JP2016509864A - インフルエンザｂ型ウイルス再集合 - Google Patents

Abstract

再集合体インフルエンザＢ型ウイルスの生成のための新しいインフルエンザドナー株が提供される。本発明はまた、第一のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＨＡセグメントおよびＢ／Ｌｅｅ／４０またはＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６またはＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０ではない第二のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＮＰセグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスも提供する。例えば、再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは、配列番号３３、３８、３９または４３の配列を有さないＮＰセグメントを有し得る。

Description

Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ（ＢＡＲＤＡ）により授与された助成金番号ＨＨＳＯ１００２０１０００６１Ｃの下で政府支援によって一部本発明はなされた。政府は本発明における特定の権利を有する。
本出願は、２０１３年３月１３日に出願された米国仮出願第６１／７７９，８８８号の利益を請求し、その完全な内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。

本発明は、インフルエンザＢ型ウイルス再集合の分野に属する。さらに、本発明は、インフルエンザＢ型ウイルスに対して防御するためのワクチンの製造に関する。

インフルエンザ感染に対する最も効率的な防御は、循環株に対するワクチン接種であり、ワクチン生産のためのインフルエンザウイルスをできるだけ迅速に生成することが重要である。

野生型インフルエンザウイルスは、しばしば卵および細胞培養物中で低い力価に増殖する。ワクチン生産用のより良好に増殖するウイルス株を得るために、循環ワクチン株をより速く増殖する高収量のドナー株と再集合させることが可能である。これは、培養宿主を循環インフルエンザ株と高収量ドナー株に共感染させ、ワクチン株からの赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）セグメントならびにドナー株からのその他のウイルスセグメント（すなわちＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ_１、Ｍ_２、ＮＳ_１およびＮＳ_２をコードするセグメント）を含む再集合体ウイルスを選択することによって達成できる。別のアプローチは、逆遺伝学によってインフルエンザウイルスを再集合させることである（例えば参考文献１および２参照）。

ワクチン生産において再集合体インフルエンザＡ型株を使用することは一般的な慣例であるが、再集合体インフルエンザＢ型株は、野生型インフルエンザＢ型ウイルスが通常、卵中で十分な収量を提供するため、通常は使用されない。さらに、野生型インフルエンザＢ型ウイルスは、再集合体インフルエンザＢ型ウイルスに比べて増殖上の利点を有することが報告されている（例えば参考文献３参照）。その結果、高増殖のインフルエンザＢ型再集合体は、少数の新しいインフルエンザＢ型ウイルスのためにのみ作製されてきた。これらの再集合体は、典型的にはＢ／Ｌｅｅ／４０、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８およびＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０に由来する骨格遺伝子セグメントの混合物を含む（４、５）。
現在まで、２種の再集合体インフルエンザＢ型ウイルス（ＢＸ−３５およびＢＸ−３９）だけが商業的ワクチン製造のために使用されている。ＢＸ−３５は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８株由来のＨＡセグメント、ＮＡセグメント、ＰＡセグメント、ＰＢ１セグメントおよびＮＳセグメント、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０由来のＰＢ２セグメントおよびＭセグメント、ならびにＢ／Ｌｅｅ／４０由来のＮＰセグメントを含む。ＢＸ−３９は、循環Ｂ／Ｈｕｂｅｉ−Ｗｕｊｉａｇａｎｇ／１５９／０８株由来のＨＡセグメント、ＮＡセグメント、ＰＢＩセグメントおよびＭセグメント、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０由来のＰＡセグメントおよびＮＳセグメント、ならびにＢ／Ｌｅｅ／４０由来のＰＢ２セグメントおよびＮＰセグメントを含む（６、７）。

国際公開第２００７／００２００８号 国際公開第２００７／１２４３２７号

Ｇｏｏｄｅｖｅ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ． ８３（３−４）：１６９−７９． Ａｕｄｓｌｅｙ， Ｊ ２００７， Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｉｒｕｓｅｓ， ＰｈＤ Ｔｈｅｓｉｓ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＲＭＩＴ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．

現在、ワクチン製造用にインフルエンザＢ型ウイルスを再集合させるためのドナー株は限られた数しか存在せず、公知の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは必ずしも親株より良好に増殖するとは限らない。したがって、インフルエンザＢ型ウイルス再集合のためのさらなる改善されたドナー株を提供することが当分野において求められている。

本発明は、したがって、ＨＡセグメントが由来する、対応する野生型インフルエンザＢ型ウイルスと比較して、培養宿主中（特に細胞培養物中）で同じ速度またはより速く増殖することができる再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを提供する。例えば、本発明者らは、驚くべきことに、第一のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＨＡセグメントならびにＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株である第二のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＮＰセグメントおよび／またはＰＢ２セグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスが、細胞培養物および卵中で特に良好に増殖することを発見した。Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８であり得る。

本発明はまた、第一のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＨＡセグメントおよびＢ／Ｌｅｅ／４０またはＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６またはＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０ではない第二のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＮＰセグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスも提供する。例えば、再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは、配列番号３３、３８、３９または４３の配列を有さないＮＰセグメントを有し得る。再集合体インフルエンザＢ型ウイルスはまた、配列番号１９、２３、４４または４５のタンパク質をコードしないＮＰセグメントを有し得る。本発明者らは、Ｂ／Ｌｅｅ／４０またはＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６またはＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０以外のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＮＰセグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスが、培養宿主中で非常に良好に増殖できることを発見した。再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは、第二のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＮＰセグメントおよびＰＢ２セグメントの両方を含み得る。第二のインフルエンザＢ型ウイルスは、好ましくはＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株である。Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８であり得る。

本発明者らはまた、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来のＨＡセグメントおよびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来の少なくとも１つの骨格セグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスが、培養宿主中で良好に増殖できることを発見した。再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来の２、３、４、５または６個の骨格セグメントを含み得る。好ましい実施形態では、再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来のすべての骨格セグメントを含む。Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８であり得る。

本発明はまた、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来のウイルスセグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスも提供し、ここでＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来のセグメントとＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来のセグメントとの比は、１：７、２：６、３：５、４：４、５：３、６：２または７：１である。７：１、６：２、４：４、３：５または１：７の比、特に４：４の比が好ましく、というのは、そのような再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは培養宿主中で特に良好に増殖するからである。Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８であり得る。Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株は、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０であり得る。これらの実施形態では、再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは通常、同じインフルエンザＢ型ドナー株由来のすべての骨格セグメントを含むとは限らない。

以下を含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスも提供される：
ａ）配列番号１１のＰＡセグメント、配列番号１２のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号１６のＮＳセグメントおよび配列番号１５のＭセグメント；または
ｂ）配列番号１１のＰＡセグメント、配列番号３１のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント；または
ｃ）配列番号１１のＰＡセグメント、配列番号３１のＰＢ１セグメント、配列番号３２のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号１６のＮＳセグメントおよび配列番号１５のＭセグメント；または
ｄ）配列番号３０のＰＡセグメント、配列番号１２のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号１６のＮＳセグメントおよび配列番号１５のＭセグメント；または
ｅ）配列番号１１のＰＡセグメント、配列番号１２のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント；または
ｆ）配列番号３０のＰＡセグメント、配列番号３１のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号３３のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント；または
ｇ）配列番号３０のＰＡセグメント、配列番号３１のＰＢ１セグメント、配列番号３２のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント；または
ｈ）配列番号１１のＰＡセグメント、配列番号１２のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号３３のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント；または
ｉ）配列番号１１のＰＡセグメント、配列番号１２のＰＢ１セグメント、配列番号３２のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント；または
ｊ）配列番号３０のＰＡセグメント、配列番号１２のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント；または
ｋ）配列番号３０のＰＡセグメント、配列番号３１のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント。

これらの再集合体インフルエンザＢ型ウイルスにおいて、ＨＡセグメントおよびＮＡセグメントは任意のインフルエンザＢ型株に由来し得る。

上記（ａ）から（ｋ）の項で論じたセグメントの組合せを有する再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは、本発明者らが、これらが培養宿主中で特に良好に増殖することを示したことから、好ましい。（ａ）、（ｂ）および（ｅ）項の再集合体インフルエンザＢ型株は、培養宿主中で特に良好に増殖し、それゆえ特に好ましい。

本発明はまた、上記（ａ）から（ｋ）の項で同定されたウイルスセグメントに少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有するウイルスセグメントを含む、これらの項で同定された再集合体インフルエンザＢ型ウイルスのバリアントも提供する。そのようなバリアントは、好ましくは、培養宿主中で、バリアントが由来する再集合体インフルエンザＢ型株を用いて同じ時間および同じ増殖条件下で達成されるウイルス力価の３％以内のウイルス力価に増殖することができる。

本発明は、本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを調製する方法を提供する。これらの方法は、（ｉ）本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを生成するのに必要なウイルスセグメントをコードする１つまたはそれより多くの発現構築物を培養宿主に導入するステップ、および（ｉｉ）再集合体ウイルスを産生させるために培養宿主を培養するステップ、および必要に応じて（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得たウイルスを精製するステップを含む。

これらの方法は、（ｉｖ）培養宿主をステップ（ｉｉ）またはステップ（ｉｉｉ）で得たウイルスに感染させるステップ、（ｖ）さらなるウイルスを産生させるためにステップ（ｉｖ）からの培養宿主を培養するステップ、および必要に応じて（ｖｉ）ステップ（ｖ）で得たウイルスを精製するステップをさらに含み得る。

本発明の方法において使用できる発現構築物も提供される。

例えば、発現構築物(複数可)は、第一のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＨＡセグメントならびにＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株である第二のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＮＰセグメントおよび／またはＰＢ２セグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスをコードし得る。ＮＰセグメントおよびＰＢ２セグメントは、どちらもＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来であり得る。Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株は、好ましくはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８である。

発現構築物(複数可)はまた、第一のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＨＡセグメントおよびＢ／Ｌｅｅ／４０またはＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６またはＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０ではない第二のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＮＰセグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスをコードし得る。例えば、発現構築物(複数可)は、配列番号１９、２３、４４または４５の配列を有するＮＰセグメントをコードしなくてよい。ＮＰセグメントおよびＰＢ２セグメントは、どちらも第二のインフルエンザＢ型ウイルス由来であり得る。第二のインフルエンザＢ型ウイルスは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株であり得、好ましくはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８である。

「第一のインフルエンザウイルス」と「第二のインフルエンザウイルス」は互いに異なる。

発現構築物(複数可)は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来のウイルスセグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスをコードすることができ、ここでＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来のセグメントとＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来のセグメントとの比は、１：７、２：６、３：５、４：４、５：３、６：２または７：１である。７：１、６：２、４：４、３：５または１：７の比、特に４：４の比が好ましい。Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８であり得る。Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株は、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０であり得る。

上述した再集合体インフルエンザＢ型ウイルスをコードする発現構築物(複数可)も提供される。

本発明は、本発明の１つまたはそれより多くの発現構築物を含む発現系を提供する。本発明はまた、本発明の発現系を含む宿主細胞も提供する。これらの宿主細胞は、発現系中で発現構築物(複数可)からインフルエンザＢ型ウイルスを発現することができる。

本発明はまた、（ａ）培養宿主を本発明の再集合体ウイルスに感染させるステップ；（ｂ）ウイルスを産生させるためにステップ（ａ）からの宿主を培養するステップ；および必要に応じて（ｃ）ステップ（ｂ）で得たウイルスを精製するステップを含む、インフルエンザウイルスを生成するための方法も提供する。

