JP2018168139A - ｎ−３系不飽和脂肪酸を含む中性脂肪値の低減または上昇抑制用の組成物、並びに該組成物の製造におけるｎ−３系不飽和脂肪酸の使用 - Google Patents

Abstract

【課題】中性脂肪値の低減または上昇抑制効果を効率よく得ることができる組成物を提供すること。【解決手段】中性脂肪値の低減または上昇抑制用の組成物の有効成分として、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を用い、有効成分の摂取のタイミングを、朝食時を必須として含み、朝食時を含む睡眠から覚醒後６時間以内を摂取用時間内とする。【選択図】なし

Description

本発明は、ｎ−３系不飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸及び／またはエイコサペンタエン酸を有効成分とする中性脂肪値の低減または上昇抑制用の組成物、並びに該組成物の製造におけるドコサヘキサエン酸及び／またはエイコサペンタエン酸の使用方法に関する。
更に、本発明は、睡眠から覚醒後６時間以内における初めての食事（朝食）にて摂取することにより、血中のｎ−３系不飽和脂肪酸（ＤＨＡ・ＥＰＡ）の濃度を高め、ヒトでは血中のｎ−６系不飽和脂肪酸の濃度を低くすることによりｎ−３／ｎ−６比を高めて中性脂肪を低下させることを可能とする魚油（ＤＨＡ・ＥＰＡ）の摂取方法およびそのための組成物に関する。

ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は、ｎ−３系（ω−３）脂肪酸に分類される高度不飽和脂肪酸であり、ニシン、サバ、イワシ、マグロ、カツオ、サンマ、ブリ等の魚から得られる魚油でのこれらの含有量が高いことが知られている。
ＤＨＡには、血小板凝集抑制作用、血中中性脂肪値低下作用、血中コレステロール値低下作用、脳機能向上効果等の種々の生理活性機能があることが報告されている。
ＥＰＡにも、血小板凝集抑制作用、血中中性脂肪値低下作用、血中コレステロール値低下作用等の種々の生理活性機能があることが報告されている。
ＤＨＡ及びＥＰＡは、中性脂肪値低下用のサプリメントや医薬品の有効成分として使用されている。
非特許文献１には、魚油に血漿中性脂肪値低減効果があることが開示されている。また、特許文献１には、魚油を含む脂肪代謝を制御する組成物が開示されている。
特許文献２には、ＤＨＡに血中中性脂肪値低下作用があることが開示されている。
非特許文献２は、エイコサペンタエン酸エチル（ＥＰＡ−Ｅ）の生体内動態に関する報告であり、ＥＰＡに血液中の中性脂肪を減らすはたらきがあることが開示されている。
一方、近年、生体リズムや概日リズムを評価する時間生物学が確立されるに至り、薬を服用するタイミングと効果の関係や、食事や栄養を摂取するタイミングと効果の関係についての検討がなされている。
非特許文献３には、食事摂取のタイミングが適切な体重維持やメタボリックシンドロームの発症予防に重要である点、ならびに、絶食することなくＤＨＡ／ＥＰＡを朝・夕に摂取させ糖・脂肪代謝に及ぼす影響や肥満抑制効果について検証している点について記載されている。
特許文献３には、ＤＨＡを食後２〜６時間であって次の食事前１時間までの食間に経口投与することで、食後の血糖値上昇を抑制できることが開示されている。

国際公開第２００９／０５０５８０号明細書 特開平８−１４０６３６号公報 国際公開第２０１２／０６３８２０号明細書

Biochimica et Biophysica Acta, 792 , (1984), 103-109 J. Lipid Nutr. Vol. 24, No. 1 (2015), 21-32 食品と開発、Ｖｏｌ．５１、Ｎｏ１、ＵＢＭメディア株式会社、２０１６年１月１日発行、第４頁〜６頁

本発明の目的は、ＤＨＡ及び／またはＥＰＡの有する中性脂肪値低減または上昇抑制効果を効率よく得ることができるＤＨＡ及び／またはＥＰＡを有効成分する中性脂肪値低減または上昇抑制用の組成物を提供することを目的とする。

本発明にかかる中性脂肪値の低減または上昇抑制用の組成物は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を有効成分として含み、朝食時を必須として含み、朝食時を含む睡眠から覚醒後６時間以内を摂取用時間範囲として摂取される、ことを特徴とする。
なお、本発明において、睡眠から覚醒後６時間以内に初めて摂取する食事を朝食と定義した。
本発明にかかる中性脂肪値の低減または上昇抑制用の組成物の製造における中性脂肪値の低減または上昇抑制用の有効成分の使用方法は、前記有効成分が、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含み、前記組成物が、朝食時を必須として含み、朝食時を含む睡眠から覚醒後６時間以内を摂取用時間範囲として摂取される、ことを特徴とする。
上記の有効成分として、魚油を用いることができる。
また、上記の組成物は、医薬製剤または機能性食品を含む食品の形態とすることができる。

