ブロットした。
（ｖ）トランスフェクション
ウイルス生成：６００万個の２９３Ｔ細胞を分離して、１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加した抗生物質不含ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、トランスフェクションの１日前に１０ｃｍプレート上に播種した。０日目に、プラスミド１０ｕｇをパッケージングベクター５ｕｇと一緒に、Ｆｕｇｅｎｅ ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む、２９３Ｔの１０ｃｍプレートに加えた。６８時間後に、１５％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１×Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した新たなＤＭＥＭで、古い培地を交換した。１日目に、新鮮なウイルスを含有する上清を回収し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過し、その直後に使用してマウス赤血球系前駆細胞に感染させた。ＧＰＡおよびＫｅｌｌの発現：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍディッシュ上に播種し、製造業者（Ｍｉｒｕｓ）の推奨に従い、ＴｒａｎｓＩＴトランスフェクション試薬を使用して、レトロウイルスベクター中のＧｎ−ｍｙｃ−ｈ／ｍＧＰＡコンストラクト１５μｇまたはレトロウイルスベクター中のｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡ７．５μｇと３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ７．５μｇの両方（連続した２重ソルターゼ標識化用）の何れかでトランスフェクトした。細胞をタンパク質発現について分析し、細胞トランスフェクションの２４時間後にソルターゼ標識した。
（ｖｉ）マウスＥ１４．５胎仔肝細胞からの赤血球系前駆細胞の単離
二酸化炭素による麻酔後、１４．５日の妊娠Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを解剖して胎仔を単離した。胎仔肝臓全体を慎重に分離し、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１００ｕＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に入れた。粉砕して７０μｍフィルター（ＢＤ）を通して濾過した後、単一胎仔肝細胞懸濁液を得た。胎仔肝細胞懸濁液中の成熟赤血球は、塩化アンモニウム溶液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）との１０分間インキュベーション後、溶解した。１５００ＲＰＭで５分間遠心分離することにより有核細胞を回収し、ＰＢＳ中に再懸濁した。ＢＤ Ｂｉｏｔｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｐａｎｅｌ（５５９９７１）およびＢＤ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｐｌｕｓ ＤＭ（５５７８１２）を使用して、系統陰性胎仔肝細胞を精製したところ、これは、赤血球系前駆細胞について濃縮されていた（９０％超）。
（ｖｉｉｉ）マウス赤血球系前駆細胞のウイルス感染および培養
精製後、系統陰性胎仔肝細胞を１ｍｌ当たり１０００万個の細胞濃度に調製した。細胞１０μｌを、５ｕｇ／ｍｌポリブレンを含むウイルス含有上清１ｍｌと共に、２４ウェルプレートのそれぞれのウェルに播種した。プレートを３７℃で９０分間、２０００ＲＰＭで遠心した。スピン感染の直後に、ウイルス含有上清を吸引し、組換えマウス幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、Ｒ＆Ｄ）、組換えマウスＩＧＦ−１（４０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）、デキサメタゾン（１００ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）、およびエリスロポエチン（２ｕ／ｍｌ、Ａｍｇｅｎ）を添加した赤血球系維持培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ−ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））と交換した。翌朝、フローサイトメトリーによりＧＦＰ陽性細胞の集団を検査することにより、感染率を調べた。感染率は典型的には９５％超であった。次いで、細胞を、１５％ＦＢＳ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）、１％無毒化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）、５００μｇ／ｍＬホロ型トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５Ｕ／ｍＬ Ｅｐｏ（Ａｍｇｅｎ）、１０μｇ／ｍＬ組換えヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および１×Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する、Ｅｐｏのみの赤血球系分化培地（イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ））中で４８時間培養した。
（ｉｘ）フローサイトメトリー
ＦＡＣＳソーティングまたは分析のために、所望の細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１μｇ／ｍｌのＰＩ含有ＰＢＳ中に、５〜１０Ｍ／ｍｌの密度で再懸濁した。脱核分析において、最初に、抗マウスＴＥＲ−１１９抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１４〜５９２１）およびヘキスト（Ｓｉｇｍａ）により室温で１５分間、細胞を染色した。Ｍｙｃタグ、ＨＡタグの表面発現もしくは標識化、またはビオチン標識化を検出するために、抗Ｍｙｃ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、３７３９）、抗ＨＡ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＣ９８４３８８１）、または抗ビオチン抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２−９８９５−８２）でそれぞれ、室温で３０分間、細胞を染色した。
（ｘ）骨髄細胞のウイルス感染
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の大腿骨および脛骨中の骨髄を、２３Ｇ注射針を使用して単離し、１５％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＤＭＥＭ中で１８時間、２×１０６細胞／ｍｌの密度で６ウェルプレートにて培養した。レトロウイルス含有培地５００μｌ、ＤＭＥＭ５００μｌ、５μｇ／ｍｌポリブレン中で４×１０６個の細胞をインキュベートし、室温で１．５時間、２５００ＲＰＭで細胞を遠心し、さらにＣＯ２インキュベーター中で５時間細胞をインキュベートすることにより、細胞を感染させた。上記のＩＬ−３／ＳＣＦ／ＩＬ−６添加培地に細胞を戻して、さらに１６時間インキュベートした。
（ｘｉ）照射手順およびマウス胎仔肝臓移植
Ｂ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃａ Ｐｅｐ３ｂ／ＢｏｙＪマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）を、移植１日前に、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ ４０照射器チャンバー中で、１０５０ｃＧｙの全身照射に供した。マウス胎仔肝細胞を採取し、上記のように調製した。レトロウイルス感染後、細胞を赤血球系維持培地で１８時間培養した。あるいは、マウス骨髄細胞を採取し、上記のようにレトロウイルス形質導入した。次いで、感染細胞を滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、２〜５百万個の細胞／ｍＬで滅菌ＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、これらのマウス幹細胞および前駆細胞１００μｌを、致死的照射を受けたマウスに後眼窩注射した。４週目から開始して、分析およびソルタギングのために照射マウスから成熟赤血球を抜き取った。
（ｘｉｉ）サイトスピン調製および免疫蛍光法
