CN113811363A - 用于HvG病的治疗的CAR - Google Patents

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Abstract

本发明提供了优化的且非常有力的嵌合抗原受体，其用于在已接受移植物的患者中治疗HvG病，用于抑制宿主针对移植物的免疫反应中。融合蛋白被修改以适用于在受体患者中抑制含有或表达HLA‑A*02的移植物的免疫排斥，其中受体患者对HLA‑A*02呈阴性，即移植前患者不表达HLA‑A*02。融合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)，其在调节性T细胞(Treg)中表达后在HLA‑A*02的存在下引起调节性T细胞的特异性抑制物活性。

Description

用于HvG病的治疗的CAR
本发明涉及融合蛋白，其为CAR，用于在已接受移植物的患者中治疗HvG病，用于抑制宿主针对移植物的免疫反应中。融合蛋白被调整以适用于在受体患者中抑制含有或表达I类MHC分子(其为人HLA-A*02)的移植物的免疫排斥中，其中受体患者对HLA-A*02呈阴性，即移植前患者不表达HLA-A*02。融合蛋白是嵌合抗原受体(CAR-A*02)，其在调节性T细胞(Treg)中表达后在HLA-A*02的存在下引起调节性T细胞的特异性抑制物活性。本发明的CAR-A*02的优势在于抑制物活性限于移植物并且导致移植物内细胞毒性T细胞的抑制，所述细胞毒性T细胞包括针对表达HLA-A*02的移植物的细胞毒性T细胞。移植物是例如实体组织、单个细胞或实体组织的一部分、或有核血细胞。
融合蛋白包含单链可变片段抗体结构域(scFv)、修饰的hCD8铰链，hCD8跨膜结构域、细胞内hCD28信号传导结构域和细胞内hCD3ζ(hCD3zeta)信号传导结构域，或由单链可变片段抗体结构域(scFv)、修饰的hCD8铰链，hCD8跨膜结构域、细胞内hCD28信号传导结构域和细胞内hCD3ζ(hCD3 zeta)信号传导结构域组成，其优选地从N末端到C末端相互连接，更优选地从N末端到C末端直接相互连接。
融合蛋白可以含有替代修饰的hCD8铰链的hΔFc IgG结构域、和/或替代hCD8跨膜结构域的融合hCD28跨膜结构域-hCD28/CD3 zeta结构域、细胞内hCD28信号传导结构域、和细胞内hCD3ζ(hCD3 zeta)信号传导结构域。
进一步地，本发明涉及编码CAR融合蛋白的核酸序列，优选地其包含在病毒载体中，例如在5’LTR和3’LTR之间，该核酸序列更优选地包含在适用于转导Treg细胞的病毒颗粒中。其中，核酸序列和病毒载体，优选地包含在病毒颗粒中，用于治疗宿主-抗-移植物(HvG)病。根据本发明，HvG病的治疗通常是针对移植的移植物的细胞毒性T细胞活性的抑制。
进一步地，本发明涉及通过在Treg细胞中表达根据本发明的融合蛋白来引入对于HLA-A*02特异的抑制物活性的体外方法，例如通过将编码融合蛋白CAR-A*02的核酸序列引入Treg细胞中，该Treg细胞通常不含有或表达HLA-A*02，且优选地，Treg细胞对患者是同种的(homogeneic)，例如是从患者的活检组织获得并分离的。本发明提供了HvG病的治疗方法，其包含向患者施用根据本发明的表达融合蛋白CAR-A*02的Treg细胞。
现有技术
MacDonald et al.,The Journal of Clinical Investigation 1-12(22March2016)描述了具有对于HLA-A2特异的scFv结构域的通用CAR，以及为了表达用于特异性抑制HLA-A2的CAR而转导的调节性T细胞。该scFv结构域含有单克隆抗体BB7.2的重链可变区和轻链可变区。除了scFv，CAR还含有CD28跨膜结构域、CD28信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。
Inaguma et al.,Gene Therapy 575-584(2014)描述了用于指导T淋巴细胞对抗表达特定蛋白质的肿瘤细胞的T细胞受体的构建，其包括分离对于当结合在HLA-A2复合物中时的肿瘤特异的蛋白质具有特异性的抗体scFv，并使用该scFv作为合成的T细胞受体中的结构域。
Noyan et al.,Cancer Gene Therapy 19,352-357(2012)描述了通过慢病毒转导在造血干细胞和祖细胞中诱导的转基因表达，其用于实体瘤的治疗中。
Galla et al.,Nuc.Ac.Res.39,1721-1731(2009)描述了用于逆转录病毒颗粒转导细胞的转座酶的细胞毒性作用。
DiStasi et al.,N Engl J Med 1673-1683(2011)描述了通过引入编码胱天蛋白酶-9二聚体的序列的遗传操作，以产生细胞中诱导性凋亡的系统。
Long et al.,Diabetes,407-415(2010)描述了用于测量IL-2R的信号传导通路中STAT5磷酸化的测定法。
Hombach et al.,Gene Therapy 1206-1213(2010)描述了用于指导T细胞对抗特异的抗原的CAR，该CAR含有在scFv和跨膜结构域之间的修饰的IgGl Fc间隔子结构域，信号传导结构域(CD28-CD3ζ)连接到该跨膜结构域。
WO 2018/001874描述了在Treg细胞中表达的通用CAR分子，其用于移植物受体中HvG病的治疗中。
发明目的
本发明的目的是提供替代的嵌合抗原受体CAR，其适用于为Treg细胞提供I类MHC(尤其是HLA-A*02)的抑制物活性，其中抑制物活性强度足以抑制表达I类MHC(例如HLA-A*02)的移植物的细胞毒性排斥，特别是在HLA-A*02阴性的受体患者中，该CAR用于治疗HvG病。
发明内容
本发明通过权利要求的特征来实现该目的，特别是通过提供融合蛋白，该融合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)，尤其是含有对人HLA-A*02特异的scFv结构域的CAR-A*02，该CAR-A*02用于HvG病的治疗中，例如用于在移植物受体患者中治疗细胞毒性排斥反应。当CAR-A*02在人Treg细胞中表达时，在人HLA-A*02的存在下，CAR-A*02提供对于细胞毒性T细胞的抑制。本发明的CAR-A*02具有SEQ ID NO:9为其scFv结构域，该scFv结构域也指定为ELFA*2(Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu ArgVal Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asp Tyr Gly Met His Trp Val ArgGln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser GluLys Thr Val Ser Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu Trp GlyArg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerGly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser AlaSer Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Leu Asp Ile Ser His TyrLeu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr HisPhe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys)。在变体中，ELFA*2具有SEQ ID NO:11(Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val ValGln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser AspTyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala PheIle Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe ThrIle Ser Arg Asp Asn Ser Glu Lys Thr Val Ser Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg AlaGlu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp TyrTrp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln SerPro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser SerLeu Asp Ile Ser His Tyr