本発明はまた、（ａ）上述した実施形態のいずれか１つの方法によってウイルスを調製するステップおよび（ｂ）ウイルスからワクチンを調製するステップを含む、ワクチンを調製する方法も提供する。

本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスからワクチンを調製する方法も提供される。

本発明はまた、本発明の方法によって得ることができるワクチンも提供する。

再集合体ウイルス
本発明の再集合体インフルエンザＢ型株は、ワクチン株および１つまたそれより多くのドナー株由来のウイルスセグメントを含む。ワクチン株は、再集合体インフルエンザＢ型株のＨＡセグメントを提供するインフルエンザ株である。ワクチン株は任意の株であってよく、また季節ごとに異なり得る。

ドナー株は、インフルエンザＢ型株の骨格セグメント（すなわちＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ_１、Ｍ_２、ＮＳ_１およびＮＳ_２をコードするセグメント）の１つまたはそれより多くを提供するインフルエンザＢ型株である。ＮＡセグメントは、ドナー株によって提供されてもよく、またはワクチン株によって提供されてもよい。本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスはまた、ワクチン株由来の骨格セグメントの、全部ではないが、１つまたはそれより多くを含み得る。再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは合計８個のセグメントを含むので、それゆえワクチン株由来のｘ個（ここでｘは１〜７である）のウイルスセグメントおよび１つまたそれより多くのドナー株由来の（８−ｘ）個のウイルスセグメントを含む。

上述したように、本発明の目的は、ひとたび救済されると、培養宿主中でより高いまたは同様のウイルス力価まで増殖することができる再集合体インフルエンザＢ型株を提供することである。したがって、本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルス株は、野生型ワクチン株と比較して同じ時間（例えば１２時間、２４時間、４８時間または７２時間）および同じ増殖条件下で細胞培養物中および／または卵中でより高いまたは同様のウイルス力価まで増殖することができる。特に、これらは、野生型ワクチン株と比較して同じ時間および同じ増殖条件下でＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ ３３０１６など）においてより高いまたは同様のウイルス力価まで増殖することができる。ウイルス力価は、当業者に公知の標準的な方法によって決定することができる。有用なことに、本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは、同じ時間枠および同じ条件下で野生型ワクチン株のウイルス力価より少なくとも５％高い、少なくとも１０％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも５０％高い、少なくとも１００％高い、少なくとも２００％高い、または少なくとも５００％高いウイルス力価を達成し得る。再集合体インフルエンザＢ型ウイルスはまた、野生型ワクチン株と比較して同じ時間および同じ増殖条件下で同様のウイルス力価に増殖し得る。これに関連して同様の力価とは、再集合体インフルエンザＢ型ウイルスが、同じ時間および同じ増殖条件下で野生型ワクチン株を用いて達成されるウイルス力価の３％以内である力価（すなわち野生型力価±３％）に増殖することを意味する。

インフルエンザＢ型ウイルスは、現在のところ異なるＨＡサブタイプを示さないが、インフルエンザＢ型ウイルス株は２つの異なる系統に分類される。これらの系統は１９８０年代後半に出現し、抗原的および／または遺伝的に相互に区別することができるＨＡを有する［８］。現在のインフルエンザＢ型ウイルス株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様のいずれかである。これらの株は、通常は抗原的に区別されるが、アミノ酸配列の相違も２つの系統を区別するために記述されており、例えばＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株はしばしば（常にではないが）、「Ｌｅｅ４０」ＨＡ配列に対して番号付けられた、アミノ酸残基１６４に欠失があるＨＡタンパク質を有する［９］。一部の実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来のウイルスセグメントを含み得る。これらは、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来のウイルスセグメントを含み得る。あるいは、これらはＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来のウイルスセグメントを含み得る。

再集合体インフルエンザＢ型ウイルスが、２つまたはそれより多くのインフルエンザＢ型ウイルス株由来のウイルスセグメントを含む場合、これらのウイルスセグメントは、関連するノイラミニダーゼを有するインフルエンザＢ型株に由来し得る。例えば、ウイルスセグメントを提供するインフルエンザＢ型株は、どちらもＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼを有してもよく［１０］、またはどちらもＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼを有してもよい。例えば、２つのＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼは、どちらも以下の配列特性の１つまたはそれより多くを有し得る：（１）残基２７はセリンではなく、好ましくはロイシンである；（２）残基４４はグルタミン酸ではなく、好ましくはリシンである；（３）残基４６はトレオニンではなく、好ましくはイソロイシンである；（４）残基５１はプロリンではなく、好ましくはセリンである；（５）残基６５はアルギニンではなく、好ましくはヒスチジンである；（６）残基７０はグリシンではなく、好ましくはグルタミン酸である；（７）残基７３はロイシンではなく、好ましくはフェニルアラニンである；および／または（８）残基８８はプロリンではなく、好ましくはグルタミンである。同様に、一部の実施形態では、ノイラミニダーゼは残基４３に欠失を有してもよく、またはトレオニンを有してもよい；ＮＡ遺伝子中のトリヌクレオチド欠失から生じる残基４３の欠失は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株の特性として報告されているが、最近の株はＴｈｒ−４３を回復している［１０］。逆に、言うまでもなく、反対の特性が２つのＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼ、例えばＳ２７、Ｅ４４、Ｔ４６、Ｐ５１、Ｒ６５、Ｇ７０、Ｌ７３および／またはＰ８８によって共有されてもよい。これらのアミノ酸は、「Ｌｅｅ４０」ノイラミニダーゼ配列に対して番号付けられる［１１］。再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは、上述した特性を備えたＮＡセグメントを含み得る。あるいはまたは加えて、再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは、上述した特性を備えたＮＡセグメントを有するインフルエンザＢ型株由来のウイルスセグメント（ＮＡ以外）を含み得る。

Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株であるインフルエンザＢ型ウイルスの骨格ウイルスセグメントは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７由来の対応するウイルスセグメントに対して、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８の対応するウイルスセグメントに対してそれが有するよりも高いレベルの同一性を有することができ、逆もまた同様である。例えば、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株である）のＮＰセグメントは、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８のＮＰセグメントに９９％の同一性を有し、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７のＮＰセグメントには９６％の同一性しか有さない。

本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスがＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来の骨格ウイルスセグメントを含む場合、ウイルスセグメントは以下の配列を有するタンパク質をコードし得る。ＰＡタンパク質は、配列番号１の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。ＰＢ１タンパク質は、配列番号２の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。ＰＢ２タンパク質は、配列番号３の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。ＮＰタンパク質は、配列番号４の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。Ｍ_１タンパク質は、配列番号５の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。Ｍ_２タンパク質は、配列番号６の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。ＮＳ_１タンパク質は、配列番号７の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。ＮＳ_２タンパク質は、配列番号８の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。一部の実施形態では、再集合体インフルエンザＢ型ウイルスはまた、これらの骨格セグメントの全部を含み得る。

本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスがＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来の骨格ウイルスセグメントを含む場合、ウイルスセグメントは以下の配列を有するタンパク質をコードし得る。ＰＡタンパク質は、配列番号２０の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。ＰＢ１タンパク質は、配列番号２１の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。ＰＢ２タンパク質は、配列番号２２の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。ＮＰタンパク質は、配列番号２３の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。Ｍ_１タンパク質は、配列番号２４の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。Ｍ_２タンパク質は、配列番号２５の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。ＮＳ_１タンパク質は、配列番号２６の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。ＮＳ_２タンパク質は、配列番号２７の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有し得る。

本発明は、配列番号１１〜１６または３０〜３５の配列に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％または１００％の同一性を有するウイルスセグメントを有するドナー株を用いて実施することができる。遺伝暗号の縮重により、同じポリペプチドを、異なる配列を有する数個の核酸によってコードさせることが可能である。例えば、配列番号４０と配列番号４１の核酸配列は、同じウイルスタンパク質をコードするが、７３％の同一性しか有さない。したがって、本発明は、配列番号１１〜１６または３０〜３５の配列と同じポリペプチドをコードするウイルスセグメントを用いて実施し得る。

一般に再集合体インフルエンザウイルスは各骨格セグメントの１つだけを含む。例えば、インフルエンザウイルスがＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８由来のＮＰセグメントを含む場合、別のインフルエンザ株由来のＮＰセグメントを同時に含むことはない。

一部の実施形態では、本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは、同じインフルエンザＢ型ドナー株由来のすべての骨格セグメントを含み得る。あるいは、１つを超えるインフルエンザドナー株由来の、例えば２、３、４または５つのドナー株由来の骨格セグメントを含み得る。再集合体インフルエンザＢ型ウイルスが２または３つのドナー株由来の骨格セグメントを含む場合、各ドナー株は、再集合体インフルエンザＢ型ウイルスの骨格セグメントの１つより多くを提供し得るが、ドナー株の１つまたは２つは、単一骨格セグメントだけを提供することもできる。骨格セグメントの少なくとも１つはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来であることが好ましく、というのは、本発明者らが、そのような再集合体インフルエンザウイルスが細胞培養物中で良好に増殖することを見出したからである。本発明に関連して好ましいＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株は、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０である。一般に再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは６を超える骨格セグメントを含むことができない。その結果、例えば、ドナー株の１つがウイルスセグメントのうち５個を提供する場合、再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは、２つの異なるインフルエンザ株全体（例えば２つのドナー株または１つのドナー株と１つのワクチン株）に由来する骨格セグメントしか含むことができない。

再集合体インフルエンザＢ型ウイルスが単一ドナー株由来の骨格セグメントを含む場合、再集合体ウイルスは、一般にドナー株由来のセグメントとワクチン株由来のセグメントを１：７、２：６、３：５、４：４、５：３、６：２または７：１の比で含む。再集合体ウイルスが２つのドナー株由来の骨格セグメントを含む場合、再集合体ウイルスは、第一のドナー株由来のセグメント、第二のドナー株由来のセグメントおよびワクチン株由来のセグメントを１：１：６、１：２：５、１：３：４、１：４：３、１：５：２、１：６：１、２：１：５、２：２：４、２：３：３、２：４：２、２：５：１、３：１：４、３：２：３、３：３：２、３：４：１、４：１：３、４：２：２、４：３：１、５：１：２、５：２：１または６：１：１の比で含むことができる。

ワクチン株由来のＨＡセグメントは、インフルエンザウイルスの主たるワクチン抗原をコードし、それゆえワクチン株から生じるので、再集合体インフルエンザＢ型ウイルスはワクチン株由来のＨＡセグメントを含む。本発明の再集合体ウイルスは、好ましくはワクチン株由来のＮＡセグメントも有するが、本発明は、異なる株由来のＨＡセグメントとＮＡセグメントを含む再集合体も包含する。

ワクチン株として使用することができる株には、耐性広域流行株を含む、抗ウイルス療法に抵抗性（例えばオセルタミビル［１２］および／またはザナミビルに抵抗性）である株［１３］が含まれる。

機能的ＮＳタンパク質をコードしないＮＳセグメントを含む再集合体ウイルスも本発明の範囲内である。ＮＳ１ノックアウト変異体は参考文献１４に記載されている。これらのＮＳ１変異体のウイルス株は、生弱毒化インフルエンザワクチンを調製するのに特に適する。

