JP2016504999A - エイコサペンタエン酸（ｅｐａ）製剤 - Google Patents

エイコサペンタエン酸（ｅｐａ）製剤 Download PDF

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Abstract

本発明は、エイコサペンタエン酸（EPA）および極性脂質（例えば糖脂質およびリン脂質）を含み、ドコサヘキサエン酸（DHA）もエステル化脂肪酸も一切含有しない組成物を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2013年3月12日に出願された米国特許非仮出願第13/797,802号の一部継続出願であり、2012年12月24日に出願された米国特許仮出願第61/745,740号および2013年4月26日に出願された米国特許仮出願第61/816,561号の米国特許法第119条(e)に基づく恩典を主張する。これらの特許出願はいずれも、あらゆる目的において、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
分野
本発明は、エイコサペンタエン酸（EPA）および極性脂質（例えばリン脂質または糖脂質）を含み、ドコサヘキサエン酸（DHA）を一切含有しない組成物を提供する。
背景
今日までのところEPA製剤の主な供給源は魚油またはオキアミのいずれかである。魚油の場合、いくつかの課題がある。すなわち、漁場の枯渇、比較的低いEPA含量、混合物中のDHAおよび他の6種類のオメガ-3化合物、ならびに種内および種間の自然変動に基づくEPA含量の変動である。他の5種類のオメガ-3化合物は、タンパク質受容体へのアクセスに関してEPAと競合するので、問題になる。漁場枯渇のせいで、魚油生産者の少なくとも1社が、その大西洋メンハーデン（Atlantic menhaden）の割当量を20％減らされている（インターネットではnutraingredients-usa.com/Industry/Omega-Protein-s-Atlantic-menhaden-catch-to-be-cut-by-20）。
未精製魚油のEPA濃度が低いことと、分子量の近い他の構成要素が存在することが、精製損失を招く。魚油は糖脂質を何も含まない。未精製魚油中に存在するリン脂質（PL）は、これらの構成要素を除去するために特別に設計された油料種子産業からの転用である脱ガム工程によって、除去される傾向にある。そのうえ、最も一般的な精製方法の一工程であるエチルエステルへのエステル交換も、リン脂質を破壊する傾向にある。最終製品中のリン脂質は0.5重量％未満になるであろう。
オキアミ油についても、同じ課題がいくつか当てはまる。オキアミ（ナンキョクオキアミ（Euphausia superba））は南極圏に天然に産する。オキアミは、多くの科学者により、世界最大のバイオマスであるとみなされている。ナンキョクオキアミは南極圏または亜南極圏の水域および群島に生きるほとんど全ての動物種の生存の基礎をなしている。オキアミも8種類のオメガ-3脂肪酸を含有する。オキアミ中の脂肪酸の多くはEPAとほとんど同じ分子量であるため、それらを精製によって除去することは難しい。他のオメガ-3類は受容体に関して競合するので、存在するEPAを減少させる。オキアミもオメガ-3含量のばらつきが大きく、熱作用と酵素作用の両方によるFFAへのPLの分解を非常に起こしやすい。
仮に米国と欧州の全ての人が、1日あたり2gのEPA（心血管の健康および精神面の健康に有効であると実証されているレベル）を摂取したとすると、持続的供給をもたらすのに足りる魚は、海には存在しない。
概要
バイオアベイラビリティが高い形態にあるEPA（例えば遊離脂肪酸として、糖脂質コンジュゲートとして、およびリン脂質コンジュゲートとして）の濃度が増加しており、かつバイオアベイラビリティが最も低い形態にあるEPA（例えばジグリセリドコンジュゲートまたはトリグリセリドコンジュゲートとして）の濃度が低下しているかまたはそれらが排除されているために、バイオアベイラビリティが改良されているEPA製剤を提供する。本EPA製剤は、低減したEPA投薬量（例えばオキアミ油および/または魚油と比較して10％、15％、20％、25％低減したEPA投薬量）で、また低下した極性脂質濃度（例えばオキアミ油および/または魚油における35重量％超、例えば少なくとも39重量％と比較して、全組成物の35重量％未満）で、さまざまなターゲット臓器および組織（例えば血液（血漿）、脳、肝臓、脂肪、皮膚）に、等価なレベルまたは増加したレベルのEPAを送達する。
したがってさまざまな態様において、約15重量％〜約90重量％のエイコサペンタエン酸（EPA）、約10重量％〜約70重量％の極性脂質、0重量％〜約5重量％のエステル化EPAを含み、ドコサヘキサエン酸（DHA）を含まず、かつヒトによる摂取に適したEPA組成物が提供される。本明細書において、DHAは、遊離脂肪酸、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、スフィンゴ脂質、リン脂質、および糖脂質を含む任意の脂質形態にあるDHAを指す。いくつかの態様では、脂質クラス別に以下のEPAの分布を含む、ヒトによる摂取に適したEPA組成物が提供される:EPAの約3重量％〜約50重量％はリン脂質コンジュゲートであり;EPAの約5重量％〜約50重量％は糖脂質コンジュゲートであり;EPAの約0重量％〜約10重量％はトリグリセリドコンジュゲートまたはジグリセリドコンジュゲートであり;かつEPAの約15重量％〜約85重量％は遊離脂肪酸の形態にある。いくつかの態様において、本組成物は、約15重量％〜約75重量％のEPA、例えば約20重量％〜約50重量％のEPAを含む。いくつかの態様において、本組成物はエステル化EPAを含まない。いくつかの態様において、本組成物は、約5重量％未満のエステル化EPA、例えば約0重量％〜約0.5重量％、1.0重量％、1.5重量％、2.0重量％、2.5重量％、3.0重量％、3.5重量％、4.0重量％、4.5重量％または5.0重量％のエステル化EPAを含む。さまざまな態様において、EPAは、遊離脂肪酸、リン脂質コンジュゲート、糖脂質コンジュゲート、トリグリセリドコンジュゲート、およびジグリセリドコンジュゲートからなる群より選択される1つまたは複数の形態にある。いくつかの態様では、組成物中のEPAの約0重量％〜約10重量％がトリグリセリドコンジュゲートまたはジグリセリドコンジュゲートであり、例えば組成物中のEPAの約0.2重量％未満がトリグリセリドコンジュゲートまたはジグリセリドコンジュゲートである。いくつかの態様では、組成物中のEPAの約15重量％〜約85重量％が遊離脂肪酸の形態にあり、例えば組成物中のEPAの少なくとも約20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、50重量％〜約85重量％が遊離脂肪酸の形態にある。いくつかの態様では、組成物中のEPAの約5重量％〜約90重量％が極性脂質コンジュゲートであり、例えば組成物中のEPAの約10重量％〜約80重量％が極性脂質コンジュゲートである。いくつかの態様において、本組成物は、少なくとも約13重量％の極性脂質、例えば少なくとも約14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％の極性脂質を含む。いくつかの態様において、本組成物は、約10重量％〜約35重量％の極性脂質、例えば約10重量％〜約15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、または35重量％の極性脂質を含む。いくつかの態様では、極性脂質が、約3:1〜約1:3の範囲の重量％比のリン脂質コンジュゲートと糖脂質コンジュゲートとから構成される。いくつかの態様では、組成物中のEPAの約5重量％〜約50重量％が糖脂質コンジュゲートである。いくつかの態様では、糖脂質コンジュゲートが、ジガラクトシルジアシルグリセロールおよびモノガラクトシルジアシルグリセロールのうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、組成物中のEPAの約3重量％〜約50重量％がリン脂質コンジュゲートである。いくつかの態様では、リン脂質コンジュゲートが、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルグリセロールのうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、リン脂質コンジュゲートが、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールのうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、総オメガ-3脂肪酸に対するEPAの比が、90％超、例えば91％超、92％超、93％超、94％超、95％超、96％超、97％超、98％超、99％超、またはそれ以上である。いくつかの態様において、本組成物は、少なくとも約13重量％の極性脂質、例えば少なくとも約14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％の極性脂質と、0.2重量％未満のグリセリドコンジュゲートと、少なくとも約30重量％の遊離脂肪酸とを含む。いくつかの態様において、本組成物は、約20〜50重量％のEPA、約10〜25重量％の糖脂質、および約5〜25重量％のリン脂質を含む。さまざまな態様において、本組成物はクロロフィルaを含む。さまざまな態様において、本組成物はクロロフィルcを含まない。いくつかの態様において、本組成物は、約10.0重量％未満のアラキドン酸、例えば約9.5重量％未満、9.0重量％未満、8.5重量％未満、8.0重量％未満、7.5重量％未満、7.0重量％未満、6.5重量％未満、6.0重量％未満、5.5重量％未満、5.0重量％未満、4.5重量％未満、4.0重量％未満、3.5重量％未満、3.0重量％未満、2.5重量％未満、2.0重量％未満、1.5重量％未満または1.0％未満のアラキドン酸を含むか、またはアラキドン酸を含まない。いくつかの態様において、本EPA組成物は、無傷細胞、細胞構成要素、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドを含まないか、または実質的に含まない。いくつかの態様において、本組成物は、補酵素Q9（CoQ9）および/または補酵素Q10（CoQ10）を含む。いくつかの態様において、本組成物は約1重量％未満のフィトステロールを含む。いくつかの態様において、本組成物は、約2重量％未満のカロテノイドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、オクタデカテトラエン酸、すなわちステアリドン酸（SDA＝C18:4ω3）、エイコサトリエン酸（ETE＝C20:3ω3）、エイコサテトラエン酸（ETA＝C20:4ω3）、ヘンエイコサペンタエン酸（heneicosapentaenoic acid）、すなわちウンコサペンタエン酸（uncosapentaenoic acid）（HPA＝C21:5ω3）、およびドコサペンタエン酸（DPA＝C22:5ω3）からなる群より選択される脂肪酸を含まない。いくつかの態様において、本組成物は、アスタキサンチン、cis-ルテイン、trans-ルテイン、cis-ゼアキサンチン、trans-α-クリプトキサンチン、trans-α-カロテン、cis-α-カロテン、cis-リコペン、およびtrans-リコペンからなる群より選択されるカロテノイドのうちの1つまたは複数、例えば2つ以上、または全部を含まない。いくつかの態様において、本組成物は、N-アシル-ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルエタノールアミンからなる群より選択される1つまたは複数のリン脂質を含まない。いくつかの態様において、本組成物はスフィンゴ脂質を含まない。
いくつかの態様において、本組成物は、脂質クラス別に以下のEPAの分布を含む:
EPAの約3重量％〜約50重量％がリン脂質コンジュゲートであり;
EPAの約5重量％〜約50重量％が糖脂質コンジュゲートであり;
EPAの約0重量％〜約10重量％がトリグリセリドコンジュゲートまたはジグリセリドコンジュゲートであり;かつ
EPAの約15重量％〜約85重量％が遊離脂肪酸の形態にある。
いくつかの態様において、本組成物は、
（i）0〜5重量％のC:18脂肪酸;
（ii）0〜20重量％のC:16脂肪酸;
（iii）0〜5重量％のC:14脂肪酸;
（iv）0〜0.5重量％のC:12脂肪酸;および/または
（v）0〜0.5重量％のC:10脂肪酸
を含む。
さまざまな態様において、本組成物は以下の構成要素を含む。
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さまざまな態様において、本組成物は以下の構成要素を含む。
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さまざまな態様において、本組成物は、オキアミ油または魚油と比較して、ターゲット組織（例えば血液（血漿）、脳、肝臓、脂肪、皮膚）へのバイオアベイラビリティが等しいかまたは増加しているEPAを含む。
さらなる局面では、上述し本明細書において説明するEPA組成物を含む、ヒトによる摂取に適したカプセル剤、錠剤、溶液剤、シロップ剤、または懸濁剤が提供される。さまざまな態様では、カプセル剤がゲルカプセル剤である。さらに、上述し本明細書において説明するEPA組成物を含む食品、飲料、エネルギーバー、または栄養補助食品が提供される。
さらに、精神障害、心血管疾患、肝疾患、慢性肝炎、脂肪症、肝線維症、アルコール依存症、栄養失調、慢性的な非経口栄養、リン脂質欠乏、脂質過酸化、細胞再生の律動異常（disarrhythmia of cell regeneration）、細胞膜の不安定化、閉経期または閉経後の状態、がん、加齢、良性前立腺肥大、腎臓疾患、浮腫、皮膚疾患、胃腸疾患、妊娠中毒症、関節炎、骨粗鬆症、炎症性疾患、および神経変性疾患からなる群より選択される疾患状態を防止し、改善し、緩和し、その進行を遅延させ、かつ/または処置する方法が提供される。いくつかの態様において、本方法は、本方法を必要とする対象に、有効量の、上述し本明細書において説明する組成物、カプセル剤、錠剤、溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、食品、飲料、エネルギーバー、または栄養補助食品を投与することを含む。さまざまな態様において、投与は、経口投与または経皮投与である。いくつかの態様では、疾患状態が、うつ病、単極性うつ病、大うつ病、抑うつ気分および/または産後うつ病、双極性障害、不安、パニック障害および社会恐怖障害、気分障害、統合失調症、強迫性障害（OCD）、境界型人格障害、注意欠陥多動障害および関連障害、および神経性食欲不振症からなる群より選択される精神障害である。いくつかの態様では、疾患状態が、高血圧症、冠動脈疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、高血圧、および末梢血管系疾患からなる群より選択される心血管疾患である。
さらに、EPAを含む組成物を生産する方法も提供される。いくつかの態様において、本方法は以下の工程を含む:
（a）藻類ペーストを用意する工程;
（b）藻類ペーストから有機溶剤で脂質を抽出することによって、中性脂質と極性脂質とを含む粗藻類抽出物（CAE）を該ペーストの水溶性構成要素から実質的に単離する工程;
（c）残存する水溶性構成要素をCAEから実質的に除去することによって、粗藻類油（CAO）を得る工程;
（d）CAOを超臨界CO2と接触させる工程であって、超臨界CO2が、中性脂質を選択的に抽出することによって、CAOを、遊離脂肪酸を含む中性脂質画分と、糖脂質およびリン脂質を含む極性脂質画分とに分ける、工程;
（e）C20遊離脂肪酸を中性脂質画分から単離することによって、濃縮EPA遊離脂肪酸画分を得る工程;および
（f）工程（e）において生産された濃縮EPA遊離脂肪酸画分を工程（d）において生産された極性脂質画分と組み合わせる工程。
いくつかの態様において、本方法は以下の工程を含む:
（a）藻類ペーストを用意する工程;
（b）藻類ペーストから有機溶剤で脂質を抽出することによって、中性脂質と極性脂質とを含む粗藻類抽出物（CAE）を該ペーストの水溶性構成要素から単離する工程;
（c）残存する水溶性構成要素をCAEから実質的に除去することによって、粗藻類油（CAO）を得る工程;
（d）CAOの第1の部分を加水分解することによって、CAOの該部分において遊離脂肪酸を放出させる工程;
（e）放出された遊離脂肪酸を鎖長に従って分画することによって、C20遊離脂肪酸を単離し、濃縮EPA遊離脂肪酸画分を得る工程;および
（f）工程（e）において生産された濃縮EPA遊離脂肪酸画分と工程（c）において生産されたCAOの第2の部分とを組み合わせる工程。
本方法のいくつかの態様では、溶剤が、エーテル、ケトン、アルコール、およびそれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの態様では、溶剤が、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、ジメチルエーテル、およびそれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの態様では、有機溶剤が、無水エタノール、190プルーフ（95v/v％）エタノール（EtOH）、変性190プルーフエタノール、特別変性アルコール（SDA）、アセトンとエタノール、イソプロピルアルコール、アセトンとメタノール、メチルエチルケトン（MEK）とメタノール、MEKとエタノール、ジメチルエーテル、ジメチルエーテルとメタノール、ジメチルエーテルとエタノールからなる群より選択される。いくつかの態様では、有機溶剤がジメチルエーテルとエタノールの混合物である。さまざまな態様において、溶剤は、ヘプタン（Hep）、酢酸エチル（EtAc）、メタノール（MeOH）、および水（H2O）を、例えば1:1:1:1の体積比で含む。さまざまな態様において、溶剤は、プロパン、EtAC、エタノール（EtOH）、および水（H2O）を、例えば1:1:1:1の体積比で含む。さまざまな態様において、溶剤は、ブタン、EtAc、EtOH、および水（H2O）を、例えば1:1:1:1の体積比で含む。いくつかの態様では、超臨界CO2が約100バール〜約1000バールの範囲、例えば約340バール〜約700バールの範囲、例えば約350バール〜約690バールの範囲の圧力、および約35℃〜約110℃の範囲、例えば約40℃〜約110℃の範囲、例えば60℃〜90℃の範囲の温度に維持される。いくつかの態様では、中性脂質画分が加水分解を受けることによって、遊離脂肪酸を放出する。いくつかの態様では、CAEの一部分が加水分解を受けることによって、遊離脂肪酸を放出する。いくつかの態様では、CAOの一部分が加水分解を受けることによって、遊離脂肪酸を放出する。いくつかの態様では、加水分解を達成するために、中性脂質画分、CAEまたはCAOが、熱、アルカリおよび/または酸に曝露される。いくつかの態様では、超臨界CO2の圧力勾配、例えば超臨界CO2の段階的または連続圧力勾配で、遊離脂肪酸を分画することにより、C20遊離脂肪酸が、放出された遊離脂肪酸から単離される。さまざまな態様において、超臨界CO2の圧力勾配は、約172バールから約345バールまでである。さまざまな態様において、超臨界CO2の圧力勾配は等温であり、例えば約50℃〜約70℃の一定温度に維持される。
さらなる態様において、本方法は、EPAと極性脂質とを含む組成物を生産する工程であって、以下の工程を含むものを含む:
（a）藻類ペーストを用意する工程;
（b）藻類ペーストを濃エタノールで抽出する工程であって、エタノールの濃度が、少なくとも約70体積％、例えば少なくとも約75体積％、80体積％、85体積％、90体積％または95体積％である、工程;
（c）エタノールを藻類ペーストから実質的に除去することによって、中性脂質と極性脂質とを含む粗藻類抽出物（CAE）を得る工程;
（d）C3-C7アルカン溶剤でCAEを抽出する工程;
（e）アルカン溶剤を実質的に除去することによって、極性脂質と脂肪酸とに富む粗藻類油（CAO）を得る工程;
（f）CAOの第1の部分において極性脂質を濃化する工程であって、
（i）CAOの第1部分を第1のシリカゲル吸着剤と接触させること;
（ii）第1のシリカゲル吸着剤をC3-C7アルカンと接触させることによって中性脂質を溶出させること;および
（iii）第1のシリカゲル吸着剤をC1-C4アルコールと接触させることによって極性脂質を溶出させること
を含み、それによって濃縮極性脂質（CPL）を得る工程;
（g）CAOの第2の部分において遊離脂肪酸を濃化する工程であって、
（i）CAOの第2の部分と工程（f）の（ii）において溶出させた中性脂質とを加水分解に供すこと;
（ii）加水分解されたCAOを第2のシリカゲル吸着剤と接触させること;
（iii）第2のシリカゲル吸着剤をC3-C7アルカンと接触させることによって遊離脂肪酸を溶出させること;および
（iv）工程（g）の（iii）において溶出させた遊離脂肪酸からEPAを濃縮すること
を含み、それによって濃縮EPAを得る工程;および
（h）工程（f）の（iii）において得たCPLと工程（g）の（iv）において得た濃縮EPAとを組み合わせることによって、EPAと極性脂質とを含む組成物を生産する工程。さまざまな態様において、工程（b）で使用されるエタノールの濃度は96％未満である。さまざまな態様において、本方法はさらに、工程（d）においてCAEを酢酸エチルで抽出する工程を含む。さまざまな態様において、本方法はさらに、工程（f）の（ii）の後に、第1のシリカゲル吸着剤をアセトンと接触させることによって極性脂質を溶出させることを含む。いくつかの態様では、EPAが、尿素結晶化によって遊離脂肪酸から濃縮される。いくつかの態様では、EPAが、超臨界二酸化炭素分画によって遊離脂肪酸から濃縮される。いくつかの態様では、EPAが超臨界CO2の圧力勾配を使って濃縮される。いくつかの態様では、超臨界CO2の圧力勾配が約172バールから約345バールまでである。いくつかの態様では、超臨界CO2の圧力勾配が等温である。いくつかの態様では、超臨界CO2の圧力勾配が約50℃〜約70℃の一定温度に維持される。
生産方法のさらなる態様に関して、いくつかの態様では、ペーストが湿ペーストである。いくつかの態様では、藻類細胞がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）細胞を含む。いくつかの態様では、ナンノクロロプシス細胞が、N.オクラタ（N.oculata）、N.オセアニカ（N.oceanica）、およびそれらの混合物から選択される。いくつかの態様では、藻類細胞がさらに、例えば屋外培養の典型的副産物として、ナンノクロリス（Nannochloris）細胞（例えば全細胞の約10％未満、9％未満、8％未満、7％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、または1％未満）を含む。さまざまな態様において、本方法は、エステル化工程を含まない。いくつかの態様では、藻類細胞が、機械的破砕、熱的前処理、アルカリ処理および/または酸処理を受けない。いくつかの態様では、藻類細胞の細胞膜が破壊されない。いくつかの態様において、ペーストは乾燥を受けていない。いくつかの態様において、ペーストは、熱乾燥、真空乾燥、周囲温度乾燥、および/または凍結乾燥を受けていない。
さらなる局面では、上述し本明細書において説明する方法によって生産されるEPA組成物が提供される。
定義
単離、除去または精製に関して「実質的に」という用語は、少なくとも約90％は単離され、除去され、かつ/または精製されていること、例えば少なくとも約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上単離され、除去され、または精製されていることを指す。
本明細書にいう「投与」は、例えば経腸投与、非経口投与、および外用/経皮投与を含む局所投与および全身性投与を指す。本明細書に記載する方法において役立ちうるEPA製剤の投与経路としては、対象への、例えば経口（per os（P.O.））投与、坐剤としての投与、体表部との接触（topical contact）、経皮送達（例えば経皮パッチによるもの）、静脈内（「iv」）投与、腹腔内（「ip」）投与、または徐放性デバイス、例えばミニ浸透圧ポンプ、デポー製剤などの埋め込みが挙げられる。投与は、非経口経路および経粘膜（例えば経口、経鼻、膣、直腸または経皮）経路を含む任意の経路で行うことができる。非経口投与としては、例えば静脈内、動脈内、室内が挙げられる。他の送達様式として、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、経皮パッチなどが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書に記載するEPA製剤と別の活性作用物質（例えば、うつ病、高血圧、および/またはコレステロールレベルの上昇を処置しまたは改善するために現在投与されている薬学的作用物質、アスタキサンチン、ビタミンE、リン脂質、補酵素Q9（CoQ9）、補酵素Q10（CoQ10））とに関して、「共投与」または「同時投与」という用語は、EPA組成物と前記活性作用物質とがどちらも同時に生理学的作用を果たすことができるような、両者の投与を指す。ただし2つの作用物質が一緒に投与される必要はない。一定の態様では、一方の作用物質の投与が、他方の投与より先に行われてもよい。同時の生理学的作用は、両作用物質が循環中に同時に存在することを、必ずしも必要としない。ただし一定の態様では、共投与により、典型的には、両方の作用物質が体内（例えば血漿中）に、任意の所与の用量に関するそれらの最大血清中濃度のかなりの分率（例えば20％以上、好ましくは30％または40％以上、より好ましくは50％または60％以上、最も好ましくは70％または80％または90％以上）で、同時に存在することになる。
「有効量」または「薬学的有効量」という用語は、所望の結果を生じさせるのに必要な本明細書に記載するEPA組成物の量および/または投薬量および/または投薬レジメン、例えば、EPAによって緩和される疾患状態（例えばうつ病）に関連する1つまたは複数の症状を哺乳動物において緩和するのに十分な量、または哺乳動物においてEPAによって緩和される疾患状態の重症度を減じまたはその進行を遅延させるのに十分な量（例えば治療有効量）、哺乳動物においてEPAによって緩和される疾患状態のリスクを低減し、その発症を遅延させ、かつ/またはその最終的重症度を低減するのに十分な量（例えば予防有効量）を指す。
「サブ治療用量」は、投与された薬理活性作用物質の量として、または対象における薬理活性作用物質の実際のレベルとして、それだけでは意図する薬理学的効果を引き出す（例えば鎮痛効果および/または抗炎症効果を得る）のには機能的に不十分であるか、またはその特定薬理作用物質について確立された治療用量（例えば、当業者が参照する参考文献に公表されているもの、例えばPhysicians' Desk Reference, 67th Ed., 2013、Thomson Healthcare、またはBrunton, et al., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th edition, 2010, McGraw-Hill Professionalに公表されている薬理作用物質に関する用量）よりも量的に少ない、薬理活性作用物質の用量を指す。「サブ治療用量」は、相対的観点から（すなわち、従来から投与されている薬理活性作用物質の百分率量（100％未満）として）定義することができる。例えばサブ治療用量の量は、従来から投与されている薬理活性作用物質の量の約1％〜約75％であることができる。いくつかの態様では、サブ治療用量は、従来から投与されている薬理活性作用物質の量の約75％、50％、30％、25％、20％、10％またはそれ未満であることができる。
「投与させる」という表現は、医療従事者（例えば医師）または対象の医療を管理する人がとる行為であって、その対象への本明細書に記載するEPA組成物の投与を管理しかつ/または許可する行為を指す。投与させることは、診断、および/または適当な治療レジメンまたは予防レジメンの決定、および/または対象のために本明細書に記載するEPA組成物を処方することを伴いうる。前記処方することには、処方箋書式を立案すること、診療記録に注釈をつけることなどを含めることができる。
1つまたは複数の他の活性作用物質と一緒になされる本明細書に記載のEPA組成物の使用に関して、「と一緒に」という表現を使用する場合、それは、EPA組成物と他の活性作用物質とが、当該生物に対するそれらの生理活性に少なくとも多少の時間的オーバーラップがあるように投与されることを示す。それらが互いに一緒には投与されない場合、当該生物に対する生理活性に時間的なオーバーラップはない。一定の好ましい態様では、「他の薬物」が当該生物に全く投与（例えば共投与）されない。
本明細書において使用する用語「処置する」および「処置」は、この用語が適用される疾患もしくは状態、またはそのような疾患もしくは状態の1つまたは複数の症状のいずれかについて、その発生を遅延させ、その進行を遅らせまたは逆転させ、その重症度を低減し、またはそれを軽減もしくは防止することを指す。
用語「緩和する」は、その病態または疾患の1つまたは複数の症状の低減または排除、および/またはその病態もしくは疾患の1つまたは複数の症状の発生率の低減もしくは発生の遅延またはその重症度の低減、および/またはその病態もしくは疾患の防止を指す。