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile TyrAsp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyThr His Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr TyrCys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu IleLys)。任选地，在ELFA*2的N末端，排列有信号肽(Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu LeuLeu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Ala Pro,SEQ ID NO:10)，且被编码CAR-A*02的核酸序列编码。该含有SEQ ID NO:9作为其scFv结构域的CAR-A*02，当在人Treg细胞中表达时，以及分别地表达此CAR-A*02的该人Treg细胞，是用于治疗HvG病的药物化合物。SEQID NO:9的scFv和分别地SEQ ID NO:11的scFv，从N末端到C末端含有重链可变区(VH1)，接头和轻链可变区(VLκ)。在重链部分和轻链(κ)部分中，通过下划线和粗体标记互补决定区(CDR)。
在重链部分，CDR1是Gly Val Thr Leu Ser Asp Tyr Gly(SEQ ID NO:9，氨基酸编号26至33)，CDR2是Ile Arg Asn Asn Asp Gly Ser Asp Lys(SEQ ID NO:9，氨基酸编号51至58)且CDR3是Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu(SEQ ID NO:9，氨基酸编号97至112)。
在轻链部分，CDR1是Leu Asp Ile Ser His Tyr(SEQ ID NO:9，氨基酸编号166至171)，CDR2是Asp Ala Ser(SEQ ID NO:9，氨基酸编号189至191)且CDR3是Gln Gln Tyr AspAsn Leu Pro Leu Thr Phe(SEQ ID NO：9，氨基酸编号228至237)。
任选地，在SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的C末端排列另外的精氨酸。
任选地，对表达CAR-A*02的Treg细胞进行遗传操作以还表达外源hFOXP3，优选地组成性地，例如通过在将编码CAR-A*02的核酸序列引入Treg细胞的同时引入编码人FOXP3的表达盒。进一步任选地，除了对Treg细胞进行遗传操作以表达FOXP3之外或作为其替代方案，除了表达CAR-A*02之外，还对Treg细胞进行遗传操作以表达诱导性胱天蛋白酶-9二聚体系统(例如如通过DiStasi et al.,N Engl J Med 1673-1683(2011)所描述的)用于在转移到患者体内后Treg细胞的消耗。
FOXP3与融合蛋白CAR-A*02的表达可以是通过在一个统一的融合蛋白中P2A与C末端融合的FOXP3的融合体，例如直接融合到CAR-A*02的C末端，的表达。这种融合，例如由一种适用于产生一种编码CAR-P2A-FOXP3融合蛋白的统一mRNA的表达盒来编码，将通过从P2A结构域水解产生游离FOXP3。P2A-FOXP3的示例性融合是SEQ ID NO:6，其可以直接融合到融合蛋白的hCD3ζ结构域的C末端。
CAR-A*02是融合蛋白，其包含或由单链可变片段抗体结构域(scFv)、铰链、跨膜结构域、细胞内hCD28信号传导结构域和细胞内CD3信号传导结构域(也称为hCD3ζ(hCD3zeta)结构域)组成，其中这些结构域优选地从N末端到C末端彼此直接连接。在scFv结构域中，抗体的可变轻链通过铰链区连接到抗体的可变重链。CAR-A*02的特征在于其scFv结构域选自SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11之一的氨基酸序列，CD8铰链和CD8跨膜结构域优选地具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，CD28信号传导结构域优选地具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并且CD3信号传导结构域具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。由于根据本发明的信号传导结构域具有人或人源化的氨基酸序列，这在本文中也通过“h”表明。铰链可以通过hΔFcIgG结构域形成，优选地hΔFc IgG结构域为SEQ ID NO:4的hΔFc IgG结构域。CD8跨膜结构域、hCD28信号传导结构域和hCD3ζ信号传导结构域可以变换为hCD28跨膜结构域、hCD28信号传导结构域和hCD3ζ信号传导结构域的融合体，优选地SEQ ID NO:5的融合体。
CAR-A*02融合蛋白的优势在于其对HLA-A*02的高度特异。CAR-A*02在Treg中的表达致使在HLA-A*02的存在下Treg增殖增强，且导致Teff(效应T细胞)抑制物活性增加。
融合蛋白CAR-A*02可以在Treg中从表达盒中编码融合蛋白的核酸序列的表达。任选地，编码融合蛋白CAR-A*02的表达盒包含病毒载体中，用于引入所述核酸序列，例如通过使用含有病毒载体的病毒颗粒进行转导。
对于表达CAR-A*02的Treg细胞的体外生产，优选地使用源自移植物受体的Treg细胞，该受者可以是未来的受体或已经接受移植物的受体。Treg细胞(Treg)是CD4+、CD25高和CD127低并且必须从HLA-A*02阴性患者中分离，例如通过细胞分选从血液样品分离，例如使用FACS或有特异抗体的磁珠。Treg细胞是是CD4+、CD25高和CD127低并且必须被分离，例如通过细胞分选从血液样品中分离，例如使用FACS或具有特异抗体的磁珠。
表达CAR-A*02的Treg细胞的一个优点是，在引入到患者之前和分别地在引入编码CAR-A*02的核酸序列之后，在引入这些Treg细胞到患者体内之前不必需体外扩增。例如，在生产这些Treg细胞的过程中，没有进行体外扩增，该体外扩增包括在培养基中刺激剂的存在下培养这些Treg细胞。优选地，在引入编码CAR-A*02的核酸序列后，将Treg细胞保留在培养物中约24小时以允许CAR-A*02的表达，然后细胞分选以分离表达CAR-A*02的Treg细胞。在该培养物中，培养基中不存在用于扩增的刺激剂，例如无抗CD3或抗CD28抗体。在该培养物中，培养基含有低剂量的IL-2，例如50U/m培养基，以防止Treg细胞死亡。已经发现表达CAR-A*02的Treg细胞可有效迁移至移植物并有效抑制针对移植物的细胞毒性反应，并且表达CAR-A*02的Treg细胞具有稳定的抑制活性。
CAR-A*02的scFv结构域对于HLA-A*02非常特异，迄今为止，未发现交叉反应性或脱毒性。进一步，没有发现CAR-A*02的内在活性或自激活，排除了与HLA-A*02存在无关的抑制活性。发现表达CAR-A*02的Treg细胞的抑制活性大大高于初始Treg(nTreg)细胞的抑制活性。
CAR-A*02可用于用于生产在HLA-A*02的存在下具有抑制活性的Treg细胞的过程中，通过将CAR-A*02的编码序列在供体与HLA-A*02接触之前引入源自供体的Treg细胞，或在供体与HLA-A*02接触后引入源自供体的Treg细胞，例如来自移植后的移植物的受体。
通常优选地，融合蛋白在其N末端包含用于融合蛋白的分泌的前导肽，以促进scFv结构域的跨膜转运和跨膜(TM)结构域跨细胞膜的排列。示例性的前导序列是SEQ ID NO：8，优选对于CAR-A*02。
现在参考附图通过实施例更详细地描述本发明，其中
-图1a示意性地显示了编码根据本发明的CAR-A*02的核酸构建体，
-图1b显示了图1a的CAR-A*02排列在细胞膜中的示意模型，
-图1c显示了FACS结果，表明本发明的CAR-A*02转导的Treg对HLA-A*02分子是高度特异的。这通过本发明的四聚体染色来显示，其中本发明的表达CAR-A*02的Treg细胞的无(对照)和有HLA-A*0201四聚体染色。
-图2a示意性地显示了编码本发明的CAR-A*02的核酸构建体的实施方案，
-图2b显示了图2a的CAR-A*02排列在细胞膜中的示意模型，
-图3a显示了表达本发明的CAR-A*02的Treg细胞响应于刺激物细胞的活化的FACS结果，
-图3b显示了通过在不同细胞比率下表达本发明的CAR-A*02的Treg细胞的T效应细胞的抑制的图，*＝P<0.05，**＝P<0.01，
-图4A和4B显示了表达本发明的CAR-A*02的Treg细胞的转录组分析的图形分析，
-图5显示了用表达本发明的CAR-A*02的Treg细胞重建的小鼠和比较小鼠上的人皮肤移植物的存活和，分别地排斥，以及
-图6显示了与未治疗组相比，关于用表达CAR-A*02的Treg和nTreg治疗的GvHD发展的治疗性干预，人PBMC重建的人源化小鼠的体重随时间变化的总结。
通常，显示的FACS结果代表三个独立的实验。
实施例1：编码CAR-A*02的逆转录病毒载体和表达CAR-A*02的细胞
用于本发明的CAR-A*02的scFv结构域ELFA*2(SEQ ID NO：9)是通过使用表达抗HLA-A*02抗体的噬菌体展示文库对于HLA-A*02的亲和选择产生的。抗-HLA-A*02(可在EBI获得的核苷酸序列，重链：AF163303；轻链：AF163304)是从已经在输血后产生A*02反应性抗体的患者克隆的。