成熟赤血球およびｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した網状赤血球をビオチンでソルタギングした後、冷１×ＰＢＳで２回洗浄した。５０，０００個のソートされたビオチン化成熟赤血球またはソートされていないｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した網状赤血球を、４００ｒｐｍで５分間、ポリ‐Ｌ‐リジンコーティングされたスライド上で遠心分離した（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ ３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈａｎｄｏｎ）。試料を風乾し、室温で３０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中２％ＢＳＡ＋２％ロバ血清）中で１時間ブロックした。次いで、細胞を、ブロッキング緩衝液中で、一次抗体：ＰＥコンジュゲート抗ビオチン（１：１０００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２−９８９５−８２）およびＡＰＣコンジュゲート抗Ｔｅｒ１１９（１：１００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１４−５９２１）と４℃で一晩インキュベートした後、冷１×ＰＢＳで３回洗浄した。最後に、すべての免疫染色実験において、ＤＡＰＩ（Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するマウンティング培地で細胞をマウントして、核を視覚化した。視覚化は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００レーザスキャン共焦点顕微鏡を使用して行った。
（ｘｉｉｉ）ｅＲＢＣの移入および生存
成熟ＲＢＣをソルタギングした後、１×ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＰＭＩ培地中に再懸濁した。これらのソルタギングされたＲＢＣを、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより回収し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中の５μＭ ＣＦＳＥを用いて、８分間標識した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。次いで、ＨＢＳＳ中の１０％ＦＢＳを等量加えて反応をクエンチした。ＲＢＣを洗浄し、カウントし、注射のために滅菌ＨＢＳＳ中に再懸濁した。次いで、２５億個のＣＦＳＥ標識化ＲＢＣ（±３００μｌマウス血液）を、レシピエントＣＤ４５．１＋マウスに静脈内注射した。正常ＲＢＣを対照として用いた。ＲＢＣの２０〜５０％のみが、操作されたｈＧＰＡまたはｈＫｅｌｌを発現したため、ＲＢＣの残りは正常なものであり、ＣＦＳＥシグナルをモニターすることにより内部標準として用いた。移入の１時間後に、最初の血液試料（２０μｌ）を後眼窩から採取し、０日目として標記した。その後同量の血液試料を１、４、および７日目等に、２８日目まで採取した。フローサイトメトリー分析中に、ビオチンを連結したｅＲＢＣが強力なＰＥシグナルを示すように、ＰＥがコンジュゲートした抗ビオチン抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で血液試料を染色した。しかしながら、ｈＫｅｌｌ−ビオチンを有するＲＢＣは、ＰＥがコンジュゲートした抗ビオチン抗体による染色後、極めて低い赤色蛍光強度しか示さなかった。ＣＦＳＥ由来の強力な緑色蛍光シグナルの存在下でその赤色蛍光を検出することは困難であった。ｈＫｅｌｌ−ＲＢＣをビオチンでソルタギングし、ＣＦＳＥ染色なしでマウスに移入した。ｈＫｅｌｌ−ＲＢＣを、その固有のＧＦＰシグナルおよびＰＥがコンジュゲートした抗ビオチン抗体からの弱いＰＥシグナルによりモニターした。対照ＲＢＣおよびｈＧＰＡ−ＲＢＣを、２回の別々の時に合計６匹のマウスに移入した。ｈＫｅｌｌ−ＲＢＣは合計３匹のマウスに移入し、理由は不明であるが一匹が死亡した。
結果
（Ｉ）遺伝子改変されたＩ型膜タンパク質ヒトグリコフォリンＡ（ＧＰＡ）は、ＲＢＣ表面上に発現され、ソルターゼ標識化された。
（ａ）ＲＢＣ上のソルタギング可能なヒトグリコフォリン（ｈＧＰＡ）の発現
融合タンパク質５Ｇｌｙ（配列番号３）−ｍｙｃ−ｈＧＹＰＡおよび３Ｇｌｙ−ｍｙｃ−ｈＧＹＰＡの発現カセットは、図１０に示すように、２つのレンチウイルスベクターＥＦ１およびＭＳＣＶ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）に挿入された。両方のベクターとも、レポート遺伝子としてＧＦＰを担持する。融合タンパク質を発現する、得られたレンチウイルスベクターは、分化Ｉの開始時にヒトＣＤ３４＋細胞に形質導入された。
図１１に、上記の実施例Ｉに記載のように、分化Ｉおよび分化ＩＩの終了時に得られたヒトＣＤ３４＋細胞および赤血球における融合タンパク質の発現を示す。ＥＦ１ベクターにより形質導入された赤血球の表面上の５Ｇｌｙ（配列番号３）−ｍｙｃ−ｈＧＹＰＡ融合タンパク質の発現は、少なくとも分化ＩＩの終了時に観察された。
同様の結果が、ＭＳＣＶ発現ベクターで形質導入された赤血球でも観察された。図１２に示すように、赤血球の表面上のＭＳＣＶ−５Ｇｌｙ（配列番号３）−ｍｙｃ−ｈＧＹＰＡの発現は、分化ＩＩＩの終了時に観察された。
５Ｇｌｙ（配列番号３）−ｍｙｃ−ｈＧＹＰＡおよび３Ｇｌｙ−ｍｙｃ−ｈＧＹＰＡ融合タンパク質を発現するためのレンチウイルスベクターはまた、Ｋ５６２細胞に形質導入され、両方の融合タンパク質の発現が、Ｋ５６２細胞の表面上で観察された。
要約すると、ソルタギング可能なｈＧＹＰＡの発現が、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロッティングにより、分化Ｉの終了時に細胞の５０〜７０％で検出された。ｈＧＹＰＡの発現は分化ＩＩＩの終了時まで一定のまま継続した。
（ｂ）ソルターゼの存在下で、赤血球表面に目的薬剤をコンジュゲートする
ｈＧＹＰＡをソルタギングするために、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の３００μＭソルターゼＡおよび５００μＭビオチン−ＬＰＲＴＧＧ（配列番号１１８）を、３７℃で３０分間、ソルターゼ緩衝液中でプレインキュベートした。次いで、ソルタギング可能なｈＧＹＰＡ（５Ｇｌｙ（配列番号３）−ｍｙｃ−ｈＧＹＰＡまたは３Ｇｌｙ−ｍｙｃ−ｈＧＹＰＡ）を発現する１００万個の赤血球を、ソルターゼ−基質混合物と３７℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３〜４回洗浄した後、フローサイトメトリーまたはウエスタンブロッティングにより、ビオチンコンジュゲーションを検出した。標識率は通常８０〜１００％である。
図１３に示すように、ウエスタンブロッティングの結果から、赤血球上の５Ｇｌｙ（配列番号３）−ｍｙｃ−ｈＧＹＰＡの発現およびｈＧＹＰＡへのビオチンのコンジュゲーションが示される。ＦＡＣＳ分析から、分化ＩＩＩの８日目に赤血球の表面にビオチンがコンジュゲートされていることが示された。図１４および１５。この結果から、成熟脱核赤血球の表面を、ソルターゼ触媒反応により修飾することができることが示される。
同様に、Ｋ５６２細胞上で発現されたソルタギング可能なｈＧＹＰＡも、ソルターゼの存在下でのビオチンによる修飾に成功した。
別の実験では、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）モチーフを含む、ＰＥがコンジュゲートしたペプチドを、３７℃で４５分間、ソルターゼＡと一緒にした。次いで、この混合物を、３Ｇｌｙ−ＧＹＰＡまたは５Ｇｌｙ（配列番号３）−ＧＹＰＡのソルタギング可能な表面タンパク質を発現する赤血球と３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ分析に供した。このようにして得られた結果から、ＰＥがコンジュゲートしたペプチドが、赤血球の表面上の３Ｇｌｙ−ＧＹＰＡおよび５Ｇｌｙ（配列番号３）−ＧＹＰＡの両方にコンジュゲートしたことが示される。
（ｃ）遺伝子改変されたｈＧＰＡは、ソルターゼ標識化されるように、マウスＲＢＣ上に発現された
グリシン残基による、ＧＰＡ（ＧＰＡ）のＮ末端の伸長は、ＧＰＡを適切なソルターゼ基質にするために必要とされる最小の修飾であった。修飾バージョンでは、Ｎ末端シグナル配列が保持され、その後にグリシン残基およびｍｙｃエピトープタグが続いた。シグナルペプチドの切断により、（Ｇｌｙ）ｎ−ｍｙｃタグ−ＧＰＡが得られることになる。修飾ＧＰＡを担持する細胞をスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡおよびＬＰＥＴＧ（配列番号４４）ベースのプローブとインキュベートすると、このプローブがＧＰＡのＮ末端にコンジュゲートする。
３個または５個のＮ末端グリシン残基（配列番号３）がそのＮ末端に伸長した生成物をコードする、ＧＰＡについての４つのレトロウイルスコンストラクトを、下記のＫｅｌｌの場合のように、マウスまたはヒトのＧＰＡおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの赤血球系分化系（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０３，Ｂｌｏｏｄ １０２（１２）：３９３８−３９４６）を使用して、ＧＰＡの発現およびソルターゼによる修飾を試験するために調製した。本発明者らが、その表面上に修飾ＧＰＡを発現する、正常数の脱核Ｔｅｒ１１９陽性赤芽球を得た、それぞれの場合と同様に、前駆細胞のレトロウイルス形質導入の際に、４つのＧＰＡコンストラクトは何れも、分化工程に影響を与えなかった（図１７および図１８Ａ、Ｂ）。