ＤＮＡおよびアミノ酸配列の変動は、ウイルスの継代の間に起こり得る自然変異に起因し得る。そのようなバリアントインフルエンザ株も本発明において使用することができる。

逆遺伝学
本発明は、逆遺伝学技術を介して再集合体インフルエンザＢ型ウイルス株を生成するのに特に適する。これらの技術では、１つまたはそれより多くの発現構築物(複数可)を使用して培養宿主中でウイルスを産生させる。発現構築物(複数可)は、本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを生成するのに必要なすべてのセグメントをコードし得る。

インフルエンザウイルスのための逆遺伝学は、複製および転写を開始させるのに必要な４つのタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＰ）ならびに８つすべてのウイルスゲノムセグメントを発現する１２のプラスミドを用いて実施することができる。構築物の数を低減するために、しかし、複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（ウイルスＲＮＡ合成用）を単一プラスミド（例えば１、２、３、４、５、６、７または８つすべてのインフルエンザｖＲＮＡセグメントをコードする配列）上に、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む複数のタンパク質コード領域を別のプラスミド（例えば１、２、３、４、５、６、７または８つのインフルエンザｍＲＮＡ転写産物をコードする配列）上に含めることができる［１５］。また、ｐｏｌ Ｉプロモーターの制御下の１つまたそれより多くのインフルエンザｖＲＮＡセグメントおよび別のプロモーター、特にｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下の１つまたそれより多くのインフルエンザタンパク質コード領域を同じプラスミド上に含めることも可能である。これは、好ましくは二方向プラスミドを使用することによって行われる。

参考文献１５の好ましい態様は、（ａ）単一発現構築物上のＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰおよびＰＡ ｍＲＮＡコード領域；ならびに（ｂ）単一発現構築物上の８つすべてのｖＲＮＡコードセグメントを含む。１つの発現構築物上にノイラミニダーゼ（ＮＡ）セグメントおよび赤血球凝集素（ＨＡ）セグメントを含み、別の発現構築物上にその他の６つのウイルスセグメントを含むことは、新たに出現するインフルエンザウイルス株は通常ＮＡセグメントおよび／またはＨＡセグメントに変異を有するので、特に好ましい。それゆえ、別の発現構築物上にＮＡセグメントおよび／またはＨＡセグメントを有することの利点は、ＨＡおよびＮＡ配列を含むベクターだけしか置き換える必要がないことである。したがって、本発明の１つの態様では、ワクチン株のＮＡセグメントおよび／またはＨＡセグメントは１つの発現構築物上に含まれてよく、ならびにＨＡセグメント(複数可)および／またはＮＡセグメント(複数可)を除く、本発明のドナー株(複数可)由来のｖＲＮＡコードセグメントは異なる発現構築物上に含まれる。本発明は、したがって本発明のドナー株の１、２、３、４、５または６のｖＲＮＡをコードする骨格ウイルスセグメントを含む発現構築物を提供する。発現構築物は、機能的ＨＡタンパク質および／またはＮＡタンパク質を生成するＨＡウイルスセグメントおよび／またはＮＡウイルスセグメントを含まなくてよい。

公知の逆遺伝学系は、ｐｏｌ Ｉプロモーター、細菌ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、バクテリオファージポリメラーゼプロモーター等から所望のウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）分子をコードするＤＮＡ分子を発現することを含む。インフルエンザウイルスは生活環を開始するためにウイルスポリメラーゼの存在を必要とするので、系はこれらのタンパク質も提供することができ、例えば系は、ウイルスポリメラーゼタンパク質をコードするＤＮＡ分子をさらに含み、その結果両方のタイプのＤＮＡの発現が完全な感染性ウイルスの組み立てをもたらす。ウイルスポリメラーゼをタンパク質として供給することも可能である。

逆遺伝学をインフルエンザｖＲＮＡの発現のために使用する場合、配列エレメントの互いに関する正確な間隔が、ポリメラーゼが複製を開始するために重要であることは当業者に明白である。それゆえ、ウイルスＲＮＡをコードするＤＮＡ分子をｐｏｌ Ｉプロモーターと終結配列の間に正しく配置することが重要であるが、この配置は、逆遺伝学系を扱う者の能力の十分に範囲内である。

組換えウイルスを産生するために、細胞は、ビリオンを組み立てるのに必要なウイルスゲノムのすべてのセグメントを発現しなければならない。本発明の発現構築物にクローニングされるＤＮＡは、好ましくはすべてのウイルスＲＮＡおよびタンパク質を提供するが、ＲＮＡおよびタンパク質の一部を提供するためにヘルパーウイルスを使用することも可能であり、しかしヘルパーウイルスを使用しない系が好ましい。インフルエンザウイルスはセグメント化ウイルスであるので、ウイルスゲノムは通常、本発明の方法において１つを超える発現構築物を使用して発現される。しかしまた、単一発現構築物上でウイルスゲノムの１つもしくはそれより多くのセグメントまたはさらにすべてのセグメントを組み合わせることも想定される。

一部の実施形態では、宿主細胞中で補助タンパク質の発現をもたらす発現構築物も含まれる。例えば、逆遺伝学系の一部として非ウイルスセリンプロテアーゼ（例えばトリプシン）を発現することは好都合であり得る。

発現構築物
本発明の発現系において使用される発現構築物は、一方向または二方向発現構築物であり得る。１つを超える導入遺伝子を本発明の方法において使用する場合（同じ発現構築物上であるかまたは異なる発現構築物上であるかにかかわらず）、一方向発現および／または二方向発現を用いることが可能である。

インフルエンザウイルスは感染性のためにタンパク質を必要とするので、一般に二方向発現構築物を使用することが好ましく、これは、宿主細胞によって必要とされる発現構築物の総数を低減するからである。したがって、本発明の方法は、遺伝子またはｃＤＮＡが上流のｐｏｌ ＩＩプロモーターと下流の非内因性ｐｏｌ Ｉプロモーターとの間に位置する、少なくとも１つの二方向発現構築物を利用し得る。ｐｏｌ ＩＩプロモーターからの遺伝子またはｃＤＮＡの転写は、タンパク質へと翻訳され得るキャップされたプラスセンスウイルスｍＲＮＡを生成し、一方非内因性ｐｏｌ Ｉプロモーターからの転写はマイナスセンスｖＲＮＡを生成する。二方向発現構築物は、二方向発現ベクターであり得る。

二方向発現構築物は、同じ構築物から異なる方向（すなわち５’から３’および３’から５’の両方）に発現を駆動する少なくとも２つのプロモーターを含む。これらの２つのプロモーターは、同じ二本鎖ＤＮＡの異なる鎖に作動可能に連結することができる。好ましくは、プロモーターの１つはｐｏｌ Ｉプロモーターであり、およびその他のプロモーターの少なくとも１つはｐｏｌ ＩＩプロモーターである。これは、ｐｏｌ ＩプロモーターをキャップされていないｖＲＮＡを発現するために使用し、一方、ｐｏｌ ＩＩプロモーターを、その後タンパク質へと翻訳され得るｍＲＮＡを転写するために使用することができ、したがって同じ構築物からのＲＮＡとタンパク質の同時発現を可能にするので、有用である。１つを超える発現構築物を発現系内で使用する場合、プロモーターは、内因性プロモーターと非内因性プロモーターの混合物であり得る。

発現構築物中で使用されるｐｏｌ Ｉプロモーターおよびｐｏｌ ＩＩプロモーターは、宿主細胞が由来する同じ分類学上の目からの生物にとって内因性であり得る。あるいは、プロモーターは、宿主細胞とは異なる分類学上の目の生物に由来し得る。「目」という用語は、従来の分類学上の順位を指し、目の例は、霊長目、げっ歯目、食肉目、有袋目、クジラ目等である。ヒトとチンパンジーは同じ分類学上の目（霊長目）に属するが、ヒトとイヌは異なる目（霊長目対食肉目）にある。例えば、ヒトｐｏｌ Ｉプロモーターは、イヌ細胞（例えばＭＤＣＫ細胞）中でウイルスセグメントを発現するために使用できる［１６］。

発現構築物は、典型的にはＲＮＡ転写終結配列を含む。終結配列は、内因性終結配列または宿主細胞にとって内因性ではない終結配列であり得る。適切な終結配列は当業者に明らかであり、これにはＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列およびリボザイムが含まれるが、これらに限定されない。さらに、発現構築物は、特にその発現がｐｏｌ ＩＩプロモーターによって調節される遺伝子の末端に、ｍＲＮＡのための１つまたはそれより多くのポリアデニル化シグナルを含み得る。

発現系は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１または少なくとも１２個の発現構築物を含み得る。

発現構築物は、プラスミドまたは他のエピソーム構築物などのベクターであり得る。そのようなベクターは、典型的には少なくとも１つの細菌の複製起点および／または真核生物の複製起点を含む。さらに、ベクターは、原核細胞および／または真核細胞中での選択を可能にする選択可能マーカーを含み得る。そのような選択可能マーカーの例は、アンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子である。ベクターは、ＤＮＡ配列のクローニングを容易にする１つまたはそれより多くの複数クローニング部位をさらに含み得る。

代替法として、発現構築物は線状発現構築物（ｌｉｎｅａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）であり得る。そのような線状発現構築物は、典型的にはいずれの増幅配列および／または選択配列を含まない。しかし、そのような増幅配列および／または選択配列を含む線状構築物も本発明の範囲内である。参考文献１７は、各ウイルスセグメントのための個別の線状発現構築物を記載している。同じ線状発現構築物上に１つを超える、例えば２、３、４、５または６個のウイルスセグメントを含むことも可能である。そのような系は、例えば参考文献１８に記載されている。一部のウイルスセグメント（例えばＨＡセグメントおよび／またはＮＡセグメント）が線状構築物上にコードされ、残りのウイルスセグメント（例えば骨格セグメント）が非線状構築物、例えばベクター、プラスミドまたは他のエピソーム構築物上にコードされる発現系を使用することも可能である。

発現構築物は当分野で公知の方法を用いて作製することができる。そのような方法は、例えば参考文献１９に記載されている。発現構築物が線状発現構築物である場合、単一制限酵素部位を利用して宿主細胞への導入の前に前記発現構築物を線状化することが可能である。あるいは、少なくとも２つの制限酵素部位を使用してベクターから発現構築物を切り出すことが可能である。さらに、核酸増幅技術を使用して（例えばＰＣＲによって）構築物を増幅することにより、線状発現構築物を得ることも可能である。

本発明の系で使用される発現構築物は、非細菌性発現構築物であり得る。これは、構築物が、その中にコードされるウイルスＲＮＡセグメントの真核細胞中での発現を駆動することができるが、細菌中での構築物の増殖に必要な成分を含まないことを意味する。したがって構築物は、細菌の複製起点（ｏｒｉ）を含まず、通常は細菌選択マーカー（例えば抗生物質耐性マーカー）を含まない。そのような発現構築物は参考文献２０に記載されている。

発現構築物は化学合成によって調製され得る。発現構築物は、完全に化学合成によって調製されるかまたは部分的に化学合成によって調製され得る。化学合成によって発現構築物を調製するための適切な方法は、例えば参考文献２０に記載されている。