本発明にかかる中性脂肪値低減または上昇抑制用の組成物によれば、有効成分としてのＤＨＡ及び／またはＥＰＡの摂取時期を、朝食時を含む睡眠から覚醒後６時間以内の摂取用時間内とすることによって、血糖値に影響を与えずに、中性脂肪値の低減または上昇抑制効果を効率よく得ることができる。

魚油含有飼料の時間制限給餌に関する実験プロトコールの簡単な説明図である。 明期１２時間、暗期１２時間の明暗サイクル下（時刻０：００点灯、時刻１２：００消灯）で２週間の魚油時間制限給餌の後、時刻２：００から６時間毎にマウスを殺処分して得た血液から血漿を分離し、血漿中のグルコース、遊離脂肪酸、中性脂肪と総コレステロールの濃度を測定したグラフである。 肝臓組織重量当たりの、遊離脂肪酸、中性脂肪と総コレステロールの含有量を示すグラフである。 脂肪酸合成関連遺伝子（Ｆａｓｎ、Ａｃｃ１、Ｓｃｄ１）の発現量の解析結果を示すグラフである。 ２週間の魚油時間制限給餌の後、時刻２：００から６時間毎にマウスを殺処分して得た血液から血漿を分離し、血漿中の脂肪酸濃度を測定したグラフである。 時刻１：００と時刻１３：００に魚油単回投与の後、投与０、６、１０、１４、１８時間後にマウスを殺処分して得た血液から血漿分離し、血漿中の脂肪酸量、ｎ−３系不飽和脂肪酸、ｎ−３／ｎ−６比を測定したグラフである。 実施例４における血漿中の脂肪酸量、ｎ−３系不飽和脂肪酸、ｎ−３／ｎ−６比を測定したグラフである。 実施例５における血中中性脂肪の推移を示すグラフである。 実施例５における血中ｎ−６系不飽和脂肪酸の推移を示すグラフである。 実施例５における血中ｎ−３系不飽和脂肪酸の推移を示すグラフである。 実施例５における血中ｎ−３／ｎ−６比の推移を示すグラフである。 実施例５における血中飽和脂肪酸の推移を示すグラフである。

ＤＨＡ及びＥＰＡには種々の生理活性機能があることが知られているが、本発明者らは、その中性脂肪値の低減または上昇抑制効果について着目し、かかる効果をより効率よく得ることができるこれらを有効成分として含む組成物の形態やその摂取または投与のタイミングについて鋭意検討を行った。
ＤＨＡ及びＥＰＡを含む魚油を用いて行ったマウスの実験において、一日ごとの生体リズムにおける睡眠からの覚醒時を含む一日の活動開始初期に魚油を摂取したマウスにおいて、１日を通しての血糖値、総コレステロール値及び血中遊離脂肪酸値には影響を与えずに、血中ＤＨＡ及びＥＰＡ濃度の増加と、中性脂肪値の低減効果が認められた。これらの効果は、一日の活動開始初期に魚油を摂取することで、よりＤＨＡ及びＥＰＡ等のｎ−３系不飽和脂肪酸の血中への取り込みが増加することにより認められると考えられた。
なお、本発明者らによる実験に用いたマウスは夜行性であり、通常、暗期１２時間の間に覚醒時を含む活動期が含まれ、明期に睡眠を採るという一日ごとの生体リズムを有する。
本発明者によりマウスでの実験による結果は、魚油の摂取のタイミングによって、魚油に含まれるＤＨＡ及びＥＰＡが中性脂肪値に対して特異的に作用していることを示しており、かかる知見は本発明らによる新規に見出されたものである。
さらに、ヒト臨床試験を行い、朝食に魚油を摂取することで血中のｎ−６系不飽和脂肪酸の濃度を低減させ、ｎ−３／ｎ−６比を高めて中性脂肪を低下させることを確認した。血中飽和脂肪酸濃度も低下していたことから、β酸化が亢進し中性脂肪の再合成を抑制した可能性も考えられた。
本発明は、上述した本発明者による新たな知見に基づいて完成されたものである。