これらのＧＰＡコンストラクトは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてそれらが発現することによって、またそれに続くビオチン含有プローブによるソルタギングによって、ソルターゼ修飾可能なものと確認された（図１８Ｃ）。マウスコンストラクトの高レベルの発現は観察されたが、コードされた生成物のビオチン化は検出されなかった。これに対して、ヒト３Ｇ−ｍｙｃ−ＧＰＡ（３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ）は容易にソルタギングされ、その後の実験に使用された。赤血球系前駆細胞において３Ｇｍｙｃ−ｈＧＰＡを発現させると、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化の際、表面上に修飾ＧＰＡを有するものが、有核赤芽球で約３６％、また脱核網状赤血球で約６７％得られた。有核および脱核の両細胞上の修飾ＧＰＡはほぼすべて、フローサイトメトリー、免疫ブロッティング、および免疫蛍光法によりモニターすると、ビオチン含有プローブでソルタギングされていた（図１９）。
Ｋｅｌｌの場合のように（下記の説明を参照のこと）、マウス胎仔肝臓系統陰性細胞に３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡを発現するレトロウイルスベクターを感染させ、致死的照射を受けたマウスにそれらを移植した（図２０）。４週間後、これらの移植マウスは、修飾ＧＰＡを発現するＴｅｒ１１９陽性の円盤型成熟ＲＢＣを２０〜５０％含有し、これらのＲＢＣは、フローサイトメトリーにより判定すると、８５％＋／−５％の効率でビオチン含有プローブによりソルタギングすることができる（図１６Ｃ）。ビオチンによりソルタギングすると、３Ｇｍｙｃ−ｈＧＰＡのゲル移動度が減少するという観察は、反応効率の読み出しとして使用することができ、ＧＰＡの大部分がソルターゼにより修飾されていることを示す。免疫蛍光顕微鏡（図１６Ｅ）により、これらの修飾赤血球はすべて、実際に、それらの表面にコンジュゲートされたビオチンを有することが確認された。これらの結果から、ソルタギング可能なＧＰＡが成熟ＲＢＣの表面上に保持され、ソルターゼ触媒反応で効率的に標識されたことが示される。
（ｄ）ＩＩ型膜タンパク質Ｋｅｌｌは、ＲＢＣ表面上に発現され、ソルターゼ標識された
ルーチン的な組換え技術により、表面融合タンパク質ｈｓＣＤ７１−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡおよびｈｓＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡを生成するための発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。融合タンパク質を発現する安定な細胞株が確立された。２００μＭソルターゼ、０．５ｍＭまたは１ｍＭ ＧＧＧ−ビオチンと細胞をインキュベートし、ウエスタンブロッティング分析に供した。この結果から、ビオチンの融合タンパク質へのコンジュゲーションが成功したことが示される。
ソルターゼ認識モチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１）によるＫｅｌｌのＣ末端の伸長は、ソルターゼ修飾可能にするために必要とされる最小の修飾であった。ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）による伸長によりＣ末端が修飾されたヒトＫｅｌｌをコードするレトロウイルスコンストラクトを、本明細書に記載のように構築し、その後にヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグにより伸長させた。グリシンベースのプローブを使用して、本明細書に記載のように、このように修飾されたＫｅｌｌに対して行ったソルターゼ反応により、ＨＡタグが消失すると同時に、ＫｅｌｌのＣ末端上にプローブがコンジュゲートされた（図２１Ａ）。
Ｋｅｌｌの発現およびソルターゼによる修飾を試験するために、以前に記載されたｉｎ ｖｉｔｒｏの赤血球系分化系を使用した。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３。マウス胎仔肝臓由来前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの約４８時間培養により、約４回の最終細胞分裂およびヘモグロビン含有赤芽球の形成が可能になり、このうちの約３０〜５０％に脱核が起こり、網状赤血球が得られる。ｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡの発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化工程を阻害しなかった。有核赤芽球と脱核網状赤血球は両方ともそのほぼ半分が、細胞表面に修飾Ｋｅｌｌを示し、これらのうちの大きな割合が、フローサイトメトリー、免疫ブロッティング、および免疫蛍光法により示されるように、ビオチン含有プローブでソルタギングすることができた（図２２）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化により得られた網状赤血球は、残存する細胞小器官の排除を受けなければならないだけでなく、両凹円盤型の成熟ＲＢＣをもたらす膜再編成も行わなければならない。この成熟ステップが修飾Ｋｅｌｌの消失をもたらさないことを保証するために、マウス胎仔肝臓系統陰性細胞を、操作されたｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡを発現するレトロウイルスベクターで感染させ、致死的照射を受けたマウスに移植した（図２０）。４週間後に移植マウスから成熟赤血球を採取し、その表面上のソルターゼ修飾可能なＫｅｌｌの存在について分析した。これらのキメラマウス中の成熟ＲＢＣの約２０〜５０％が、その表面上にソルタギング可能なヒトＫｅｌｌを含有すること（図２１Ｂ）、およびこれらの細胞が、フローサイトメトリーにより判定すると、８１％＋／−２８％の効率で、ソルターゼを使用してビオチンで共有結合的に修飾することができること（図２１Ｃ）がルーチン的に見出された。免疫ブロット上でのＨＡの完全な消失によって証明されるように、ソルタギングによる、ＫｅｌｌのＣ末端へのビオチンプローブの高レベルのコンジュゲーションが観察された（図２１Ｄ）。免疫蛍光顕微鏡（図２１Ｅ）により、赤血球の表面にコンジュゲートされたビオチンの存在が確認される。これらのデータから、ソルターゼ認識モチーフでそのＣ末端が伸長したＫｅｌｌは、赤血球系分化を阻害せず、成熟赤血球の形質膜上に保持され、ソルタギング反応で標識化することができることが実証される。
（ｅ）ＲＢＣの２重標識化
別々の基質特異性を有するソルターゼを使用し、Ｎ末端標識化とＣ末端標識化の戦略を組み合わせて、多重標識化ＲＢＣを生成させることが可能である（Ａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ．Ａｍｅｒｉ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３１（３１）：１０８００−１０８０１）。スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡと異なり、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のソルターゼＡは、ＬＰＸＴＡ（配列番号２）モチーフを認識し、求核試薬としてオリゴアラニンプローブを受容する。したがって、両酵素のソルターゼ反応は、直交した反応として行なうことができる。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に２つのコンストラクト：ＡＡＡ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡおよびｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡを感染させた。ビオチン−ＬＰＥＴＡ（配列番号１１９；Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼによるＧＰＡソルタギング用）またはＧＧＧ−ＴＡＭＲＡ（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼによるＫｅｌｌソルタギング用）の何れかの存在下で、２つの異なるタイプのソルターゼＡと細胞を逐次的にインキュベートし、ビオチン化ＧＰＡとＴＡＭＲＡ修飾Ｋｅｌｌの両方を含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を生じさせる（図１６Ｆ）。さらに、３Ａ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡとｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡの両方が細胞表面に発現した成熟ＲＢＣを生成させた。個々のＲＢＣ上のｈＫｅｌｌおよびｈＧＰＡの発現レベルがいくぶん変動するという事実にもかかわらず、ＲＢＣ表面上で、ｈＧＰＡのビオチンによるソルタギングおよびｈＫｅｌｌのＡｌｅｘａ−６４７によるソルタギングが成功した（図２３）。したがって、２重標識化を使用して、ＲＢＣの表面上に２つの異なる機能成分を結合させることができる。
（ｆ）血液循環における、操作されたＲＢＣの生存
