JP2020018317A - ソルタギング可能なタンパク質を有する赤血球のin vitro生成 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づいて、2013年5月10日に出願された米国仮特許出願第61/822,071号明細書に対する優先権を主張するものであり、この仮特許出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
本発明は、国防総省国防高等研究事業局(Defense Advanced Research Projects Agency)(DARPA)からの助成金第HR0011−12−2−0015号の下で、政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
CD34+前駆細胞(例えば、ヒト被験体由来)から成熟脱核赤血球を生成させるためのin vitro培養工程が本明細書に記載される。この培養工程には、複数の分化段階(例えば、2、3、またはそれ以上の段階)および場合によっては分化段階の前の拡大段階が含まれる。本明細書に記載のin vitro培養工程の合計期間は、11〜25日の範囲(例えば、15〜25日、15〜20日、または18〜21日)に及び得る。一例では、合計期間は21日である。
CD34は、細胞表面糖タンパク質であり、細胞間接着因子として機能する。多くのヒト前駆細胞がこの細胞表面マーカーを発現する。Novershtern et al.,Cell 144:296−309,2011。幹細胞のような前駆細胞には、特定の細胞型に分化する傾向がある。前駆細胞は通常、幹細胞よりも特異的であり、多くの場合、標的細胞に分化するように促進される。赤血球に分化する傾向を保有する任意のCD34+前駆細胞型を、本明細書に記載のin vitro培養工程で使用することができる。そのような前駆細胞は当技術分野で周知である。例えば、Novershtern et al.,Cell 144:296−309,2011を参照されたい。一部の例では、本明細書に記載のin vitro培養工程は、脱核赤血球への分化のための前駆細胞として、動員されたCD34+末梢血液細胞を利用する。CD34+前駆細胞は、他の供給源(例えば、骨髄)に由来する場合もある。
場合によっては、本明細書に記載のin vitro培養工程は、CD34+前駆細胞を増殖させる拡大段階を含む。本明細書で使用される場合、拡大または増殖は、細胞数の任意の増加を含む。拡大には、例えば、培養の開始に使用される細胞集団に存在するCD34+細胞の数を超えてCD34+細胞の数が増加することが含まれる。拡大にはまた、既存のCD34+細胞の生存の増大が含まれる。生存という用語は、細胞が生命を保持し続けるかまたは機能し続ける能力を指す。
本明細書に記載のin vitro培養工程には、CD34+前駆細胞が成熟脱核赤血球に分化する、複数の分化段階(2、3、4、またはそれ以上)が含まれる。各分化段階では、CD34+前駆細胞(拡大段階から得られたものかもしくは本来の供給源から収集されたもの)または前の分化段階から得られた細胞を、適切な条件下で適切な期間、1種または複数の適切なサイトカイン(例えば、本明細書に記載のもの)を含む培地中で培養することができる。赤血球形成状態を評価するために、各分化段階の間またはその終了時に、細胞のサイズおよび表面マーカーの発現など細胞の生物学的特性をモニターすることができる。必要な場合はいつでも、最適な赤血球系分化および/または培養中の細胞集団の同期化を達成するように、各分化段階でサイトカインを適時に供給または除去することができる。
ソルタギング可能な表面タンパク質、緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光タンパク質、またはタンパク質性薬物(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント)など、目的の表面タンパク質を発現することができる、遺伝子操作された赤血球を調製する方法も本明細書に記載される。
目的の表面タンパク質を生成させるための発現ベクターを、CD34+前駆細胞に導入することができるが、この前駆細胞は、本来の供給源から単離することも、またはルーチン的な組換え技術により上記の拡大段階から得ることもできる。一部の実例では、発現ベクターは、当技術分野で公知の方法により、相同または非相同組換えによる細胞ゲノムへの組込みができるように設計することができる。CD34+前駆細胞に発現ベクターを導入するための方法としては、以下に限定されるものではないが、ウイルス媒介遺伝子導入、リポソーム媒介導入、形質転換、トランスフェクション、および形質導入、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびヘルペスウイルスなどのDNAウイルスに基づくベクターならびにレトロウイルスベースのベクターの使用などのウイルス媒介遺伝子導入が挙げられる。遺伝子導入方法の例としては、例えば、裸のDNA、CaPO4沈殿、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクター、アジュバント支援DNA、遺伝子銃、カテーテルが挙げられる。一例では、ウイルスベクターが使用される。細胞への非ウイルスベクターの送達を増強するために、核酸またはタンパク質を、細胞表面抗原、例えばCD34に結合する抗体またはその結合フラグメントにコンジュゲートすることができる。ターゲティング抗体またはそのフラグメントをさらに含むリポソームを、本明細書に記載の方法で使用することができる。
一部の実施形態では、CD34+前駆細胞は、赤血球膜タンパク質とペプチド(例えば、膜タンパク質に異種のペプチド)とを含む融合タンパク質などのソルタギング可能な表面タンパク質を発現できるように、本明細書に記載または当技術分野で公知の任意の方法を使用して遺伝子改変することができる。ソルタギング可能な表面タンパク質は、ソルターゼ媒介ペプチド転移反応により、別のペプチドにコンジュゲートすることができる。Strijbis et al.,Traffic 13(6):780−789,2012。好ましくは、ソルタギング可能な表面タンパク質をコードする遺伝子によるCD34+前駆細胞の形質導入は、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを介するものである(例えば、国際公開第94/29438号パンフレット、国際公開第97/21824号パンフレット、および国際公開第97/21825号パンフレットに記載のように)。
ソルタギング可能な表面タンパク質を発現する遺伝子改変細胞(例えば、CD34+前駆細胞または成熟脱核赤血球)は何れも、ソルターゼの存在下で修飾して、目的薬剤を細胞の表面にコンジュゲートさせることができる。これはソルタギングとして知られるプロセスである。本明細書で使用される「ソルタギング」という用語は、ソルターゼ媒介ペプチド転移反応により、標的分子、例えば赤血球の表面上の標的タンパク質に、タグ、例えば成分または分子(例えば、タンパク質、ポリペプチド、検出可能な標識、結合剤、またはクリックケミストリーハンドル)を付加するプロセスを指す。