本発明にかかる組成物は、有効成分としてＤＨＡ及び／またはＥＰＡを含む。
本発明は、ＤＨＡ及び／またはＥＰＡの、中性脂肪値の低減または上昇抑制用の組成物の製造における中性脂肪値の低減または上昇抑制用の有効成分としての使用方法に関する。
上記の組成物は、いずれも、朝食時を必須として含み、朝食時を含む睡眠から覚醒後６時間以内を摂取用時間範囲として摂取される。
更に、本発明は、処置を必要とする対象者の中性脂肪値を低減または中性脂肪値の上昇を抑制する方法であって、中性脂肪値の低減または上昇抑制用の有効成分を含む組成物が前記対象者により、朝食時を必須として含み、朝食時を含む睡眠から覚醒後６時間以内を摂取用時間範囲として摂取され、前記有効成分が、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含む、処置を必要とする対象者の中性脂肪値を低減または中性脂肪値の上昇を抑制する方法に関する。
更に、本発明は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の、処置を必要とする対象者における中性脂肪値の低減または上昇抑制のための使用であって、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が、朝食時を必須として含み、朝食時を含む睡眠から覚醒後６時間以内を摂取用時間範囲として前記対象者により摂取される、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の、処置を必要とする対象者における中性脂肪値の低減または上昇抑制のための使用に関する。
ＤＨＡ及びＥＰＡはこれらを単独で、あるいはこれらを組み合わせて有効成分として用いることができる。ＤＨＡ及びＥＰＡの両方を有効成分として用いる場合には、魚油が好適に利用可能である。
魚油としては、ＤＨＡ及びＥＰＡに関する種々の純度や組成のものが市販あるいは公知となっており、これらの魚油から本発明の目的効果が得られるものを選択して用いることができる。
市販の魚油としては、例えばマルハニチロ社製のＤＨＡ２２（脂肪酸組成としてＤＨＡ ２２％含有精製まぐろ油）、ＤＨＡ２２Ｋ（脂肪酸組成としてＤＨＡ ２２％含有精製まぐろ油、かつお油）、ＤＨＡ２７Ｗ（脂肪酸組成としてＤＨＡ ２７％含有精製まぐろ油・かつお油）、ＤＨＡ４６Ａ（脂肪酸組成としてＤＨＡ ４６％含有精製まぐろ油）、ＤＨＡ−ＲＳ（脂肪酸組成としてＤＨＡ ７０％含有精製まぐろ油・かつお油）等を挙げることができる。
魚油中のＤＨＡ及びＥＰＡの含有量は、一般に、ＤＨＡが５〜７０質量％、ＥＰＡが０．１〜４５質量％であり、ＤＨＡとＥＰＡの質量比は、７００：１〜１：９であり、これらの範囲のＤＨＡ及びＥＰＡ含有量を有する魚油を本発明にかかる組成物の有効成分として利用可能である。

本発明にかかる組成物における、ＤＨＡ及び／またはＥＰＡの含有量は、目的とする中性脂肪値の低減または上昇抑制効果を得ることができれば特に限定されないが、０．０１〜９５質量％の範囲から選択することができる。
また、本発明にかかる組成物における、ＤＨＡ及び／またはＥＰＡの含有量は、摂取用時間内における総摂取量（または総投与量）及び組成物の形態の少なくとも一方に応じて選択することができる。
摂取用時間内における総摂取量（または総投与量）は、目的とする中性脂肪値の低減または上昇抑制効果を得ることができれば特に限定されないが、１日（体重６０ｋｇ）当たり、１００ｍｇ〜１００００ｍｇ、好ましくは３００ｍｇ〜５０００ｍｇ、より好ましくは５００ｍｇ〜２０００ｍｇの範囲から選択することができる。

本発明において目的とする効果を得るには、本発明にかかる組成物を、睡眠からの覚醒後の生体の活動開始時期の初期に、ＤＨＡ及び／またはＥＰＡを生体に摂取させること、すなわち一日ごとの生体リズムにおけるＤＨＡ及び／またはＥＰＡの摂取のタイミングが重要となる。
睡眠からの覚醒後の生体の活動開始時期の初期としては、朝食時を必須として含み、朝食時を含む睡眠から覚醒後６時間以内の範囲が摂取用時間として用いられる。
この摂取用時間には昼食は含まれないことが好ましい。
上記の摂取用時間内において、朝食時を必須とし、必要に応じて朝食時以外の摂取用時間内において、単回または複数回に分けて本発明にかかる組成物を摂取することができる。
本発明の組成物の摂取のタイミングは、上記の摂取用時間内のみに限定することが、ＤＨＡ及び／またはＥＰＡの消費量を必要最小限に抑えて、効率良く目的とする効果を得る上で好ましい。
本発明でいう「睡眠」は、周囲の刺激に対する反応の低下を伴い、意識はないが容易に覚醒できる自然な状態であり、該状態が１日２４時間の中に複数存在する場合は、それらのうちで該状態が最も長い時間継続したもののみが、本発明でいう「睡眠」に該当する。即ち、本発明でいう睡眠は、１日２４時間の中で１回だけであり、また例えば、人が通常夜間にとる数時間に亘る睡眠（就寝）とは別に、昼間などにとる比較短時間に亘るいわゆる昼寝は、本発明でいう睡眠ではない。また、本発明の食品の摂取方法において、睡眠時間は特に制限されないが、好ましくは３時間以上、さらに好ましくは４〜１０時間である。