本発明の発現構築物は、当業者に公知の任意の技術を用いて宿主細胞中に導入することができる。例えば、発現構築物は、電気穿孔、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、マイクロインジェクションまたは微粒子銃を用いることによって宿主細胞中に導入することができる。発現構築物(複数可)は、その後再集合体インフルエンザＢ型ウイルスの増殖のために使用される同じ細胞型に導入することができる。あるいは、発現構築物が導入される細胞と再集合体インフルエンザＢ型ウイルスの増殖のために使用される細胞は異なっていてもよい。一部の実施形態では、参考文献２１に記載されているように、発現構築物(複数可)による宿主細胞のトランスフェクション後に同じまたは異なる細胞型のトランスフェクトされていない細胞を宿主細胞に添加し得る。

従来の再集合
伝統的に、インフルエンザウイルスは、培養宿主、通常は卵をドナー株とワクチン株に共感染させることによって再集合される。再集合体ウイルスは、ワクチン株のＨＡタンパク質および／またはＮＡタンパク質を含む再集合体ウイルスを選択するためにドナー株のＨＡタンパク質および／またはＮＡタンパク質に対して特異性を有する抗体を添加することによって選択される。この処理の数継代を経て、ワクチン株のＨＡセグメントおよび／またはＮＡセグメントを含む、迅速に増殖する再集合体ウイルスを選択することができる。

再集合体インフルエンザウイルスはまた、国際公開第２０１１／１４５０８１号において教示されるように、所望の再集合体インフルエンザウイルス中には存在しないウイルスセグメントの転写および／または翻訳を選択的に低減する阻害剤を添加することによって選択することもできる。

本発明は、これらの方法における使用に適する。ドナー株(複数可)と比較して、異なるインフルエンザＢ型系統由来のワクチン株を使用することは、これが再集合体ウイルスの選択を促進するので、より容易であり得る。しかしまた、ドナー株(複数可)と同じインフルエンザＢ型系統由来のワクチン株を使用することも可能であり、本発明の一部の態様ではこれが好ましい。この場合、ドナー株(複数可)のＨＡタンパク質および／またはＮＡタンパク質に対して選択的特異性を有する抗体または阻害剤が使用可能であるべきである。

培養宿主
本発明における使用のための培養宿主は、関心対象のウイルスを産生することができる任意の真核細胞であり得る。本発明は、典型的には細胞株を使用するが、例えば代替法として初代細胞を使用してもよい。細胞は、典型的には哺乳動物細胞または鳥類細胞である。適切な哺乳動物細胞には、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長動物（ヒトおよびサルを含む）細胞ならびにイヌ細胞が含まれるが、これらに限定されない。様々な細胞型、例えば腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞等を使用し得る。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣの名称を有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えばアフリカミドリザル細胞、例えばＶｅｒｏ細胞株におけるような腎細胞である［２２〜２４］。適切なイヌ細胞は、例えばＣＬＤＫ細胞株およびＭＤＣＫ細胞株におけるような腎細胞である。適切な鳥類胚性幹細胞には、ニワトリ胚性幹細胞由来のＥＢｘ細胞株、ＥＢ４５、ＥＢ１４およびＥＢ１４−０７４が含まれる［２５］。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）も使用し得る。

さらなる適切な細胞には、ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；ＭＲＣ ５；ＰＥＲ．Ｃ６［２６］；ＦＲｈＬ２；ＷＩ−３８等が含まれるが、これらに限定されない。適切な細胞は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクションから［２７］、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓから［２８］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ ８１、ＣＣＬ ８１．２、ＣＲＬ １５８６およびＣＲＬ−１５８７の下で様々な異なるＶｅｒｏ細胞を供給し、カタログ番号ＣＣＬ ３４の下でＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０の下でＥＣＡＣＣから入手可能である。

本発明における使用のための好ましい細胞は、Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞である［２９〜３１］。元のＭＤＣＫ細胞は、ＣＣＬ ３４としてＡＴＣＣから入手可能である。ＭＤＣＫ細胞の派生物を使用することが好ましい。そのような派生物は、例えば参考文献２９に記載されており、この文献は、懸濁培養での増殖に適合させたＭＤＣＫ細胞を開示する（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された、「ＭＤＣＫ ３３０１６」または「３３０１６−ＰＦ」）。さらに、参考文献３２は、無血清培養において、懸濁状態で増殖するＭＤＣＫ由来の細胞を開示する（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された、「Ｂ−７０２」）。一部の実施形態では、使用されるＭＤＣＫ細胞株は腫瘍形成性であり得る。非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を使用することも想定される。例えば参考文献３３は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０３）を含む、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を開示する。参考文献３４は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １２０４２）を含む、感染に対して高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞を開示する。

本発明の方法を実施するために１つを超える細胞型の混合物を使用することが可能である。しかし、本発明の方法は単一細胞型を用いて、例えばモノクローナル細胞を用いて実施することが好ましい。好ましくは、本発明の方法で使用される細胞は単一細胞株に由来する。さらに、同じ細胞株を、ウイルスを再集合させるためおよびウイルスの任意のその後の増殖のために使用し得る。

好ましくは、一般的な汚染物源を回避するために、血清の不在下で細胞を培養する。真核細胞培養のための様々な無血清培地が当業者に公知である（例えばイスコフ培地、ウルトラＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。さらに、無タンパク質培地を使用してもよい（例えばＰＦ−ＣＨＯ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。さもなければ、複製用の細胞を慣例的な血清含有培地で培養することもできる（例えば０．５％から１０％のウシ胎仔血清を含むＭＥＭまたはＤＭＥＭ培地）。

細胞は、接着培養または懸濁状態であり得る。

本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスは、卵を培養宿主として使用して増殖させ得る。ワクチン用のインフルエンザウイルスの増殖のための現在の標準的な方法は、発育鶏卵を使用し、ウイルスを卵内容物（尿膜腔液）から精製する。卵を介してウイルスを継代させ、その後細胞培養で増殖させることも可能であり、その逆も同様である。

ウイルスの調製
１つの実施形態では、本発明は、（ａ）培養宿主を本発明の再集合体ウイルスに感染させるステップ；（ｂ）ウイルスを産生させるためにステップ（ａ）からの宿主を培養するステップ；および必要に応じて（ｃ）ステップ（ｂ）で産生されたウイルスを精製するステップを含む、インフルエンザウイルスを生成するための方法を提供する。

ステップ（ｂ）における培養宿主は、細胞（上述したような）または発育鶏卵であり得る。本発明のこの態様において細胞を培養宿主として使用する場合、細胞培養条件（例えば温度、細胞密度、ｐＨ値等）は、使用する細胞株およびウイルスによって広い範囲で異なり、適用の必要条件に適合させ得ることは公知である。それゆえ、以下の情報は単に指針を示すに過ぎない。

細胞は、好ましくは無血清培地または無タンパク質培地で培養する。

細胞の増殖は、当業者に公知の方法に従って実施することができる。例えば、遠心分離またはろ過のような通常の支援方法を用いて灌流系で細胞を培養することができる。さらに、感染前に流加系で本発明に従って細胞を増殖させることができる。本発明に関連して、培養系は流加系を指し、その流加系では、細胞を最初にバッチ系で培養し、培地中の栄養素（または栄養素の一部）の枯渇を濃縮栄養素の制御された供給によって補償する。感染前の細胞の増殖の間に培地のｐＨ値をｐＨ６．６からｐＨ７．８の間、特にｐＨ７．２からｐＨ７．３の間の値に調整することは好都合であり得る。細胞の培養は、好ましくは３０から４０℃の間の温度で行う。感染細胞を培養する場合（ステップｂ）、細胞を、好ましくは３０℃から３６℃の間または３２℃から３４℃の間または３３℃の温度で培養する。この温度範囲での感染細胞のインキュベーションは、ワクチンに製剤化された場合改善された効果をもたらすウイルスの産生を生じさせることが示されているので［３５］、これは特に好ましい。

感染前の培養の間、酸素分圧を、好ましくは２５％から９５％の間の値、特に３５％から６０％の間の値に調整することができる。本発明に関連して述べる酸素分圧の値は空気の飽和に基づく。細胞の感染は、バッチ系では好ましくは約８〜２５×１０^５細胞／ｍＬ、灌流系では好ましくは約５〜２０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で行う。細胞を、１０^−８から１０の間、好ましくは０．０００１から０．５の間のウイルス用量（ＭＯＩ値、「感染多重度」；感染時点の細胞１個当たりのウイルス単位の数に対応する）で感染させることができる。

ウイルスは、接着培養または懸濁状態の細胞で増殖させ得る。マイクロキャリア培養を使用することができる。一部の実施形態では、細胞を懸濁状態での増殖に適合させ得る。

本発明による方法は、ウイルスまたはウイルスによって生成されたタンパク質の採取および単離も含む。ウイルスまたはタンパク質の単離の間に、分離、ろ過または限外ろ過のような標準的な方法によって細胞を培養培地から分離する。次に、勾配遠心分離、ろ過、沈殿、クロマトグラフィ等のような当業者には十分に公知の方法に従ってウイルスまたはタンパク質を濃縮し、その後精製する。本発明によれば、精製の間または精製後にウイルスを不活化することも好ましい。ウイルスの不活化は、例えば精製工程内の任意の時点でβ−プロピオラクトンまたはホルムアルデヒドによって行うことができる。

ワクチン
ワクチン（特にインフルエンザウイルスのための）は、一般に生ウイルスまたは不活化ウイルスのいずれかに基づく。不活化ワクチンは、全ビリオン、「スプリット」ビリオンまたは精製表面抗原に基づき得る。抗原は、ビロソームの形態で提示することもできる。本発明は、これらの型のワクチンのいずれかを製造するために使用できるが、不活化ワクチンが好ましい。

不活化ウイルスを使用する場合、ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオンまたは精製表面抗原（インフルエンザに関しては、赤血球凝集素を含み、および通常はノイラミニダーゼも含む）を含有し得る。ウイルスを不活化するための化学的手段には、有効量の１つまたはそれより多くの以下の作用物質：洗浄剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミンまたはこれらの組合せでの処理が含まれる。例えばＵＶ光またはガンマ線照射などの、ウイルス不活化の非化学的方法は当分野で公知である。

ビリオンは、ウイルス含有流体、例えば尿膜腔液または細胞培養上清から様々な方法によって採取することができる。例えば、精製工程は、ビリオンを破壊する洗浄剤を含む直線スクロース勾配溶液を使用したゾーン遠心分離を含み得る。次に、任意選択の希釈後に、ダイアフィルトレーションによって抗原を精製し得る。

スプリットビリオンは、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリット化工程を含む、洗浄剤（例えばエチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９等）で精製ビリオンを処理して、サブビリオン調製物を生成することによって得られる。例えばインフルエンザウイルスをスプリット化する方法は当分野で周知であり、例えば参考文献３６〜４１等を参照されたい。ウイルスのスプリット化は、典型的には、感染性または非感染性に関わらず、ウイルス全体を破壊濃度のスプリット化剤で破壊または断片化することによって実施される。破壊は、ウイルスタンパク質の完全なまたは部分的可溶化をもたらし、ウイルスの完全性を変化させる。好ましいスプリット化剤は、非イオン性およびイオン性（例えばカチオン性）界面活性剤、例えばアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミンおよびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｌｅｎｅ ｅｓｔｅｒ）等である。１つの有用なスプリット化手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的な作用を使用し、最初のビリオン精製の間に（例えばスクロース密度勾配溶液中で）スプリット化を生じさせることができる。したがって、スプリット化工程は、ビリオン含有材料の清澄化（非ビリオン材料を除去するため）、採取したビリオンの濃縮（例えばＣａＨＰＯ_４吸着などの吸着方法を用いて）、非ビリオン材料からの全ビリオンの分離、密度勾配遠心分離ステップでのスプリット化剤を使用したビリオンのスプリット化（例えばデオキシコール酸ナトリウムなどのスプリット化剤を含有するスクロース勾配を使用して）、および次に望ましくない材料を除去するためのろ過（例えば限外ろ過）を含み得る。スプリットビリオンは、有用なことに、リン酸ナトリウム緩衝等張性塩化ナトリウム溶液中に再懸濁することができる。スプリットインフルエンザワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）製品である。