ソルターゼは、アミド基転移を介してタンパク質のC末端を別のタンパク質のN末端にコンジュゲートさせるペプチド転移反応を行うことができる酵素のファミリーである。ソルターゼは、トランスアミダーゼとも呼ばれ、典型的にはプロテアーゼとペプチド転移活性の両方を示す。原核生物由来の種々のソルターゼが同定されている。例えば、グラム陽性細菌由来の一部のソルターゼは、タンパク質を切断して無傷細胞壁のプロテオグリカン成分に転位置させる。スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)から単離されたソルターゼの中に、ソルターゼA(Srt A)およびソルターゼB(Srt B)がある。そこで、特定の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲーション方法に従って使用されるトランスアミダーゼは、例えば、S.アウレウス(S.aureus)由来で、本明細書でSrtAアウレウスとも呼ばれるソルターゼAである。他の実施形態では、トランスアミダーゼは、例えば、S.アウレウス(S.aureus)由来で、本明細書でSrtBアウレウスとも呼ばれるソルターゼBである。
ソルタギングにより(直接的または間接的に)細胞表面にコンジュゲートさせることができる薬剤は、以下に限定されるものではないが、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、検出可能な標識、結合剤、タグ、金属原子、造影剤、触媒、非ポリペプチドポリマー、合成ポリマー、認識エレメント、脂質、リンカー、または小分子などの化学物質を含む、任意の分子、実体、または成分であり得る。一部の実施形態では、薬剤は、結合剤、例えば、リガンドまたはストレプトアビジン/ビオチンなどのリガンド結合分子および抗体または抗体フラグメントである。
ソルターゼ触媒アシル基転移反応、およびタンパク質工学のためのペプチド転移(場合によってはアシル基転移とも呼ばれる)におけるその使用は、当業者に周知である(例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ploegh et al.、国際公開第2010/087994号パンフレットおよびPloegh et al.、国際公開2011/133704号パンフレットを参照のこと)。一般に、ソルターゼにより触媒されるペプチド転移反応により、C末端ソルターゼ認識モチーフ、例えばLPXTX(配列番号80;Xの各存在は独立して、任意のアミノ酸残基を表わす)を含有する第1のタンパク質がN末端ソルターゼアクセプターペプチド、例えば、1つまたは複数のN末端グリシン残基を含む第2のタンパク質とコンジュゲートする。一部の実施形態では、ソルターゼ認識モチーフは、本明細書に記載のソルターゼ認識モチーフである。特定の実施形態では、ソルターゼ認識モチーフは、LPXT(配列番号50)モチーフまたはLPXTG(配列番号1)である。
遺伝子改変のCD34+前駆細胞、およびこれも記載されるように遺伝子改変することができる脱核赤血球(本明細書に記載のin vitro培養工程から得られるものを含む)は何れも、本開示の範囲内である。
本開示の一部の態様は、赤血球の遺伝子改変およびソルタギングによる表面修飾に有用なキットを提供する。このようなキットは、それぞれが赤血球膜タンパク質と本明細書に記載のペプチドとを含む1つまたは複数の融合タンパク質をコードする1つまたは複数の発現ベクターを含む。キットが記載のように複数の発現ベクターを含む場合、発現ベクターは異なるソルターゼ認識モチーフをコードする配列を含むことができる。一部の実施形態では、異なるソルターゼ認識モチーフは、直交したソルターゼにより認識され、例えば、SrtAアウレウスによりあるモチーフが、SrtAピオゲネスにより別のモチーフが認識される。
CD34+について濃縮されたヒト末梢血G−CSF動員造血幹/前駆細胞を、Fred Hutchinson Cancer Research Center(FHCRC),Seattleから購入する。FHCRCプロトコールに従って、細胞を解凍する。ヒトCD34+(hCD34+)血液細胞は、21日の間に、図1に示され、また以下に記載される4段階:(a)拡大、(b)分化I(「分化I」)、(c)分化II(「分化II」)、および分化III(「分化III」)で構成される方法により、成熟脱核赤血球に分化させた。
RBCは核を欠いており、その成熟段階では遺伝子改変することができない。そこで、赤血球系前駆体を、成熟RBCの形質膜上に保持される、ソルターゼ修飾可能なタンパク質を発現するように遺伝子操作した。この試験では、2つのソルターゼ修飾可能な膜タンパク質、KellおよびグリコフォリンA(GPA)を、赤血球系前駆細胞で発現させた:
(1)血液型抗原Kellは、細胞外に露出したC末端を有するII型膜タンパク質であり、C末端標識化の標的として選択された。
(2)細胞外に配置されたN末端を有するI型膜タンパク質であるGPAは、RBC表面上で最も豊富なタンパク質であり、N末端修飾のために選択された。
(i)プラスミド
ヒト、マウスのグリコフォリンA(GPA)およびKellのコード配列はそれぞれ、NCBI参照配列NM_002099.6、NM_010369.3、およびNM_000420.2から入手した。細胞表面の発現を検出するために、Mycタグコード配列(GAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG;配列番号109)をシグナルペプチドと成熟GPAとの間に挿入した。GPAのN末端にソルターゼタグを結合させるために、5個のグリシン(配列番号3)または3個のグリシンタグコード配列(GGTGGCGGAGGTGGA;配列番号110またはGGTGGCGGA)を、シグナルペプチドの直後に挿入した。完全長の操作されたヒトおよびマウスGPAは、Genscriptにより合成され、次いでMSCVレトロウイルスベクターにクローニングされた。ヒトKellは、Mycタグ(GAACAAAAACTTATTTCTGAAGAAGATCTG;配列番号112)、LPETGG(配列番号107)(CTGCCAGAAACTGGTGGA;配列番号113)、次いでHAエピトープタグ(TACCCATACGACGTCCCAGACTACGCT;配列番号114)のコード配列をそのC末端に伸長してMSCVレトロウイルスベクターにクローニングした。
pET30における、Kcatの改善(1)(P94R、D160N、D165A、K190E、K196T)およびCa2+非依存性活性(Hirakawa et al.,Biotechnol.Bioeng 109(12):2955−2961)(E105K、E108Q)のために突然変異させたスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)Δ59由来のソルターゼAならびにストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)由来のソルターゼAを両方とも、以前に記載のように発現させ精製した。Guimaraes et al.,(2013)Nat Protoc 8(9):1787−1799。pHEN中の、LPETGGHHHHHH(配列番号115)がC末端に伸長したVHH7も、以前に(4)記載のように発現させ精製した。ソルターゼプローブの設計および合成も同様に以前に記載されている。Guimaraes et al.,2013;およびTheile et al.,(2013)Nat.Protoc.8(9):1800−1807。