「精神医学的状態」という用語は、本明細書において列挙する精神医学的状態を含めて、American Psychiatric AssociationによるDiagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders DSM-IV-TR Fourth Edition (Text Revision）（Jun 2000）に定義されているとおりである。
本明細書において使用する「本質的に〜からなる」という表現は、ある方法または組成物において列挙された活性薬学的作用物質（例えば本明細書に記載するEPA組成物）の類概念または種概念を指し、列挙した適応または目的についてそれだけでは実質的活性を有さない他の薬剤をさらに含むことができる。いくつかの態様において、「本質的に〜からなる」という表現は、本明細書に記載のEPA組成物および/または本明細書に記載のEPA組成物の列挙された構成要素以外には、薬理学的活性を有する1つまたは複数の追加作用物質の包含を明確に除外する。
用語「対象」、「個体」、および「患者」は、可換的に、哺乳動物、好ましくはヒトまたは非ヒト霊長類を指すが、家畜化された哺乳動物（例えばイヌまたはネコ）、実験動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット）および農業動物（例えばウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ）も指す。さまざまな態様において、対象は、病院、精神科医療施設において、外来患者として、または他の臨床状況において、医師または他の医療保健業務従事者のケアを受けている、ヒト（例えば成人男性、成人女性、青年期男性、青年期女性、男児、女児）でありうる。一定の態様において、対象は、医師または他の医療保健業務従事者のケアまたは処方を受けていなくてもよい。
ナンノクロロプシスペーストから標準化EPAおよび極性脂質混合物への例示的プロセスの全体的概観である。 粗藻類油（CAO）および濃縮極性脂質（PoL）中の最も一般的なリン脂質であるホスファチジルコリン（PC）の構造である。 図3Aは、本明細書に記載のEPA製剤に見いだされる糖脂質であって五炭糖環一つのMGDG(モノガラクトシルジアシルグリセロール）の構造である。図3Bは、本明細書に記載のEPA製剤に見いだされる糖脂質であって五炭糖環２つのDGDG（ジガラクトシルジアシルグリセロール）の構造である。 ナンノクロロプシスペーストを標準化EPAおよび極性脂質混合物に転化するための抽出および精製プロセスの一態様を図解している。 ナンノクロロプシス油精製中の主要混合物構成成分の典型的質量分割の一例を図解している。 ナンノクロロプシス油精製中の主要混合物構成成分の典型的質量分割の一例を図解している。 藻類を粗藻類抽出物（CAE）へと濃化するために、溶液中の可溶性構成要素を濃縮するプロセスの概略図である。EtOHとH2Oの溶剤混合物は、これらの溶剤の存在を必要とする後続のプロセス工程を容易にするためにも、また取り扱いを容易にするためにも、CAEと共に保持される。 CAEを粗藻類油（CAO）へと濃化するためのプロセスの概略図である。CAOになるアルカン可溶相は、最終EPA組成物の主要構成要素である脂肪酸構成成分と極性脂質構成成分とを含有している。 CAO中の極性脂質を濃化して濃縮極性脂質（CPL）を生産するためのプロセスの概略図である。CAOを溶液としてシリカ上に移してから、C3-C7アルカン、アセトン、およびC1-C4アルコール/水で抽出する。アルカンにより、TG、DG、PI、およびクロロフィルが分離される。アセトンにより、糖脂質、特にDGDGが得られる。アルコール/水により、リン脂質の大半とMGDGを含む残りの極性脂質が得られる。 CAOの濃化に使用されるプロセスの概略図である。CAOになるアルカン可溶相は、製品の主要構成要素である脂肪酸構成成分と極性脂質構成成分とを含有している。 EPAのさらなる濃化に使用されるプロセスの概略図である。このプロセスでは、濃縮EPAから非EPA構成要素を除去するために、クロマトグラフィー、尿素結晶化、および脱ろうを併用する。クロマトグラフィーは、EPAの非FA構成要素を除去することにより、遊離脂肪酸を濃化する。尿素結晶化により、飽和体（すなわちC16:0）および一価不飽和体（すなわちC16:1）との錯体が形成される。脱ろう工程は溶液を冷却して複合体を溶液から析出させ、それによってEPA画分を濃化する。 最終EPA組成物が所望する最低濃度のEPAと極性脂質とを含有するように、最終EPA組成物を標準化するためのプロセスの概略図である。CAOはEPAと極性脂質をどちらも含有する。超濃縮EPAは、濃縮オメガ-3脂肪酸（EPAを含む）を含有し、極性脂質を含有しても含有しなくてもよい。CPL構成要素と超濃縮EPA構成要素とを計算手順に従って配合することにより、最終EPA組成物が作出される。最終EPA組成物は、それが製品品質および製品仕様を満たすことを保証するために、完全に特徴づけられる。 S12粗藻類抽出物の典型的組成を図解している。 S12粗藻類油の典型的組成を図解している。 S12粗藻類油中の脂質クラス別の脂肪酸の典型的な分布を図解している。 S14粗藻類抽出物の典型的組成を図解している。 S14粗藻類油の典型的組成を図解している。 S14粗藻類油中の脂質クラス別の脂肪酸の典型的な分布を図解している。 超臨界二酸化炭素分画した部分加水分解S14中性脂質の遊離脂肪酸（FFA）含量を図解している。 超臨界二酸化炭素によって分画される脂肪酸分子量鎖（fatty acid molecular weight chain）およびFFAの特徴の分布を図解している。 糖脂質、リン脂質、トリグリセリドおよびジグリセリドとしての中性脂質、ならびに遊離脂肪酸を含む標準化EPA製剤の典型的組成を図解している。 標準化EPA製剤中の脂質クラス別の脂肪酸の典型的な分布を図解している。 EicoOilまたはオキアミ油のいずれかを投与された雄および雌（M＋F）ラットの組織におけるEPAとDHAの組織分布を比較したグラフである。EicoOilは、さまざまな脂質クラスの約25重量％EPAである総オメガ-3と、およそ2:1の比の糖脂質（約10重量％）およびリン脂質（約5重量％）の組合せから構成される約15重量％の極性脂質とを有する、ナンノクロロプシス・オクラタ抽出物由来の極性およびEPA製剤である。EicoOilのDHAは0重量％である。これらの結果は、EicoOilとオキアミ油からのEPAおよびDHAの組織分布に統計的有意差がないことを示している。 EicoOilまたはオキアミ油を与えられたヒト被験者におけるEPA＋ドコサペンタエン酸（DPA）の血漿中濃度の変化を時間の関数として図解している。 EicoOilまたはオキアミ油を投与されたヒト被験者における総オメガ-3の血漿中濃度の変化を時間の関数として図解している。
詳細な説明
1.序論
本発明は、真正眼点藻（eustigmatophyte）の一種ナンノクロロプシス・オクラタに由来するエイコサペンタエン酸（EPA）オメガ3脂肪酸、極性脂質、および植物栄養素を含む、栄養学上および薬理学上有益な混合物の組成を提供する。これらの植物栄養素には、オメガ-7脂肪酸、クロロフィル、カロテノイド、ならびに補酵素Q9（CoQ9）および補酵素Q10（CoQ10）が含まれる。N.オクラタは、多糖細胞壁を有する単細胞の真核藻類であり、球状細胞である。ナンノクロロプシスは、クロロフィルa、ゼアキサンチン、およびβ-カロテンを含有する緑黄色のクロロプラストを含有し、クロロフィルbとクロロフィルcは特異的に欠いている。この種は、いくつかの異なるクラスの脂肪酸、すなわち遊離脂肪酸、トリグリセリド、およびジグリセリドから構成される中性脂質、ならびにリン脂質および糖脂質から構成される極性脂質を合成する。ナンノクロロプシスが生産する脂肪酸の3分の2超は、エイコサペンタエン酸（EPA＝C20:5ω3）、パルミチン酸（C16:0）、パルミトレイン酸（C16:1＝C16:1ω7）からなる。この種は、他のオメガ-3を一つしか、すなわちα-リノレン酸（ALA＝C18:3ω3）しか生産しない。この種はドコサヘキサエン酸（DHA＝C22:6ω3）を全く生産しない。存在しないことが目につく他のオメガ-3脂肪酸は、オクタデカテトラエン酸、すなわちステアリドン酸（SDA＝C18:4ω3）、エイコサトリエン酸（ETE＝C20:3ω3）、エイコサテトラエン酸（ETA＝C20:4ω3）、ヘンエイコサペンタエン酸、すなわちウンコサペンタエン酸（HPA＝C21:5ω3）、ドコサペンタエン酸（DPA＝C22:5ω3）である。
表1に、魚油エチルエステル（EPAX 6000 EEおよびEPAX 4020 EE）、高精製魚油（Minami Nutrition Plus EPA）、オキアミ油（NOW Neptune Krill Oil（NKO））、ナンノクロロプシス・オクラタのS12変異体およびS14変異体の相対的脂肪酸プロファイルを示す。他の供給源はこれら8つのオメガ-3脂肪酸のうちの少なくとも7つを含むが、ナンノクロロプシス・オクラタ油は2つ、すなわちEPAとALAしか含有しない。最適な栽培条件下の純粋藻類培養では、総オメガ3に対するEPAの比は99％を上回る。熱的ストレスが存在する実世界の条件下では、この藻類はALAをさらに生産しうる。総オメガ-3に対するEPAの比は90％を上回り、より典型的には、93％、95％、96％、97％、または98％を上回る。0.5％を超えて見いだされる脂肪酸プロファイルの他の微量脂肪酸構成要素は、ミリスチン酸 (C14:0）、ミリストレイン酸（C14:1）、オレイン酸（C18:1ω9）、オレイン酸（C18:1ω7）、リノール酸（C18:2ω6）、およびアラキドン酸（C20:4ω6）。
（表１）
Figure 2016504999
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本発明は、総EPA、極性脂質、および植物栄養素の制御製剤（controlled formulation）を提供する。本製剤は、オキアミ油と類似する有益な効果を有すると同時に、糖脂質の利点も含んでいる。オキアミ由来の油はリン脂質だけを含有し、糖脂質を含有しない。オキアミなどの動物はリン脂質を合成するが、糖脂質は合成しない。植物はリン脂質と糖脂質を合成する。驚くべきことに、本製剤は、太陽光とCO2を受けとると成長して高濃度のEPA脂肪酸、リン脂質、および糖脂質の組合せを与える単細胞植物供給源によって生産される油から作出される。さらにまた、環境曝露の変動ゆえに、藻類に伴う化学的構成成分も変動しうる。この変動に対応するために、本発明者らは、望ましい量のEPA、リン脂質、糖脂質、および植物栄養素から構成される制御されたEPA濃縮物を作出するための手段を同定した。
さまざまな態様において、制御製剤は、本明細書においてS12およびS14と呼ぶ2つのユニークなN.オクラタ株から得られる。どちらの株もテキサス大学オースチン校のUTEX The Culture Collection of Algae（インターネットではweb.biosci.utexas.edu/utex/）において派生した。S12は低温環境条件に適応し、一方、S14は、高温条件に対する耐性が高い。N.オクラタは、当技術分野において公知の水路（raceway）培養システムにおける屋外培養で栽培することができる。このバイオマスは1〜20g/Lの希薄濃度の塩水溶液中で成長する海藻類である。収穫時には、クロスフローろ過、凝集、沈降、溶解空気浮上法、および遠心分離の組合せを含む、当業者に公知のいくつかの技法によって、藻類が濃縮される。収穫後は、結果として得られる固形分濃度が、100g/L（10重量％）〜300g/L（30重量％）固形分の範囲にある。遠心分離を使用する場合、この濃度は、より典型的には、18〜25重量％固形分の範囲にある。本発明者らは、この材料形態を藻類ペーストと呼ぶ。藻類バイオマスが主としてナンノクロロプシスである場合、それはナンノ（Nanno）ペーストと呼ばれる。
EPAと極性脂質の混合物を作出するには、一連の抽出工程および精製工程を実施する必要がある。これには、バイオマス抽出、非脂質および水溶性構成要素の除去（MONL精製）、中性脂質構成成分および極性脂質構成成分の分離、中性脂質画分中のEPAの濃縮、および最終製品において標準EPA濃度を達成するための配合が含まれる。この一般プロセスを図1に示す。EPA脂肪酸は、糖脂質、リン脂質、トリグリセリドとコンジュゲートされて、また非コンジュゲート遊離脂肪酸（FFA）として、標準化製品中に存在する。バイオマス抽出は、主として脂質から構成される溶液であって、バイオマスのタンパク質、糖質、ミネラル、繊維を微量構成要素とする溶液の単離を伴う。このプロセスにより、脂質、植物栄養素、糖質、水溶性タンパク質、および水の複雑な混合物である粗藻類抽出物（CAE）と呼ばれる脂質混合物が作出される。CAEは、脂質および植物栄養素以外の構成要素-非脂質有機物（Matter Organic-Not Lipid）（MONL）-の大部分を含有する。次のプロセスでは、MONL構成要素の半分〜90％超が除去されて、粗藻類油（CAO）が作出される。この中間材料は、最終配合物の3つの構成要素のうちの1つであり、中性脂質、極性脂質、および植物栄養素を含有している。
本発明者らは、ナンノクロロプシスが5〜50mg/kg（ppm）のCoQ9と20〜100ppmのCoQ10とを含有することを見いだした。S12では、本発明者らはCoQ9を8.5ppmおよび25ppmと測定した。S14では、本発明者らはCoQ9を19ppmと測定した。S12については、本発明者はCoQ10を31ppmおよび35ppmと測定した。S14については、CoQ10は67ppmと測定された。CoQ9およびCoQ10は、ナンノクロロプシス抽出物中に存在する植物栄養素または微量栄養素である。
次のプロセス工程では、中性脂質と極性脂質を分離する。極性脂質（PoL）濃縮物は、CAO中に存在するリン脂質構成成分と糖脂質構成成分を事実上全て含有する。中性脂質画分は中性脂質ホモジナイゼーション（Neutral Lipid Homogenization）において加工される。このプロセスでは、脂肪酸が、グリセロール骨格とコンジュゲートされていない単独分子の形態に転化される。ホモジナイズされたストリームは、この時点で、均質な脂質タイプかららなり、最も一般的な形態は塩およびFFAである。脂質分画工程では、高分子量で二重結合の多いEPA脂質が、分布中の他の脂肪酸から濃縮される。配合のための一形態はFFAである。したがって、分画において塩を使用する場合は、その塩を酸性化してFFAを形成させる。濃縮EPA FFA（EPA-FFA）は配合物の第3構成要素である。制御製剤はCAO、PoL濃縮物、およびEPA-FFA濃縮物の配合物である。個々の構成成分は、その脂肪酸プロファイルおよび極性脂質プロファイルについて特徴づけられる。目標PoL含量および目標EPA含量を満たすように、各構成成分の質量比が調節される。
PoL濃縮物は30％超の総極性脂質で構成される。糖脂質の量はリン脂質の1〜3倍である。リン脂質は、典型的には、SN3位にあるグリセロールとコンジュゲートされたリンおよび他の有機部分と、グリセロール骨格上のSN1位およびSN2位（中央）にある1つまたは2つの脂肪酸とからなる。CAOおよび濃縮PoL中の最も一般的なリン脂質であるホスファチジルコリン（PC）を図2に示す。SN1位の脂肪酸がR1基およびカルボン酸（COO）基であることに注意されたい。同様に、SN2位の脂肪酸はR2基およびCOO基である。EPAがリン脂質クラスに関連する場合、それはSN1位またはSN2位のどちらかにある。図3に示す糖脂質は、五炭糖環一つのMGDG(モノガラクトシルジアシルグリセロール）、または五炭糖環２つのDGDG（ジガラクトシルジアシルグリセロール）とからなる。同様に、糖脂質関連脂肪酸は、OCOR1部分によって示されるとおりSN1位と、-OCOR2部分によって示されるとおりSN2位にある。糖脂質とコンジュゲートされた脂肪酸はこれら2つの位置にある。濃縮PoLとCAOとに関連するEPA脂肪酸が測定される。濃縮EPA-FFAを他の2つの構成要素と配合して、少なくとも25重量％の目標EPA量が達成されるようにする。PoLおよびCAO中のEPA濃度はこの値より低い。COAおよび濃縮PoL中の典型的なEPA値は、それぞれ14重量％および11重量％である。濃縮EPA-FFAは40％を上回る濃度であるから、それより低いEPA濃度と配合して、25重量％の濃度を達成することができる。混合物のEPA含量は、混合則（rule of mixtures）、すなわち各配合物構成要素の質量分率とEPA濃度との積の和によって決定される。
標準化製剤は、身体への脂質の吸収をもたらす代謝機能に関係するので、バイオアベイラビリティが増加している点で有利である（インターネットではvivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/digestion/smallgut/absorb_lipids.html）。脂肪が小腸の内腔を進む時、脂肪が身体に吸収されるには、脂肪は、腸細胞（小腸および結腸を裏打ちする柱状上皮細胞）の細胞膜を通過しなければならない。トリグリセリド（TG）と、多少のジグリセリド（DG）とである中性脂肪は、疎水性であり、水に不溶である。TGとDGの混合物が水に曝露されると、これらの分子は互いに引きつけあい、水に排斥されて、水に分散する大きなミセルを形成する。これら大きなミセルは、サイズ排除により、形質膜を横切って拡散することができない。リン脂質（PL）および糖脂質（GL）などの極性脂質は、疎水性脂肪酸部分を親水性のリンまたは糖質部分と結びつけるグリセロール骨格を有する。これらの極性脂質は両親媒性である。腸内の胆汁酸と共に、PLおよびGLは、TG中性脂肪とDG中性脂肪の乳化を助ける。正味の効果は、TG/DGミセルを多数の小さなミセルに分解することで、質量を保存しつつ、ミセル表面積を増加させることである。TG、PL、およびGLの存在は重要である。それらの存在は、水溶性酵素である膵リパーゼの放出の引き金になるからである。膵リパーゼはトリグリセリドのSN1位およびSN3位に作用し、これらの位置にある脂肪酸を加水分解することで、遊離脂肪酸（FFA）と1-モノグリセリド（1-MG）（SN2位に脂肪酸が残っているグリセロール骨格）を作出する。FFAはPLやGLのように両親媒性である。リパーゼは極性脂質にも作用してSN1位にある脂肪酸を切断することで、1-リゾホスファチジルコリン（1-LPC）および1-リゾホスファチジルエタノールアミン（1-LPE）、および1-リゾホスファチジルイノシトール（1-LPI）などの1-リゾホ脂質（1 lysopholipid）（1-PL）を形成させる。次に、FFA、1-MG、および1-PLは、拡散により、または腸細胞膜中の脂肪酸輸送体タンパク質により、腸細胞内へと進入することができる。EPA-FFAはTG、PL、またはGLの分子量のおよそ3分の1と小さな分子であり、かつ両親媒性であるから、EPA-FFAは酵素作用および/または胆汁作用なしで吸収されうる。EPAは、さらに、TG、DG、PL、およびGL経路でも吸収される。本製剤は、TGおよびDGと混合されて吸収前の酸化的分解を防止するクロロフィル、ステロール、およびカロテノイドなどの植物栄養素を含有する。ステロールは、腸管におけるコレステロールの取り込みを阻害することで知られている。
2.EPA製剤
一般に、本EPA製剤は、約15重量％〜約90重量％の範囲のエイコサペンタエン酸（EPA）、例えば約20重量％〜約75重量％のEPA、例えば約20重量％〜約50重量％のEPAを、そのさまざまな化学的形態で（例えばFFA、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、糖脂質として）含むと共に、約10重量％〜約70重量％の範囲の極性脂質（糖脂質およびリン脂質）、例えば約30重量％〜約35重量％の極性脂質を含み、かつドコサヘキサエン酸（DHA）を含まない。本EPA組成物は、ヒトによる摂取のために、またバイオアベイラビリティが最も高い形態にある（例えば遊離脂肪酸としての、リン脂質コンジュゲートとしての、および/または糖脂質コンジュゲートとしての）EPAの比率を増加させ、かつバイオアベイラビリティが低い形態にある（例えばジグリセリドコンジュゲートとしての、および/またはトリグリセリドコンジュゲートとしての）EPAを低減または排除することによってEPAのバイオアベイラビリティを改良するために、処方される。さらに本組成物は、エステル化EPAなどのエステル化脂肪酸を含まない。
さまざまな態様において、EPAは、リン脂質コンジュゲート、糖脂質コンジュゲート、トリグリセリドコンジュゲート、ジグリセリドコンジュゲートおよび/または遊離脂肪酸からなる群より選択される1つまたは複数の形態（例えば2つ、3つ、4つまたは全ての形態）にある。さまざまな態様において、トリグリセリドコンジュゲートおよび/またはジグリセリドコンジュゲートの形態にあるEPAは、約0.2重量％未満に低減されるか、検出不可能なレベルに低減されるか、または完全に排除される。
さまざまな態様において、総オメガ-3脂肪酸に対するEPAの比は90％超、例えば91％超、92％超、93％超、94％超、95％超、96％超、97％超、98％超、99％超またはそれ以上である。いくつかの態様において、本組成物は、約25重量％〜約50重量％のEPA、例えば約25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、45重量％または50重量％のEPAを含む。
ヒトによる摂取のために処方された組成物における脂質クラス別の脂肪酸の分布に関して、さまざまな態様において、本組成物は、約10重量％〜約15重量％のリン脂質（例えば約10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％のリン脂質）、約15重量％〜約25重量％の糖脂質（例えば約15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％、25重量％の糖脂質）、約0重量％〜約10重量％ジグリセリドおよびトリグリセリド（例えば約10重量％未満、9重量％未満、8重量％未満、7重量％未満、6重量％未満、5重量％未満、4重量％未満、3重量％未満、2重量％未満、1重量％未満、0.5重量％未満のジグリセリドおよびトリグリセリド）、および約30重量％〜約45重量％の遊離脂肪酸（例えば約30重量％、31重量％、32重量％、33重量％、34重量％、35重量％、36重量％、37重量％、38重量％、39重量％、40重量％、41重量％、42重量％、43重量％、44重量％、45重量％の遊離脂肪酸）を含む。さまざまな態様において、本組成物は、約30〜35重量％（例えば約1/3）の極性脂質（すなわちリン脂質と糖脂質の合計）を含む。さまざまな態様において、本組成物は、検出可能なレベルのジグリセリドおよびトリグリセリドを有さないか、ジグリセリドおよびトリグリセリドから単離されているか、かつ/またはジグリセリドおよびトリグリセリドを含まない。さまざまな態様において、本組成物が含むジグリセリドおよびトリグリセリドは約0.2重量％未満である。したがって、いくつかの態様において、本組成物は、約10重量％〜約15重量％のリン脂質（例えば約10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％のリン脂質）、約15重量％〜約25重量％の糖脂質（例えば約15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％、25重量％の糖脂質）、約0.2重量％未満のジグリセリドおよびトリグリセリド、および約30重量％〜約45重量％の遊離脂肪酸（例えば約30重量％、31重量％、32重量％、33重量％、34重量％、35重量％、36重量％、37重量％、38重量％、39重量％、40重量％、41重量％、42重量％、43重量％、44重量％、45重量％の遊離脂肪酸）を含む。
ヒトによる摂取のために処方された組成物における脂質クラス別のEPAの分布に関して、さまざまな態様において、本組成物は、リン脂質コンジュゲートとして約3重量％〜約30重量％、例えば約5重量％〜約20重量％（例えばリン脂質コンジュゲートとして約3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％、25重量％、26重量％、27重量％、28重量％、29重量％、30重量％）、糖脂質コンジュゲートとして約8重量％〜約50重量％、例えば約10重量％〜約25重量％（例えば糖脂質コンジュゲートとして約3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％、25重量％、26重量％、27重量％、28重量％、29重量％、30重量％、31重量％、32重量％、33重量％、34重量％、35重量％、36重量％、37重量％、38重量％、39重量％、40重量％、41重量％、42重量％、43重量％、44重量％、45重量％、46重量％、47重量％、48重量％、49重量％、50重量％）、約0重量％〜約10重量％のジグリセリドコンジュゲートおよびトリグリセリドコンジュゲート（例えばジグリセリドコンジュゲートおよびトリグリセリドコンジュゲートとして約10重量％未満、9重量％未満、8重量％未満、7重量％未満、6重量％未満、5重量％未満、4重量％未満、3重量％未満、2重量％未満、1重量％未満、または0.5重量％）、および遊離脂肪酸として約40重量％〜約85重量％、例えば約50％重量％〜約80重量％（例えば遊離脂肪酸として少なくとも約40重量％、41重量％、42重量％、43重量％、44重量％、45重量％、46重量％、47重量％、48重量％、49重量％、50重量％、51重量％、52重量％、53重量％、54重量％、55重量％、56重量％、57重量％、58重量％、59重量％、60重量％、61重量％、62重量％、63重量％、64重量％、65重量％、66重量％、67重量％、68重量％、69重量％、70重量％、71重量％、72重量％、73重量％、74重量％、75重量％、76重量％、77重量％、78重量％、79重量％、80重量％、81重量％、82重量％、83重量％、84重量％、または85重量％）を含む。さまざまな態様において、本組成物は、約10重量％〜約50重量％、例えば約15重量％〜約30重量％の極性脂質（すなわちリン脂質と糖脂質の合計）を含む。さまざまな態様において、本組成物は、検出可能なレベルのジグリセリドおよびトリグリセリドを有さないか、ジグリセリドおよびトリグリセリドから単離されているか、かつ/またはジグリセリドおよびトリグリセリドを含まない。さまざまな態様において、本組成物が含むジグリセリドおよびトリグリセリドは約0.2重量％未満である。したがって、いくつかの態様において、本組成物は、脂質クラス別に、約3重量％〜約30重量％、例えば約5重量％〜約20重量％のリン脂質コンジュゲート（例えば約3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％、25重量％、26重量％、27重量％、28重量％、29重量％、30重量％のリン脂質コンジュゲート）、約8重量％〜約50重量％、例えば約10重量％〜約25重量％の糖脂質コンジュゲート（例えば約3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％、25重量％、26重量％、27重量％、28重量％、29重量％、30重量％、31重量％、32重量％、33重量％、34重量％、35重量％、36重量％、37重量％、38重量％、39重量％、40重量％、41重量％、42重量％、43重量％、44重量％、45重量％、46重量％、47重量％、48重量％、49重量％、50重量％の糖脂質コンジュゲート）、約0.2重量％未満のジグリセリドコンジュゲートおよびトリグリセリドコンジュゲート、および約40重量％〜約85重量％、例えば約50％重量％〜約80重量％の遊離脂肪酸（例えば約40重量％、41重量％、42重量％、43重量％、44重量％、45重量％、46重量％、47重量％、48重量％、49重量％、50重量％、51重量％、52重量％、53重量％、54重量％、55重量％、56重量％、57重量％、58重量％、59重量％、60重量％、61重量％、62重量％、63重量％、64重量％、65重量％、66重量％、67重量％、68重量％、69重量％、70重量％、71重量％、72重量％、73重量％、74重量％、75重量％、76重量％、77重量％、78重量％、79重量％、80重量％、81重量％、82重量％、83重量％、84重量％、85重量％の遊離脂肪酸）という分布のEPAを含む。
さまざまな態様において、糖脂質は、ジガラクトシルジアシルグリセロールおよびモノガラクトシルジアシルグリセロールのうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、リン脂質は、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルグリセロールのうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、リン脂質は、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールのうちの1つまたは複数を含む。
いくつかの態様において、本EPA組成物は、
（i）0〜5重量％のC:18脂肪酸、例えば0.2〜3重量％のC:18脂肪酸;
（ii）0〜20重量％のC:16脂肪酸、例えば2〜20重量％のC:16脂肪酸;
（iii）0〜5重量％のC:14脂肪酸、例えば0.2〜5重量％のC:14脂肪酸;
（iv）0〜0.2重量％のC:12脂肪酸;および/または