结果，可以分离出对应于ELFA*2的抗体，与最初克隆的抗HLA-A*02抗体相比，该抗体对于HLA-A*02的亲和力显著增加，并且与WO2018/001874中描述的scFv相比，该抗体对HLA-A*02的亲和力也显著提高。
克隆该scFv结构域的编码序列以生成一种融合蛋白的编码序列，从N末端到C末端含有可变轻链、接头、可变重链、hCD8铰链结构域、hCD6跨膜结构域，hCD28细胞内信号传导结构域和hCD3ζ细胞内信号传导结构域。在逆转录病毒载体的5'-LTR和3'-LTR之间克隆编码序列，在CAR-A*02的该编码序列和3'-LTR之间另外含有在作为启动子的IRES(内部核糖体进入位点)元件的控制下的作为报告子蛋白的非信号传导表面分子ΔLNGFR(截短的低亲和力神经生长因子)的编码序列。除了作为CAR-A*02表达的报告子的功能外，这种报告子可用于分离转导的细胞，例如使用对报告子特异的并且偶联到携带体(例如磁珠)上的抗体进行亲和分离。
对于转导，将编码含有ELFA*2的CRA-A*02的核酸序列克隆到γ-逆转录病毒LTR驱动的表达载体中。
使用抗CD271抗体(C40-1457,Becton Dickinson)通过流式细胞术来检测报告子ΔLNGFR。
为了引入编码CAR-A*02的核酸序列，报告子(例如ΔLNGFR)包含在逆转录病毒载体中，产生含有该载体的病毒颗粒，如Galla et al.,Nuc.Ac.Res.39,1721-1731(2009)所描述的。在分离被认为是nTreg细胞的Treg细胞后，用板结合的抗CD3抗体(OKT-3，5μg/mL)和可溶性抗CD28抗体(CD28.2，从BioLegend获得，5μg/mL)在完全培养基中刺激这些细胞48小时。在转导之前，将硫酸鱼精蛋白(4μg/mL，从Sigma获得)添加到Treg培养物中。Treg细胞用编码CAR-A*02的逆转录病毒颗粒或对于PE特异的对照CAR在31℃中700xg下旋转感染1.5小时。
使用对照CAR的表达载体转导后，SC-1细胞可以通过抗CD271抗体免疫染色ΔLNGFR，并使用抗IgG-Fab(从Jackson实验室获得)染色scFv，这证明对照CAR的表面表达和通过对照CAR对PE的识别。尽管SC-1细胞不表达FOXP3或B220，但它们用PE缀合的抗体染色呈阳性。
使用FACS与以下抗体组合：抗CD8(HIT8a，从BioLegend获得)、抗CD4(RPA-T4，从Becton Dickinson获得)、抗CD25(M-A251，从Becton Dickinson获得)、抗CD127(hIL-7R-M21，从BectonDickinson获得)，从人PBMC中分离人Treg细胞，导致纯度至少为90％的CD8-CD4+C25高CD127低的分离。PBMC制剂是在伦理批准和个人书面知情同意后，通过来自不同HLA型的健康供体在Ficoll-Paque Plus(从GE Healthcare获得)上进行密度梯度离心产生的。
Treg细胞通过如Galla et al.,Nuc.Ac.Res.39,1721-1731(2009)的描述进行转导。通常，所有T细胞培养物和所有T细胞相关的测定均在37℃和5％CO2的加湿培养箱中，在完全培养基(RPMI 1640GlutaMax-I(从Gibco获得)中进行，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS)(从Gibco获得)、1％青霉素和链霉素(从Biochrom获得)、0.05mMβ-巯基乙醇(从Gibco获得)、20mM HEPES(从Gibco获得)、1％丙酮酸钠(从Gibco获得)和500IU/mL IL-2(阿地白介素，从Novartis获得)。所有细胞系对于支原体检测均呈阴性。
图1a显示了CAR-A*02的核酸构建体的排列，包括在侧接有γ逆转录病毒载体的5'-LTR和3'-LTR并且在IRES元件的控制下的报告子ΔLNGFR的编码序列。通常，在Treg细胞中膜结合蛋白的表达，例如在与CAR-A*02编码序列连接的IRES的控制下，优选地在病毒载体中，可通过针对膜结合蛋白的亲和分离用于遗传操作的Treg细胞的分离。此类膜结合蛋白的实例是ΔLNGFR。
图1b显示了CAR-A*02的模型，其具有跨越细胞膜的跨膜结构域，排列在细胞外表面的scFv，排列在细胞质内的细胞内信号传导结构域。
包含ELFA*2作为其scFv结构域的CAR-A*02的替代实施方案在图2a中显示，模型在图2b中显示。在本实施方案中，胞外组分(EC)由ELFA*2scFv和作为铰链的hΔFc IgG结构域组成，跨膜结构域(TM)是hCD4 TM结构域，CAR的胞内组分(IC)由hCD28信号传导结构域和hCD3ζ信号传导结构域组成。使用编码的P2A结构域，翻译产品还包含FOXP3，以及使用IRES，翻译产品还包含报告子ΔLNGFR。图2b的模型表明负载有HLA-A*02的靶细胞，该HLA-A*02作为CAR的靶抗原(靶X)。
使用杂交瘤细胞的转导测试融合蛋白在细胞表面的膜锚定表达。简言之，用编码CAR-A*02或阴性对照融合蛋白的逆转录病毒载体转导杂交瘤细胞。通过与各种HLA-A*02阳性或HLA-A*02阴性人PBMC(外周血单核细胞)接触来刺激转导的杂交瘤细胞。与转导的杂交瘤细胞共培养20小时并辐照(30Gy)。对于ΔLNGFR的特异的染色，使用抗CD271抗体C40-1457(从Becton Dickinson获得)，对于CAR-A*02的特异的染色，使用单克隆抗体(mAb)抗IgG-F(ab)(从Jackson实验室获得)。通常通过流式细胞术使用流式细胞仪FACSCalibur(Becton Dickinson)或LSRII(Becton Dickinson)，使用FACSDiva软件和FlowJo软件(TreeStar Inc.)进行分析。对于统计分析，使用了GraphPad Prism7.0版。
分析显示报告子ΔLNGFR在初始的杂交瘤细胞(未转导)中转导的杂交瘤细胞的表面上的表达和定位，仅对ΔLNGFR(对照CAR)进行染色且对CAR-A*02(A2-CAR)进行染色。结果显示，报告子ΔLNGFR和CAR-A*02均在转导的杂交瘤细胞表面表达。
逆转录病毒载体转导从HLA-A2*阴性个体(HLA-A*02阴性供体)分离的Treg细胞(CD4+CD25高CD127低)，以表达CAR-A*02和报告子ΔLNGFR。对于染色，使用了展示丙型肝炎病毒肽的HLA I四聚体(HLA-A1-CMV五聚体,为pp65从ProImmune获得)。
FACS结果显示转导的细胞被HLA A*0201(A*0201,从Beckman coulterImmunomics,San Diego,USA获得)四聚体染色。
进一步，FACS结果显示经转导以表达CAR-A*02和报告子ΔLNGFR的来自HLA-A2*阳性人(HLA-A*02阳性供体)的Treg细胞没有被A*01四聚体染色。
这些结果表明CAR-A*02在转导的Treg细胞表面表达，并且其特异性地识别HLA-A*02四聚体，例如无法识别HLA-A*01四聚体。此外，发现通过A*02四聚体的特异的染色与结合到A*02四聚体的肽无关。
作为阴性对照CAR，在相同表达载体中编码含有除了对于藻红蛋白(PE)特异的scFv代替对于HLA-A*02特异的scFv但其他方面相同的融合蛋白。为了确定对照CAR的表面表达和特异性，根据Noyan et al.,Cancer gene therapy 19,352-357(2012)转导SC-1细胞，缺乏鼠白血病病毒的宿主范围限制的胎鼠胚胎细胞(ATCC CRL-1404)。对照CAR对于藻红蛋白(PE)的特异性通过使用几种PE缀合蛋白和PE缀合抗体鼠B220-PE(RA3-6B2，从Caltag获得)、鼠Foxp3-PE和鼠Foxp3-PacBlue(FJK-16，从eBioscience获得)，使用eBioscience Fix/Perm试剂盒根据制造商的说明进行细胞内Foxp3染色，进行评估。FACS结果显示阴性对照CAR在细胞表面上表达并识别PE。
使用从HLA-A*02阴性供体获得的Treg细胞分析表达CAR-A*02的Treg细胞的表型，以防止转导后通过Treg细胞自身的CAR-A*02的活化。这种情况近似于HLA-A*02阴性受体中的情况。发现转导基本上不影响nTreg表型，CAR-A*02转导的Treg细胞和非转导的nTreg细胞中展示的效应分子CTLA-4和CD39水平相似，需要相似的CD45RA+初始Treg细胞百分比和相似的CCR7表达将细胞归巢到次级淋巴器官。对于染色，在FACS分析中使用抗体抗CD39(A1，从BioLegend获得)、抗CD45RA(HI100，从Becton Dickinson获得)、抗CD45RO(UCHL1，从BioLegend获得)、抗CCR7(3D12，从Becton Dickinson获得)、抗CTLA-4(BNI3，从BectonDickinson获得)、抗FoxP3(PCH101，从eBioscience获得)。对于用PE特异的对照CAR转导的Treg细胞，发现了相同的表型。
图1c)：Treg从HLA-A*02阴性PBMC中分离出来，并用编码CAR A*02的传染性颗粒进行遗传操作。在FACS分析中，可以显示只有可通过ΔLNGFR识别的表达ELFA*2-CAR的Treg，携带针对HLA-A*02分子的高度特异的scFv(通过HLA-A*02四聚体染色)。