ビオチンによりGPAのN末端を標識化するために、83mM Tris−HCl pH7.5、250mM NaCl緩衝液中の500μM S.アウレウス(S.aureus)ソルターゼおよび1mM K(ビオチン)LPRTGG(配列番号116)ペプチド30μlを、氷上で15分間プレインキュベートし、(DMEMで前洗浄した)DMEM中の約1×106個の培養細胞(網状赤血球またはHEK293T細胞)または最大5×107個の赤血球(全血10μl)70μlに加えた。VHH7によりGPAのN末端を標識化するために、50mM Tris−HCl pH7.5、150mM NaCl緩衝液中の100μM S.アウレウス(S.aureus)ソルターゼ、100μM VHH−LPETG−His6(配列番号126)50μlを、氷上で15分間プレインキュベートし、DMEM中の最大5×107個の赤血球50μlに加えた。ビオチンによりKellのC末端を標識化するために、83mM Tris−HCl pH7.5、250mM NaCl緩衝液中の500μM S.アウレウス(S.aureus)ソルターゼ、1.4mM GGGK(ビオチン)(配列番号47)ペプチド30μlを、(DMEMで前洗浄した)DMEM中の約1×106個の培養細胞(網状赤血球またはHEK293T細胞)または最大5×107個の赤血球に加えた。すべてのソルターゼと細胞の混合物は、随時緩やかに混合しながら30分間、氷上でインキュベートした。これらの混合物を4℃で2分間、2000RPMで遠心して緩衝液/DMEMを除去し、氷冷PBS1mlで3回洗浄した。GPAとKellの連続した2重標識化のために、83mM TrisHCl、250mM NaCl、16.7mM CaCl2緩衝液中の333μM S.ピオゲネス(S.pyogenes)ソルターゼ、1.33mM K(ビオチン)LPETAA(配列番号45)ペプチド30μlを、37℃で15分間、プレインキュベートし、(DMEMで前洗浄した)DMEM中の1×106個のHEK293T細胞70μlに加え、時々緩やかに混合しながら37℃で25分間インキュベートした。細胞を4℃で2分間、2000RPMで遠心し、氷冷PBS1mlで2回洗浄し、最後に氷冷DMEM70μlに再懸濁した。83mM Tris−HCl pH7.5、250mM NaCl中の333μM S.アウレウス(S.aureus)ソルターゼ、1.67mM GGGK(Alexa647;配列番号117)ペプチド30μlを細胞に加え、時々緩やかに混合しながら氷上で30分間インキュベートした。細胞を氷冷PBS1mlで3回洗浄した。
全血をソルターゼ標識化する場合、赤血球を最初に、塩化アンモニウム溶液(Stemcell Technologies)500μlで、氷上5分間のインキュベーションにより溶解し、4℃で10分間、14000RPMで遠心沈殿させた。PBS500μlで膜を1回洗浄した。コンプリートミニプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット(Roche)を添加した25mM Tris−HCl pH7.5、0.5%NP40、5mM MgCl2、150mM NaCl中で細胞を可溶化し、撹拌し、氷上で10分間インキュベートし、4℃で10分間、14,000RPMで遠心した。上清をSDS試料緩衝液とインキュベートし、8分間煮沸した。SDS−PAGE後、タンパク質をPVDF膜上に転写し、ビオチン(ストレプトアビジン−HRP(GE Healthcare)を使用)、mycタグ(Cell Signaling #2040)、HAタグ(Rosh 3F10)、ヘモグロビン、またはCD19(Cell Signaling #3574)について免疫ブロットした。
ウイルス生成:600万個の293T細胞を分離して、15%ウシ胎仔血清(FBS)および2mM L−グルタミンを添加した抗生物質不含ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Invitrogen)中、トランスフェクションの1日前に10cmプレート上に播種した。0日目に、プラスミド10ugをパッケージングベクター5ugと一緒に、Fugene 6(Promega)を含む、293Tの10cmプレートに加えた。68時間後に、15%FBS、2mM L−グルタミン、および1×Pen Strep(Invitrogen)を添加した新たなDMEMで、古い培地を交換した。1日目に、新鮮なウイルスを含有する上清を回収し、0.45μmフィルター(Millipore)を通して濾過し、その直後に使用してマウス赤血球系前駆細胞に感染させた。GPAおよびKellの発現:HEK293T細胞を10cmディッシュ上に播種し、製造業者(Mirus)の推奨に従い、TransITトランスフェクション試薬を使用して、レトロウイルスベクター中のGn−myc−h/mGPAコンストラクト15μgまたはレトロウイルスベクター中のhKell−LPETG(配列番号44)−HA7.5μgと3G−myc−hGPA7.5μgの両方(連続した2重ソルターゼ標識化用)の何れかでトランスフェクトした。細胞をタンパク質発現について分析し、細胞トランスフェクションの24時間後にソルターゼ標識した。
二酸化炭素による麻酔後、14.5日の妊娠C57BL/6Jマウスを解剖して胎仔を単離した。胎仔肝臓全体を慎重に分離し、2%ウシ胎仔血清(FBS)および100uM EDTAを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れた。粉砕して70μmフィルター(BD)を通して濾過した後、単一胎仔肝細胞懸濁液を得た。胎仔肝細胞懸濁液中の成熟赤血球は、塩化アンモニウム溶液(Stemcell)との10分間インキュベーション後、溶解した。1500RPMで5分間遠心分離することにより有核細胞を回収し、PBS中に再懸濁した。BD Biotin Mouse Lineage Panel(559971)およびBD Streptavidin Particles Plus DM(557812)を使用して、系統陰性胎仔肝細胞を精製したところ、これは、赤血球系前駆細胞について濃縮されていた(90%超)。
精製後、系統陰性胎仔肝細胞を1ml当たり1000万個の細胞濃度に調製した。細胞10μlを、5ug/mlポリブレンを含むウイルス含有上清1mlと共に、24ウェルプレートのそれぞれのウェルに播種した。プレートを37℃で90分間、2000RPMで遠心した。スピン感染の直後に、ウイルス含有上清を吸引し、組換えマウス幹細胞因子(100ng/ml SCF、R&D)、組換えマウスIGF−1(40ng/ml、R&D)、デキサメタゾン(100nM、Sigma)、およびエリスロポエチン(2u/ml、Amgen)を添加した赤血球系維持培地(StemSpan−SFEM(StemCell Technologies))と交換した。翌朝、フローサイトメトリーによりGFP陽性細胞の集団を検査することにより、感染率を調べた。感染率は典型的には95%超であった。次いで、細胞を、15%FBS(Stemcell)、1%無毒化ウシ血清アルブミン(BSA)(Stemcell)、500μg/mLホロ型トランスフェリン(Sigma−Aldrich)、0.5U/mL Epo(Amgen)、10μg/mL組換えヒトインスリン(Sigma−Aldrich)、2mM L−グルタミン(Invitrogen)、および1×Pen Strep(Invitrogen)を含有する、Epoのみの赤血球系分化培地(イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM))中で48時間培養した。
FACSソーティングまたは分析のために、所望の細胞をPBSで1回洗浄し、1μg/mlのPI含有PBS中に、5〜10M/mlの密度で再懸濁した。脱核分析において、最初に、抗マウスTER−119抗体(eBioscience、14〜5921)およびヘキスト(Sigma)により室温で15分間、細胞を染色した。Mycタグ、HAタグの表面発現もしくは標識化、またはビオチン標識化を検出するために、抗Myc抗体(Cell signalling、3739)、抗HA抗体(Thermo Fisher Scientific、NC9843881)、または抗ビオチン抗体(eBioscience、12−9895−82)でそれぞれ、室温で30分間、細胞を染色した。
