KR101759353B1 - 오메가-3 지방산이 풍부하고 피탄산 함량이 적은 조성물 - Google Patents

오메가-3 지방산이 풍부하고 피탄산 함량이 적은 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오메가-3 지방산이 풍부하고 기름 1g당 피탄산 함량이 90μg 미만인 조성물들을 얻는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DHA가 풍부하고 기름 1g당 피탄산 함량이 90μg 미만, 더욱 구체적으로는 DHA가 650~950mg/g, 다시 말해 65~95 중량%이고 피탄산 값은 90μg미만이고, 바람직하기는 조성물을 형성하는 기름 1g당 5μg 미만인 조성물들을 얻는 것에 관한 것이다. 얻은 조성물들은 그들의 예방 작용 및 치료 효과 때문에 식품 보충제, 영양제 및 약품의 분야에 사용된다.

Description

오메가-3 지방산이 풍부하고 피탄산 함량이 적은 조성물{COMPOSITIONS RICH IN OMEGA-3 FATTY ACIDS WITH A LOW CONTENT IN PHYTANIC ACID}
본 발명은 오메가-3 지방산이 풍부하고 기름 1g당 피탄산 함량이 90μg 미만인 조성물들을 얻는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DHA가 풍부하고 기름 1g당 피탄산 함량이 90μg 미만, 더욱 구체적으로는 DHA가 650~950mg/g, 다시 말해 65~95 중량%이고 피탄산 값은 90μg미만이고, 바람직하기는 조성물을 형성하는 기름 1g당 5μg 미만인 조성물들을 얻는 것에 관한 것이다. 얻은 조성물들은 그들의 예방 작용 및 치료 효과 때문에 식품 보충제, 영양제 및 약품의 분야에 사용된다.
오메가-3 지방산은 마지막 이중 결합이 지방산의 최종 메틸기에서 시작하는 세 번째 C-C 결합에 위치하는 것을 일반적인 특징으로 하는 다가 불포화 지방산 계열이다. 오메가-3 지방산은 필수지방산으로, 다시 말해 인체 내부에서 이와 같은 지방산들을 생성할 수 없기 때문에, 반드시 음식물을 통해 또는 조성물을 통해 섭취하는 것이 필요하다. 다가 불포화 성질 때문에, 오메가-3 지방산은 인체에서 아주 특별한 물리화학적 기능들(즉, 녹는점이 매우 낮음)을 갖고, 그래서 폭넓게 연구되어 왔다. 오늘날, 오메가-3 지방산은 최대 10개(예를 들면, 스테아린산)가 있는데, 인체 내에 존재하는 양은 극소량이며, DHA 및/또는 EPA를 제외하고는 그들의 생리활성이 매우 낮거나 또는 존재하지 않는 것으로 알려져 있다.
5,8,11,14,17-에이코사펜타에노산 즉 EPA뿐만 아니라 4,7,11,13,16,19- 도코사헥사엔산 즉 DHA는 가장 많은 생리적 기능을 갖는 오메가-3 지방산이고, 특히 DHA는 망막, 정자, 신경 조직 등에서 특이한 기능을 갖는다. DHA 및 EPA는 공통의 생리적 기능을 갖지만, DHA는 특히 광수용체, 신경 조직 및 정자에 다른 지방산들은 미치지 못하는 특이한 생리적 기능들을 갖는다. DHA를 고용량 섭취하면 EPA의 수치가 증가하고, 그 반대는 일어나지 않는다; 게다가 DHA는 다른 지방산의 합성을 변화시키지 않는다(Voss et al., 1992).
생물학적 관점에서 볼 때 생리적 측면에서 DHA는 인간 소비에 가장 흥미로운 오메가-3 지방산이다. DHA 및 EPA는 동일한 음식 공급원에 존재하고 EPA가 더욱 풍부하기 때문에, 처음에는 EPA가 얻기 더 쉬워서 더 많은 관심을 불러일으키는 지방산이었다. 그러나, 지난 15년간 이들 두 지방산에 대한 지식이 DHA에 대해, 그리고 그것의 필요한 정화에 대한 관심을 현저히 증대시켜왔는데, 몇 가지 예외들을 제외하고 가장 풍부한 음식 공급원의 지방에 겨우 10~15% 존재하기 때문이다.
DHA가 풍부한 오메가-3 지방산을 얻기 위한 공급원의 다수는 해양 기원이다: 미세조류(즉, 스키조치트리움(Schizochytrium sp.), 크립스에코디니움(Crypthecodinium sp.), 울케니아(Ulkenia sp.), 에우글레나(Euglena sp.)), 갑각류(즉, 크릴 새우(Euphausia superba)), 지방성 생선(즉, 튜뉴스 이비뉴스 사이뉴스(Thunnus ibynnus thynnus) 또는 붉은 참치) 및 해양 포유류; 또한 버섯 및 이스트(즉, 야로비아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)) 및 박테리아(즉, 락토바실러스 spp.).
인간 소비를 위하여 DHA가 풍부한 오메가-3 지방산을 얻기에 가장 적합한 고순도의 가장 풍부한 공급원은 생선으로, 연간 어패류 포획량은 1억 4천만 톤(FAO, 2007)이고, 어유의 생산량은 연간 1백만 미터톤에 해당하는 것으로 추산(IFFO, 국제 피시밀 & 어유 기구)되기 때문이다. 가장 적절한 생선은 참치 및 오메가 3 함량이 가장 높은 다른 종들로, DHA의 비율이 20 중량%를 초과한다; 뿐만 아니라, 이들은 식품이기 때문에, 공공 보건에 가장 높은 보장 및 안전을 보여준다. 한편, 생선과 함께 크릴 새우가 지구상의 DHA가 가장 풍부한 보고이자 바이오매스를 대표한다. 그러나, 오메가-3 지방산을 얻기 위한 크릴 새우의 착취는 먹이사슬(trophic chains) 및 인류 식단에 필요한 종 및 생선의 개발에 심각하고 알려진 위험을 의미한다. 미래의 한 가지 가능성은 영양사슬에 대한 위험이 없고, 또한 크릴 새우가 일반적으로 해수에 존재하는 오염물질들로부터 자유로운 환경에서 번식할 수 있는 크릴 새우 양식장에서 이와 같은 크릴 새우를 얻는 것이다.
수많은 저자들이 DHA가 전세계 대부분의 식단에 결핍된 영양소라고 생각한다. 그러나, DHA 결핍 질환의 치료제로서의 그것의 적절성뿐만 아니라, 그것의 생리적 작용 때문에 DHA는 알츠하이머 또는 편집증과 같은 퇴행성 신경 질환, 망막 퇴행성 질환, 암, 자가면역 질환, 만성 관절 및 피부 염증성 질환, 신장 및 비뇨기 질환(전립선), 남성형 탈모증, 남성 및 여성의 가임 수정 능력의 변동, 원발성 주의집중 장애 또는 과잉행동, 지적 및 인지적 발달의 치료 및 예방을 위하고 뿐만 아니라 시력 발달에 필요하며 특히 반점 부위, 심혈관계 질환, 당뇨 및 과트리글리세라이드 혈증의 치료와 예방을 위한 가장 중요한 보조 인자이다.
여러 병증을 치료하기 위해서는, 식단에서만 얻는 양(일반적으로 >2~4g)의 10배 이상의 용량을 사용할 필요가 있고, 그렇기 때문에 충분한 용량의 소비를 달성하기 위해서(즉, 20% 기름 조성물로부터 DHA 4g의 용량을 얻기 위해서는, 기름 20g 또는 종래의 500mg짜리 소프트겔 40개를 섭취해야할 것이다) 고순도의 DHA 조성물을 얻어야 한다.
다가 불포화 지방산은 유리기 형태에서 상당히 불안정하기 때문에, 그것을 경구 섭취하려면 안정화가 요구되며, 이 안정화는 에스테르화 반응 또는 글리세롤 및 에탄올과 같은 다른 분자와의 연결을 통해 달성될 수 있고, 이와 같은 방법은 그것을 더욱 안정하게 하고 그들의 생체이용률을 증가시킨다. 첫 번째 비히클(글리세롤)은 더 높은 순도(트리글리세리드)와 안정성을 가능하게 하고, 최대 생체이용률을 나타내면서, 고용량이 요구되는 경우에 그리고 여러 응용에서, 임산부 및 어린아이에게 사용될 뿐만 아니라, 그것의 사용이 만성적일 때, 특히 중요한 알코올의 존재를 방지한다. 트리글리세리드는 일반 식품의 일부의 수백 배 더 높은 농도로 섭취되고, 표적 조직에 천연 영양 공급원이자 지방산의 약동학(pharmacokinetics)이다. 트리글리세리드의 약동학은 최대치이고, 이것은 활성 물질인 DHA의 최대 순도를 가능하게 하고, 그렇기 때문에 DHA 트리글리세리드는 최상의 흡수를 나타내고 더 많은 생리적 및 대사적 영향을 끼친다.
식품과 건강의 연관성에 대한 민감도가 증가하는 것과 병행하여, 건강한 영양 공급원으로의 생선에 대한 인식이 증가하였다. 생선은 다가 불포화 오메가-3 지방산뿐만 아니라 고급 단백질, 미네랄 및 비타민의 중요한 공급원으로, 건강에 대한 이들의 혜택은 이미 잘 알려져 있다. 그러나, 최근의 연구에서 수은 및 다이옥신과 같이, 생선 체내에 축적되는 것으로 알려진 환경 오염물질들과 연관된 위험이 부각되고 있다.
지방산의 합성 및 생명유기체의 먹이사슬은 세포막의 물리화학적 특성들 그리고 환경 조건(예, 온도)에 대한 그들의 생리적 적응을 좌우한다. 생명 유기체의 인지질과 지방에서 발견되는 용융점(FP)이 가장 낮은 지방산은 프리스탄산(PA), 피탄산(PhA), EPA, DHA, 아라키돈산(AA) 및 에스테아린산(SDA)이고, 이들은 저온에서 최상의 생리적 상황을 허락한다. 유기체는 FP가 아주 낮은 지방산을 얻기 위해 2가지 화학적 전략들을 사용한다: 메틸화 및 카르복실산의 불포화화. 해양 기원의 유기체에서 만나게 되는 극한의 상황을 고려해볼 때, 이와 같은 지방산이 가장 풍부한 공급원들이 주로 차가운 해수에 있다는 것은 전혀 놀라운 일이 아니다. 이런 점에서, 자연, 천연식품 및 해양 기원의 기름과 같은 지방 유도 제품에서 만나는 FP가 가장 낮은 지방산은 메틸기가 여러 개 달린 긴 분지형 사슬 지방산(C>18)이고, 이와 같은 지방산에서 PhA는 가장 높은 농도로 존재하는 것이자 긴 사슬 선형 오메가-3 지방산(C≥18)이고, 이 중에서 그들의 농도 및 풍부함 때문에 가장 영향력 있는 2가지는 DHA와 EPA이다.
PhA는 인간 식단 또는 동물 조직에 존재하는데, 여기서 PhA는 식물의 엽록소를 통해 얻어질 수 있다. PhA는 상응하는 알코올, 피톨로부터 형성되고, 산화되어 PA를 형성하는데, 이것은 PA와 PhA를 함께 발견하는 것이 왜 일반적인지를 설명해준다. PhA는 한 가지 인간 병증, 레프섬 증후군에 관여하는데, 이 증후군은 혈액 및 조직에 PhA의 축적을 특징으로 하고, 추후에 이것은 간에서의 알파-산화 루트에서의 결핍과 연관된다는 것이 발견되었다.
식품 대다수가 1g당 PhA를 5μg 미만 함유하는 한편, 가장 높은 함량을 갖는 식품은 1g당 PhA 1mg을 초과하고, 생선의 경우 1g당 750μg을 초과하는데, 이것은 지방의 비율에 비례하는 양이다. 생선은 망막색소변성증(RP) 그리고 레프섬 질환과 같은 PhA의 산화의 결함과 같은 질환에서 소비할 경우 PhA의 농도가 가장 높고 위험도가 더 높은(제III군) 식품으로 고려된다. 한편, 어유 생성에서 지방의 분리를 위한 공정은 현저하게 PhA의 농도를 증가시킨다.
생선의 지방 분획은 식단 중의 오메가-3 지방산 DHA와 EPA의 주요 공급원일 뿐만 아니라 또한 PhA의 주요 공급원이기도 한 것으로 알려져 있다. EPA와 DHA의 함량이 가장 높은 공급원들은 DHA와 EPA의 섭취의 대부분을 차지하고, 이와 동시에 PhA의 최고 농도 및 섭취 공급원과 연관된다. DHA와 PhA는 식품 및 약품 용도의 생성물들을 훨씬 초과하여 공급원을 공유하고, 따라서 해양 기원 및 미생물 기원의 제품들에서 가장 높은 농도의 DHA 및 PhA가 발견된다. 일반적으로, PhA는 EPA 및 DHA와 함께 발견된다. 박테리아, 균류, 미세조류는 천연에서 가장 높은 농도의 PhA를 갖는 유기체이다. DHA 함량이 풍부하고 PhA 비율이 최소한인 마이크로유기체로부터 유도된 기름은 종종 100μg/g을 초과한다.
지중해 지방의 식단을 비롯하여 서양의 모든 식단은, 조사 결과, 1일 DHA 섭취량이 100~150mg이고, 한편 여러 저자들은 1일 필요량이 200~300mg이라고 확립했다. DHA는 사실상 세계 모든 인구의 식단에서 결핍된 유일한 영양소이다.
본 문헌에 보통 나타나지 않은 가장 중요한 핵심은 식단으로부터의 DHA는 100% 동물기원이라는 것인데, 식물 식품 공급원에는 DHA가 전혀 없기 때문이다(식품으로서 사용되지 않는 일부 조류는 제외). 따라서, 채식주의자들에게서 결핍은 훨씬 더 크고, 특히 엄격한 채식주의자들의 결핍이 심한데, 가장 낮은 수치가 발견될 수 있다. 퍼옥시솜 결함과 관련된 대사성 퇴행성 신경 질환뿐만 아니라 망막색소변성증(RP)에서, 결핍이 훨씬 더 크고 일부 저자들에게는 이러한 결핍이 표지자로 여겨진다.
오메가-3 지방산의 정화에 대한 관심이 만연하고 있다는 점을 감안할 때, 주로 DHA, EPA 또는 둘 다는 지난 수십 년간 여러 특허의 대상이었고 더 높은 순도를 얻기 위해 DHA 및 EPA가 풍부한 정제유를 얻기 위한 일반적인 방법들이 존재해 왔다.
그러나, 도 3에 나타난 바와 같이, 시장에 있는 그리고 특허받은 방법들 및 우수의약품 제조 관리 기준(Good Manufacturing Practice(GMP))으로 얻은 정제되고 정화된 기름은 심지어 DHA 순도가 높은 기름에서조차 높은 수치의 PhA를 함유한다.
PhA 가 건강에 미치는 부정적 영향들
PhA는 전립선, 유방, 결장...등의 암을 유발할 뿐만 아니라 신경 및 시각 장애(Lloyd-MD et al., 2008; Allen-NE et al., 2008; Thornburg-G et al., 2006; Xu-J et al., 2005)를 유발하기 때문에 공공보건에 위험 요인이다. 더불어, 이것은 세포독성이 있다(Komen-JC et al., 2007; Schonfeld et Reiser, 2006; Schonfeld et al., 2006, Heinz, 2005; Elmazar & Nau, 2004). PhA의 섭취는 질병의 발발 및/또는 진전에 위험 요인이다: 안과적(망막, 백내장, 건조한 눈 등), 후각 및 청각적 변성들, 신경적(알츠하이머, 뇌질환 등) 및 정신적 변형, 신장 변형, 심혈관계(전기적 이상 푸르킨예 현상, 평활근의 변형, 허혈성 심장질환, 죽상경화증), 근질환 및 중증 근위축, 골 변형, 간 변형, 남성 및 여성의 수정 능력의 변형, 만성 자가면역 및 염증 질환(크론병, 궤양성 대장염, LES) 및 암(전립선, 결장, 유방, 신장, 난소, 일부 유형의 백혈병 등).
PhA가 지각 신경 및 신경 조직, 심장, 신장, 간, 창자, 평활근 및 횡문근, 전립선, 유방, 정자, 폐 및 뼈 계통에 독성이 되는 정확한 메커니즘은 점차 설명될 것이다. 가장 잘 알려진 메커니즘들은 종양 표지자(알파-메틸아실-조효소 라세마제(AMACAR) 또는 SPC-2)의 과잉 발현 및 미토콘드리아 및 세포막(즉, 망막 중의 광전도)에서 호흡기 전자 전달계의 연결 풀림 프로토노포어(protonophore) 작용과 연관이 있다. PhA는 아주 적은 용량으로 체내의 산화 스트레스를 가장 많이 유도하는 분자들 중 하나이고, 이것은 태아의 기형발생을 가능하게 하고 죽상경화증 및 심부전에 의한 사망을 크게 유도하는 물질이다.
PhA는 미토콘드리아에 직접적으로 해롭고, 강력한 죽상경화 작용을 나타낸다. PhA는 미토콘드리아 막 내부의 산화 인산화에서 복합체 I의 연합 풀림에 로테논 유형 활성을 갖고, 그 결과로 나중에 활성 산소 종이 생성되고 DHA 및 다른 다가 불포화 지방산(PUFA)이 체내에서 지방 과산화된다(Kahler-S et al., 2005). PhA는 인지질에서, 주로 광수용체 및 신경 조직에서의 DHA의 수치를 감소시키고, 그럼으로써 허혈, 심혈관계 재관류(reperfusion) 병변 및 저밀도 지단백의 산화(LDLox)에 대한 민감도를 증가시켜, 대식세포 항염증 작용을 증가시키고, 그럼으로써 에너지 및 대사 작용을 감소시키고(산화 인산화를 억제하고) 미토콘드리아성 DNA의 변이를 유도한다. 이와 같은 유독성 대사 작용은 그 자체로 광수용체, 색소 상피 조직, 신경 조직, 심장(푸르키네 세포), 신장, 간, 난소, 정자, 폐 등 미토콘드리아가 풍부한 모든 조직들이 높은 PhA 농도를 갖는 환자들에게서 영향을 받는 첫 번째 조직들인 이유를 설명해준다. PhA는 푸르키네 세포에서 Ca+2 유도 세포소멸(Powers-J.M et Al. 1999)과 동물 모델에서의 심장 돌연사를 유도한다. PhA는 허혈을 일으키고, 혈관 평활근의 세포소멸을 일으키며, 죽상경화성이고 특히 심 독성이다. 스테롤-2 수송 단백질(SPC-2)의 결핍이 마우스에서의 PhA의 축적에 의한 심장 돌연사를 일으킨다. PhA는 인간, 쥐 및 돼지의 혈관 평활근 세포(VSMC)의 세포배양액에서 세포소멸을 유도한다.
PhA로 인한 Ca+2 재흡수의 변형된 작용 및 파골세포의 세포소멸은 뼈 이상으로 이어진다. 칼모듈린(calmoduline)이 특히 농축되어 있는, 광수용체의 외부구역의 막들에서 Ca2 +에 연결된 단백질들은 광수용체에서의 다중 이벤트(광전달 및 광전도 및 시냅스 전달 포함)를 통제하는 Ca2 + 흐름을 좌우한다. 칼모듈린 기능은 GTPases를 비롯하여 그것에 연결된 여러 단백질들에 의해 가능해진다. 칼모듈린 농도가 광수용체에서 감소되면, 시야에 결함이 발생하고, 특히 빛과 어둠에 대한 적응에 결함이 생긴다.
PhA는 안구 궤도의 후안부에서 부교감 신경절 신경에 영향을 미치는 섬모 신경절 세포에 직접적으로 해롭고, 동공 수축 및 시각 조절(노안, 원시, 햇빛 알레르기 등)의 원인이다. PhA는 광수용체의 원발섬모에서 서로 다른 유형의 미오신의 상호반응과 Rab GTPase의 프레닐화에 의해 가능해진, 섬모의 생성(biogenesis)에 필요한 미소관에 연결된 단백질과 기저 소체, 그리고 섬모 세포들의 작용을 방해하고, 옵신과 같은 필수 단백질의 전달, 후각 세포, 달팽이관, 신장 세포, 호흡계, 정자, 창자 미세 융모에 영향을 미치고, 또한 망막의 색소 상피에서의 멜라노솜의 이동에 영향을 미친다. PhA의 대사작용에서 변형을 나타내는 RP는 섬모 세포들의 변형의 모델로, 정자 축사 및 간상체 섬모 세포의 이상이 발견되고, 섬모체에 의존하는 간상체의 외부 영역(outer segments)의 재생에 영향을 미치고, 그 결과 회복 불가능한 시력 손상을 초래한다. 또한, 관련 증후군이 없는 RP에서, 청각 유발 전위의 변동과 섬모 세포들이 특징인 달팽이관 변형과 양립할 수 있는 청각검사의 변형들이 발견된다. 섬모체의 의미 있는 변형들은, 귀의 변형과 관련 없는 증후군을 앓는 환자들에게서처럼 어셔 및 다른 증후군들과 비교할 수 있는 방식으로, RP 및 난청으로 이어진다.
Rho 및 Rab 류(family) 작은 G-단백질은 정상적인 GTPase 기능을 위해 그것의 C말단에 이와 같은 이소프레닐 모이어티의 첨가를 요구한다. 경로를 알리는 Rho GTPase는 신장 질환, 신경적 장애(myelinisation), 암 진행, 심혈관계 질환, 감염성 질환 등의 치료적 개입을 위한 목표물로 반드시 설정될 필요가 있다. PhA 및 다른 이소프레노이드는, DHA 및 스태틴과는 반대 방향으로, Rho-GTPase 시그널링을, 특히 Rac 경로를 손상시킨다. PhA는 상피조직 및 소화기 및 호흡계 점막에서의 몇몇 박테리아성 독소에 견줄 수 있는 방식으로 Rho-GTPases를 변형시켜 침습적 및 감염성 프로세스가 생기게 한다; 종양 프로세스 및 전이(즉, 전립선, 유방), 신장 병변(사구체, 관상 등) 및 신경장애(demyelinisation).
이와 같은 GTPases는 본 발명에 따른 여러 응용에서 PhA 없는 DHA가 왜 나머지 PhA 있는 DHA보다 더 효율적인지를 설명하는 주요한 메커니즘이다.
이와 같은 맥락에서, PhA 및 PA는 혈관형성 및 염증 표현형의 주요한 그리고 가장 강력한 매개체들의 제어 인자들이다. PhA 및 PA에 의한 혈관형성, TNF-알파, GBP-1, GBP-2 및 염증성 사이토카인(CI)의 유입은 암(전이), 자가면역 질환, 염증 질환, 감염성 질환, 신장, 폐 및 신경 질환의 발병에 대한 결정적 요인이다.
PhA는 산화에 의해 PA가 되고, PhA 및 PA 둘 다 취급 후 2시간 내에 산화질소 합성효소의 UNAM의 형성 및 고농도의 단백질에 의해 가능해지는 세포소멸을 유도한다(Idel et al., 2002). 게다가, PhA 및 PA는 혈관형성 표현형 및 염증의 주요하고 가장 강력한 매개체들을 제어한다. 또한 PhA 및 PA는 종양 괴사 인자 α(TNF-알파)의 활성 및 분비의 가장 강력한 유도 인자들이다(Idel et al., 2002). 인간 구아닐레이트-결합 단백질(GBP)-1의 발현은 염증 사이토카인(ICs)에 의해 유도되기 쉽고, 그렇기 때문에 IC-활성 세포들을 특징으로 할 수 있다. GBP-1은 내피 세포의 IC-활성 표현형을 특징으로 하는 새로운 세포활성 표지자이다. GBP-1은 ICs에 대한 내피 세포의 혈관생성-억제 반응의 주요한 조절 인자이다. GBP-1은 세포질 단백이고, 내피 세포에서 이것의 발현은 인터페론-감마, 인터루킨-1 알파, 인터루킨-1 베타, 또는 TNF-알파에 의해 선택적으로 유도되고, 다른 사이토카인, 케모카인, 또는 성장 인자들에 의해서는 유도되지 않는다. PhA 및 PA는 알파 TNF 및 인터페론 감마의 유도 인자이다. GBP-1 발현은 혈관 내피 세포와 상당히 관련이 있으나 피부에서 검출될 수 없었지만, 그러나 건선, 약물 부작용 및 카포시 육종을 비롯하여 고-염증성 성분을 갖는 피부 질환의 혈관에서 상당히 유도되었다. GBP-1 및 매트릭스-메탈로프로티나제-1(MMP-1)의 발현은 체외 및 체내에서 반비례적으로 관련이 있고, 그리고 GBP-1은 내피 세포에서 MMP-1의 발현을 선택적으로 억제하지만, 다른 프로테아제의 발현은 억제하지 않는다는 것이 밝혀진 바 있다. 나중에 밝혀진 바에 의하면, 모세혈관 형성의 억제는 구체적으로 GBP-1에 의한 MMP-1의 억제 때문이고, GBP-1의 나선식 영역의 증식-억제 작용에 의해 영향을 받지 않는다(Guenzi et al., 2003).
PhA는 레티노산의 기형발생 효과를 가능하게 하고(Elmazar & Nau, 2004), 특히 PhA와 자주 연관되는 DHA가 임신, 수유 및 유아식에 권장되기 때문에 특히 의미가 있다.
망막색소 변성증(RP)은 DHA의 존재에서 PhA의 독성을 연구하기에 적당한 이상적인 모델로, 본 문서에서 앞으로 계속해서 등장할 것이다. PhA는 그것의 물리화학적 성질로 인해 인지질의 위치 2(광수용체에서 보통 DHA의 위치)로 병합될 때 DHA의 중요한 경쟁 인자가 된다. PhA는 자유 회전 결합이 여러 개(14) 있고, 아주 낮은 결정점을 갖고 있어서, 막에서의 높은 유동성을 가능하게 한다. 그러나, PhA는 반데르발스 작용에 대한 DHA의 특징이자, 막과 3차 구조에서 운동성에 필요한 알파-헬릭스의 로돕신을 갖는 구조적 형태가 부족하다. 그 결과, PhA는 로돕신 작용 및 광전도를 감소시킨다. PhA는 광수용체 막들의 연결을 풀 능력이 있어서, 그 결과 RP에서 발견되는 광전도의 실패(지속적인 과분극)로 이어진다. PhA는 산화에 의한 분해에 민감하지 않고, RP에서 발견되는 것과 같은 영양실조 상태에 저항한다. 이것은 영양 결핍의 결과인 RP에서와 같이, DHA 결핍의 경우에 특히 발생하는 것으로, RP는 이 질환의 표지자로 여겨지는 DHA의 결핍이 있는 단일 질환이다.