ソルターゼとのインキュベーション、遠心分離、および洗浄を含む、ＲＢＣをソルタギングする工程が、ＲＢＣのｉｎ ｖｉｖｏでの生存に影響を与えるか否かを評価するために、野生型ＲＢＣおよびソルターゼの存在下または非存在下（プローブのコンジュゲーションはない）で、模擬Ｃ末端ソルタギング反応を受けた野生型ＲＢＣを、生細胞のサイトゾルを安定的に染色する蛍光色素であるＣＦＳＥで標識化した。次いで、ＲＢＣを正常なレシピエントマウスに移入し、血液循環での細胞生存を、ＣＦＳＥ蛍光を使用して定期的に評価した。実験群間の差は、ＲＢＣのｉｎ ｖｉｖｏ生存では観察されず（図２４Ａ）、ソルタギング手順により、細胞が早発に除去されることになる顕著な損傷が細胞にもたらされないことが示された。
実施例３：細胞型特異的ターゲティングのための、操作された赤血球への抗体のコンジュゲーション
修飾ＲＢＣの有望な１つの用途は、特定の組織型または細胞型へのその送達を可能にするターゲティング成分（および結合したまたは組み込まれたペイロード）をそれに装着させることである。このようなターゲティングは、目的標的の特異的認識に関与することができる、特定の受容体のリガンドなど、タンパク質または他の実体の設置により行うことができる。
ＲＢＣの表面上への機能タンパク質のコンジュゲーションを試験するために、ソルタギング可能なアルパカ由来の単一ドメイン抗体を使用した。この抗体は、マウスＭＨＣクラスＩＩ分子、ＶＨＨ７−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）に特異的であり、その表面上に３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡを有する赤血球に共有結合させた。３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡのゲル移動度のシフトにより示されるように、ソルタギング反応は化学量論的である（図２５Ａ）。
Ｂ細胞−赤血球の結合アッセイを以下のように行った。製造業者の推奨に従い、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４３（Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＭＨＣクラスＩＩについてノックアウトされたマウスの何れかから、Ｂ細胞を単離した。１〜１．５個の脾臓に由来する細胞を、ビオチン標識化抗マウスＣＤ１９抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）５μｇと、氷上で３０分間インキュベートし、氷冷ＰＢＳ５００μｌで１回洗浄した。予め洗浄した磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙｏｎｅストレプトアビジンＴ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）７０μｌと共にＰＢＳ５００μｌ中に、細胞を再懸濁し、４℃で１時間、回転プラットフォーム上でインキュベートし、氷冷ＰＢＳ５００μｌで洗浄した。再懸濁した細胞（ＰＢＳ５００μｌ）を、３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡを発現し、ソルターゼ標識化された約２×１０７個の赤血球と４℃で１時間さらにインキュベートし、氷冷ＰＢＳ１ｍｌで４回洗浄し、最後にＳＤＳ試料緩衝液とインキュベートして、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために煮沸した。
ビーズ上に固定されたＭＨＣクラスＩＩ陽性Ｂ細胞とこれらの修飾ＲＢＣのインキュベーションにより、ＲＢＣのＢ細胞への結合が生じる。洗浄後にＢ細胞と共精製するヘモグロビンの存在から、特異的結合が推定された。未修飾赤血球と野生型Ｂ細胞のインキュベーションも、修飾赤血球とＭＨＣクラスＩＩノックアウト動物由来のＢ細胞のインキュベーションも２つの細胞型の結合をもたらさなかった（図２５Ｂ、Ｃ）。
実施例４：最終分化したヒト赤血球のソルタギングおよびサイトゾル修飾
本明細書に記載の方法の有用性を拡張するために、赤血球系前駆細胞の修飾およびその後のソルターゼ媒介細胞表面標識化がヒト細胞についても実行可能であるか否かを検討した。
最終分化したヒト赤血球を以下のように遺伝子操作した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したヒトＲＢＣを操作するために使用するプラスミドは、ＧＧＧ含有ヒトＧＰＡを、３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ−ＥＧＦＰを作製するためにそのＣ末端に改良型ＧＦＰを付加したＨＩＶ／ＭＳＣＶレンチウイルスベクターにクローニングすることにより作製した。レンチウイルスは、ｐＶＳＶ−ＧエンベローププラスミドおよびｐＤｅｌｔａ ８．９パッケージングベクターによる２９３Ｔ細胞の共感染により生成した。以前に記載の方法（Ｚａｉｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｌｏｏｄ １１５（２５）：５２４１−５２４８）を使用して、Ｇ−ＣＳＦ（果粒球コロニー刺激因子）動員のＣＤ３４＋末梢血幹細胞を、１８日の間にヘモグロビン含有網状赤血球にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させた。培養３日目に、ポリブレンの存在下、レンチウイルス含有培地２ｍｌ中で５×１０５個の細胞をインキュベートすることにより、分化中の細胞を感染させ、室温で１．５時間、２５００ＲＰＭで遠心した後、ＣＯ２インキュベーター中で一晩、さらにインキュベートした。次の日、感染細胞を２回洗浄し、新鮮な分化培地に入れた。１８日目に、脱核網状赤血球を回収し、本明細書に記載のようにビオチン含有プローブによるソルターゼ標識化に供した。得られた操作ヒト網状赤血球のデータ分析は、以下の抗体：ＰＥがコンジュゲートした抗ビオチン（１：１０００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２−９８９５−８２）、ヘキスト（Ｓｉｇｍａ）、およびＡＰＣコンジュゲート（１：１００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１７−００８７−４２）を使用して、フローサイトメトリーにより行った。
この実施例に記載の実験は、以前に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏヒト赤血球系分化系である。例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照されたい。Ｇ−ＣＳＦ（果粒球コロニー刺激因子）動員のＣＤ３４＋末梢血幹細胞を、約５０％の脱核効率で、１８日の間にヘモグロビン含有網状赤血球にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させた。そのＣ末端で改良型ＧＦＰに融合した３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡのバージョン（３Ｇ−ｍｙｃ−ＧＰＡ−ＧＦＰ）をコードするレンチウイルスベクターを構築した。これは、ＧＰＡへのその遺伝子融合を介して成熟ＲＢＣ中に保持されるように設計された、細胞質内で発現されるタンパク質ドメインの例を提供する。空（対照）ベクターと３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ−ＧＦＰベクターは両方とも、ＩＲＥＳ配列の３’側にＧＦＰ成分をコードした（３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）。ＧＰＡの細胞質ドメインに結合した追加の改良型ＧＦＰを含有する３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ−ＧＦＰの細胞への形質導入が成功した場合、これらの細胞は、フローサイトメトリーにより示されように（図２６Ａ、最初のパネル）、顕著に高レベル（約２倍）のＧＦＰシグナルを発現することになる。ＧＦＰおよびｈＧＰＡの分子量がそれぞれ、３２．７ｋＤａおよび３７ｋＤａであるため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ−ＧＦＰの移動度からも、修飾ＧＰＡタンパク質が単量体および二量体の形態で発現されることが示される（図２６Ｂ）。３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ−ＧＦＰによるヒトＣＤ３４＋細胞のウイルス形質導入は、空（対照）ベクターに感染した培養物と同様の数の脱核網状赤血球（５０〜６０％）が形成されたため（図２６Ａ、中央のパネル）、ヒトＣＤ３４＋細胞の分化には影響を与えなかった。
フローサイトメトリーによりモニターされるように、表面に修飾ＧＰＡを含有する脱核網状赤血球はすべて、ビオチン含有プローブでソルターゼ標識化することができた（図２６Ａ）。さらに、３Ｇ−ｍｙｃｈＧＰＡ−ＧＦＰのゲル移動度のシフトにより証明されるように、網状赤血球表面上に存在する３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ−ＧＦＰはすべて、ビオチンソルタギングにより修飾された（図２６Ｂ）。したがって、この実験により、目的のターゲティング成分による修飾ＧＰＡのソルタギングにより、目的とする標的にＲＢＣを選択的にターゲティングする能力を保持させながら、細胞質内に配置された目的タンパク質を成熟ヒトＲＢＣに備えさせる技術が確立された。