（v）0〜0.1重量％のC:10脂肪酸
を含む。
さまざまな態様において、本組成物は、以下の構成要素を含む:
Figure 2016504999
。
さまざまな態様において、本組成物は、以下の構成要素を含む:
Figure 2016504999
Figure 2016504999
さまざまな態様において、本組成物はクロロフィルaを含む。さまざまな態様において、本組成物は、約10.0重量％未満のアラキドン酸、例えば約9.5重量％未満、9.0重量％未満、8.5重量％未満、8.0重量％未満、7.5重量％未満、7.0重量％未満、6.5重量％未満、6.0重量％未満、5.5重量％未満、5.0重量％未満、4.5重量％未満、4.0重量％未満、3.5重量％未満、3.0重量％未満、2.5重量％未満、2.0重量％未満、1.5重量％未満または1.0％未満のアラキドン酸を含むか、またはアラキドン酸を含まない（すなわち0重量％）。
さまざまな態様において、本組成物は、無傷細胞、細胞構成要素、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドを含まないか、または実質的に含まない。さまざまな態様において、本組成物は、オクタデカテトラエン酸、すなわちステアリドン酸（SDA＝C18:4ω3）、エイコサトリエン酸（ETE＝C20:3ω3）、エイコサテトラエン酸（ETA＝C20:4ω3）、ヘンエイコサペンタエン酸、すなわちウンコサペンタエン酸（HPA＝C21:5ω3）、およびドコサペンタエン酸（DPA＝C22:5ω3）からなる群より選択される脂肪酸を含まない。さまざまな態様において、本組成物は、アスタキサンチン、cis-ルテイン、trans-ルテイン、cis-ゼアキサンチン、trans-α-クリプトキサンチン、trans-α-カロテン、cis-α-カロテン、cis-リコペン、およびtrans-リコペンからなる群より選択されるカロテノイドを含まない。さまざまな態様において、本組成物は、クロロフィルcを含まない。さまざまな態様において、本組成物は、N-アシル-ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルエタノールアミンからなる群より選択される1つまたは複数のリン脂質を含まない。いくつかの態様において、本組成物は、スフィンゴ脂質を含まない。
本組成物は、さらに、薬学的に許容される担体および/または1つもしくは複数の薬学的に許容される賦形剤を含みうる。一般に本組成物は、二相性ではなく（例えば単相性であり）、約10％未満の水、例えば約9％未満、8％未満、7％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満の水を含むか、または水を含まない。
上述し本明細書において説明するEPA組成物を含む、ヒトによる摂取に適したカプセル剤、錠剤、溶液剤、シロップ剤、および懸濁剤も考えられる。さまざまな態様において、カプセル剤は、ゼラチンカプセル剤または軟カプセル剤（非動物性の菜食主義者用供給源からの軟カプセル剤を含む）である。さらに、本明細書に記載するEPA組成物を含む食品、飲料、エネルギーバー、および栄養補助食品も考えられる。
3.高バイオアベイラビリティEPA製剤を生産する方法
本方法では、バイオアベイラビリティが最も高い形態にある（例えば遊離脂肪酸としての、または糖脂質としての、またはリン脂質コンジュゲートとしての）EPAの量を最大にする微細藻類油由来の（例えばナンノクロロプシス由来の）EPA製剤を高いエネルギー効率および費用効率で生産することが可能である。本明細書において記載するEPA製剤を調製するための工程を図解した概略図を図1および図4に示す。
さまざまな態様において、本方法は以下の工程を含む:
（a）藻類ペーストを用意する工程;
（b）藻類ペーストから有機溶剤で脂質を抽出することによって、中性脂質と極性脂質とを含む粗藻類抽出物（CAE）を該ペーストの水溶性構成要素から実質的に単離する工程;
（c）水溶性構成要素を実質的に除去することによって、粗藻類油（CAO）を得る工程;
（d）CAOの第1の部分を加水分解することによって、CAOの該部分において遊離脂肪酸を放出させる工程;
（e）放出された遊離脂肪酸を鎖長に従って分画することによって、C20遊離脂肪酸を単離し、濃縮EPA遊離脂肪酸画分を得る工程;および
（f）工程（e）において生産された濃縮EPA遊離脂肪酸画分と工程（c）において生産されたCAOの第2の部分とを組み合わせる工程。
さまざまな態様において、本方法は以下の工程を含む:
（a）藻類ペーストを用意する工程;
（b）藻類ペーストから有機溶剤で脂質を抽出することによって、中性脂質と極性脂質とを含む粗藻類抽出物（CAE）を該ペーストの水溶性構成要素から実質的に単離する工程;
（c）水溶性構成要素を実質的に除去することによって、粗藻類油（CAO）を得る工程;
（d）CAOを超臨界CO2と接触させる工程、ここで超臨界CO2は、中性脂質を選択的に抽出することによって、CAOを、遊離脂肪酸を含む中性脂質画分と、糖脂質およびリン脂質を含む極性脂質画分とに分ける;
（e）C20遊離脂肪酸を中性脂質画分から単離することによって、濃縮EPA遊離脂肪酸画分を得る工程;および
（f）工程（e）において生産された濃縮EPA遊離脂肪酸画分を工程（d）において生産された極性脂質画分と組み合わせる工程。
一般に本方法は、藻類細胞を破壊する工程、藻類細胞を機械的破砕、熱的前処理、アルカリ処理および/または酸処理に供す工程を含まない。加えて、上記工程では、脂肪酸をエステル化すること、例えば限定するわけではないがメチルエステルまたはエチルエステルへの転化は、特に避けられる。
本方法は、EPAの任意のバイオマス源から高バイオアベイラビリティEPA組成物を生産するために使用することができる。好ましくは、バイオマス源は、約30重量％〜約70重量％の範囲の濃度のEPAを有する油を産生する。例えばEPAは、従属栄養性珪藻類キクロテラ（Cyclotella）属およびニッチア（Nitzschia）属（米国特許第5,244,921号）、シュードモナス属（Pseudomonas）、アルテロモナス（Alteromonas）およびシュワネラ（Shewanella）属（米国特許第5,246,841号）、フィチウム（Pythium）属の糸状菌（米国特許第5,246,842号）、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）、M.エクシグア（M.exigua）、およびM.ハイグロフィラ（M.hygrophila）（米国特許第5,401,646号）、ならびにナンノクロロプシス属の真正眼点藻類（eustigmatophycean alga）（Krienitz, L. and M. Wirth, Limnologica, 36:204-210 (2006)）を含む、さまざまな非油性微生物および油性微生物中で天然に産生される。さらにまた、いくつかのタイプの酵母は、EPAを産生するように組換え操作されている。例えば非油性酵母サッカロミセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）（米国特許第7,736,884号）および油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）（米国特許第7,238,482号;米国特許第7,932,077号;米国特許出願公開第2009-0093543号A1;米国特許出願公開第2010-0317072号A1）での研究を参照されたい。さまざまな態様において、バイオマス源は魚油またはオキアミ油であることができる。
a.藻類ペーストを用意する工程
ある工程では、藻類細胞を収穫し、濃縮して、ペーストを形成させる。種々の態様において、藻類細胞源材料のペーストが用意される。
さまざまな態様において、本EPA製剤は藻類細胞に由来し、ドコサヘキサエン酸（DHA）を一切含有しない。さまざまな態様において、本EPA組成物の供給源バイオマスは、ナンノクロロプシス属の微細藻類から得られる。さまざまな態様において、供給源バイオマスは、ナンノクロロプシス・ガディタナ（gaditana）、ナンノクロロプシス・グラニュレート（granulate）、ナンノクロロプシス・リムネティカ（limnetica）、ナンノクロロプシス・マリタイム（maritime）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（oceanica）、ナンノクロロプシス・オクラタ、ナンノクロロプシス・サリナ（salina）、およびナンノクロロプシス属の種（例えば10S010、AN1/12-10、AN1/12-5、AN1/12-7、AN2/29-2、AN2/29-6、AS4-1、BR2、C95、CCAP211/46、CCAP211/78、CCMP1779、CCNM 1032、CCNM 1034、CSIRO P74、HSY-2011、JL11-8、JL2/4-1、KMMCC EUS-02、KMMCC EUS-05、KMMCC EUS-06、KMMCC EUS-08、KMMCC EUS-09、KMMCC EUS-11、KMMCC EUS-12、CCMP2195、KMMCC EUS-13、KMMCC EUS-14、KMMCC EUS-15、KMMCC EUS-16、KMMCC EUS-17、KMMCC EUS-18、KMMCC EUS-19、CCMP533、KMMCC EUS-20、KMMCC EUS-21、LL-2012、MA-2012、UTEX2164、MBTD-CMFRI-S006、MBTD-CMFRI-S007、MBTD-CMFRI-S012、MBTD-CMFRI-S076、MBTD-CMFRI-S077、MBTD-CMFRI-S078、CCMP525、MDL11-16、MDL3-4、NANNO-IOLR、RCC438、CCAP849/7、RCC504、SC-2012、IOLR株、Tow 2/24 P-1w、UTEX2379、W2J3B、YJH-2012、YW0980）からなる群より選択されるナンノクロロプシスから得られる。さまざまな態様において、供給源バイオマスは、ナンノクロロプシス・オセアニカおよびナンノクロロプシス・オクラタからなる群より選択されるナンノクロロプシスから得られる。
微細藻類、例えばナンノクロロプシスは、典型的には0.1〜1.0g/Lの範囲のバイオマス、より典型的には0.3〜0.7g/Lの範囲のバイオマスである比較的希薄な培養で成長する。0.5g/L培養濃度の場合、これは、培養1000gにつき0.5gという希薄な濃度の乾燥重量換算バイオマスが存在することを含意する。藻類は、もっと濃縮された状態で、典型的には2〜300g/Lの範囲で、さらに加工される。微細藻類は、当技術分野において公知である任意の方法を使って、培養物から収穫され、ペーストへと濃縮される。さまざまな態様において、当技術分野で公知の脱水、沈降分離、ろ過、クロスフローろ過および/または遠心分離技法を使用することができる。適宜、ナンノクロロプシス細胞の濃縮および収穫を容易にするために、空気散布技法および凝集技法を使用することができる。
ナンノクロロプシス細胞を収穫し濃縮するための方法は、当技術分野において公知であり、使用することができる。例えば米国特許出願公開第2013/0046105号;同第2012/0282651号;同第2012/0225472号;同第2012/0108793号;および同第2011/0081706号ならびにSirin, et al, Bioresour Technol. (2013) Jan 22;132C:293-304;Farid, et al, Bioresour Technol. 2013 Jan 23. doi:pii:S0960-8524(13)00081-3;およびWan, et al, Bioresour Technol. 2012 Oct 16. doi:pii:S0960-8524(12)01506-4を参照されたい。
前記の参考文献は、あらゆる目的において、参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
一態様では、培養液のpHを、例えばおよそpH10.0まで上げ、細胞を凝集剤および/または凝固剤に曝露し、それによって細胞バイオマスを約0.5g/Lのバイオマスから約10〜20g/Lのバイオマスに濃縮することによって、ナンノクロロプシス細胞を収穫し、濃縮する。凝固/凝集された細胞を、例えば沈降槽で沈降させ、沈殿した細胞バイオマス上の水性上清をデカントし、沈降した細胞バイオマスを含有する残りの液体を、遠心分離によってさらに脱水することにより、藻類ペーストを形成させる。
b.有機溶剤を使って藻類ペーストから脂質を抽出する工程
脂質は、湿潤状態または乾燥状態のいずれかで、当技術分野において公知である任意の方法を使って藻類ペーストから抽出することができる。湿潤状態では、水分含量が400〜1000％（w/w）乾燥バイオマス（25〜10重量％固形分）である。乾燥状態では、水分含量が乾燥バイオマスの15％（w/w）未満である。脂質は、有機溶剤を使って藻類バイオマスから抽出することができる。さまざまな態様において、約1倍〜約20倍、例えば約2倍〜約7倍の質量の有機溶剤をバイオマスと混合して、バイオマス、溶剤、および抽出物のスラリーを形成させる。藻類ペーストは、前処理工程なしで溶剤に曝露し、溶剤と接触させ、かつ/または溶剤に浸漬することができる。
驚いたことに、本発明者らは、粗藻類抽出物を得るためのバイオマス抽出が、機械的破砕（例えばビーズミル）、熱的前処理、または細胞壁消化（例えば酸または塩によるもの）を必要としないことを見いだした。いくつかの態様では、脂質が湿潤状態の藻類ペーストから抽出される。バイオマスの湿式抽出には、少なくとも部分的には水と混和する純溶剤または溶剤混合物が使用される。本発明者らは、意外にも、湿藻類ペーストからの抽出は、乾燥後の同じバイオマスの抽出と比較して、1.5倍〜3.5倍多い脂肪酸回収につながることを発見した。機械的破壊、熱的破壊またはpH破壊（例えばアルカリ処理または酸処理）によって細胞膜を破壊するための努力を特にしなくても、湿ペーストは乾燥後の同じバイオマスより、抽出収率が高い。
藻類ペーストからの脂質の抽出に有用な溶剤としては、エーテル、ケトン、およびアルコールなど、幅広い溶剤タイプが挙げられる。有用な溶剤および溶剤混合物は、トリグリセリドなどの疎水性無極性脂質構成要素と、リン脂質および糖脂質などの親水性極性脂質構成要素とを、藻類ペーストから抽出する能力を有する。例示的溶剤系として、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトンとエタノール、ジメチルエーテル、ジメチルエーテルとエタノールが挙げられる。さまざまな態様において、溶剤系は、エーテルとアルコールの混合物であるか、またはケトンとアルコールの混合物である。有用な溶剤の組合せの具体例としては、無水エタノール、190プルーフ（95v/v％）エタノール（EtOH）、変性190プルーフエタノール、特別変性アルコール（SDA）、アセトンとエタノール、イソプロピルアルコール、アセトンとメタノール、メチルエチルケトン（MEK）とメタノール、MEKとエタノール、ジメチルエーテル、ジメチルエーテルとメタノール、ジメチルエーテルとエタノールが挙げられる。さまざまな態様において、脂質は、50重量％（v/v）アセトンおよび50重量％（v/v）190プルーフエタノール（EtOH）である溶剤混合物を使って、藻類ペーストから抽出される。他の有用な溶剤混合物としては、純ジメチルエーテル（DME）、メタノールと混合されたDME、または190プルーフEtOH単独が挙げられる。EtOHは非変性であってもよいし、特別変性アルコール（SDA）等級（1-1、1-2、2B-2、2B-3、3A、3C、23A、23H、29、30、35A）プルーフ変性エタノールの一つであってもよい。SDAの主要組成を表5に示す。
抽出は、バッチ法および連続流法（例えば向流カラム、クロスフローろ過）など、当技術分野において公知である任意の方法によって行うことができる。バイオマスペーストを通した溶剤パーコレーションは、ペーストをろ過助材（例えば珪藻土）と混合するか、または溶剤との激しい混合をクロスフローろ過と組み合わせることによって、容易にすることができる。抽出された脂質リッチ溶液は、例えばろ過または遠心分離など、当技術分野において公知である任意の方法を使って、バイオマスから分離することができ、ここでは、ろ過、またはいくつかの態様ではクロスフローろ過が、溶液から固形分を除去するために使用される。ほぼ完全な脂質抽出のために、多段階の抽出、例えば適宜、2段階、3段階、4段階、5段階、6段階、7段階、8段階、9段階、10段階またはそれ以上の抽出を行う。有機溶剤を使った藻類ペーストからの脂質構成要素の抽出により、粗藻類抽出物（CAE）が作出される。粗藻類抽出物（CAE）は脂質ではない構成成分を10〜80％含有しうる。CAEは一般に中性脂質、極性脂質、クロロフィル、ステロール、カロテノイド、マンニトール（manitol）、およびグリセロールを含む。
c.CAEから水溶性構成要素を除去して粗藻類油（CAO）を生産する工程
CAEは、かなりの比率の非脂質有機物（「matter-organic non-lipid」すなわち「MONL」）を含有している。MONLは、総脂肪酸（TFA）、リン脂質、糖脂質、および植物栄養素には分類されず、そう分類するほかない材料である。MONLは水溶性構成要素、例えば水溶性糖質およびタンパク質を含有する。本方法のさまざまな態様では、CAEから水溶性構成要素を実質的に除去して粗藻類油（CAO）を生産する工程が行われる。当技術分野において公知である任意の方法によって、例えば有機溶剤と水への分配によって、水溶性構成要素をCAEから実質的に除去することで、CAOを得ることができる。このアプローチにより、極性の高い水溶性構成成分が無極性構成成分（例えば中性脂質）および複合極性構成成分（例えばPLおよびGL）から分離される。さまざまな態様において、溶剤抽出から回収されたCAEを別の溶剤において可溶化し、液液分配系に加えることにより、水溶性構成要素を実質的に除去することができる。
さまざまな態様において、MONL精製は、過剰の水および有機溶剤をCAEに加え、水、有機溶剤、およびCAEを高せん断ミキサーで密に接触させ、沈降または遠心分離によって水層と有機層とを分離することを含む、水溶性構成要素の分配を含みうる。供給物間の密な接触を保証するために撹拌した後、水相と有機相を沈降槽または遠心分離によって（すなわち強化された重力によって）分離する。材料は、上側の有機層と下側の水層に分かれる。中性脂質および極性脂質、ステロール、およびコレステロールは、有機層に対してはるかに高い分配係数を有し、主として有機層に残る。糖質（とりわけマンニトール）、水溶性タンパク質、およびグリセロールを含む水溶性構成成分は、主として、水層内の溶液中に移行する。有機相は、極性脂質（PoL）と中性脂質（NL）の脂質リッチ混合物を含有するCAOである。
あるいは、CAEを連続的に、中性脂質の方に適した溶剤で抽出した後、極性脂質に適した溶剤でさらに抽出することもできる。中性脂質の抽出に適した溶剤の具体例として、ヘキサン、クロロホルム、シクロヘキサン、塩化メチレン、二酸化炭素またはそれらの組合せが挙げられる。極性脂質の抽出に適した溶剤の具体例として、アセトン、メタノール、エタノールまたはそれらの組合せが挙げられる。さらなる有用な溶剤の組合せとして、体積比が例えば1:1:1:1の、ヘプタン（Hep）、酢酸エチル（EtAc）、メタノール（MeOH）、および水（H2O）が挙げられる。さらなる有用な溶剤の組合せとして、体積比が例えば1:1:1:1の、プロパン、EtAC、エタノール（EtOH）、および水（H2O）が挙げられる。さらなる有用な溶剤の組合せとして、体積比が例えば1:1:1:1の、ブタン、EtAc、EtOH、および水（H2O）が挙げられる。
さまざまな態様において、液液分配には、環境にやさしい代替有機溶剤を使用することができる。環境にやさしい溶剤の具体例として、水、アセトン、エタノール、2-プロパノール、1-プロパノール、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、メタノール、メチルエチルケトン（MEK）、1-ブタノール、およびt-ブタノールが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。液液分配に有用な他の溶剤としては、液体のシクロヘキサン、ヘプタン、トルエン、プロパン、ブタン、ペンタン、メチルシクロヘキサン(methylcylcohexane）、メチルt-ブチルエーテル、イソオクタン、アセトニトリル、2-メチルテトラヒドロフラン、テトラヒドロフラン（THF）、キシレン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、酢酸、およびエチレングリコールが挙げられる。
さまざまな態様において、溶液は分配され、NLリッチな上側の相が収集される。NLリッチ抽出物は、溶剤をエバポレートすることによって回収される。この時点でPoLとMONLに富んでいる下側の相を、PoLに適した溶剤系で抽出する。疎水性層を親水性層から分離し、溶剤を留去することによって、PoLリッチ抽出物を回収する。NLリッチ抽出物とPoLリッチ抽出物を合わせれば、CAOが得られる。CAEからCAOへの転化を達成するための水溶性構成要素の実質的除去により、30％〜50％の質量減少が起こる。CAOはEPA標準化EPA/極性脂質配合物の構成成分の一つである。さまざまな態様において、CAEの一部分が、標準化EPA配合物に含まれる。
さまざまな態様において、水溶性構成要素の少なくとも約90％、例えば水溶性構成要素の少なくとも約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上が、粗藻類抽出物から除去または分離されて、粗藻類油を与える。
d.粗藻類油から超臨界CO 2 を使って中性脂質を抽出する任意の工程
さまざまな態様において、CAOは、高圧/高温（HP/HT）超臨界二酸化炭素（SCCO2）を使って、極性脂質（PoL）混合物を含まない中性脂質（NL）リッチストリームに転化することができる。抽出は、バッチ法および連続流法（例えば向流カラム）など、当技術分野において公知である任意の方法で行うことができる。本発明者らは、SCCO2によって中性脂質が完全に抽出され、極性脂質はリン脂質の形態でも糖脂質の形態でも本質的にゼロになることを見いだした。100〜1000バール、例えば300〜1000バールの範囲、例えば100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000バール、および35〜110℃、例えば60〜110℃の範囲の温度、例えば35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、95、100、110℃であるSCCO2は、中性脂質に対して高い分配係数を有し、極性脂質に対する分配係数は本質的にゼロである。さまざまな態様において、CAOを、約340バール〜約700バールの範囲の圧力および約40℃〜約110℃の範囲の温度のSCCO2と接触させる。さまざまな態様において、CAOを、約350バール〜約690バールの範囲の圧力および約60℃〜約90℃の範囲の温度のSCCO2と接触させる。350バールおよび60℃において、SCCO2の密度は0.863g/mLである。700バール/100℃において、SCCO2は0.9g/mLの密度を有する。0.83〜0.9g/mLの密度を与える340バール〜700バールの圧力範囲のプロセス条件が適切である。高P/T SCCO2は、PoLを全く含まないNL画分を与える。これにより、クロロフィルの一部とステロールのほとんど全てが、CAOから抽出される。NL画分は、遊離脂肪酸（FFA）、トリグリセリド（TG）、ジグリセリド（DG）、クロロフィル、およびステロールから構成される。高P/T SCCO2抽出からの残存材料は、リン脂質と糖脂質とを含む濃縮極性脂質（濃PoL）である。濃PoLはEPA標準化配合物の2つ目の構成要素である。このストリームおよびCOAが、EPA標準化EPA/極性脂質配合物に極性脂質を与える。
さまざまな態様において、CAEまたはCAOは、エタノールおよび水と合わせて、プロパンまたはブタンで抽出することができる。これにより、極性脂質から中性脂質が優先的に抽出されて、FFA、TG、およびDGから構成される濃縮EPA画分が形成される。水およびエタノールの存在は、極性脂質に対する分配係数を高め、極性脂質を水/エタノール相にとどめる。いくつかの態様では、エタノールを、メタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、またはn-ブタノールもしくはtert-ブタノールなどのC4アルコールで置き換えることができる。体積比は約1:1 アルコール:水とすることができる。
さまざまな態様において、CAEは、HP/HT SCCO2と、それに続くジメチルエーテル（DME）による抽出とを使って、NLリッチ画分とPoLリッチ画分に分けることができる。
e.中性脂質画分からC20遊離脂肪酸を単離する工程
CAOのNLリッチ画分、全CAOの一部分、またはCAEの一部分を加水分解して、遊離脂肪酸（FFA）を形成させ、次にSCCO2分画に供すことにより、EPA FFAの濃縮物を作出する。さまざまな態様において、CAEの第1の部分、例えば全CAEの30〜80％、例えばCAEの30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、または80％が、そのまま加水分解を受ける。CAEの第2の部分は、最終配合EPA製剤に含めるために、とっておくことができる。
遊離脂肪酸を放出させるための加水分解は、当業者にはよく知られているさまざまな経路によって行うことができる。最も一般的な方法は鹸化とそれに続く酸性化および直接酸性化である。生成物収率の面から、鹸化は有用な経路である。なぜなら反応の第1工程で不可逆的に脂肪酸塩が形成されるからである。さまざまな態様において、中性脂質混合物は、過剰量の水の存在下で水酸化物塩、例えばKOHまたはNaOHと合わせることができる。脂肪酸とグリセロール骨格との間のオキシル結合（oxyl bond）が破壊され、それぞれの陽イオン相互作用、例えばK＋またはNa＋陽イオン相互作用が形成される。この反応は、50℃〜90℃の範囲の温度条件において還流下で完了させることができる。トリグリセリド（TG）構成成分およびジグリセリド（DG）構成成分は、塩と遊離グリセロールに転化される。遊離グリセロールは極性が高い。その塩溶液をリン酸、硫酸、塩酸またはギ酸などの酸で処理する。これにより、塩の陽イオンが除去され、対応する遊離脂肪酸（FFA）が形成される。溶液は2つの相、すなわち有機相と水相に分配する。直接酸性化法では、反応の工程数は少ないものの、反応が可逆的である。したがってFFAの収率は、鹸化経路ほど大きくはないだろう。酸性化では、中性脂質を水および強酸、例えば硫酸、塩酸、リン酸、またはギ酸と合わせる。化学量論を上回る水、例えば少なくとも5倍程度の水、例えば約6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、またはそれ以上の水を、中性脂質に加える。酸を加えてpHを約2に下げる。その混合物を60〜100℃の温度で還流下に加熱する。この反応は、単一工程ではあるが、可逆的である。平衡をFFAの方向に押しやるために過剰の水が必要である。次にバイオマスの混合物を、例えばヘキサン類などを使って、溶剤抽出することができる。溶剤をエバポレートすると、主として脂肪酸（そのほぼ半分が遊離脂肪酸である）から構成される部分加水分解藻類油が回収される。
中性脂質が加水分解を受けてFFAが形成されたら、その混合物内のEPA画分をさらに濃縮し、鎖長の短い脂肪酸から単離することができる。先の加工工程で、トリグリセリドとジグリセリドは全てFFAに転化されている。これは高酸油と呼ばれ、主として遊離脂肪酸の形態にあるさまざまな脂肪酸（FA）化合物の混合物である。SCCO2によって、メチルエステルから、またひいてはエチルエステルから、オメガ-3を濃縮できることは、文献公知であるが（Nilsson, et.al.「Supercritical Fluid CO2 Fractionation of Fish Oil Esters」Advances in Seafood Biochemistry, 1992）、SCCO2が非エステル化FFA（FFA FA）の混合物を分画できることは、これまで知られていなかった。FFA FAは極性部分である。SCCO2溶解度における従来の考えは、これらの化合物はSCCO2には不溶であり、したがってSCCO2の調整可能な溶解特徴を適用することはできないだろうというものであった。驚いたことに、本発明者らは、SCCO2が、FFA FAを分子量によって分画する能力を有することを見いだした。FFA FAは、圧力勾配または温度勾配を適用することによって分画することができる。
さまざまな態様において、FFA FA供給原料はSCCO2の圧力勾配下で分画される。どの特定理論にも束縛されることは望まないが、8〜20炭素分子長の長いカルボン酸鎖の無極性効果は、カルボニル基の極性特徴を圧倒する。したがって、等温条件の存在下で、SCCO2圧を約100バールから増加させることにより、高分子量カルボン酸の溶解度が次第に増加する。等温条件下、例えば約40℃〜約60℃の範囲の温度で、100バールを上回る圧力の低圧SCCO2、例えば約150バール〜約350バールの範囲における圧力の段階的勾配または連続的勾配を使って、低分子量遊離脂肪酸を高分子量遊離脂肪酸から除去することができる。これにより、C8、C10、C12、C14、C18構成成分を低減または排除しつつ、EPAおよびARAを含むC20構成要素を濃縮することが可能になる。さまざまな態様において、EPA濃度は少なくとも2倍になる。濃縮後は、これがEPA濃縮FFAストリーム（濃EPA）であり、EPA標準化製剤を作出するための混合物中の第3構成成分である。