本発明にかかる組成物を上記の特定されたタイミングでの摂取を実施する期間は、本発明の効果が得られるように設定すればよく、特に制限されないが、一定期間継続的に上記の特定されたタイミングでの摂取を実施することが好ましく、本発明にかかる効果をより十分に得るという観点から、２週間以上、特に、４週間以上継続して上記の特定されたタイミングでの摂取を実施することが好ましい。

本発明にかかる組成物は、種々の形態として提供することができる。例えば、本発明にかかる組成物は、機能性食品を含む食品そのもの、各種の加工食品や機能性食品を含む食品を製造する際に用いる添加剤、動物用飼料そのもの、動物用飼料を製造する際に用いる添加剤、あるいは医薬製剤等の形態とすることができる。これらの各種形態は、通常行われている方法によって製造することができる。
なお、本発明の適用対象としての食品は、飲料を含む食品全般を包含し、いわゆる健康食品を含む一般加工食品の他、日本国消費者庁の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品や栄養機能食品等の保健機能食品、サプリメント等、並びに日本国以外の国において対応する特定保健用食品や栄養機能食品等の保健機能食品、サプリメント等を包含し、さらには動物に給餌される飼料も包含する。
医薬品の形態としては、経口用液剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、坐剤、点眼剤、ゼリー等を挙げることができる。また、機能性食品等の食品も、例えば、経口用液剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、ゼリー等として提供することができる。

医薬製剤としての製剤化には、製薬において用いられている各種の担体、賦型剤、希釈剤、基剤などの添加剤が利用できる。
各種製剤で用いられる添加剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、乳糖、デキストリン、デンプン類、メチルセルロース、脂肪酸グリセリド類、水、プロピレングリコール、マクロゴール類、アルコール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース類、ポピドン、ポリビニルアルコール、ステアリン酸カルシウム等を挙げる事ができる。この際、必要に応じて、着色剤、安定化剤、抗酸化剤、防腐剤、ｐＨ調節剤、等張化剤、溶解補助剤及び／または無痛化剤等を添加する事ができる。
顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤は、コーティング基剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等によってコーティングする事もできる。これらの製剤はＤＨＡ及び／またはＥＰＡを、０．０１質量％以上、好ましくは０．５〜５０質量％の割合で含有する事ができる。
本発明を適用し得る食品は、固形、半固形又は液状の形態をとることができ、製剤化する場合の形態としては、錠剤、丸剤、カプセル、液剤、シロップ、粉末、顆粒等の各種の製剤形態を挙げることができる。

本発明を適用し得る食品の製品形態としては、例えば、飲料（清涼飲料、茶飲料、コーヒー飲料、乳飲料、果汁飲料、炭酸飲料、栄養飲料、粉末飲料、ゼリー飲料、アルコール飲料など）、パン類、麺類、ご飯類、ゼリー状食品、菓子類（各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、タブレットなど）、スープ類、乳製品、冷凍食品、水産加工品（魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、はんぺんなど）、畜産加工品（ハンバーグ、ハム、ソーセージ、ウィンナー、チーズ、バター、ヨーグルト、生クリーム、マーガリン、発酵乳など）、インスタント食品、サプリメント、カプセル、シリアル、その他加工食品、調味料及びそれらの材料等が挙げられる。これらの製品中にＤＨＡ及び／またはＥＰＡを、０．０１質量％以上、好ましくは０．１〜５質量％の割合で含有する事ができる。
本発明にかかる組成物を摂取させる、あるいは本発明にかかる組成物の投与対象としての生体、あるいはＤＨＡ及び／またはＥＰＡによる本発明にかかる処置を必要とする対象者には、ヒト及び各種動物が含まれる。動物としては、例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、サル等を挙げることができる。特に、中性脂肪値の上昇が問題となっているペット、家畜、畜肉用動物等に対して本発明の組成物を適用することが好ましい。

本発明の組成物を各種の形態の食品や医薬製剤等の製品として提供する際に、利用者が朝食用として認識できるように、朝食時が摂取時として必須であり、かつ必要に応じて朝食時を含む睡眠から覚醒後６時間以内を摂取用時間範囲とする点に関する説明を製品に添付することができる。この説明は、製品と別途用意した説明書の製品パッケージ内への添付や、製品自体あるいは製品の包装（区分けした製品を包装する中袋を含む）への説明書の印刷により提供することができる。この説明には、製品のＤＨＡ及び／またはＥＰＡの含有量、摂取時間内でのＤＨＡ及び／またはＥＰＡの摂取総量、あるいは継続的に摂取する期間等に関する情報を記載することができる。また、製品は、摂取用時間範囲内に摂取する分量ごとに区分して、区分けされた製品の必要量を製品パッケージ内に収納することができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
（実施例１：ＤＨＡ・ＥＰＡ等のｎ−３系不飽和脂肪酸を含む魚油の活動期前半摂取による脂質代謝改善作用）
＜マウス飼料の調製＞
表１に示す通り、高フルクトース飼料Ｆ２ＨＦｒＤ（オリエンタル酵母工業株式会社製）に含まれる４質量％のラードを、ＤＨＡ・ＥＰＡ等のｎ−３系不飽和脂肪酸を含む魚油（ＤＨＡ−２２Ｋ、マルハニチロ株式会社製）に置換したものを魚油含有改変Ｆ２ＨＦｒＤ飼料とした。対照として、Ｆ２ＨＦｒＤをマウスの飼料とした。