PhA는 인지질 및 트리글리세리드로의 통합을 통해 광수용체의 작용을 변경하여, DHA를 치환하고(McCoII & Converse, 1995; Powers et al., 1999, Monning et al., 2004) 그리고 PhA에 의해 유도된 지방 과산화 및 미토콘드리아의 손상 때문에 DHA의 수치를 감소시킨다. PhA는 또한 미토콘드리아뿐 아니라 광수용체 막에서 양자 수송체(연결풀림제)로 작용하는 해로운 능력이 있어서(Gutknecht-J, 1988), 따라서 광수용체의 외부 영역(outer segments)의 분극을 변형시킨다.
PhA 에 의한 DHA 의 치환
PhA는 인지질 및 트리글리세리드로의 통합을 통해 광수용체의 기능을 바꾸고, 그 때문에 ROS 막과 미토콘드리아의 인지질의 두 번째 탄소에서 DHA를 치환한다. 따라서, PhA에 의한 막으로부터의 DHA의 치환은 광수용체의 기능을 변화시키고, 광전도에서 DHA 대항물질로 작용하여, 칼슘 항상성 및 로돕신의 재생을 변화시킨다. PhA에 의한 DHA의 치환은 몇몇 질환(즉, 레프섬 질환)에서 부분적으로 병원성 메커니즘인 다양한 작용 메커니즘들 중 하나다.
DHA가 세포소멸의 억제 인자이고 또한 광수용체에 대한 신경성장 또는 생존 인자인 반면, PhA는 체내에서 산화 및 세포소멸의 가장 강력한 유도 인자 중 하나로 DHA의 작용 메커니즘에 대한 대항적 작용에 개입한다. 기름에서의 PhA 수치는 DHA의 작용에 개입하는데, 이것은 DHA가 망막에서 세포소멸을 억제하는 능력이 PhA의 존재에 의해 용량-의존적으로 감소되기 때문이다.
PhA는 미토콘드리아에서 불가역적 손상을 일으키는 RP를 가진 동물 모델의 광수용체에서 세포소멸을 일으킨다. 이와 같은 상황에서, 광수용체의 생존에 책임이 있는 펩타이드는 세포소멸을 억제할 수 없다. 하지만, DHA는 영양실조 상태에서 망막의 반응 종들(reactive species)을 중화시키는 단일 지방산이다. PhA는 특히 영양실조성 망막에 유독성이고, DHA는 그것의 영향을 감소시킨다. DHA가 광수용체 변성을 초래하는 산화 스트레스 및 비가역성 미토콘드리아 손상의 억제 인자임이 증명된 바 있다(Rotstein et al. 2003).
그렇기 때문에, PhA는 세포독성일 뿐만 아니라 관련된 모든 영향들로 DHA의 대항물질이라고 결론지을 수 있다. 구체적으로, DHA에 적대적인 PhA는 미토콘드리아를 통해 세포소멸을 유도한다.
본 발명에서는 PhA 농도와 관련해 DHA의 체외 및 체내에서의 세포소멸-억제 효과를 연구하기 위해, 파라콰트(도 1)와 MNU(도 2)로 광수용체에서 세포소멸을 유도하는 두 가지 임상-전 실험을 전개하였다. 두 실험에서, 광수용체에서의 DHA의 세포소멸-억제 능력은 PhA 농도와 반비례적인 상관관계가 있음이 입증된다. 가장 높은 세포소멸-억제 작용은 0~20μg/g의 농도에서 얻어지고, 여기서 Bcl-2/Bax 비율은 5μg/g 미만을 먹인 마우스에서보다 상당히 낮았다.
PhA 의 독성
독성을 보여주기 위해 반드시 PhA 산화의 대사 변화 또는 약리학적 또는 영양학적 상호작용이 필요하지 않은데, 그것은 종래의 식단을 통한 PhA의 영양학적 용량이 또한 PhA의 중요한 변형 및 건강과 독성에 대한 위험 증가로 이어지기 때문이다. 도식적으로, 낮은 용량의 PhA의 소비를 통한 그것의 독성은 하기 상황과 관련이 있다:
1. PhA의 산화 과정 내에 생리적-병리적 과정의 일부가 포함된다: AMACAR 유입. 건강에 대한 PhA의 영향은 또한 역학적으로 큰 가치가 있는 여러 암들(전립선암, 결장암 및 신장세포암)과 관련된 특정 분자성 표지자의 과도한 발현에 의해 측정된다. 이와 같은 표지자는 인슐린 저항과 관련된 난소, 유방 및 내분비 암과 연결되어 있다는 증거가 있다. PhA는 여러 종양 세포주(전립선, 신장, 유방, 결장, 폐)의 생존에 필수적이라서, AMACAR 및 SPC-2의 과도한 발현을 가져온다. 신경병증, RP 및 PhA와 PA의 증가로 인한 AMACAR의 결핍에 관한 사례들이 기술된 바 있다(Ferdinanduse et al., 2000).
2. 청소년 또는 성인 레프섬 병, 젤웨거 증후군, 유아 레프섬 병 및 점상 연골 이형성증와 같이 RP가 있는 환자에게서 PhA의 축적 증가로 인해 PhA의 산화의 실패.
3. 그러나 다른 유전적 질환은: a) 미토콘드리아 병증(복합물 IV)을 가진 질환, COX 결핍, 레이 증후군, 신장 판코니 증후군(Fingerhut R et al., 1994)에서와 같이 퍼옥시솜 결함 때문에 일반적인 집단과 비교하여, PhA의 증가를 보여준다.
4. 산화 및 시토크롬 P450을 통해 1일 50mg 이상의 PhA가 제거된다. PhA의 산화가 시토크롬 p450에 의해 이루어진다는 것이 잘 알려져 있지만, 시토크롬 P450의 강력한 억제 인자들(즉, 항진균성 아졸, 발프로산, 시메티딘 에리스로마이신, 설파메톡사졸, 오피오이드, 시클로스포린, 프로테아제 억제제, 항우울제, 하이퍼포린, 바르비투릭스, 항히스타민제, 타목시펜, 카나비노이드, S-와파린 등)이 있다는 것 또한 잘 알려져 있다. 그렇기 때문에, 특정 약물들은 의미 있는 방식으로 PhA 농도를 증가시킬 수 있다. 여러 약리학적 치료는 PhA의 대사 분해를 억제하여, 주로 망막 독성, 신경- 및 심장-독성을 축적한다. PhA는 칼슘 대항물질, 혈관형성 억제제, 면역억제제 및 항염증제와 상호작용할 수 있다. 인체에서 PhA의 신속한 산화 (알파-산화 = PhA의 90% 산화)는 시토크롬 P450 (즉, CYP2C8)의 다른 이소엔자임 (isoenzymes)에 의해 가능해진다. 상업적 관심과 용도 때문에 가장 주목받는 약물들 중 하나는 고지혈증 약물, 피브레이트 및 스태틴(PhA의 산화 대사를 강력히 억제하고, 그리하여 PhA의 축적으로 이어지는 P450 CYP2C8의 억제제)이다. 피브레이트는 퍼옥시솜에서 베타-산화를 활성화하는데, PhA의 분해는 시토크롬 P450 CYP2C8의 억제를 통해 피브레이트에 의해 억제되는 알파-산화가 필요하다. PhA는 그것의 주요한 부차적 효과, 횡문근변성의 부분적 책임이 있을 가능성이 있다.
5. PhA 산화의 2차 실패: 알츠하이머 병의 경우, 퍼옥시솜에서 티아민-의존 효소의 활성이 감소되고, 그 결과 PhA의 산화에 필요한 히드록시피타노일-조효소 리아제의 양이 감소된다. 알츠하이머 병에서 발견되는 아세틸콜린 수치의 증가와 병행하여, PhA 수치의 증가가 발견된 바 있다.
6. 티아민의 감소에 영향을 끼치는 영양학적 변화(대사 길항물질: 티아민아제 및 티아민 대항물질, 아세틸콜린), 여기서 티아민 피로포스페이트는 (리가제에 의한) PhA 산화뿐만 아니라 베르니케-콜사코프 증후군(잉어 및 연어과 생선의 섭취로 인한 태아 심혈관계 질환 각기병 및 신경독성 증후군)과 연관된 것으로 가장 잘 알려진 티아민 결핍의 보조 인자이다. 티아민 대항물질은 식물 및 섭취가 빈번한 음식(frequent foods)(즉, 차, 포도, 구연산 등)의 식품 방부제(즉, 아황산염) 등과 같은 물질에서 발견되고, 이것은 커피산, 클로로젠산 및 타니산, 퀘르세틴 및 루틴(약리학에서 상당히 사용되고, 그리고 식품 보충제로서 사용됨)과 같이 끓기에 저항하고(오소- 및 히드록시페놀);식품(주로 생선 양식장으로부터 생선에 자주 사용, 소비의 80%), 루멘, 낙농제품 및 반추동물 고기: PhA가 풍부한 식품으로부터의 티아민아제; 알코올 소비, 포도 그레이프 프루트 쥬스(및 더 적은 범위로 오렌지 주스, 만다린, 사과, 포도 및 그들의 유도체) 및 카페인은 PhA의 침착을 훨씬 적은 범위로 증가시킬 수 있다. 흥미로운 모델은 티아민 결핍과 신경-감각 난청을 일으키는 유전병이다. 7일 내에 중증 티아민 결핍을 일으키기 위해서는 알코올과 피리티아민(티아민 대사길항물질)이 단 100μg/ml가 필요하다. 이와 같은 상호작용들은 식품에 함유된 PhA 및 피톨의 양을 계산하는 것이 중요할 뿐만 아니라, 식단과 관련된 식품들, 약리학적 치료, 식품 보충제 및 습성이 식단으로부터의 PhA의 축적에 영향을 미칠 수 있음이 주목받고 있다.
7. 한편, 역학적 데이터는 정상으로 여겨지는 용량(50~100mg/일)에서의 유독성 효과와 관련해 추호의 의심도 남기지 않는데, PhA는 무려 0.1μmol/mg 지방과 같은 낮은 용량에서도 유독성 물질이다. 심지어 훨씬 낮은 농도에서조차, PhA는 체내 산화를 유도하는 가장 강력한 능력을 가진 분자들 중 하나이고, 그로써 DHA의 가장 중요한 생리적 메커니즘과 상호작용하고 그리고 체내에서의 그것의 수치를 감소시켜서, 지방 과산화를 통해 그것의 구조를 손상시킨다. 아주 낮은 혈액 농도 300μg/ml 또는 1mmol/l 미만(총 지방산의 1% 미만) 및 신경조직의 총 지방산의 약 5~10%에서, PhA는 중증 신경 병증를 일으키고 죽음에 이르게 한다. PhA의 축적(레프섬 병)과 관련된 사후 유독성 연구에서, 단 몇몇 조직에서 발견된 가장 높은 수치는 총 지방산의 8.5%에 달했다23. 심각한 PhA의 축적으로 인한 성인 및 유아 레프섬 병은 레티노산 변성증, 안진증, 저안압증, 운동실조증, 정신 및 성장 부진, 얼굴 및 뼈 이형성증, 간 비대 및 저콜레스테롤혈증을 비롯해, PhA에 의한 유독성을 연구하기에 이상적인 모델이다.
DHA 와 PhA
PhA 유독성은 망막색소 변성증(RP)에서와 같이 DHA의 섭취가 권장되고 사용되는 질환 및 상황과 관련되는데, 여기서 DHA는 질병의 표지자로 행동하고 PhA는 RP의 원인 물질(etiological agent)이다. 일반적으로 치유를 위해 DHA를 필요로 하는 질병은 동시에 PhA에 의해 유도된다. 종양 질환뿐만 아니라, 무엇보다 가장 분명한 것은 망막색소 변성증(RP)이다. 분지 사슬 지방산 PhA 및 PA는 PA의 알파- 및 베타-산화의 대사에서의 결함과 관련된 서로 다른 RP 질환(레프섬, 신생아 부신백색질형성 장애증(NALD), 점상 연골 이형성증, 리조멜릭, 젤웨거, 어셔 IV)의 표지자이다. PhA는 이와 같은 경우들에서 RP의 단일 원인이다.
수십 년 전, RP의 경우, 모든 표적 조직에서의 DHA의 결핍이 있음이 알려졌다. 모든 RP 환자는 DHA 대사에 변동을 나타내고, 그들 중 상당수는 어느 정도 질병 진전의 원인인 고농도의 PhA를 갖고 있다. DHA 결핍의 정도는 질병의 진전 및 예후와 관련이 없다. 이런 점에서, 비-전신성 상염색체 우성 RP는, 산발적으로 취한 값들보다 낮은 DHA 수치에서조차(Schaefer et al. 1995), 모든 유전적 형태의 최고의 양성(benign)이다(PhD Thesis Cela-Lopez, JM). 그러나, X-연관 RP 환자가 DHA를 1일 2g 경구투여하는 것은 영양실조성 망막에서 DHA의 손실 때문에 DHA의 수치를 정상화시키지 못하기에, 적혈구 인지질에서 DHA의 수치를 정상화시키기 위해서는 1일 4g 섭취가 필요하다. 여러 유형의 RP의 진전과 예후는 DHA의 약리학적 투여량 및 DHA의 섭취 시작 순간, 그리고 PhA 수치에 좌우된다. 따라서, PhA의 농도는 질병의 진전에서 최악의 예후와 관련이 있고, 중심 작용기(반점 부위)의 손실에 있다고 말할 수 있다.
" DHA " 치료에서 발견된 피탄산 수치의 증가
환자 4명의 샘플 4개가 2가지 RP 증후군에서 DHA로의 치료의 이로운 효과를 평가하기 위해 실험실에 도착했다. 지난 3개월 동안 청소년 레프섬 병 및 젤웨거 증후군을 앓는 환자 4명을 대상으로 1일 4g의 DHA(피탄산 4.86mg)로 치료하자, 분지 사슬 지방산의 수가 늘어났다: 피탄산 및 프리스탄산이 각각 50% 및 44% 증가했다. 이와 병행하여, 임상 조건의 완전한 악화가 관찰되었다: 신경학적, 난청 및 RP (시력의 예리함 및 시야). 케네디 크리거 연구소(발티모어 소재)의 퍼옥시솜 질환 실험실은 본 실험실에서 연구한 모든 환자들에게 모든 분석적 결과들로, 생선으로부터 DHA의 섭취는 피탄산의 유독성 수치를 증가시키고, 그렇게 때문에 그들은 항상 조류로부터의 DHA를 권장한다고 통보한다. 데이터는 DHA의 상업적 농도가 퍼옥시솜 결함과 관련된 RP 환자에게는 유독성임을 나타낸다.
1994년 RP 환우회(AARPE 스페인)는 혈장에서 피탄산의 수치를 증가시켰던 증후군(레프섬, 젤웨거, NADL, 컨스, 바르데-비들, 상염색체 열성 RP, 및 산발적 RP)이 있거나 또는 없는 RP 환자 17명에 대한 연구를 수행하였다. 환자들은 모두 서로 다른 양의 피탄산(1일 5~11.5mg)이 함유된 DHA 기름을, 1개월부터 3년에 이르기까지 다양한 기간 동안 섭취하였다. 환자들은 모두 어유 원료와 상관없이, 피탄산 수치가 23%에서 무려 82%로 상승함을 보였다. 1년 후, RP의 진행은 비-증후군성 RP 환자(11명)(시력 8.3% 미만)에게서는 기대된 것보다 더 컸으나, 증후군성 환자(6명)에게서 시각 기능의 손실은 상당히 중요한 것이었다. 추후에, 피탄산이 풍부한 DHA로의 치료가 제거되었고, 환자들은 혈장 내 피탄산 수치(중간 수치: 5~30μg/ml; 높은 수치 30~900μg/ml)에 따라 두 군으로 분리되었다. 피탄산 함량이 낮은(<90μg/ml) DHA 4g으로의 치료가 도입되었고, 그리고 피탄산 수치 및 시각 기능이 평가되었다. 피탄산 수치가 중간인 군(증후군과 관련 없음)에서, 피탄산 수치는 점진적인 감소가 관찰되었고, 12개월 내에 정상이 되었다(도 4). 이와 병행하여, 시각 기능에 있어서 질병의 진전의 퇴보가 관찰되었고, 이것은 피탄산이 풍부한 DHA로의 치료를 시작하기 전에 얻은 것과 비교할 만하다.
PhA 의 유독성은 DHA 및 EPA 가 풍부한 공급원(즉 참치)의 소비와 연관이 있는데, 그것이 아주 낮은 비율로(약, 0.1%) 기름에 존재하기 때문이다.
PhA는 인간 식단 또는 동물 조직에서 발견되고, 여기서 PhA는 식물 추출물의 클로로필로부터 유래될 수 있다; 이와 같은 방법으로 PhA는 동물 조직에 축적될 수 있다. PhA는 피톨로부터 형성되고 산화되어 프리스탄산(PA)을 형성한다. 인류의 지방성 식단에 존재하는 중요한 변화들을 고려해볼 때(채식주의자, 유채식주의자 등), 혈중 PhA 수치에서의 변화(최대 6.7배)가 종래의 식단으로부터의 PhA의 소비와 단독으로 관련하여 발견된 바 있고, 여기서 채식주의자 식단은 최대 10배 적은 PhA를 나타내고, 한편 이와 동시에 DHA의 심한 결핍이 있다.
피탄산은 전립선암의 위험인자인 반면, DHA는 같은 유형의 암에 대한 보호 인자이다. 증거는 여러 분자 연구를 능가하고, 역학적 데이터 및 여러 약리학적 연구에 의해 뒷받침되고, 연구들 중 몇몇은 전립선암뿐만 아니라 위암의 예방 및 1차 치료(first line treatment)에서 다른 화학요법 약물(셀리콕시브, 플라퀴탁셀(Plaquitaxel))과의 조합에서 DHA의 역할과 관련하여 잘 전개되고 있다(단계 II)(Ballet et al., 2004; Jones et al., 2007). 또한, 전립선암의 유도에서의 피탄산의 역할에 대한 충분한 역학적 증거가 있다(Walsh, 2005; Xu et al., 2005; Thornburg et al., 2006; Mobley et al., 2003). 게다가, 지방질 생선, 붉은 고기 및 낙농 제품(최고 농도의 피탄산의 공급원)의 섭취를 전립선암과 연관시키는 3가지 별개의 연구들이 있다.
특허 분야에서, EPA 및 DHA를 함유하는 기름을 정화하기 위한 문서들이 알려져 있는데, 예를 들면 문서 US 4,874,629(1989)는 EPA 및 DHA를 함유하는 연어, 정어리 및 다른 생선과 같이 오메가-3 지방산을 함유하는 기름을 처리하는 방법을 언급하고, 이 방법은 본질적으로 다음 단계로 이루어진다: a) 해당 기름을 2~5시간 동안 30~150℃에서 진공 증류시키고, 높은 끓는점 온도를 감소시키고 가장 휘발성 있는 극성 풍미제 그리고 예를 들어 중합체, 콜레스테롤, 색소, 해충제 및 중금속과 같은 원치 않는 다른 구성성분들을 감소시키기 위해 실리카 겔 및 규산 중에서 선택되는 흡착제와 기름을 접촉시키는 단계, 그리고 b) 추후에 상기 혼합물로부터 기름을 회수하는 단계. 추후에, 동일 저자들은 US 5,023,100에서, 산화 안정성을 개선하기 위해 식물성 기름 및/또는 로즈메리 기름과 혼합될 수 있는 EPA 및 DHA를 함유한 식용 기름을 생산하기 위해 이전의 방법들을 적용한다.
이와 마찬가지로, 문서 US2008/0268117 A1은 EPA 및 DHA를 함유하는 기름을 정화하는 방법을 기술하고, 이 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) C1~C4의 지방족 알코올을 기름에 첨가하는데, 바람직하기는 수용액 중의 에탄올을 60~70%로, 그리고 기름과 알코올이 두 개의 상으로 나뉘어져 있는 온도(대략 1O℃)에서 첨가하고; (b) 기름과 알코올이 혼합될 때까지 혼합물을 가열하고(50~80℃): (c) 기름과 알코올이 분리되는 온도로 혼합물을 냉각시키고(대략 1O℃); 및 (d) 기름 상을 회수하는 단계. 이와 같은 방법은 특히 식품 및 약품에 사용되도록 기름을 제조하는 데 적합한데, 상기 방법이 콜레스테롤과 같은 유기 오염물질 및 수은과 같은 중금속을 제거하기 때문이다. 사실상, 이와 같은 방식으로 제조된 기름은 특히 영아 분유(US 5,013,569) 및 류머티스성 관절염 치료용 조성물(US 4,843,095)의 제조에 적합하다고 언급되어 있다.
또한 EPA 및 DHA 트리글리세리드를 얻는 방법에 대한 문서들이 있는데, 예를 들어 문서 ES 2035751 T3은 분자에 하나 이상의 지방산 C8+이 있는 트리글리세리드를 제조하는 방법을 언급하고, 이 방법은 리파제, 긴 사슬의 유리 지방산 또는 분자 중에 하나 이상의 짧은 사슬 지방산 C2~C6이 있고 반응 중에 증발에 의해 분리되는 트리글리세리드를 갖는 그것의 저급 알킬 에스테르 C1~C4, 짧은 사슬 유리 지방산 또는 그것의 저급 알킬 에스테르, 그리고 다가 불포화 산이 EPA 또는 DHA이거나 또는 둘의 혼합물인 조성물의 존재 하에서, 에스테르 교환반응을 특징으로 한다. 문서 GB 2350610 A는 트리글리세리드의 저급 알킬 알코올과의 트랜스에스테르화 반응, 증류 및 움직일 수 없는 리파제에 의해 촉매반응이 일어나는 알콕시 알코올과의 선택적인 효소성 트랜스에스테르화 반응의 조합을 사용하는 방법을 통해 트리글리세리드로서의 이 기름으로부터 DHA의 제조를 기술한다. 또한, 문서 US2008/0114181 A1은 지방산의 에스테르화 반응을 통해 지방족 알코올 C1~C8을 함유한 트리글리세리드로 만드는 방법을 언급한다. 상기 방법은 촉매로서 산성 이온 교환 수지를 사용하고, 이것은 에스테르화 반응에 적합한 조건에서 최소한 1% 이상의 유리 지방산과 지방족 알코올 C1~C8을 갖는 트리글리세리드를 함유하는 반응 혼합물과 접촉한다.
이와 마찬가지로, EPA 및 DHA를 에틸 에스테르로서 얻는 방법이 알려져 있는데, 예를 들어 문서 US 5,679,809는 다가 불포화 지방산, 바람직하기는 EPA 및 DHA로부터 에틸 에스테르 농축물을 얻기 위한 방법을 기술하고, 그 방법은 상기 지방산을 함유한 기름을 촉매의 존재 하에 에탄올과 혼합되어 지방산의 에틸 에스테르가 형성되고, 이것의 상이 분리되어 유레아 및 에탄올과 혼합되고, 그 후 고체상이 형성될 때까지 냉각되고, 이어서 원하는 다가 불포화 산이 풍부한 분획이 얻어진 것으로부터 액체상이 분리된다. 해양 동물 기름에 존재하는 나머지 지방산으로부터 포화 지방산과 다수의 일가 불포화 지방산을 분리하기 위해 유레아를 또한 사용하는 문서는 EP 0347509 A1이고, 이것은 최종 생성물로서 EPA와 DHA의 혼합물을 얻는다. 문서 US 5734071은 유레아를 포함하는 유사한 방법을 사용하여 어유로부터 EPA+DHA를 함유하는 생성물을 얻는 방법을 기술하고, 문서 ES 2018384는 EPA 및 DHA를 상대적 비율 1:2 내지 2:1로 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 기술하는데, 여기서 이들 지방산은 총 지방산 중량의 75%를 차지하고, 또한 유레아와 분자 증류로 분획함으로써 농축 및 그리고/또는 초임계(super-critic) 조건 또는 크로마토그래피에서의 유체로의 추출을 사용하는 방법이 있다.
문서 ES 2056852 T3은 또한 어유에서 DHA의 에틸 에스테르의 추출 방법을 청구하는데, 황산의 존재 하에서 에탄올과 어유의 트랜스에스테르화 반응을 포함하고, 이어서 헥산으로 혼합물의 추출, 실리카겔 크로마토그래피, -4O℃로 냉각된 아세톤에서의 잔여물의 취급, 여과, 아세톤의 증발 및 0.133 Pa에서 두 단계의 분자 증류 (첫 번째 단계는 80~100℃에서, 두 번째 단계는 105~125℃)를 포함한다.
앞서 언급한 결핍 및 질환의 다양한 상태들에 대한 DHA의 용도를 언급한 문서들이 수없이 많이 있다. 하나의 예로서, 우리는 기억력 증강 및 지력 개선을 위해 거치형 석송, 로디올라 뿌리 및 어유 농축물(활성 물질로서 DHA를 50mg 함유)을 포함하는 조성물을 기술하는 문서 CN 1557453(A)을 언급할 것이다. 이것은 신경 전달물질 사이의 연결을 통한 정보 전달을 강화하고, 그리하여 산소결핍에 대한 저항을 개선하고, 신경세포들의 구조를 안정화시키고, 그리고 그와 같은 신경 세포들에 필수 영양 물질들을 제공한다고 기술되어 있다.
추가로, DHA는 다른 문서들에서 인간 두뇌를 위한 영양 물질로 그리고 지능에 새로운 활성을 주는 것으로 건강에 이로운 특성을 갖는 것이라고 언급되었다(CN 1130040 (A)). JP 8098659 (A)에는 DHA가 에스테르 또는 포스포리피드로서, 스트레스에 대항하는 개선된 효과가 있다고 기술되었다. CN 1105205 (A)는 순수 DHA 11~45%와 칼슘, 비타민 및 녹말을 함유하여, 뇌의 탄력을 되살리고 지능을 활성화하는 캡슐에 대한 설명을 제시한다. 그리고 문서 ES 2277557 A1은 산화성 세포 손상의 치료에 적합한 약제학적 조성물의 제조를 위한 DHA의 용도를 언급한다.
최신 기술의 측면에서, EPA와 DHA를 선택적으로 분리 및 정화하는 문서들이 발견될 수 있다. 따라서, 문서 EP 1065196 A1은 EPA 또는 DHA, 또는 산 또는 에스테르의 혼합물에서 그들의 에스테르를 선택적으로 분리 및 정화하는 방법을 언급하고, 이 방법은 하기를 포함한다: (a) 은염이 함유된 수용성 유체를 규조토가 담긴 칼럼에 통과시켜, 은염이 규조토에 부착되도록 하고; (b) 규조토 및 은염이 담긴 칼럼에 상당히 불포화된 지방산 또는 그것의 유도체들을 함유하는 혼합물의 용매를 함유한 용액을 통과시키고; 그리고 (c) 용매를 지나가게 하여 원하는 지방산을 분리한다.