C57BL/6Jマウス由来の大腿骨および脛骨中の骨髄を、23G注射針を使用して単離し、15%ウシ胎仔血清、2mM L−グルタミン(Invitrogen)、1×Pen/Strep(Invitrogen)、20ng/ml IL−3(Peprotech)、50ng/ml SCF(Peprotech)、および50ng/ml IL−6(Peprotech)を添加したDMEM中で18時間、2×106細胞/mlの密度で6ウェルプレートにて培養した。レトロウイルス含有培地500μl、DMEM500μl、5μg/mlポリブレン中で4×106個の細胞をインキュベートし、室温で1.5時間、2500RPMで細胞を遠心し、さらにCO2インキュベーター中で5時間細胞をインキュベートすることにより、細胞を感染させた。上記のIL−3/SCF/IL−6添加培地に細胞を戻して、さらに16時間インキュベートした。
B6.SJL−Ptprca Pep3b/BoyJマウス(The Jackson Lab)を、移植1日前に、Gammacell 40照射器チャンバー中で、1050cGyの全身照射に供した。マウス胎仔肝細胞を採取し、上記のように調製した。レトロウイルス感染後、細胞を赤血球系維持培地で18時間培養した。あるいは、マウス骨髄細胞を採取し、上記のようにレトロウイルス形質導入した。次いで、感染細胞を滅菌PBSで2回洗浄し、2〜5百万個の細胞/mLで滅菌PBS中に再懸濁した。次いで、これらのマウス幹細胞および前駆細胞100μlを、致死的照射を受けたマウスに後眼窩注射した。4週目から開始して、分析およびソルタギングのために照射マウスから成熟赤血球を抜き取った。
成熟赤血球およびin vitroで分化した網状赤血球をビオチンでソルタギングした後、冷1×PBSで2回洗浄した。50,000個のソートされたビオチン化成熟赤血球またはソートされていないin vitroで分化した網状赤血球を、400rpmで5分間、ポリ‐L‐リジンコーティングされたスライド上で遠心分離した(Cytospin 3、Thermo Shandon)。試料を風乾し、室温で30分間、4%パラホルムアルデヒドで固定し、ブロッキング緩衝液(PBS中2%BSA+2%ロバ血清)中で1時間ブロックした。次いで、細胞を、ブロッキング緩衝液中で、一次抗体:PEコンジュゲート抗ビオチン(1:1000、eBioscience、12−9895−82)およびAPCコンジュゲート抗Ter119(1:100、eBioscience、14−5921)と4℃で一晩インキュベートした後、冷1×PBSで3回洗浄した。最後に、すべての免疫染色実験において、DAPI(Prolong Gold Antifade,Invitrogen)を含有するマウンティング培地で細胞をマウントして、核を視覚化した。視覚化は、Zeiss LSM 700レーザスキャン共焦点顕微鏡を使用して行った。
成熟RBCをソルタギングした後、1×PBSで2回洗浄し、RPMI培地中に再懸濁した。これらのソルタギングされたRBCを、1500rpmで5分間遠心分離することにより回収し、ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中の5μM CFSEを用いて、8分間標識した(Life Technologies)。次いで、HBSS中の10%FBSを等量加えて反応をクエンチした。RBCを洗浄し、カウントし、注射のために滅菌HBSS中に再懸濁した。次いで、25億個のCFSE標識化RBC(±300μlマウス血液)を、レシピエントCD45.1+マウスに静脈内注射した。正常RBCを対照として用いた。RBCの20〜50%のみが、操作されたhGPAまたはhKellを発現したため、RBCの残りは正常なものであり、CFSEシグナルをモニターすることにより内部標準として用いた。移入の1時間後に、最初の血液試料(20μl)を後眼窩から採取し、0日目として標記した。その後同量の血液試料を1、4、および7日目等に、28日目まで採取した。フローサイトメトリー分析中に、ビオチンを連結したeRBCが強力なPEシグナルを示すように、PEがコンジュゲートした抗ビオチン抗体(ebioscience)で血液試料を染色した。しかしながら、hKell−ビオチンを有するRBCは、PEがコンジュゲートした抗ビオチン抗体による染色後、極めて低い赤色蛍光強度しか示さなかった。CFSE由来の強力な緑色蛍光シグナルの存在下でその赤色蛍光を検出することは困難であった。hKell−RBCをビオチンでソルタギングし、CFSE染色なしでマウスに移入した。hKell−RBCを、その固有のGFPシグナルおよびPEがコンジュゲートした抗ビオチン抗体からの弱いPEシグナルによりモニターした。対照RBCおよびhGPA−RBCを、2回の別々の時に合計6匹のマウスに移入した。hKell−RBCは合計3匹のマウスに移入し、理由は不明であるが一匹が死亡した。
(I)遺伝子改変されたI型膜タンパク質ヒトグリコフォリンA(GPA)は、RBC表面上に発現され、ソルターゼ標識化された。
(a)RBC上のソルタギング可能なヒトグリコフォリン(hGPA)の発現
融合タンパク質5Gly(配列番号3)−myc−hGYPAおよび3Gly−myc−hGYPAの発現カセットは、図10に示すように、2つのレンチウイルスベクターEF1およびMSCV(System Biosciences,Inc.)に挿入された。両方のベクターとも、レポート遺伝子としてGFPを担持する。融合タンパク質を発現する、得られたレンチウイルスベクターは、分化Iの開始時にヒトCD34+細胞に形質導入された。
hGYPAをソルタギングするために、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)の300μMソルターゼAおよび500μMビオチン−LPRTGG(配列番号118)を、37℃で30分間、ソルターゼ緩衝液中でプレインキュベートした。次いで、ソルタギング可能なhGYPA(5Gly(配列番号3)−myc−hGYPAまたは3Gly−myc−hGYPA)を発現する100万個の赤血球を、ソルターゼ−基質混合物と37℃で1時間インキュベートした。細胞をPBSで3〜4回洗浄した後、フローサイトメトリーまたはウエスタンブロッティングにより、ビオチンコンジュゲーションを検出した。標識率は通常80〜100%である。
グリシン残基による、GPA(GPA)のN末端の伸長は、GPAを適切なソルターゼ基質にするために必要とされる最小の修飾であった。修飾バージョンでは、N末端シグナル配列が保持され、その後にグリシン残基およびmycエピトープタグが続いた。シグナルペプチドの切断により、(Gly)n−mycタグ−GPAが得られることになる。修飾GPAを担持する細胞をスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)由来のソルターゼAおよびLPETG(配列番号44)ベースのプローブとインキュベートすると、このプローブがGPAのN末端にコンジュゲートする。
ルーチン的な組換え技術により、表面融合タンパク質hsCD71−LPETG(配列番号44)−HAおよびhsKell−LPETG(配列番号44)−HAを生成するための発現ベクターをHEK293T細胞にトランスフェクトした。融合タンパク質を発現する安定な細胞株が確立された。200μMソルターゼ、0.5mMまたは1mM GGG−ビオチンと細胞をインキュベートし、ウエスタンブロッティング分析に供した。この結果から、ビオチンの融合タンパク質へのコンジュゲーションが成功したことが示される。