表１における各成分における数値は、飼料１ｋｇ当たりのグラム数である。
表１におけるＡＩＮ−９３Ｇ ｍｉｎｅｒａｌ ｍｉｘｔｕｒは、以下の組成（ｇ／ｋｇ）を有する。
・炭酸カルシウム：３５７
・リン酸二水素カリウム：２５０
・クエン酸三カリウム：２８
・塩化ナトリウム： ７４
・硫酸カリウム：４６．６
・酸化マグネシウム：２４
・クエン酸第二鉄：６．０６
・スミソナイト（菱亜鉛鉱）：１．６５
・炭酸マンガン：０．６３
・炭酸第二銅：０．３２４
・ヨウ素酸カリウム：０．０１
・セレン酸ナトリウム：０．０１０３
・モリブデン酸アンモニウム・４Ｈ_２Ｏ：０．００７９５
・メタケイ酸ナトリウム・９Ｈ_２Ｏ：１．４５
・硫酸クロムカリウム・１２Ｈ_２Ｏ：０．２７５
・塩化リチウム：０．０１７４
・ホウ酸：０．０８１５
・フッ化ナトリウム：０．０６３５
・炭酸ニッケル（ＩＩ）・４Ｈ_２Ｏ：０．０３０６
・メタバナジン酸アンモニウム：０．００６６
・ショ糖：２０９．７８３２
表１におけるＡＩＮ−９３ ｖｉｔａｍｉｎ ｍｉｘｔｕｒｅは、以下の組成（ｇ／ｋｇ）を有する。
・ニコチン酸：３
・パントテン酸カルシウム：１．６
・塩酸ピリドキシン：０．７
・塩酸チアミン： ０．６
・リボフラビン：０．６
・葉酸：０．２
・Ｄ−ビオチン：０．０２
・ビタミンＢ−１２（シアノコバラミン：０．１％）：２．５
・ビタミンＥ（ａｌｌ−ｒａｃ−アルファ−トコフェロール酢酸エステル：５０％）：１５
・ビタミンＡ（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−パルミチン酸レチノール：５００，０００Ｕ／ｇ）：０．８
・ビタミンＤ_３（コレカルシフェロール：４００，０００Ｕ／ｇ）：０．２５
・ビタミンＫ（フィロキノン）：０．０７５
・ショ糖：９７４．６５５
ＤＨＡ−２２Ｋの脂肪酸組成は以下の通りである。
・パルミチン酸（１６：０）：２２．０％
・ステアリン酸（１８：０）：５．７％
・オレイン酸（１８：１ ｎ−９）：１１．７％
・リノール酸（１８：２ ｎ−６）：１．２％
・アラキドン酸（２０：４ ｎ−６）：１．８％
・ＥＰＡ （２０：５ ｎ−３）：５．１％
・ＤＨＡ （２２：６ ｎ−３）：２７．３％
・その他：２５．２％

＜マウスの飼育およびＤＨＡ・ＥＰＡを含む魚油の時間制限給餌＞
ｄｄＹ系統のマウス（５週齢の雄性、日本エスエルシー株式会社）を明期１２時間、暗期１２時間の明暗サイクル下（時刻０：００点灯、時刻１２：００消灯）で３週間飼育した（馴化飼育期間）。馴化飼育期間後、マウスを３群（各群２４匹）に分け、図１に示す通り、対照群（ＣＴＲＬ）には食餌として終日Ｆ２ＨＦｒＤ飼料を、魚油朝摂取群（ＢＦ−ＦＯ）には食餌として魚油含有改変Ｆ２ＨＦｒＤ飼料（図１における「Ｆ２ＨＦｒＤ＋魚油」）をマウスの活動開始時刻を含む時刻６：００〜１８：００に与え、残りの時刻１８：００〜６：００にはＦ２ＨＦｒＤ飼料を、魚油夕摂取群（ＤＮ−ＦＯ）には食餌として魚油含有改変Ｆ２ＨＦｒＤ飼料をマウスの活動終了時刻を含む時刻１８：００〜６：００に与え、残りの時刻６：００〜１８：００にはＦ２ＨＦｒＤ飼料を２週間摂食させた。１日当たりの魚油の摂取量は、魚油朝摂取群が０．１２±０．００８４ｇ（平均値±標準誤差）、魚油夕摂取群が０．１４±０．００８９ｇで、統計的な有意差は認められなかった（ｔ−検定）。