문서 US 6,846,942 B2는 순수한 EPA 및 DHA의 제조 방법에 관한 것이고, 이 방법은 하기를 포함한다: a) DHA 및 EPA의 혼합물을 아세톤에 용해시키고 마그네슘 이온을 첨가하여, 아세톤에서 용해도가 다른 EPA 및 DHA 염을 생성하고, b) 단계 a)에서 얻은 용액을 냉각시켜 EPA 염을 침전시키고, c) 침전된 EPA 염을 여과시키고, d) 얻어진 침전물을 산성화시켜 순수한 EPA를 얻고, 그리고 e) 여과물에서 용매를 증발시켜 순수한 DHA를 얻는다. EPA 및 DHA 혼합물이 어유에서 얻어질 때, 이것은 트리글리세리드를 유리산으로 전환시키기 위해서 알코올 분해 또는 검화를 우선 거쳐야 한다.
따라서, 건강에 효과적인 양으로 DHA가 존재함으로써, 즉, 많은 양의 DHA가 존재함으로써 식단 및 건강에 이로워야할 뿐만 아니라, 동시에 DHA를 섭취할 때 PhA의 영향을 막기 위해서 되도록 최소한의 PhA를 함유하는 조성물에 대한 요구가 여전히 있다.
따라서, 본 발명의 제1 대상은 해양 기원의 기름으로부터 오메가-3 지방산이 풍부하고 PhA 수치가 90μg/g 미만인 조성물을 얻는 방법에 관한 것이고, 여기서 언급된 방법은 다음 단계들을 포함한다:
a) 지방산염을 얻기 위해 해양 기원의 기름이 검화(saponified)되고,
b) 산성화된 기름을 얻기 위해 단계 a)의 지방산염이 산성화되고,
c) 단계 b)의 산성화된 기름이 진공(27Pa) 하의 온도 10℃에서 글리세롤 구배 중에 초원심분리되고,
d) 단계 c)의 글리세롤 구배가 온도 범위 0~-57℃에서 결정화되어, 고체상과 액체상을 얻고, 여기서 고체상은 포화 지방산, 일가(mono) 불포화 지방산 및 PhA를 함유하고, 액체상은 다가 불포화 오메가-3 지방산과 함량이 90μg/g미만인 PhA을 함유하고,
e) 단계 d)의 액체상이 상층액 분리(decantation)를 통해 회수되도록 상기 고체상으로부터 분리된다.
부가적으로, 상기 방법은 오메가-3 지방산이 에스테르화되어 PhA 함량이 90μg/g 미만인 오메가-3 트리글리세리드를 얻는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 현 대상의 검화 단계는, 바람직한 한 구현예에서, KOH, 물 및 에탄올로 상기 혼합물을 불활성 대기에서 1시간 동안 300rpm으로 40℃에서 교반하여 수행된다. 바람직한 또 다른 구현예에서, 산성화 단계 b)는 불활성 대기 중에서 200rpm으로 단계(a)에서 얻은 지방산염을 70% 아세트산과 혼합함으로써 수행된다.
단계 c)의 초원심분리가 등밀도라면, 이것은 사용되는 원심분리 조건이 42시간 동안 10000Og이어야 한다는 것을 시사한다. 상기 초원심분리가 평형 없는 밀도 구배에 따른다면, 원심분리 조건은 24시간 동안 10000Og이어야 한다.
바람직한 또 다른 구현예에서, 초원심분리 단계가 등밀도라면, 결정화 단계는 0℃의 온도에서 수행된다.
바람직한 또 다른 구현예에서, 초원심분리 단계가 등밀도라면, 결정화 단계는 -3O℃의 온도에서 수행된다.
바람직한 또 다른 구현예에서, 초원심분리가 평형 없는 밀도 구배인 경우, 결정화 단계는 -3O℃의 온도에서 수행된다.
본 발명의 제2 대상은, 제1 대상에 기술된 방법에 따른, 오메가-3 지방산이 65~99 중량%이고 PhA 함량이 90μg/g 미만인 조성물을 포함하고, 바람직하기는 오메가-3 지방산의 함량이 75~99 중량%이고, 더 바람직하기는 오메가-3 지방산은 적어도 중량의 90%를 차지하는 조성물을 포함한다.
바람직한 한 구현예에서, 제1 대상에 기술된 방법에 따라 얻은 조성물은 오메가-3 지방산을 65~99 중량% 포함하고 PhA의 함량이 5μg/g 미만이고, 바람직하기는 오메가-3 지방산의 함량이 75~99 중량%이고, 더 바람직하기는 오메가-3 지방산이 적어도 중량의 90%를 차지한다.
바람직한 또 다른 구현예에서, 제1 대상에 기술된 방법에 따라 얻은 조성물에서, 오메가-3 지방산은 65~95 중량%의 DHA를 포함하고 PhA 함량은 90μg/g 미만이고, 바람직하기는 DHA 함량은 75~95 중량%이고, 더 바람직하기는 DHA 함량은 적어도 80 중량%이다.
바람직한 또 다른 구현예에서, 제1 대상에 기술된 방법에 따라 얻은 조성물에서, 오메가-3 지방산은 DHA를 65~95 중량% 포함하고 PhA 함량은 5μg/g 미만이고, 바람직하기는 DHA 함량이 75~95 중량%이고, 더 바람직하기는 DHA 함량이 적어도 80 중량%이다.
바람직한 또 다른 구현예에서, 제1 대상에서 기술된 방법에 따라 얻은 오메가-3 지방산 조성물은 부가적으로 EPA를 5~35 중량% 포함한다.
바람직한 또 다른 구현예에서 제1 대상에 기술된 방법에 따라 얻은 DHA 조성물을 포함하는 오메가-3 지방산은 추가적으로 EPA를 5~35 중량 % 포함한다.
바람직한 한 구현예에서, 제1 대상에 기술된 방법에 따라 얻은 조성물에서, DHA의 중량%가 80.65%이고, EPA의 중량%가 13.38%이고, 상기 조성물에서 지방산의 총 중량%는 91.75%이다.
바람직한 한 구현예에서, 제1 대상에 기술된 방법에 따라 얻은 조성물은 추가적으로 보조인자, 추출물 및/또는 약학적 또는 영양학적 용도용 활성 물질을 포함한다.
바람직한 한 구현예에서, 제1 대상에 기술된 방법에 따라 얻은 조성물은 추가적으로 약제학적 또는 영양학적 용도를 목적으로 하는 부형제 및/또는 애쥬번트를 포함한다.
본 발명의 제3 대상은 본 발명의 제2 대상에 기술된 조성물을 드링크제, 소프트 또는 하드 겔, 수용성 현탁액 또는 분말에 포함하는 영양 보충물에 관한 것이다.
본 발명의 제4 대상은 본 발명의 제2 대상에 기술된 조성물을 드링크제, 소프트 또는 하드 겔, 수용성 현탁액 또는 분말에 포함하는 식품에 관한 것이다.
본 발명의 제5 대상은 본 발명의 제2 대상에 따른 또는 본 발명의 제1 대상에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는, 오메가-3 지방산이 풍부한 화합물, 또는 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대상은 알레르기 질환, 눈 표면 질환 및 건조한 눈의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것이고, 바람직하기는 상기 질환은 안검염, 안검결막염, 결막염, 각막염, 건조한 각결막염, 각막질환, 각막 이식 거부반응에 대한 치료, 라식수술 전후의 각막두께 검사를 통한 평균 각막 세포 밀도의 증가로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.
본 발명의 또 다른 대상은 유전적 이영양증과 관련이 없는 망막 퇴화 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것이고, 바람직하기는 상기 질환은 노화에 따른 퇴화와 관련된 습식 또는 건식 황반변성, 당뇨병성 망막증, 녹내장, 안압 변화, 근시와 관련된 망막변증, 망막 박리, 라식 후 근시안에서의 열공성 망막 박리, 허혈 기원의 부차적 황반부종, 낭포 황반부종 또는 어바인-가스 증후군, 베를린 암점, 맥락막염, 맥락망막염, 매독성 시신경 망막염, 홍역, 거대세포 바이러스, 맥락막 악성 흑색종, 수은 중독(미나마타병, 선단통증, 헌터-러셀 증후군), 망막 혈관염(일스병), 출혈성 외상성 망막층간 분리로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 대상은 레티노산 변성증을 제외한 유전적 망막 위축증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것이고, 바람직하기는 이 장애는 스타르가르트 병, X-연관 맥락막 결손, 레버 선천성 흑암시, X-연관 망막층간 분리, 골드만-파브르 유리체망막 위축증, 바그너 유리체 망막 위축증, 및 스틱클러 증후군, 가족성 평면부염으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 대상은 망막색소 변성증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제9 대상은 망막색소 변성증 관련 증후군의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다.
바람직한 한 구현예에서 치료대상 망막 위축증은 특이적 돌연변이 및/또는 간합성 또는 DHA의 수송의 실패의 결과로 또는 대사 스트레스의 결과로 인한 비-증후군성 RP, 멘델 유형의 전형적인 비-전신성 RP, 부채꼴 비-전신성 RP, 양쪽 비-전신성 RP, 한쪽 비-전신성 RP, 양쪽 비-전신성 RP, 반대 비-전신성 RP, 상염색체상염색체 우성 RP, 상염색체 열성 RP, X-연관 RP, 단순성 또는 산발성 RP, 유리체 망막 RP, 백점 RP, 색소 없는 RP, 맥락막 위축, 맥락막 이랑(gyrata) 및/또는 망막 위축, 안진증 동반 RP, 어셔 증후군 유형 I, 어셔 증후군 유형 II, 어셔 증후군 유형 III, 어셔 증후군 유형 IV, 의원성 RP, 시오리다지나(Thioridazina), 클로로킨(CloroKine), 히드록시클로로킨(HidroxycloroKine), 클로로프로마진(Clorpromacine)으로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직한 또 다른 구현예에서, 치료대상 망막 위축증은 다양한 신경계, 심혈관계, 근골격계 및 피부의 변성을 나타내는 RP 동반 퍼옥시솜 결함 및/또는 DHA 결핍 및 PhA와 PA의 증가를 동반한 유전적 증후군이고, 바람직하기는 하기를 포함하는 군에서 선택된다: 젤웨거 증후군, 유아 레프섬 병, 유아 레프섬 병, 퍼옥시솜 생체내 합성 장애, 점상 연골 이형성증(RCDP), 아크릴-조효소 산화효소 결핍, 이작용기성(bifunctional) 촉매 결핍, 레프섬 병, 베타-산화 결핍, 가족성 어린선양 각질 피부증(쇼그렌-라손 증후군), 미토콘드리아 병증 질환(복합체 IV): COX 결핍, 레이 증후군.
바람직한 또 다른 구현예에서 치료대상 망막 위축증은 퍼옥시솜 및 미토콘드리아 결함 및/또는 RP 및 망막 변성과 관련된 유전적 증후군이고, 바람직하기는 바센-콘츠바이크 증후군, 배튼 증후군 또는 리포푸신증, 저베타지단백 혈증, 어셔 증후군, 할러보든-스파츠 증후군, 저세룰로플라스민혈증, 컨스-세이어 증후군, 뒤센 및 베커 근위축증, 로렌스-문-바르데-비들 증후군, 로렌스-문 증후군, 바르데-비들 증후군, 그라페 증후군, 레버 선천성 흑암시, 홀그렌 증후군, 코카인 증후군, 알스트롬 증후군, 펠리제우스 메르츠바하 증후군, 소뇌성 운동실조증, 프리드리히 운동 실조증, 리포푸신증, 특발성 가족성 흑내장(테이-삭스 또는 할티아 산타부오리 증후군, 빌쇼스키-얀스키, 보그트-스필마이어-배튼-마이오우 증후군, 쿠프스 증후군), 골-신경-내분비 이형증, 점액다당류증(헐러 증후군, 헌터 증후군, 쉐이레 증후군, MPS I-H/S, 산필리포 증후군), 바센-콘즈베이그 증후군, 흑인-망막 이형증, 골격계 이형증, 신장-안구-골격 증후군, 에드워즈 증후군, X 열성 연관 안구대뇌신장 또는 로위(Lowe) 증후군, 리냑-판코니 증후군(시스틴 증), 거대 축삭 신경병증, 및/또는 덴마크 가족형 치매 등을 포함하는 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 대상은 포도막염 및 관련 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것으로, 치료대상 질환은 바람직하기는 홍채염, 평면부염, 맥락막염, 맥락망막염, 전포도막염 및/또는 후포도막염, 홍채모양체맥락막염, 감염성 포도막염, 브루셀라병, 단순포진, 대상포진, 렙토스피라증, 라임병, 추정되는 안구 히스토플라스모시스 증후군, 매독, 톡소카리아증, 톡소플라즈마증, 결핵, 칸디다증, 포도막염 증후군, 급성 후부 다발성 판모양 색소 상피증, 산탄 맥락 망막, 푹스 홍채 이색 모양체염, 다발성 맥락막염 및 전체 포도막염 증후군, 다발성 소실 백반 증후군, 점상 내층 맥락막 병증, 사행성 맥락막염, 포도막염 관련 전신성 장애(예를 들어, 강직성 척추염, 베체트병, 만성육아종병, 골부착 부위염, 염증성 대장질환, 소아 류머티스성 질환, 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 결절성 다발동맥염, 건선성 관절염, 리이터 증후군, 유육종증, 전신 홍반성 낭창, 보그트-고야나기-하라다 증후군, 휘플 병, 안구의 전안부 및/또는 후안부에서의 가면(masquerade) 증후군, 망막 모세포종, 망막 박리, 악성 흑색종, 백혈병, 소아 황색 육아종, 안구내 이물질, 림프종, 다발성 경화증 및/또는 세망 세포 육종으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 대상은 망막 퇴화 질환 및 혈관질환과 관련된 2차 안과 질환들의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것으로, 치료대상 질환은 바람직하기는 고혈압성 망막증, 고혈압성 시신경 허혈성 신경병증, 고혈압성 맥락막 병증, 맥락막 경화증, 분지 또는 중앙 정맥 혈전증, 엘쉬니히 및 시에그리스트(Siegrist) 줄무늬, 죽상경화증, 대뇌 및 신경-안구 허혈증, 대동맥궁 증후군, 다카야수 질환, 다카야수 혈관염, 전층동맥염, 홍채모양체염, 공막염, 허혈증에 의해 생성되고 유리체 출혈로 이어질 수 있는 망막전(preretinal) 신생혈관생성, 각막 부종, 안구 수양액 중의 틴들(Tyndall), 증식성 당뇨병성 망막 병증 또는 신생혈관 녹내장, 경동맥 부전 또는 만성 안구 허혈, 안동맥의 폐색, 중심 망막 동맥의 폐색, 응고 장애, 단백질 S와 C의 결핍, 전안구염 망막염, 맥락막염, 돌기 울혈(papilar stasis), 망막 출혈, 로스 스테인, 면역복합체로 인한 병변, 시신경 병증, 허혈성 망막 병증, 안근마비, 안와 위종양, 안구 허혈성 증후군, 후두엽 경색증, 복시증, 눈꺼풀 부종, 눈꺼풀 하수증, 눈꺼풀 모세혈관 확장증, 결막, 망막, 중심 망막 동맥, 안저 동맥 또는 그것의 분지의 급성 폐색, 후안부 섬모 동맥의 폐색, 비동맥성 허혈 시신경 병증, 저관류 및/또는 흐릿한 시야에 의한 만성 안구 허혈 증후군 또는 샤이-드래거 증후군으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 대상은 본 발명의 제2 대상에 따른, 망막과 관련되지 않은 시력의 손실의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 화합물의 용도 및 다른 안과적 용도에 관한 것으로, 치료 대상 질환은 바람직하기는 백내장, 유리체염, 유리체 박리, 안내염, 원시, 근시 및/또는 노안으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 대상은 신경학적 및/또는 정신과적 장애, 특히 퇴행성 신경 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것으로, 치료 대상 질병은 바람직하기는 유전성 운동 감각 신경병증, 운동실조증, 강직성, 신경염, 알츠하이머 병, 치매, 원발성 주의력 결핍, 우울증, 양극성 장애 및 분열형 장애, 다발성 경화증 및/또는 근위축성 측삭 경화증으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 대상은 종양 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것으로, 치료대상 질환은 바람직하기는 전이 및 가장 만연한 종양 세포주, 결장암, 전립선암, 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 식도암, 췌장암, 신장암, 간암종, 뇌종양, 교모세포종, 흑색종, 망막 모세포종, 담낭, 다발성 골수종, 내분비암 및/또는 인슐린 내성과 관련된 암으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 대상은 신증(신염 및 신장증)의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것으로, 치료대상 질환은 바람직하기는 IgA에 의한 신증, 전신 홍반성 낭창과 연관된 신증, 신부전증, 사구체병증, 세뇨관증, 간질 및/또는 신장 혈관 질환으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 대상은 심혈관계 질환의 치료 및 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것으로, 치료 대상 질환은 바람직하기는 허혈성 변성, 동맥경화증, 과트리글리세라이드 혈증, 과지방혈증, 심실성 부정맥, 고혈압, 당뇨 및/또는 아포단백 α(아포 (α)) 수치가 증가되는 것인 심혈관계 질환으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 대상은 의원성 질환(iatrogenies)의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것으로, 치료 대상 질환은 바람직하기는 횡문근변성, 간 독성, 심장 독성, 신경 독성, 부종, 지방 이영양증 및/또는 스태틴, 코르티코이드, 항레트로바이러스 및/또는 면역억제제에 관련된 면역억제로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 대상은 섬유근육통 및/또는 만성 피로 증후군의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대상은 관절증 및 골다공증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대상은 자가면역 질환, 만성 염증 및 골근계 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도로, 치료 대상 질환은 바람직하기는 류머티스성 관절염, 소아 관절염, 쇼그렌 질환, 강직성 척추염, 전신 홍반성 낭창, 관절증, 골다공증으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 대상은 피부 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것으로, 남성형 탈모증, 주사비, 여드름, 습진 및/또는 건선으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 대상은 알레르기 질환, 천식 및/또는 만성 호흡기 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대상은 소화기 질환 및 염증성 대장 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것으로, 치료 대상 질환은 바람직하기는 자가면역, 바이러스성 및/또는 독성, 위염, 식도염, 크론병, 궤양성 대장염, 위막성 대장염, 교원성 대장염, 장투과성의 변성, 흡수장애 증후군, 식품 불내성 및 알레르기 및/또는 치질로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 대상은 기생충 및 감염성 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대상은 DHA 결핍의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다. 바람직한 한 구현예에서, 이와 같은 결핍은 낭포성 섬유증, 장 흡수장애 증후군, 췌장염, 췌장 기능부전 및/또는 담석증으로 이루어진 군에서 선택되는 위장 흡수장애 증후군 때문이다. 바람직한 또 다른 구현예에서, DHA 결핍은 거식증 및/또는 폭식증을 포함하는 군에서 선택되는 영양 장애 때문이다. 세 번째 바람직한 구현예에서, 본 발명의 본 대상의 화합물은 인간 집단에서, 바람직하기는 임산부, 수유부 및 아동, 바람직하기는 생후 1년의 아동을 포함하는 군에서 관찰되는 일반적인 영양상의 DHA 결핍을 보충하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대상은 하기와 연관될 때 화합물의 부차적 효과를 감소시키고 그리고/또는 그것의 치료 작용을 증가시키기 위해 다른 약물들과의 보조인자 또는 보조 애쥬번트로서의 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다: 스태틴, 항-염증 약물, 코르티코이드, 면역억제제, 항고혈압제; 고지혈증, 항염증, 자가면역 질환, 알레르기, 이식된 장기에 대한 거부 반응 및 항고혈압의 치료.
본 발명의 또 다른 대상은 기억력 및 인지 기능을 증가시키고, 운동 능력을 성과를 향상시키고 병변을 감소시키고 그리고/또는 정상적인 근신경계 피로를 감소시켜서 생리적 상태를 개선하는 본 발명의 제2 대상에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다.
도 1. PhA(파랑) 및 Bcl-2/Bax 지수(초록)의 서로 다른 농도로 체외에서 파라콰트에 의해 유도되는 DHA의 광수용체 세포소멸(%) 억제 능력. 붉은 선은 DHA로 치료하지 않은 경우의 세포소멸의 정도를 나타낸다. 이 실험에서, PhA 함량이 5μg/g 미만인 DHA 기름은 농도가 더 큰 것보다 세포소멸의 억제 작용이 더 크고, 생산되는 산화 스트레스 또한 더 작다는 것이 분명히 나타날 수 있다. 이것은 체외에서 5μg/g 미만의 DHA는 세포소멸의 억제제로서, 망막 위축증의 치료에 더 큰 생리적 작용이 있음을 확인시켜준다.
도 2. PhA(파랑) 및 Bcl-2/Bax 지수(초록)의 서로 다른 농도로 체내에서 MNU에 의해 유도되는 DHA의 광수용체 세포소멸(%) 억제 능력. 붉은 선은 DHA로 치료하지 않은 경우의 세포소멸의 정도를 나타낸다. 이 실험은 체외에서 나타난 관찰내용을 확인시켜주고, PhA의 함량이 5μg/g 미만인 DHA의 경구 섭취가 세포소멸의 억제제로서 더 큰 생리 활성을 갖는다는 결론을 도출한다.
도 3. 이 도표는 시장의 주요 회사 및 제품을 나타내고, 뿐만 아니라 본 연구가 수행될 때 PhA의 수치가 가장 낮은 것으로 밝혀진 것들을 나타낸다. 이 제품들의 품질 및 공정은 대다수의 제조업체들의 경우 보장되고, 유럽 약전 및 미 식품의약국 FDA에 따른 영양 및 제약 우수의약품 제조 관리 기준(GMP)을 충실히 이행하고 있고, 영양학적 용도로 분명히 승인받고 있다. 이들은 특허 대상이고, 체계적으로 인간을 대상으로 연구되고 있다. 순도가 다른 DHA를 함유한 시중의 기름들은 PhA 함유량이 높고, DHA의 순도와 상관없이 상당히 다르다는 것을 알 수 있다.
도 4. 5μg/ml 미만의 DHA를 가진 증후군 없는 환자에게서 PhA의 수치 감소. 이 도표는 이전에는 5μg/g보다 많은 PhA를 함유하는 DHA로 치료했던, 5μg/g미만의 PhA를 함유하는 DHA를 갖는 RP 환자 11명(관련 증후군 없음)의 진전을 나타낸다. 이 도표에서, PhA 수치가 5μg/g보다 많은 DHA를 섭취했던 RP 환자들은 그들의 PhA 수치(TO)가 증가하였고, 5μg/g 미만의 PhA를 함유하는 DHA를 섭취할 때 PhA의 수치의 현저한 감소가 나타남이 드러날 수 있다. 이것은 5μg/g 미만의 PhA를 함유하는 DHA가 RP 환자의 치료제로서 안전함을 입증한다.
도 5. DSC(시차 주사 열량계)를 통한 PhA의 두 개의 부분입체 이성질체의 녹는점(MP)의 계산
DSC법은 샘플의 온도를 증가시키기 위해 필요한 열을 구분하는 열-분석 기법이다. 이 기법의 주요 기능은 녹는점(MP)과 같은 상 전이 또는 물리적 상태의 연구이다. 이 기법은 녹는점을 추산하는 데 큰 민감도를 나타낸다. 본 발명과 관련하여, PhA의 각각의 이성질체에 대해 두 가지 표준이 생성되었는데, 전 세계 시장에 쓸만한 표준이 없기 때문이다.
참치의 PhA는 정화되었다. 이 그래프는 본 발명의 방법에 따라 참치에서 얻은 DHA(700mg/g 초과)가 풍부한 기름으로부터 분리한 96.5% 초과의 PhA를 함유하는 샘플의 녹는점을 나타낸다. DSC가 수행되었고 두 개의 선명하게 구분된 피크가 측정되었다. 그렇게 하기 위해서, -50℃에서 결정화시키고, 분리된 두 상은 GC-MS에 의해 분석되었고, 그 결과 이들이 PhA의 두 가지 분획임을 나타내었다. DSC 기법은 한번 더 반복되었고 순수한 방식으로 분리된 상의 각각에 대해 단일 피크가 -45℃ 및 -65℃에서 나타났다. 결정분석을 통해, PhA 이성질체(3S)는 녹는점이 -45℃이고 PhA 이성질체(3R)는 녹는점이 -65℃임이 검증 및 확인되었다.
이런 방식에서, DSC에 의해, PhA의 두 가지 이성질체의 정량적 분석을 실행하기 위한 쉬운 방법이 개발되었다. 이로써 PhA 이성질체(3S)가 본 발명에서 PhA의 가장 효율적인 분리의 선택을 위해 평가될 수 있음을 검증하는 것이 가능해진다. 앞으로 DHA 및 오메가-3가 풍부한 기름의 여러 샘플들로부터 PhA를 분리하기 위한 다른 방법들이 제외되지 않는다.
본 발명에 기술된 바와 같이, 두 이성질체는 인간 건강에 서로 다른 생리적 병증을 나타낸다. 이 분석을 통한 이성질체의 측정값은 역학적, 임상적 및 영양학적 표지자일 것이고 암에서 AMACAR (3S와 관련되고 3R과는 관련 없음)와 같이 다른 분자 표지자의 작용 대 지배적인 이성질체(3R)로부터의 독성을 측정한다.
도 6. 밀도에 의한 분획 결정화(FCD): 오메가-3가 풍부한 미가공 기름의 밀도 평형 구배 또는 등밀도에서 분획. 분획(a) 초록색, 분획 (b) 파란색, 그리고 분획 (c) 오렌지색.
이 다이어그램은 기름이 등밀도 원심분리에 노출될 때 생성되는 지방산 분획의 형성을 나타낸다. 출발점에서 사용되는 기름의 최대 밀도에 상응하는 오메가-3 지방산(분획 c)이 회전축의 가장 멀리 있는 부분에서 분획되고, 한편 분획 a 와 b는 밀도가 더 낮고 회전축에 더 가까이 생성된다. 구배 그리고 분획 a와 b의 결정화는 오메가-3 지방산이 여전히 분획 c에 남아 있는 액체 상을 분리하는 것을 가능하게 한다 .