f.C20遊離脂肪酸画分と極性脂質画分を組み合わせる工程
3つの構成要素を配合して、EPAと極性脂質との標準化された組合せを形成させる。
すなわち、CAO、濃PoL、および濃EPAを使って、配合物中のEPA含量と極性脂質含量がどちらも制御された標準化製品を作出する。
g.代替生産法
さまざまな態様において、EPAと極性脂質とを含む組成物を生産するための方法であって、以下の工程を含む方法が提供される:
（a)藻類ペーストを用意する工程;
（b）藻類ペーストを濃エタノールで抽出する工程であって、エタノールの濃度が、少なくとも70体積％、例えば少なくとも75体積％、80体積％、85体積％、90体積％または95体積％である、工程;
（c）エタノールを藻類ペーストから実質的に除去することによって、中性脂質と極性脂質とを含む粗藻類抽出物（CAE）を得る工程;
（d）C3-C7アルカン溶剤でCAEを抽出する工程;
（e）アルカン溶剤を実質的に除去することによって、極性脂質と脂肪酸とに富む粗藻類油（CAO）を得る工程;
（f）CAOの第1の部分において極性脂質を濃化する工程であって、
（i）CAOの第1の部分を第の1シリカゲル吸着剤と接触させること;
（ii）第1のシリカゲル吸着剤をC3-C7アルカンと接触させることによって中性脂質を溶出させること;および
（iii）第1のシリカゲル吸着剤をC1-C4アルコールと接触させることによって極性脂質を溶出させること
を含み、それによって濃縮極性脂質（CPL）を得る工程;
（g）CAOの第2の部分において遊離脂肪酸を濃化する工程であって、
（i）CAOの第2の部分と工程（f）の（ii）において溶出させた中性脂質とを加水分解に供すこと;
（ii）加水分解されたCAOを第2のシリカゲル吸着剤と接触させること;
（iii）第2のシリカゲル吸着剤をC3-C7アルカンと接触させることによって遊離脂肪酸を溶出させること;および
（iv）工程（g）の（iii）において溶出させた遊離脂肪酸からEPAを濃縮すること
を含み、それによって濃縮EPAを得る工程;および
（h）工程（f）の（iii）において得たCPLと工程（g）の（iv）において得た濃縮EPAとを組み合わせることによって、EPAと極性脂質とを含む組成物を生産する工程。
さまざまな態様において、工程（b）において使用されるエタノールの濃度は、96％未満（例えば共沸混合物形成濃度未満）である。さまざまな態様において、本方法はさらに、工程（d）においてCAEを酢酸エチルで抽出する工程を含む。さまざまな態様において、本方法はさらに、工程（f）の（ii）の後に、第1のシリカゲル吸着剤をアセトンと接触させることによって極性脂質を溶出させることを含む。いくつかの態様では、EPAが尿素結晶化によって遊離脂肪酸から濃縮される。いくつかの態様では、EPAが超臨界二酸化炭素分画によって遊離脂肪酸から濃縮される。いくつかの態様では、EPAが超臨界CO2の圧力勾配を使って濃縮される。いくつかの態様では、超臨界CO2の圧力勾配が約172バールから約345バールまでである。いくつかの態様では、超臨界CO2の圧力勾配が等温である。いくつかの態様では、超臨界CO2の圧力勾配が、約50℃〜約70℃の一定温度に維持される。
この代替方法では、生産プロセスが、脂肪酸組成物の変動の影響をはるかに受けにくくなる。エタノール（水中に少なくとも約70体積％、例えば少なくとも約75体積％、80体積％、85体積％、90体積％または95体積％）を使ってバイオマスを抽出する。エタノールの濃度は約96％未満、または共沸混合物を形成する濃度未満である。藻類を破壊する必要はない。エタノール抽出物は、エタノール系溶剤の大半を実質的に除去および分離（例えばエバポレーションによるもの）した後は、湿粗藻類抽出物（湿CAE）と呼ばれる。湿CAEを向流カラムに移し、そこでC3-C7アルカン溶剤（例えば純度が少なくとも約95重量％のもの）で抽出する。有用なC3-C7アルカン溶剤の具体例としては、n-プロパン、n-ブタン、イソブタン、ペンタン、ヘキサン、イソヘキサン、ヘプタン、およびそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。n-プロパン、n-ブタン、およびイソブテンの混合物も有用である。さまざまな態様において、混合アルカンは、約40〜82mol％のn-ブタン、18〜60mol％のイソブタン、8mol％未満のn-プロパン、および0.5mol％未満のペンタンとすることができる。純粋なn-ブタンまたはイソブタンである必要はない。プロパンの添加は混合物の蒸気圧を上昇させる。ペンタンの添加は蒸気圧を低下させる。これが抽出に著しい影響を及ぼすことはないが、これにより、プロセス設備の所要圧力定格が達成される。さまざまな態様において、n-ブタンとn-プロパンとを含む混合物が、CAEを抽出するためのアルカン溶剤として使用される。いくつかの態様では、ブタンまたはn-ブタンとイソブタンとの混合物が、CAEを抽出するためのアルカン溶剤として使用される。さまざまな態様において、CAEは、向流カラムにおいてC3-C7アルカン溶剤で抽出される。C3-C7アルカン溶剤の実質的な除去および分離（例えばエバポレーションによるもの）後に、粗藻類油（CAO）が得られる。CAOは、極性脂質と脂肪酸に富み、かつ水溶性タンパク質と糖質がより多く減損している混合物である。さらに、極性脂質のアルカン相へのさらなるシフトを容易にするために、酢酸エチル（EtAc）を湿CAE供給混合物に加えることもできる。これにより、CAOからEtAcを回収するための二次的溶剤除去と引き換えに、極性脂質の回収率を高めることができる。さまざまな態様において、EtAcは少なくとも約95重量％の純度を有する。EtAcを使用する態様では、CAE、エタノール、および水の液状混合物にまずEtAcを加えてから、C3-C7アルカン溶剤と接触させる。さまざまな態様において、EtAc:CAEの比は0:1〜2:1、例えば約0.8:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1である。さまざまな態様において、C3-C7アルカン溶剤:CAEの比は約0.5:1〜約3.0:1、例えば約0.8:1〜約1.2:1である。
CAOは、最終配合EPA組成物用の構成要素のための出発材料である。これは、CPL（濃縮極性脂質）および超濃縮EPAという2つの形態に転化される。CPLは、極性脂質が強化された混合物構成要素である。CPLへの加工は、中性脂質（FFA、TG、およびDG）からの除去および分離によって、極性脂質の濃化をもたらす。超濃縮EPAでは、EPAをそのFFA形態で標準化し濃化する方法で、あらゆる中間形態からのEPAが統合される。さまざまな態様において、超濃縮EPAを作出するためのプロセスは、加水分解、吸収クロマトグラフィー（absorptive chromatography）、および尿素結晶化/脱ろうまたは超臨界二酸化炭素（SCCO2）分画を伴う。
CPLはシリカゲル吸着剤を使って作出される。さまざまな態様において、40オングストローム〜2000オングストロームの範囲の孔径と5〜2000ミクロンの粒径とを有する球状または不規則な形状の顆粒形態にあるシリカゲル吸着剤を使用することができる。いくつかの態様では、吸着剤が、粒子表面に結合された追加部分を何も持たない。いくつかの態様では、約60オングストロームの孔径と60〜200ミクロンの範囲の粒径とを有する不規則な顆粒が使用される。さまざまな態様において、20〜250ミクロンの範囲にある広範囲の通常シリカを使用することができる。適切な市販シリカゲル吸着剤として、Silicycle社のSiliaFlash P60およびSiliaFlash GE60が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。シリカゲル吸着剤は、極性別に大まかな分子クラスを分離するための吸収剤として使用される（例えば順相クロマトグラフィー）。CAOは、当業者によく知られている方法を使ってシリカカラムに移される。さまざまな態様において、ロードされたシリカは、中性脂質、クロロフィル、およびカロテノイドから構成される最も極性の低い構成要素の第1画分（F1）を除去するために、C3-C7アルカン溶剤で脱着される。この第1画分（F1）の溶出については、適切なC3-C7アルカン溶剤の具体例として、n-プロパン、n-ブタン、イソブタン、ペンタン、ヘキサン、イソヘキサン、ヘプタン、およびそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。さまざまな態様において、F1を溶出させるためのアルカン溶剤はブタンである。さまざまな態様において、カラムは、次に、第2画分（F2）を溶出させるために、アセトン（Ace）で脱着される。最後に、C1-C4アルコールによる3回目の洗浄を使って、第3画分（F3）を溶出させる。有用なC1-C4アルコールの具体例としては、エタノール（EtOH）、エタノールと水（EtOH/H2O）、メタノール（MeOH）、イソプロピルアルコール（IPA）、n-ブタノール（nBuOH）、イソブタノール（iBuOH）、およびそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。さまざまな態様において、EtOH/H2Oが使用される。なぜならこれはFDA GRAS（Generally Regarded As Safe（一般に安全と認められる））溶剤だからである。2〜6ベッド体積の溶剤を、特定画分の溶出に使用する。一定の態様では、F2アセトン洗浄を排除し、アセトン洗浄とアルコール洗浄の組合せによって脱着されるであろう構成成分（F2およびF3）を全てアルコール洗浄（F3）のみで除去することにより、CPLを作出するためのプロセスを単純化することができる。ジガラクトシルジアシルグリセロール（DGDG）はF2に濃縮される。比較的無極性であるホスファチジルイノシトール（PI）以外のリン脂質は、F3に濃縮される。F3は、モノガラクトシルジアシルグリセロール（MGDG）の大半も含有する。一般に、F3よりF2の方に、高濃度のEPAが溶出する。F2とF3の組合せにより、配合に有用な約35〜約50重量％の範囲にある総極性脂質濃度が溶出する。
上述の順相クロマトグラフィーにおいてC3-C7アルカン溶剤を使ってCAOから溶出させたF1は、中性脂質を含有するが、藻類の栽培履歴に依存して、それは、EPAの濃度がかなり高い場合もあるし、そうでない場合もある。F1は、主に、FFA、TG、およびDGを含む中性脂質を含有する。これはPIを含みうる。F1は、CAO中に存在するEPAの50〜75％を含有しうる。したがって、さまざまな態様において、F1は、それを未加工のCAOと混合し、そのCAO/F1混合物を超濃縮EPAに転化することによって、さらに加工される。
超濃縮EPAは、CAOまたはCAOとF1の混合物を含む供給原料を使って作出される。さまざまな態様において、超濃縮EPAは、以下の3工程で製造することができる:
（1）加水分解
（2）吸収クロマトグラフィー
（3）尿素結晶化またはSCCO2分画。
加水分解工程では、CAOまたはCAOとF1の混合物を、以下の例示的プロセスに供すことができる:
（1）CAOに水を加える。さまざまな態様において、この水は、ろ過され、脱イオン化されている。さまざまな態様において、約91gのCAOまたはCAO/F1混合物を、約500mLの水と合わせる。
（2）温度を少なくとも約60℃まで、例えば少なくとも約10分間、上昇させる。
（3）塩基を加えて、pHを12.5まで上昇させる。さまざまな態様において、塩基は水酸化ナトリウム（NaOH）であり、固形物として、水500mLにつき約22gの濃度で加えられる。さまざまな態様において、最終濃度は約0.5重量％〜約5.0重量％NaOH（0.125M〜1.25M NaOH）の範囲にあり、例えば約1.5重量％（0.375M NaOH）である。さまざまな態様において、水酸化ナトリウムは、固形物として、水500mLにつき約22gの濃度で加えられる。
（4）温度を少なくとも約80℃まで、例えば少なくとも約2時間、上昇させる。
（5）溶液を周囲温度（例えば約22℃〜約30℃の範囲、例えば約25℃）まで冷却する。
（6）酸を加えて、pHを1.5まで低下させる。さまざまな態様において、酸は硫酸（H2SO4）である。さまざまな態様において、約12mLの濃H2SO4を加える。H2SO4の最終濃度は1〜12重量％（0.102M〜1.22M H2SO4）の範囲にあり、典型的な値は4.4重量％（0.45M H2SO4）である。
（7）アルカン溶剤を加える。さまざまな態様において、アルカン溶剤はC3-C7アルカン溶剤、例えばn-プロパン、n-ブタン、イソブタン、ペンタン、ヘキサン、イソヘキサン、ヘプタン、およびそれらの混合物である。いくつかの態様では、アルカン溶剤がヘキサンである。いくつかの態様では、アルカン溶剤がブタン、例えばn-ブタン、イソブタンおよびそれらの混合物である。さまざまな態様において、アルカン溶剤は1:1の濃度で加えられる。さまざまな態様において、加水分解プロセスの第1工程において使用した水500mLにつき約500mLのアルカン溶剤が加えられる。
（8）混合物を適当なサイズの分液漏斗に移す。
（9）下側の水相を、それより色の濃い上側の有機相からデカントする。水相を捨てる。
（10）アルカン溶剤を分離し、回収する。さまざまな態様において、アルカン溶剤はエバポレーションによって除去される。無溶剤混合物は主としてFFAであり、これを濃縮EPAと呼ぶ。
さまざまな態様において、工程10からの濃縮FFAは、約13重量％〜約15重量％のEPAおよび約35重量％〜約40重量％の総脂肪酸（TFA）の範囲にある。この混合物中の材料の残りは、カロテノイド、クロロフィル、および他の極性脂質構成要素を含む非脂肪酸構成要素である。いくつかの態様では、nBut、iBut、またはBut抽出、エバポレーション、および抽出物の回収が、工程7〜10の代わりに行われる。
吸収クロマトグラフィー工程では、当業者に公知の方法を使って、濃縮EPAを順相シリカカラムにロードする。20〜400ミクロンの広い粒径範囲を有する任意の順相シリカが適切である。有用なシリカゲル吸着剤の具体例はSiliaflash P60である。第1画分用にC3-C7アルカン溶剤を使ってFFA抽出物をカラムから溶出させる（F1 FFA）。無極性構成要素の大半がC1-C4アルコール溶剤を使ってカラムから除去される（F2 FFA）。濃縮EPA供給物の極性構成成分を脱着させるには、メタノール（MeOH）、エタノール（EtOH）、EtOH/H2O、イソプロピルアルコール（IPA）、n-ブタノール（nBuOH）、イソブタノール（iBuOH）、およびそれらの混合物を含む任意の低級アルコールを使用することができる。F1 FFAは、著しく強化されたTFA濃度を有し、その濃度は典型的には75重量％〜85重量％の範囲にある。溶出するEPAレベルは、28重量％〜40重量％の範囲にある。典型的なF1 CAOは約13重量％〜約15重量％EPAの範囲にあり、結果として溶出するF1 FFAは少なくとも約25重量％EPA、例えば少なくとも約26重量％、27重量％、28重量％、または29重量％であるだろう。濃縮極性脂質（CPL）画分と配合する前に、F1 FFA溶出画分からのEPAをさらに濃縮することが望ましい。
EPAのさらなる最終的濃縮工程には、（1）尿素結晶化および脱ろう（UREA）または（2）超臨界二酸化炭素分画（SCCO2）という、2つの選択肢を使用することができる。前者の場合は、試薬等級の尿素（例えばVWR Ultrapure等級の尿素（カタログ番号:97061-920））を、上記F1 FFA画分中に溶出した濃縮EPAと合わせる。同じ重さの尿素と濃縮EPAをアセトン中で混合し（例えば20gの尿素と20gのEPAを80gのアセトン中で混合し）、少なくとも約50℃の温度で少なくとも約1時間は加熱撹拌し、室温まで冷却する。次に、その溶液を約-30℃に4時間冷却する。さまざまな態様において、冷却は極低温冷却装置中で果たすことができる。尿素は、飽和脂肪酸（例えば主にパルミチン酸（C16:0））および一価不飽和脂肪酸（例えば主にパルミトレイン酸（C16:1））と錯体を形成する。これらの錯体は、冷却すると尿素溶液から沈殿する。尿素溶液を素早く冷却ろ過することで、沈殿物を除去し、濾液をとっておく。濾液（透明溶液）は、アセトンの（例えばエバポレーションによる）回収後は、飽和脂肪酸と一価不飽和脂肪酸が除去されているので、EPAに富む。この上清は、約35重量％〜約55重量％の範囲のEPAを含有する。この超濃縮EPAは濃縮極性脂質（CPL）画分と共に配合して最終EPA/極性脂質組成物を作出するのに適している。
いくつかの態様では、SCCO2を使って濃縮EPAを超濃縮EPAに分画する。これは、内部還流型または外部還流型のSCCO2抽出システムに移すことができる。低分子量のFFA構成要素（C16:0およびC16:1）を除去するには、低圧低温条件（例えば約2175psi（150バール）および60℃以下）を使用する。濃縮EPAの高分子量構成要素（具体的にはアラキドン酸（C20:4n6）およびEPA（C20:5n3））を取り出すには、高圧条件（例えば約4350psi（300バール）および70℃以上）を使用する。さまざまな態様において、このような分画は、約28〜29重量％EPAの出発濃度から始めて、それを45重量％〜55重量％EPAまで増加させることができる。この超濃縮EPAは、最終EPA/極性脂質組成物を作出するために濃縮極性脂質（CPL）画分と共に配合するのに適している。
最後に、濃縮極性脂質（CPL）画分と超濃縮EPAとを合わせることによって、標準化配合EPA極性脂質混合物を作出する。両構成成分のEPAレベルを測定し、最終混合物が少なくとも約25重量％EPAであることが保証されるように、適当な配合比を算出する。さまざまな態様において、CPLと超濃縮EPAの濃度の加重平均に基づく混合則の計算を使用する。
4.EPAによって緩和される状態を防止および処置する方法
数多くの疾患状態および障害、例えば限定するわけではないが、精神障害（例えばうつ病（大うつ病、抑うつ気分および/または産後うつ病を含む）、双極性障害、不安、パニック障害および社会恐怖障害、気分障害、統合失調症、強迫性障害（OCD）、境界型人格障害、注意欠陥多動障害および関連障害、神経性食欲不振症）、心血管疾患、骨障害（osteopathic disorder）（例えば変形性関節症、骨粗鬆症）、がん、および神経変性障害（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、または他の任意の「トリプレットリピート」病、卒中、多発梗塞型または他の形態の認知症、多発性硬化症、慢性疲労およびてんかん）などに対して医学的に確立された治療能力を持つことから、エイコサペンタエン酸（EPA、C20:5、n-3）はオメガ-3類の重要な脂肪酸である。例えばHegarty, et al, Curr Opin Psychiatry. (2013) 26(1):33-40;Parker, et al, Am J Psychiatry. (2006) 163(6):969-78;Martins, J Am Coll Nutr. (2009) 28(5):525-42;Stahl, et al, Curr Opin Investig Drugs. (2008) 9(1):57-64;Simopoulos, Am. J. Clin. Nutr. (1999) 70:560S-569S;およびUrsin. J. Nutr. (2003) 133:4271-4274を参照されたい。本明細書に記載のEPA製剤は、EPAによって防止され、改善され、緩和され、遅延され、かつ/または処置されることがわかっている任意の疾患状態の防止、改善、緩和、進行の遅延、および/または処置に役立ちうる。
a.利益を得ることができる対象
有効量の、本明細書に記載するEPA組成物の投与による防止、改善、緩和、進行の遅延、および/または処置を適用できる対象/患者には、現在症状を示している対象だけでなく、疾患のリスクがあるが症状は示していない個体も含まれる。一定の態様では、その疾患状態の遺伝的リスクを有することがわかっている個体に、その個体が無症候性であるか、疾患の症状を示しているかに関わらず、有効量のEPA製剤を投与する。そのような個体には、その疾患状態を経験したかまたはその疾患状態であると診断された血縁者（例えば親、祖父母、兄弟姉妹）を有する者、遺伝子マーカーまたは生化学的マーカーの解析によってそのリスクが決定された者が含まれる。いくつかの態様では、対象は無症候性であるが、その疾患状態を発症する家族性リスク因子および/または遺伝的リスク因子を有する。いくつかの態様では、対象は、疾患の症状を呈しているか、またはその疾患状態を有すると診断されている。
b.処置を適用できる状態
本明細書に記載するEPA製剤は、幅広い疾患および障害、例えば限定するわけではないが、任意の精神疾患、神経疾患、または他の中枢神経系疾患もしくは末梢神経系疾患-特に、うつ病、統合失調症、双極性障害、神経性食欲不振症、および脳の変性障害、例えばアルツハイマー病および他の認知症ならびにパーキンソン病;喘息および他の呼吸器疾患;任意の系を冒す炎症性疾患;任意の形態の炎症性疾患、例えば任意の形態の関節炎、任意の形態の炎症性皮膚疾患、例えば乾癬および湿疹、任意の形態の炎症性胃腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、および例えば目および脳を含む任意の臓器の任意の炎症状態;任意の形態の心血管疾患または脳血管疾患;任意の形態の代謝性疾患、例えば糖尿病、X症候群、および任意のカルシウム代謝障害、例えば骨粗鬆症、尿結症（unolithiase）、または尿路結石;任意の形態の腎疾患または尿路疾患;生殖器系または月経周期の任意の形態の疾患または障害;腎臓疾患または尿路疾患;肝疾患;男性生殖器官または女性生殖器官、例えば乳腺または前立腺の疾患、;がんおよび/またはがん悪液質;頭頸部の疾患、例えば口および歯の疾患、目の疾患、または耳の疾患;ウイルス、細菌、真菌、原虫または他の生物による感染などの防止、改善、緩和、進行の遅延、および/または処置に使用することができる。
有効量の、本明細書に記載するEPA組成物を投与することによって防止し、改善し、緩和し、遅延させ、かつ/または処置することができる疾患状態の具体例としては、精神障害（例えばうつ病（単極性うつ病、大うつ病、抑うつ気分および/または産後うつ病を含む）、双極性障害、気分障害、統合失調症、統合失調感情障害、統合失調症傾向、境界型人格障害、注意欠陥多動障害および関連障害、神経性食欲不振症）、骨障害（例えば変形性関節症、骨粗鬆症）、心血管疾患（例えば高血圧症、冠動脈疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、高血圧、および末梢血管系疾患）、がん、がん悪液質、神経変性障害（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症または他の任意の「トリプレットリピート」病、卒中、多発梗塞型または他の形態の認知症、多発性硬化症、慢性疲労およびてんかん）、喘息および他の呼吸器疾患、肝疾患（例えば慢性肝炎;脂肪症;肝線維症;肝硬変）、アルコール依存症;栄養失調;慢性的な非経口栄養;リン脂質欠乏;脂質過酸化;細胞再生の律動異常;細胞膜の不安定化;閉経期または閉経後の状態;加齢;良性前立腺肥大;腎臓疾患;浮腫;皮膚疾患;胃腸疾患（例えば炎症性腸疾患および過敏性腸症候群）;および妊娠中毒症が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。さまざまな態様において、EPA製剤は一般栄養補助食品として服用することができる。
したがって、有効量の、本明細書に記載するEPA組成物の投与によって、前述の疾患または状態、特に神経障害および精神障害、例えば統合失調症、統合失調感情障害、統合失調症傾向、うつ病（大うつ病、抑うつ気分および/または産後うつ病を含む）、双極性障害、気分障害、統合失調症、境界型人格障害、注意欠陥多動障害および関連障害のいずれかを防止し、改善し、緩和し、その進行を遅延させ、かつ/または処置する方法が提供される。
さらにまた、有効量の、本明細書に記載するEPA組成物を投与することによって、喘息および他の呼吸器疾患;脳の変性障害、例えばアルツハイマー病および他の認知症ならびにパーキンソン病;消化管の疾患、例えば炎症性腸疾患および過敏性腸症候群;任意の系を冒す炎症性疾患;血管疾患;任意の形態の異脂肪血症、任意の形態の糖尿病または任意の形態の代謝性疾患;任意の形態の皮膚疾患;任意の形態の腎臓疾患または尿路疾患;任意の形態の肝疾患;男性生殖器系もしくは女性生殖器系または関連二次生殖器官、例えば乳腺または前立腺の任意の形態の疾患;任意の形態のがんまたはがん悪液質;頭頸部の任意の疾患、例えば口および歯の疾患、目の疾患、または耳の疾患;およびウイルス、細菌、真菌、原虫または他の生物による任意の形態の感染から選択される任意の疾患を防止し、改善し、緩和し、その進行を遅延させ、かつ/または処置する方法も提供される。
c.製剤および投与
一態様において、EPA組成物は経口送達することができる。本明細書において「経口送達することができる」または「経口投与」という用語は、治療作用物質またはその組成物が対象の口内に置かれるような、対象への治療作用物質またはその組成物の任意の形態の送達を包含し、その薬剤または組成物が嚥下されるか否かを問わない。したがって「経口投与」には、食道投与だけでなく、バッカル投与および舌下投与も包含される。
いくつかの態様では、EPA組成物が固形剤形の形態にある。適切な固形剤形の非限定的な例としては、錠剤（例えば懸濁錠剤（suspension tablet）、咀嚼懸濁錠剤（bite suspension tablet）、迅速分散錠剤、咀嚼錠、溶解錠、発泡錠、二層錠剤など）、カプレット、カプセル剤（例えば動物性ゼラチンまたは植物供給源でできた軟ゼラチンカプセル剤または硬ゼラチンカプセル剤であって、固形物および/または液体が充填されているもの）、散剤（例えば包装された散剤、分配可能な散剤（dispensable powder）または発泡性散剤）、口中錠、サシェ剤、カシェ剤、トローチ剤、ペレット剤、顆粒剤、微粒剤、封入微粒剤、粉末エアロゾル製剤、または経口投与に十分に適合した他の任意の固形剤形が挙げられる。
さまざまな態様において、本EPA組成物は単一投与単位または個別投与単位で処方することができる。本明細書において「用量単位（dose unit）」および「投薬単位（dosage unit）」という用語は、治療効果を与えるための単回投与に適した量の治療作用物質を含有する薬学的組成物の一部分を指す。そのような投与単位は、1日あたり1回〜複数回（すなわち1〜約10回、1〜8回、1〜6回、1〜4回または1〜2回）投与するか、防止的、緩和的および/または治療的応答を引き出すのに必要な回数だけ投与することができる。
別の態様において、EPA組成物は、そのまま飲むための液状剤形または用量単位の形態にあるか、摂取前に食品または飲料と混合することができる。適切な液状剤形の非限定的な例としては、溶液剤、懸濁剤、エリキシル剤、シロップ剤、液体エアロゾル製剤などが挙げられる。一般に、液状形態は二相性ではなく、約10重量％未満のH2O、例えば約9重量％未満、8重量％未満、7重量％未満、6重量％未満、5重量％未満、4重量％未満、3重量％未満、2重量％未満、または1重量％のH2Oを含有する。
さまざまな態様において、本EPA組成物は、2グラム以下、例えば1グラム未満、100mg未満、10mg未満、1mg未満、例えば約1mg〜約10mg、例えば約10mg〜約100mg、例えば約10mg〜約2g、例えば約100mg〜約2gの1日量でEPAを投与するために処方される。さまざまな態様において、本EPA組成物は、1日あたり250mg〜2gの範囲の総投薬量でEPAを投与するために処方される。例えば本EPA組成物は、300mgカプセル剤中60〜100mg、例えば500mgカプセル剤中90〜170mg、例えば1000mgカプセル剤中180〜340mgの用量でEPAを投与するために処方することができる。理論に束縛されることは望まないが、本EPA組成物中の糖脂質の存在は、オキアミ油または魚油からの同じターゲット組織へのEPAバイオアベイラビリティと等しいかそれ以上のレベルのターゲット組織へのEPAのバイオアベイラビリティを可能にする。本EPA製剤は、半分未満の極性脂質濃度で、等しいかそれ以上のバイオアベイラビリティでターゲット組織にEPAを送達することができ、EPA投与を低減し、カプセル剤サイズを低減することが可能になる。オキアミ油または魚油は少なくとも約35重量％の極性脂質、例えば少なくとも約39重量％の極性脂質を含有する場合があり、糖脂質を含有しないが、本EPA製剤は糖脂質と約10重量％〜約35重量％の総極性脂質を含有する。したがって、さまざまな態様において、本EPA組成物は、上述のEPA用量より、またはオキアミ油もしくは魚油として提供されるEPA用量と比較して、90％、85％、80％、75％、70％少ない1日量でEPAを投与するために処方される。さまざまな態様において、本EPA製剤を投与するためのカプセル剤サイズは、関心対象のターゲット組織（例えば血液（血漿）、肝臓、脳、皮膚）においてEPAの等価なバイオアベイラビリティを達成するのに現在使用されているカプセル剤のサイズの約30％、40％、50％、60％または70％であることができる。