对于CAR-A*02转导的Treg细胞和来自同一实验的未转导的nTreg，在不同剂量的IL-2下使用FACS测量STAT5的磷酸化(方法如Long et al.,Diabetes,407-415(2010)中描述的，使用从Becton Dickinson获得的抗pSTAT5抗体(pY694,47/SAT5))。FACS结果显示，在培养物中在nTreg的存活所需的低剂量IL-2下，这些Treg细胞均显示出高水平的STAT5磷酸化。与未转导的细胞相比，用CAR-A*02转导的Treg细胞显示出更高的基线和略高的最大STAT5磷酸化水平。STAT5磷酸化水平与IL-2剂量的比较发现，没有观察到IL-2信号传导中的缺陷。这些结果显示，转导Treg细胞以表达CAR-A*02不会显著影响STAT5磷酸化，表明这些转导细胞的归巢能力没有受损。
为了分析CAR-A*02转导的细胞的功能，用CAR-A*02转导稳定表达含有NFAT敏感IL-2启动子以控制GFP表达的报告子构建体的T细胞杂交瘤。为了在FACS分析中检测CAR表达，检测了报告子ΔLNGFR，作为GFP(绿色荧光蛋白)的表达检测了NFAT刺激。
如图3a所示，发现CAR-A*02转导的细胞(A2-CAR)在转导后没有显示出任何NFAT激活和GFP的相关表达，但NFAT激活和GFP表达通过与作为刺激细胞的HLA-A*02+PBMC共培养而被强烈上调，但不响应于HLA-A*02-PBMC。非转导(未转导)的T细胞杂交瘤和用ΔLNGFR(对照CAR)转导的细胞对HLA-A*02阳性和HLA-A*02阴性PBMC刺激细胞均未显示反应。该结果显示，根据本发明的CAR-A*02能够进行激活NFAT所必需的信号传导。由于杂交瘤不表达任何内源性T细胞受体(TCR)，因此观察到的信号传导完全是由CAR-A*02的信号传导引起的。
当使用CAR-A*02转导HLA-A*02阴性供体Treg细胞时，通过CAR或通过TCR的信号传导之间的区分将更加困难，因为8％至12％的这些nTreg细胞的TCR也会识别HLA-A*02。因此，使用在含有报告子构建体的T细胞杂交瘤中的表达，CAR-A*02针对一系列呈现各种MHCI和MHC II等位基因的人PBMC进行了测试。通过GFP表达的流式细胞术进行分析。结果显示，CAR-A*02(HLA-A2 CAR)在杂交瘤中表达后，可识别所有HLA-A*02阳性供体样品，与HLA-A*02阴性血样品无任何交叉反应。为了比较，使用了PE特异的对照CAR(不相关的CAR)。结果总结在下表中，其中对于编号的样品(人PBMC)在每一行中表明个体HLA-A和HLA-B，并且X表示GFP表达：
Figure BDA0003346803650000121
与血样品共培养后表达对照CAR的杂交瘤细胞对于任何HLA都不表达GFP(-)。这证明了根据本发明具有作为其scFv的ELFA*2的CAR-A*02对于HLA-A*02的高特异性，显示出低或不存在非特异活性或脱靶活性。
使用HLA-A*02阳性PBMC作为刺激细胞，测试了根据本发明的CAR-A*02在人HLA-A*02阴性Treg细胞中表达时的激活效果。基于CFSE稀释测定，分析表达CAR-A*02的Treg细胞的增殖，为此用CFSE(5mM，从Invitrogen获得)标记Treg细胞。对于表达CAR-A*02的HLA-A*02阴性Treg细胞，通过与辐照(30Gy)的HLA-A*02阳性PBMC(刺激细胞)共培养使用多克隆刺激，所述HLA-A*02阳性PBMC也在1:4的比率中与5mM APC细胞增殖染料(eFluor 670，从eBioscience获得)接触。对于经转导以表达对照CAR(PE特异的)的人HLA-A*02阴性Treg细胞，通过抗CD3/抗CD28将刺激定向到TCR。对于Treg激活，测量了使用抗CD39抗体(A1,BioLegend)对CD39的检测，并对于增殖，检测了CFSE。为了比较，对增殖细胞的CFSE稀释测定进行了FACS分析。FACS结果如图3b所描绘，显示CAR-A*02被HLA-A*02阳性PBMC强烈激活，导致CD39效应分子强烈增殖和上调。这种效应比在表达对照CAR的激活的Treg细胞中强得多。表达对照CAR的Treg细胞可能经由它们的同种异体特异的TCR被激活，因为可在多达12％的所有nTreg细胞上发现。使用在TCR上起作用的抗CD3和抗CD28抗体的组合在激活后还发现CD39的上调。这些数据表明表达根据本发明的CAR-A*02的Treg细胞可以经由CAR-A*02或经由TCR被同样好地激活。
假定在转移到患者体内后表达根据本发明的CAR-A*02的Treg细胞的高增殖能力支持它们的作用，例如他们的小生境填充能力。
实施例2：CAR-A*02的体外抑制物活性
通过测定针对HLA-A*02阳性CD1c刺激细胞的同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制来测试实施例1的表达CAR-A*02的Treg细胞的抑制物活性。应答细胞是CFSE标记的(5mM)分离的CD4+CD25-效应T细胞，它们与分离的HLA-A*02CD1c+细胞在不同比率的同基因的HLA-A1 CD4+CD25+CD127低Treg(nTreg)细胞或表达CAR-A*02的同基因Treg细胞的存在下共培养五天。同基因效应T细胞增殖的抑制是经由CFSE稀释测定基于Treg/Teff比率来计算的。为了比较，使用了来自相同转导实验的未转导的nTreg细胞。
Treg-CAR-ELFA*2的调节能力如图3b所描绘，显示表达ELFA*2的Treg细胞(A2-CARTreg)在抑制同种异体特异的效应T细胞的增殖上比非转导的Treg细胞(nTreg)更有力。表达ELFA*2-CAR的Treg细胞在几乎测试的表达CAR-A*02的Treg/效应T细胞的所有比率下都是更有力的抑制子。即使在表达CAR-A*02的Treg/效应T细胞(比率Treg/Teff)的比率为1:64，也观察到超过80％的抑制，这证明包含ELFA*2作为scFv结构域的融合蛋白赋予的强抑制活性。
为了通过CAR-A*02分析Treg细胞中信号传导的后果，包含1149个基因的转录组分析，通过在未激活和表达CAR-A*02的Treg细胞中进行深度测序，并且与对于非转导的Treg细胞得到的结果相比较来完成。表达CAR-A*02的Treg细胞(CD4+CD25高CD12低)用辐照的(30Gy)作为刺激细胞的HLA-A*02+PBMC通过共培养36小时来激活。作为对照，未转导的Treg细胞未经处理或由组合的抗CD3/抗CD28抗体经由其TCR刺激48小时。刺激后，使用MicroRNeasy试剂盒(从Qiagen获得)分离RNA，在Agilent Technologies 2100生物分析仪上测量总RNA的质量和完整性。根据制造商的方案，使用TruSeq RNA Sample Prep试剂盒v2(从Illumina获得)用于mRNA纯化，然后使用ScriptSeq v2 RNA Seq Library Preparation试剂盒(从Epicenter获得)从100ng总RNA生成RNA测序文库。使用TruSeq SBS试剂盒v3-HS(50个循环，单端运行)在Illumina HiSeq2500设备上对文库进行测序，每个RNA样品的读数平均为3x107。使用默认设置的开放来源短读比对器STAR将读数与参考基因组hg19比对。比对后每个基因的读数由称为Rsubread的R包的特性.计数函数(feature.count function)进行。对于原始计数数据的log2转换，然后通过数据标准化和差异表达基因的统计确定，使用称为edgeR的R包。
结果的图形表示(热图，水平条强调个体样品，垂直条表示主要基因簇)如图4A所示，对于经由抗CD3/抗CD28的TCR激活的nTreg细胞，以及经转导以表达CAR-A*02的nTreg细胞通过HLA-A*02阳性反应细胞的存在而被激活。图4B显示了TCR激活后差异表达的基因子集(1149个基因，FDR<0.05)的表达水平与Treg功能和表型相关的图形分析(集中log2强度值，z分数)。发现CAR-A*02转导的Treg细胞和未转导的Treg细胞具有非常相似的激活和下调的转录模式，支持经由CAR-A*02进行信号传导与经由TCR进行信号传导在Treg细胞内致使相似的转录谱的观点。与非激活状态相比，CAR-A*02或TCR的激活分别导致转录谱的重大变化，但两种激活状态的转录谱彼此相似。对参与Treg细胞功能及其归巢的特异的基因的分析揭示了细微的差异。CAR-A*02激活的Treg细胞表达更高量的IL-4、IL-5和IL-10，但CTLA4和IL-2R的转录数量略低。这些降低的转录水平对CTLA4蛋白表达和IL-2信号传导没有明显后果。
实施例3：CAR-A*02体内的抑制物活性
作为体内抑制活性的实例，人源化非肥胖糖尿病(NOD)-RAG1零IL2零(NRG)小鼠(未重建的)接受来自HLA-A*02阴性供体的5x104个CD4+CD25+CD127低人Treg细胞，其中Treg细胞用根据实施例1的编码CAR-A*02的逆转录病毒载体转导，或用实施例1的对照CAR(PE特异的)转导的相同Treg细胞，或未转导的Treg细胞。作为移植组织的一个实例，将混合了5x105个辐照的同基因HLA-A*01PBMC和同种异体辐照的HLA-A*02PBMC作为体内MLR注射到小鼠的每个耳廓中。
这些实验以盲法进行。为了确定抑制物活性，使用弹簧加载的数字测厚仪测量耳肿胀。耳肿胀测试的结果，计算为注射前和注射24小时后的耳厚度之间的差异，每个值与在未注射Treg细胞的作为内部对照的动物的另一只耳中观察到的耳肿胀有关。