実施例５：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用する、ｍＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）マウスの作製
相同組換え修復（ＨＤＲ）を刺激するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９依存性二本鎖切断のためのｓｇＲＮＡ配列を、表５のように、ｍＫｅｌ遺伝子座の最後のエキソン上に設計し、ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）をｍＫｅｌのＣ末端に導入するための鋳型としてオリゴＤＮＡを表６のように設計した。
Figure 2016519933
Figure 2016519933
標的配列の潜在的なオフターゲット効果を、ＮＣＢＩマウスヌクレオチドＢＬＡＳＴを使用して検索した。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３に記載のように、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを調製した。下記の表７に示すように、鋳型としてｐＸ３３０ベクター、そしてプライマー、ｍＫｅｌ Ｔ７−ｓｇＲＮＡ ＦｗおよびｓｇＲＮＡの一般的なＲｖを使用するＰＣＲ増幅によって、Ｔ７プロモーターおよびＰＡＭモチーフのないｍＫｅｌ−ＣＴターゲティングｓｇＲＮＡコード配列を、ｓｇＲＮＡの一般的な尾部（ヘアピン領域から末端モチーフまでの部分）の直前に加えた。
Figure 2016519933
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）のためのＴ７−ｓｇＲＮＡ鋳型ＰＣＲ産物を、カラム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりゲル精製し、精製したＰＣＲ産物を、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＩＶＴのための鋳型として使用した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡの両方を、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製し、ＲＮアーゼ不含水で溶出した。受精接合体を、過剰排卵した雌の卵管から集め、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、および鋳型オリゴＤＮＡを、前核段階の細胞質に注入した。注入された接合体を、偽妊娠した雌の卵管の中に２細胞段階で移入した。マウスの遺伝子型を同定するために：マウス尾部を、尾部溶解緩衝液を使用して５５℃で１２時間溶解し、溶解物からイソプロパノール沈殿によりゲノムＤＮＡを精製した。ｓｇＲＮＡ標的近傍のゲノムＤＮＡを、プライマーであるｍＫｅｌシークエンシング用ＦｗおよびｍＫｅｌシークエンシング用Ｒｖを使用して、表３のように［ＫＯＤ Ｘｔｒｅｍｅ（ＶＷＲ）、条件：９５℃で２分間；３５×（９８℃で１０秒間、５０℃で３０秒間、６８℃で３０秒間）；６８℃で２分間；４℃に保持］、ＰＣＲにより増幅し、次いでゲル精製した。精製したＰＣＲ産物を同じＦｗプライマーを使用してシークエンシングした。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−９ゲノム編集技術（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６−８２１；およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ １５３（４）：９１０−９１８）を使用して構築されたトランスジェニックマウスを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでのＲＢＣ生存を検討した。このようなトランスジェニックマウスは、マウス内因性Ｋｅｌｌ遺伝子のＣ末端に挿入されたＬＰＥＴＧ（配列番号４４）を含有する（ｍＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ；配列番号４４）。これらのマウスは正常に見え、かつ正常に繁殖する。これらのマウスに由来するｍＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）ＲＢＣは、ｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）−ＨＡ ＲＢＣと同様に効率的に、ソルターゼ媒介反応でプローブにより標識することができる。
対照ＲＢＣ、ｍＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）ＲＢＣ、およびビオチンでソルタギングされたｍＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）ＲＢＣに対してＣＦＳＥ染色を行い、それらを野生型レシピエントマウスに移入し、血液循環におけるそれらの生存をモニターした。そのＣ末端でのＬＰＥＴＧ（配列番号４４）によるｍＫｅｌｌの修飾は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける修飾ＲＢＣの生存に影響を与えなかった（図２４Ｂ）。ビオチンプローブでソルタギングされたｍＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）ＲＢＣの生存では、わずかであるが有意な差が観察された。ｈＫｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）ＲＢＣも移植マウスから採取し、ビオチンでソルタギングし、レシピエントに移入した。同様に、野生型ＲＢＣに比較するとわずかに生存が低下するものの、操作されたビオチン標識化Ｋｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）ＲＢＣも２８日を超えて血液循環中に存続する（図２４Ｃ）。これらの結果から、正常ＲＢＣのｉｎ ｖｉｖｏ生存をソルターゼ標識化ビオチン−３Ｇ−ｍｙｃ−ｈＧＰＡ ＲＢＣに比較する同様の実験が示唆される。その結果（図２４Ｄ）は、Ｋｅｌｌ−ＬＰＥＴＧ（配列番号４４）ＲＢＣで見られた傾向を反復したものであり；ソルタギングされたＲＢＣについて、わずかではあるが有意な生存率の低下があった。それにもかかわらず、重要なことには、正常マウスにおける操作されたＲＢＣの半減期は、ビオチンでコンジュゲートされたものも含めて、少なくとも２８日であり、したがって、これまでに設計された他のＲＢＣベースの担体よりも大幅に長い。
他の実施形態
本明細書に開示の特徴はすべて、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示の特徴はそれぞれ、同一、均等、または同様の目的に役立つ別の特徴に置き換えることができる。したがって、明示的に他に記載がない限り、開示されるそれぞれの特徴は、一般的な一連の均等または同様の特徴の一例にすぎない。
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的特性を容易に確認することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の使用および条件に本発明を適応させるために、本発明の種々の変更形態および修正形態をなすことができる。したがって、他の実施形態もまた特許請求の範囲内にある。

Claims (92)

  1. 第１の目的ペプチドと第１の赤血球膜タンパク質とを含む第１の融合タンパク質を表面上に発現することを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  2. 請求項１に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の赤血球膜タンパク質がＩ型赤血球膜貫通型タンパク質であり、かつ前記第１の目的ペプチドが前記Ｉ型赤血球膜貫通型タンパク質のＮ末端に融合されていることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  3. 請求項２に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記Ｉ型赤血球膜貫通型タンパク質がグリコフォリンＡ（ＧＰＡ）であることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  4. 請求項１に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の赤血球膜タンパク質がＩＩ型膜貫通型タンパク質であり、かつ前記第１の目的ペプチドが前記ＩＩ型膜貫通型タンパク質のＣ末端に融合されていることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  5. 請求項４に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の目的ペプチドが第１のソルターゼにより認識可能な第１の配列を含むことを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  6. 