別々の基質特異性を有するソルターゼを使用し、N末端標識化とC末端標識化の戦略を組み合わせて、多重標識化RBCを生成させることが可能である(Antos et al.,2009,J.Ameri.Chem.Soc.,131(31):10800−10801)。スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)由来のソルターゼAと異なり、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)由来のソルターゼAは、LPXTA(配列番号2)モチーフを認識し、求核試薬としてオリゴアラニンプローブを受容する。したがって、両酵素のソルターゼ反応は、直交した反応として行なうことができる。
ソルターゼとのインキュベーション、遠心分離、および洗浄を含む、RBCをソルタギングする工程が、RBCのin vivoでの生存に影響を与えるか否かを評価するために、野生型RBCおよびソルターゼの存在下または非存在下(プローブのコンジュゲーションはない)で、模擬C末端ソルタギング反応を受けた野生型RBCを、生細胞のサイトゾルを安定的に染色する蛍光色素であるCFSEで標識化した。次いで、RBCを正常なレシピエントマウスに移入し、血液循環での細胞生存を、CFSE蛍光を使用して定期的に評価した。実験群間の差は、RBCのin vivo生存では観察されず(図24A)、ソルタギング手順により、細胞が早発に除去されることになる顕著な損傷が細胞にもたらされないことが示された。
修飾RBCの有望な1つの用途は、特定の組織型または細胞型へのその送達を可能にするターゲティング成分(および結合したまたは組み込まれたペイロード)をそれに装着させることである。このようなターゲティングは、目的標的の特異的認識に関与することができる、特定の受容体のリガンドなど、タンパク質または他の実体の設置により行うことができる。
本明細書に記載の方法の有用性を拡張するために、赤血球系前駆細胞の修飾およびその後のソルターゼ媒介細胞表面標識化がヒト細胞についても実行可能であるか否かを検討した。
相同組換え修復(HDR)を刺激するCRISPR/Cas9依存性二本鎖切断のためのsgRNA配列を、表5のように、mKel遺伝子座の最後のエキソン上に設計し、LPETG(配列番号44)をmKelのC末端に導入するための鋳型としてオリゴDNAを表6のように設計した。
本明細書に開示の特徴はすべて、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示の特徴はそれぞれ、同一、均等、または同様の目的に役立つ別の特徴に置き換えることができる。したがって、明示的に他に記載がない限り、開示されるそれぞれの特徴は、一般的な一連の均等または同様の特徴の一例にすぎない。
Claims (1)
- 第1の目的ペプチドと第1の赤血球膜タンパク質とを含む第1の融合タンパク質を表面上に発現することを特徴とする遺伝子操作された脱核血液細胞。
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EP3583202A1 (en) | 2017-02-17 | 2019-12-25 | Rubius Therapeutics, Inc. | Functionalized erythroid cells |
WO2018165504A1 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
KR20190127797A (ko) | 2017-03-10 | 2019-11-13 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 시토신에서 구아닌으로의 염기 편집제 |
CA3057192A1 (en) | 2017-03-23 | 2018-09-27 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins |
US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
EP3654991A1 (en) * | 2017-07-19 | 2020-05-27 | Rubius Therapeutics, Inc. | Compositions and methods related to multimodal therapeutic cell systems for infectious disease |
US20200172867A1 (en) * | 2017-07-19 | 2020-06-04 | Rubius Therapeutics, Inc. | Compositions and methods related to multimodal therapeutic cell systems for cardiometabolic disease |
US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
US10960071B2 (en) | 2017-08-07 | 2021-03-30 | The Regents Of The University Of California | Platform for generating safe cell therapeutics |
KR20200037353A (ko) * | 2017-08-07 | 2020-04-08 | 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 안전한 세포 치료제를 생성하기 위한 플랫폼 |
WO2019040516A1 (en) | 2017-08-22 | 2019-02-28 | Rubius Therapeutics, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS OF LIPID NANOPARTICLES FOR THE PRODUCTION OF MODIFIED ERYTHROID CELLS |
US20200206269A1 (en) * | 2017-08-23 | 2020-07-02 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Production of enucleated red blood cells and uses thereof |
US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
CA3082251A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
US20190160102A1 (en) | 2017-11-03 | 2019-05-30 | Rubius Therapeutics, Inc. | Compositions and methods related to therapeutic cell systems for tumor growth inhibition |
SG11202005203UA (en) * | 2017-12-23 | 2020-07-29 | Rubius Therapeutics Inc | Artificial antigen presenting cells and methods of use |