본 발명은 기름 1g 당 수치가 90μg미만인 피탄산을 함유하는 풍부한 오메가-3 지방산을 얻는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 해양 동물, 마이크로유기체 및 조류에 존재하는 오메가-3 지방산을 온도 구배를 통해 분리하는 방법을 제시하고, PhA와 포화 및 일가 불포화 지방산 그리고 액체상을 농축시키는 고체상을 형성할 때까지 추출물을 냉각시켜, 오메가-3 지방산, 바람직하기는 DHA를 반드시 PhA가 없이 농축시킨다. 기술된 방법은 천연에 존재하는 상당한 불포화 지방산을 얻고 정화하기 위해 사용될 수 있다.
오메가-3 지방산, 바람직하기는 DHA를 실질적으로 PhA 없이 얻기 위해 사용되는 기름은 발생할 수 있는 지방산 분해 또는 산화를 피하기 위해 가능한 한 신선한 것이 편리하다. 대부분의 생선(반드시 지방성 생선(oily fish)), 단세포 조류 배양 및 크릴 새우는 애초에 오메가-3의 주요 공급원으로 여겨진다. 그러나 오메가-3는 또한 다른 해양 공급원들(즉, 참치, 대구, 연어, 정어리, 붉은 생선, 고래, 바다표범, 상어, 비-단세포 조류 등), 박테리아 공급원 및 균류로부터 얻을 수 있다. 가장 값비싼 공급원은 미생물 기원의 것들(제어된 배양조직 및 배양조로부터 얻은 것)로, 이것은 해양 공급원과 함께 더 높은 수치의 PhA와 이소프레노이드를 함유한다. 아직 사용되지 않은 일부 종들(즉, 이원자 조류)은 PhA 생산자로서 큰 관심을 불러일으킬 것이고, 한편 간 기름은 프리스탄의 공급원으로서 큰 관심을 불러일으킬 것이다. 향후, 우리는 오메가-3 생산, 특히 DHA를 증가시키기 위한 공급원 재료로서 유전 조작 동물, 채소, 미생물 및/또는 균종으로부터의 기름을 사용할지 모른다. PhA 수치는 양식어 또는 자연산 생선 둘 다 높다.
본 발명의 주제인 방법은 여러 단계로 이루어지는데, 그들 중 몇몇 단계는 선택사항이다:
1. 예비 정제 (선택사항):
이 단계의 목표는 비검화된 지방의 제거이다. 미가공 어유와 같은 정제되지 않은 미가공 1차 재료에만 적용된다.
2. 트리글리세리드와 에스테르 가수분해:
이 단계의 목표는 기름으로부터 유리 지방산을 얻는 방법을 가능하게 하는 것이다.
가수분해는 a) 검화+가산분해 반응 또는 b) 리파제에 의한 가수분해가 될 수 있다.
검화 과정은 지방산염을 형성한다. 산성화는 비-분극 유리 지방산(산성화된 기름)의 상태를 형성하고, 극성 상태의 염은 반응기의 바닥을 열 때 제거될 것이다.
3.원심분리 (등밀도 또는 비-등밀도):
전 단계에서 얻은 산성화된 기름은 이 단계에서 글리세롤 구배에 의해 초원심분리가 수행된다. 원심분리는 등밀도일 수도 있고 또는 비-평형 밀도-구배에 의한 것일 수도 있다.
원심분리가 등밀도일 때, 글리세롤 구배를 사용하는 밀도-구배에 의한 분획 결정화가 수행되고, 이것은 평형으로 이어진다.
원심분리 후 온도가 급격히 감소되면, 0℃의 글리세롤 구배에서 분획 3개가 얻어진다: 2개는 고체로 하나는 포화 지방산을 함유하고; 다른 하나는 불포화 지방산과 PhA를 함유하지만, 제거되고; 그리고 세 번째 액체 분획은 다가 불포화 지방산을 함유하고 오메가-3 지방산을 65~99% 함유하고 DHA 수치는 65~85%이고, PhA는 90μg/g 미만이다.
온도는 24시간 동안 -30℃로 감소되고, 글리세롤 구배를 사용하여, 결국 2 상을 얻는다: 고체상은 포화 및 일가 불포화 지방산, PhA 그리고 글리세롤 구배를 함유하고; 액체상은 오메가-3 지방산 수치가 65~99%인 다가 불포화 지방산이고, DHA 수치는 65~85%이고 PhA는 5μg/g 미만이다.
원심분리가 비-등밀도이면, 2가지 분획이 생성될 때 글리세롤 구배를 사용하여, 온도가 -3O℃까지 급격히 감소한다: 고체 분획은 포화 및 일가 불포화 지방산과 PhA를 함유하고, 액체 분획은, 오메가-3 지방산 수치가 65~99%이고, 65~85%의 DHA에 90μg/g 미만의 PhA를 함유하는 다가 불포화 지방산을 함유한다.
4. 유리 지방산의 에스테르화 반응:
이 단계의 목적은 에스테르와 에틸-에스테르, 또는 트리글리세리드(첫 번째 최종 생성물)인 유리 지방산을 안정화시키는 것이다.
기름 정화 과정에서, PhA는 그 목적을 위해 특정 상태가 안정화되지 않는 한 분리되지 않는데, 그 이유는 PhA(C20)의 물리화학적 특성들이 긴-사슬 오메가-3 지방산(C>18)과 비교될 수 있기 때문이다: 용융점, 녹는점, 검화값, 요오드 지수, 물과 다른 용매에서의 용해도, 용매에 대한 극성, 광회전 등. 비교 연구로서, DHA와 PhA는 수소 결합 받개(2) 및 주개(2), 자유 회전 결합(14), 극성 표면적(26.3 A2), 25℃에서 물 용해도(0.001)가 동일하고, 몰 부피(347.0 대 354.8 cm3), 분자 중량(328.49 대 312.53), 증발의 엔탈피 (77.28 대 74.2 kj/mol), 분극도(41.97 IO-24 대 38.09 10-24), 굴절률(1.52 대 1.454)은 비교된다. PhA, PA, EPA, DHA, SDA는 모든 지방산 중에서 -40℃ 내지 -80℃인 가장 낮은 용융점(PF)을 갖는다.
유레아 복합체를 사용하여 포화 지방산의 검화 및 환원을 기반으로 포화 지방에서 스테아린의 검화 및 제거로 인한 생성물의 제거는 오메가-3 분획이 풍부한 기름에서 PhA의 농도를 증가시킨다. 정제된 어유에서, 모든 분석된 상황들은 PhA의 농도의 증가(>0.1%)를 드러냈고, 특정 방법에서만 고순도의 DHA(>700mg/g)를 얻고 처음 정제 및 정화 과정에서의 상기 증가가 감소된다(<0.1%)(도 3). 이것은 어유(즉, 최대 DHA가 200mg/g)로 수행되는 모든 정제 및 정화 단계에서 PhA가 제거되지 않고, 한편 PhA의 물리화학적 행동이 오메가-3에서 발견된 것과 상당히 견줄 만하다는 점(나머지 포화 지방산에 비교할 때와는 상황이 다름)을 고려할 때, 오메가-3의 농도의 증가는 PhA의 비례적 증가를 초래함을 시사한다.
유레아 복합물의 형성 및 이들 복합물들의 결정화에 대한 방법론적 변형은 특허를 받은 상태이고(WO1995/011216), 산업에서의 큰 응용 때문에 최적화되어 있고, 어유 정화 과정에 널리 사용되고 있다. 이와 같은 과정에서 유레아 복합물의 형성에서의 에탄올-유레아 반응은 에틸-카르바메이트 또는 우레탄(EC)의 형성 및 정화된 기름 내에 그것의 존재를 초래함이 입증된 바 있다. 150여 년 전 발견된 우레탄은 이미 알려진 발암물질 시약이고, 미 식품의약청 FDA에 의해 조사 중이며, 1980년 이래로 FDA 의원인 카나스와 우라베크즈가 에디토리얼에 명시한 대로, 환경유해 물질 목록에 포함되어 있다. 따라서, 본 발명은 현 탈취 및 정화 방법의 개선된 결과를 제공하고, 탈취(고온), 유레아를 사용한 정제 및 정화 방법과 같이, 분명히 PhA 제거에 부적합하고 권장되지 않는, 산업에서 바람직하지 않은, 그러나 자주 일어나는 방법의 사용을 막을 수 있다.
특허받은 냉각 정제 및 정화 방법은 보통 -5℃ 이상의 온도에서 사용되고, 일부 경우에는 수행 온도가 -2O℃까지 떨어지기도 했다. 그러나 이와 같이 포화 지방산을 분리하는 유용한 방법은 PhA에 적용될 수 없고, 그 이유는 EPA, DHA, PhA 및 PA는 용융점(PF)이 각각 대략 -54℃, -43℃, -65℃ 및 -8O℃이라서, PhA가 오메가-3 분획에 농축되기 때문이다.
PhA 및 PA는 어유에서 발견되는 트리글리세리드의 일부분으로 오메가-3 지방산과 비교된다. 요즘은 효소 가수분해 방법이 자주 사용되고; 오메가-3 지방산 및 특히 DHA를 농축시키는 것은 선택적인 에스테르화 반응이다. PhA의 생물학적 특징에서, PhA는 DHA 및 다른 PUFA(들)에서 발견된 바와 같이 트리글리세리드 및 인지질의 두 번째 탄소에 위치하는 경향이 있음이 오래전에 입증되었고; PhA와 DHA 그리고 다른 오메가-3 지방산은 검화 및 효소 가수분해에 동일한 저항력을 갖는다는 것 또한 잘 알려져 있다. 췌장 리파제는 긴-사슬 지방산보다 짧은-사슬 지방산을 더 빨리 가수분해시키고, 한편 PhA, PA, DHA 및 EPA는 아주 천천히 작용하여, 지방분해에 저항한다(Brockerhoff, 1970; Ellingboe & Steinberg, 1972). 이와 같은 저항은 DHA 및 PhA에서 발견되는 것과 비교할 만하고(Nus et al, 2006), 이것은 PhA, PA, DHA 및 EPA의 비교할 만한 스테아르산 효과 때문이다(Faber, 2004 y Bottino- NR et ai., 1967). 더욱이, 효소법의 사용은, 다른 방법들이 그렇듯이, PhA 수치를 증가시킨다. 완전한 가수분해 및 비특이적 리파제와 같은 방법은 PhA 수치의 변화 없이 고체의 경우 검화 및 촉매사용 가수분해만큼 효능이 있다.
이와 같은 이유로, 기름 조성의 변형 없이 또는 정제법을 통해 오메가-3 및 DHA를 포함한 기름에 있는 PhA를 분리하는 법은 없고, 그렇기 때문에 PhA를 분리하기 위한 특이적 방법이 요구된다.
도 3은 실제로 순수한 DHA(>700mg/g)를 얻기 위한 방법들이 본 발명의 목적에 효능이 없는 변형들을 낳는다는 것을 나타낸다. 크로마토그래프를 이용한 방법은 아마도 최고의 선택일 것이고, 비록 그것이 PhA를 분리하기 위한 특이적 방법이 아니라고 해도, 이것은 실제 순수한 DHA를 얻기 위한 진정한 방법이다. 크로마토그래피에 의한 이전의 산업적 분리 방법들은 합당한 비용으로 PhA 및 PA를 분리할 만큼 민감하지 않아서, 분자수준의 증류에서 발생하듯이, 고온의 사용으로 인해 벤조(a)피렌의 수치를 증가시킬 더 큰 위험이 있어서, 본 발명에 필요한 범위를 벗어난 수치가 측정되었다. 가장 주목할 만한 크로마토그래프 방법(즉, SFC)은 극성 및 스테아르 효과(stearic effects)에 기초한다. 강도 흡수는 극성, 세척시간 및 분자 작용기의 성질들뿐만 아니라, 스테아르 요인들에 의해서도 좌우된다. 앞서 명시된 바와 같이, PhA 및 DHA는 스테아르 작용, 분자량 등이 EPA와 다른 지방산보다 DHA에 좀 더 가깝다. PhA의 낮은 농도를 감안할 때 그리고 DHA의 모든 정제 과정에서 EPA 역시 상당량 증가한다는 점을 고려할 때, PhA 또한 부적절하게 존재하고, 여기서 몇몇 경우에, 그것의 존재가 모든 참치 기름 중의 높은 수치에 도달하여 700mg/g을 함유하고 자주 400μg/g의 수치가 측정되는가 하면, 다른 한편으로는 특허받은 다른 방법들에서는 1500μg/g (>0.1%) 이상의 수치가 측정될 수 있고, 이것은 미가공 생선(참치)에서 발견된 것보다 더 높은 PhA 수치임을 밝히는 분석을 얻어도 전혀 놀랍지 않다.
종래의 크로마토그래피 분석 등급의 연구들에서 발견된 낮은 농도의 PhA (<0.1%)를 고려할 때, PhA와 PA는 측정되지 않는다. 따라서, PhA의 구체적인 검출을 위해 크로마토그래피 기법(GC)을 훨씬 더 높은 감도로 조절할 필요가 있다.
PhA와 DHA의 물리화학적 특성들을 감안할 때, PhA를 감소시키기 위해 매우 값비싼 비용으로 상기 기법을 상당한 고순도 수치로 조절하는 것이 필요할 것이다. 이와 같은 접근법으로부터, 그리고 요구되는 비용과 산업적 기술을 가지고, DHA는 실험실 크로마토그래피 기법 및 분자 증류로부터, 어유(구체적으로는 참치의 어유인데, 이것이 가장 높은 농도 수치를 제공하기 때문이다)에서 830mg/g을 얻을 때까지 정화되었고, 한편 PhA 수치는 산술적 평균 57μg/g이 측정되었고, 높은 변동성(+31μg/g)을 나타냈다. 이로써, 특정 산업적 DHA 정화 방법들은 어유에 존재하는 PhA를 제거하기에 효율적이지 않다.
고순도의 DHA를 갖는 기름의 소비와 낮은 함량의 PhA를 갖는 기름의 소비 사이에는 간접적인 관계가 있는데, 근본적으로 순도가 더 낮은 기름에서 더 많은 양의 기름을 취해 동일한 DHA 양을 얻는 것에 존재하는 기하학적 인자(geometric factor) 때문이다. 이것을 제외하고, 고순도 상업용 제품들은 PhA 수치에 어떤 감소도 제공하지 않는다. DHA 및 오메가-3 지방산의 정제 또는 정화에 사용되는 방법들 사이의 차이점은, 모든 방법들이 원하는 수치보다 더 높은 수치의 농도를 제공하지만, 현저히 다르다(도 3).
본 발명에 관하여, PhA의 분리를 위한 구체적인 방법이 개발된 바 있고, 이방법은 모든 순도 수치의 DHA를 함유하고 그리고/또는 서로 다른 오메가-3 조성물들을 함유하는 기름을 얻어, PhA의 수치가 아주 낮거나 또는 PhA가 없이(검출 한계: 5μg/ml) DHA 및 오메가-3가 풍부한 기름을 얻기 위해, 초기 단계들, 즉 정제 단계에서 수행되어야 한다. 따라서, 이 방법은 모든 산업 공정에 맞게 그리고 서로 다른 순도를 갖는 제품들에 알맞게 조절될 수 있다.
본 발명은 또한 PhA가 적은 기름 또는 PhA가 없는 기름을 얻기 위해 하나 이상의 지방산을 정화하거나 또는 기름의 자연적 조성을 변형할 필요가 더 이상 없음을 시사한다. 이것은 식품 또는 건강의 목적으로 오메가-3 지방산 천연 혼합물들을 사용할 때, 상당히 의미가 있다. 이것은 오메가-3 지방산에 대한 탈취 및 정화 공정들이 더 이상 필요 없어서, 현재 수행되는 방법들보다 덜 위험한 영양 및 약제학적 등급을 얻기 때문에 수익성 있는 방법이다.
본 발명은, 생선, 조류 또는 기타 마이크로유기체와 같이 오메가-3가 풍부하고 PhA 수치가 낮거나 또는 0인 공급원들로부터 DHA, EPA 또는 기타 오메가-3 지방산의 대규모 산업적 생산을 위해, PhA를 5μg/g보다 많이 함유하고 오메가-3 지방산의 에스테르가 풍부한 모든 기름에서 발견되는 PhA를 물리적으로 분리하기 위한 구체적인 방법을 가리킨다.
이와 같은 방법은 결정화를 사용하여 상기 기름의 물리적 상태에 변화를 획득하고, PhA 및 PA를 액체 상태로 유지시키는데, 이들이 DHA 및 오메가-3 지방산, 또는 다른 기타 지방산보다 현저히 낮은 녹는점을 갖기 때문이다.
Figure 112011089733400-pct00001
이 방법은, 구체적으로 독성이 없고 트랜스지방산을 형성할 위험이 더 낮은 것으로 보고되었고 약제학적 또는 영양학적 등급을 얻기에 충분한 생선 중의 기름의 생산 연쇄 반응의 출발점에서 PhA를 제거한다는 점에서 흥미로운 방법이다. 본 발명은 현 기술에 상당히 적응될 수 있는 방법에 관한 것으로, 특히 약제학적 및 영양학적 기술들에 관한 것이고, 이것은 냉 기술(cold technology)이 이미 양쪽 산업 모두에서 사용되고 있기 때문이다. 오메가-3가 풍부한 기름에서의 압력 증가로 녹는점과 그것의 에너지 비용을 감소시키는 것은, PUFA(들) 및 DHA가 수소화 반응에 민감하기에, 선택사항이 아니다.
다른 한편으로, 이 방법은 PhA의 분리를 위해 사용되는 동시대 산업 기술과 함께, 다른 어떤 추가적 정화 공정을 추가하지 않고, 녹는점이 아주 낮은 DHA, EPA 및 다른 지방산의 순도의 상승을 허용한다. 이것은 또한 주로 생선에 대한, DHA 및 오메가-3 지방산 정화 방법이다.
본 발명은 모든 오메가-3 비율을 갖는 비-정제 및 정제 기름에 관한 것이고, 그리고 모든 종류의 오메가-3 지방산, 바람직하기는 DHA에서, 또는 총 오메가-3 함량에서 고순도를 얻기 위해 정화를 거치는 기름에 관한 것이다. 이와 같은 목표를 위해, 우리는 모든 종류의 에스테르, 원칙적으로는 트리글리세리드, 인지질 및 에틸-에스테르를 함유하는 지방 또는 기름을 기초로 할 수 있다.
주요 목적은 오메가-3 기름, 바람직하기는 DHA를 함유하고 고순도(>700mg/g)이며 PhA 수치가 낮거나(< 5μg/g) 또는 0인 기름을 얻는 것으로, 바람직하기는 더 높은 순도, 안정도 및 생체이용률을 얻고, 에탄올과 같이 잠재적 상호성 등급이 있는 비-영양 성분들(이것의 식품으로서의 사용은 특히 임산부 및 아이들에게서는 피해야 하는 것이지만 다른 한편으로는 더 요구되고 더 사용되는 대중 영역이다)을 첨가할 필요 없는, 트리글리세리드가 풍부한 에스테르와 연관된다. 유리 지방산은 경구 사용에는 상당히 불안정하고, 주사 가능 물질로의 사용은 이득을 가져올 수 있다(즉, 안구내 주사). 본 발명의 활성 성분들이 오메가-3 지방산, 특히 DHA라는 점을 감안할 때, 그리고 치료용의 경우 필요 용량이 너무 높다는 점을 감안할 때, 활성 성분들의 더 높은 농도를 허용하는 DHA 중의 에스테르인 트리글리세리드가 최상의 선택이라 여겨진다. 에틸-에스테르의 경구 섭취는 문제가 있고, 한편 식단을 통한 천연 지방산 섭취는 트리글리세리드로부터 얻는다. 일상의 식단은 100g 이상의 트리글리세리드의 천연 섭취를 수반하고, 이것은 생리적 및 약동학적 관점에서 DHA가 포유류에게 가장 효율적인 섭취물임을 입증한다.
에틸-DHA는 인간 및 자연에서 사용되지 않는 화학식이고, 한편 트리글리세리드의 화학식은 생물효율성이 훨씬 더 크고 에틸-에스테르 유형과 관련된 단점들 및 부차적 효과가 없다. 에틸-에스테르로서 DHA는 덜 효율적이라서, 이것은 생리적으로 산화에 좀 더 민감하고, 이것은 식품이 아니고(알코올을 함유한다), 살아 있는 유기체 중에 어떤 식단의 일부분을 형성하지 않고, 이것의 사용은 제한되고(식품으로 불충분), 이것은 다른 지방산들과 간섭하여 다른 에틸-에스테르의 생성을 증가시키고, 다른 약물 및 식품(즉, 커피)과 간섭하여 인구의 유의미한 일부에게서 내성을 일으키고, 이것은 알코올 섭취물의 유형이고 에탄올의 비-산화 대사 산물이기 때문에 부차적 영향(secondary effects)(간 독성 및 췌장염)이 있다. 본 문서는 DHA의 트리글리세리드 형태를 오메가-3의 공급원만큼 안전하고, 건강에 좋고, 가장 효율적인 약물이라고 명시하고, 반면 에틸-에스테르는 트리글리세리드로서 DHA 및 EPA를 얻기 위한 중간 물질이다.
본 제품의 주요 용도는 더 건강에 좋고 DHA가 풍부한 약물, 보충제 또는 식품을 얻는 것으로, 이들은 더 큰 생리적 작용을 제공하고, DHA와 관련이 없는 상호성의 간섭이 없고, 체내 산화 용량이 더 적고, 공공보건에 대하여 PhA 관련하여 독성이 적고 위험률이 0이다. 수없이 많은 최근의 분자 차원의 증거들과 임상 전 및 역학적 연구들에 따르면, PhA는 식단에 제공되지만 비-영양적 물질이고, 이것은 건강에 치명적인 위험들 중 하나를 수반한다.
PhA를 분리하는 이 방법은 상당히 효과적인 탈취 방법이다. 이것을 수행할 때, 중금속을 제거하는 관점에서, 어유를 흙 또는 활성화된 탄소로 처리하면 충분할 것이고, 다른 가열 또는 탈취 방법은 피한다. 본 발명은 PhA 및 PA의 제거뿐만 아니라 특징적인 냄새를 일으키는 휘발성 입자들의 효율적인 제거 역시 수반하고, 또한 상기 기름에 해를 끼칠 수 있는 모든 공정(고온)을 방지하고, 특정 공정이 추가되지 않으므로 비용을 감소시킨다.
본 PhA의 분리 방법에 따라 수행되는 기름 탈취 기반(base)은 하기와 관련된다:
a) 녹는점(MP)이 매우 높고 실온에서 고체 상태인 단백질의 분해. 단백질은 고체 분획 또는 미가공 어유에서 스테아린으로 분리된다.
b) 생선에서 악취를 발생시키는 휘발성 물질은 녹는점(MP)이 매우 낮다는 사실 때문이다. 헵타디에날, 옥타디엔, 옥텐, 헵테날, 데카트리에날 및 특히 디메틸아민 및 트리메틸아민과 같은 물질들은 용융점(PF)이 각각 -92℃ 및 -117℃이다.
기름의 냉각 및 고체화 과정 중에, 상기 물질들은 분리될 예정인 액체 분획 중 일부일 수 있고, 그리고 그것은 PhA 및 다른 알켄들과 함께 이와 같은 휘발성 물질들과 PhA의 수치가 낮은 알코올을 함유한다. 탈취는 가열이 아닌 냉각법에 의해 수행되고, 다른 종류의 정화 방법은 필요 없다. 본 발명은 다가 불포화 지방산을 변형시킬 위험을 증가시키는 탈취를 위한 모든 종래의 방법(고온)을 수행할 필요 없이 정화되지 않은 정제유를 얻는 것을 허용한다.
PhA는 적은 양의 유리기 형태로 검출되는 트리글리세리드 (약 >80%) 및 다른 에스테르에 근본적으로 존재하고, PUFA 지방산과 마찬가지로, 그들의 비교할 만한 물리화학적 특성들 때문에 기름의 트리글리세리드 및 인지질 둘 다의 같은 위치(C-2)에 모습을 드러낸다. PhA 추출은, DHA 및 오메가-3의 정화의 전 과정에서와 마찬가지로, 혼합물에 따라 서로 다른 녹는점(MP)을 갖는 3가지 지방산을 함유하는 트리글리세리드로부터 직접 수행될 수 없다. 이때, 지방산은 트랜스에스테르화 반응(촉매)을 통해 유리 지방산을 형성하여 가수분해(촉매)를 통해 알코올로부터 에스테르를 형성하여 유리산을 얻기 위해, 기름 또는 지방의 일부인 트리글리세리드의 가수분해에 의해 이전에 얻어야 한다. 하기의 두 가지 상황이 발생할 수 있다:
트랜스에스테르화 반응 및 지방산의 에스테르(즉, 에탄올) 형성:
그러나, 촉매 트랜스에스테르화 반응으로부터 얻은 알코올 에스테르(즉, 에탄올)로부터 수행될 수 있지만, 지방산의 녹는점(MP)은 약 >20℃로 상당히 축소되고, 알코올 유형에 따라 달라진다(표 1). 이와 같은 사실은 기름을 DHA로 고체화하기 위해 온도가 지방산이 유리되는 경우보다 더 낮은 2O℃로 감소되어야 하기 때문에 더 높은 에너지 비용을 수반한다.
유리 지방산을 얻기 위한 촉매 가수분해: (즉, 검화+ 산성화)
촉매 가수분해는 기반으로서 널리 개발되고 현 산업에서 사용되고 있는 종래의 모든 방법을 취해 어유에 상당히 적용되는 방법이다. 영양학적 또는 약제학적 등급의 유기산은, 아세트산과 같은 촉매로서, 또는 이온 교환 수지(스티렌 수지)와 같은 고체 촉매, 또는 리파제에 의한 효소 촉매반응(즉, Novozyme 435)(고정화 또는 용액 중)으로서 역할을 할 것이다.
어유에는 콜레스테롤, PCBs, A 및 D, 비타민 등을 함유한 비-검화 지방이 있고, 이것은 영양학적 또는 약제학적 등급을 얻기 위한 목적으로, DHA 또는 오메가-3가 풍부한 기름으로부터 제거되어야 한다. 정제 공정 중에 비-검화 지방(스테아린)을 분리하기 위해 널리 사용되고, 비용-효과적이고 효율적인 방법은 다가 불포화 지방산의 변형을 피하기 위해 불활성 대기에서 그리고 저온에서, 적정 알칼린 매개체 중의 어유의 검화에 의한 온전한 가수분해이다. 이런 방식으로, 정제 공정에 필요한 가수분해는 본 발명에서 PhA의 분리를 진행하는 데 유용하다.
이 때문에, 본 발명은 액체 기름을 얻기 위해, 그리고 가수분해에 유리하게하기 위해, 지방산의 온전한 가수분해 및 검화까지, 저온(즉, 4O~9O℃)에서 적정 알칼린 매개체(즉, 수산화칼륨 또는 수산화나트륨)에서 어유 중에 발견되는 트리글리세리드 및 에스테르의 가수분해로부터 개시되었다.