いくつかの態様において、EPA組成物はさらに、貯蔵中の活性成分の分解を抑制し、防止し、妨害し、または他の形で減弱する安定剤を含む。例えば組成物中のEPAの酸化的分解は、酸化防止剤の存在によって防止または減弱されうる。適切な酸化防止剤の非限定的な例として、トコフェロール、Origanox（商標）（Frutarom Ltd.から入手できる）、レシチン、クエン酸および/またはアスコルビン酸が挙げられる。所望であれば、組成物中に1つまたは複数の酸化防止剤が、典型的には、重量にして約0.001％〜約5％、約0.005％〜約2.5％、または約0.01％〜約1％の量で存在する。
賦形剤
本EPA組成物は、任意で、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。本明細書において「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、それ自体は治療作用物質ではなく、治療作用物質を対象に送達するための担体または媒体として使用されるか、薬学的組成物の取り扱い性または貯蔵性を改良するために、または薬学的組成物の単位用量の形成を可能または容易にするために、薬学的組成物に加えられ、許容できない毒性または組成物中の他の構成要素との相互作用をもたらさない、任意の物質を意味する。
本EPA組成物は、任意で、1つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤を賦形剤として含むことができる。適切な希釈剤の具体例としては、個別に、または組合せとして、ラクトース、例えば無水ラクトースおよびラクトース一水和物;デンプン、例えば直接圧縮可能な（directly compressible）デンプンおよび加水分解デンプン（例えばCelutab（商標）およびEmdex（商標））;マンニトール;ソルビトール;キシリトール;デキストロース（例えばCerelose（商標）2000）およびデキストロース一水和物;二塩基性リン酸カルシウム二水和物;スクロース系希釈剤;粉砂糖;一塩基性硫酸カルシウム一水和物;硫酸カルシウム二水和物;顆粒状乳酸カルシウム三水和物;デキストレーツ;イノシトール;加水分解穀類固形物（hydrolyzed cereal solid）;アミロース;セルロース、例えば微結晶セルロース、α-セルロースおよび無定形セルロースの食品用供給源（例えばRexcel（商標））ならびに粉末セルロース;炭酸カルシウム;グリシン;ベントナイト;ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。そのような希釈剤が存在する場合、それは全部で、組成物の総重量の約5％〜約99％、約10％〜約85％、または約20％〜約80％を構成することができる。
EPA組成物は、任意で、1つまたは複数の薬学的に許容される崩壊剤を賦形剤として含むことができる。適切な崩壊剤としては、個別に、または組合せとして、デンプン、例えばグリコール酸デンプンナトリウム（例えばPenWestのExplotab（商標））およびα化トウモロコシデンプン（例えばNational（商標）1551、National（商標）1550、およびColocorn（商標）1500）、粘土（例えばVeegum（商標）HV）、セルロース、例えば精製セルロース、微結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム（例えばFMCのAc-Di-Sol（商標））、アルギネート、クロスポビドン、およびゴム質、例えば寒天、グアーガム、キサンタン、ローカストビーンガム、カラヤゴム、ペクチンおよびトラガカントゴムが挙げられる。そのような崩壊剤が存在する場合、それは、典型的には、全部で、組成物の総重量の約0.2％〜約30％、約0.2％〜約10％、または約0.2％〜約5％を構成する。
本EPA組成物は、任意で、1つまたは複数の酸化防止剤を含むことができる。例示的酸化防止剤としては、アスコルビン酸ナトリウム、Origanox（商標）、およびビタミンE（トコフェロール）が挙げられる。1つまたは複数の酸化防止剤が存在する場合、それはEPA組成物中に、典型的には、重量にして約0.001％〜約5％、約0.005％〜約2.5％、または約0.01％〜約1％の量で存在する。
本EPA組成物は、任意で、1つまたは複数の薬学的に許容される結合剤または粘着剤を賦形剤として含むことができる。そのような結合剤および粘着剤は、打錠される粉末に十分な凝集力を付与して、分粒、潤滑、圧縮およびパッケージングなどといった通常の加工操作を可能にし、なおかつ摂取後に錠剤が崩壊して組成物が吸収されることを可能にすることができる。適切な結合剤および粘着剤としては、個別に、または組合せとして、アラビアゴム;トラガカント;スクロース;ゼラチン;グルコース;デンプン、例えば限定するわけではないが、アルファ化デンプン（例えばNational（商標）1511およびNational（商標）1500）;セルロース、例えば限定するわけではないが、メチルセルロースおよびカルメロースナトリウム（例えばTylose（商標））;アルギン酸およびアルギン酸の塩;マグネシウムアルミニウムシリケート;PEG;グアーガム;多糖酸;ベントナイト;ポビドン、例えばポビドンK-15、K-30およびK-29/32;ポリメタクリレート;HPMC;ヒドロキシプロピルセルロース（例えばKlucel（商標））;およびエチルセルロース（例えばEthocel（商標））が挙げられる。そのような結合剤および/または粘着剤が存在する場合、それは、全部で、組成物の総重量の約0.5％〜約25％、約0.75％〜約15％、または約1％〜約10％を構成する。
本EPA組成物は、任意で、1つまたは複数の薬学的に許容される湿潤剤を賦形剤として含むことができる。本EPA組成物中に湿潤剤として使用することができる界面活性剤の非限定的な例として、4級アンモニウム化合物、例えば塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムおよび塩化セチルピリジニウム、ジオクチルナトリウムスルホスクシネート、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、例えばノノキシノール9、ノノキシノール10、およびオクトキシノール9、ポロキサマー（ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロックコポリマー）、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド、および油、例えばポリオキシエチレン（8）カプリル/カプリンモノおよびジグリセリド（例えばGattefosseのLabrasol（商標））、ポリオキシエチレン（35）ヒマシ油およびポリオキシエチレン（40）硬化ヒマシ油;ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えばポリオキシエチレン（20）セトステアリルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、例えばポリオキシエチレン（40）ステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリソルベート20およびポリソルベート80（例えばICIのTween（商標）80）、プロピレングリコール脂肪酸エステル、例えばプロピレングリコールラウレート（例えばGattefosseのLauroglycol（商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、脂肪酸およびその塩、例えばオレイン酸、オレイン酸ナトリウムおよびトリエタノールアミンオレート、グリセリル脂肪酸エステル、例えばグリセリルモノステアレート、ソルビタンエステル、例えばソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレート、ソルビタンモノパルミテートおよびソルビタンモノステアレート、チロキサポール、およびそれらの混合物が挙げられる。そのような湿潤剤が存在する場合、それは全部で、組成物の総重量の約0.25％〜約15％、約0.4％〜約10％、または約0.5％〜約5％を構成する。
本EPA組成物は、任意で、1つまたは複数の薬学的に許容される潤滑剤（抗粘着剤および/または流動促進剤）を賦形剤として含むことができる。適切な潤滑剤として、個別に、または組合せとして、グリセリルベハペート（glyceryl behapate）（例えばCompritol（商標）888);ステアリン酸およびその塩、例えばステアリン酸のマグネシウム塩（ステアリン酸マグネシウム）、カルシウム塩およびナトリウム塩;硬化植物油（例えばSterotex（商標））;コロイダルシリカ;タルク;ロウ;ホウ酸;安息香酸ナトリウム;酢酸ナトリウム;フマル酸ナトリウム;塩化ナトリウム;DL-ロイシン;PEG（例えばCarbowax（商標）4000およびCarbowax（商標）6000）;オレイン酸ナトリウム;ラウリル硫酸ナトリウム;およびラウリル硫酸マグネシウムが挙げられる。そのような潤滑剤が存在する場合、それは全部で、組成物の総重量の約0.1％〜約10％、約0.2％〜約8％、または約0.25％〜約5％を構成する。
適切な抗粘着剤としては、タルク、トウモロコシデンプン、DL-ロイシン、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸金属塩が挙げられる。タルクは、例えば設備表面への製剤の粘着を低減するために、そしてまた配合物中の静電気を低減するために使用される、抗粘着剤または流動促進剤である。タルクが存在する場合、それは、組成物の総重量の約0.1％〜約10％、約0.25％〜約5％、または約0.5％〜約2％を構成する。流動促進剤は、固形製剤の粉体流を促進するために使用することができる。適切な流動促進剤としては、コロイド状二酸化ケイ素、デンプン、タルク、三塩基性リン酸カルシウム、粉末セルロースおよび三ケイ酸マグネシウムが挙げられる。
本発明の組成物は、任意で、1つまたは複数の香味剤、甘味剤、および/または着色剤を含む。本発明において有用な香味剤としては、アラビアシロップ、アリターム、アニス、リンゴ、アスパルテーム、バナナ、ババロア、ベリー、カシス、バター、バターペカン（butter pecan）、バタースコッチ、クエン酸カルシウム、ショウノウ、キャラメル、サクランボ、チェリークリーム（cherry cream）、チョコレート、シナモン、柑橘類、シトラスポンチ（citrus punch）、シトラスクリーム（citrus cream）、ココア、珈琲、コーラ、クールチェリー（cool cherry）、クールシトラス（cool citrus）、シクラメート、シラメート（cylamate）、デキストロース、ユーカリ、オイゲノール、フルクトース、フルーツポンチ、ショウガ、グリチルレチネート、グリシリザ（甘草）シロップ、ブドウ、グレープフルーツ、ハチミツ、イソマルト、レモン、ライム、レモンクリーム、MagnaSweet（登録商標）、マルトール、マンニトール、メープル、メントール、ミント、ミントクリーム、ミックスベリー、ナッツ、オレンジ、ピーナツバター、セイヨウナシ、ペパーミント、ペパーミントクリーム、Prosweet（登録商標）粉末、キイチゴ、ルートビアー、ラム、サッカリン、サフロール、ソルビトール、スペアミント、スペアミントクリーム、イチゴ、イチゴクリーム、ステビア、スクラロース、スクロース、スイスクリーム（Swiss cream）、タガトース、タンジェリン、タウマチン、トゥッティフルッティ（tutti fruitti）、バニラ、クルミ、スイカ、ワイルドチェリー、冬緑油、キシリトール、およびそれらの組合せ、例えばアニス-メントール、チェリー-アニス、シナモン-オレンジ、チェリー-シナモン、チョコレート-ミント、ハチミツ-レモン、レモン-ライム、レモン-ミント、メントール-ユーカリ、オレンジ-クリーム、バニラ-ミントなどが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
本発明において使用することができる甘味剤としては、例えばアセスルファムカリウム（アセスルファムK）、アリターム、アスパルテーム、シクラメート、シラメート（cylamate）、デキストロース、イソマルト、MagnaSweet（登録商標）、マルチトール、マンニトール、ネオヘスペリジンDC、ネオテーム、Prosweet（登録商標）粉末、サッカリン、ソルビトール、ステビア、スクラロース、スクロース、タガトース、タイマチン、キシリトールなどが挙げられる。
香味剤、甘味剤、および/または着色剤は、本EPA組成物中に、任意の適切な量で、例えば重量にして約0.01％〜約10％、約0.1％〜約8％、または約1％〜約5％の量で、存在することができる。
本EPA組成物は、任意で、懸濁化剤を含むことができる。適切な懸濁化剤の非限定的具体例としては、二酸化ケイ素、ベントナイト、水和アルミニウムシリケート（例えばカオリン）およびそれらの混合物が挙げられる。1つまたは複数の懸濁化剤が、任意で、重量にして約0.01％〜約3.0％、約0.1％〜約2.0％、または約0.25％〜約1.0％の総量で、EPA組成物中に存在する。
上記の賦形剤は当技術分野において知られているように複数の役割を有しうる。例えばデンプンは充填剤としても崩壊剤としても役立ちうる。上記賦形剤の分類は、決して限定と解釈してはならない。当技術分野の通常の技能を有する者には容易に理解されるであろうが、どのように類別された賦形剤であっても、さまざまな異なるカテゴリーの賦形剤としても働きうる。
本EPA組成物を機能性食品として処方する場合、それらは、食品、飲料、エネルギーバー、スポーツ飲料、サプリメントの形態、または他の形態をとることができ、それらはいずれも当技術分野において知られているとおりである。
併用療法
さまざまな態様において、本EPA製剤は、抗うつ薬、抗高血圧剤および/またはコレステロール低下剤、アスタキサンチン、ビタミンE、リン脂質、補酵素Q9（CoQ9）、および/または補酵素Q10（CoQ10）と共投与することができる。本明細書に記載のEPA製剤との共投与は、抗うつ薬、抗高血圧剤および/またはコレステロール低下剤をサブ治療用量で投与することを可能にすることができる。
本EPA製剤と共投与することができる例示的抗うつ薬としては、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、SSRI（例えばシタロプラム、エスシタロプラム、パロキセチン、フルオキセチン、フルボキサミン、セルトラリン）;選択的ノルエピネフリン再取り込み阻害薬（NRI）（例えばアトモキセチン、レボキセチン、ビロキサジン）;ノルアドレナリン作動性・特異的セロトニン作動性抗うつ薬（NaSSA）（例えばミアンセリン、ミルタザピン）;セロトニン-ノルエピネフリン再取り込み阻害薬（SNRI）（例えばデスベンラファキシン、デュロキセチン、ミルナシプラン、ベンラファキシン）;セロトニン拮抗再取り込み阻害薬（SARI）（例えばエトペリドン、ネファゾドン、トラゾドン）;ノルエピネフリン-ドーパミン再取り込み阻害薬（例えばブプロピオン）;選択的セロトニン再取り込み促進薬（例えばチアネプチン、アミネプチン）;ノルエピネフリン-ドーパミン脱抑制薬（NDDI）（例えばアゴメラチン）;三環系抗うつ薬（例えばアミトリプチリン、クロミプラミン、ドキセピン、イミプラミン、トリミプラミン、デシプラミン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン）;モノアミンオキシダーゼ阻害薬（MAOI）（例えばイソカルボキサジド、モクロベミド、フェネルジン、ピルリンドール、セレギリン、トラニルシプロミン）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
本EPA製剤と共投与することができる例示的抗高血圧剤としては、ループ利尿薬（例えばブメタニド、エタクリン酸、フロセミド、トルセミド）;チアジド利尿薬（例えばエピチジド、ヒドロクロロチアジド、クロロチアジド、ベンドロフルメチアジド）;チアジド様利尿薬（例えばインダパミド、クロルタリドン、メトラゾン）;カリウム保持性利尿薬（例えばアミロライド、トリアムテレン、スピロノラクトン）;ベータアドレナリン作動性受容体遮断薬（例えばアテノロール、メトプロロール、ナドロール、ネビボロール、オクスプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール、チモロール）;アルファアドレナリン作動性受容体遮断薬（例えばドキサゾシン、フェントラミン、インドラミン、フェノキシベンザミン、プラゾシン、テラゾシン、トラゾリン）;混合アルファ＋ベータ遮断薬（例えばブシンドロール、カルベジロール、ラベタロール）;カルシウムチャネル遮断薬（例えばアムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、レルカニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニトレンジピン、ジルチアゼム、ベラパミル）;レニン阻害薬（例えばアリスキレン）;アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害薬（例えばカプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリル、ベナゼプリル）;アンジオテンシンII受容体アンタゴニスト（例えばカンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、オルメサルタン、テルミサルタン、バルサルタン）;アルドステロン受容体アンタゴニスト（例えばエプレレノン、スピロノラクトン）;血管拡張薬（例えばニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン）;アルファ-2アゴニスト（例えばクロニジン、グアナベンズ、メチルドパ、モクソニジン）およびアドレナリン作動性ニューロン遮断薬（例えばグアネチジン、レセルピン）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
本EPA製剤と共投与することができる例示的脂質低下剤（別名、抗高脂血症剤または脂質低下薬）としては、スタチン、すなわちHMG-CoA還元酵素阻害薬（例えばアトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン）、フィブラート（例えばベザフィブラート、シプロフィブラート、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート）、ナイアシン、胆汁酸吸着剤（レジン）（例えばコレスチラミン、コレセベラム、コレスチポール、コレスチピド（colestipid）、エゼチミブ、ロイタピド、フィトステロール（例えばβ-シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール）、およびオルリスタットが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
本EPA製剤は、治療有効量のまたはサブ治療量の、抗うつ薬、抗高血圧剤および/または抗高脂血症剤のうちの1つまたは複数と共投与することができる。具体的化合物の投薬量は、当業者には周知である多くの因子に依存する。それらには、例えば投与経路およびその特定化合物の力価などがある。抗うつ薬、抗高血圧剤および/または抗高脂血症剤の投薬および計画は当技術分野において公知であり、例えば公表された文献や参考テキスト、例えばPhysicians' Desk Reference, 67th Ed., 2013, Thomson HealthcareまたはBrunton, et al., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th edition, 2010, McGraw-Hill Professionalに見いだすことができる。EPA製剤と抗うつ薬、抗高血圧剤および/または抗高脂血症剤とが協同作用するので、共投与される作用物質の一方または両方をサブ治療用量で投与することができる。
有効量の決定は、特に本明細書において提供する詳細な開示に照らせば、当業者の能力の範囲内で十分に可能である。一般に、本発明の1つまたは複数のポリペプチドの組合せの効能量または有効量は、まず低用量または少量のポリペプチドまたは組成物を投与し、次に、処置対象において所望の効果が最小限の毒性副作用でまたは毒性副作用を伴わずに観察されるまで、必要に応じて第2または第3の薬物治療を加えて、投与される用量、すなわち投薬量を徐々に増加させることによって決定される。本発明の組合せの投与に関して適当な用量および投与計画を決定するための応用可能な方法は、例えばGoodman and Gilman 's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th Edition, 2010, 前記;Physicians' Desk Reference (PDR), 67th Edition, 2013;Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., 2005, 前記;およびMartindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press.、およびMartindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31st Edition., 1996, Amer Pharmaceutical Assnに記載されており、これらの各文献は参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、請求項に記載する発明を例示するために提示するのであって、その範囲を限定しようとするものではない。
実施例1:改良されたバイオアベイラビリティを有するEPA製剤
この標準化オメガ3および極性脂質製剤は、微細藻類ナンノクロロプシス・オクラタの2つの株（以下、S12およびS14という）から得られる。N.オクラタは海藻株であり、したがって海水または塩水のいずれかで栽培しなければならない。塩水は、海水中に存在する溶解固形分の5分の1倍〜1倍の溶解固形分を有する。S12とS14はどちらも遺伝子改変を受けていない。これらの株は選抜育種プログラムの結果である。S12株は、名目上、低い周囲温度条件に適合しており、一方、S14は温かい温度条件において栽培することができる。藻類の組成には、さまざまな因子、例えば限定するわけではないが、株、培地の内容、日内温度変動、照度、培養濃度などによる自然変動がある。
加えて、抽出物の組成は、栽培系から取り出した後の藻類バイオマスの取り扱いにも依存する。名目上、藻類は、典型的には、0.1〜1.0g/Lバイオマスの範囲、より典型的には0.4〜0.7g/Lの範囲の系で、比較的希薄な培養において成長する。0.5g/L培養濃度の場合、これは培養物1000gにつき乾燥重量換算で0.5gのバイオマスが存在するという、希薄な濃度を含意する。藻類は、もっと濃縮された状態、典型的には2〜300g/Lの範囲で、さらに加工されるので、かなりの量の水を除去する必要がある。この場合、水は塩水、すなわち溶解固形分を含む水であると理解される。
S12およびS14 N.オクラタ中のオメガ-3とは、エイコサペンタエン酸（EPA）（C20:5ω3）とα-リノレン酸（ALA）（C18:3ω3）を指し、名目上、EPAは総オメガ-3のかなりの割合を占めた。極性脂質にはリン脂質（PL）と糖脂質（GL）がどちらも含まれる。PL画分は、以下の4つのPL構成要素から構成される:ホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルグリセロール（PG）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、およびホスファチジルイノシトール（PI）。混合物中の糖脂質は、主として、ジガラクトシルジアシルグリセロール（DGDG）およびモノガラクトシルジアシルグリセロール（MGDG）である。オメガ-7は、名目上、パルミトレイン酸（C16:1ω7）によって表される。混合物中の脂肪酸（FA）は以下の4つの主要脂質タイプに関連している:PL、GL、遊離脂肪酸（FFA）、およびトリグリセリド（TG）。ジグリセリド（DG）という微量構成要素も存在する。中性脂質（LP）は、FFA、TG、およびDGから構成される。極性脂質（PoL）はPLおよびGLから構成される。
標準化製剤を作出するためのプロセスの具体的一態様を図4に示す。これは、中性脂質および極性脂質分離（NL/PoL分離）、中性脂質ハーモナイゼーション（Harmonization）、および脂質分画の詳細が、図1とは異なっている。バイオマス抽出と、それに続く超臨界二酸化炭素（SCCO2）を使ったNL/PoL分離、中性脂質ハーモナイゼーションのための加水分解、およびSCCO2分画による脂質分画の具体的態様には、いくつかの変法がある。バイオマス抽出法は、名目上、NLおよびPoLの回収率が最大になるように行われる。ナンノクロロプシス・オクラタは光合成単細胞生物であるから、光合成機構と脂質貯蔵手段とが同じ細胞内に位置する。バイオマスからのCAEはクロロフィル含量が高く、混合物の2重量％から最大20重量％までさまざまでありうるが、典型的な値は5〜8重量％の範囲にある。また、ステロール含量は1重量％程度である。カロテノイドは2,500〜10,000ppm（0.25〜1重量％）である。
ナンノペーストは湿潤状態または乾燥状態のいずれかで抽出することができる。湿潤状態では、水分含量が400〜1000％（w/w）乾燥バイオマス（25〜10重量％固形分）である。乾燥状態では、水分含量が乾燥バイオマスの15％（w/w）未満である。CAEは、10〜80％の、脂質ではない構成成分を含有しうる。脂質および植物栄養素以外の構成要素を非脂質有機物（Matter Organic-Not Lipid）の略でMONLと呼ぶ。この材料の組成は完全にはわかっていないが、排除する必要がある構成成分が水溶性構成要素であることはわかっている。MONL精製の結果として得られるアウトプットは、総脂質が50重量％を上回る、またいくつかの実施形態では総脂質が60〜70重量％を上回る、粗藻類油（CAO）である。
藻類バイオマス中の脂肪酸含量を決定するためのベンチマーク技法は、脂肪の酸加水分解（fat by acid hydrolysis）（FAH）法である。この方法では、強酸でバイオマスを処理することによる細胞要素の消化と、それに続く抽出、脂肪酸メチルエステル（FAME）への転化、ならびにAOCS（American Oil Chemist Society）Method Ce 1b 89「Fatty Acid Composition of Marine Oils by GLC（GLCによる海洋性油の脂肪酸組成）」およびAOCS Method Ca 5b 71「Crude Fatty Acids（粗脂肪酸）」による分析が行われる。前者の方法では、脂肪酸の総収集物中の各脂肪酸構成成分の相対量が決定される。後者の方法では、試料中の総鹸化性脂肪が決定される。総鹸化性脂肪によって標準化した各脂肪酸の相対量により、各脂肪酸の試料ベースの量が決定される。米国ニュージャージー州トレントンのNew Jersey Feed Laboratory, Inc.（NJFL）は、酸消化、抽出、およびFAME転化について、特定の独自拡張技術を有する。別段の注記がある場合を除き、FAHプロファイルは全て、この方法と組織によって測定される。さらにまた、異なる抽出方法によって得られた混合物の脂肪酸プロファイル（FAP）を決定する場合は、AOCS Methods Ca 5b 71およびCe 1b 89が使用される。別段の注記がある場合を除き、FAPデータは全てNJFLから得られる。
脂質および植物栄養素を、藻類細胞を構成する残りのタンパク質、糖質、無機質、および繊維から抽出することによって、CAEが生産される。バイオマス抽出により、脂質はバイオマスから単離されると同時に、ごく少量の糖質、タンパク質、および無機質が除去される。残余バイオマスは脂質が実質的に減損しているので、脂質抽出藻類（LEA）と呼ばれる。驚いたことに、また他の多くの藻類種とは異なり、本発明者らは、N.オクラタを抽出するのに、細胞膜を破壊するための機械的、熱的、化学的手段のいずれかによる破壊が必要ないことを見いだした。これは、それぞれ表2および表3に示すS12およびS14バイオマスの複製試料（N＝3または4）の比較抽出によって例証される。藻類バイオマスは全て、低湿度環境中、60℃で、固形分が水分10重量％未満になるまで乾燥した。表2および表3に報告する脂肪酸プロファイルについては、バイオマスを従来のソックスレー抽出機または自動化ソックスレー抽出機（インターネットではen.wikipedia.org/wiki/Soxhlet_extractor）で加工した。これは、CAEを反映したデータであるので、抽出物中の脂肪以外の他の構成要素も含まれている。S12抽出物ではS14抽出物よりTFAが低く、この抽出物に非脂質構成要素があることを示している。これらの表は、FAHによる乾燥バイオマスの抽出と、70/30v/v％のヘキサン（Hex）/メタノール（MeOH）（70/30 Hex/MeOH）溶剤抽出との間で、抽出されるEPAはバイオマスベースで本質的に同じであることを示している。総脂肪酸（TFA）は十分に同じであるから、70/30 Hex/MeOHを代表的な非独自抽出技法として応用することができる。驚いたことに、S12では、FAH法によって、70/30 Hex/MeOHの場合よりTFAの高い抽出物が作出されたが、S14では、70/30 Hex/MeOHの方が抽出物中のTFAが高くなった。それでもなお、バイオマスからの総抽出物によって量を標準化して、乾燥固形分中の脂肪酸にすると、2つの方法はどちらの株についても、ほぼ同じ量のEPAをもたらす。これは、バイオマスの抽出挙動が、種、バイオマスの栽培履歴、収穫条件および収穫時と抽出時の間の取り扱い条件、および溶剤系を含むいくつかの変量に著しく依存することを示すいくつかの事実の一つである。