WO2019133881A1 (en) | 2017-12-29 | 2019-07-04 | Rubius Therapeutics, Inc. | Gene editing and targeted transcriptional modulation for enginerering erythroid cells |
WO2019140116A2 (en) | 2018-01-10 | 2019-07-18 | Rubius Therapeutics, Inc. | Amplifiable rnas for therapeutic cell systems |
RU2020132924A (ru) | 2018-03-08 | 2022-04-11 | Рубиус Терапьютикс, Инк. | Терапевтические клеточные системы и способы лечения рака и инфекционных заболеваний |
JP2022513705A (ja) * | 2018-12-03 | 2022-02-09 | ルビウス セラピューティクス, インコーポレイテッド | Hla-eおよびhla-g分子を含む人工抗原提示細胞、ならびに使用の方法 |
SG11202109073VA (en) | 2019-02-20 | 2021-09-29 | Rubius Therapeutics Inc | Engineered erythroid cells including loadable antigen-presenting polypeptides and methods of use |
MX2021011426A (es) | 2019-03-19 | 2022-03-11 | Broad Inst Inc | Metodos y composiciones para editar secuencias de nucleótidos. |
JP2022530130A (ja) | 2019-04-26 | 2022-06-27 | ルビウス セラピューティクス, インコーポレイテッド | 除核赤血球細胞を含む緩衝組成物 |
CA3141315A1 (en) | 2019-05-24 | 2020-12-03 | Rubius Therapeutics, Inc. | Methods of generating enucleated erythroid cells |
CN115038784A (zh) | 2019-11-04 | 2022-09-09 | 鲁比厄斯治疗法股份有限公司 | 使用肌-肌醇产生去核红系细胞的方法 |
WO2021092047A1 (en) | 2019-11-04 | 2021-05-14 | Rubius Therapeutics, Inc. | Methods of generating enucleated erythroid cells using taurine or hypotaurine |
KR20220140542A (ko) * | 2020-02-07 | 2022-10-18 | 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 제핵 세포의 생체공학적 제조를 위한 방법 및 용도 |
WO2021162731A1 (en) | 2020-02-10 | 2021-08-19 | Rubius Therapeutics, Inc. | Engineered erythroid cells including hla-g polypeptides and methods of use thereof |
WO2021185360A1 (en) * | 2020-03-20 | 2021-09-23 | Westlake Therapeutics (Hangzhou) Co., Limited | Novel truncated sortase variants |
IL297761A (en) | 2020-05-08 | 2022-12-01 | Broad Inst Inc | Methods and compositions for simultaneously editing two helices of a designated double-helix nucleotide sequence |
US20230226218A1 (en) | 2020-05-11 | 2023-07-20 | Erytech Pharma | Red Cell Extracellular Vesicles (RCEVs) Containing Cargoes and Methods of Use and Production Thereof |
CN116547000A (zh) * | 2020-10-30 | 2023-08-04 | 西湖生物医药科技(杭州)有限公司 | 经修饰的红细胞及其在递送活性剂中的用途 |
IL302728A (en) | 2020-11-13 | 2023-07-01 | Catamaran Bio Inc | Genetically modified natural killer cells and methods of using them |
TW202241471A (zh) | 2021-01-08 | 2022-11-01 | 美商盧比亞斯治療公司 | 提高個體中NKp30陽性淋巴球的方法及其用途 |
TW202241470A (zh) | 2021-01-08 | 2022-11-01 | 美商盧比亞斯治療公司 | 治療人類個體腫瘤之方法 |
US20240110153A1 (en) * | 2021-01-29 | 2024-04-04 | National University Of Singapore | Surface Modified Red Blood Cells And Methods Of Generating The Same |
CN116888258A (zh) * | 2021-02-04 | 2023-10-13 | 西湖生物医药科技(杭州)有限公司 | 修饰的红细胞及其治疗高尿酸血症和痛风的用途 |
TW202304482A (zh) | 2021-03-14 | 2023-02-01 | 美商盧比亞斯治療公司 | 於個體中增加nkg2d陽性淋巴球之方法及其用途 |
CN117202894A (zh) | 2021-03-31 | 2023-12-08 | 胭脂红治疗私人有限公司 | 负载至少两个不同核酸的细胞外囊泡 |
TW202317179A (zh) | 2021-06-03 | 2023-05-01 | 美商盧比亞斯治療公司 | 在個體中治療hpv16-陽性或hpv16-相關的癌症之方法 |
WO2023284742A1 (en) * | 2021-07-13 | 2023-01-19 | Westlake Therapeutics (Hangzhou) Co. Limited | Cells modified by conjugated n-terminal glycine and uses thereof |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8211656B2 (en) * | 2008-08-13 | 2012-07-03 | The Invention Science Fund I, Llc | Biological targeting compositions and methods of using the same |