생성된 혼합물은, 지방산의 녹는점(MP)을 변형하므로, 본 발명에 기술된 방법에 적합하지 않은 지방산의 염(칼륨 또는 나트륨)을 함유하는데, 그래서 산성화 또는 촉매 가수분해가 비-산화 유기산(즉, 아세트산)의 사용에 의해 수행되고, 유리산 형태의 지방산을 얻기 위해 격렬히 교반된 혼합물에 첨가한다.
유리 지방산을 분리하기 위해 기름상의 증류물을, 그리고 유리 PUFA 지방산에 어떤 손상을 피하기 위해 불활성 대기를 진공으로 빨아들이는 것(즉, 2 mmHg)이 가능하다. 그러나, 이와 같은 방법은 상층액 분리(decantation) 및 원심분리에 의해, 스테아린과 비-검화 지방을 함유하는 고체상의 분리를 촉진하고, 반복적인 세척에 의해 아세테이트 나트륨 또는 아세테이트 칼륨을 함유하는 산성화된 기름을 함유하는 액체상의 분리를 촉진시킨다. 이것은 글리세롤 보존을 보장한다.
글리세롤은 영양학적 또는 약제학적 등급의 용매들보다 더 안전하고, 그래서 생성물의 시작 단계 및 최종 단계 모두에서 그것의 필요한 존재를 고려할 때 훨씬 쉬운 방법을 수반한다. 그러나 가장 주목할 만한 면은 글리세롤이 밀도 구배 분리를 허용한다는 점인데, 이것은 다른 화학 물질들(즉, 유레아)을 대상으로 현재 사용되는 분획법보다 훨씬 더 효율적으로 결정화를 촉진시켜, 포화 지방산과 일가 불포화 지방산을 분획하고 특히 PhA 및 오메가-3을 분리한다.
산성화된 기름 중의 글리세롤은 가장 안전한 동결방지용 물질이자 양호한 습윤제(humectant)라서, PhA 분리상 중의 포화 지방산의 결정화를 촉진한다. 게다가, 본 발명은 산성화된 기름에 글리세롤을 첨가하여 밀도 구배 분획을 촉진하고, 또한 이것은 원심분리 구배에 의한 분획뿐만 아니라 결정화를 촉진하는 데도 일조한다.
본 발명에서 사용된 밀도 구배 원심분리의 경우, 하기의 특정한 특성들을 갖는 구배를 필요로 한다: 저분자량(원심분리 시간 단축), 낮은 점도, 용질(지방산)보다 높은 밀도, 자외선 아래서의 투명성 및 양호한 용매 성질들. 밀도가 높은 글리세롤(1.25g/cm3)은 오메가-3 기름에 풍부한 것으로 밝혀진 지방산에서 검출된 바와 같이 1.15 g/cm3까지 밀도 구배 분획 또는 분자 쪼개기를 하기 위한 매개체로 작용한다. 글리세롤은 물 또는 다른 용매와 혼합되어, 그것의 공융점(즉, 물에 65%로 글리세롤을 용해하면 녹는점(MP)이 +18℃에서 -47℃로 감소된다)을 현저히 감소시키고, 이로써 글리세롤은 결정화 과정 중에 액체 상태로 존재한다. 용매의 작은 분획 중의 글리세롤은 점도의 감소를 허용하고(표 2), 등밀도 원심분리에서 이상적인 구배로 작용한다. 또한 점도는, 특히 본 발명의 냉각 단계에서, 온도를 증가시킴으로써 감소될 수 있다. 이것은 밀도 구배 및 결정화에 의해 지방산의 원심분리로 인한 분획에 이상적인 구배이다.
이와 같은 기름의 함량에 핵심인 지방산 조성물은 분자량에서는 현저한 차이를 보이지 않고 밀도에서 차이를 보인다(지방산의 3가지 분획). 이것의 녹는점(MP)은 유사하게 행동하여, 이와 같은 지방산의 결정화를 녹는점(MP)에 근접하게 상당히 최적화한다. 밀도 구배에 의한 두 가지 원심분리 기법(속도침강 또는 등밀도) 중에, 본 실험에 가장 적합한 기법은 등밀도법으로, 이것이 밀도에 따른 분획을 초래하는데, 속도침강법에 필요한 PhA (312.53g/몰), DHA(328.5g/몰) 및 EPA(302.4g/몰) 사이의 분자량의 현저한 차이가 존재하지 않기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 속도침강법은 포화 및 일가 불포화 오메가-3 지방산을 분리하기 위해 그리고 DHA와 EPA를 분리하기 위한 본 기법의 한계(8%)에서 사용될 수 있다(그러나 본 발명에서, 이들은 10% 미만의 분자량 차이를 갖는 다른 분자들과 동일한 방식으로 분리되었다)(Fuentes-Arderiu et al., 1998).
본 발명에서, 주요 기름 분획들(포화 및 일가 불포화 지방산 그리고 오메가-3)에 상응하는 밀도에 따른 분획 3가지를 형성하기 위해 결정화에 앞서 밀도 구배 분획이 수행된다. 이로써 기름의 지방산 혼합물의 분획과 공융점의 수정을 야기할 것이고, 이것은 그들의 녹는점에 따라 분획의 고체화를 높은 비율로 최적화한다. 이 방법은 또한 어떤 용매의 사용 없이 오메가-3으로부터 PhA를 분리할 때 최적의 방법이다.
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밀도 구배를 사용하여 그들의 다른 유형들에 따른 분획 결정화에 의한 PhA와 순도 높은 오메가-3 지방산의 분리.
기름에서 발견된 지방산의 분리법은 특히 실시하기 복잡한데, 특히 지방산들이 분리법에 필수인 물리화학적 성질들(증류, 결정화, 용매로 추출 또는 크로마토그래피)을 공유할 때 그러하다.
분획 결정화는 온도 변화들의 측면에서 용해도가 서로 다른 여러 물질들을 분리하기 위한 방법이다. 분획 결정화의 기본이 이와 같은 물리화학적 특성에 기인한다는 사실에도 불구하고, 사실상 분획 결정화는 둘 이상의 화학적 화합물을 그들의 서로 다른 녹는점에 따라 분리하는 것으로 이루어진다.
본 발명에서 제안된 방법은 전에 기술된 바 없는데, 이것이 둘 이상의 구성성분들을 분리하고, 이들을 온도 변화에 따라, 용해도가 아닌 밀도의 측면에서 분획할 수 있기 때문이다. 이 때문에, 본 발명은 밀도에 의한 명명된 분획 결정화(FCD)이다.
기술된 본 방법은 하기 성분들을 분리하기 위해 사용될 수 있다: a) 공유 조성물 다이어그램의 변형을 가져오는 복잡한 상호작용과 관련하여 유사한 특징들을 갖는 구성 성분들 또는 b) 용해도가 서로 다르고, 그러나 모든 구성성분들이 온도 변화 또는 증가에 상당히 민감한 이질적 조성물들 중의 구성성분들. 본 발명은 구체적으로 특정 기름 균질 조성물의 둘 이상의 조성물로의 분리를 명시하고, 냉각법을 적용하고 분획 결정화에 의한 분리에 의해 그들의 공융점을 변화시키고 온도 변화를 초래한다. 주요 목적은 포화 및 일가 불포화 지방산 그리고 PhA로 구성된 분획을 분리하는 것인데, 이 분획은 오메가-3 지방산을 함유하는 분획보다 더 높은 공융점을 함유한다.
결정화 및 밀도는 오메가-3 지방산, PhA 및 포화 지방산을 분리할 때 가장 차별적인 특징임이 밝혀졌다. 본 발명은 포화 및 일가 불포화 지방산과 같이 밀도가 더 낮은 지방산을 고함량 함유하고 밀도가 더 높은 오메가-3 지방산의 PhA를 함유하는 지방산 또는 미셀(micelles)(구배의 지용성(liposolubility)에 따라)의 분획들의 분리를 가능하게 한다. 이와 같은 두 조성물들은, 순수할 수도 그렇지 않을 수도 있는데(서로 다른 지방산의 혼합물인 경우), 어떤 경우이든지 녹는점과 지방산의 개별적인 조성물의 농도와 관련하여 서로 다른 공융점을 갖는다; 서로 다른 조성물의 두 분획들은 분획 결정화에 의해 분리될 수 있다.
이와 같은 방법은 또한 특히 심지어 유사한 물질들을, 그들의 밀도에 따라, 분획 결정화에 의해 분리하는 데 효율적이다. 이것은 구성성분 중 하나인 농도 수치가 낮은 PhA(3S)가 (DHA)구성성분/들과 유사한 MP를 갖는 본 발명의 구체적인 사례이다. 본 발명에서, 등밀도 또는 비-등밀도에 의한 초원심분리가 적용될 수 있다. 순도가 높은 DHA를 얻기 위해 일반적으로 사용되는 용매의 적용은 본 발명의 방법에 요구되지 않는다.
선택 1 : 등밀도 밀도- 구배 초원심분리에 의한 분획 결정화
원심분리는 유리 지방산과 지방을 분리하기 위해 용매를 사용하지 않기 때문에, 화학 생성물에서 90%이상 비용 효율적이고, 인력업무부하 측면에서 70%, 60% 더 빠르고 더 생태적임이 입증된 바 있다(Feng et al., 2004). 원심분리 및 동결은 식품 산업에서 널리 사용된다. 본 발명에서, 용매가 있든 없든 오메가-3 지방산과 PhA의 분리 및 결정화를 촉진하는 것은 가능하다. 제약 업계에서는 대규모로 초원심분리가 폭넓게 사용된다. 초원심분리는 결정화 이전에 서로 다른 지방산 분획들의 분리를 허용한다는 점이 주목되어야 한다.
거대분자의 분리를 위한 원심분리의 사용은 잘 알려져 있지만, 분자량이 유사하고 밀도가 다른 지방산과 같이 아주 작은 분자들을 분리하기 위해서는 사용된 적이 없다. 피콜(Ficoll) 밀도 구배 초원심분리에 의해, 지방산과 견줄 만한 분자량을 가진 지용성 화합물 DDT의 99%가 분리된 바 있다(Adamich et al., 1974). 본 발명에서, 분자량이 유사한 지방산들(300달턴)은 등밀도 밀도 구배 초원심분리에 의해 분획된다.
유리 지방산을 함유하는 산성화된 기름이 본 발명의 특이상에 사용될 것이다: 오메가-3가 풍부한 기름으로부터 PhA 분리. 이 방법에서, 기름의 물리적 상태는 기름 그 자체의 결정화에 의해 변화되고, 오메가-3 지방산(즉, DHA)을 함유하고, 액체 상태에서 PhA와 PA를 보존하고, 그리고 DHA, EPA, PhA(3S)의 분획들의 결정화로부터 PhA와 PA를 구체적으로 분리한다. 이 기법은 PhA 없는(<5μg/g) 고순도(>95% 및>99%)의 DHA와 EPA 또는 영양학적 또는 약제학적 등급(>850 mg/g)의 트리글리세리드의 획득을 가능하게 한다. 오메가-3 지방산의 값비싼 손실 또한 피할 수 있다.
지방산은 자동-핵생성(auto-nucleation)의 특성을 갖고, 과융합(overfusion)의 성질은 갖지 않는다. 녹는점(MP)과 어는점이 동일하다. 이 때문에 PhA 없는 오메가-3 지방산의 정화를 수행하기 위해서는 상기 정화 방법을 가능하게 하는 서로 다른 공융점들을 갖는 둘 이상의 분획들을 얻는 것으로 충분할 것이다.
포화 지방산은 MP가 높은 반면(>18℃), 일가 불포화 지방산은 MP가 >13℃이다. 게다가, 산성화된 원유 중에 포화 및 일가 불포화 지방산 형태의 조성물은 50%를 넘고(조류 기원의 기름의 경우) 그리고 종종 70%의 수치에 도달한다(어유의 경우). 그러나, 오메가-3 지방산 종들의 많은 양과 존재는 공융점을 현저하게 감소시키고, 이것은 -2O℃와 같은 매우 낮은 온도에서 비효과적인 냉각 결정화 방법을 야기한다.
한편, 표1에 나타난 바와 같이, PhA의 MP는 2O℃를 초과하고 DHA와 EPA보다 각각 2O℃ 더 높고 10℃ 더 낮다. 하지만, 특정 기름(즉, 어유)에 존재하는 PhA 이성질체는 PhA(3S)와 DHA 사이에 존재하는 차이를 약 2℃ 감소시킨다.
기름이 분획을 위해 유사한 용해도를 갖는 구성성분들 또는 지방산을 결정화하기 위한 조건들을 충족시키지 못한다는 점을 감안할 때, 밀도에 의한 분획 결정화에 의한 이전의 지방산 분획이 수행된다. 그렇기 때문에 본 발명으로, 탈취법은 오메가-3을 함유한 기름의 정화 및 DHA와 오메가-3의 분획 결정화와 마찬가지로 최적화된다.
이와 같은 목적을 위해, 밀도-구배 또는 등밀도 자동형성-구배에 의한 분획 원심분리가 처음에 수행된다. 이것은 실험실에서뿐만 아니라 반드시 제약 업계에서 다른 응용들 중에서 단백질을 정화 및 분리하여 백신을 생성하기 위해, 분자량이 유사하나 밀도가 다른 분자들을 분리하는 기법이다.
이 기법에서, 기름은 원심력 하에서 등용매 용액에 용해되고, 지방산은 분자량이 아닌 밀도에 따라 구배를 형성하는데, 이것은 지방산이 원심분리 중에 반응기에서 분산되기 때문이다. 주요 전제는 최대 구배(즉, 글리세롤) 밀도가 항상 지방산 밀도를 초과해야 한다는 것이다.
밀도-구배에 의한 원심분리는 지방산이 그들의 밀도와 구배의 밀도가 동일한 지점(등밀도)에 도달할 때까지 구배를 따라 움직이는 것을 허용한다. 바로 이 순간에, 종래의 분리가 아주 조심스럽게 일어나야하듯이 그리고 오메가-3 기름의 원치 않는 오염을 야기하듯이 결정화 분리가 일어날 것이다.
부분적으로 무극성인 용매(즉, 헵타놀)를 함유하는 구배는 균질 기름 구배 혼합물을 생성하여 미셀의 형성 없이 개개의 지방산들을 분리하는데 도움이 되도록 사용될 수 있다. 이런 방식으로, 유리 지방산의 분산이 일어나고, 오메가-3 지방산 중에 PhA가 없거나 손실된 좀 더 순수한 분획을 얻는다. 하지만, 여기에는 두 가지 어려움이 존재한다: 최종 생성물에서 구배의 분리 그리고 유리 지방산의 분자 차원의 분리는 더 긴 초원심분리 시간이 필요하다는 사실. 첫 번째 이유 때문에, 구배의 정상적인 조건들 중 하나는 그것의 수용성(water-solubility)이다. 지용성 구배를 사용할 경우, 모든 과정 후 최종 과정 중에 분리될 수 있는데, 분리될 분획과 차이가 나는 MP를 가질 경우에 가능하다.
본 발명을 위해 사용되는 구배는 글리세롤이고, 이것은 본 과정 중에 생성되기에, 영양학적 및 약제학적 용도로 값싸고 안전하며, 이 목적을 위해 다른 구배(즉, 수크로오스)를 폐기하지 않는데, 구배의 높은 점도는 두 경우 모두 가장 큰 불편함이다. 구배로 글리세롤을 사용할 때, 이것은 초원심분리 동안 1O℃에서 또는 글리세롤의 MP(18℃) 아래에서 동결되어야 한다. 하지만, 이것은 물과 다른 용매와 용해되는 과냉각액으로서 행동한다.
본 발명에서, 구배의 점도를 감소시키고 MP를 낮추기 위해 글리세롤과의 여러 용매 혼합물들이 사용된다. 특히, 결정화를 촉진하기 위해, 그러나 무엇보다도 구배의 공융점과 점도를 감소시키기 위한 용매의 사용이다. 글리세롤/물 혼합물, 이소프로파놀 또는 기타 알코올들과 같이, 높은 영양학적 및 약제학적 등급의 용매의 사용은 권장할 만하나 거기에 제한되지는 않는다. 글리세롤/물 혼합물 및 아세톤과 같은 용매들은 지방산, 특히 본 발명에서 요구되는 온도에서(MP가 매우 낮기 때문에(-95℃)), 지방산의 결정화를 촉진하는 용매로서 양극성 및 습윤성의 행동을 상당히 보인다.
가장 적합한 글리세롤 혼합물은 글리세롤이 점도를 감소시키고, MP를 적당히 감소시키고 점도를 현저히 감소시키도록 하는 것들이다. 구배의 점도의 감소는 PhA를 좀 더 효율적으로 분리하기 위해 분획의 분해(resolution)와 평형에 걸리는 시간에 필수요소이다. 글리세롤/물 혼합물에 있어서, 이상적인 비율은 과냉각 또는 과동결 액체의 형성을 허용하고 그것의 MP를 현저하게 감소시키는 비율이다: MP가 -47℃인 글리세롤 67%. 이로써, 밀도는 감소되고, 밀도 구배에 의한 원심분리시간은 상당히 단축되고, 값싸고 안전한 결과가 야기된다.
적은 양의 용매를 사용하고, DHA(>0.95g/cm3) 미만으로의 밀도의 하락을 방지하는 다른 글리세롤 혼합물의 사용이 또한 가능해서, 이것은 구배로 사용되어, 미셀의 분산을 위한 짧은-사슬 극성 용매(C1~C5)로서, 바람직하기는 유리 지방산의 분산을 허용하는 중간길이-사슬 부분 극성 구배(C6~C8)를 얻기 위한 용매로서, 알코올처럼 작용한다. 이와 같은 알코올 중의 글리세롤 부분은 반드시 밀도가 더 높고 MP가 낮아야 한다. 5~50%의 글리세롤은 초원심분리 동안 온도의 범위에서 이와 반비례로 MP의 감소를 허용하고, 이로써 밀도와 점도를 상당히 감소시키지만 항상, >1g/cm3이 본 발명에 필요하다. 본 발명의 경우, 25% w/w의 글리세롤 구배와 약 -7℃의 MP는 초심원심분리 시간을 감소시키면서 분획 절차의 최적화를 가능하게 한다. 50% w/w의 글리세롤은 약 -23℃의 MP를 얻고 대규모 초원심분리의 최대 온도 감소를 초과하기에 충분하다.
수용성 구배의 사용은 평형 시간을 감소시키는 나노미셀의 형성을 촉진한다. 그러나, 이상적인 평형과 분획에 도달하기 위해, 이와 같은 미셀들의 조성물은 그들의 밀도에 따라 균질해야 한다. 지방산의 확산은 밀도에 따른 패턴에 따라 일어나지, 무작위로 선택되거나 밀도 구배에 의한 초원심분리에 의해 수정되지 않는다. 원심분리 구배에서 발생한 바와 같이, 밀도 구배는 회전축과의 거리에 따라 형성된다; 이 방법은 처음에 밀도가 가장 높은 지방산을 함유하는 미셀들을 형성하면서 전개되는데, 지방산은 회전축에서 가장 멀리서 가장 밀도가 높은 분획을 형성한다.
지방산, 특히 PhA와 포화 오메가-3 지방산의 밀도의 유의미한 증가는 이것을 효율적인 기법으로 만든다. 주요한 문제는 비교적 적은 분자량은 분리를 얻기 위해 아주 빠른 속도와 시간을 요구한다는 점이다. 과도한 시간은 분리에 영향을 미치지 않는다. 그러나 분자들은 이와 같이 분자량이 낮기 때문에 필요 시간이 긴데(즉, 48 시간), 비록 분리 과정에서 그리 눈에 띄지는 않지만, 이 시간은 최적화될 수 있다.
오메가-3가 풍부한 미가공 기름에 적용된 등밀도 초원심분리에 의해, 3가지 분획이 분자량 및 밀도에 따라 형성된다: a) 주로 228~290g/몰의 분자량과 기름보다 낮은 밀도(0.85~0.86g/cm3 )를 갖는, 주로 미리스트산, 팔미트산 및 스테아린산 을 함유하는 포화 지방산 b) 유사한 분자량과 약간 높은 밀도(0.88~0.89g/cm3)를 갖는 일가 불포화 지방산 c) 300~330g/몰의 분자량과 더 높은 밀도(0.93~0.95g/cm3)를 갖는 오메가-3 지방산. PhA는 밀도 0.88g/cm3의 등밀도 원심분리를 통해 분획 (b)에서 검출된다.
이것은 선형 또는 비선형, 연속 또는 비연속 구배에서 수행될 수 있고, 본 발명의 경우, 그것의 산업적 응용 때문에 연속 선형법을 선택하였다. 평형을 얻기 위해 필요한 시간을 감소시키는 것이 본 발명에 필수적이다. 이것은, 수직 회전자들이 평형 시간을 상당히 감소시키기에, 이 경우에 가장 적합한 방법이 수직 회전자의 사용인 이유이다.
초원심분리의 속도는 30,000rpm으로 시작하거나 또는 평형에 도달될 때까지 100,000xg일 수 있다. 이 기법에서는 초과 시간이란 없다. 초원심분리가 시작하면서, 포화 지방산은 2O℃에서 천천히 결정화되고 일가 불포화 지방산은 1O℃에서 결정화된다. 평형의 형성은 초원심분리의 초기에 기름의 공융점을 현저히 증가시키고, 이로써 결정이 느리게 형성된다. 지방산은 고체 상태에서 밀도에 현저한 변화가 없다.
따라서, 1O℃에서의 초원심분리는 여러 상들의 결정화에 기여하여 포화 및 일가 불포화 지방산을 함유하는 (a)와 (b)를 폐기한다. 평형에 도달했을 때, 오염의 위험 없이 오메가-3와 구배를 함유하는 액체 분획을 분리하는 것이 가능하다.
원심분리 중의 분획은 1O℃에서 항상 완전히 결정화되지 않는데, 일가 불포화 지방산과 PhA의 혼합물이 공융점을 감소시키기 때문이다. 이와 같은 이유로, 0~-5℃의 온도에서 또는 바람직하기는 -3O℃에서, 또는 오메가-3 지방산과 정화된 분획의 공융점 미만의 온도(조성물에 따라 대략 -44~-57℃로 달라지고, 이것은 근본적으로 DHA와 EPA의 조성에 달려 있다)에서, 냉각하는 것이 권장된다.
냉각 방법은 단순히 평형 상태의 구배를 함유한 비이커를 냉각함으로써 수행될 수 있다. 그러나 이와 같은 냉각 방법은, 대규모 초원심분리가 -2O℃까지 온도의 감소를 허용하여 이와 같은 단계들에서 결정화를 향상시키기 때문에, 초원심분리 동안 일어날 수 있다. 하지만, 본 발명에서 이와 같은 냉각 방법은 평형점 동안 또는 그 근처에서 일어나고, 그렇기 때문에 PhA의 고체화를 보장한다.
초원심분리 동안 온도를 2O℃ 이하로 설정하는 것은 본 발명에만 제한되는 것이 아니다. 온도를 증가시킴으로써(즉 6O℃) (20~9O℃ 사이) 평형 시간을 감소시키고 초원심분리 방법을 최적화하는 것이 가능한데, 이는 포화 지방산의 점도, 특히 포화 및 일가 불포화 지방산의 점도를 상당히 감소시킬 뿐만 아니라 구배(글리세롤)의 점도를 감소시키고, 분획을 최적화하고 평형에 도달할 때까지 원심분리 시간을 상당히 감소시키기 때문이다.
등밀도 원심분리법에, 시간을 감소시키고 PhA의 분리를 최적화할 수 있도록 변화를 줄 수 있다. 이와 같은 측면에서, 결정화는 초원심분리의 시간을 감소시키기 위해, 평형에 도달하지 않고 달성될 수 있다. 보통 평형에 도달하는 데 필요한 시간은 48~72 시간이고, 이것은 사용되는 구배, 온도, 속도 및 회전자에 달려 있다. PhA는 아주 작은 분획으로 이루어지고, 우리의 목표는 화학적 순수성이 아니라는 점을 고려할 때, 평형에 도달하지 않고 본 발명의 사양(specifications)을 얻을 수 있다.
24시간 내에, 오메가-3 지방산과 나머지 지방산 그리고 PhA의 분획의 대부분이 발생하였다. 이런 방식으로, PhA 대부분을 포함하여 지방산의 대부분이 오메가-3 지방산의 결정화 온도보다 낮은 온도에서의 결정화에 민감하다. 이런 방식으로, 평형에 도달하기 전에 결정화로 진행할 수 있고, 오메가-3 지방산과 구배를 함유하는 액체 분획을 분리하기 위해 몇 시간이 필요하든(즉, 24시간) 그 시간 동안 초원심분리의 온도를 감소시킨다. 대규모 초원심분리는 -2O℃의 온도에 도달하는 것을 가능하게 한다. 그렇게 함으로써, 또한 PhA를 효과적으로 분리하고 오메가-3 지방산을 함유한 기름을 어떤 물질의 손실 없이 정화할 수 있다.
선택 2: 비- 등밀도 밀도- 구배 초원심분리에 의한 분획 결정화
비록 분획으로부터 오메가-3 정화된 기름을 추출하는 것이 가능하지만, 오염의 위험이 높다. 초원심분리의 시간 또한 밀도 구배의 완전한 평형 또는 유사-평형에 도달함 없이 현저하게 감소될 수 있다. 그렇게 함으로써, 고농도의 포화 지방산과 PhA 일부를 제거할 수 있고, 이것은 원래 농도와 이성질체(3R)에 따라 본 발명의 사양을 얻기에 충분할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 대부분의 경우, 결정화를 통해 분리가 이루어질 때 더 나은 결과가 얻어진다.
본 발명에서, 서로 다른 온도 주기가 형성될 수 있고, 또는 속도침강 분획이 사용되어 DHA와 EPA를 정화할 수 있다.
어유와 다른 해양 기원의 기름들의 적은 부분에서 보통 발견될 수 있고, 포유류와 마이크로유기체에는 없는(즉, DHA가 풍부한 참치) 이성질체 PhA(3S)는 DHA에 가까운 MP를 갖는다(표 1과 도 5 참조). 이와 같은 이성질체는 결정화에 의한 분리에 큰 장애물이다. 따라서, 이와 같은 이성질체의 분리는, 특히 본 발명을 사용할 경우, PhA의 MP 온도가 DHA보다 겨우 2℃ 더 낮은 반면에 PhA(0.882g/cm3)와 DHA(0.943g/cm3)의 밀도에 차이가 있음을 감안할 때, 기름의 사전 등밀도 원심분리가 필요하다.