表4ではS12とS14の脂肪酸プロファイルを比較している。これは、FAHと70/30 Hex/MeOH抽出の両方によって加工した乾燥S12と乾燥S14を示している。いずれの場合も、飽和FAは脂肪酸プロファイル（FAP）の約25％であり、一価不飽和FAは約30％であり、多価不飽和FAは約35％である。EPAオメガ-3は、S12でもS14でも、総オメガ-3の98％超に相当する。したがって、FAP中のEPAは約約30％であり、FAP中のオメガ-3と類似している。S12は、ARAに対するEPAの比が700〜900％と特徴的である（すなわちEPAはARAの7〜9倍である）。S14では、ARAに対するEPAの比が500〜600％の範囲にあって、低い。
（表２）脂肪の酸加水分解および70/30 Hex/MeOHによるS12乾燥バイオマス抽出
Figure 2016504999
（表３）脂肪の酸加水分解および70/30 Hex/MeOHによるS14乾燥バイオマス抽出
Figure 2016504999
（表４）FAHおよび70/30MeOH抽出によるS12およびS14乾燥バイオマス中の脂肪酸クラス
Figure 2016504999
湿ナンノペーストまたは乾燥ナンノペーストを抽出する場合、バイオマスから脂質を取り出すために、細胞膜破壊は必要ない。バイオマスの湿式抽出には少なくとも部分的に水と混和する純粋な溶剤または溶剤混合物が必要である。これには、エーテル、ケトン、およびアルコールなど、幅広い溶剤タイプが含まれる。溶剤系の一例は、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトンとエタノール、ジメチルエーテル、ジメチルエーテルとエタノールである。これらの技法は、湿ペーストの共通供給原料（約15〜25重量％）を使って、体系的に比較することができる。さらにまた、驚いたことに、本発明者らは、バイオマス抽出が、機械的破砕（例えばビーズミル）、熱的前処理、または酸もしくは塩基による細胞壁消化を必要としないことを見いだした。本抽出方法は、湿ナンノペースト（約15〜25重量％）に作用し、機械的破砕、熱的前処理、またはアルカリ処理もしくは酸処理を一切利用しない。さまざまな態様において、溶剤系はエーテルとアルコールの混合物であるか、ケトンとアルコールの混合物である。バイオマスペーストの溶剤パーコレーションが問題になりうる。これは、ペーストをCelite（登録商標）（珪藻土）またはCellu-Flo（商標）などのろ過助剤と混合することによって、または溶剤との激しい混合をクロスフローろ過と併用することによって、軽減することができる。溶剤の組合せの例は、無水エタノール、190プルーフ（95v/v％）エタノール（EtOH）、変性190プルーフエタノール、特別変性アルコール（SDA）、アセトンとエタノール、イソプロピルアルコール、アセトンとメタノール、メチルエチルケトン（MEK）とメタノール、MEKとエタノール、ジメチルエーテル、ジメチルエーテルとメタノール、ジメチルエーテルとエタノールである。溶剤混合物の一般的特徴は、トリグリセリドなどの疎水性無極性脂質構成要素と、リン脂質および糖脂質などの親水性極性脂質構成要素とを抽出できることである。
さまざまな態様において、溶剤混合物は50％（v/v）アセトンと50％（v/v）190プルーフエタノール（EtOH）である。他の混合物例は、純粋なジメチルエーテル（DME）、メタノールと混合されたDME、または190プルーフEtOH単独である。EtOHは非変性であるか、または特別変性アルコール（SDA）等級（1-1、1-2、2B-2、2B-3、3A、3C、23A、23H、29、30、35A）プルーフ変性エタノールの一つであることができ、SDAの主要組成は表5に記載する。さまざまな態様において、エタノールは、SDA1-1、3A、3C、23A、または35Aであり、その主な際立った特徴は、抽出に関する何か特定の技術的利点というよりも、入手可能性と価格である。
（表５）特別変性アルコール（SDA）の主要構成成分
Figure 2016504999
S12バイオマスとS14バイオマスはどちらも、6段階の溶剤系の使用によって、脂質が実質的に減損する。各段階では、質量の2倍のアセトン/EtOH混合物がバイオマスと混合されて、バイオマス、溶剤、および抽出物のスラリーが形成される。抽出物溶液は、ろ過または遠心分離によってバイオマスから分離され、ここでは、溶液から固形分を除去するために、ろ過またはいくつかの態様ではクロスフローろ過が使用される。脂質をほぼ完全に抽出するには、全部で6つの段階を完了しなければならない。この方法によって粗藻類抽出物（CAE）が作出される。
乾燥バイオマスでの異なる抽出技法の比較を表6に示す。いずれの場合も、細胞材料は機械的破壊にも、熱的前処理にも、その他、アルカリ消化または酸消化にも付されなかった。バイオマスは、イスラエル北部で栽培したS12藻類であった。夏期における複数回の収穫で得た濃縮湿藻類をプールし、その濃縮湿バイオマスをホモジナイズし、その結果得られたバイオマス固形分懸濁液を、約120℃の熱空気温度で噴霧乾燥した。その結果得られた乾燥海藻粉末は、10重量％未満の水分含量であったことから、これは、細胞外水および細胞内水の大部分が除去された藻類バイオマスに相当する。この乾燥バイオマスを以下の5つの異なる方法で抽出した:NJFLによるFAH、NJFLによる70/30（v/v％）Hex/MeOH、50/50（v/v％）のアセトンと190プルーフ変性アルコール、およびDME法。第1のDME法では、噴霧乾燥バイオマスを前処理して、藻類を、水とメタノール（MeOH）の75/25（v/v％）混合物で再び濡らした。アルコール共溶剤またはケトン共溶剤の非存在下での、水と部分的に混和する溶剤であるDMEによる抽出に先立って、バイオマスを再水和させることができるかどうかを試験によって調べた（ニートDMEにおける水の溶解度は約6重量％）。DMEは水中25重量％濃度のMeOHと混和性である。「湿DME」試験には、乾燥バイオマスの軽い散水と、それに続く水飽和ニートDMEの抽出が必要であった。こうして、水はDMEの共溶剤として作用する。
（表６）
Figure 2016504999
Figure 2016504999
表6に示すように、Hex/MeOHでは、TFAもオメガ3も、それぞれバイオマスの8.71％および3.11％が示すとおり、これらの方法のなかで最大の量が得られる。Hex/MeOH試料の場合、純度の極めて高いS12試料を反映して、EPA/総EPA比は99.5％より高かった。逆に、FAH法では、抽出物の脂肪が56％を上回り、他の技法の35.2％、19.7％、31.5％および14.6％と比較して最も濃縮されることになる。Hex/MeOHでは、脂肪酸混合物を希薄にする他の非脂質構成成分を抽出することと引き換えに、乾燥バイオマスから、より多くの脂肪およびEPAが回収される。2つのDME法は、バイオマスの6.57重量％および7.32重量％というほぼ同じ量の脂肪と、バイオマスの2.44重量％および2.59重量％というよく似た量のEPAを与える。H2O/MeOH型のDMEの方が、より濃縮された抽出物をもたらす。この方法は、バイオマスからのEPAの収率がわずかに低いが、脂肪酸、オメガ-3、およびEPAが2倍を超えて濃縮された抽出物を与える。アセトン/EtOH法は、脂肪、オメガ3およびEPAの回収率が他の方法より低くなる。乾燥バイオマスから見れば、これは劣った溶剤系であり、したがって適切な方法ではないと結論することができるだろう。しかし、もっと多量の細胞内水および細胞外水が存在する状況におけるこの溶剤系の挙動を、これで説明することはできないだろう。
乾式抽出と比較した湿式抽出の優れた利益を示す好適な主要指標は、表7に見ることができる。バイオマスは、イスラエル北部で栽培したS12収穫物から採取された、名目上、同じ株および同じロットのものである。噴霧乾燥材料は何日にもわたって収集されたが、湿スラリーは単一日の収穫を反映している。湿スラリーは11.9重量％の固形分含量、すなわち98.1重量％の水分含量を有した。噴霧乾燥物は水分8重量％であった。これを考慮に入れると、100gの噴霧乾燥材料は773gのスラリーに相当した。これは、おそらく脂肪回収およびオメガ3回収には湿式抽出の方が効果的であるものの、湿式抽出は質量および体積が著しく大きいバイオマスの取り扱いを必要とすることを含意している。湿式抽出の場合、バイオマスベースでのTFA、オメガ3、およびEPA回収率は、それぞれ18.46、6.45、および6.38重量％であった。同時に栽培した噴霧乾燥S12バイオマスでは同じ値が、7.32、2.62、および2.59重量％であった。湿式抽出は、噴霧乾燥材料と比較して250％に相当するTFAおよびEPAを与えた。日間変動はおそらく抽出されるTFAおよびEPAの20〜50％の変動を引き起こすであろうが、違いがこれほど大きくなるとは、当初、本発明者らには信じがたかった。どの特定理論にも束縛されることは望まないが、細胞内水の存在が、そうでなければ乾燥バイオマスと結合していて乾燥状態では取り出されないであろうEPAおよび脂質を、抽出できるようにする。湿式抽出は、CAE中、30.8重量％TFAおよび10.6重量％EPAであり、噴霧乾燥材料のCAEが14.6重量％TFAおよび5.18重量％EPAであるのと比較して、CAE中の脂肪酸濃度およびEPA濃度の改良にもつながる。
乾燥S14バイオマスでの異なる抽出技法の比較を表8に示す。いずれの場合も、細胞材料は機械的破壊にも、熱的前処理にも、その他、アルカリ消化または酸消化にも付されなかった。S14バイオマスはイスラエル北部での栽培後に噴霧乾燥された。試験は全て乾燥バイオマスの同じロットから行われた。S12の場合と同様に、噴霧乾燥は約120℃の熱空気温度で遂行された。その結果得られた乾燥藻類粉末は15重量％未満の水分含量を有した。これは細胞外水および細胞内水のほぼ完全な除去を表す。この乾燥バイオマスを以下の5つの異なる方法で抽出した: NJFLによる70/30（v/v％）Hex/MeOH、67/33（w/w％）Hex/MeOH、アセトン、190プルーフ（95/5）（v/v％）変性EtOH、および乾燥DME。67/33 Hex/MeOH、アセトンおよび190プルーフEtOHの場合、抽出は、室温において6つの接触段階で行い、各段階では、単位バイオマスあたり重量で2倍の溶剤を使用した。乾燥DMEでは、バイオマスを濡らすことやDMEを水で飽和させることによって系に水を加え戻すということはしなかった。NJFLによる70/30v/v％Hex/MeOHでは、この溶剤溶液を、この混合物の沸点のすぐ下の高温（約60℃）で使用した。
（表７）乾燥S12および湿S12のDME抽出
Figure 2016504999
（表８）
Figure 2016504999
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このデータは、温かいHex/MeOHの方が、どの室温抽出技法よりも、バイオマスからの脂肪酸およびオメガ3の抽出に関して有効であることを示している。乾燥DMEは2番目に有効な抽出方法である（70/30 Hex/MeOHの14.5重量％のTFAに対して5.11重量％のTFA）。乾燥抽出および室温抽出は、脂肪酸の抽出を著しく阻害する。
室温DME抽出については、材料が再水和されうる可能性、または水の存在が、おそらくはDMEと共に共溶剤として作用するので、抽出を助長しうる可能性があった。そこで、DMEについて、さらに2つの変法を実施した。これには表8と同じバイオマスロットを使用した。このデータを表9い示す。「湿DME」法では、噴霧乾燥バイオマスに軽く水を適用した。これは、乾燥バイオマスに対する10重量％未満の添加になった。意図は、乾燥した藻類細胞の表面を再水和することであった。この材料を1時間静置してから加工した。加工中は、DMEを水槽に通してから、バイオマスと接触させた。ニートDMEは水に対して室温でおよそ6重量％の溶解性を有するので、これにより、DMEは水で飽和した。「H2O/MeOH-DME」法では、噴霧乾燥S14をH2O/MeOHの75/25w/w％混合物で飽和させた。バイオマスと液体を一晩浸漬しておいた。このアプローチは、効率のよいDME抽出を可能にする混合物で材料を再水和させようとしたものである。75/25w/w％H2O/MeOHはDMEと混和するので、はるかに少量のDMEでこの水混合物と脂質を抽出することを可能にしている。表9のデータは、湿DMEが乾燥DMEと比較してわずかな改良をもたらしうることを示している。湿DMEでは抽出によりバイオマスから6.96重量％のTFAおよび1.27重量％のEPAが得られるのに対して、乾燥DMEの場合は5.11重量％のTFAおよび0.975重量％のEPAであった。これは、ソックスレー様の条件で行われた70/30 Hex/MeOHより劣っていた。
（表９）
Figure 2016504999
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表10では噴霧乾燥S14と凍結乾燥S14とで乾燥技法を比較している。バイオマスは、表8および表9のデータと関連する方法により、乾燥DMEで抽出した。バイオマスはイスラエル北部で収穫された。バイオマスは2つの異なる収穫日から採取したが、その収穫物はその年のこのシーズン中の通常の培養を反映している。凍結乾燥バイオマスは、2.1重量％という並外れて低い水分含量を有していた。バイオマスベースのTFAは噴霧乾燥では4.73重量％であったのに対し、凍結乾燥では3.22重量％であった。抽出収率が低いのは、並外れて低い水分含量の結果であるかもしれない。バイオマスからのEPAの回収率を最大にするという目的では、凍結乾燥材料は噴霧乾燥より不利だと思われる。
表11には、乾燥状態でのS14抽出と湿潤状態でのS14抽出の最も直接的な比較が含まれている。このS14はニューメキシコで栽培され、単一日に収穫された。ペーストは固形分30.8重量％であった。湿バイオマスを珪藻土（DE）と1:1 w:wの比で合わせてからDME抽出にかけた。乾燥バイオマスは室温凍結乾燥によって作出された。湿ペーストを50mbarの減圧に48時間付した。これにより固形分は89.2重量％になる。この材料も、DEと1:1 w:wの比で合わせてから、抽出した。どちらの場合も、乾燥DMEを使って材料を抽出した。表11に示すように、湿ペーストがバイオマスから16.8重量％のTFAおよび3.32重量％のEPAを与えたのに対し、乾燥バイオマスでは6.12重量％のTFAおよび1.10重量％のEPAであった。同じバイオマスが、湿潤状態では、乾燥状態と比べて、2.5倍を超える脂質と3倍を上回るEPAを与えた。50重量％と38重量％のTFAおよび9.87重量％と6.90重量％のEPA含量に反映されているとおり、CAEも、湿ペーストからの方が、乾燥バイオマスからよりも濃縮された。このように、湿潤状態のバイオマスを抽出することには、乾燥状態と比較して劇的な利点がある。特定の理論に束縛されることは望まないが、細胞内水および細胞外水の存在が、DME溶剤に対する細胞膜の多孔性を維持することを可能とし、脂質を抽出されやすくしている。
S14に関して表11に示すデータおよびS12に関して表7に示すデータに基づいて、驚いたことに、本発明者らは、湿ナンノペーストから抽出すると、乾燥後の同じバイオマスを抽出した場合と比較して、バイオマスからの脂肪酸の回収率が1.5〜3.5倍増えることを見いだした。機械的破壊、熱的破壊、またはpH破壊によって細胞膜を破壊する努力を特にしなくても、湿ペーストでは抽出収率が乾燥後の同じバイオマスよりも高い。
（表１０）噴霧乾燥S14と凍結乾燥S14とを比較するDME抽出
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（表１１）乾燥S14と湿S14とを比較するDME抽出
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表11のデータを生成するのに使用したものと同じS14バイオマスロットを、湿潤状態において、いくつかの異なる溶剤系で抽出した。表12に示すように、これにはDME、50/50w/w％アセトン/EtOH、90/10w/w％アセトン/MeOH、および95/5v/v％（190プルーフ）変性EtOHを含めた。異なる技法について、バイオマスに基づくTFA収率は、16.84重量％、13.96重量％、8.95重量％、および16.12重量％であった。本発明者らは15％程度の抽出成績の変動を認めた。したがって、DME、50/50w/w％EtOHおよび95/5v/v％EtOHはいずれもほぼ同じTFA収率を与える。バイオマスから抽出されるEPAという面でも、3.32重量％、2.79重量％、1.71重量％、および3.41重量％と、傾向は類似している。脂肪酸と共に抽出される他の構成要素に着目すると、抽出物中のEPA含量は9.9重量％、6.6重量％、6.4重量％、および7.1重量％であった。DMEと95/5v/v％のEtOHが、最もよい結果を与えた。
脂肪酸プロファイルに加えて、極性脂質および他の植物栄養素も、31P NMR（31P NMR）、1H-NMR（1H NMR）、および13C-NMR（13C NMR）を併用して、Spectral Service GmbH（ドイツ・ケルン）によって決定された。スペクトルは全て、自動試料交換機およびQNPクライオプローブ付きのBruker Avance III 600MHz NMR分光計（Bruker、ドイツ・カールスルーエ）を使って取得した。定性31P NMRは、方法SAA MET002 02に従った。1H NMR/13C NMR分析は方法SAA MET001-02に従った。取得およびデータ処理にはBruker TopSpinを使用した。31P NMRでは内部標準をトリフェニルホスフェート（TPP）（Alrich Chemia AG、チェコ共和国ブーフス（Buchs））とした。1H NMRおよび13C NMRでは内部標準をTPPおよびDソルビトール（C6H14O6、Sigma Aldrich、ドイツ・シュタインハイム）とした。31P NMRは試料中のリン脂質分布を定量するために使用した。1H NMRは、ジガラクトシルジアシルグリセロール（DGDG）、モノガラクトシルジアシルグリセロール（MGDG）、コレステロール、クロロフィルを定量するために使用した。DGDGとMGDGは糖脂質（GL）である。極性脂質（PoL）は、リン脂質および糖脂質から構成される。コレステロールは、一般にフィトステロールのマーカーとし、以後、フィトステロール、総ステロール、またはステロールという。13C NMRはマンニトールとグリセロールを定量するために使用した。マンニトールは鎖状のC6糖質である。この構成成分は、これまで、ナンノクロロプシス・オクラタ抽出物には同定されていなかった。
（表１２）
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（表１３）
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表13は、S12バイオマスおよびS14バイオマスの半精製DME抽出物の極性脂質組成をオキアミ油と対比して示している。半精製材料には、粗藻類抽出物（CAE）中の水溶性非脂質構成成分の約半分を除去する水分配が関わっている。オキアミ油とナンノクロロプシス・オクラタ抽出物との間の格別に大きな相違は、オキアミ油がGLを含有しないことである。オキアミはGLを産生するための生合成経路を持たない。さらにまた、N.オクラタのリン脂質産生量はオキアミ油より少ない。N.オクラタはGLをPLより多く産生し、GLはPLよりも20％〜300％多い。この表は、噴霧乾燥の効果を湿ペーストと対比して示している。湿S12および乾燥S12の総PoL含量が31.5重量％および16.6重量％であり、湿S14および乾燥S14の総PoL含量が43.9重量％および30.6重量％であることに反映されているとおり、湿ペーストは、極性脂質を50〜100％多く抽出することを可能にする。S12抽出物およびS14抽出物はいずれもホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルグリセロール（PG）、および他のリン脂質構成要素を含有する。乾燥S12を除けば、S12およびS14はホスファチジルイノシトール（PI）およびホスファチジルエタノールアミン（PE）も含む。S12およびS14は、オキアミ油に見いだされる1-リゾホスファチジルコリン（1-LPC）、リゾホスファチジルエタノールアミン（LPE）、およびN-アシルホスファチジルエタノールアミン（APE）を欠いている。
表14は乾燥S14藻類と湿S14藻類の極性脂質含量を対比して示している。これはQLTS1およびQLTS2の極性および植物栄養素分析である。この抽出物は先の定義による粗藻類抽出物（CAE）である。抽出物からのFAPを表11に報告する。厳密に同じロットのバイオマスについて、湿潤状態でのDMEによる抽出が、バイオマスベースで4.34重量％のPLおよび5.50重量％のGLを与え、一方、乾燥状態でのDMEによる抽出は、バイオマスベースで0.61重量％のPLおよび0.81重量％のGLを与えた。湿潤状態抽出物はPLの抽出に関して7倍を超えて効果的であり、GLの抽出については6倍を超えて効果的であった。フィトステロールおよびクロロフィルは、湿潤状態では乾燥状態より2倍効果的に抽出される。湿式抽出からのCAEは12.89重量％のPLおよび13.35重量％のGLを有する。乾式抽出の場合、PLは3.81重量％および5.06重量％である。CAEは、PLが3倍を超えて濃縮されており、GLが2.5倍を超えて濃縮されている。この結果から、本発明者らは、乾式抽出と比較して湿式抽出には著しい利点があると結論する。
（表１４）DMEで抽出した乾燥S14および湿S14からの極性脂質および植物栄養素
Figure 2016504999
表15は、S14藻類ペーストからの極性脂質および植物栄養素の抽出収率について、異なる溶剤系を比較している。抽出物からのFAPは表12に報告する。溶剤系は、DME、50/50w/w％アセトン/EtOH（Ace/EtOH）、90/10w/w％アセトン/MeOH（Ace/MeOH）、および95/5v/v％（190プルーフ）変性EtOH（190プルーフEtOH）であった。バイオマスベースで、DME、Ace/EtOH、Ace/MeOH、および190プルーフEtOHについて、PL含量は4.34、3.83、1.53、および4.79であり、GL含量は5.50、3.88、1.62、および4.76であった。抽出収率は、DMEと190プルーフEtOHでは、ほぼ同じであった。Ace/EtOHが低いのは試料間変動によるのかもしれない。CAEについて言えば、DMEが29.24重量％の総PoLで最もよく、一方、Ace/EtOHおよび190プルーフEtOHはそれぞれ18.26重量％および19.73重量％であった。本発明者らは、その後の研究から、これらの液体溶剤がDME抽出物より多量の水溶性非脂質構成要素を含むことを知っている。この水溶性構成要素はCAEをCAOに添加する際に除去される。湿ペーストでは、これらの液体溶剤はいずれも、依然として、DMEで抽出した乾燥バイオマスより、バイオマスからのPoLの収率がよく、抽出物中のPoLの濃度も高いことに留意されたい（表14参照）。
表16は、乾燥S12藻類と湿S12藻類の極性脂質含量を対比して示している。これはQLTS18およびQLTS17の極性および植物栄養素分析である。これらの抽出物からのFAPを表7に報告する。同時期に収穫されたバイオマスでは、バイオマスベースでのDME抽出結果について、湿潤状態S12がバイオマスベースで3.53重量％のPLおよび9.06重量％のGLを与えたのに対し、乾燥状態はバイオマスベースで2.13重量％のPLおよび3.41重量％のGLを与えた。湿潤状態抽出の方が、PLの抽出に関して1.5倍を超えて効果的であり、GLの抽出については2.5倍を超えて効果的である。湿式抽出からのCAEは5.89重量％のPLおよび15.10重量％のGLを含んでいる。乾式抽出の場合、PLは4.26重量％および6.81重量％である。CAEは、PLが33％を超えて濃縮され、GLが2.5倍近く濃縮されている。この結果は、乾式抽出と比較して湿式抽出には著しい利点があることを、さらに補強している。
（表１５）
Figure 2016504999
Figure 2016504999
（表１６）DMEで抽出した乾燥S12および湿S12からの極性脂質および植物栄養素
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S12の湿式抽出には、収率が高いことに加えて、リン脂質の分布が乾燥S12からのそれとは異なることに、別の利点がある。QLTS-17では、リン脂質分布がホスファチジルイノシトール（PI）およびホスファチジルエタノールアミン（PE）を含むことに留意されたい。PIおよびPEは、CAE中の全部で5.89重量％のPLのうち、それぞれ0.90重量％および0.44重量％を占める。PIおよびPEは、質量で総PLの15.2％および9.0％に相当し、混合物のほぼ25％である。PL分布の相違は、これら2つの欠けている構成成分で、ほとんど完全に説明される。S12ナンノクロロプシス・オクラタでは、細胞内水の存在がこれら2つのPL構成成分の抽出にとって不可欠であると思われる。
NL、PL、GL、クロロフィル、ステロール、カロテノイド、マンニトール（manitol）、およびグリセロールから構成されるCAEが、S12およびS14に対するこれらの異なる乾燥アプローチ、前処理方法、および溶剤抽出方法から得られる。PLおよびGLは共に極性脂質を構成する。S12およびS14中のリン脂質は、PC（ホスファチジルコリン）、PI（ホスファチジルイノシトール）、PE（ホスファチジルエタノールアミン）、PG（ホスファチジルグリセロール）、および他の非特異的リン脂質である。表14によれば、S12油およびS14油では、オキアミ油より、「その他」のリン脂質の比率が高い。これは、S12油とS14油にはオキアミ油よりユニークなPL化合物の数が多いことを含意している。以下のリン脂質はS12およびS14 N.オクラタ油には存在しないことが目につく:LPI（リゾホスファチジルイノシトール）、PS（ホスファチジルセリン）、LPS（リゾホスファチジルセリン）、SPH（スフィンゴミエリン）、LPE（リゾホスファチジルエタノールアミン）、APE（N-アシルホスファチジルエタノールアミン）、PA（ホスファチジン酸）、およびLPA（リゾホスファチジン酸）。糖脂質はDGDG（ジガラクトシルジアシルグリセロール）とMGDG（モノガラクトシルジアシルグリセロール）である。オキアミ油にはGLは存在しない。
図6に示すように、CAEは、かなりの比率のMONLを含有する。MONLは、TFA、リン脂質、糖脂質、および植物栄養素には分類されず、そう分類するほかない材料である。MONLは、水溶性糖質およびタンパク質であると考えられるが、この画分の組成は現在はまだ調査されていない。CAEは、水分配によってCAOに転化することができる。MONL精製は、過剰の水をCAEに加え、高せん断ミキサーで水とCAEを密に接触させ、沈降または遠心分離のいずれかによって水相と有機相を分離することを含む、水溶性構成要素の分配を含みうる。その有機相がCAOであり、極性脂質（PoL）および中性脂質（NL）の脂質リッチ混合物である。あるいは、CAEを連続的に、中性脂質の方に適した溶剤、例えばヘキサン、クロロホルム、シクロヘキサン、塩化メチル、またはそれらの組合せで抽出した後、PoLに適した溶剤、例えばアセトン、メタノール、エタノールまたはそれらの混合物で、さらに抽出することもできる。第1工程では、溶液が分配され、NLリッチな上側の相が収集される。NLリッチ抽出物は、溶剤をエバポレートすることによって回収される。この時点でPoLにもMONLにも富む下側の相を、PoLに適した溶剤系で抽出する。抽出後に、溶剤をエバポレートすることによって、PoLリッチ抽出物を回収する。NLリッチ抽出物とPoLリッチ抽出物を合わせれば、CAOが得られる。CAEからCAOへの転化により、30％〜50％の質量減少が起こる。CAOはEPA標準化EPA/極性脂質配合物の構成成分の一つである。
S12ナンノクロロプシスについて、CAEおよびCAOの組成、ならびに異なる脂質クラス間のFAの分布を、それぞれ図6、図7、および図8に示す。S12のCAEは35〜45重量％のMONLを含有する。このMONLはCAOでは実質的に減少する。CAOでは、MONLがCAOの4〜10重量％である。脂肪酸は、FFA以外のNL、FFA、PL、およびGLに分布する。S12では、FAがNLとPoLにほとんど均等に分割されている。TG/DG NLはFAの35〜48％であり、FFA NLは3〜12％（6％が典型的）である。収穫時または抽出時の高温への曝露は、GL、PL、またはTG/DGからFFAへの、FAの転化をもたらしうる。これは加水分解プロセスである。高温を最小限にし、周囲温度を上回る温度になる時間を低減するように注意する。PoLのうち、GLはPoLにおけるFAの約3/5（29％）に相当し、PLはPoLにおけるFAの約2/5（21％）に相当する。これらの数字は、栽培培地および環境条件に基づいて、その公称値から±10％上下しうる。