WO2013003555A1 (en) * | 2011-06-28 | 2013-01-03 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Using sortases to install click chemistry handles for protein ligation |
Family Cites Families (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5834256A (en) | 1993-06-11 | 1998-11-10 | Cell Genesys, Inc. | Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells |
US5670132A (en) | 1994-09-20 | 1997-09-23 | Immunomedics, Inc. | Modified radioantibody fragments for reduced renal uptake |
US5728369A (en) | 1994-10-05 | 1998-03-17 | Immunomedics, Inc. | Radioactive phosphorus labeling of proteins for targeted radiotherapy |
WO1997021824A2 (en) | 1995-12-15 | 1997-06-19 | Systemix, Inc. | Method for obtaining retroviral vector supernatant having high transduction efficiency |
US5910434A (en) | 1995-12-15 | 1999-06-08 | Systemix, Inc. | Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant |
CA2365523A1 (en) | 1999-04-15 | 2000-10-26 | The Regents Of The University Of California | Identification of sortase gene |
AU2002218751A1 (en) | 2000-07-06 | 2002-01-21 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Stable radiopharmaceutical compositions |
JP4511943B2 (ja) | 2002-12-23 | 2010-07-28 | ワイス エルエルシー | Pd−1に対する抗体およびその使用 |
US6960473B2 (en) * | 2003-02-27 | 2005-11-01 | Istituto Superiore Di Sanita | In vitro mass production of human erythroid cells from the blood of normal donors and thalassemic patients |
WO2005051976A2 (en) | 2003-11-20 | 2005-06-09 | Ansata Therapeutics, Inc. | Protein and peptide ligation processes and one-step purification processes |
US20090098611A1 (en) | 2004-02-27 | 2009-04-16 | Wood David W | Self-cleaving affinity tags and methods of use |
US8206979B2 (en) * | 2004-06-04 | 2012-06-26 | Universite Pierre et Marie Curie — Paris VI | Method for producing red blood cells |
DK2170959T3 (da) | 2007-06-18 | 2014-01-13 | Merck Sharp & Dohme | Antistoffer mod human programmeret dødsreceptor pd-1 |
EP2185188B1 (en) | 2007-08-22 | 2014-08-06 | Medarex, L.L.C. | Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions |
US20110159023A1 (en) | 2008-08-25 | 2011-06-30 | Solomon Langermann | Pd-1 antagonists and methods for treating infectious disease |
NZ591130A (en) | 2008-08-25 | 2012-09-28 | Amplimmune Inc | Compositions comprising a PD-1 antagonists and cyclophosphamide and methods of use thereof |
US20100092470A1 (en) | 2008-09-22 | 2010-04-15 | Icb International, Inc. | Antibodies, analogs and uses thereof |
JP2010115136A (ja) * | 2008-11-12 | 2010-05-27 | Teruyuki Nagamune | N末端標識膜蛋白質の作製方法、及びn末端標識膜蛋白質を表層に有する細胞 |
WO2010078376A2 (en) | 2008-12-30 | 2010-07-08 | Ventana Medical Systems, Inc. | Fc-specific polymer-conjugated antibodies and their diagnostic use |
WO2010087994A2 (en) | 2009-01-30 | 2010-08-05 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods for ligation and uses thereof |
JP5844159B2 (ja) | 2009-02-09 | 2016-01-13 | ユニヴェルシテ デクス−マルセイユUniversite D’Aix−Marseille | Pd−1抗体およびpd−l1抗体ならびにその使用 |
CN102933231B (zh) | 2010-02-10 | 2015-07-29 | 伊缪诺金公司 | Cd20抗体及其用途 |
BR112012020958A2 (pt) * | 2010-02-22 | 2015-09-15 | Univ Paris Curie | "meio de cultura para a criação e/ou diferenciação de células da linhagem hemapo |
JP5920929B2 (ja) | 2010-03-11 | 2016-05-18 | ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム | Pd−1抗体 |