＜試験例１：血液中脂質濃度に対する効果＞
魚油含有改変Ｆ２ＨＦｒＤ飼料の時間制限給餌を２週間継続後、時刻２：００から６時間毎に各群４匹ずつマウスを殺処分し、全採血後、血漿を分離し、マイナス８０度で凍結保存した。図２は、血漿中のグルコース（Ｇｌｕ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、中性脂肪（ＴＧ）と総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）の濃度を示すグラフであり、市販のキット（ＬａｂＡｓｓａｙ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＬａｂＡｓｓａｙ ＮＥＦＡ、ＬａｂＡｓｓａｙ Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ、ＬａｂＡｓｓａｙ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌキット（和光純薬））を用いて測定した。魚油朝摂取群（ＢＦ−ＦＯ）においては、総コレステロール、中性脂肪、遊離脂肪酸の血漿中濃度が、対照群（ＣＴＲＬ）に比べて統計的有意に低下していることが明らかとなった。グルコース濃度に対しては、有意な作用は確認できなかった。

＜試験例２：肝臓中脂質量に対する効果＞
試験例１と同様、魚油含有改変Ｆ２ＨＦｒＤ飼料の時間制限給餌を２週間継続後、時刻２：００から６時間毎に各群４匹ずつマウスを殺処分し、肝臓の一部を採取し、非特許文献（Journal of Nutrition (2015), Vol. 145, No. 2, pp. 199-206, Oishi K. et al.）に従って、肝臓組織中の脂質を測定した。図３は、肝臓組織重量当たりの、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、中性脂肪（ＴＧ）と総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）の含有量を示すグラフである。魚油朝摂取群（ＢＦ−ＦＯ）においては、総コレステロール、中性脂肪、遊離脂肪酸の肝臓組織中の含有量が、対照群（ＣＴＲＬ）に比べて統計的有意に低下していることが明らかとなった。魚油夕摂食群（ＤＮ−ＦＯ）においては、対照群と比べて有意な差異は認められなかった。

＜試験例３：脂肪組織における脂肪酸合成遺伝子のｍＲＮＡ発現に対する効果＞
試験例１と同様、魚油含有改変Ｆ２ＨＦｒＤ飼料の時間制限給餌を２週間継続後、時刻２：００から６時間毎に各群４匹ずつマウスを殺処分し、白色脂肪の一部を採取し、全ｍＲＮＡを抽出した後、定量ＰＣＲ法にて脂肪酸合成関連遺伝子（Ｆａｓｎ、Ａｃｃ１、Ｓｃｄ１）の発現量を調べた。図４は、脂肪酸合成関連遺伝子（Ｆａｓｎ、Ａｃｃ１、Ｓｃｄ１）の発現量の解析結果を示すグラフである。図４中、ｍＲＮＡの発現量は、対照群（ＣＴＲＬ）のピーク値を１００％とした比として示してある。魚油朝摂取群（ＢＦ−ＦＯ）においては、Ｓｃｄ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量が、対照群に比べて統計的有意に低下していることが明らかとなった。魚油夕摂食群（ＤＮ−ＦＯ）においては、対照群（ＣＴＲＬ）と比べて有意な差異は認められなかった。

＜試験例４：血液中脂肪酸濃度に対する効果＞
図５は、試験例１と同様、２週間の魚油時間制限給餌の後、時刻２：００から６時間毎にマウスを殺処分して得た血液から血漿を分離し、血漿中の脂肪酸濃度を測定したグラフである。脂肪酸は、血漿（１００μＬ）から、Canadian Journal of Biochemistry and Physiology（1959）, Vol. 37, No. 8, pp. 911-917, E. G. Bligh, W. J. Dyerの方法に従い、クロロホルム−メタノール溶液で抽出した。脂肪酸濃度の測定は、日本油化学会制定 基準油脂分析試験法 2.4.1.2-2013 メチルエステル化法（三フッ化ホウ素−メタノール法）を一部改変して実施した。抽出した試料に対し、０．５ Ｎ水酸化ナトリウムメタノール溶液１．５ｍＬを加え、１００℃、９分間加熱した。冷却した後、三フッ化ホウ素メタノール錯体・メタノール溶液２ｍＬを加え、１００℃, ７分間加熱した。再度冷却した後、ヘキサン３ｍＬを加えて撹拌した。さらに蒸留水３ｍＬを加えて撹拌し、静置し２層に分離した後に上層を回収した。無水硫酸ナトリウムで水を取り除き、これをガスクロマトグラフィーに供した。魚油朝摂取群においては、魚油に含まれ、体内ではほとんど合成されないＤＨＡやＥＰＡの濃度が、魚油夕摂取群に比べて１日を通して統計的有意に高値を示した。魚油中にＤＨＡと同程度含まれるパルミチン酸の濃度に違いは見られなかった。
また、脂肪酸の絶対量を測定したところ（表２）、時刻２０：００において魚油朝摂取群（ＢＦ−ＦＯ）は、魚油夕摂取群（ＤＮ−ＦＯ）と比べて有意にＤＨＡおよびＥＰＡ量が多かった。ＤＨＡをはじめとするｎ−３系不飽和脂肪酸はリンパ管を経由して体循環移行し、血漿中濃度は投与９時間後に最高値を示すことが知られており（非特許文献２）、朝食時（時刻６：００〜１８：００）に摂取したｎ−３系不飽和脂肪酸が移行したと考えられた。一方、時刻８：００において魚油夕摂取群（ＤＮ−ＦＯ）は、魚油朝摂取群（ＢＦ−ＦＯ）と比べて有意な差は認められなかった。これらのことから、魚油朝摂取群（ＢＦ−ＦＯ）の方がより血漿中ｎ−３系不飽和脂肪酸濃度を高めることが示唆された。