S14ナンノクロロプシスについて、CAEおよびCAOの組成、ならびに異なる脂質クラス間のFAの分布を、それぞれ図9、図10、および図11に示す。S14のCAEは40〜60重量％のMONLを含有する。このMONLはCAOでは実質的に減少する。CAOでは、MONLがCAOの5〜15重量％である。脂肪酸は、FFA以外のNL、FFA、PL、およびGLに分布する。S14では、FAが約40％のPoLと約60％のNLである。TG/DG NLはFAの40〜50％であり、FFA NLは10〜25％（17％が典型的）である。S12の場合と同様に、収穫時または抽出時の高温への曝露は、GL、PL、またはTG/DGからFFAへの、FAの転化をもたらしうる。PoLのうち、GLはPoL中のFAの約半分（17％）に相当し、PLはPoL中のFAの約半分（20％）に相当する。これらの数字は、栽培培地および環境条件に基づいて、その公称値から±10％上下しうる。
図4に示すように、CAOは、高圧/高温（HP/HT）超臨界二酸化炭素（SCCO2）によってNLリッチかつゼロPoLの混合物に分けることができる。本発明者らは、SCCO2が中性脂質を完全に抽出し、極性脂質はリン脂質の形態でも糖脂質の形態でも本質的に全く抽出しないことを見いだした。100〜1000バールの範囲および35〜110℃の温度のSCCO2は、中性脂質に対して高い分配係数を有し、極性脂質に対する分配係数は本質的にゼロである。典型的な値は、最低340バールおよび40℃から、最高700バールおよび110℃であるだろう。さまざまな態様において、圧力および温度の範囲は、350バール/60℃〜690バール/90℃である。350バールおよび60Cでは、SCCO2の密度は0.863g/mLである。700バール/100℃では、SCCO2は0.9g/mLの密度を有する。0.83〜0.9g/mLの密度を与える340バール〜700バールの圧力範囲のプロセス条件は好適である。高P/T SCCO2により、PoLを全く含まないNL画分が生産される。これはCAOからクロロフィルの一部とほとんど全てのステロールを抽出する。NL画分は、遊離脂肪酸（FFA）、トリグリセリド（TG）、ジグリセリド（DG）、クロロフィル、およびステロールから構成される。高P/T SCCO2抽出からの残留物は、リン脂質および糖脂質を含む濃縮極性脂質（濃PoL）である。濃PoLはEPA標準化配合物の第2の構成要素である。このストリームおよびCOAが、EPA標準化EPA/極性脂質配合物に極性脂質の全てを提供する。
図4のプロセスに代わるプロセスとして、CAEは、HP/HT SCCO2と、それに続くジメチルエーテル（DME）による抽出とを使って、NLリッチ画分とPoLリッチ画分とに分けることもできる。CAEを生産するためのアセトン/エタノールによる湿ペーストプロセス、結果として得られるHT/HP SCCO2画分、およびDME画分の一例を、表17A、表17B、および表17Cに提示する。表17Aは脂肪酸プロファイルを示している。最も顕著な特徴はCAE中の比較的低いTFAである。これはMONLの存在によるものである。表17Bは同じ試料の極性脂質および植物栄養素の組成を示している。表17Bからの最も決定的な知見は、HP/HT SCCO2が、極性脂質（PoL）を一切抽出しないことである。PLもGLもHP/HT SCCO2には可溶でない。SCCO2はNLの大部分を抽出する。表17Cは、NL、PL、およびGLクラスにおけるFAの分布、および試料全体におけるNL、PL、およびGLの分率を示している。CAEでは、NLはFAのほぼ75％であり、FAの残りはPLとGLにほとんど均等に分かれる。HP/HT SCCO2画分では、NLが濃縮されており、PLとGLはどちらも全くない。NLはCAEの23.5重量％からNL濃縮物（HP/HT SCCO2）では69.3重量％になる。MONLはNL濃縮物ではほとんど完全に除去されている。最後に、DME画分、すなわちPoL濃縮物画分は、CAEからのPoLを事実上全て含有している。PoL濃縮物中のFA分布は、40.4％のNL、28.0％のPL、31.6％のGLを含有している。DME試料全体では、総脂質は62.4重量％であり、これは19.3重量％のNL、18.9重量％のPL、および24.3重量％のGLから構成される。
（表１７Ａ）S14 CAE、HP/HT SCCO2抽出物およびDME抽出物の脂肪酸組成
Figure 2016504999
（表１７Ｂ）S14 CAE、HP/HT SCCO2抽出物およびDME抽出物の極性脂質および植物栄養素組成
Figure 2016504999
（表１７Ｃ）S14 CAE、HP/HT SCCO2抽出物およびDME抽出物の脂肪酸分布およびNL、PL、GL分布
Figure 2016504999
混合物中に、制御されたEPA濃度を作り出すには、NL画分のEPAをさらに濃縮しなければならない。図1に示すように、NL画分脂質はホモジナイズしなければならない。これは、グリセロール骨格と関連している脂肪酸を、その骨格から分離しなければならないことを意味する。EPAがグリセロール骨格とコンジュゲートしている間は、可能になるEPA脂肪酸の濃縮はごくわずかである。FAホモジナイゼーションのための適切な方法としては、エステル交換によるメチルエステルもしくはエチルエステルの形成、または加水分解によるFFAの作出が挙げられる。好ましい方法は加水分解によるFFAの作出である。エステル交換によるメチルエステルまたはエチルエステルの形成には、追加のプロセス工程とエステル交換中のメタノールまたはエタノールの消費が必要になる。加水分解は、鹸化および酸性化によって達成するか、直接加圧蒸気加水分解によって達成することができる。脂肪酸がグリセロール骨格への共有結合から解放されると、それらを、その分子量と不飽和度（すなわち二重結合の数）の組合せに従って再編成することが可能になる。EPAの濃縮には多くの方法を使用することができる。例えば尿素結晶化を使って飽和FAおよび一価不飽和FAの大部分を混合物から除去することができる。さらにまた、脂肪酸混合物を溶剤に溶解し、硝酸銀または銀官能化シリカとの錯体を形成させることができる。これは、高度多価不飽和体を、混合物の残りの部分から除去するという正味の効果を有している。別の代替手段は、SCCO2による圧力プロファイリングを使って、低分子量の構成要素（すなわちC12〜C18）を高分子量の構成成分（すなわちC20）から選択的に除去することである。
図4に、EPA FFAの濃縮物を作出するための、加水分解とSCCO2分画の組合せを示す。まずNL画分を加水分解してFFAを形成させる。これは、脂質化学者にはよく知られているさまざまな経路によって行うことができる。最も一般的な方法は、鹸化とそれに続く酸性化、および直接酸性化である。生成物収率の面から、鹸化は有用な経路である。なぜなら反応の第1工程で不可逆的に脂肪酸塩が形成されるからである。この場合は、過剰量の水の存在下で、中性脂質混合物をKOHまたはNaOHと合わせる。脂肪酸とグリセロール骨格との間のオキシル結合が破壊され、それぞれのK塩またはNa塩が形成される。この反応は、50℃〜90℃の範囲の温度条件において還流下で完了させる。TG構成成分とDG構成成分は、塩と遊離グリセロールとに転化される。遊離グリセロールは極性が高い。その塩溶液をリン酸、硫酸、または塩酸などの酸で処理する。これにより、塩の陽イオンが除去され、対応する遊離脂肪酸（FFA）が形成される。溶液は2つの相、すなわち有機相と水相に分配する。直接酸性化法では、反応の工程数は少ないものの、反応が可逆的である。したがってFFAの収率は、鹸化経路ほど大きくないだろう。酸性化では、中性脂質を水および強酸、例えば硫酸、塩酸、リン酸、またはギ酸と合わせる。化学量論を上回る（6倍程度の）水を中性脂質に加える。酸を加えてpHを約2に下げる。その混合物を60〜100℃の温度で還流下に加熱する。この反応は、単一工程ではあるが、可逆的である。平衡をFFAの方向に押しやるために過剰の水が必要である。
中性脂質が加水分解を受けてFFAが形成されたら、その混合物内のEPA画分をさらに濃縮することができる。先の加工工程で、トリグリセリドとジグリセリドは全てFFAに転化されている。これは高酸油と呼ばれ、主として遊離脂肪酸の形態にあるさまざまなFA化合物の混合物である。SCCO2によって、メチルエステルから、またひいてはエチルエステルから、オメガ-3を濃縮できることは、文献公知であるが（Nilsson, et.al.「Supercritical Fluid CO2 Fractionation of Fish Oil Esters」Advances in Seafood Biochemistry, 1992）、SCCO2がFFAの混合物を分画できることは、これまで知られていなかった。FFAは極性部分である。SCCO2溶解度における従来の考えは、これらの化合物はSCCO2には不溶であり、したがってSCCO2の調整可能な溶解特徴を適用することはできないだろうというものであった。驚いたことに、本発明者らは、SCCO2が、FFAを分子量によって分画する能力を有することを見いだした。どの特定理論にも束縛されることは望まないが、8〜20炭素分子長の長いカルボン酸鎖の無極性効果は、カルボニル基の極性特徴を圧倒する。したがって、等温条件の存在下で、SCCO2圧を約100バールから増加させることにより、高分子量カルボン酸の溶解度が次第に増加する。100バールを上回る圧力と40Cの低圧SCCO2を使って、低分子量の遊離脂肪酸を高分子量の遊離脂肪酸から除去することができる。これにより、C8、C10、C12、C14、C18構成成分を低減または排除しつつ、EPAおよびARAを含むC20構成要素を濃縮することが可能になる。これにより、EPA濃度を少なくとも2倍にすることが可能になる。濃縮後は、これがEPA濃縮FFAストリーム（濃EPA）であり、EPA標準化製剤を作出するための混合物中の第3構成成分である。
驚いたことに、本発明者らは、高濃度FFA供給原料を圧力勾配SCCO2によって分画できることを見いだした。一例として、供給原料を、加水分解抽出法によって、S14バイオマスから得た。バイオマスを硫酸で処理し、70℃に加熱した。次に、バイオマスの混合物をヘキサン類で抽出した。ヘキサン類をエバポレートした後、部分加水分解藻類油を回収した。この混合物はFFAが約44.7％であり、TFAは80.03重量％であった。供給原料の組成を表18に示す。60℃等温条件下、この油を、第1画分（F1）用の2500psi（172バール）から出発して、以後の各画分では100psi（6.9バール）ずつ増加させる圧力プロファイル（すなわち、第2画分（F2）用は2600psi（179バール）、第3画分（F3）用は2700psi（186バール）など）で抽出した。最終圧力は画分F12用の圧力で、5000psi（345バール）とした。これにより、供給原材料が完全に抽出された。
各画分のFFAレベルと供給物に対するパーセンテージとを表19に示す。FFAレベルは図12のグラフに示す。これらの表と図はどちらも画分F1〜F6の高いFFAレベルを示している。画分F7〜F12には、加水分解されていないトリグリセリドが存在している。表20は、画分F1〜F7のFA組成と、これらの画分のそれぞれに回収された供給原料質量のパーセンテージを示している。驚いたことに、低分子量の化合物は画分F1〜F3に濃縮された。高分子量の化合物は画分F4〜F6に濃縮された。F7は、FFA測定結果がF6の68.5％に対して23.1％であることから、EPA FFAと低分子量TGとの組合せである。F7にはかなりのEPAが含まれているので、低MW TGの存在にも関わらず、これを高MW画分に含める。総合すると、このデータは、FFA供給原料をF3と類似するプロセス条件で抽出すれば、その結果得られる抽出物は低分子量FAが濃縮されており、高分子量FAは残渣になるであろうということを含意している。これは向流カラム抽出器で達成することができる。抽出物は低分子量化合物の濃縮物である。ラフィネート（カラム残留物）はEPAを含む高分子量化合物の濃縮物である。各分子量クラスにおける回収された質量の比に基づいて、表21に示すように、分子量範囲別に有効質量分率を画定することができる。この表は加水分解供給原料中のEPAの85重量％をEPA濃縮画分（ラフィネート）に回収できることを示している。図13は、いくつかの特徴的分子量構成要素の分布と各画分に関連するFFAレベルとを示している。
（表１８）加水分解S14藻類油供給原料の脂肪酸分布
Figure 2016504999
（表１９）高濃度FFA S14油供給原料の圧力勾配画分のFFAおよび質量分率
Figure 2016504999
（表２０）
Figure 2016504999
Figure 2016504999
（表２１）EPA濃縮係数を含む、主要脂肪酸構成要素の質量分率
Figure 2016504999
EPA濃縮の典型例を表22に示す。S12藻類から得た供給原料をまずSCCO2で分画して、NLを他のCAO構成成分から取り出した。次にこの混合物を加水分解して遊離脂肪酸を形成させた。供給混合物はFFAが85％を上回っていた。供給物では、EPAが脂肪酸の46％および混合物の28.7重量％を占める。この混合物を、前述の方法を使って、SCC02で濃縮した。濃縮EPA混合物では、EPAが脂肪酸の65.1％であり、混合物の48.1重量％である。FFA供給原料にもEPA濃縮物にも極性脂質は全くなかった。総オメガ-3に対するEPAの比は、供給原材料でもEPA濃縮物でも99％より高く、これはS12藻類に典型的な値である。
この高濃度EPA画分を使って、標準化製剤における不変のEPAレベルを維持する。このFFAはFFAの形態にあるので、より迅速な生体吸収（bioabsorbance）を助長する。総オメガ-3に対するEPAの比はこの例では99％より高い。これを使用して、標準化製剤における総オメガ-3に対するEPAの高い分率を維持する。この配合物については、総EPAに対するEPAの比が常に94％より高く、より典型的には95％、96％、97％、または98％である。
（表２２）S12由来のFFAおよび濃縮EPA混合物の組成
Figure 2016504999
3つの構成要素を配合して、EPAと極性脂質との標準化複合物を形成させる。すなわち、CAO、濃PoLおよび濃EPAを使って、配合物中のEPA含量と極性脂質含量がどちらも制御された標準化製品を作出する。名目上、EPAは25重量％であり、総極性脂質は15重量％より高く、5重量％超がPLであり、10重量％超がGLである。
表23および表24は、極性脂質およびEPAの典型的標準化製剤の、それぞれ脂肪酸プロファイルおよび極性脂質プロファイルを示している。この例では、混合物中にCAOは使用されていない。標準化製剤への極性脂質の寄与は濃PoL画分からくる。PoL画分はリン脂質および糖脂質から構成される。PoLでは、TFA（総脂肪酸）が25〜45重量％の範囲で変動する可能性があり、典型的な実測値は約35重量％である。この脂肪酸において、EPAは5重量％という低値から25重量％という高値まで変動しうる。典型的な値は約10重量％（実測値）である。この特定の測定では、EPAが脂肪酸分布の約29重量％であった。
PLとGLの比は変動しうる。本発明者らは、TG/DG/MGおよびFFAを完全に除去したPL/GL画分を精製した。したがってこの画分は中性脂質を全く含まない。極性脂質分布の一例では、PLが約20重量％であり、GLが約35重量％であった。したがってPLとGLはそれぞれ極性脂質の37重量％および63重量％であった。脂肪酸はPLとGLとにそれぞれ39.5％および60.5％として分布していた。脂質クラス間での脂肪酸の分布が、2つの脂質クラスの比にほぼ等しいことから、おそらくEPAは重量では均等に分布しているのであろう。したがって典型的なEPA分布はPLで39.5重量％およびGLで60.5％であった。PLとGLの間のEPA分布の妥当な比は3:1〜1:3であるだろう。したがって、一方の極値において、EPAはPLで64％およびGLで36％でありうる。他方の極値では、EPAはPLで16％、GLで83.6％でありうる。おそらくEPAはPLよりGLに偏向しているだろう。しかし、代謝履歴および環境履歴に応じて、藻類はどちらの分布でも、それを生産するであろう。
EPAレベルは、濃EPAからのEPA-FFAを使って調節することができる。総オメガ-3に対するEPAの比は99％より高いことに留意されたい。EPAは混合物の25％超を構成する。典型的な値は約25％であるが、EPA濃縮物をさらに精製すれば、この値は約50％にもなりうる。標準化製剤に特有の値は、30％、35％、40％、45％、および50％である。C16:0およびC16:1は、合わせて、混合物の11％に相当する。典型的な範囲は2〜15重量％である。いずれにせよ、C16脂肪酸は全部で2重量％超かつ20重量％未満の量で混合物中に存在するであろう。それより低分子量の化合物、例えばC10:0、C12:0、C14:0は、混合物中では比較的微量の構成要素である。これらの構成要素は全て検出可能でありうる。C14:0脂肪酸は、標準化化合物の0.2重量％超かつ5重量％未満で存在する。C18化合物は標準化混合物の微量構成要素であり、典型的には組成物の5％未満である。本組成物は検出可能な量のC18:0、C18:1ω9、C18:1ω7、C18:2ω6、C18:3ω3を含有し、このリスト中の化合物は、C18:0を除いて全て、0.2重量％超かつ3重量％未満の質量分率で標準化混合物中に存在する。
（表２３）S12 PoLおよびEPA濃縮物に由来する標準化混合物の脂肪酸組成
Figure 2016504999
（表２４）S12 PoLおよびEPA濃縮物に由来する標準化混合物の極性脂質および植物栄養素プロファイル
Figure 2016504999
表24に極性脂質および植物栄養素の組成を示す。PLおよびGLはPoL濃縮物に関連している。EPA濃縮物にはPLとGLは全く存在しない。EPA濃縮物の方がフィトステロールの濃度は高い。カロテノイドはSCCO2への溶解性が高いので、これはSCCO2分画した材料の特徴である。標準化混合物は、全部で10.6重量％の総PLと19.7重量％の総GLとを含有する。
これらは典型値である。PL構成成分は常にPCとPGを含有している。混合物中に存在しうる他のPLは、2-LPC、PI、およびPEである。PCおよびPGは、典型的には、PL構成成分の、それぞれ30重量％および15重量％より多い。PLに対するGLの比は0.75〜4.0の範囲で変動する可能性があり、典型的な値は1.5〜2.5の範囲にある。GLは常にDGDGとMGDGを含有する。典型的にはDGDGはGLの50重量％超であり、より典型的な値は50重量％、55重量％、60重量％、65重量％、70重量％、75重量％、または80重量％である。標準化混合物は少なくとも0.1重量％のフィトステロールを含有し、典型的な範囲は0.25重量％〜0.75重量％である。クロロフィルの方が多量に存在する。11.1重量％という値が典型的である。クロロフィルレベルは標準化化合物の1重量％以上であり、より典型的には、混合物の5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、または15重量％である。さらにまた、クロロフィルは最も一般的には8〜12重量％の範囲になるであろう。配合物中のマンニトールの量は0.1重量％〜3.0重量％である。典型的な値は2重量％前後、より典型的には0.5重量％、1.0重量％、1.5重量％、または2.0重量％である。
標準化混合物の典型的一態様の構成成分を図14に示す。この製剤は、PL、GL、TGおよびDGとしてのNL、ならびにFFAとしてのNLを含む。EPAはこれらの脂質クラスの全てに分布している。この混合物は、クロロフィル、マンニトール、フィトステロール、およびカロテノイドを含む植物栄養素の微量構成要素を含有する。異なる脂質クラス間での脂肪酸の分布を図15に示すが、FFAとして53重量％、中性TGおよびDGとして9重量％、PLとして16重量％、およびGLとして22重量％である。FFA画分は低くて30重量％、高くて60重量％でありうるが、より典型的な値は40重量％、45重量％、50重量％、および55重量％である。TG/DG画分としてのNLタイプは、低くて1重量％、高くて14％でありうる。典型的な値は5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、および10重量％である。PLは5％〜30％の範囲で変動する可能性があり、典型的な値は12重量％、14重量％、16重量％、18重量％、および20重量％である。GLは10重量％〜40重量％の範囲で変動する可能性があり、典型的な値は16重量％、18重量％、20重量％、22重量％、24重量％、および26重量％である。
実施例2:能率化された加工方法
この実施例では、藻類バイオマスの脂肪酸プロファイルにおけるEPA分率を35重量％超まで高めるナンノクロロプシスバイオマスの培養における改良を利用する、本EPA製剤を生産するための能率化された方法を要約する。この計画では極性脂質と中性脂質がどちらも強化されたEPA含量を有する。この方法の概略を図6に図示する。一般に、このプロセスでは、CAOを中性脂質画分と極性脂質画分に分けるためにCAOをSCCO2抽出に供す工程が、排除される。その代わりに、CAOの第1の部分が加水分解と遊離脂肪酸分画を受け、CAOの第2の部分は、最終配合EPA製剤にそのまま含まれる。一般に、CAOの第1の部分と第2の部分とはほぼ等しいか、約3:1〜約1:3の範囲の体積比を有する。
実施例1で述べたように、有機溶剤は、ケトン類およびアルコール類ならびにそれらの混合物から構成され、湿藻類バイオマスからCAEを作出するために使用される。この湿バイオマスの固形分含量は17重量％を上回る。
溶剤からの回収後に、結果として得られたCAEをメタノールに可溶化してから、液液分配系に加えることができる。典型的な溶剤の組合せは、体積比が1:1:1:1のヘプタン（Hep）、酢酸エチル（EtAc）、メタノール（MeOH）、および水（H2O）であるだろう。この混合物を撹拌し、沈降させる。材料は、HepおよびEtAcを主体とする上側の有機層と、MeOHおよびH2Oから構成される下側の水層とに分かれる。中性脂質および極性脂質、ステロール、およびコレステロールは、有機層に対してはるかに高い分配係数を有し、主として有機層にとどまる。マンニトールを含む水溶性糖質、水溶性タンパク質、およびグリセロールは、主として水層内の溶液に移行する。
さまざまな態様において、液液分配には、Hep、EtAc、MeOH、またはH2O構成要素のいずれか一つの代わりに、環境にやさしい代替有機溶剤を使用することができる。環境にやさしい溶剤の具体例としては、水、アセトン、エタノール、2-プロパノール、1-プロパノール、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、メタノール、メチルエチルケトン（MEK）、1-ブタノール、およびt-ブタノールが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。液液分配に有用な他の溶剤としては、液体のシクロヘキサン、ヘプタン、トルエン、メチルシクロヘキサン(methylcylcohexane）、メチルt-ブチルエーテル、イソオクタン、アセトニトリル、2-メチルテトラヒドロフラン、テトラヒドロフラン（THF）、キシレン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、酢酸、およびエチレングリコールが挙げられる。
液体分配の典型的な一例として、11.9gのCAEを33mLのMeOHに溶解した。次に、この溶液を、125mLのEtAcと125mLのHepとの混合物に加えた。この組合せを分液漏斗でよく混合した。125mLのH2Oをこの混合物に加え、さらに撹拌した。系を静置して上側の有機層と下側の水層の二相に分離させた。
供給材料の組成は典型的CAEであった:
水分:1.40重量％
FFA＝5重量％
総脂肪酸（TFA）:36.4重量％
混合物中のEPA:14.6重量％
脂肪酸(FA）中のEPA:40.8％
総PL:9.1重量％
総GL:14.9重量％
総極性脂質（PoL）:24.0重量％
コレステロール/フィトステロール:1.0重量％
クロロフィル:11.8重量％
マンニトール:7.3重量％
グリセロール:0.4重量％
溶剤の回収後に、有機相は回収されたCAOを含有していた。これは供給材料の66.2重量％であった。これは以下の無溶剤構成成分を含んでいた:
水分:1.76重量％未満
FFA＝21.6重量％
TFA:51.6重量％
EPA:18.5重量％
FA中のEPA:35.9％
総PL:14.3重量％
総GL:21.9重量％
総PoL:36.2重量％
フィトステロール:5.4重量％
クロロフィル:5.4重量％
マンニトール:0.0重量％
グリセロール:0.0重量％
有機層中のEPAの回収率は95.9重量％であった。このCAO中のEPA含量は15重量％より高く、総PoLは25重量％より高い。供給材料はEPA含量が高いので、このCAOは、これ以上加工しなくても、標準化EPA配合物を形成させるための濃縮PoLとして役立ちうる。
溶剤（水を含む）のエバポレーション後に、水層（供給物の41.3％）は以下の構成成分を含んでいた:
水分:1.03重量％超
FFA＝32.0重量％
TFA:3.14重量％
EPA:1.27重量％
FA中のEPA:40.6％
総PL:2.3重量％
総GL:2.0重量％
総PoL:4.3重量％
フィトステロール:0.02重量％
クロロフィル:0.3重量％
マンニトール:5.8重量％
グリセロール:2.2重量％
水層へは4.1％のEPAの損失があった。
このCAOの場合、本発明者らには、CAOを（図6に示すように）直接加水分解するか、またはCAEの一部分を加水分解するという選択肢がある。どちらの場合も、加水分解された脂質クラスは、FFAに転化される。次に、このFFAを圧力プロファイル分画して、高濃度EPA画分を優先的に取り出す。これが濃縮EPA FFA（またはEPA-FFA）である。CAOの組成とEPA-FFAの組成はどちらもわかるので、標準化EPA製剤を作出するために、質量比を決定することができる。
実施例3:ラット組織における脂質および代謝産物の分布
このラット研究の目的は、オキアミ油またはEicoOilを補足した7日間の給餌トライアル後に、血漿、脳、肝臓、後腹膜脂肪、および性腺脂肪組織を含むラット臓器における脂質および代謝産物の消化性および分布を調べることであった。この研究では、2群のSprague Dawley雄および雌ラットを、オキアミ油およびEicoOilを使った経管栄養に付した。オキアミ油は、Neptune BioTech Ltd（カナダ）のNeptune Krill Oil（NKO）を含有するNOW Food Supplements Krill Oilであり、これは総オメガ-3が23重量％で、EPAは13重量％、DHAは7.5重量％、リン脂質は39重量％であった。EicoOilは、ナンノクロロプシス・オクラタ抽出物由来の極性およびEPA製剤であり、さまざまな脂質クラスの約25重量％EPAである総オメガ-3と、約2:1の比の糖脂質（約10重量％）およびリン脂質（約5重量％）の組合せから構成される約15重量％の極性脂質とを含んでいる。EicoOilではDHAは0重量％である。
この研究では、ラットの数を雄と雌とで同じにした。典型的な体重は研究開始時点で200〜250gの範囲にあった。個々の動物の最小体重と最大体重は、群平均体重の±20％の範囲内にあった。給餌トライアルの前にラットを5日間順化させた。動物には市販の齧歯類用飼料（Teklad Certified Global 18％ Protein Diet（カタログ番号:2018SC）、米国ウィスコンシン州マディソン）（18.6％の粗タンパク質、6.2％の粗脂肪、44.2％の糖質、3.5％の粗繊維、14.7％の中性デタージェント繊維、および5.3％の灰分を含有する飼料）を自由に摂取させた。この市販の齧歯類飼料は0.9重量％の飽和脂肪酸、1.3重量％の一価不飽和脂肪酸、および3.4重量％の多価不飽和脂肪酸を含有していた。主な脂肪酸構成要素は0.7重量％のパルミチン酸（C16:0）、0.2重量％のステアリン酸（C18:0）、1.2重量％のオレイン酸（C18:1ω9）、3.1重量％のリノール酸（C18:2ω6）、および0.3重量％のα-リノレン酸（C18:3ω3）であった。動物には市営上水道から得た酸性化飲料水（pH2.5〜3.5）を自由に飲ませた。20〜24℃の温度範囲および30〜70％の相対湿度に温度と湿度が調節された環境において、12時間明/12時間暗の周期で、動物を飼育した。
動物に体重1kgあたり5mLの油を与えた。オキアミ油中の総EPA＋DHA濃度は230mg/gである。EicoOil中の総EPA＋DHAは250mg/gである。各ラットに7日間で与えられた油の総量は35mL/kg体重である。オキアミ油（密度0.9g/mL）の場合、これは31.5gの油および7.245gの総EPA＋DHAであった（どちらも体重1kgあたりの値）。EicoOil（密度0.836g/mL）の場合、これは29.3gの油および7.315gの総EPA＋DHAであった（どちらも体重1kgあたりの値）。オキアミ油とEicoOilのどちらについても、37℃のオリーブ油で1:1に希釈して投薬した。
動物を、それぞれが雌ラット5匹と雄ラット5匹とを含む2つの群（AおよびB）に分割した。オメガ-3補足飼料を給餌する前に、両群を5日間順化させた。A群には研究の0日目から6日目までオキアミ油を経管栄養した。B群には研究の0日目から6日目までEicoOilを経管栄養した。いずれの場合も、経管栄養は朝の時間帯（午前8:00〜10:00）に行った。7日目に、動物を屠殺し、心臓穿刺によって採血した。脳、肝臓、性腺脂肪組織、および後腹膜脂肪組織も集めた。血液をEDTA入りチューブに入れ、4℃、5000RPMで15分間遠心分離した。上層（血漿）をピペットで分離し、試料収集チューブに入れた。血漿と臓器を、分析時まで80℃で保存した。血漿および臓器をフォルチ抽出で加工して脂質を回収し、AOAC公定法963.22による脂肪酸メチルエステル（FAME）分析のために、メチルエステルに転化した。結果を臓器重量ベースで組織100mgあたりの脂肪酸のμg数として表した。