精製インフルエンザウイルス表面抗原ワクチンは、表面抗原の赤血球凝集素および、典型的には、ノイラミニダーゼも含む。これらのタンパク質を精製形態で調製するための工程は当分野において周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）製品はインフルエンザサブユニットワクチンである。

別の形態の不活化抗原は、ビロソーム［４２］（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子）である。ビロソームは、洗浄剤でウイルスを可溶化し、次いでヌクレオキャプシドを除去して、ウイルス糖タンパク質を含有する膜を再構成することによって調製できる。ビロソームを調製するための選択的な方法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に添加し、その膜中にウイルスタンパク質を有するリポソームを生成することを含む。

本発明の方法は、生ワクチンを生成するためにも使用し得る。そのようなワクチンは、通常、ビリオン含有流体からビリオンを精製することによって調製される。例えば、流体を遠心分離によって清澄化し、緩衝液（スクロース、リン酸カリウムおよびグルタミン酸一ナトリウムを含有する）で安定化し得る。様々な形態のインフルエンザウイルスワクチンが現在使用可能である（例えば参考文献４３の第１７章および１８章参照）。生ウイルスワクチンには、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＦＬＵＭＩＳＴ（商標）製品が含まれる。

ウイルスは弱毒化し得る。ウイルスは温度感受性であり得る。ウイルスは低温適合性であり得る。これら３つの特徴は、生ウイルスを抗原として使用する場合に特に有用である。

ＨＡは、現在の不活化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的にはＳＲＩＤによって測定される、ＨＡレベルを参照して標準化される。既存のワクチンは、典型的には１株当たり約１５μｇのＨＡを含むが、例えば小児に対して、または汎流行の状況で、またはアジュバントを使用する場合には、より低い用量を使用することができる。より高用量（例えば３倍または９倍用量［４４、４５］）と同様に、２分の１（すなわち１株当たり７．５μｇのＨＡ）、４分の１および８分の１などの分割用量が使用されている。したがってワクチンは、１つのインフルエンザ株当たり０．１から１５０μｇの間、好ましくは０．１から５０μｇの間、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ等のＨＡを含み得る。特定の用量には、例えば１株当たり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５等が含まれる。

生ワクチンに関しては、投薬は、ＨＡ含量ではなくメジアン組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０）によって測定し、１株当たり１０^６から１０^８の間（好ましくは１０^６．５〜１０^７．５）のＴＣＩＤ_５０が典型的である。

本発明と共に使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスに見出される天然ＨＡまたは改変ＨＡを有し得る。例えば、鳥類種においてウイルスを高病原性にする決定基（例えばＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周囲の超塩基性領域）を除去するようにＨＡを改変することが公知である。逆遺伝学の使用はそのような改変を容易にする。

汎流行間期の株に対して免疫するのに適するだけでなく、本発明のワクチンは、汎流行の株または潜在的に汎流行の株に対して免疫するのに特に有用である。本発明は、ヒトならびに非ヒト動物をワクチン接種するのに適する。

本発明のワクチンは、インフルエンザＡ型ウイルスおよび／またはインフルエンザＢ型ウイルスを含む、１つまたはそれより多くの（例えば１、２、３、４またはそれより多くの）インフルエンザウイルス株由来の抗原を含み得るが、ただし、少なくとも１つのインフルエンザ株は本発明の再集合体インフルエンザ株である。２つの抗原が本発明の再集合体インフルエンザ株に由来するワクチンも想定される。ワクチンが１つを超えるインフルエンザ株を含む場合、異なる株は、典型的には別々に増殖され、ウイルスを採取し、抗原を調製した後で混合される。したがって本発明の工程は、１つを超えるインフルエンザ株由来の抗原を混合するステップを含み得る。２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含む、三価ワクチンが典型的である。２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および２つのインフルエンザＢ型ウイルス株（好ましくは異なる系統の２つのインフルエンザＢ型株）、または３つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含む、四価ワクチンも有用である［４６］。インフルエンザワクチンが１つを超えるインフルエンザＢ型株由来の抗原を含む場合、これらの１つまたはそれより多くは、本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスに由来し得る。

本発明のワクチンは薬学的に許容され得る。それらは通常、抗原に加えて成分を含み、例えば典型的には１つまたはそれより多くの薬学的担体および／または賦形剤を含む。以下で述べるように、アジュバントも含まれ得る。そのような成分の詳細な論述は参考文献４７において入手可能である。

ワクチンは一般に水性形態である。しかし、一部のワクチンは乾燥形態、例えば注射用固体またはパッチ上の乾燥もしくは重合調製物であり得る。

ワクチンは、チメロサール（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）または２−フェノキシエタノールなどの防腐剤を含み得る。しかし、ワクチンは水銀物質を実質的に含むべきでない（すなわち５μｇ／ｍｌ未満）、例えばチメロサールを含むべきでない［４０、４８］ことが好ましい。水銀を全く含有しないワクチンがより好ましい。コハク酸α−トコフェロールを水銀化合物の代替物として含めることができる［４０］。防腐剤を含まないワクチンは特に好ましい。

張性を調節するために、ナトリウム塩などの生理的な塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在し得る。存在してもよい他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等が含まれる。

ワクチンは、一般に２００ｍＯｓｍ／ｋｇから４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有し、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内にある。重量オスモル濃度は、ワクチン接種によって引き起こされる痛みに影響を及ぼさないことが以前に報告されているが［４９］、それにもかかわらず重量オスモル濃度をこの範囲内に維持することが好ましい。

ワクチンは１つまたはそれより多くのバッファーを含み得る。典型的なバッファーには、リン酸バッファー；トリスバッファー；ホウ酸バッファー；コハク酸バッファー；ヒスチジンバッファー（特に水酸化アルミニウムアジュバントと共に）；またはクエン酸バッファーが含まれる。バッファーは、典型的には５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。

ワクチンのｐＨは、一般に５．０から８．１の間、より典型的には６．０から８．０の間、例えば６．５から７．５の間または７．０から７．８の間である。本発明の工程は、それゆえ、包装の前にバルクワクチンのｐＨを調整するステップを含み得る。

ワクチンは、好ましくは無菌である。ワクチンは、好ましくは非発熱性であり、例えば用量当たり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な尺度）、好ましくは用量当たり＜０．１ＥＵを含有する。ワクチンは、好ましくはグルテンを含まない。

本発明のワクチンは、特にスプリットワクチンまたは表面抗原ワクチンに関して、洗浄剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知である）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）またはデオキシコール酸ナトリウムを含み得る。洗浄剤は微量でのみ存在し得る。したがってワクチンは、各々１ｍｇ／ｍｌ未満のオクトキシノール−１０およびポリソルベート８０を含み得る。微量の他の残留成分は抗生物質（例えばネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。

ワクチンは、単回免疫用の材料を含み得るか、または複数回免疫用の材料（すなわち「複数回量」キット）を含み得る。複数回量の準備（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ）では防腐剤を含むことが好ましい。複数回量ワクチンに防腐剤を含めることの代替法として（またはそれに加えて）、材料の取り出しのための無菌アダプタを有する容器にワクチンを収めてもよい。

インフルエンザワクチンは、典型的には約０．５ｍｌの投与容量で投与するが、半分の用量（すなわち約０．２５ｍｌ）を小児に投与してもよい。

ワクチンおよびキットは、好ましくは２℃から８℃の間で保存する。ワクチンおよびキットは凍結すべきでない。それらは、理想的には直接日光を避けるべきである。

宿主細胞ＤＮＡ
ウイルスを細胞株で単離および／または増殖させた場合、ＤＮＡのあらゆる潜在的な腫瘍形成活性を最小限に抑えるために、最終ワクチン中の残留細胞株ＤＮＡの量を最小限にすることが標準的な慣行である。

したがって、本発明のワクチンは、好ましくは用量当たり１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在し得る。

任意の残留宿主細胞ＤＮＡの平均の長さは、５００ｂｐ未満、例えば４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満等であることが好ましい。

標準的な精製手順、例えばクロマトグラフィ等を使用して、ワクチン調製の間に混入ＤＮＡを除去することができる。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって、例えばＤＮアーゼを使用することによって増強できる。宿主細胞ＤＮＡの混入を低減するための好都合な方法は参考文献５０および５１に開示されており、この方法は２段階処理を含み、最初にウイルス増殖の間に使用し得るＤＮアーゼ（例えばＢｅｎｚｏｎａｓｅ）を使用し、次にビリオン破壊の間に使用し得るカチオン洗浄剤（例えばＣＴＡＢ）を使用する。β−プロピオラクトンなどのアルキル化剤での処理も、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用でき、好都合にはビリオンを不活化するのにも使用し得る［５２］。

アジュバント
本発明のワクチンは、好都合には、ワクチンを受ける被験体中で惹起される（体液性および／または細胞性）免疫応答を増強するように機能することができるアジュバントを含み得る。好ましいアジュバントには水中油型エマルジョンが含まれる。種々のそのようなアジュバントが公知であり、それらは、典型的には少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤を含み、油（単数または複数）および界面活性剤（単数または複数）は生分解性（代謝可能）および生体適合性である。エマルジョンにおける油滴は、一般に直径５μｍ未満であり、理想的にはサブミクロンの直径を有し、この小さなサイズはマイクロフルイダイザを用いて達成され、安定なエマルジョンを提供する。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、フィルタ滅菌に供することができるため、好ましい。

エマルジョンは、動物（魚など）または植物供給源由来のものなどの油を含み得る。植物油の供給源には、堅果、種子および穀物が含まれる。最も一般的に入手可能な、落花生油、大豆油、ヤシ油およびオリーブ油は、堅果油を例示する。例えばホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油には、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油等が含まれる。穀物の群では、トウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、例えば、コムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなど他の穀物粒の油も使用し得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中には天然では存在しないが、堅果油および種子油から出発して適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製し得る。哺乳動物の乳由来の脂肪および油は代謝可能であり、それゆえ本発明の実施において使用し得る。動物供給源から純粋な油を得るのに必要な分離、精製、けん化および他の手段の手順は当分野で周知である。大部分の魚は、容易に回収し得る代謝可能な油を含有する。例えばタラ肝油、サメ肝油および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書で使用し得る魚油の一部を例示する。多くの分岐鎖油が５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般にテルペノイドと称される。サメ肝油は、スクアレンとして公知の分枝不飽和テルペノイド、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンを含有し、これは本明細書で特に好ましい。スクアレンの飽和類似体であるスクアランも好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、商業的供給源から容易に入手可能であり、または当分野で公知の方法によって入手し得る。別の好ましい油はα−トコフェロールである（下記参照）。