结果表明，与表达对照CAR的Treg细胞(对照CAR Treg)相比以及与未转导的Treg(CD4+CD25高Treg)相比，表达CAR-A*02的Treg细胞(A2-CAR Treg)的同种异体混合的淋巴细胞反应具有显著更强的抑制作用。
在另一个实验中，在免疫重建的NRG小鼠中分析了抑制物活性。目前，在此类小鼠中测试移植物排斥很困难，因为在具有免疫能力的小鼠中，同种异体皮肤移植物会在10天内被排斥，而在人源化NRG小鼠中在移植后30天之前不会发生相似的排斥。在这个晚的时间点，免疫重建后异种特异的移植物抗宿主反应已经变得明显。为了避免GvHD反应之外的其他影响，使用了严格的排斥模型，其中同种异体移植的细胞在通过注射移植到第5天被完全排斥。使用注射的同种异体移植细胞具有额外的优势，即Treg细胞归巢到移植的组织不应起主要作用，因为免疫反应是在脾脏中启动的，因此避免了人源化小鼠中受扰动归巢的可能影响。
作为Treg细胞，使用了根据实施例1用CAR-A*02转导的CD4+CD25+CD127低人Treg细胞，或用实施例1的对照CAR(PE特异的)转导的相同Treg细胞，或未转导的Treg细胞。通过在来自下颌静脉的外周血样品中表达人CD8和人CD4，在重建后14天通过FACS监测免疫重建。从实验中排除没有可察觉的人CD8和CD4 T细胞的重建的动物。在免疫重建后的第14天，小鼠被静脉注射了5x105个用CFSE标记的同基因PBMC和5x105个用APC增殖染料标记的HLA-A*02PBMC作为同种异体阳性靶细胞。同时，不同的动物接受不同的Treg细胞5x104个，它们是表达CAR-A*02的Treg(加A2-CAR Treg)或对照CAR的Treg(加对照CAR Treg)或未转导的Treg(加nTreg)。注射后五天，处死小鼠，分析血液和脾脏细胞的同种异体靶标和同基因供体细胞，并与未接受Treg细胞(不添加Treg)的动物中获得的那些进行比较。同基因和同种异体细胞的标记允许评估动物中同种异体靶细胞的相对杀伤，因为两种细胞群都以1:1的细胞比率注射。
代表性的FACS结果表明，在移植后120小时后，在具有免疫能力的小鼠中不再检测到同种异体靶细胞，这与非人源化小鼠中同种异体组织的快速排斥相对应。注射表达对照CAR的Treg或未转导的Treg对防止同种异体靶细胞的杀伤的影响很小，表达CAR-A*02的Treg细胞的转移完全防止了同种异体靶细胞的排斥。
实施例4：CAR-A*02体内的抑制物活性
作为体内抑制物活性的一个实例，n＝6只人源化非肥胖糖尿病(NOD)-RAG1零IL2γ零(NRG)小鼠(未重建的)接受来自HLA-A*02阴性供体的5x104个CD4+CD25+CD127低人Treg细胞，其中Treg细胞用编码根据实施例1的CAR-A*02的逆转录病毒载体转导，或(n＝7)用实施例1的对照CAR(PE特异的，比较性)转导的相同Treg细胞，或未转导的nTreg细胞(n＝5，比较性)。作为移植组织的一个实例，老鼠接受了15mmx15mm的人皮肤作为移植物，替换了它们天然皮肤的一部分。人皮肤从Department of Plastic,Aesthetic,Hand andReconstructive Surgery,Hannover Medical School,Hannover,Germany获得。
存活如图5所展示，显示含有根据本发明的CAR-A*02(●)的Treg细胞抑制了移植物排斥，没有被Treg细胞重建的小鼠(▲)排斥移植物直到第30天，并且用nTreg细胞重建的小鼠(■)显示出非显著的更长的移植物存活(37天)。
这些结果表明，在Treg细胞中表达的根据本发明的CAR-A*02，还在没有任何免疫抑制的情况下导致完全采用表达HLAA*02的移植物。
实施例5：CAR-A*02体内的抑制物活性
作为表达本发明的CAR-A*02的Treg细胞抑制物活性的进一步体内证明，向免疫无能(NRG，缺乏T细胞、B细胞和NK细胞)小鼠注射人PBMC以重建免疫细胞的存在。注射人PBMC14天后，可以在该重建小鼠中检测到人T细胞，因为注射的人细胞可以在这些最初不含鼠免疫细胞的小鼠中快速发展。作为存在人类免疫细胞的结果，注射后大约30天的小鼠出现人类免疫细胞针对鼠细胞的不良免疫反应，这是GvH病，因为注射的来自PBMC(移植物)的人类免疫细胞攻击鼠宿主。
在第-1天将人PBMC成功转移到四只小鼠后，将每只动物分配到两个重建组(n＝5)，一个同时接受1x106个表达本发明的CAR-A*02的Treg，一个同时接受1x106个没有CAR表达的Treg(nTreg)，其中Treg是HLA-A*011，即HLA-A*02阴性。PBMC是HLA-A*02阳性。结果显示，表达CAR-A*02的Treg细胞消除了移植物针对鼠宿主的免疫反应。
图6描绘了接受表达CAR-A*02的Treg细胞的组的体重变化过程(●，1x106个Elfa-CAR Treg的过继转移)，接受没有表达CAR的Treg细胞的组的体重变化过程(▲，1x106个nTreg，天然Treg的过继转移)，没有注射PBMC和没有Treg的组的体重变化过程(■，没有重建)，p值**＝0,043。进一步，GvH疾病的常见指标，蓬松的毛皮和发炎的眼睛，仅在接受了表达CAR-A*02的Treg细胞的小鼠中不存在。接受PBMC和nTreg的动物显示出严重的体重减轻，表明PBMC针对鼠细胞的无限制不良免疫反应，表明没有CAR的Treg无法调节这种免疫反应。接受重建PBMC和表达本发明CAR的Treg细胞的小鼠显示出稳定的体重增加，表明不存在不良的免疫反应，因为Treg细胞的存在抑制了重建PBMC的免疫反应。
序列表
<110> 汉诺威医学院
布伦瑞克工业大学
<120> 用于HvG病的治疗的CAR
<130> M1085PCT
<150> EP19166421.8
<151> 2019-03-29
<160> 11
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8铰链结构域和跨膜结构域
<400> 1
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
50 55 60
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
65 70 75 80
Arg
<210> 2
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28信号传导结构域
<400> 2
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
1 5 10 15
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
35 40
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3zeta信号传导结构域
<400> 3
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
Ser
<210> 4
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hΔFC IgG结构域
<400> 4
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn
35 40 45
Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys
50 55 60
Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr
65 70 75 80
Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser
85 90 95
Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly
100 105 110
Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys
115 120 125
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr
130 135 140
Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His
145 150 155 160
Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln
165 170 175
Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro
180 185 190
Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr
195 200 205
Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile
210 215 220
Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln
225 230 235 240
Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys
245 250 255
Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe
260 265 270
Lys Arg Trp Asn Arg Gly Ile Leu
275 280
<210> 5
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD28跨膜结构域 - hCD3zeta信号传导结构域
<400> 5
Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
1 5 10 15
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
20 25 30
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
35 40 45
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala Ala Arg
50 55 60
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
65 70 75 80
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
85 90 95
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
100 105 110
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
115 120 125
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
130 135 140
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
145 150 155 160
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
165 170 175
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
180
<210> 6
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合P2A hFOXP3
<400> 6
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro Ser Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala
20 25 30
Pro Ser Leu Ala Leu Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg
35 40 45
Ala Ala Pro Lys Ala Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly
50 55 60
Thr Phe Gln Gly Arg Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser
65 70 75 80
Ser Leu Asn Pro Met Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro
85 90 95
Leu Val Met Val Ala Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His
100 105 110
Leu Gln Ala Leu Leu Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser
115 120 125
Thr Val Asp Ala His Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu
130 135 140
Glu Ser Pro Ala Met Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly
145 150 155 160
Val Phe Ser Leu Lys Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val
165 170 175
Ala Ser Leu Glu Trp Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe
180 185 190
Pro Asn Pro Ser Ala Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro
195 200 205
Gln Ser Ser Tyr Pro Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly
210 215 220
Cys Glu Lys Val Phe Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln
225 230 235 240
Ala Asp His Leu Leu Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln
245 250 255
Arg Glu Met Val Gln Ser Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu
260 265 270
Lys Leu Ser Ala Met Gln Ala His Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr
275 280 285
Lys Ala Ser Ser Val Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ser Cys Cys Ile Val
290 295 300
Ala Ala Gly Ser Gln Gly Pro Val Val Pro Ala Trp Ser Gly Pro Arg
305 310 315 320
Glu Ala Pro Asp Ser Leu Phe Ala Val Arg Arg His Leu Trp Gly Ser
325 330 335
His Gly Asn Ser Thr Phe Pro Glu Phe Leu His Asn Met Asp Tyr Phe
340 345 350
Lys Phe His Asn Met Arg Pro Pro Phe Thr Tyr Ala Thr Leu Ile Arg
355 360 365
Trp Ala Ile Leu Glu Ala Pro Glu Lys Gln Arg Thr Leu Asn Glu Ile
370 375 380
Tyr His Trp Phe Thr Arg Met Phe Ala Phe Phe Arg Asn His Pro Ala
385 390 395 400
Thr Trp Lys Asn Ala Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe
405 410 415
Val Arg Val Glu Ser Glu Lys Gly Ala Val Trp Thr Val Asp Glu Leu
420 425 430
Glu Phe Arg Lys Lys Arg Ser Gln Arg Pro Ser Arg Cys Ser Asn Pro
435 440 445
Thr Pro Gly Pro
450
<210> 7
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ΔLNGFR (报道子)
<400> 7
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn
35 40 45
Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys
50 55 60
Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr
65 70 75 80
Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser
85 90 95
Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly
100 105 110
Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys
115 120 125
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr
130 135 140
Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His
145 150 155 160
Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln
165 170 175
Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro
180 185 190
Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr
195 200 205
Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile
210 215 220
Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln
225 230 235 240
Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys
245 250 255
Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe
260 265 270
Lys Arg Trp Asn Arg Gly Ile Leu
275 280
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分泌前导肽
<400> 8
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Ala Pro
20
<210> 9
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 链
<222> 1..123
<223> 重链可变区
<220>
<223> scFv (ELFA*2)
<220>
<221> 链
<222> 26..33
<223> CDR1
<220>
<221> 链
<222> 51..58
<223> CDR2
<220>
<221> 链
<222> 97..112
<223> CDR3
<220>
<221> 链
<222> 124..139
<223> 接头
<220>
<221> 链
<222> 140..246
<223> 轻链可变kappa
<220>
<221> 链
<222> 166..171
<223> CDR1
<220>
<221> 链
<222> 189..191
<223> CDR2
<220>
<221> 链
<222> 228..237
<223> CDR3
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Lys Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Val Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Gln Ser Ser Leu Asp Ile Ser His Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
180 185 190
Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
His Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28细胞外结构域信号肽
<400> 10
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Ala Pro
20
<210> 11
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 链
<222> 1..123
<223> 重链可变区
<220>
<223> 变体ELFA*2
<220>
<221> 链
<222> 124..138
<223> 接头
<220>
<221> 链
<222> 139..245
<223> 轻链可变kappa
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Lys Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
145 150 155 160
Cys Gln Ser Ser Leu Asp Ile Ser His Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu
180 185 190
Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His
195 200 205
Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Lys
245

Claims (24)

1.融合蛋白，其包含单链可变片段抗体结构域(scFv)、铰链、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述融合蛋白形成对HLA-A*02具有特异性的嵌合抗原受体(CAR-A*02)，用于治疗患者中的HvG病，其特征在于所述单链可变片段抗体结构域(scFv)具有重链可变区氨基酸序列
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，
其中重链CDR1具有SEQ ID NO:9的氨基酸编号26至33的氨基酸序列，
重链CDR2具有SEQ ID NO:9的氨基酸编号51至58的氨基酸序列，且
重链CDR3具有SEQ ID NO:9的氨基酸编号97至112的氨基酸序列，
以及与所述重链氨基酸序列相关联的轻链可变氨基酸序列
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中
轻链CDR1具有SEQ ID NO:9的氨基酸编号166至171的氨基酸序列，
轻链CDR2具有SEQ ID NO:9的氨基酸编号189至191的氨基酸序列，且
轻链CDR3具有SEQ ID NO:9的氨基酸编号228至237的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于所述单链可变片段抗体结构域(scFv)具有作为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
3.根据前述权利要求中任一项的融合蛋白，其特征在于所述重链可变区氨基酸序列通过接头与所述轻链可变氨基酸序列相关联，作为重链可变区氨基酸序列-接头-轻链可变氨基酸序列。
4.融合蛋白，其包含单链可变片段抗体结构域(scFv)、铰链、跨膜结构域、细胞内hCD28信号传导结构域和细胞内hCD3ζ(hCD3 zeta)信号传导结构域，其形成对HLA-A*02具有特异性的嵌合抗原受体(CAR-A*02)，用于治疗患者中的HvG病，其特征在于所述单链可变片段抗体结构域(scFv)具有作为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求中任一项的融合蛋白，其特征在于所述细胞内信号传导结构域包含hCD28信号传导结构域和细胞内hCD3ζ(hCD3zeta)信号传导结构域。
6.根据前述权利要求中任一项的融合蛋白，其特征在于所述铰链和所述跨膜结构域具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述hCD28信号传导结构域具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且所述hCD3ζ(hCD3 zeta)信号传导结构域具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
7.根据权利要求5的融合蛋白，其特征在于所述铰链是具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的h氨基酸序列的N结构域。
8.根据前述权利要求中任一项的融合蛋白，其特征在于所述铰链和所述跨膜结构域具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域，所述hCD28信号传导结构域具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且所述hCD3ζ结构域具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或者包括所述hCD3ζ信号传导结构域的所述hCD28信号结构域具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
9.根据前述权利要求中任一项的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白在CD4+CD25+CD127低HLA-A*02阴性人调节性T(Treg)细胞中表达。
10.根据前述权利要求中任一项的融合蛋白，其特征在于所述患者为HLA-A*02阴性并且在于所述患者含有或意图含有作为HLA-A*02阳性的实体组织移植物。
11.根据前述权利要求中任一项的融合蛋白，其特征在于SEQ ID NO:10的信号肽排列在SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的N末端处。