分析の結果を、血漿、脳、肝臓、性腺脂肪組織、および後腹膜脂肪組織における脂肪酸濃度について、それぞれ表25〜29に示し、図17に図示する。オキアミ油群の雌ラットが一匹、給餌トライアルの終了前に試験とは無関係な原因で死亡した。結果は、EPAとドコサペンタエン酸（DPA）（C22:5ω3）の和として与えられ、これをEPA*という。DPAは、EPAからインビボで直接合成される。総オメガ-3は臓器内のEPA*＋DHAの含量に着目している。雄ラットに関する結果と雌ラットに関する結果を合わせた。データはMediStat Ltd.（イスラエル）によりSAS（登録商標）バージョン9.1（SAS Institute、米国ノースカロライナ州カリー）を使って解析された。オキアミ油とEicoOilの間の全ての変量の相違の統計的有意性を検定するために、二標本T検定とノンパラメトリック・ウィルコクソン・マン・ホイットニーの順位和検定を適用した。検定は全て両側検定とし、0.05以下のp値を統計的に有意とみなした。
結果は、EicoOilおよびNOW NKOオキアミ油からのEPAとDHAの更新（update）に統計的有意差がないことを示している。EicoOilは、ラットの組織への吸収係数が、オキアミ油と類似している。最も重要なことに、EicoOil中の極性脂質、すなわちリン脂質と糖脂質の組合せは、腸障壁を横切って血漿中に脂肪酸を輸送し、次に、検査したさまざまな組織に脂肪酸を沈着させる上で、オキアミ油中のリン脂質と同じように作用する。そのうえ、EicoOil中の極性脂質の量がEicoOilの15％であったのに対し、オキアミ油の場合は39％であるから、糖脂質とリン脂質の組合せは、オキアミにおけるリン脂質のみの場合と比較して、より少量の複合極性脂質で、ラット臓器におけるオメガ-3取り込みを強化することを可能にするようである。
（表２５）血漿におけるEPA*およびDHAの分布
Figure 2016504999
（表２６）脳におけるEPA*およびDHAの分布
Figure 2016504999
（表２７）肝臓におけるEPA*およびDHAの分布
Figure 2016504999
（表２８）性腺脂肪組織におけるEPA*およびDHAの分布
Figure 2016504999
（表２９）後腹膜脂肪組織におけるEPA*およびDHAの分布
Figure 2016504999
実施例4:ヒト被験者バイオアベイラビリティ研究
このヒトパイロットトライアルは、健常男性ボランティアにおけるオメガ3脂肪酸のバイオアベイラビリティと処分を評価するための、藻類供給源およびオキアミ供給源に由来する2つの異なるオメガ-3脂肪酸製品のオープンラベル単回投与2剤2期クロスオーバー研究であった。この研究の目的は、藻類から得られるオメガ-3製剤（EicoOil）の単回投与後の薬物動態シグナルを、血漿脂質中のEPAおよびDHAの濃度に関して、最初の10時間にわたって、オキアミ供給源に基づくオメガ-3製剤（Krill）の単回投与と比較して評価することであった。EicoOilは、大半がEPAの形態にあってさまざまな脂質クラスである約25重量％の総オメガ-3と、約2:1の比の糖脂質（約10重量％）およびリン脂質（約5重量％）の組合せから構成される約15重量％の極性脂質とを有する、ナンノクロロプシス・オクラタ抽出物から得られる極性およびEPA製剤である。EicoOilではDHAは0重量％である。オキアミ油は、Neptune Technologies and Bioresources Inc.（カナダ）のNeptune Krill Oil（NKO）を含有するNOW Food Supplements Krill Oilであり、これは総オメガ-3が23重量％で、EPAは13重量％、DHAは7.5重量％、リン脂質は39重量％であった。
10人の健常非喫煙男性ボランティアを研究のためにリクルートした。各ボランティアは、表30および表31による一連の組み入れ基準および除外基準に基づいて、研究責任医師によって選別された。試験期間の前に、患者を病歴、併用薬、理学的検査、身長/体重/ボディマス指数、バイタルサイン、ECG、臨床検査室分析について評価した。臨床検査室分析は、試験期間に先立って、表32に列挙する試験について施行した。ボランティアは、一般用医薬品（OTC医薬品）または植物薬を服用していないことが要求された。さらにまた、オメガ-3脂肪酸レベルに影響を及ぼすか炎症を抑制することが知られている投薬も、ウォッシュアウト期間中または投与期間中は許可されなかった。試験期間の開始に先立って、ボランティア全員に、各投与日前のウォッシュアウト期間中は脂肪分の多い魚の摂取を避けることを含む食事指導が施された。
（表３０）組み入れ基準
Figure 2016504999
（表３１）除外基準
Figure 2016504999
（表３２）臨床検査室分析
Figure 2016504999
研究中は常に、有害事象（AE）（これは、製品またはデバイスを投与された患者または臨床試験被験者における好ましくない医療上のできごとであって、この処置との因果関係を有するとは限らない）について、ボランティアをモニタリングした。AEは、製品またはデバイスの使用と時間的に関連するあらゆる好ましくないまたは意図しない徴候（異常な臨床検査所見を含む）、症状、または疾患であることができ、当該製品またはデバイスと関係する否かは問わない。AEはこのパイロット研究中は起こらなかった。
10人の健常男性被験者を、以下の2つの処置シーケンスの一方に無作為に割り当てた（1:1）:7日間のウォッシュアウト期間、KrillまたはEicoOilのどちらかを1回投与、7日間のウォッシュアウト期間、およびEicoOilまたはKrillの1回投与。16日間の研究期間の間に、各被験者にはKrillとEicoOilの両方を投与した。処置Aでも処置Bでも、用量は軟ゲルカプセル剤の形態で1.5gの総オメガ-3とした。被験者を処置に割り当てる際に考えられるバイアスは、処置シーケンスへの被験者のランダムな配置によって回避した。
各単回投与の前に、被験者は絶食状態で試験場所に到着した。併用薬、有害事象およびバイタルサインに関する評価の後、ジャムまたはマーマレード（糖質を与えるため）付きのトーストと、ミルクセーキ粉末、ダブルクリーム、油、および水から作った、脂肪とタンパク質を提供するためのミルクセーキとから構成される標準化高脂肪朝食時に、単回経口用量の治験製品が各被験者に与えられた。正味の組成を表33に記載する。
（表３３）高脂肪朝食の内容
Figure 2016504999
高脂肪朝食の一部として、各被験者に1.5のオメガ-3脂肪酸が投与された。カプセル剤は200mLの水と共に嚥下された。製品が飲み込まれたことを保証するために、口内チェックを行った。被験者が水または茶を飲むことは許可したが、最後の血液試料を収集するまでは、他の液体を飲むことを許可しなかった。朝食の6時間後に標準化低脂肪軽食を与えた。
各投薬日に、薬物動態（PK）分析のために、各ボランティアから各7.5mLの血液試料を12本採取した。血液試料は、投薬前および投薬の0.5時間後、1時間後、1.5時間後、2時間後、2.5時間後、3時間後、4時間後、5時間後、6時間後、8時間後、および10時間後に採取した。各血液試料をリチウムヘパリンチューブに収集した。試料を室温、1500gで、15分間遠心分離した。血漿をピペットで各0.5mL×4本に小分けし、-80℃で貯蔵した。分析検査室まではドライアイスに乗せて試料を輸送した。
分析検査室では、血漿試料をフォルチ抽出で加工して脂質を回収し、AOAC公定法963.22による脂肪酸メチルエステル（FAME）分析のために、メチルエステルに転化した。結果を表34に試料中の脂肪酸のμg数の変化として表した。投薬前試料を、他の全ての試料に対するベースラインとして使用した。結果をEPA*（EPAとDPAの和）として示す。ドコサペンタエン酸（DPA）（C22:5ω3）は、EPAからインビボで直接合成される。総オメガ-3はEPA*＋DHAの含量に着目している。時間の関数としてのオメガ-3の変化を、EPA*については図18に、総オメガ-3については図19に示す。データはMediStat Ltd.（イスラエル）によりSAS（登録商標）バージョン9.1（SAS Institute、米国ノースカロライナ州カリー）を使って解析された。オキアミ油とEicoOilの間の全ての変量の相違の統計的有意性を検定するために、独立した試料に、二標本T検定とノンパラメトリック・ウィルコクソン・マン・ホイットニーの順位和検定を適用した。検定は全て両側検定とし、0.05以下のp値を統計的に有意とみなした。
（表３４）脂肪酸のAUC（曲線下面積）（μg）の変化の要約統計量
Figure 2016504999
p値は、KrillとEicoOilの間の差の統計的優位性を示す。
結果は、EicoOilのオメガ-3バイオアベイラビリティが、NOW NKOオキアミ油に等しいか、さらにはそれより良好であることを示している。EicoOilの消化はNKOオキアミ油に等しいか、それより早い。同等量の藻類油で、NKOオキアミ油よりはるかに高レベルのEPAおよびEPA*が提供される。最も重要なことに、EicoOil中の極性脂質、すなわちリン脂質と糖脂質の組合せは、腸障壁を横切って血漿中に脂肪酸を輸送する上で、オキアミ油中のリン脂質と同じように作用する。そのうえ、極性脂質の量がEicoOilの約15％であったのに対し、オキアミ油の場合は約39％であるから、糖脂質とリン脂質の組合せは、オキアミにおけるリン脂質のみの場合と比較して、より少量の複合極性脂質で、ヒト男性血漿へのオメガ-3取り込みを強化することを可能にするようである。
本明細書に記載する実施例および態様は例示を目的とするにすぎず、当業者にはこれらを踏まえたさまざまな変更および改変が示唆され、それらは本願の精神および趣旨ならびに本願請求項の範囲に含まれることになると理解される。本明細書において言及する刊行物、特許、および特許出願は、全て、参照により、あらゆる目的において、そのまま本明細書に組み込まれる。

Claims (81)

  1. 約15重量％〜約90重量％のエイコサペンタエン酸（EPA）および約10重量％〜約70重量％の極性脂質を含むEPA組成物であって、5重量％未満のエステル化EPAを含み、ドコサヘキサエン酸（DHA）を含まない、ヒトによる摂取に適した、EPA組成物。
  2. EPAが、遊離脂肪酸、リン脂質コンジュゲート、糖脂質コンジュゲート、トリグリセリドコンジュゲート、およびジグリセリドコンジュゲートからなる群より選択される1つまたは複数の形態にある、請求項1記載の組成物。
  3. エステル化EPAを含まない、請求項1〜2のいずれか一項記載の組成物。
  4. 組成物中のEPAの約0重量％〜約10重量％がトリグリセリドコンジュゲートまたはジグリセリドコンジュゲートである、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
  5. 組成物中のEPAの約0.2重量％未満がトリグリセリドコンジュゲートまたはジグリセリドコンジュゲートである、請求項1〜4のいずれか一項記載の組成物。
  6. 組成物中のEPAの約15重量％〜約85重量％が遊離脂肪酸の形態にある、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物。
  7. 組成物中のEPAの約5重量％〜約90重量％が極性脂質コンジュゲートである、請求項1〜6のいずれか一項記載の組成物。
  8. 組成物中のEPAの約5重量％〜約50重量％が糖脂質コンジュゲートである、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。
  9. 組成物中のEPAの約3重量％〜約50重量％がリン脂質コンジュゲートである、請求項1〜8のいずれか一項記載の組成物。
  10. 脂質クラス別に以下のEPAの分布を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の組成物:
    EPAの約3重量％〜約50重量％はリン脂質コンジュゲートであり;
    EPAの約5重量％〜約50重量％は糖脂質コンジュゲートであり;
    EPAの約0重量％〜約10重量％はトリグリセリドコンジュゲートまたはジグリセリドコンジュゲートであり;かつ
    EPAの約15重量％〜約85重量％は遊離脂肪酸の形態にある。
  11. ヒトによる摂取に適した、脂質クラス別に以下のEPAの分布を含むEPA組成物:
    EPAの約3重量％〜約50重量％はリン脂質コンジュゲートであり;
    EPAの約5重量％〜約50重量％は糖脂質コンジュゲートであり;
    EPAの約0重量％〜約10重量％はトリグリセリドコンジュゲートまたはジグリセリドコンジュゲートであり;かつ
    EPAの約15重量％〜約85重量％は遊離脂肪酸の形態である。
  12. 総オメガ-3脂肪酸に対するEPAの比が90％より大きい、請求項1〜11のいずれか一項記載の組成物。
  13. 約15重量％〜約75重量％のEPAを含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の組成物。
  14. 約20重量％〜約50重量％のEPAを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の組成物。
  15. 約10重量％〜約35重量％の極性脂質を含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の組成物。
  16. 少なくとも約13重量％の極性脂質、0.2重量％未満のグリセリドコンジュゲート、および少なくとも約30重量％の遊離脂肪酸を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の組成物。
  17. 極性脂質が、約3:1〜約1:3の範囲の重量％比のリン脂質コンジュゲートと糖脂質コンジュゲートとから構成される、請求項1〜16のいずれか一項記載の組成物。
  18. 糖脂質コンジュゲートが、ジガラクトシルジアシルグリセロールおよびモノガラクトシルジアシルグリセロールのうちの1つまたは複数を含む、請求項17記載の組成物。
  19. リン脂質コンジュゲートが、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルグリセロールのうちの1つまたは複数を含む、請求項17〜18のいずれか一項記載の組成物。
  20. リン脂質コンジュゲートが、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールのうちの1つまたは複数を含む、請求項19記載の組成物。
  21. （i）0〜5重量％のC:18脂肪酸;
    （ii）0〜20重量％のC:16脂肪酸;
    （iii）0〜5重量％のC:14脂肪酸;
    （iv）0〜0.5重量％のC:12脂肪酸;および/または
    （v）0〜0.5重量％のC:10脂肪酸
    を含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の組成物。
  22. クロロフィルaを含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の組成物。
  23. 約10.0重量％未満のアラキドン酸を含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の組成物。
  24. 無傷細胞、細胞構成要素、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドを実質的に含まない、請求項1〜23のいずれか一項記載の組成物。
  25. 補酵素Q9（CoQ9）および/または補酵素Q10（CoQ10）を含む、請求項1〜24のいずれか一項記載の組成物。
  26. 約1重量％未満のフィトステロールを含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の組成物。
  27. 約2重量％未満のカロテノイドを含む、請求項1〜26のいずれか一項記載の組成物。
  28. オクタデカテトラエン酸、すなわちステアリドン酸（SDA＝C18:4ω3）、エイコサトリエン酸（ETE＝C20:3ω3）、エイコサテトラエン酸（ETA＝C20:4ω3）、ヘンエイコサペンタエン酸、すなわちウンコサペンタエン酸（HPA＝C21:5ω3）、およびドコサペンタエン酸（DPA＝C22:5ω3）からなる群より選択される脂肪酸を含まない、請求項1〜27のいずれか一項記載の組成物。
  29. アスタキサンチン、cis-ルテイン、trans-ルテイン、cis-ゼアキサンチン、trans-α-クリプトキサンチン、trans-α-カロテン、cis-α-カロテン、cis-リコペン、およびtrans-リコペンからなる群より選択される1つまたは複数のカロテノイドを含まない、請求項1〜28のいずれか一項記載の組成物。
  30. クロロフィルcを含まない、請求項1〜29のいずれか一項記載の組成物。
  31. N-アシル-ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、およびホスファチジルエタノールアミンからなる群より選択される1つまたは複数のリン脂質を含まない、請求項1〜30のいずれか一項記載の組成物。
  32. スフィンゴ脂質を含まない、請求項1〜31のいずれか一項記載の組成物。
  33. 約20〜50重量％のEPA、約10〜25重量％の糖脂質、および約5〜25重量％のリン脂質を含む、請求項1〜32のいずれか一項記載の組成物。
  34. Figure 2016504999
    を含む、請求項1〜33のいずれか一項記載の組成物。
  35. Figure 2016504999
    Figure 2016504999
    を含む、請求項1〜34のいずれか一項記載の組成物。
  36. オキアミ油と比較してターゲット組織へのバイオアベイラビリティが等しいかまたは増加しているEPAを含む、請求項1〜35のいずれか一項記載の組成物。
  37. 請求項1〜36のいずれか一項記載の組成物を含む、ヒトによる摂取に適したカプセル剤、錠剤、溶液剤、シロップ剤、または懸濁剤。
  38. 軟カプセル剤である、請求項37記載のカプセル剤。
  39. 請求項1〜35のいずれか一項記載の組成物を含む、食品、飲料、エネルギーバー、または栄養補助食品。
  40. 精神障害、心血管疾患、肝疾患、慢性肝炎、脂肪症、肝線維症、アルコール依存症、栄養失調、慢性的な非経口栄養、リン脂質欠乏、脂質過酸化、細胞再生の律動異常、細胞膜の不安定化、閉経期または閉経後の状態、がん、加齢、良性前立腺肥大、腎臓疾患、浮腫、皮膚疾患、胃腸疾患、妊娠中毒症、関節炎、骨粗鬆症、炎症性疾患、および神経変性疾患からなる群より選択される疾患状態を防止し、改善し、緩和し、その進行を遅延させ、かつ/または処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、請求項1〜35のいずれか一項記載のEPA組成物、請求項37記載のカプセル剤、錠剤、溶液剤、シロップ剤、もしくは懸濁剤、および/または請求項39記載の食品、飲料、エネルギーバー、もしくは栄養補助食品を投与する工程を含む、前記方法。
  41. 疾患状態が、うつ病、単極性うつ病、大うつ病、抑うつ気分および/または産後うつ病、双極性障害、不安、パニック障害および社会恐怖障害、気分障害、統合失調症、強迫性障害（OCD）、境界型人格障害、注意欠陥多動障害および関連障害、ならびに神経性食欲不振症からなる群より選択される精神障害である、請求項40記載の方法。
  42. 疾患状態が、高血圧症、冠動脈疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、高血圧、および末梢血管系疾患からなる群より選択される心血管疾患である、請求項40記載の方法。
  43. EPA組成物、カプセル剤、錠剤、溶液剤、シロップ剤、または懸濁剤、食品、飲料、エネルギーバーまたは栄養補助食品が、抗うつ薬、抗高血圧剤、コレステロール低下剤、アスタキサンチン、ビタミンE、リン脂質、補酵素Q9（CoQ9）、および/または補酵素Q10（CoQ10）と共投与される、請求項40〜42のいずれか一項記載の方法。
  44. （a）藻類ペーストを用意する工程;
    （b）藻類ペーストから有機溶剤で脂質を抽出することによって、中性脂質と極性脂質とを含む粗藻類抽出物（CAE）を該ペーストの水溶性構成要素から実質的に単離する工程;
    （c）残存する水溶性構成要素をCAEから実質的に除去することによって、粗藻類油（CAO）を得る工程;
    （d）CAOを超臨界CO2と接触させる工程であって、超臨界CO2が、中性脂質を選択的に抽出することによって、CAOを、遊離脂肪酸を含む中性脂質画分と、糖脂質およびリン脂質を含む極性脂質画分とに分ける、工程;
    （e）C20遊離脂肪酸を中性脂質画分から単離することによって、濃縮EPA遊離脂肪酸画分を得る工程;ならびに
    （f）工程（e）において生産された濃縮EPA遊離脂肪酸画分を工程（d）において生産された極性脂質画分と組み合わせる工程
    を含む、EPAを含む組成物を生産する方法。
  45. （a）藻類ペーストを用意する工程;
    （b）藻類ペーストから有機溶剤で脂質を抽出することによって、中性脂質と極性脂質とを含む粗藻類抽出物（CAE）を該ペーストの水溶性構成要素から単離する工程;
    （c）残存する水溶性構成要素をCAEから実質的に除去することによって、粗藻類油（CAO）を得る工程;
    （d）CAOの第1の部分を加水分解することによって、CAOの該部分において遊離脂肪酸を放出させる工程;
    （e）放出された遊離脂肪酸を鎖長に従って分画することによって、C20遊離脂肪酸を単離し、濃縮EPA遊離脂肪酸画分を得る工程;および
    （f）工程（e）において生産された濃縮EPA遊離脂肪酸画分と工程（c）において生産されたCAOの第2の部分とを組み合わせる工程
    を含む、EPAを含む組成物を生産する方法。
  46. 溶剤が、エーテル、ケトン、アルコール、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項44〜45のいずれか一項記載の方法。
  47. 溶剤が、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、ジメチルエーテル、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項44〜46のいずれか一項記載の方法。
  48. 溶剤が、無水エタノール、190プルーフ（95v/v％）エタノール（EtOH）、変性190プルーフエタノール、特別変性アルコール（SDA）、アセトンとエタノール、イソプロピルアルコール、アセトンとメタノール、メチルエチルケトン（MEK）とメタノール、MEKとエタノール、ジメチルエーテル、ジメチルエーテルとメタノール、ジメチルエーテルとエタノールからなる群より選択される、請求項44〜47のいずれか一項記載の方法。
  49. 溶剤が、ジメチルエーテルとエタノールの混合物である、請求項44〜48のいずれか一項記載の方法。
  50. 溶剤が、ヘプタン（Hep）、酢酸エチル（EtAc）、メタノール（MeOH）、および水（H2O）の混合物である、請求項44〜48のいずれか一項記載の方法。
  51. 溶剤が、プロパン、酢酸エチル（EtAc）、エタノール（EtOH）、および水（H2O）の混合物である、請求項44〜48のいずれか一項記載の方法。
  52. 溶剤が、ブタン、酢酸エチル（EtAc）、エタノール（EtOH）、および水（H2O）の混合物である、請求項44〜48のいずれか一項記載の方法。
  53. 超臨界CO2が、約100バール〜約1000バールの範囲の圧力、および約35℃〜約110℃の範囲の温度に維持される、請求項44〜52のいずれか一項記載の方法。
  54. 超臨界CO2が、約340バール〜約700バールの範囲の圧力、および約40℃〜約110℃の範囲の温度に維持される、請求項44〜53のいずれか一項記載の方法。
  55. 超臨界CO2が、約350バール〜約690バールの範囲の圧力、および60℃〜90℃の範囲の温度に維持される、請求項44〜54のいずれか一項記載の方法。
  56. 中性脂質画分が加水分解を受けることによって、遊離脂肪酸を放出する、請求項44〜55のいずれか一項記載の方法。
  57. 加水分解を達成するために、中性脂質画分が、熱、アルカリ、および/または酸に曝露される、請求項56記載の方法。
  58. 超臨界CO2の圧力勾配で中性脂質画分を分画することによって、C20遊離脂肪酸が中性脂質画分から単離される、請求項44〜57のいずれか一項記載の方法。
  59. 超臨界CO2の圧力勾配が約172バールから約345バールまでである、請求項58記載の方法。
  60. 超臨界CO2の圧力勾配が等温である、請求項58〜59のいずれか一項記載の方法。
  61. 超臨界CO2の圧力勾配が約50℃〜約70℃の一定温度に維持される、請求項58〜60のいずれか一項記載の方法。
  62. （a）藻類ペーストを用意する工程;
    （b）藻類ペーストを濃エタノールで抽出する工程であって、エタノールの濃度が、少なくとも約70体積％である、工程;
    （c）エタノールを藻類ペーストから実質的に除去することによって、中性脂質と極性脂質とを含む粗藻類抽出物（CAE）を得る工程;
    （d）C3-C7アルカン溶剤でCAEを抽出する工程;
    （e）アルカン溶剤を実質的に除去することによって、極性脂質と脂肪酸とに富む粗藻類油（CAO）を得る工程;
    （f）CAOの第1の部分において極性脂質を濃化する工程であって、
    （i）CAOの第1の部分を第1のシリカゲル吸着剤と接触させること;
    （ii）第1のシリカゲル吸着剤をC3-C7アルカンと接触させることによって中性脂質を溶出させること;および
    （iii）第1のシリカゲル吸着剤をC1-C4アルコールと接触させることによって極性脂質を溶出させること
    を含み、それによって濃縮極性脂質（CPL）を得る、工程;
    （g）CAOの第2の部分において遊離脂肪酸を濃化する工程であって、
    （i）CAOの第2の部分と工程（f）の（ii）において溶出させた中性脂質とを加水分解に供すこと;
    （ii）加水分解されたCAOを第2のシリカゲル吸着剤と接触させること;
    （iii）第2のシリカゲル吸着剤をC3-C7アルカンと接触させることによって遊離脂肪酸を溶出させること;および
    （iv）工程（g）の（iii）において溶出させた遊離脂肪酸からEPAを濃縮すること
    を含み、それによって濃縮EPAを得る、工程;ならびに
    （h）工程（f）の（iii）において得たCPLと工程（g）の（iv）において得た濃縮EPAとを組み合わせることによって、EPAと極性脂質とを含む組成物を生産する工程
    を含む、EPAと極性脂質とを含む組成物を生産する方法。
  63. 工程（b）において使用されるエタノールの濃度が96％未満である、請求項62記載の方法。
  64. 工程（d）においてCAEを酢酸エチルで抽出することをさらに含む、請求項62〜63のいずれか一項記載の方法。
  65. 工程（f）の（ii）の後に、第1のシリカゲル吸着剤をアセトンと接触させることによって極性脂質を溶出させることをさらに含む、請求項62〜64のいずれか一項記載の方法。
  66. EPAが、尿素結晶化によって遊離脂肪酸から濃縮される、請求項62〜65のいずれか一項記載の方法。
  67. EPAが、超臨界二酸化炭素分画によって遊離脂肪酸から濃縮される、請求項62〜65のいずれか一項記載の方法。
  68. EPAが超臨界CO2の圧力勾配を使って濃縮される、請求項67記載の方法。
  69. 超臨界CO2の圧力勾配が約172バールから約345バールまでである、請求項68記載の方法。
  70. 超臨界CO2の圧力勾配が等温である、請求項68〜69のいずれか一項記載の方法。
  71. 超臨界CO2の圧力勾配が約50℃〜約70℃の一定温度に維持される、請求項68〜70のいずれか一項記載の方法。
  72. エステル化工程を含まない、請求項44〜71のいずれか一項記載の方法。
  73. 藻類細胞が、機械的破砕、熱的前処理、アルカリ処理、および/または酸処理に供されない、請求項44〜72のいずれか一項記載の方法。
  74. 藻類細胞の細胞膜が破壊されない、請求項44〜73のいずれか一項記載の方法。
  75. 前記ペーストが湿ペーストである、請求項44〜74のいずれか一項記載の方法。
  76. 藻類細胞がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）細胞を含む、請求項44〜75のいずれか一項記載の方法。
  77. ナンノクロロプシス細胞が、N.オクラタ（N.oculata）、N.オセアニカ（N.oceanica）、およびそれらの混合物から選択される、請求項76記載の方法。
  78. 藻類細胞がナンノクロリス（Nannochloris）細胞をさらに含む、請求項76〜77のいずれか一項記載の方法。
  79. 前記ペーストが乾燥に供されていない、請求項44〜78のいずれか一項記載の方法。
  80. 前記ペーストが、熱乾燥、真空乾燥、周囲温度乾燥、および/または凍結乾燥に供されていない、請求項79記載の方法。
  81. 請求項44〜80のいずれか一項記載の方法によって生産されるEPA組成物。
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