오메가-3가 풍부한 기름들의 공융점은 분획되기 전에는 4O℃미만이다. 이와 같은 분리 방법으로, 분획들의 지방산 조성물의 서로 다른 공융점들로부터 충분히 차이가 나는 서로 다른 분획들의 결정화의 움직임을 얻는 것이 가능하다. 분획(a)와 (b)의 혼합물의 공융점은 PhA(-0.1%)를 함유하는 지방산의 원 조성물과 비교해, 현저히 상승한다. 또한 이 분획에는 기름의 특징적인 냄새의 원인인 휘발성 성분들이 함유된다. 상기 공융점은 <-2O℃의 온도에서 분획의 고체화를 가능하게 하지만, 그것은 -4O℃ 미만의 공융점을 가진 오메가-3 지방산의 분획 c)를 효율적으로 분리할 만큼 높다. 이와 같은 방식으로 PhA는 고체 분획 (b) 또는 (b+a)의 일부이다. 분획 (b)는 사실상 기름 중의 모든 PhA(2개 이성질체)를 함유하고, 이것은 결정화에 의한 분리가 상당히 복잡할 수 있는 PhA (3S)의 상당히 효과적인 분리를 가능하게 한다.
필요한 결정화 시간은 18~72시간으로 다를 수 있다. DHA 결정화가 -3.3℃의 온도/속도의 감소 또는 더 낮은 냉각 속도로 24시간 후에 발생했지만, 냉각 속도는 지방산의 결정화를 활성화할 만큼 충분히 느려야한다.
유리 DHA 결정의 성장을 얻을 수 있고, 그래서 일단 분리되면 이 결정들은 최소한의 양의 액체상을 보유한다. 그래서 이 과정 중에 큰 결정이 형성되고, 천천히 온도를 낮추는 것이 편리할 수 있다. 결정화는 큰 침착물에서 수행되고, -44℃로 시작되는 온도의 냉장실 또는 저온 냉동고에 보관될 수 있다.
정화되지 않은 또는 미가공 기름에서, 또는 포화 및/또는 일가 불포화 지방산을 고비율로 함유한 기름에서, PhA는 오메가-3 지방산의 MP와 기름의 공융점보다 낮은 -3O℃(-2O~-40℃ 사이)의 온도 주기를 사용함으로써 분리된다. 그렇게 해서 포화 지방산 + 일가 불포화 지방산 + PhA를 함유한 고체 분획이 고순도의 DHA 및 EPS를 함유한 액체 분획으로부터, 필요한 경우 여과를 통해, 분리될 수 있다.
이 온도에서, 글리세롤 구배는 결정화되고, 고순도 오메가-3를 갖고 가장 높은 밀도와 가장 낮은 MP를 갖는 분획은 액체 상태에 머물면서, 또한 오메가-3 지방산의 구배를 분리한다. 그러나 67% w/w의 글리세롤/물 혼합물이 사용되면, 이것은 밀도 구배에 의한 또 다른 원심분리 방법을 허용하는 액체로 존재하고(즉, DHA/EPA의 분리 또는 DHA/PhA가 풍부한 기름의 분리) 또는 또 다른 배치(batch)의 기름에 또 다른 PhA 분리법을 위한 구배를 재생한다.
이 방법은 2가지 PhA 이성질체 전체를 거의 완전히 제거한다. 이와 같은 방식으로, 2가지 주요 성분 DHA와 EPA의 고순도(>95% 또는 >800mg/g)를 갖고 일반적으로 >99%이 탈취되고, PhA가 낮거나 또는 0인 오메가-3 기름을 얻는다. 원 기름 중의 DHA/EPA 비율에 따라 하기를 얻을 수 있다:
a) 근본적으로 단일 오메가-3 지방산으로서 DHA를 함유하는 기름의 경우(즉, 스키조치트리움(Schizochytrium sp.)), >95%(>850mg/g) 또는 >99%(>900mg/g)의 DHA가 얻어진다;
b) DHA/EPA 비율이 >3인 경우(즉, 참치), DHA가 >700mg/g로 풍부하고 <5μg/g의 PhA를 함유하는 기름이 얻어진다;
c) DHA/EPA 비율이 1~3인 경우(즉, 연어), DHA가 <700mg/g이고 <90μg/g의 PhA를 함유하는 기름이 얻어진다;
d) DHA/EPA 비율이 <1인 경우(즉, 붉은 생선, 멸치, 고등어, 정어리, 대구), >400 mg/g의 EPA와 <400mg/g의 DHA, 그리고 <5μg/g의 PhA를 함유한 기름이 얻어진다.
본 발명으로, 또한 DHA와 EPA를 분획하여, PhA 함량이 낮거나 또는 0이고 고순도인 DHA와 EPA를 얻을 수 있다. DHA와 EPA는 분자량이 10% 차이가 나는데, 이것은 속도침강 초원심분리가 충분할 정도의 차이다(Arderiu et al., 1988). 이 경우, -5O℃에서 또는 -44~-54℃에서 또는 DHA와 EPA의 MP 사이의 어떤 다른 온도에서, 속도침강 밀도-구배 초원심분리의 사전 및 필요 과정인 2차 냉각 주기를 수행할 수 있다. 애초의 조성물과 상관없이, PhA의 농도가 낮거나 0이고 고순도인 DHA와 EPA가 모든 기름에서 얻어진다.
이 시점에서, PUFA의 산화를 안정화시키기 위해 몇몇 영양학적 또는 약제학적 친유성(lipophillic) 항산화제(즉, 토코페롤)가 첨가될 수 있다. PhA 함량이 낮거나 또는 0인 산성화된 기름은 알코올 첨가 분해(alcoholysis)에 의한 유리 지방산의 즉각적인 에스테르화 반응 또는 현재 업계에서 수행되는 모든 종래의 방법들, 비특이적 또는 선택적 효소 또는 액체 또는 고체 촉매제를 사용하는 또 다른 방법에 의해, 우리의 주요 목표인, 노보트리글리세리드의 형성이 요구된다(즉, 특허 US 20080114181). 에틸-에스테르를 함유한 기름의 경우, 반복된 에스테르화 반응이 또한 수행되어 트리글리세리드를 얻는다.
DHA가 >700mg/g이고 PhA가 <0.5μg/g인 트리글리세리드를 얻기 위한 실시예들의 다이어그램. 그러나 보통 농도가 >900mg/g인 DHA를 얻을 수 있다(기름 중의 DHA의 이론적인 최대 순도는 약 960mg/g을 함유하는 100 % 순도의 트리글리세리드 이다). 선택된 방법은 비록 DHA 농도가 처음에 선택된 원료와 EPA를 분리하기 위해 DHA를 분획하는 선택적 방법에 따라 달라질 테지만, 모든 원료에 대해 동일하다. 이런 점에서, >3 비율의 DHA/EPA를 함유하는 모든 공급원 기름의 경우, 오메가-3의 정화 방법은 결국 >700mg/g의 순도를 갖는 DHA를 얻게 될 것이다.
원료 1 : 오메가-3 지방산의 유의미한 함량 없이 DHA만을 함유하는 기름.
ㆍ 즉: 트리글리세리드(DHA >400mg/g, PhA >120μg/g)를 함유하는 바이오매스 또는 마이크로유기체(즉, 스키조치트리움(Schizochytrium sp))로부터의 기름.
원료 2: 오메가-3 지방산 중의 유일한 유의미한 함량으로서 서로 다른 DHA/EPA를 갖는 오메가-3가 풍부한 기름.
ㆍ DHA/EPA <1. 즉: 트리글리세리드(DHA >100mg/g; EPA >150mg/g 및 PhA >1900μg/g)를 함유하는 붉은 생선 정제유(30% 오메가-3)
ㆍDHA/EPA <3. 즉: 트리글리세리드 ( DHA >200mg/g; EPA >60mg/g 및 PhA >1300μg/g)를 함유하는 참치 정제유(30% 오메가-3)
ㆍDHA/EPA <3. 즉: 트리글리세리드(DHA >500 mg/g, EPA <150mg/g 및 PhA >1600μg/g)를 함유하는 정화된 참치 정제유(70% 오메가-3)
원료 3: EPA 함량이 낮은(>700mg/g) DHA 정화유가 에틸-에테르와 정화된 정제(즉, 분자 증류)로서 규칙적으로 생성되어 얻어진다. 이들은 오메가-3 지방산의 정화가 필요 없고, PhA만이 추출되어야 한다.
ㆍDHA/EPA >7. 즉: 트리글리세리드(DHA >700 mg/g, EPA <150mg/g 및 PhA > 3μg/g)를 함유하는 정화된 참치 정제유(90% 오메가-3)
본 방법은 PhA와 PA 둘 다 제거되는데, 기술된 바와 같이, PhA만 임상적으로 유의미한 분량을 제시하고, 이 때문에 우리는 본 특허에서 PhA는 항상 언급하면서도 PA는 결과에서 산발적으로 언급하였다. PA는 PhA와 마찬가지로 결정화에 의한 동일한 분획점에서 분리된다. 실시예 1은 PA가 이전에 얼마나 존재하였고, 최종 생성물의 최종 분석에서 얼마나 남았는지를 나타낸다(실시예 1).
본 발명을 설명하기 위해, DHA가 풍부하고 PhA 함량이 낮은, 서로 다른 기름으로부터 얻은 서로 다른 추출물들이 제시되었다. 하기 실시예들은 본 발명에 국한되지 않는다. 얻은 추출물은 추후에 다른 질환을 치료하기 위한 건강 보충제 또는 의약품으로서 다른 생약 제형, 바람직하기는 캡슐제로 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1 : 등밀도 초원심분리 및 결정화에 의해, >700 mg /g의 DHA 와 <5μg/g의 PhA 를 갖는 트리글리세리드를 함유하는 추출물을 얻는 방법
사용된 원료는 DHA(210mg/g), EPA(67 mg/g) 및 총 오메가-3(285mg/g)을 함유하는 비-탈취 및 비-정화된 미가공 참치 기름(Sanco)이었다. 기체 크로마토그래피와 질량 분광광도계를 통해 기름에 있는 지방산을 정량화한 후, PhA의 함량을 측정하였다(1.3mg/g). 이들의 효과를 위해, 그리고 PhA 없는 DHA라는 혁신적인 본 발명의 주요한 목적을 신속하게 달성하기 위해, 감소하는 온도 주기 두 개를 설정하였다.
1. 검화(Saponification)
교반기가 담긴 5L 반응기에서, KOH 25Og, 물 280ml, 그리고 에탄올 10ml로 미가공 참치 기름 1000g을 검화하기 시작하여, 불활성 기체(질소) 하에서 4O℃의 온도에서 반응을 개시하고, 1시간 동안 300rpm으로 상기 혼합물을 교반하였다.
2. 유리지방산 염으로부터 유리 지방산의 산성화 형성
전 단계에서 얻은 칼륨 혼합물에 아세트산(산화제산 아님) 3L를 70%로 첨가하고, 불활성 기체(질소) 하에서 60분 동안 200rpm으로 격렬하게 혼합하였다. 아세테이트칼륨이 형성되어 침전시킨 뒤 여과를 통해 제거하였다. 일단 가라앉히고 나니, 두 상이 형성되었다: 무극성상 그리고 남아 있는 아세트산을 함유하여 밀도가 더 높은 극성상으로, 이것은 반응기 바닥에 구멍(opening)을 통해 제거하였다. 그런 다음, 정제된 물 4L를 반응기에 첨가하고 30분 동안 150rpm으로 교반하여 세척을 수행하였고, 일단 가라앉히자 두 상이 형성되었다: 기름을 함유한 무극성상과 물을 함유하고 반응기 바닥에 가라앉은 무극성상. 상기 무극성상은 반응기의 바닥에 있는 구멍을 통해 제거하였다. 그런 다음, 참치의 산성화된 기름을 얻을 때까지, 물을 4L씩 4회 첨가하여 세척하였다.
3. 등밀도 원심분리
전 단계에서 얻은 참치 산성화된 기름을 20분 동안 150rpm으로 원심분리하여, 고체상 또는 스테아린과 유리 지방산을 함유한 액체상을 형성시켰고, 이 액체상을 다음 단계에서 사용하기 위해 진공으로 빨아들였다. 25% w/w의 글리세롤/물 혼합물로부터 구배 2400ml를 제조하고, 물 1800ml와 글리세롤 535ml를 첨가한 뒤, 여기에 이전에 얻은 유리 지방산과 글리세롤을 실온에서 첨가하였다.
혼합물은 Hitachi-Koki CC40 초원심분리기 및 C40CT4 Core(H) 회전자에서 1시간 동안 3000g을 균질화시켰다. 그런 다음 진공(27Pa)으로 빨아들이고, 그리고 최초 온도 1O℃에서, 원심분리 속도를 42시간 동안 1000000g으로까지 증가시켰다. 24시간 동안 초원심분리 후, 온도를 갑자기 O℃로 낮춰서 평형에 도달할 때까지 18시간 동안 그 온도를 유지하였다. 이와 같은 원심분리 방법으로부터, 우리는 회전자의 축에서 폐기 가능한 고체 분획 2가지를 얻었고, 그 중 하나는 포화 지방산을 다른 하나는 일가 불포화 지방산 및 PhA를 함유하였다.
액체 상을 분석하기 위해, 피펫을 사용하여 샘플을 채취하였다. 샘플에 GC-MS 분석을 실시하였고, 그 후 PhA 및 DHA 농도를 검사한 결과, 각각 90μg/mg 미만 및 740mg/g이었다.
이와 같이 특별한 경우에, 비록 PhA 농도가 90μg/mg 미만이고 DHA 농도가 740mg/g인 생성물을 얻을 수 있지만, 분획은 분리되지 않았다.
4. 오메가-3 지방산의 결정화에 의한 분리
그런 다음, 이전 단계에서 얻은 3가지 분획을 함유한 실린더를 -3O℃의 온도에서 직접 및 급속 냉각하였다. 이 온도에서 두 상이 생성되었다. 하나는 고체상이고 다른 하나는 액체상이었다. 고체 분획은 포화 및 일가 불포화 지방산, PhA, 프리스탄산 그리고 글리세롤 구배를 함유하고, 한편 액체상은 DHA가 풍부한 다가 불포화 지방산의 혼합물을 함유하였다. 실린더 축의 반원으로부터 가장 멀리 있는 액체 분획은 실린더 바닥에 있는 구멍을 통해 고체 분획으로부터 분리하였다.
이 액체 분획은 DHA가 풍부하고 PhA 함량이 낮거나 또는 전혀 없는 오메가-3 지방산을 함유하였다. 전단계에서 얻은 DHA가 풍부한 지방산 281g을 GC-MS로 분석하였다. 상기 분석은 -3O℃에서의 냉장 전과 후의 DHA가 각각 96.7% 및 97.2%이고, PhA 수치는 냉장 전 90μg/g 미만이고 냉장 후 5μg/g 미만임을 나타내었다.
5. 트리글리세리드에서 기름에 있는 유리 지방산의 에스테르화 반응
단계 4에서 얻은 유리 지방산의 에스테르화 반응을 위해, 특허 US20080114181에 개시된 방법을 사용하였다. Soxhlet 콘덴서를 사용하여, 5%의 스티렌 수지를 유리 지방산(200g) 및 글리세롤(50g)과 혼합하였고, 혼합물에 기계적 열 교반기를 도입하여 20분 동안 4O℃에서 185rpm으로 교반하였다. 그런 다음, 에탄올 80ml를 혼합물에 첨가하였고, 온도를 6O℃로 올려 235rpm으로 교반하였다. 불활성 기체(질소) 하에서, 대기압으로 25시간 동안 반응을 유지하였다. 그런 다음 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 기름의 여과에 의해 수지 또는 촉매를 회수하였다. 에탄올을 제거하여, 트리글리세리드 혼합물을 얻었다.
최종 생성물의 샘플을 취해 기술된 바와 같이 GC-MS 분석을 실시하였고, 그로써 얻은 결과들은 아래 실시예 1에 나타냈다(유리 지방산 포함).
실시예 3에서, 트리글리세리드, 부분적 글리세리드 및 얻은 유리 지방산의 조성을 측정하기 위해 기름의 GC/MS 분석을 측정하였다.
단계 5에서 실시된 방법으로부터, >700mg/g 농도의 DHA 트리글리세리드와 < 5μg/g 미만의 PhA 그리고 총 870mg/g인 오메가-3(>95%)를 함유하는 완전히 탈취된 기름을 얻었다.
실시예 2: ≥700 mg /g의 DHA 및 <90μg/g의 PhA 를 얻기 위한 지속적인 방법
이 실시예를 위해, 정제된 붉은 생선(Sebastes sp.) 기름을 출발 원료 물질로 사용하였다. 오메가-3 함량이 315mg/g이고, 그 중 110mg/g이 DHA, 165mg/g이 EPA, 그리고 1.9g/kg이 PhA인 물질(LYSI).
1. 검화 및 2. 산성화
실시예 1에 사용된 비율과 방법을 그대로 따라서 붉은 생선 1000g의 검화 및 산성화를 실시하였다.
산성화된 기름으로부터 두 가지 것을 할 수 있었다. 정화된 기름을 PhA 분리 및 오메가-3 지방산의 정화를 위해 똑같이 이등분하고, 하나는 다음 단계를 위해 사용하였다:
a) 등밀도 초원심분리 및 결정화
1. 등밀도 원심분리
산성화된 기름 500g을 20분 동안 150rpm으로 원심분리하여, 고체상 또는 스테아린(274g)을 형성하고, 실시예 1에 기술된 대로 나중에 글리세롤 구배에 사용하기 위해 유리 지방산을 함유한 상청액를 진공으로 빨아들였다. 앞서 실시예에서와 마찬가지로, 일단 평형에 도달하면, 포화, 일가 불포화 및 PhA 지방산을 함유하는 고체상 두 개와 DHA가 풍부한 다가 불포화 지방산을 함유하는 세 번째 액체상을 얻었다.
2. 오메가-3 지방산의 결정화에 의한 분리
구배를 고체화하고 그래서 포화, 불포화 지방산 및 PhA를 함유하는 고체 분획과 오메가-3 지방산을 함유하는 액체 분획을 얻기 위해 24시간 동안 -3O℃의 온도에서 앞서 기술한 3가지 상을 함유한 실린더를 냉각시키기 시작하였다. 실린더 바닥의 구멍을 통해 액체 분획을 분리하여, 산성화된 기름 156g을 얻었다.
출발 물질인 붉은 생선 원료 기름의 사양에 따라, 폐기된 고체 분획은 포화 지방산(68%)과 일가 불포화 지방산(31%) 그리고 PhA(2.2g)을 함유하고 있음을 추정할 수 있었다. GC-MS로, 앞서 얻은 오메가-3가 풍부한 산성화된 기름 156g(이것의 순도는 오메가-3가 98.3%이고 PhA 수치는 90μg/g 미만)을 분석하였다.
3. 트리글리세리드가 없는 지방산의 에스테르화 반응(실시예 1과 동일).
사용된 에스테르화 반응은 실시예 1의 단계 5에서 기술된 바와 같다. Soxhlet 콘덴서를 사용하여, 5% 스티렌 수지와 유리 지방산(200g) 그리고 글리세롤(50g)을 혼합하고, 이 혼합물에 기계적 열 교반기를 도입하여, 20분 동안 4O℃에서 185rpm으로 교반하였다. 그런 다음, 에탄올 80ml를 혼합물에 첨가하고, 온도를 6O℃로 올리고, 교반속도를 235rpm으로 올렸다. 반응은 불활성 기체(질소) 하에서 대기압으로 24시간 동안 유지하였다. 그런 다음 이 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 수지 또는 촉매는 기름의 여과에 의해 회수하였다. 에탄올을 제거하고, 트리글리세리드 혼합물을 얻었다. GC-MS에 의한 분석용으로 얻은 샘플로부터 얻은 기름이 DHA 농도가 470mg/g이고 PhA가 90μg/g 미만인 0.4% 미만의 유리 지방산을 함유하는 것을 밝혀내었다.
b) 비-등밀도 원심분리(비평형 밀도 구배).
2. 초원심분리
본 실시예의 방법 (a)의 단계 1, 2에서 얻은 나머지 기름으로부터, 20분 동안 150rpm으로 산성화된 기름 491g을 분리하여, 고체상 또는 스테아린(267g)과 유리 지방산을 함유하는 액체상을 형성하고, 진공으로 빨아들였다. 본 액체상을 글리세롤 구배에 첨가하고, 실시예 1의 단계 3에 명시된 바와 같이 준비하였고, 24시간 동안 평형에 도달함 없이 100000xg에서 원심분리하였다.
3. 오메가-3 지방산의 결정화에 의한 분리.
24시간 동안 -3O℃에서 원심분리기의 실린더에 함유된 기름을 직접적으로 냉각시키기 시작했다. 그 결과, 85g이 생성된 고체상은 포화, 일가 불포화 지방산 및 PhA를 함유하였고, 145g이 생성된 액체상은 오메가-3 지방산을 함유하였다. 액체 분획은 실린더의 바닥의 구멍을 통해 분리하였다.
이 방법의 결과로서 그리고 상기 액체상의 GC-MS 분석을 통해, 얻은 생성물이 92.4%의 순도의 오메가-3과 90μg/g 미만의 PhA 수치를 함유함을 밝혀냈다.
4. 트리글리세리드 없는 지방산의 에스테르화 반응
전 단계에서 얻은 유리 지방산을 에스테르화하기 위해, 실시예 1에서와 마찬가지로, 특허 US 20080114181에 기술된 방법을 사용하였다. Soxhlet 콘덴서를 사용하여, 5%의 스티렌 수지와 유리 지방산(200g) 그리고 글리세롤(50g)을 혼합하고, 기계적 열 교반기를 도입하여 20분 동안 4O℃에서 185rpm으로 혼합물을 교반하였다. 그런 다음, 에탄올 80ml를 상기 혼합물에 첨가하고 온도를 6O℃로 올리고, 교반속도를 235rpm으로 올렸다. 반응은 대기압에서 24시간 동안 유지하였다. 전 과정은 불활성 대기(질소) 하에서 발생하였다. 그런 다음, 상기 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 기름의 여과로 수지 또는 촉매를 회수하였다. 기름을 9O℃에서 가열하여 에탄올을 제거하였다.
GC-MS에 의한 분석을 위해 얻은 샘플로부터, 얻은 상기 기름은 농도 440mg/g의 DHA와 90μg/g 미만의 PhA를 갖는 0.6% 미만의 유리 지방산을 함유함을 밝혀내었다.
상기 실시예 2에서, 출발 물질이 적은 양의 DHA를 함유하고 있었으므로, 최종 물질 역시 적은 양의 DHA를 함유하였다. 그렇지만, 이 방법으로부터 DHA 정량의 4배(110mg/g에서 440mg/g)를 얻고 PhA를 200배 감소시킬 수 있다는 결론에 도달하였다. 얻은 생성물을 출발 물질로 사용하여 상기 방법을 반복한 후, DHA가 740 mg/g이고 PhA가 90μg/g 미만인 조성물을 얻었다.
실시예 3: 생성물 분석
지방산의 총량을 측정하기 위해, 다음 분석을 실시하였다:
i) 기체 크로마토그래피-질량 분광광도계(GS-MS)에 의한 지방산의 분석:
시약: 에탄올 96%, 석유 에테르, 헥산, 메탄올, 0.8 mol/L KOH (Sigma-aldrich).
기구: Agilent HP 6890 시리즈 GC 시스템 - 5793 질량 선택 검출기; HP Analytical CD-ROM MS Chemstation Libraries Version A.00.00.
방법: 10ml 시험관에 든 지방산 50mg을 에테르와 헥산 혼합물(2:1), 메탄올 5ml 그리고 0.8mol/L KOH 1ml와 혼합하여 흔들어주었다. 물을 첨가하고 10분 동안 3000rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 버리고 GC/MS에 의한 분석을 실시하였다.
GC/MS: 크로마토그래피 칼럼 HP-1.17m x 200μm x 0.11μm. 주사기 온도: 28O℃; 중간상 온도: 29O℃; 속력: 100℃에서 260℃까지 1분당 5℃; 0.9ml/분의 흐름을 갖는 헬륨 칼럼; 주사기로부터 주입되는 샘플: 1μl; 이온화원(ionizing source) 온도: 23O℃; 전극 온도 15O℃.
ii) 기체 크로마토그래피(GS)에 의한 PhA의 분석:
추출: 스크류 시험관에 샘플 1ml, 클로로포름/메탄올(2:1) 9.5ml 그리고 KCI 2ml를 첨가하고, 격렬하게 교반하고 3000rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 상층부(수용성)를 분리하여 버리고, 황산나트륨을 입힌 여과지로 여과하였다. 여과액(유기상)을 스크류 탑이 있는 시험관에 회수하여 증발시켰다.
유도체화: 건조된 추출물에 메탄올 중의 삼불화붕소 1ml를 첨가하고, 30분 동안 100℃에서 가열한 뒤, 시험관을 냉각시켰다. 물 3ml와 n-헥산 3ml를 첨가하고, 교반한 뒤 방치하였다. 맨 윗층을 분리하여 보관하고, 수용액층에 n-헥산 3ml를 첨가하고 교반하였다. 유기상들을 수집하여, 황산나트륨을 입힌 여과지로 여과하였고, 건조될 때까지 증발시켰고, 상기 샘플을 n-헥산으로 희석시키고, 2mcl을 주입하였다.
기구: 불꽃 이온화(FID) 기능의 Agilent Technologies 기체 크로마토그래피 6890N. 칼럼: TRB-WAX 30m 0.25mm 0.5 mcm. 표준: 피탄산 에스테르 메틸릭(Sigma). 반응성 유도체: 메탄올 중의 삼불화붕소 20% (Merck). 크로마토그래피 프로그램: 오븐 온도: 205℃. 주사기 온도: 25O℃. 검출기 온도: 26O℃.
iii) 실시예 1에 기술된 방법의 결과로 얻은 생성물의 분석.
실시예 1에서 얻은 생성물을 지방산 및 PhA에 대해 GC-MS에 의해 분석하였다.
분석에서 얻은 오메가-3 지방산의 총 %는 DHA+EPA+SDA+DPA의 합이다. 상기 조성물은 다른 오메가-3 지방산은 기법 때문에 매우 적은 양 또는 검출 불가한 양만큼 포함했고, 이만한 양은 약전 또는 분석에서 고려되지 않았다.(즉 C28:8,n3).