油の混合物が使用できる。

界面活性剤は、その「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、以下を含むがこれらに限定されない界面活性剤と共に使用することができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと称される）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商品名で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が異なり得る、オクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして公知）、例えばトリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ ８５）およびモノラウリン酸ソルビタン。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョン中に含めるための好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、Ｓｐａｎ ８５（トリオレイン酸ソルビタン）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。

界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ ８０）およびオクトキシノール、例えばｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）の組合せも適切である。別の有用な組合せは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。

界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ ８０など）では０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎシリーズ中の他の洗浄剤など）では０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）では０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％である。

ワクチンがスプリットウイルスを含む場合、水相中に遊離界面活性剤を含むことが好ましい。これは、遊離界面活性剤が抗原に「スプリット化効果」を及ぼすことができ、それにより、さもなければ存在し得る非スプリットビリオンおよび／またはビリオン凝集体を破壊するので、好都合である。これは、スプリットウイルスワクチンの安全性を改善することができる［５３］。

好ましいエマルジョンは、＜ｌμｍ、例えば≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍまたはより小さい平均液滴サイズを有する。これらの液滴サイズは、マイクロフルイダイゼーションなどの技術によって好都合に達成することができる。

本発明に関して有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントには、以下が含まれるが、これらに限定されない：

・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ ８０およびＳｐａｎ ８５のサブミクロンエマルジョン。体積でのエマルジョンの組成は、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０および約０．５％Ｓｐａｎ ８５であり得る。重量では、これらの比は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０および０．４８％Ｓｐａｎ ８５となる。このアジュバントは、参考文献５７の第１０章および参考文献５８の第１２章により詳細に記載されているように、「ＭＦ５９」として公知である［５４〜５６］。ＭＦ５９エマルジョンは、好都合にはクエン酸イオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。

・スクアレン、トコフェロールおよびポリソルベート８０を含むエマルジョン。エマルジョンはリン酸緩衝生理食塩水を含み得る。これらのエマルジョンは、体積で２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロールおよび０．３〜３％のポリソルベート８０を有してよく、およびスクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは＜１（例えば０．９０）であり、これは、より安定なエマルジョンを提供することができるからである。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の体積比または約１１：５の重量比で存在し得る。したがって３つの成分（スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート８０）は、１０６８：１１８６：４８５またはおよそ５５：６１：２５の重量比で存在し得る。１つのそのようなエマルジョン（「ＡＳ０３」）は、Ｔｗｅｅｎ ８０をＰＢＳ中に溶解して２％溶液を得、次に９０ｍｌのこの溶液を（５ｇのＤＬ αトコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合して、その後混合物をマイクロフルイダイズすることによって作製できる。生じたエマルジョンは、例えば１００から２５０ｎｍの間、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロンの油滴を有し得る。エマルジョンはまた、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３ｄ ＭＰＬ）も含み得る。この種の別の有用なエマルジョンは、例えば上記で論じた比で、ヒト用量当たり、０．５〜１０ｍｇのスクアレン、０．５〜１１ｍｇのトコフェロールおよび０．１〜４ｍｇのポリソルベート８０を含み得る［５９］。

・スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルジョン。このエマルジョンは３ｄ−ＭＰＬ（下記参照）も含み得る。エマルジョンはリン酸緩衝液を含み得る。

・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えばコハク酸α−トコフェロール）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、これら３つの成分を約７５：１１：１０（例えば７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）の質量比で含んでよく、これらの濃度は抗原からのこれらの成分の何らかの寄与を含むはずである。このエマルジョンはスクアレンも含み得る。エマルジョンは３ｄ−ＭＰＬ（下記参照）も含み得る。水相はリン酸緩衝液を含み得る。

・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中で製剤化することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント［６０］（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）中でトレオニル−ＭＤＰと共に使用されてきた。これは、「ＡＦ」アジュバント［６１］（５％スクアラン、１．２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）におけるように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでも使用することができる。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。

・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えばソルビタンエステルまたはマンニドエステル、例えばモノオレイン酸ソルビタンまたは「Ｓｐａｎ ８０」）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、好ましくは熱可逆性であり、および／または２００ｎｍ未満のサイズを有する少なくとも９０％の油滴（体積比で）を有する［６２］。エマルジョンはまた、アルジトール；凍結防止剤（例えば糖、例えばドデシルマルトシドおよび／もしくはスクロース）；ならびに／またはアルキルポリグリコシドの１つまたはそれより多くを含み得る。エマルジョンはＴＬＲ４アゴニストを含み得る［６３］。そのようなエマルジョンは凍結乾燥し得る。

・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［６４］。アジュバントを添加したワクチン中のこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％スクアレン、４％ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。

・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献６５に記載されているように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが好都合である。

・非代謝可能な油（軽油など）および少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、Ｔｗｅｅｎ ８０またはＳｐａｎ ８０など）のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加剤、例えばＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性コンジュゲート（グルクロン酸のカルボキシル基を介したデスアシルサポニンへの脂肪族アミンの付加によって生成される、参考文献６６に記載されている、ＧＰＩ−０１００など）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンを含み得る。

・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えばコレステロール）がヘリカルミセルとして結合しているエマルジョン［６７］。

・鉱油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪族アルコールおよび非イオン性親水性界面活性剤（例えばエトキシル化脂肪族アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６８］。

・鉱油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪族アルコールおよび非イオン性親油性界面活性剤（例えばエトキシル化脂肪族アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６８］。

一部の実施形態では、エマルジョンは、送達の時点で即座に抗原と混合されてもよく、したがってアジュバントおよび抗原は、使用時に最終的な製剤にする準備ができている、包装されたまたは分配されたワクチン中に別々に保持され得る。他の実施形態では、エマルジョンを製造の間に抗原と混合し、したがって組成物を液体のアジュバント添加形態で包装する。抗原は一般に水性形態であり、その結果ワクチンは最終的に２つの液体を混合することによって調製される。混合する２つの液体の体積比は異なり得るが（例えば５：１から１：５の間で）、一般に約１：１である。成分の濃度が特定のエマルジョンの上の記載において与えられている場合、これらの濃度は、典型的には未希釈組成物に関するものであり、したがって抗原溶液と混合した後の濃度は低下する。

ワクチンの包装
本発明のワクチン（またはキット成分）のための適切な容器には、バイアル、シリンジ（例えば使い捨てシリンジ）、鼻スプレー等が含まれる。これらの容器は無菌であるべきである。

組成物／成分がバイアル中にある場合、バイアルは、好ましくはガラスまたはプラスチック材料で作製されている。バイアルは、好ましくは組成物がそれに添加される前に滅菌される。ラテックス感受性患者に関する問題を回避するために、バイアルを、好ましくはラテックスを含まないストッパーで密封し、すべての包装材料中にラテックスが存在しないことが好ましい。バイアルは単回用量のワクチンを含んでもよく、または１回分を超える用量（「複数回量」バイアル）、例えば１０回量を含んでもよい。好ましいバイアルは無色のガラス製である。バイアルは、特に複数回量バイアルに関して、その内容物を無菌的に取り出すことができるキャップを有し得る。

成分をシリンジに詰める場合、シリンジは、それに取り付けられた針を有し得る。針が取り付けられていない場合、組み立てて使用するための別個の針がシリンジと共に供給され得る。そのような針は覆われてよい。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージおよび５／８インチ２５ゲージの針が典型的である。シリンジは、記録の維持を容易にするために、ロット番号、インフルエンザの流行期および内容物の使用期限を印刷し得る剥離式のラベルと共に提供され得る。シリンジ中のプランジャーは、好ましくは、吸引の間にプランジャーが誤って取り出されるのを防止するためのストッパーを有する。シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単回用量のワクチンを含有する。シリンジは一般に、針の取り付け前に先端を密封する先端キャップを有し、この先端キャップは、好ましくはブチルゴム製である。シリンジと針を別々に包装する場合、針は、好ましくはブチルゴムシールドを装着される。好ましいシリンジは、「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」（商標）の商品名で市販されているものである。

例えば小児への送達を容易にするために、容器に半分の用量の体積を示す印をつけてもよい。例えば、０．５ｍｌ用量を含有するシリンジは、０．２５ｍｌ体積を示す印を有し得る。

ガラス容器（例えばシリンジまたはバイアル）を使用する場合、ソーダ石灰ガラスではなくホウケイ酸ガラスでできた容器を使用することが好ましい。

キットまたはワクチンは、ワクチンの詳細、例えば投与のための指示、ワクチン内の抗原の詳細等を含むリーフレットと共に包装し得る（例えば同じ箱の中に）。指示は、例えばワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合にアドレナリンの溶液をすぐに使用できるようにしておくための警告も含み得る。

処置の方法およびワクチンの投与
本発明は、本発明に従って製造されるワクチンを提供する。これらのワクチンは、ヒトまたは非ヒト動物被験体、例えばブタまたは鳥類への投与に適しており、本発明は、本発明のワクチンを被験体に投与するステップを含む、被験体において免疫応答を惹起する方法を提供する。本発明はまた、医薬として使用するための本発明のワクチンも提供し、被験体において免疫応答を惹起するための医薬を製造するための本発明のワクチンの使用も提供する。

これらの方法および使用によって惹起される免疫応答は、一般に抗体応答、好ましくは防御抗体応答を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価する方法は当分野で周知である。ヒトでの試験は、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体価が防御と相関することを示した（約３０〜４０の血清試料の赤血球凝集阻害力価は、同種のウイルスによる感染からのおよそ５０％の防御を与える）［６９］。抗体応答は、典型的には赤血球凝集阻害、マイクロ中和試験、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）および／または一元放射溶血反応（ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は当分野で周知である。

本発明のワクチンは様々な方法で投与することができる。最も好ましい免疫経路は、筋肉内注射（例えば腕または脚への）によるものであるが、他の利用可能な経路には、皮下注射、鼻内［７０〜７２］、経口［７３］、皮内［７４、７５］、経皮［７６］等が含まれる。

本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するのに使用し得る。インフルエンザワクチンは、現在、６か月齢から、小児および成人の免疫における使用に関して推奨されている。したがって、ヒト被験者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳または少なくとも５５歳であり得る。ワクチンを受けるための好ましい被験者は、高齢者（例えば≧５０歳、≧６０歳、好ましくは≧６５歳）、若年者（例えば≦５歳）、入院被験者、医療従事者、軍人および軍関係者、妊娠女性、慢性疾患患者、免疫不全被験者、ワクチンを受ける前７日以内に抗ウイルス化合物（例えばオセルタミビルまたはザナミビル化合物；下記参照）を服用した被験者、卵アレルギーがある人および外国を旅行している人である。しかし、ワクチンは単にこれらの群に適するだけではなく、より一般的に集団において使用し得る。汎流行株に関しては、すべての年齢群への投与が好ましい。

本発明の好ましいワクチンは、有効性に関するＣＰＭＰ基準の１、２または３つを満たす。成人（１８〜６０歳）では、これらの基準は、（１）≧７０％のセロプロテクション；（２）≧４０％のセロコンバージョン；および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増加である。高齢者（＞６０歳）では、これらの基準は、（１）≧６０％のセロプロテクション；（２）≧３０％のセロコンバージョン；および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増加である。これらの基準は、少なくとも５０名の患者での非盲検試験に基づく。