請求項５に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１のソルターゼが第１のソルターゼＡであることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  7. 請求項６に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１のソルターゼにより認識可能な前記配列が、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）であることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  8. 請求項４乃至７の何れか１項に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記ＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質がＫｅｌｌまたはＣＤ７１であることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  9. 請求項１に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の赤血球膜タンパク質がＩＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質であることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  10. 請求項９に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記ＩＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質がＧＬＵＴ１であることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  11. 請求項１乃至１０の何れか１項に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記目的ペプチドが、タンパク質性薬物、ワクチン抗原、蛍光タンパク質、ストレプトアビジン、ビオチン、酵素、または細胞をターゲティングすることができるペプチドを含むことを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  12. 請求項１１に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の目的ペプチドが、疾患細胞をターゲティングすることができるペプチドであることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  13. 請求項１２に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の目的ペプチドが抗体またはそのフラグメントであることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  14. 請求項１３に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記抗体が単一ドメイン抗体であることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  15. 請求項１乃至１４の何れか１項に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の目的ペプチドが検出可能な標識または化学療法剤にコンジュゲートされていることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  16. 請求項１乃至Ｂ１４の何れか１項に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の目的ペプチドが、脂質、炭水化物、核酸、結合剤、クリックケミストリーハンドル、または小分子にコンジュゲートされていることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  17. 請求項１乃至１６の何れか１項に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の融合タンパク質が目的タンパク質をさらに含み、前記目的タンパク質が、細胞質空間に露出される、前記第１の赤血球膜タンパク質の末端に融合されており、かつ前記第１の目的ペプチドが、細胞外空間または管腔空間に露出される、前記第１の赤血球膜タンパク質の末端に融合されていることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  18. 請求項１７に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の赤血球膜タンパク質がＩ型膜タンパク質であり、前記目的タンパク質が前記Ｉ型膜タンパク質のＣ末端に融合されており、かつ前記第１の目的ペプチドが前記Ｉ型膜タンパク質のＮ末端に融合されていることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  19. 請求項１７に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の赤血球膜タンパク質がＩＩ型膜タンパク質であり、前記目的タンパク質が前記ＩＩ型膜タンパク質のＮ末端に融合されており、かつ前記第１の目的ペプチドがＩ型膜タンパク質のＣ末端に融合されていることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  20. 請求項１７乃至１９の何れか１項に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記目的タンパク質が細胞質タンパク質であることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  21. 請求項２０に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記目的タンパク質が診断薬または治療薬であることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  22. 請求項２０または２１に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の目的ペプチドが、タンパク質性薬物、ワクチン抗原、蛍光タンパク質、ストレプトアビジン、ビオチン、酵素、または細胞をターゲティングすることができるペプチドであることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  23. 請求項２２に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の目的ペプチドが疾患細胞をターゲティングすることができるペプチドであることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  24. 請求項１乃至２３の何れか１項に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、第２の目的ペプチドと第２の赤血球膜タンパク質とを含む第２の融合タンパク質を表面上にさらに発現することを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  25. 請求項２４に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の融合タンパク質中の前記第１の目的ペプチドが、第１のソルターゼの認識可能部位または受容可能ペプチドを含み、かつ前記第２の融合タンパク質中の前記第２の目的ペプチドが、第２のソルターゼの認識可能部位または受容可能ペプチドを含み、前記第１のソルターゼおよび前記第２のソルターゼが、異なる認識可能部位および異なる受容可能ペプチドを使用することを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  26. 請求項２５に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の目的ペプチドが、ＬＰＸＴＡのモチーフ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）またはオリゴアラニンを含み；かつ前記第２の目的ペプチドが、モチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１）またはオリゴグリシンを含むことを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  27. 請求項２４に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の融合タンパク質がＫｅｌｌを含み、そのＣ末端がモチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１）を含む第１の目的ペプチドに融合されており、かつ前記第２の融合タンパク質がＧＰＡを含み、そのＣ末端がオリゴアラニンを含む第２の目的ペプチドに融合されていることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  28. 請求項２４乃至２７の何れか１項に記載の遺伝子操作された脱核血液細胞において、前記第１の融合タンパク質および前記第２の融合タンパク質が２つの異なる機能成分にコンジュゲートされていることを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