Figure 112011089733400-pct00003
따라서, 얻은 조성물의 조성비율은 하기와 같았다:
ㆍ지방산: 91.75%
그 중 80.65%는 DHA이고, 13.38%는 EPA, 5.07%는 기타 오메가-3이고, 0.69%는 다른 다가 불포화, 0.08%는 기타 포화이고 0.08%는 일가 불포화였다. PhA 및 PA 불순도의 %는 각각 0.000005% 미만 그리고 0.000002% 미만이었다.
ㆍ기타 비-검화 지방질 0.1%
ㆍ글리세롤 (에스테르화됨) 8.1 %
ㆍ에탄올 (에스테르화됨) 0.11 %
ㆍ부형제: 토코페롤(3.5ppm- 0.000003%)
ㆍ중량이 큰 불순물들, 다이옥신... (<0.000001%)
iv) 벤조아피렌 독성 분석(GC-MS):
5-mm ID Focusliner(Restek, USA) 및 소프트웨어 Xcalibur 1.2 (ThermoFinnigan Corp.)으로 Thermo-Finnigan AS 2000 사용. 크로마토그래프 칼럼 30m x 0.25 mm (ID)x0.25mm, Rtx-5 ms (Restek, USA). 주사기 온도: 28O℃; 중간상 온도: 285℃; 속도: 75℃에서 15O℃까지 1분당 25℃씩 증가; 265℃까지는 1분당 4℃의 속도로 증가; 그리고 마지막으로 285℃까지는 1분당 30℃의 속도로 증가. 헬륨 칼럼(40cm/seg의 유속); 주사기 샘플: 1μl; 이온화원의 온도: 200℃. 250mA 배출 그리고 전압 70 eV, 그리고 이온 모니터링 m/z ± 0.5인 선택이온모드(ISM)로 작동하였다. 기름 샘플의 정량화를 위해, 20, 50, 100, 500, 1000 ng/ml 벤조피렌을 사용하였다. 내부 통제를 위해, 페릴렌-d12(200ng/ml)을 사용하였다.
v) 독성 PCB 분석 및 퓨란 다이옥신(PCDD/Fs).
면역학적 검정을 수행하여, PCB1 및 DF1 면역학적 검정 키트(CAPE technologies)를 사용해 PCB와 관련된 재료들 그리고 퓨란 다이옥신을 측정하였다. 이를 위해, 단순화된 방법(Harrison and Carlson, 2000)을 적용하였다.
vi) 중금속의 독성 분석:
산성화된 기름의 샘플 6개를 취해, 중량을 알고 있는 각각의 자제 도가니에 각 샘플 1g씩을 담았다. 머플 가마에서 하소하고, 이어서 대기압에 의해 산분해함으로써 상기 기름을 광물화하였다. 사용된 분석법은 펄스 차이 산화전극 전압전류법(DPASV)(적하 수은 전극이 있는 음이온 해상도(anionic resolution)를 갖는), -1150과 75mV 사이의 차등 전력 스트립핑(differential power stripping)을 적용하였다. 또한 비소는 수소화물 생성 원자 흡수 스펙트로스코피(HGAAS)를, 수은은 냉증발법을 사용하였다. 참조 물질은 리첸 에베르니아 프루나트리 엘(lichen Evernia prunatri L)(IAEA-336)이었고, 항상 실효 중인 규범(DOCE1 1990) 하의 방법과 기준을 따랐다. Windows XP용 통계 SPSS 12-0을 위한 소프트웨어를 사용하여, 독립적 샘플에 대한 테스트 및 하나의 인자의 ANOVA를 수행하였다.
vii)
Figure 112011089733400-pct00004
실시예 4: 최종 생성물 캡슐화
경구 섭취를 위해, 기름을 캡슐화하기 위해 다른 부드러운 식물성 캡슐 기술을 버리지 않고, 부드러운 젤라틴 캡슐(젤라틴, 글리세롤, 물)을 제조할 수 있다. 상기 캡슐로 가능한 또 다른 조성물은 풍미 강화제(>95%)를 기름(즉, 레몬 에센셜 오일 5~6.5%)에 첨가하여, 씹을 수 있는 부드러운 캡슐(즉, '스와치(swatches)' 겔 1, 5%-2,5% 레몬으로 덮힘)이다. 최종 분석 결과: 열량: 14.7Kcal; 단백질: 0.283g; 탄수화물: 0,170g; 지방: 1.4g; DHA: 1g.
물 또는 다른 수용해성(hydrosoluble) 물질이 있는 현탁액 또한 그들을 풍미 강화제와 혼합하여 드링크제 액체로 소비되게 만들 수 있고 그래서 리포솜을 제조하게 만들 수 있다. 최종 생성물은 또한 분말로 얻어질 수 있다. 경구 섭취와 다른 기타 용도가 가능한데, 특히 정맥 및 안내 주사뿐만 아니라 아이소토닉 현탁액(식염수) 등이다.
본 특허의 최종 생성물은 실시예 1에서 얻은 100% 액체 기름을 함유하고, DHA가 1OOOmg인 기름 1389mg을 함유하는 투명 젤라틴 소프트 캡슐 형태(크기 24의 장방형(조성: 젤라틴, 글리세롤, 물))의 보충제 및 약제의 개발이었다. 또한 위액 내성 코팅이 있는 캡슐을 사용하는 것이 가능하다.
이 제제는 색소성 망막증의 치료를 위해 필수인, 타우린, 베타-알라닐-L-아연 히스티디네이트, 리포산, 에스테르-아스코르베이트, 색소: a) 제아잔틴 디파미테이트(이에스 리시움 바르바룸), b) 델피니딘(시아니딘 함량이 낮은 이에스 백시니움 미르틸루스), 미리세틴, 나린제닌, 헤스페리틴 및 그들의 글리코사이드, 아시아티코사이드, 징코플라본글리코사이드 A + B; 및 에피갈로카테퀸 갈레이트, 빈카민 유도체와 같은 보조인자들을 함유할 수 있다.
i) 사용된 보조인자들
Figure 112011089733400-pct00005
ii) 사용된 추출물
Figure 112011089733400-pct00006
iii) 관련 활성 물질의 분석
Figure 112011089733400-pct00007
iv) 조성물 중의 다른 활성 물질의 분석
Figure 112011089733400-pct00008
서로 다른 메커니즘을 통해, 상기 조성물의 서로 다른 글루코사이드들(즉, 델피딘과 미리세틴)이 망막과 광수용체에서의 DHA 농도를 증가시키고 빛에 의해 야기되는 광수용체의 세포소멸을 억제하였다(Laabich et al., 2007).
실시예 5: 체내(경구 투여) 또는 체외에서, DHA 의 억제제로서의 작용과 PhA 에 따른 그것의 메커니즘을 측정하기 위한 실험들:
A) 실험 A: 파라콰트로-유도된 광수용체 세포소멸
티르아미드(Tyramide) 신호 증폭(TSA)- FISH PerkinElmer, Boston, MA, USA.); 2차 항체, 단일 클론 항체 to-Bax(sc-7480), Bcl-2(sc-7382), 로돕신 RET-P1(sc-57433) (Santa Cruz Biotechnology, Inc. - USA), PhA, 도코사헥사엔산, 파라콰트 디클로라이드, (Sigma-Alldrich). 용매 및 반응기는 HPLC 및 분석 등급을 가졌다.
Wistar의 알비노 래트에서 유래된 정화된 신경세포 배양액을 Politi et al.(1966)에 따라 준비하고, Adler-R (1982)에서와 마찬가지로 폴리-오르니딘(poli-ornithine) 배지에서 처리하였다. 배양 1일, 신경세포 배양액에 동일한 농도의 DHA(9mM)와 해양 기원의 DHA가 풍부한 기름에서 보통 발견되는 7개의 서로 다른 농도의 PhA(기름 1 g당 PhA 5/ 20/ 100/ 500/ 2500 및 12500μg)를 첨가하고, 2개 대조군에는 DHA를 첨가하지 않고, 파라콰트를 첨가하거나 또는 첨가하지 않았다. 배양 3일, 파라콰트를 첨가하고, 24시간 동안 인큐베이팅한 뒤 인산 완충 식염수(0.01M NaH2PO4 [pH 7.4] 중의 0.9% NaCl)에서 파라포름알데히드로 1시간 동안 고정시키고 그런 다음 15분 동안 트리톤 X-100(0.1%)으로 처리하였다. 세포소멸에서, Bax 및 Bcl-2의 발현을 Rotstein-NP et al.(2003)의 방법에 따라 측정하고 정량화하였다. 세포화학 연구의 경우, 필드/샘플 10개를 무작위로 정량화하였고, 이 경우 결과들은 PhA 함유 DHA의 각 농도에 대해 샘플/플레이트 3개의 평균을 나타낸다.
광수용체에서 DHA의 세포소멸 억제 능력은 PhA 농도(PhA)와 반비례의 상관관계가 있다(도 1). 농도가 0~4μg/ml인 PhA를 사용함으로써 더 큰 세포소멸 억제 작용을 얻을 수 있었고, 어떤 유의미한 차이들이 검출되지 않았다.
0~4μg/g의 PhA를 함유하는 DHA로 기름에서의 세포소멸 억제 작용은 각각 20μg/g 초과 및 100μg/g 초과의 농도의 PhA를 함유하는 DHA를 함유한 기름에서보다 현저하게 더 컸고, 후자의 경우에 DHA의 세포소멸 억제 작용은 유의미하게 감소되었다. PhA의 농도가 2500mg/g일 때, 광수용체의 세포소멸을 억제하는 작용은 무효화되었고, 농도가 더 클 때는 DHA가 존재함에도 광수용체의 세포소멸이 유도되었다. Bcl-2/Bax 지수는, 광수용체의 세포소멸과 산화 스트레스에 반비례의 상관관계가 있다는 것 외에, 20μg/g 미만의 농도의 DHA가 100μg/g 초과의 농도의 DHA보다 산화 스트레스가 유의미하게 적다는 것을 나타낸다.
B) 실험 B: MNU로 유래된 망막 세포소멸
실험 A에서와 같은 동일한 재료 및 면역조직화학 및 정량법들을 사용하였다. 세포소멸을 유도하기 위해 파라콰트를 사용하는 대신, N-니트로소-N-메틸유레아 (MNU)(Sigma-Alldrich)를 사용하였다. 실험 A에서와 마찬가지로 체외에서 배양액을 분석하는 대신, 희생된 Wistar 알비노 래트로부터의 망막을 분석하였다. 이와 같은 목적으로 42일령의 래트 S-D 8마리를 선택하여 표준 기초 식단으로 4주 동안 먹이를 주었다. 각 래트에게 다른 방식으로 먹이를 주었는데, 한 마리는 대조 식단으로서 표준 방식을 따랐고, 한편 나머지 7마리는 식단을 수정하여, 실험 A에서와 마찬가지로 서로 다른 농도의 PhA(기름 1g당 PhA 0/4/20/100/500/2500/12500μg)를 함유하는 DHA 15%를 공급하였다. 이와 같이 4주를 보낸 후, 각각의 래트에게 복강내 주사 한 방으로 MNU(75mg/체중kg)를 주입하였다. 6일 동안 모든 래트에게 동일한 식사가 제공되었고, 24시간 금식 후 7일째 희생시키고, 실험 A와 마찬가지로 고정 및 면역조직화학적 방법을 수행한 다음 망막 추출을 수행하였다. 세포화학적 연구를 위해, 무작위로 필드/샘플 10개를 정량화하였고, 여기서 결과들은 눈/샘플 10개의 평균값을 나타내었다.
밝혀진 체외 결과에 따르면(도 1), DHA의 광수용체의 세포소멸 억제 능력은 PhA의 농도와 반비례적인 상관관계가 있었다. 체외에서 DHA를 포함한 기름 중의 PhA의 농도의 작용은 또한 체내에서 관찰된 것(도 2)과 비교할 만했다. 0~20μg/g의 농도에서 더 큰 세포소멸 억제 작용을 얻었고, 이 범위에서는 유의미한 차이가 없었지만, 체외에서 PhA 수치가 20μg/g일 때와 마찬가지로, Bcl-2/Bax 비는 5μg/g 미만을 먹인 래트들 보다 현저하게 낮았다. DHA의 세포소멸의 억제 효과의 무효화는 없었다. <5μg/g의 PhA가 함유된 DHA를 먹인 래트들은 PhA를 첨가하지 않은 DHA와 관련하여 세포소멸 억제 작용 및 표지자인 Bax 및 Bcl-2에 어떤 변화도 나타내지 않았다.
이와 같은 두 가지 예들은 체외 그리고 체내 둘 다에서 PhA가 없는 DHA가 PhA의 수치가 높은 시중의 수많은 DHA 브랜드들보다 RP와 같은 퇴행성 질환의 치료에 있어 더 효율적이고 안전하다는 것을 확인해주었다. 이와 같은 예들은 본 특허 전문에 기술된 질환에서 DHA의 작용의 결정적 메커니즘과 그와 같은 효과를 PhA가 어떻게 방해하는지 설명한다. 이것은 모두 수많은 PhA의 해로운 효과 및 DHA와의 대항효과에 대한 수많은 역학적 증거들과 분자 및 예비임상 연구들과 일맥상통한다. 퇴행성 신경 질환, 비뇨생식기 질환, 근골계 질환, 심혈관계 질환 및 본 발명에 기술된 응용들에서 PhA가 없는 DHA의 작용은 본 발명에 기술된 PhA의 대항효과로 인해 특히 이와 같은 예들에서 관측되는 미토콘드리아 및 세포소멸 억제 작용에서의 다른 상업적 DHA 제품들의 작용보다 더 크다.
실시예 6. 망막색소 변성증의 임상적 연구를 위해 DHA 의 함량이 높고 PhA 가 없는 조성물의 사용
본 연구에서 처음으로, 관련 증후군이 없는 RP 환자에게서 잠재성(subclinical) 청각 변성, 중증 심혈관계 질환(부정맥), 전립선, 고혈압, 당뇨 및 갑상선염과 같이 상당히 잦은 여러 변형을 밝혀내었다.
지난 수십 년에 걸쳐, RP 환자에게서 도코사헥사엔산(DHA)이 감소됐고, 그들 중 일부에게서는 PhA가 증가됐음이 밝혀졌다. 서로 다른 동물 대상 개입 연구들은 PhA의 수치를 통제할 때의 DHA의 혜택을 시사했다. DHA는 광수용체의 생존 및 광전도에 필수적이다.
영양상 섭취를 넘어서 1회 투여량으로 5μg/g 미만의 PhA를 함유한 DHA의 섭취가 RP를 치료할 수 있는지 그리고 그것이 어떤 종류의 임상적 이점을 가져오는지 파악하기 위해서, 개입 무작위 교차 이중-맹검 연구 후 임상 실험을 수행하였다. 평균 연령 46세(17~70세)의 RP 환자 40명을 무작위로 선택하였다. 다음 검사들을 실시하였다: 망막 전위도 검사, 시각 유발 전위 검사(VEP), 자동 시야 검사, 시력 검사(시력), 청력검사, 표준 및 임상적 안과 검사, 혈액 검사 울혈 및 지방산. 두 집단(A와 B)을 대상으로 10개월 동안 0.20mg 미만의 PhA를 함유한 드링크제 DHA를 1일 1회 740mg의 투여량(영양학적 투여량의 2배)으로 치료하여 개입 무작위 교차 이중 맹검 연구를 실시하고, 각 집단은 생활방식 습성에 있어서 대조군이 있었다. 이와 같이 연구의 1단계를 마치고, 두 집단을 교차하여 2단계에서 동일한 개입 연구를 다시 반복하였다.
결과: 연구를 시작하기 전, 환자의 61%는 비정상적으로 반점형 피부 위축증이 있는 높은 EVP를 갖고 있었다. 환자 눈의 81%는 시야가 10°미만이었고, 그 중 35.5%는 시력이 0.5(20/40)를 초과했다. 시력 값에 따라 법적 시력상실을 앓고 있는 환자들은 25.8%를 차지했다. 6.4%는 시력이 20/200 미만이었다. 평균 시력은 0.41±0.22이었다. RP 환자들 중 48%는 시력이 20/40 이하이고, 60세가 넘으면 평균 시력이 0.39±0.21인 비율이 62.5%까지 증가하였다.
매년 0.06의 시력 감소가 발행하였다. 환자들의 소집단(n=8)은 높은 수치의 PhA를 나타내었고, 시력은 0.2 미만이었다. 이와 같은 소집단은 DHA로의 치료가 시력 회복의 결과를 초래하지 않은 RP 환자들만을 나타낸다. PhA 수치가 정상인 나머지 환자들(n = 32)에게서, DHA로의 치료는 A 집단과 B 집단의 각각의 시력 0.055 및 0.119의 현저한 상승의 결과를 초래하였다. 상염색체 우성, 단순, 상염색체 열성, 및 산발적 RP 등 모든 유전적 형태들은 시력이 상승되었다: 각각 0.104, 0.091, 0.068 그리고 0.025. 시력1(0.2 미만), 시력2(0.2~0.5), 시력3(0.5 초과)의 눈들은 비례적으로 그들의 시력을 각각 0.02, 0.08 및 0.13만큼 회복시켰다. 이와 같은 정상적인 수치의 PhA를 갖는 환자들에게서, 시야의 변화 역시 관찰하였으나, 중심와 및 중심와 부근 민감도(A 집단: 각각 5.3%와 9.8%, 그리고 B 집단: 각각 6.6%와 11.3%)의 현저한 증가는 없었다. 두 집단 모두에서, HDL 콜레스테롤 수치가 30% 증가하였다.
RP 환자들은 심혈관계 질환, 당뇨 및 갑상선 기능 항진증의 발병 빈도가 높다. 부작용은 발견되지 않았다. 시각 기능은 환자의 나이보다는 증상이 발발한 연령 및 PhA의 농도와 더 관련이 있는 것으로 보였다. 우성형이 열성형보다 더 나은 예후를 가졌다. PhA 수치가 높은 소집은 최악의 예후를 가졌고 1일 740mg의 DHA로의 치료 이후 시력의 향상을 나타내지 않았다. 정상적인 PhA 수치를 갖는 소집단에서, 환자의 76.5%가 유전적 패턴과 상관없이 그들의 시력을 회복시켰다. 치료는 시야의 회복을 초래하지 못했다. 이와 같은 시험용 검사는 DHA가 적어도 중심 시력의 기능의 치료에 도움이 될 수 있음을 보여주고 그리고 환자들 중 소집단은 PhA 수치가 높았다는 것을 명심하면서 RP 환자에게서 망막 위축증을 피할 수 있는 투여량이 얼마인지 확인해준 것과 같다.
실시예 7. DHA 약물 동력학 및 RP 에서 주변부 및 중심부 시각 기능에 대한 효과 및 1일 2회 투여 시 DHA 의 내약성 ( tolerability ): RP 의 고유한 치료법으로서 4g/일(60 mg / kg ) 및 8g/일(120 mg / kg ) 대 위약
병행집단이 있는 무작위, 이중-맹검 위약-대조군 연구(24개월 이중-맹검 치료).
RP 환우회(AARPE)로부터 평균 연령 42세(24~68세)의 환자(n=18)를 선택하였다. 약정성에 동의한 환자 21명 중에서, 18명을 무작위로 선정하여 이중-맹검법을 실시하였다; 그러나, 나머지 3명은 치료 목적의 분석에서 제외시켰는데 그 이유는 이중-맹검 평가를 실시하지 않았거나, 또는 그들의 중심에 모든 치료 집단에 있는 환자들이 부족했기 때문이었다. 환자 18명 모두에 대해 부작용에 대한 평가를 실시하였다. 이로써, 환자 18명은 치료를 완성하였다. 습관의 통제 및 식사/식단의 DHA와 PhA의 통제를 실시하였다. 다음 검사를 실시하였다: 망막 전위도 검사, 시각 유발 전위 검사(PEV), 자동 시야 검사, 독물학 및 면역학적 분석, 울혈, 및 지방산 및 산화 부산물.
1차 결과 변수(중심 시각 기능)는 평균 시력의 변화였고, 24개월 후 증가하였다. 4g(0.05) 및 8g(0.06) DHA를 공급한 집단들에서, 시력 값들은 위약 집단(-0.04)의 경우에서보다 현저하게 컸다(각각 P=O.03 및 P<.0.05); 2차 결과 변수(주변수 시각 기능)에서, 시야에 변화가 있었고, 4g 및 8g DHA-집단들에서는 각각 2% 및 5% 증가하였고, 한편 유의미한 변화는 아니었지만, 위약 집단에서는 1.2%의 감소가 있었다(각각 P=.15 및 P=.23).
DHA-집단은 전기생리적 개선(진폭의 감소 및 EVP 잠복기에서의 감소)을 나타냈다. DHA-집단에서는 유의미한 임상적 차이들이 존재하지 않았다. 모든 환자들은, 각 DHA-집단에서 PhA 수치가 높은 환자 1명을 제외하고, 치료 후 PhA 수치가 정상이었다. 환자 중에 내약성 문제를 일으킨 환자는 한 명도 없었고, 위약 또는 DHA 집단에서 부작용은 전혀 관측되지 않았다. PhA의 변화도 관측되지 않았으나, 단 PhA 수치가 높은 환자 두 명은 여전히 4g 및 8g DHA-집단에서 각각 52% 및 48%의 감소를 나타내었다. DHA는 AA 수치와 기타 다른 오메가-6 지방산에서 유의미한 변화를 일으키지 않았고, DHA 집단에서 EPA의 농도를 현저하게 증가시켰다. 표적 조직에서의 DHA의 증가는 치료를 위한 투여량에 비례하였고, 여기서 DHA 수치는 5.2로 기본 수치와 비교해 인지질에서 7.3배 더 높은 것이 관측되었다. 정상적인 지방 함량의 음식과 함께 경구 투여한 후 3~6시간 사이에 최대 혈장 농도에 도달하였다.
따라서, 본 발명의 DHA의 조성물은 망막 위축증에서 시각 중심 기능을 개선시키는 데 효능이 있고, 샘플의 크기와 시험의 기간 때문에 RP 환자들의 주변부 시각 기능에서의 혜택을 제외할 수 없다는 결론을 내릴 수 있었다. 또한 DHA가 RP에 대한 치료법으로서 잘 수용되고; 그 반응은 분명히 용량-의존성이라는 결론을 내릴 수 있었다.
실시예 8. 망막 유전적 위축증과 관련된 서로 다른 병환들에서 본 발명의 조성물의 효능 및 안전성의 측정
현 기술 현황에서 보면, 망막 위축증은 넓은 범위의 질환군을 포함하고, 그들 중에는 하기가 포함될 수 있다: 상염색체 우성 망막색소 변성증(AD), 상염색체 열성 망막색소 변성증 (AR), 단순 망막색소 변성증 (SP), 성별 관련 망막색소 변성증(XL), 스타르가르트 병 (ST), 맥락막 결여, 뤼베르 등.
하기 연구를 수행하기 위해, RP 환우회(AARPE) 파일에서 평균 연령 45세(8~72세) 환자 171명을 선택하였다(남성 76명, 여성 85명). 개개인들을 두 집단으로 분리하였다. 개인 97명의 첫 번째 집단(남성 41명, 여성 56명(AD 14명, AR 26명, SP 44명, XL 1명, ST 7명, 레프섬 1명, 컨스 1명, 어셔 3명))은 1일 본 발명의 조성물 4g으로 치료하였다. 개인 74명의 두 번째 집단(남성 35명, 여성 39명(AD 9명, AR 24명, SP 34명, ST 4명, 뤼베르 1명, 어셔 1명, XL 1명)은 어떤 치료도 받지 않았다. 질환의 평가에서 본 발명의 조성물의 효능을 측정하기 위해 고려한 매개변수들은 시력(VA)과 시야(VF)였다. 이와 같은 매개변수들은 연구 기간이었던 8년을 통틀어, 1년에 한 번씩 측정하였다.
집단 1에서 치료를 받은 환자들의 경우 시력과 시야에서 유의미한 차이가 관측되었고, 한편 치료받지 않은 집단의 매개변수들은, 질환의 진전에 상응하여, 변화가 없거나 또는 악화되었다. 치료받은 집단에서는 2년 후 시력에 차이가 있었고, 한편 시야는 6년까지 어떤 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 1일 DHA 4g 섭취가 RP 환자와 스타르가르트 병에서의 시각적 매개변수들을 개선시켰다.
실시예 8.1 X-연관 맥락막 결손
X-연관 맥락막 결손이 있는 세 형제(9, 13 및 16세)가 시력의 변화 없이 ERG의 변화, 야맹증을 보였고, 큰형은 시야의 변화(그러나 VF >60°)를 나타냈다. 이들은 1일 PhA가 없는 DHA 2g으로의 치료를 시작하였다. 치료 6개월 후, 세 형제는 적혈구 인지질에서의 DHA 수치를 정상화시키지 못했고, ERG의 변화도 없었다. 그런 다음 6개월 동안, 투여량을 1일 4g으로 증가시켰고, 그 결과 인지질에서의 DHA 수치의 증가와 ERG에서의 주간시(photopia) 변화 그리고 16세 환자의 시야 개선을 관측하였다.
실시예 8.2 스타르가르트 병
21~42세의 스타르가르트 병 환자 6명이 앞서 기술한 단면 연구(RP 연구 3)에 참여하였다. 8년 동안, 이들 중 4명은 본 발명의 생성물(DHA)로 치료를 받지 않았고, 이들 중 1명은 8년 동안 이것을 복용했고, 또 다른 한 명은 3년 동안 DHA와 함께 부정기적으로 앞서 기술한 제제의 보조인자를 복용하였다. 치료를 받지 않은 환자 모두는 질환의 자연적인 진행에 따라 시력이 점진적으로 손실되어, 양쪽 눈(AO) 모두 20/200 미만(AO)의 시력을 유지하였다. 8년 동안 DHA를 복용한 환자들은 그 기간 동안 2/10 AO의 시력을 어떤 변화 없이 유지하였다. 6개월 동안 DHA 및 제형으로 치료를 받은 환자들은 시력이 1/10 AO에서 3/10 AO으로 개선되었다. 그러나, 치료를 중단하면, 치료받고 2년 후, 시력은 1/10으로 나빠졌다. 이 환자는 치료를 재개하여 현재까지 받으면서(2.5년) 시력이 2/10까지 증가하였다.
실시예 8.3 유전적 망막 층간 분리
망막층간 분리 진단을 받은 두 형제(11세, 13세)는 진단 당시 각각 4/10 AO 및 6/10 AO의 시력을 나타냈다. 두 형제는 자발적으로 31개월 동안, 본 발명의 DHA 3g을 복용하기 시작하였고, 그리하여 치료의 마지막 시점에는 각각 5/10 및 8/10의 시력을 유지하였다.