処置は、単回投与スケジュールまたは反復投与（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）スケジュールによるものであり得る。反復投与は、初回免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて使用し得る。反復投与スケジュールでは、様々な投与を同じかまたは異なる経路によって、例えば非経口での初回および経粘膜での追加、経粘膜での初回および非経口での追加等によって実施し得る。１回を超える投与（典型的には２回投与）の実施は、免疫学的にナイーブな患者において、例えばそれまで一度もインフルエンザワクチンを受けたことのない人々にとって、または新たなＨＡサブタイプに対するワクチン接種のために（汎流行の発生におけるように）特に有用である。反復投与は、典型的には少なくとも１週間の間隔で（例えば約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間等）施行する。

本発明に従って生産されるワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に（例えば同じ医療相談の間または医療専門家もしくはワクチン接種施設への訪問の間に）、例えば麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチンなど）、呼吸器合抱体ウイルスワクチン、肺炎球菌結合型ワクチン等と実質的に同時に患者に投与し得る。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、高齢患者において特に有用である。

同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、特にインフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えばオセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時に（例えば同じ医療相談の間または医療専門家への訪問の間に）患者に投与し得る。これらの抗ウイルス薬には、ノイラミニダーゼ阻害剤、例えば（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸、ならびにこれらのエステル（例えばエチルエステル）およびこれらの塩（例えばリン酸塩）が含まれる。好ましい抗ウイルス薬は、リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（商標））としても公知の、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸エチルエステル・リン酸塩（１：１）である。

全般
「含む」という用語は、「含有する」ならびに「から成る」を包含し、例えばＸを「含む」組成物は、もっぱらＸだけから成ってもよくまたは追加の何か、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。

「実質的に」という語は、「完全に」を排除せず、例えばＹを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合、「実質的に」という語は、本発明の定義から除外してもよい。

数値ｘに関して「約」という用語は任意的（ｏｐｔｉｏｎａｌ）であり、例えばｘ±１０％を意味する。

特に明記されない限り、２つまたはそれより多くの成分を混合するステップを含む工程は、混合のいかなる特定の順序も必要としない。したがって成分は任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合、２つの成分を互いに組み合わせることができ、次にその組合せを３番目の成分と組み合わせ得る等である。

本発明の方法の様々なステップは、同じまたは異なる時点で、同じまたは異なる地理的位置、例えば国において、および同じまたは異なる人々または実体によって実施され得る。

動物（特にウシ）材料を細胞の培養において使用する場合、それらは、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から入手すべきである。全体として、動物由来材料が完全に存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。

化合物を組成物の一部として身体に投与する場合、その化合物は、あるいは適切なプロドラッグによって置き換えられてもよい。

２つのアミノ酸配列の間の配列同一性パーセントへの言及は、整列させた場合、２つの配列を比較してアミノ酸のそのパーセンテージが同じであることを意味する。このアラインメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば参考文献７７の第７．７．１８章に記載されているものを用いて決定することができる。好ましいアラインメントは、ギャップオープンペナルティが１２、ギャップ伸長ペナルティが２、ＢＬＯＳＵＭマトリックスが６２のアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献７８において教示されている。

２つの核酸配列の間の配列同一性パーセントへの言及は、整列させた場合、２つの配列を比較して塩基のそのパーセンテージが同じであることを意味する。このアラインメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば参考文献７７の第７．７．１８章に記載されているものを用いて決定することができる。好ましいアラインメントプログラムは、好ましくはデフォルトパラメータを使用する、ＧＣＧ Ｇａｐ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｓｕｉｔｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．１）であり、デフォルトパラメータは、オープンギャップ＝３；伸長ギャップ＝１である。

図１は、野生型（ＷＴ）または逆遺伝学由来（ＲＧ）Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８株に対して、ＭＤＣＫ細胞における種々の再集合体インフルエンザＢ型株のＨＡ収量を比較する。試験したインフルエンザＢ型ウイルスのウイルスセグメントを表１に示す。ｙ軸は、μｇ／ｍＬでのＨＡ収量を示す。 図２は、野生型（ＷＴ）または逆遺伝学由来（ＲＧ）Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０株に対して、ＭＤＣＫ細胞における種々の再集合体インフルエンザＢ型株のＨＡ収量を比較する。試験したインフルエンザＢ型ウイルスのウイルスセグメントを表１に示す。ｙ軸は、μｇ／ｍＬでのＨＡ収量を示す。 図３は、対応する野生型株で得たＨＡ収量と、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０またはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８骨格を含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスのＨＡ収量を比較する。Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ａ）、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｂ）、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／０６ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｃ）またはＢ／Ｌｅｅ／４０ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｄ）を使用して種々の実験を実施した。白色のバーは野生型株に関する結果を示し、斜線模様のバーはＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０骨格に関する結果を示し、格子模様のバーはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８骨格に関する結果を示す。図３（Ａ）、３（Ｂ）および３（Ｃ）のｙ軸は、ＥＬＩＳＡによって決定したμｇ／ｍＬでのＨＡ収量を示し、図３（Ｄ）のｙ軸は、ＨＡアッセイによって決定したＨＡ力価を示す。 図３は、対応する野生型株で得たＨＡ収量と、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０またはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８骨格を含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスのＨＡ収量を比較する。Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ａ）、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｂ）、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／０６ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｃ）またはＢ／Ｌｅｅ／４０ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｄ）を使用して種々の実験を実施した。白色のバーは野生型株に関する結果を示し、斜線模様のバーはＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０骨格に関する結果を示し、格子模様のバーはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８骨格に関する結果を示す。図３（Ａ）、３（Ｂ）および３（Ｃ）のｙ軸は、ＥＬＩＳＡによって決定したμｇ／ｍＬでのＨＡ収量を示し、図３（Ｄ）のｙ軸は、ＨＡアッセイによって決定したＨＡ力価を示す。

図４は、ＢＸ−３５、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０もしくはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８骨格または対応する野生型ウイルスで得たＨＡ収量と、Ｎｏ．２、Ｎｏ．９、Ｎｏ．３２またはＮｏ．３４ハイブリッド骨格（表１に示す）を含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスのＨＡ収量を比較する。Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ａ）、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｂ）、ＢＸ−３５ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｃ）またはＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／０６ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｄ）を使用して種々の実験を実施した。ｙ軸は、μｇ／ｍＬでのＨＡ収量を示す。 図４は、ＢＸ−３５、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０もしくはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８骨格または対応する野生型ウイルスで得たＨＡ収量と、Ｎｏ．２、Ｎｏ．９、Ｎｏ．３２またはＮｏ．３４ハイブリッド骨格（表１に示す）を含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスのＨＡ収量を比較する。Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ａ）、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｂ）、ＢＸ−３５ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｃ）またはＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／０６ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｄ）を使用して種々の実験を実施した。ｙ軸は、μｇ／ｍＬでのＨＡ収量を示す。

図５は、対応する野生型株で得たＨＡ収量と、Ｎｏ．３４またはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８骨格を含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスのＨＡ収量を比較する。Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ａ）、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｂ）、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／０６ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｃ）、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／０３／０７ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｄ）、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／３２／０２ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｅ）、ＢＸ−３５ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｆ）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｇ）またはＢ／Ｈｕｂｅｉ−Ｗｕｊｉａｇａｎｇ／１５９／０８ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｈ）を使用して種々の実験を実施した。白色のバーはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８骨格に関する結果を示し、斜線模様のバーはＮｏ．３４骨格に関する結果を示し、格子模様のバーは野生型株に関する結果を示す。ｙ軸は、μｇ／ｍＬでのＨＡ収量を示す。 図５は、対応する野生型株で得たＨＡ収量と、Ｎｏ．３４またはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８骨格を含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスのＨＡ収量を比較する。Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ａ）、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｂ）、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／０６ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｃ）、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／０３／０７ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｄ）、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／３２／０２ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｅ）、ＢＸ−３５ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｆ）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｇ）またはＢ／Ｈｕｂｅｉ−Ｗｕｊｉａｇａｎｇ／１５９／０８ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｈ）を使用して種々の実験を実施した。白色のバーはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８骨格に関する結果を示し、斜線模様のバーはＮｏ．３４骨格に関する結果を示し、格子模様のバーは野生型株に関する結果を示す。ｙ軸は、μｇ／ｍＬでのＨＡ収量を示す。 図５は、対応する野生型株で得たＨＡ収量と、Ｎｏ．３４またはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８骨格を含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスのＨＡ収量を比較する。Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ａ）、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｂ）、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／０６ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｃ）、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／０３／０７ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｄ）、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／３２／０２ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｅ）、ＢＸ−３５ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｆ）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｇ）またはＢ／Ｈｕｂｅｉ−Ｗｕｊｉａｇａｎｇ／１５９／０８ ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント（Ｈ）を使用して種々の実験を実施した。白色のバーはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８骨格に関する結果を示し、斜線模様のバーはＮｏ．３４骨格に関する結果を示し、格子模様のバーは野生型株に関する結果を示す。ｙ軸は、μｇ／ｍＬでのＨＡ収量を示す。

図６は、発育鶏卵での増殖後の、（ａ）Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８（Ｎｏ．３５）からのすべての骨格セグメントならびにＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／１０からのＨＡセグメントおよびＮＡセグメントを含む逆遺伝学由来の再集合体インフルエンザＢ型ウイルス、（ｂ）Ｂ／Ｌｅｅ／４０からのＰＢ２セグメント、ＮＰセグメントおよびＭセグメントならびにＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／１０（Ｎｏ．４１）からのすべての他の遺伝子を含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルス、ならびに（ｃ）野生型Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／１０株（ＷＴ）のＨＡ力価（Ａ）およびウイルス増殖（Ｂ）を比較する。各々の三角形は個々の卵を表し、バーは平均値を表す。「２８０」および「２８００」は、卵に接種した感染量（ＩＵ）を示す。（Ａ）のｙ軸はＨＡ収量を表し、（Ｂ）のｙ軸はＩＵ／ｍＬを表す。

新ドナー株の開発
高増殖ドナー株を提供するために、本発明者らは、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８およびＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０からの骨格セグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスが卵および細胞、例えばＭＤＣＫ細胞中で特に良好に増殖することを見出した。このために、これらのウイルスからの骨格セグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを生成し、生じたインフルエンザＢ型ウイルスをＭＤＣＫ細胞中で増殖させる。ウイルス収量をＥＬＩＳＡによって（国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１２／０５７２３５号に記載されているように）または当分野で公知のＨＡアッセイによって決定する。

再集合体インフルエンザＢ型ウイルスの増殖特性
様々なインフルエンザ株由来のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質ならびにＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８および／またはＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０由来のその他のウイルスセグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを、逆遺伝学によって生成する。対照として対応する野生型インフルエンザＢ型株を使用する。これらのウイルスを発育鶏卵中またはＭＤＣＫ細胞中のいずれかで培養する。以下のインフルエンザＢ型株を使用する：
表１