12.根据前述权利要求中任一项的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白从N末端到C末端包含以下项或由以下项组成：一个具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的scFv结构域、具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的铰链和跨膜结构域、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的hCD28信号传导结构域和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的hCD3列的NO:结构域、具有信号传导结构域，任选地另外在N末端处的SEQ ID NO:10的信号肽。
13.根据前述权利要求中任一项的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白从N末端到C末端包含以下项或由以下项组成：一个具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的scFv结构域、作为具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的铰链的h链的酸IgG结构域、具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的hCD28跨膜结构域和hCD28/hCD3信号传导结构域，任选地另外在N末端处的SEQ ID NO:10的信号肽。
14.根据前述权利要求中任一项的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白从编码所述融合蛋白的核酸序列表达，所述融合蛋白任选地有另外的N末端分泌前导肽。
15.根据前述权利要求中任一项的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白从编码所述融合蛋白的核酸序列表达，所述融合蛋白有另外的N末端分泌前导肽和另外的具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的C末端P2A-hFOXP3。
16.根据权利要求14至15中任一项的融合蛋白，其特征在于所述前导肽具有SEQ IDNO:8的氨基酸序列。
17.根据前述权利要求中任一项的融合蛋白，其特征在于在HLA-A*02阳性实体组织的存在下或在SLA-01*0401阳性实体组织的存在下，向CD4+CD25+CD127低HLA-A*02阴性人调节性T(Treg)细胞提供抑制物活性。
18.根据前述权利要求中任一项的融合蛋白，其特征在于在CD4+CD25+CD127低HLA-A*02阴性人调节性T(Treg)细胞中提供到次级淋巴器官的归巢能力。
19.提供在HLA-A*02阳性实体组织的存在下具有抑制物活性的人调节性T(Treg)细胞的方法，其包括以下步骤:
a.从血液样品中分离CD4+CD25+CD127低人调节性T(Treg)细胞以产生分离的Treg细胞，
b.将编码和表达根据权利要求1至16中任一项的融合蛋白的核酸序列导入所述分离的Treg细胞以产生表达所述融合蛋白的Treg细胞，
其中表达所述融合蛋白的所述Treg细胞在体外培养物中不扩增。
20.根据权利要求19的方法，其特征在于分离所述人调节性T细胞是分离HLA-A*02阴性人调节性T细胞。
21.根据权利要求19至20中任一项的方法，其特征在于所述核酸序列包含在逆转录病毒载体中，所述逆转录病毒载体包装在逆转录病毒颗粒中并通过转导被引入所述分离的Treg细胞。
22.根据权利要求19至21中任一项的方法，其特征在于在步骤b.之后，将所述Treg细胞保留在培养物中24小时，随后分离表达所述融合蛋白的Treg细胞。
23.根据权利要求22的方法，其特征在于将所述Treg细胞保留在含有低剂量IL-2的培养基中的培养物中，所述培养基不含有刺激Treg细胞扩增的药剂。
24.Treg细胞，其含有编码根据权利要求1至18中任一项的融合蛋白的核酸构建体。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201915384D0 (en) * 2019-10-23 2019-12-04 Ucl Business Ltd Vector
WO2023111594A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Quell Therapeutics Limited Anti-thymocyte globulin for immunomodulation of a subject with regulatory t cells
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EP4289859A1 (en) 2022-06-10 2023-12-13 Medizinische Hochschule Hannover Fusion protein for maintenance of regulatory t-cells

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018037103A1 (en) * 2016-08-26 2018-03-01 Idogen Ab Procainamide for treating immune disorders and for modulating ido expression
CN109265550A (zh) * 2018-09-25 2019-01-25 华东师范大学 Bcma抗体、嵌合抗原受体和药物
CN109293773A (zh) * 2018-09-25 2019-02-01 上海邦耀生物科技有限公司 靶向cd38蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物
CN112969784A (zh) * 2018-08-31 2021-06-15 伦敦国王学院 工程化调节性t细胞

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102100817B1 (ko) * 2012-01-13 2020-04-17 율리우스-막시밀리안스 우니버지태트 뷔르츠부르크 이중 항원-유도된 이분 기능 상보성
EP3263595A1 (en) 2016-06-30 2018-01-03 Medizinische Hochschule Hannover Fusion protein for use in the treatment of hvg disease
AU2018246143A1 (en) * 2017-03-28 2019-10-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods to protect transplanted tissue from rejection

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018037103A1 (en) * 2016-08-26 2018-03-01 Idogen Ab Procainamide for treating immune disorders and for modulating ido expression
CN112969784A (zh) * 2018-08-31 2021-06-15 伦敦国王学院 工程化调节性t细胞
CN109265550A (zh) * 2018-09-25 2019-01-25 华东师范大学 Bcma抗体、嵌合抗原受体和药物
CN109293773A (zh) * 2018-09-25 2019-02-01 上海邦耀生物科技有限公司 靶向cd38蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D. A. BOARDMAN ET AL.: "Expression of a Chimeric Antigen Receptor Specific for Donor HLA Class I Enhances the Potency of Human Regulatory T Cells in Preventing Human Skin Transplant Rejection", AMERICAN JOURNAL OF TRANSPLANTATION, vol. 17, pages 931 - 943, XP055489070, DOI: 10.1111/ajt.14185 *
N.A. WATKINS ET AL.: "The isolation and characterisation of human monoclonal HLA-A2 antibodies from an immune V gene phage display library", TISSUE ANTIGENS, vol. 55, pages 219 - 228, XP093021440, DOI: 10.1034/j.1399-0039.2000.550305.x *

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