（実施例２：ＤＨＡ・ＥＰＡ等のｎ−３系不飽和脂肪酸を含む魚油の摂取時刻の違いによる糞便中への脂肪酸排出量の影響）
＜マウス飼料の調製＞
実施例１と同様の飼料を用いた。
＜マウスの飼育およびＤＨＡ・ＥＰＡを含む魚油の時間制限給餌＞
実施例１と同様の時間制限給餌を行った。
魚油含有改変Ｆ２ＨＦｒＤ飼料の時間制限給餌を９日間継続後、１日分の糞便を採取し、糞便中の脂肪酸量を測定した。脂肪酸は、糞便から（実施例１）＜試験例４＞と同様の方法で抽出しメチルエステル化処理を行いガスクロマトグラフィーに供した。１日分の糞便中の脂質量を表３に示した。傾向ではあるが魚油朝摂取群（ＢＦ−ＦＯ）は魚油夕摂取群（ＤＮ−ＦＯ）と比べて少なく、より体内に脂質が取り込まれたことが示唆された。中でも、魚油朝摂取群（ＢＦ−ＦＯ）はｎ−３系不飽和脂肪酸の糞便中への排出が少なく、ｎ−３／ｎ−６比も魚油夕摂取群（ＤＮ−ＦＯ）より低かった。朝食として魚油を摂取した場合、より多くのｎ−３ＰＵＦＡを血中に取り込むことから、血漿中ｎ−３系不飽和脂肪酸濃度が増加したものと考えられた。

（実施例３：ＤＨＡ・ＥＰＡ等のｎ−３系不飽和脂肪酸を含む魚油の摂取時刻の違いによる血中への脂肪酸取り込み量の影響）
ｄｄＹ系統のマウス（７週齢の雄性、日本エスエルシー株式会社）を、魚油（１０ ｍｇ／ｋｇ）を時刻１：００に単回投与する魚油夕摂取群（ＤＮ−ＦＯ）と時刻１３：００に単回投与する魚油朝摂取群（ＢＦ−ＦＯ）に分けた（各群２５匹）。魚油は５時間の絶食後に投与した。各群、投与０、６、１０、１４、１８時間後に５匹ずつマウスを殺処分し、血漿を採取した。脂肪酸は（実施例１）＜試験例４＞と同様の方法で抽出しメチルエステル化処理を行いガスクロマトグラフィーに供した。図６は、各群の血漿中脂肪酸量、ｎ−３系不飽和脂肪酸、ｎ−３／ｎ−６比を測定したグラフである。魚油朝摂取群（ＢＦ−ＦＯ）は血中への脂肪酸の取り込み量が多く、（実施例２）の糞中への排出が少なかった結果とも合致した。

（実施例４：ＤＨＡ・ＥＰＡ等のｎ−３系不飽和脂肪酸を含む魚油の摂取時刻の違いによる血中への脂肪酸取り込み量の影響２）
実施例３と同様の試験を、サンプル数を増やして実施した。７週齢ｄｄｙマウス９８匹を、魚油夕摂取群（ＤＮ−ＦＯ）と魚油朝摂取群（ＢＦ−ＦＯ）の２群（各４９匹）に分けた。魚油は５時間の絶食後に投与した。各群、投与０、６、１０、１４、１８時間後に９匹ずつ（０時間後のみ８匹）マウスを殺処分し、血漿を採取した。図７は、各群の血漿中脂肪酸量、ｎ−３系不飽和脂肪酸、ｎ−３／ｎ−６比を測定したグラフである。サンプル数を増やした場合も実施例３と同様に魚油朝摂取群（ＢＦ−ＦＯ）は血中への脂肪酸の取り込み量が多かった。