  29. 被験体に薬剤を送達するための方法において、請求項１１乃至２８の何れか１項に記載の脱核血液細胞を、それを必要とする被験体に投与することを含むことを特徴とする方法。
  30. 請求項２９に記載の方法において、前記脱核血液細胞が同じ被験体に由来することを特徴とする方法。
  31. 目的ペプチドを赤血球の表面にコンジュゲートするための方法において、
    第１の赤血球膜タンパク質と第１のペプチドとを含む第１の融合タンパク質を発現する赤血球を準備するステップと、
    第１のソルターゼの存在下で前記赤血球を第１の目的ペプチドと、前記ソルターゼが前記目的ペプチドを前記融合タンパク質中の前記第１のペプチドにコンジュゲートさせるのに適した条件下で接触させるステップと
    を含み、前記融合タンパク質中の前記第１のペプチドまたは前記第１の目的ペプチドの何れかが前記第１のソルターゼにより認識可能な配列を含むことを特徴とする方法。
  32. 請求項３１に記載の方法において、前記ソルターゼがソルターゼＡであることを特徴とする方法。
  33. 請求項３１または３２に記載の方法において、前記ソルターゼにより認識可能な前記配列が、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）であることを特徴とする方法。
  34. 請求項３１乃至３３の何れか１項に記載の方法において、前記第１の赤血球膜タンパク質がＩ型赤血球膜貫通型タンパク質であり、かつ前記第１のペプチドが前記Ｉ型赤血球膜貫通型タンパク質のＮ末端に融合したアクセプターペプチドであり、前記第１の目的ペプチドが前記ソルターゼにより認識可能な前記配列を含むことを特徴とする方法。
  35. 請求項３４に記載の方法において、前記Ｉ型赤血球膜貫通型タンパク質がグリコフォリンＡ（ＧＰＡ）であることを特徴とする方法。
  36. 請求項３４または３５に記載の方法において、前記アクセプターペプチドがオリゴグリシンであることを特徴とする方法。
  37. 請求項３６に記載の方法において、前記アクセプターペプチドが１〜５個のグリシン残基からなるオリゴグリシンであることを特徴とする方法。
  38. 請求項３１乃至３３の何れか１項に記載の方法において、前記第１の赤血球膜タンパク質がＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質であり、かつ前記第１のペプチドが前記ＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質のＣ末端に融合されており、前記第１のペプチドが前記ソルターゼにより認識可能な前記配列を含むことを特徴とする方法。
  39. 請求項３８に記載の方法において、前記ＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質がＫｅｌｌまたはＣＤ７１であることを特徴とする方法。
  40. 請求項３１乃至３３の何れか１項に記載の方法において、前記第１の赤血球膜タンパク質がＩＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質であることを特徴とする方法。
  41. 請求項４０に記載の方法において、前記ＩＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質がＧＬＵＴ１であることを特徴とする方法。
  42. 請求項３１乃至４１の何れか１項に記載の方法において、前記第１の目的ペプチドが、タンパク質性薬物、ワクチン抗原、蛍光タンパク質、ストレプトアビジン、ビオチン、酵素、または細胞をターゲティングすることができるペプチドを含むことを特徴とする方法。
  43. 請求項４２に記載の方法において、前記第１の目的ペプチドが、疾患細胞をターゲティングすることができるペプチドであることを特徴とする方法。
  44. 請求項４２に記載の方法において、前記第１の目的ペプチドが抗体またはそのフラグメントであることを特徴とする方法。
  45. 請求項４４に記載の方法において、前記抗体が単一ドメイン抗体であることを特徴とする方法。
  46. 請求項３１乃至４５の何れか１項に記載の方法において、前記第１の目的ペプチドが検出可能な標識または化学療法剤にコンジュゲートされていることを特徴とする方法。
  47. 請求項３１乃至４５の何れか１項に記載の方法において、前記第１の目的ペプチドが、脂質、炭水化物、核酸、結合剤、クリックケミストリーハンドル、または小分子にコンジュゲートされていることを特徴とする方法。
  48. 請求項３１乃至４７の何れか１項に記載の方法において、前記第１の融合タンパク質が目的タンパク質をさらに含み、前記目的タンパク質が、細胞質空間に露出される、前記第１の赤血球膜タンパク質の末端に融合されており、かつ前記第１の目的ペプチドが、細胞外空間または管腔空間に露出される、前記第１の赤血球膜タンパク質の末端に融合されていることを特徴とする方法。
  49. 請求項４８に記載の方法において、前記第１の赤血球膜タンパク質がＩ型膜タンパク質であり、前記第１の目的タンパク質が前記Ｉ型膜タンパク質のＣ末端に融合されており、かつ前記第１のペプチドが前記Ｉ型膜タンパク質のＮ末端に融合されていることを特徴とする方法。
  50. 請求項４８に記載の方法において、前記第１の赤血球膜タンパク質がＩＩ型膜タンパク質であり、前記目的タンパク質が前記ＩＩ型膜タンパク質のＮ末端に融合されており、かつ前記第１のペプチドがＩ型膜タンパク質のＣ末端に融合されていることを特徴とする方法。
  51. 請求項４８乃至５０の何れか１項に記載の方法において、前記目的タンパク質が細胞質タンパク質であることを特徴とする方法。
  52. 請求項５１に記載の方法において、前記目的タンパク質が診断薬または治療薬であることを特徴とする方法。
  53. 請求項５１または５２に記載の方法において、前記第１の目的ペプチドが、タンパク質性薬物、ワクチン抗原、蛍光タンパク質、ストレプトアビジン、ビオチン、酵素、または細胞をターゲティングすることができるペプチドであることを特徴とする方法。
  54. 請求項５３に記載の方法において、前記第１の目的ペプチドが、疾患細胞をターゲティングすることができるペプチドであることを特徴とする方法。
  55. 請求項３１乃至５４の何れか１項に記載の方法において、第２のソルターゼの存在下、前記第２のソルターゼが第２の目的ペプチドを赤血球の表面上に発現される第２の融合タンパク質にコンジュゲートさせるのに適した条件下で前記赤血球を接触させるステップであって、前記第２の融合タンパク質が第２の赤血球膜タンパク質と前記第２の目的ペプチドがコンジュゲートする第２のペプチドとを含むステップをさらに含み、
    前記融合タンパク質中の前記第２のペプチドまたは前記第２の目的ペプチドの何れかが前記第２のソルターゼにより認識可能な配列を含み、かつ
    前記第１のソルターゼにより認識可能な前記配列が、前記第２のソルターゼにより認識可能な前記配列とは異なることを特徴とする方法。
  56. 請求項５５に記載の方法において、前記第１の融合タンパク質中の前記第１のペプチドが、前記第１のソルターゼにより認識可能な配列または前記第１のソルターゼの受容可能ペプチドを含み、かつ前記第２の融合タンパク質中の前記第２のペプチドが、前記第２のソルターゼにより認識可能な配列または前記第２のソルターゼの受容可能ペプチドを含み、前記第１のソルターゼの前記受容可能ペプチドが、前記第２のソルターゼの前記受容可能ペプチドとは異なることを特徴とする方法。
  57. 請求項５６に記載の方法において、前記第１のソルターゼがスタフィロコッカス・アレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｒｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡであり、前記第１の融合タンパク質中の前記第１のペプチドおよび前記第１の目的ペプチドのうちの一方が、モチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含み、かつ他方が、オリゴグリシンである受容可能ペプチドを含むことを特徴とする方法。
  58. 請求項５７に記載の方法において、前記第１の融合タンパク質がＫｅｌｌを含み、そのＣ末端がモチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１）を含む前記第１のペプチドに融合されており、かつ前記第１の目的ペプチドがオリゴグリシンを含むことを特徴とする方法。
  59. 請求項５７または５８に記載の方法において、前記第２のソルターゼがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のソルターゼＡであり、前記第２の融合タンパク質中の前記第２のペプチドおよび前記第２の目的ペプチドのうちの一方が、モチーフＬＰＸＴＡ（配列番号２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含み、かつ他方が、オリゴアラニンである受容可能ペプチドを含むことを特徴とする方法。
  60. 請求項５９に記載の方法において、前記第２の融合タンパク質がＧＰＡを含み、そのＮ末端がオリゴグリシンを含む前記第２のペプチドに融合されており、かつ前記第２の目的ペプチドが、モチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含むことを特徴とする方法。