US20130122043A1 (en) | 2010-04-20 | 2013-05-16 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Modified polypeptides and proteins and uses thereof |
WO2012142659A1 (en) | 2011-04-19 | 2012-10-26 | Baker Idi Heart And Diabetes Institute Holdings Limited | Site-selective modification of proteins |
EP2822957A1 (en) | 2012-03-07 | 2015-01-14 | Aurigene Discovery Technologies Limited | Peptidomimetic compounds as immunomodulators |
US9751945B2 (en) | 2012-04-13 | 2017-09-05 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Sortase-modified VHH domains and uses thereof |
US20140030697A1 (en) | 2012-06-14 | 2014-01-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Sortase-mediated modification of viral surface proteins |
US9267127B2 (en) | 2012-06-21 | 2016-02-23 | President And Fellows Of Harvard College | Evolution of bond-forming enzymes |
US9511350B2 (en) | 2013-05-10 | 2016-12-06 | Clean Diesel Technologies, Inc. (Cdti) | ZPGM Diesel Oxidation Catalysts and methods of making and using same |
WO2014183066A2 (en) | 2013-05-10 | 2014-11-13 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Protein modification of living cells using sortase |
US10471099B2 (en) | 2013-05-10 | 2019-11-12 | Whitehead Institute For Biomedical Research | In vitro production of red blood cells with proteins comprising sortase recognition motifs |
EP2997135B1 (en) | 2013-05-15 | 2020-04-29 | University Of Rochester | Human extensively self-renewing erythroblasts (esre) |
US9878045B2 (en) | 2013-10-15 | 2018-01-30 | Regents Of The University Of Minnesota | Triorthogonal reagents for dual protein conjugation |
WO2015073746A2 (en) | 2013-11-13 | 2015-05-21 | Whitehead Institute For Biomedical Research | 18f labeling of proteins using sortases |
US10053683B2 (en) | 2014-10-03 | 2018-08-21 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Intercellular labeling of ligand-receptor interactions |
US20180135012A1 (en) | 2015-05-13 | 2018-05-17 | Rubius Therapeutics, Inc. | Membrane-receiver complex therapeutics |
EP4218833A1 (en) | 2015-10-01 | 2023-08-02 | Whitehead Institute for Biomedical Research | Labeling of antibodies |
US20200206269A1 (en) | 2017-08-23 | 2020-07-02 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Production of enucleated red blood cells and uses thereof |
CA3141315A1 (en) * | 2019-05-24 | 2020-12-03 | Rubius Therapeutics, Inc. | Methods of generating enucleated erythroid cells |
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-
2021
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8211656B2 (en) * | 2008-08-13 | 2012-07-03 | The Invention Science Fund I, Llc | Biological targeting compositions and methods of using the same |
WO2013003555A1 (en) * | 2011-06-28 | 2013-01-03 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Using sortases to install click chemistry handles for protein ligation |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
CHEM. COMMUN., 2009, PP.1022-1024, DOI: 10.1039/B818792D, JPN6018015653, ISSN: 0004379154 * |
CHEMBIOCHEM, 2008, VOL.9, PP.802-807, JPN6018015650, ISSN: 0004379153 * |
EXPERT OPINION ON DRUG DELIVERY, 2010, VOL.7, NO.4, PP.403-427, vol. doi: 10.1517/17425241003610633., JPN6018015648, ISSN: 0004379156 * |
NATURE CHEMICAL BIOLOGY, 2007, VOL.3, NO.11, PP.707-708, JPN6018015654, ISSN: 0004379155 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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