（実施例５：ＤＨＡ・ＥＰＡ等のｎ−３系不飽和脂肪酸を含む魚油の摂取時刻の違いが健常人における血中脂質に及ぼす影響）
本試験では１本あたりＤＨＡ８５０ｍｇ、ＥＰＡ２００ｍｇ含有する魚油添加魚肉ソーセージ、対照として魚油の替りにオリーブ油を配合したプラセボ魚肉ソーセージを用いた。
２０歳以上６０歳以下の健康な日本人男女２０名を１０名ずつの２群に分け、８週間試験を行った。魚油朝摂取群は朝食に魚油添加魚肉ソーセージ、夕食にプラセボ魚肉ソーセージをそれぞれ毎日１本ずつ摂取させた。魚油夕摂取群は朝食にプラセボ魚肉ソーセージ、夕食に魚油添加魚肉ソーセージをそれぞれ毎日１本ずつ摂取させた。朝食は睡眠から覚醒後６時間以内に摂取した。採血は、０週目、４週目、８週目に朝の採血を基準（０ｈ）とし、朝の採血から８時間後に夕方の採血（８ｈ）を行った。朝の採血８時間前までに規定食を摂取し、朝の採血終了まで絶食とした。朝の採血終了後に規定食および被験食を摂取し、以後、夕の採血まで８時間以上の絶食とした。血中中性脂肪量および血中脂肪酸量の測定を行い、評価した。

図８に血中中性脂肪の推移を示す。魚油朝摂取群において、８週目（８ｗｋ）における血中中性脂肪が摂取前と比べて０ｈ、８ｈ採血ともに有意に低下した。
図９にｎ−６系不飽和脂肪酸、図１０にｎ−３系不飽和脂肪酸、図１１にｎ−３／ｎ−６比をそれぞれ示す。魚油朝摂取群は、８週目（８ｗｋ）において、０ｈ、８ｈ採血ともにｎ−６系不飽和脂肪酸が摂取前と比べて低下した一方、魚油夕摂取群は、摂取前と比べて増加した。ｎ−３／ｎ−６比を高めることにより中性脂肪を低下させると考えられた。
図１２に飽和脂肪酸を示す。魚油朝摂取群は、８週目（８ｗｋ）において、０ｈ、８ｈ採血ともに飽和脂肪酸が摂取前と比べて低下していたことから、β酸化が亢進し中性脂肪の再合成を抑制した可能性も考えられた。
これらの結果は、マウスだけではなくヒトにおいても朝食として魚油を摂取することの有用性を示している。

Claims (18)

1. ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を有効成分として含み、朝食時を必須として含み、朝食時を含む睡眠から覚醒後６時間以内を摂取用時間範囲として摂取される、ことを特徴とする中性脂肪値の低減または上昇抑制用の組成物。
2. 前記摂取用時間内のみに摂取される、請求項１に記載の組成物。
3. ドコサヘキサエン酸及び／またはエイコサペンタエン酸を０．０１質量％以上含有する、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記摂取用時間内でのドコサヘキサエン酸及び／またはエイコサペンタエン酸の総摂取量が５００ｍｇ〜２０００ｍｇの範囲から選択される量でドコサヘキサエン酸及び／またはエイコサペンタエン酸を含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の組成物。
5. ドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸を含む魚油を含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 請求項１乃至５のいずれか１項に記載の組成物を含む、中性脂肪値の低減または上昇抑制用の医薬製剤。
7. 請求項１乃至６のいずれか１項に記載の組成物を含む、中性脂肪値の低減または上昇抑制用の食品。
8. 機能性食品である請求項７に記載の食品。
9. 朝食用である請求項７または８に記載の食品。
10. 中性脂肪値の低減または上昇抑制用の組成物の製造における中性脂肪値の低減または上昇抑制用の有効成分の使用方法であって、
    前記有効成分が、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含み、
    前記組成物が、朝食時を必須として含み、朝食時を含む睡眠から覚醒後６時間以内を摂取用時間範囲として摂取される、
    ことを特徴とする使用方法。
11. 前記組成物が、摂取用時間内のみに摂取される、請求項１０に記載の使用方法。
12. 前記組成物が、ドコサヘキサエン酸及び／またはエイコサペンタエン酸を、０．０１質量％以上含有する、請求項１０または１１に使用方法。
13. 前記摂取用時間内でのドコサヘキサエン酸及び／またはエイコサペンタエン酸の総摂取量が５００ｍｇ〜２０００ｍｇの範囲から選択される量でドコサヘキサエン酸及び／またはエイコサペンタエン酸を含む、請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載の使用方法。
14. 前記有効成分が、ドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸を含む魚油を含む、請求項１０乃至１３のいずれか１項に記載の使用方法。
15. 前記組成物が、中性脂肪値の低減または上昇抑制用の医薬製剤である、請求項１０乃至１４のいずれか１項に記載の使用方法。
16. 前記組成物が、中性脂肪値の低減または上昇抑制用の食品である、請求項１０乃至１５のいずれか１項に記載の使用方法。
17. 前記食品が、中性脂肪値の低減または上昇抑制用の機能性食品である、請求項１６に記載の使用方法。
18. 前記食品が朝食用である請求項１６または１７に記載の使用方法。

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