  61. 請求項５５乃至６０の何れか１項に記載の方法において、前記第１および第２の目的ペプチドが、２つの異なる機能成分を含むかまたはそれにコンジュゲートされていることを特徴とする方法。
  62. ヒト脱核赤血球を生成させるための方法において、
    （ｉ）ヒトＣＤ３４＋前駆細胞の集団を準備するステップと、
    （ｉｉ）前記ヒトＣＤ３４＋前駆細胞の集団を０〜６日間、第１の培地中で拡大させるステップであって、前記第１の培地がＦｌｔ−３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、およびインターロイキン６（ＩＬ−６）を含むステップと、
    （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）から得られる拡大したヒトＣＤ３４＋末梢血液細胞を４〜７日間、第２の培地中で分化させるステップであって、前記第２の培地がデキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦ、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含むステップと、
    （ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）から得られる細胞を３〜５日間、第３の培地中で分化させるステップであって、前記第３の培地がＳＣＦおよびＥＰＯを含むステップと、
    （ｖ）ステップ（ｉｖ）から得られる細胞を４〜１２日間、第４の培地中で分化させてヒト脱核赤血球を生成させるステップであって、前記第４の培地がＥＰＯを含むステップと、
    （ｖｉ）ステップ（ｖ）から得られる前記ヒト脱核赤血球を収集するステップと
    を含むことを特徴とする方法。
  63. 請求項６２に記載の方法において、ステップ（ｉｉ）では、ヒトＣＤ３４＋末梢血液細胞の集団が前記第１の培地中で４日間培養されることを特徴とする方法。
  64. 請求項６２または６３に記載の方法において、ステップ（ｉｉｉ）では、前記拡大したヒトＣＤ３４＋前駆細胞が、前記第２の培地中で５日間分化させられることを特徴とする方法。
  65. 請求項６２乃至６４の何れか１項に記載の方法において、ステップ（ｉｖ）では、前記細胞が前記第３の培地中で４日間分化させられることを特徴とする方法。
  66. 請求項６２乃至６５の何れか１項に記載の方法において、ステップ（ｖ）では、前記細胞が前記第４の培地中で９日間分化させられることを特徴とする方法。
  67. 請求項６２乃至６６の何れか１項に記載の方法において、ステップ（ｉｉ）〜（ｖ）の合計期間が１１〜２５日間の範囲であることを特徴とする方法。
  68. 請求項６７に記載の方法において、ステップ（ｉｉ）〜（ｖ）の合計期間が２１日間であることを特徴とする方法。
  69. 請求項６２乃至６８の何れか１項に記載の方法において、ステップ（ｖ）が、細胞外マトリックス成分の表面コーティングを有する培養容器中で行なわれることを特徴とする方法。
  70. 請求項６２乃至６９の何れか１項に記載の方法において、前記第２、第３、および第４の培地の１つまたは複数が、ホロ型ヒトトランスフェリンおよびインスリンをさらに含むことを特徴とする方法。
  71. 請求項７０に記載の方法において、前記第２の培地が、２５０〜１５００μｇ／ｍｌのホロ型ヒトトランスフェリン、５〜２０μｇ／ｍｌのインスリン、１００ｎＭ〜５μＭのデキサメタゾン、０．１〜５μＭのβ−エストラジオール、１〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０〜５００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、および２〜１０ＵのＥＰＯを含むことを特徴とする方法。
  72. 請求項７１に記載の方法において、前記第２の培地が、約５００μｇ／ｍｌのホロ型ヒトトランスフェリン、約１０μｇ／ｍｌのインスリン、約２μＭのデキサメタゾン、約１μＭのβ−エストラジオール、約５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、約１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、および約６ＵのＥＰＯを含むことを特徴とする方法。
  73. 請求項７０乃至７２の何れか１項に記載の方法において、前記第２の培地が、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−６、またはその両方を含まないことを特徴とする方法。
  74. 請求項７０乃至７３の何れか１項に記載の方法において、前記第３の培地が、２５０〜１５００μｇ／ｍｌのホロ型ヒトトランスフェリン、５〜２０μｇ／ｍｌのインスリン、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、および２〜１０ＵのＥＰＯを含むことを特徴とする方法。
  75. 請求項７４に記載の方法において、前記第３の培地が、約５００μｇ／ｍｌのホロ型ヒトトランスフェリン、約１０μｇ／ｍｌのインスリン、約５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、および約６ＵのＥＰＯを含むことを特徴とする方法。
  76. 請求項７０、７４、または７５の何れか１項に記載の方法において、前記第３の培地が、Ｆｌｔ−３リガング、ＩＬ−６、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、またはそれらの組合せを含まないことを特徴とする方法。
  77. 請求項７０乃至７６の何れか１項に記載の方法において、前記第４の培地が、２５０〜１５００μｇ／ｍｌのホロ型ヒトトランスフェリン、５〜２０μｇ／ｍｌのインスリン、および０．５〜３ＵのＥＰＯを含むことを特徴とする方法。
  78. 請求項７７に記載の方法において、前記第４の培地が、約５００μｇ／ｍｌのホロ型ヒトトランスフェリン、約１０μｇ／ｍｌのインスリン、および約２ＵのＥＰＯを含むことを特徴とする方法。
  79. 請求項７０、７７、または７８の何れか１項に記載の方法において、前記第４の培地が、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−６、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦ、またはそれらの組合せを含まないことを特徴とする方法。
  80. 請求項６２乃至７９の何れか１項に記載の方法において、前記ヒトＣＤ３４＋前駆細胞が、赤血球膜タンパク質と目的ペプチドとを含む融合タンパク質を発現することを特徴とする方法。
  81. 請求項８０に記載の方法において、前記融合タンパク質が、Ｉ型赤血球膜貫通型タンパク質であって、前記Ｉ型赤血球膜貫通型タンパク質のＮ末端でアクセプターペプチドに融合したＩ型赤血球膜貫通型タンパク質を含むことを特徴とする方法。
  82. 請求項８１に記載の方法において、前記Ｉ型赤血球膜貫通型タンパク質がグリコフォリンＡであることを特徴とする方法。
  83. 請求項８１または８２に記載の方法において、前記アクセプターペプチドがオリゴグリシンであることを特徴とする方法。
  84. 請求項８３に記載の方法において、前記アクセプターペプチドが１〜５個のグリシン残基からなるオリオゴグリシンであることを特徴とする方法。
  85. 請求項８０に記載の方法において、前記融合タンパク質が、ＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質であって、前記ＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質のＣ末端でソルターゼにより認識可能な配列を含むペプチドに融合されたＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質を含むことを特徴とする方法。
  86. 請求項８５に記載の方法において、前記ソルターゼがソルターゼＡであることを特徴とする方法。
  87. 請求項８６に記載の方法において、前記ソルターゼＡにより認識可能な前記配列が、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）であることを特徴とする方法。
  88. 請求項８５乃至８７の何れか１項に記載の方法において、前記ＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質がＫｅｌｌまたはＣＤ７１であることを特徴とする方法。
  89. 請求項８０に記載の方法において、前記膜タンパク質がＩＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質であることを特徴とする方法。
  90. 請求項８９に記載の方法において、前記ＩＩＩ型赤血球膜貫通型タンパク質がグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）であることを特徴とする方法。
  91. 請求項６２乃至９０の何れか１項に記載の方法において、前記ヒトＣＤ３４＋前駆細胞がヒトＣＤ３４＋末梢血液細胞であることを特徴とする方法。
  92. 請求項６２乃至９１に記載の方法の何れかにより調製されることを特徴とするヒト脱核血液細胞集団。
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