結果は、再集合体ウイルスＮｏ．２、Ｎｏ．９、Ｎｏ．２２、Ｎｏ．２３、Ｎｏ．２９、Ｎｏ．３０、Ｎｏ．３１、Ｎｏ．３２、Ｎｏ．３３、Ｎｏ．３４およびＮｏ．３５が、培養宿主中で、対応する野生型株と同等に良好にまたは対応する野生型株よりもさらに一層良好に増殖する（図１および２参照）ことを示す。これらの株の大部分はＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８からのＮＰセグメントを含み、一部（特に最も良好に増殖した株）はＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８からのＰＢ２セグメントをさらに含む。これらのウイルスすべてが、また、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株からのウイルスセグメントを７：１、６：２、４：４、３：４または１：７の比で含む。

Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８からの骨格セグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスの増殖特性
本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを種々の株からのＨＡセグメントおよびＮＡセグメントと共に使用することができるかどうかを試験するため、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０、Ｂ／Ｌｅｅ／４０またはＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／０６からのＨＡセグメントおよびＮＡセグメントならびにＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８からの骨格セグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを生成する。再集合体インフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞中で６０時間増殖させ、ＥＬＩＳＡまたはＨＡアッセイによってＨＡ収量を決定する。データ（図３参照）は、再集合体インフルエンザＢ型ウイルスすべてが野生型インフルエンザＢ型ウイルスと比較してより高い力価まで増殖したことを示し、これは、本発明の再集合体インフルエンザＢ型ウイルスが様々な異なるＨＡセグメントおよびＮＡセグメントのために有用であることを示す。

ハイブリッド骨格セグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスの増殖特性
本発明の骨格セグメントを含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスの増殖特性も、野生型インフルエンザＢ型ウイルスならびにＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８からのＨＡセグメント、ＮＡセグメント、ＰＡセグメント、ＰＢＩセグメント、およびＮＳセグメント、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０からのＰＢ２およびＭセグメントおよびＢ／Ｌｅｅ／４０からのＮＰセグメントを含む公知のインフルエンザＢ型再集合体ＢＸ３５と比較して決定する。これらの骨格をＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０、ＢＸ−３５およびＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／０６のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質に関して試験する。再集合体インフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞中で６０時間増殖させ、ＥＬＩＳＡまたはＲＰ−ＨＰＬＣによってＨＡ収量を決定する。データ（図４参照）は、本発明の骨格を含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスが、野生型および公知のＢＸ３５骨格を含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスと比較してより高い力価まで増殖できることを示す。

Ｎｏ．３４およびＮｏ．３５で得たＨＡ収量を、多くの異なるＨＡセグメントおよびＮＡセグメントを使用してさらに試験する。ＭＤＣＫ細胞をこれらの再集合体インフルエンザＢ型ウイルスおよび対応する野生型インフルエンザＢ型ウイルスに感染させる。データ（図５参照）は、本発明による骨格を含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルスすべてが対応する野生型株と同等に良好にまたは野生型株よりも良好に増殖できることを示す。

卵における再集合体インフルエンザＢ型ウイルスの増殖特性
発育鶏卵に、２８０または２８００感染量（ＩＵ）の（ａ）Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８からのすべての骨格セグメント（Ｎｏ．３５骨格）ならびにＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／１０からのＨＡセグメントおよびＮＡセグメントを含む逆遺伝学由来の再集合体インフルエンザＢ型ウイルス、（ｂ）Ｂ／Ｌｅｅ／４０からのＰＢ２セグメント、ＮＰセグメントおよびＭセグメントならびにＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／１０からのすべての他の遺伝子を含む再集合体インフルエンザＢ型ウイルス（ＢＸ−４１）、ならびに（ｃ）野生型Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／１０株を接種した。卵の尿膜腔液を感染の７２時間後に採取し、ＨＡアッセイによってＨＡ力価を、またはフォーカス形成アッセイによってウイルス増殖をアッセイした。データ（図６参照）は、本発明による再集合体インフルエンザＢ型ウイルスが対照株と同等に良好にまたは対照株よりも良好に増殖できることを示す。

本発明を単なる例として記載したことならびに本発明の範囲および精神を保持しつつ変更を行い得ることが理解される。

Claims (42)

1. 再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを調製する方法であって、
   （ｉ）インフルエンザＢ型ウイルスを生成するのに必要なウイルスセグメントをコードする１つまたはそれより多くの発現構築物を培養宿主に導入するステップであって、該発現構築物が、第一のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＨＡセグメントならびにＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株である第二のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＮＰセグメントおよび／またはＰＢ２セグメントをコードする、ステップ；ならびに
   （ｉｉ）再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを産生させるために該培養宿主を培養するステップ
   を含む方法。
2. 再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを調製する方法であって、
   （ｉ）インフルエンザＢ型ウイルスを生成するのに必要なウイルスセグメントをコードする１つまたはそれより多くの発現構築物を培養宿主に導入するステップであって、該発現構築物が、第一のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＨＡセグメントならびにＢ／Ｌｅｅ／４０またはＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６またはＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０ではない第二のインフルエンザＢ型ウイルス由来のＮＰセグメントをコードする、ステップ；ならびに
   （ｉｉ）再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを産生させるために該培養宿主を培養するステップ
   を含む方法。
3. 前記ＮＰセグメントおよびＰＢ２セグメントが前記第二のインフルエンザＢ型ウイルス由来である、請求項２に記載の方法。
4. 前記第二のインフルエンザＢ型ウイルスがＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株である、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
5. ＰＡセグメント、ＰＢ１セグメント、ＰＢ２セグメント、ＮＰセグメント、ＮＳセグメントおよびＭセグメントが前記第二のインフルエンザＢ型ウイルス由来である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記再集合体インフルエンザＢ型ウイルスが２またはそれより多くのインフルエンザＢ型株由来の骨格セグメントを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 少なくとも１つの骨格セグメントがＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来である、請求項６に記載の方法。
8. 再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを調製する方法であって、
   （ｉ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来のＨＡセグメントおよびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来の少なくとも１つの骨格セグメントを含むインフルエンザＢ型ウイルスを生成するのに必要なウイルスセグメントをコードする１つまたはそれより多くの発現構築物を培養宿主に導入するステップ；ならびに
   （ｉｉ）再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを産生させるために該培養宿主を培養するステップ
   を含む方法。
9. ２、３、４、５または６個の骨格セグメントが前記Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来である、請求項８に記載の方法。
10. 前記Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来のセグメントと前記Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来のセグメントとの比が７：１、６：２、４：４、３：５または１：７である、請求項８に記載の方法。
11. 再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを調製する方法であって、
    （ｉ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来のウイルスセグメントを含むインフルエンザＢ型ウイルスを生成するのに必要なウイルスセグメントをコードする１つまたはそれより多くの発現構築物を培養宿主に導入するステップであって、該Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株由来のセグメントと該Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来のセグメントとの比が１：７、２：６、３：５、４：４、５：３、６：２または７：１である、ステップ；ならびに
    （ｉｉ）再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを産生させるために該培養宿主を培養するステップ
    を含む方法。
12. 前記比が７：１、６：２、４：４、３：５または１：７である、請求項１０または１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株がＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８である、請求項１または請求項４から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株がＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０である、請求項７から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記ＮＰセグメントが、配列番号４の配列に少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有するタンパク質をコードする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
16. 前記ＰＢ２セグメントが、配列番号３の配列に少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するタンパク質をコードする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
17. 前記ＮＳセグメントが、配列番号３５の配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するタンパク質をコードする、および／または前記Ｍ１セグメントが、配列番号３４の配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するタンパク質をコードする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
18. 前記再集合体インフルエンザＢ型ウイルスが、
    ａ）配列番号１の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有するＰＡタンパク質；および／または
    ｂ）配列番号２の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有するＰＢ１タンパク質；および／または
    ｃ）配列番号５の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有するＭ１タンパク質；および／または
    ｄ）配列番号６の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有するＭ２タンパク質；および／または
    ｅ）配列番号７の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有するＮＳ１タンパク質；および／または
    ｆ）配列番号８の配列に少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有するＮＳ２タンパク質
    を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
19. 再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを調製する方法であって、
    （ｉ）ａ）配列番号１１のＰＡセグメント、配列番号１２のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号１６のＮＳセグメントおよび配列番号１５のＭセグメント；または
    ｂ）配列番号１１のＰＡセグメント、配列番号３１のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント；または
    ｃ）配列番号１１のＰＡセグメント、配列番号３１のＰＢ１セグメント、配列番号３２のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号１６のＮＳセグメントおよび配列番号１５のＭセグメント；または
    ｄ）配列番号３０のＰＡセグメント、配列番号１２のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号１６のＮＳセグメントおよび配列番号１５のＭセグメント；または
    ｅ）配列番号１１のＰＡセグメント、配列番号１２のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント；または
    ｆ）配列番号３０のＰＡセグメント、配列番号３１のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号３３のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント；または
    ｇ）配列番号３０のＰＡセグメント、配列番号３１のＰＢ１セグメント、配列番号３２のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント；または
    ｈ）配列番号１１のＰＡセグメント、配列番号１２のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号３３のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント；または
    ｉ）配列番号１１のＰＡセグメント、配列番号１２のＰＢ１セグメント、配列番号３２のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント；または
    ｊ）配列番号３０のＰＡセグメント、配列番号１２のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント；または
    ｋ）配列番号３０のＰＡセグメント、配列番号３１のＰＢ１セグメント、配列番号１３のＰＢ２セグメント、配列番号１４のＮＰセグメント、配列番号３５のＮＳセグメントおよび配列番号３４のＭセグメント
    を含むインフルエンザＢ型ウイルスを生成するのに必要なウイルスセグメントをコードする１つまたはそれより多くの発現構築物を培養宿主に導入するステップ；ならびに
    （ｉｉ）再集合体インフルエンザＢ型ウイルスを産生させるために該培養宿主を培養するステップ
    を含む方法。
20. ステップ（ｉｉ）で得た前記再集合体ウイルスを精製するステップ（ｉｉｉ）をさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる再集合体インフルエンザＢ型ウイルス。
22. 前記培養宿主が発育鶏卵である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記培養宿主が細胞である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記細胞がＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞またはＰｅｒＣ６細胞である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記細胞が接着して増殖する、請求項２３または２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記細胞が懸濁状態で増殖する、請求項２３または２４のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記ＭＤＣＫ細胞が細胞株ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９）である、請求項２６に記載の方法。
28. （ａ）請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法によってウイルスを調製するステップおよび（ｂ）該ウイルスからワクチンを調製するステップを含む、ワクチンを調製する方法。
29. 請求項２１に記載のウイルスからワクチンを調製するステップを含む、ワクチンを調製する方法。
30. ステップ（ｂ）が前記ウイルスを不活化することを含む、請求項２８または２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記ワクチンが全ビリオンワクチンである、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記ワクチンがスプリットビリオンワクチンである、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記ワクチンが表面抗原ワクチンである、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記ワクチンがビロソームワクチンである、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記ワクチンが用量当たり１０ｎｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項２８から３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記ワクチンがインフルエンザＡ型株由来の抗原を含む、請求項２８から３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記インフルエンザＡ型株が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプの株である、請求項３６に記載の方法。
38. 請求項２８から３７のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるワクチン。
39. 請求項２１に記載のインフルエンザＢ型ウイルスのセグメントをコードするｖＲＮＡを含む１つまたはそれより多くの発現構築物を含む発現系。
40. 請求項３９に記載の発現系を含む宿主細胞。
41. 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項４０に記載の宿主細胞。
42. 前記宿主細胞がＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞またはＰｅｒＣ６細胞である、請求項４１に記載の宿主細胞。

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