실시예 9. 유전 질환과 관련이 없는 망막 위축증의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 사용
DHA는 허혈성 상태에서 신경세포의 내성을 증가시키고, 신경병증에서 시신경 위축증과 맥관장애에서 망막 위축증을 감소시킨다. DHA는 세포소멸 억제 효과뿐만 아니라, F2 프로스타글란딘에 대한 억제 효과가 있다. 녹내장 치료제와 안압 조절제(lOP)는 DHA와 유사하고, 혈관 수축 신경 프로스타노이드 수용체 길항체(PGF2)로 작용한다. 따라서, 이 치료는 증식성 허혈성 망막증, 네오프로스탄(neoprostane), 시신경 허혈성 요로병증 및 신경 장애(demyelinising), 당뇨병성 미세혈관 합병증, 노화 관련 황반변성 (습식 및 건식), 녹내장 및 근시를 앓는 환자에게서 입증된 바 있다. 각 경우의 내용은 길다. 일부는 전형적이 될 필요가 있지만, 모든 경우에 시각 기능(시력 및 시야에 따라 측정됨), 안저 검사, 광간섭단층촬영기(OCT) 및 혈관 촬영법에서 황반장애의 개선이 있었다. 특히, 이와 같은 환자 집단에서, DHA와 앞서 기술한 제제와의 조합은 망막의 심한 레올로지(rheology) 변화 및 그 안에서의 DHA의 감소된 생체이용률 때문에 더 필요하게 되었다. 그뿐만 아니라, 혈관 장애가 주요 원인이다.
실시예 9.1 망막 위축증(즉, RP)에 부차적인 또는 허열 기원의 황반부종 : 낭포 황반부종 ( 어바인 -가스 증후군) 및 베를린 암점
33~75세의 범위의 환자 6명은 적어도 12개월 전 낭포황반부종 및 어바인-가스 증후군(CMO)으로 진단을 받았고, 12개월 동안 내내 전신 코르티코이드, 트리암시놀론 및 탄산 탈수효소 억제제(즉, 아세트아졸아미드)로 치료를 받았다. 이들 중 아무도 알려진 망막 위축증을 앓고 있지 않았다. 이들 환자들은 적어도 낭포 황반부종으로 진단받기 24개월 전에 시력이 8/10를 초과했다. 본 발명에 기술된 제제와 관련하여, 본 발명의 DHA를 4g/일로 치료받기 전, 시력은 1/10 과 3/10이었다. 치료기간은 3개월과 12개월이었다.
3개월 동안 치료받은 후, 모든 환자들은 시력이 회복되었다. 치료가 끝나갈 무렵, 모든 환자들은 시력이 정상화되었고, 9/10~10/10의 시력에 도달하였으며, 이것은 어떤 경우에는, 백내장 수술 후 발생하는 낭포 황반 부종의 발생 전의 시력보다 높은 값이었다.
RP로 진단받은 환자 3명은 CMO를 앓았다. 그들은 앞서 기술한 바와 같이, 동일한 치료 계획으로 치료를 받았다. 치료 전 시력은 1/10, 1/10 및 1.5/10이었다. 6개월 후, 세 경우의 시력은 3/10, 6/10 그리고 7/10으로 회복되었다. CMO를 앓기 전 시력은 3/10, 5/10, 7/10이었다.
실시예 9.2. 출혈성 평면부염
8세 여아(체중 32kg)가 출혈성 평면부염으로 진단을 받았다. 진단 후 3개월동안, 임상적 진행 과정에 긍정적 변화는 없어서, 외과적 개입을 실시하기로 결정하였다. 개입하기 10일 전, 여아 환자는 수술 24시간 전까지 매일 본 발명의 DHA 33g으로 치료를 받았다(9일). 수술에 앞선 연구에서, 전문의에 의해 관측된 임상적 호전으로 인해 수술 일자가 30일 연기되었다. 그 후, 여아 환자는 30일 동안 PhA 수치가 5㎍/g 미만인 DHA 3g으로 매일 치료를 받았고, 시각 기능의 완전한 차도 및 정상화를 관측하였다.
실시예 10. 건강한 사람들의 시각 기능에서, 본 발명의 조성물의 생리적 농도 이상의 투여량( supra - physiologic )의 효과
건강한 사람들에게서, DHA는 광전도 및 로돕신의 재생을 증가시킨다. 망막 위축증이 없는 18~45세의 건강한 개인 32명(정상 시력 또는 원시 변화 없음)은 6주 동안 1일 PhA가 없는 DHA 4g으로 치료를 받았고, 치료 전과 후의 시력을 검사하였다.
모든 개인은 치료 시작 시점에 10/10의 시력을 나타냈다. 6개월 후, 모든 사람의 시력은 1이 넘는 시력(20/16)을 가졌다. 두 경우에, 양쪽 눈에 난시 0.0이 있었다. 9명의 경우, 시력이 20/12를 초과하였다. 이들 모두 야간 적응(명암 순응 측정기)을 증가시켰다.
또한 근시가 있는 건강한 개인에게서 시신경 농후화(graduation)을 변화시키기 않고 시력의 증가가 발견된 바 있다. 근시가 진행 중인 청년층과 근시가 있는 개인들에게서, 10년간 추적 후 근시의 중단이 있었다.
실시예 11. 알레르기 상태, 안구 표면 및 안구 건조 장애의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 용도
DHA의 안구 표면에 대한 효과는 기계적 보호 및 영양학적 효과, 화학적 보호 및 살균 효과를 제공한다. DHA는 신경, 호르몬, 면역 및 항-염증(프로스타글란딘) 제어 작용을 한다. DHA는 눈물 지질막의 조직에 활성적인 역할을 담당하고, 점액질-수용액 상의 증발을 감소시키고, 상 사이의 표면 장력을 감소시키고 항균제 역할을 한다. DHA는 세포소멸을 억제하고, 고블렛(Goblet) 세포의 분비를 제어한다. 지질 분비 및 마이봄선의 점도를 정상화한다. DHA는 온갖 유형의 안구 건조 질환에 작용한다: 알레르기성, 호르몬성(안드로겐), 염증성 및 지방산 조성물의 대사-식이성 장애. DHA는 눈물샘에서 디하이드록시테스토스테론의 형성을 억제하고, 동시에 안드로겐 수치를 증가시킨다. 이것은 눈물샘의 세포소멸, 괴사 및 염증을 막는다. DHA는 만성 염증, 알레르기 및 각막 부종에 효율적인 제어 능력을 발휘하는데, 이것이 루코트리엔의 합성을 억제하고(76%), 혈소판 PAF, 프로스타글라딘 E2를 감소시키고(40%), 프로스타글라딘 F2를 감소시키고(81%), TNF, 인터루킨 IL-6 및 IL-Ib를 억제하기 때문이다.
망막 위축증과 9도 미만의 근시가 없는 20~43세의 환자 50명은 근시 수술을 받기 1개월 전 라식-이전 치료로서 1일 4g의 용량으로 DHA를 복용하였다. 각막두께 검사를 실시하였고, 수술 전 12.4%의 평균 증가가 관측되었다. 일부 경우에는, 치료 전 그리고 수술 후 각막두께가 비슷하거나 약간 더 컸다.
실시예 12. 신경학 및 정신의학에서 보조 애쥬번트로서의 본 발명의 조성물로의 치료
앞서 기술한 신경 장애와 함께 유전적 질병을 제외하고, DHA는 영양적 장애가 있는 질환에서 결핍이 되어 있고, 이것은 거식증 및 폭식증이나, 정신 분열 장애, 성격 장애, 원발성 집중 장애 등과 같은 질병에서 임상적 진전뿐만 아니라 차도에 있어서도 결정적인 역할을 한다. 여러 관측 및 개입 연구를 통해, DHA는 우울증, 공격성, 원발성 주의력 결핍을 감소시키고, 기억력을 증대시키며 학습능력을 향상시키고 알츠하이머 병을 앓을 위험을 감소시키는 것이 확인되었다. DHA는 뇌와 신경 조직에 축적되고, 대뇌피질은 DHA가 좀 더 보존되는 기관의 영역이다. 시냅시스를 증가시키고, 허혈성 상태에서 세포소멸을 억제하는 데 있어 DHA의 역할은 광범위하게 연구되어 왔다.
다발성 경화증 및 척수 장애(척수 허열, 척수 종양, 횡단성 척추염, 경추 척추증, 뇌성마비 또는 퇴행성 척수증)에서 총 30명을 대상으로 PhA가 없는 DHA 4g/일, 8g/일, 15g/일로 강직성의 치료에 대한 연구를 실시하였다
연구한 모든 경우에서, 유의미한 감소와 함께 강직성 근경직의 차도, 운동성 향상 및 강직성에 의한 통증 감소를 얻었다. 모든 환자들은 긴 병력, 임상적 추후 조치를 갖고 있고, 2년 이상의 기간 동안 약물 치료(즉, 바클로펜, 인터페론 등)를 받아 왔고, 치료 시작 무렵에 강직성 및 운동성에서 좋지 않은 임상적 상황을 나나타낸 바 있다. 결과에 따르면 치료는 복용량-의존적으로, 즉, 더 많은 양(15g/일)을 복용한 환자들은, 더 적은 양(4g/일)으로 치료받은 환자들보다, 더 빠른 임상적 반응을 보였고(7일 전), 더 빠르고 더 효율적인 방식으로 운동성 및 강직성의 차도를 증가시켰다. 연구 대상인 세 가지 복용량은 결과적으로 강직성의 개선을 초래하였다.
실시예 13. 종양학적 치료에서 보조 애쥬번트로서 본 발명의 조성물로의 치료
PhA가 전이율이 가장 높은 종양에서 종양성 위험 요인이라는 점을 감안할 때, 종양학에서 보조 애쥬번트로서의 피탄산 없는 DHA에 의해 제공되는 지원은 매우 중요하다. PhA는 종양의 활성을 증가시키고, 약제학적 상호작용을 나타내고, 그리고 더 심각한 심혈관계 괴사(mortalily)를 나타낼 수 있다. 현재, DHA는 혈관형성의 억제, 수많은 종양 세포주에서의 세포소멸의 유도, 종양 세포주에서 재발의 감소와 같은 여러 혜택을 제공하기 때문에,이미 항종양 치료제(즉, 플라크리탁셀(placlitaxel)로 전립선암)로서 포함되어 있다. PhA 없는 DHA는 하기와 같은 이유로 종양학에서 보조인자이다:
a) 서로 다른 메커니즘을 통해 아주 효율적인 방식으로 혈관형성을 억제하고: 종양에서 프로스타글란딘 대사를 조절하고, VEGF의 강력한 억제제이고, 통증의 강도를 감소시키고, 항염증제 및 진통제의 항염증 효과를 향상시키고, 그래서 더 적은 복용량을 가능하게 하고 부차적 효과를 감소시킨다.
b) 여러 종양 세포에서 세포소멸을 유도하고, 적은 복용량으로 다른 세포분열 억제제의 세포독성을 증가시켜 항종양 치료를 향상시킨다. 항종양 치료제의 세포 독성을 감소시키고, 그것의 효능을 증가시키고 더 긴 치료 사이클을 허용한다.
c) 폐, 전립선, 결장 등의 선암에서 종양 세포주에서의 세포소멸을 유도하고, 또한 폐, 심장, 전립선 등의 건강한 조직의 기능을 향상시키고, 그럼으로써 환자의 삶의 질을 현저히 개선시킨다.
d) PhA가 없는 DHA는 직접적으로 심장 독성, 신경 독성 및 간 독성을 감소시킨다. 또한 더 낮은 조혈 또는 수질(medular) 독성과 연관이 있었다.
e) DHA는 전이율이 가장 높은 조양 세포주(결장암, 전립선, 유방, 폐, 난소, 위, 식도 등)의 재발을 감소시킨다.
레티노이드와 함께 사용되는 PhA 없는 DHA는, 특히 PhA의 부재가 레티노이드에 추가된 독성을 유도하지 않기 때문에, 폐 선암의 치료에 보조 애쥬번트이다. 레티노이드 및 DHA는 특히 특정 폐암 및 결장암에서 상승적 작용을 한다. DHA는 폐암(Serini et al., 2008), 결장 암 등에서 화학예방요법으로 자리 잡은 바 있다. 특히 스태틴 또한 화학예방제이고 또한 본 발명은, 특히 PhA가 스태틴과의 상호작용을 유도하기 때문에, 그것의 연관성을 사용하였다. DHA 및 스태틴은 엄청난 역학적 값을 갖는 여러 가지 그리고 주요 종양에서 화학예방요법으로서 강력한 효과를 보인다. 그들의 역학적/역학적 값(여전히 평가되어야 함)에 의해 현재 이들이 발병률, 중증도 및 예후의 감소, 전이의 감소,치료 가능성의 증가, 병의 진화의 지연 및 재발의 방지에 중요한 물질이라는 생각에 이르게 했다. 특히, DHA는, 그것이 대중에게 부차적 효과 또는 추가된 위험을 유도하지 않기 때문에, 특히 이것은 일반 대중에게 결핍되어 있는 유일한 영양분이기 때문에, 노화에 따른 큰 역학적 값(실명 및 치매로 이어지는 질환)의 중요한 예방 효과를 갖는다.
설명적 예(제한적이지 않음)로서, 1 cm미만의 폐뿐만 아니라 뼈와 간에 20개 이상 전이가 된 폐 선암을 앓는 환자의 사례에 대한 내용을 제공하였다. PhA 없는 DHA로의 치료를 받기 전 2년 동안의 항종양 치료 이력은 전이의 수의 증가와 함께 악화를 나타냈다. 처음 3회에 걸친 구조(rescue) 화학요법 주기의 실패 후, PhA 없는 DHA 12g/일을 구조 화학요법의 4번째 주기에 도입하였다. 추후 제어에서, 6주째에, 복부-골반 TAC를 통해, 해당 병변의 차도가 있음이 밝혀졌다. 본 발명의 화합물을 보조 애쥬번트로 사용하여 구조 프로토콜을 7회 실시하였다. 마지막 3년의 제어에서, 환자의 종양 활성은 여전히 소강상태에 있었다.
종양 치료에 보조 애쥬번트로서 PhA 없는 DHA의 사용은 더 긴 기간 동안 환자의 임상적 상태를 향상시키고, 평균수명의 통계치를 증가시켰다.
실시예 14. 신장 및 비뇨기계에 본 발명의 조성물의 사용
IgA와 관련된 신증과 전신 홍반성 낭창와 관련된 신증의 DHA 치료는 10여년 전에 기술된 바 있다. DHA는 신장의 세포소멸을 억제하고, 허혈성 신장 병변을 감소시키고, 염증 신장 질환 (신염, 사구체신염)에서 강력한 신장 항염증 물질이다. DHA는 신장 이식의 경우 칵테일 요법(multi-drug) 면역 억제 치료에 이상적인 보조 애쥬번트이다. 관용(tolerance) 또는 거부의 경우, 수상 세포(수지상 세포)는 항체와 "거부냐 관용이냐를 결정하는 것들"의 제시를 담당한다. DHA에 의한 수상 세포의 모듈화는 거부 반응, 알츠하이머, 자가면역 질환 등을 예방하는 것으로 잘 알려져 있다.
PhA가 없는 DHA는 특히 비뇨기계 염증 가능성을 감소시킨다. 프로스타글란딘에 대한 제어 기능, DHT 합성 그리고 특히 전립선암의 고위험 요인인 PhA가 없기 때문에, 양성 전립선 비대증 및 전립선 기능의 변성에 대한 억제 효과의 결과로서, DHA는 특히 양성 전립선 비대증의 치료 및 예방과 발기 부전의 예방에 효율적이다. 하기는 5가지 사례에 대한 설명으로, 여기서 서로 다른 신증에 대한 PhA 없는 DHA의 효능을 입증하였다.
실시예 14.1 신증후군
5세 때 신증후군으로 진단을 받은 12세 남아는 코르티코이드(격일마다 15 mg)로 제어하였다. 여러 번 이 치료를 중단하려고 시도했을 대, 3주 후 소변에 심각한 단백질 수치와 함께 신증후군이 나타났다. 치료를 중단하고 PhA 없는 DHA 4g/일을 도입하였고, 임상적 추적을 실시하였다. 치료 3개월 후, 소변에 단백질의 흔적은 없었다. 3주 동안 치료를 중단한 후, 신증후군의 증상들이 나타났고, 그래서 추가로 2년 동안 본 발명의 조성물을 1일 4g의 투여량으로 구현하기로 결정하였고, 그 기간 동안 신증후군의 활성의 흔적이 없었다.
실시예 14.2 악성 고혈압과 관련된 신부전증
코카인 중독자인 38세의 남성 환자는 악성 고혈압을 한 차례 앓았다. 혈압을 제어하였고, 약물의 사용을 중지시켰다. 환자는 왼쪽 눈에 시신경 위축증을, 오른쪽 눈에 시신경염을 앓았고, 시력은 4/10이고, 크레아티닌 값이 6.9mg/dl인 신부전증을 앓았다. 6개월간의 추적 후, 크레아티닌이 4.5mg/dl에서 6.9mg/dl로 증가하였고, 투석을 시작하기로 결정하였다. 투석 시작 전에 PhA 없는 DHA 8g/일로의 치료를 도입하였다. 치료를 시작하고 2주 후, 크레아티닌 값이 4.8mg/dl으로 감소하였고, 투석을 연기하기로 결정하였다. 6개월 동안 PhA 없는 DHA의 동일 요법을 실시한 후, 크레아티닌 수치는 1.8mg/dl이었고, 오른쪽 눈의 시력은 10/10이었다.
실시예 14.3 낭창성 신염과 관련된 만성 신부전증
9세 이후 낭창성 신염을 앓아 온 한 24세 여성은, 평생 코르티코이드 치료를 받아왔고, 18년을 통틀어 미코페놀레이트와 시클로포스파미드로 약 6개월씩 완전한 치료를 6회 받았다. PhA 없는 DHA 8g/일로 치료를 시작했을 때, 크레아티닌 값은 4.6mg/dl이었다. 30일 후, 크레아티닌 값은 3.1mg/dl로 감소하였다. 1년 추적 후, 크레아티닌 수치는 1.3mg/dl로 감소하였다. 그 후 2년 동안 상기 치료를 받았고, 크레아티닌 값은 안정적이었다. 치료를 중단하고 90일 후, 크레아티닌 값이 3.4mg/dl로 관측되었고, 그래서 프레드니솔론 1mg과 관련된 PhA 없는 DHA 8mg/일로의 치료를 영구적으로 재개하기로 결정하였다.
실시예 14.4: 낭창성 신염을 앓는 환자에게 신장 이식
6년 전 신장 이식 수술을 받은 33세 여성 환자는 미코페놀레이트(1g/일) 및 프로그라프(7mg/일)로 유지 요법 이후 크레아티닌 값이 1.8mg/dl로 안정된 치료를 받았는데, 신장 생검을 통해 진단된 거부 반응을 앓았고 크레아티닌이 2.9mg/dl로 증가하였다. 6개월 동안 프로그라프로의 치료를 늘리고 코르티코 치료 요법을 도입하였으나, 생검 결과가 없고 평균 크레아티닌 값이 2.4mg/dl이었다. PhA 없는 DHA 12g/일로 치료를 도입하였고, 7일 후 크레아티닌이 1.7mg/dl로 감소한 것을 확인하였고, 그리고 1년 동안 크레아티닌 수치를 최소 0.9mg/dl까지 감소시켰다. 신장 생검을 실시하였고, 그것은 거부반응에 음성이었고, 프로그라프(7mg/일), 미코페놀레이트(500mg/일) 및 PhA 없는 DHA 4g/일로의 유지요법을 도입하였다. 그 후 4년 동안, 크레아티닌 수치는 평균값 1.17mg/dl을 유지하였고, 신장 기능의 변성의 증거는 없었다.
실시예 14.5: 전신 질환과 관련이 없는 신장 이식
62세에 신장 이식을 받은 70세 여성 환자. 이식받고 2년 후, 거부 반응이 두 차례 일어났고, 크레아티닌 값은 2.1~2.5mg/dl이었다. 코르티코 요법으로 치료를 받았다. 그 후 4년 동안, 크레아티닌 값은 1.3 mg/dl로 안정화되었다. 이식받고 6년 후, PhA 없는 DHA를 1일 4g의 용량으로 복용하기 시작했고, 그 기간 동안 크레아티닌 값은 1.1~1.2mg/dl을 나타냈다. 정기적으로 이와 같은 치료를 받은 지 2년이 지지난 뒤, 6개월 후, 크레아티닌 수치가 0.97~1mg/dl으로 감소된 것이 관측되었다. 의료진은 본 환자가 이식된 장기에 대한 거부 반응의 증상을 전혀 나타내지 않는다고 결론지었다.
실시예 15. 자가면역 질환, 염증 만성 질환 및 골격계 질환에 PhA 없는 DHA 의 조성물의 사용
만성 염증에서 DHA의 역할은 널리 알려졌고, 출원서들의 여러 부분에 걸쳐 간단하게 기술된 바 있다. 그러나 이 문제와 관련해 가장 뛰어난 문서는 수상 세포의 조절에 관한 것이다. 이와 같은 점에서, 본 발명의 생성물은 면역 억제제의 용량과 사용 시간을 현저하게 감소시키는 보조 애쥬번트이고, 특히 본 발명에서 LES, 류머티스 관절염, 소아 관절염, 건선 관절염 및 통풍 건선 관절염 및 통풍; 및 근위축증에 대해 연구하였다. 또한 본 발명의 생성물은 관절증 및 골다공증의 예방 및 치료에서의 역할이 잘 알려져 있다.
SLE로 진단받은 26세 여성 환자는 SLE 및 전신 공피증이라는 병력이 있었는데, 8년 동안 추적하여 본 발명의 DHA 4g/일로 치료한 결과, 항핵 항체(ANA)의 존재를 비롯하여 임상적 징후가 사라졌다.
실시예 16. 피부 질환에 PhA 없는 DHA 조성물의 사용: 남성형 탈모증, 주사비 및 여드름, 아토피성 피부염, 어린선 , 홍피증 , 공피증 , 원판성 낭창, 피부 근염, 건선
남성형 탈모증 (남성형 및 여성형)의 경우, 테스토스테론에서 디히드로테스토스테론(DHT)의 생성의 원인인 5-알파 환원 효소의 활성이 증가한다. DHT의 증가는 탈모를 가져온다. DHA는 "5-알파 환원효소" 유형 1과 2의 억제제이고, 안드로젠 활성(테스토스테론)을 유지시킨다. 상기 효소를 억제하기 위해, 최소한 PhA 없는 DHA는 2g/일이 필요하고, 최대 4g/일이 되어야 한다; 치료 후 4주 내에 탈모 및 두피 염증의 변화가 관찰될 수 있다.
탈모증을 피하기 위해, 발현의 억압이 지속돼야 하고, 그럼으로써 유지 투여량을 더 적게(1일 1~4g) 사용하는 것이 가능하다. 이와 같은 치료는 기타 억제제(즉, 피나스테라이드)에 대해 이점이 있어서, 이와 같은 치료는 일반적인 건강, 안구 표면의 기능, 전립선, 근육 및 신경 조직을 위해 필요한 테스토스테론의 수치를 감소시키지 않고; 그러므로 또한 양성 전립선 비대의 치료에 유용하다.
18~44세의 남성 36명과 남성형 탈모증이 있는 여성 4명이 5년 동안 PhA없는 DHA를 매일 4g씩 복용하는 치료를 받았다. 4주 안에 탈모가 92.4% 안정화되었고, 6주째는 95%였다. 남성의 경우, 모세관 밀도가 52.8% 증가했고, 여성의 경우 75% 증가했다. 2년 동안 추적 조사를 실시하였고, 그 기간 동안 탈모증의 흔적은 없었다.
아토피성 피부염, 건선 및 원형 탈모증의 경우, DHA의 항염증 효과는 DHA의 세포 주기 및 면역체계(사이토카인, 수지상 세포 등)의 제어로 인해, 그것의 예방 효과 다음으로 중요하고, 이와 같은 상태에서 보조 애쥬번트로서 사용된다.
여드름 문제에 기여한 요소들 중 하나는 효소 5-알파 환원 효소를 통해 테스토스테론으로부터 DHT의 생산 증가이다. 따라서, DHA의 섭취는, 앞서 탈모증의 경우 설명했던 것과 동일한 메커니즘을 기반으로, 여드름 개선에 일조한다. PhA 없는 DHA로의 치료는, 경구 투여와 피부에 대한 국부 사용의 경우 모두, 여드름 치료에 효능이 있고, 그 이유는 그것의 항균성 및 항염증성뿐만 아니라 여드름에 관련하여 주요 물질인 안드로겐에 의해 제어되는, 피지분비선의 액 분비를 정상화하는 능력 때문이다. 그렇기 때문에, 1주에 2~5번, 20분씩 피부에 대한 국부 사용(200mg/cm2)은 특히 낭종성 여드름에 대해 효능이 있다.
7년 동안 복합성 및 영구성 낭종성 여드름의 병력을 가진 23세 여성의 경우, 항생제 및 시스-레티노산 치료에 내성이 생겼다. 이 환자는 PhA 없는 DHA 4g/일로 치료하였고, 2주 기간 동안 탈취되고 레몬 풍미를 첨가한 동일 기름을 피부에 직접 도포하고 20분 후 제거하였다. 첫 주 내에 그리고 8주 후, 차도의 기미가 검출되었고, 여드름 잔여물만 남았다. 여드름이 완전히 사라질 때까지 경구 투여 치료를 9개월 동안 계속 유지하였고, 그 후 적어도 1년 동안 새로운 여드름 활성은 검출될 수 없었다.
면역 체계 변성에 대한 치료제로서 DHA의 역할에 대한 지식은 시간이 지나면서 점점 커지고 있다. 특히, 아토피성 피부염에서, 임상 실험을 실시하였고, 여기서 DHA와 같은 지방산은 모든 알레르기 유발 항원에 대한 반응에서 사이토카인 (IL-5, IL-13, IL-10 및 IFN-감마)를 통해 면역 반응을 감소시켜, 그럼으로써 아아토피성 피부염의 작용을 감소시킨다. 특히, 아토피성 피부염 및 공기 알레르기들은 IL-10에 연관이 있고, 여기서 DHA는 특히 IL-10 및 알레르기 반응을 감소시키는 데 효능이 있다(Dunstan et al. 2003 및 2005).
본 발명으로부터의 DHA는 적은 알레르기성 활성을 나타내는데, 그것은 생선(알레르기 발생 경우)과 다른 공급원으로부터 고순도의 탈취된 그리고 펩티드 및 유도체에서 상당히 환원된, PhA 없는 DHA를 얻을 수 있기 때문이다.
특히, 본 발명의 조성물은 어린선(즉, 할리퀸 어린선, 심상선 어린선, 선천성 어린선양 홍피증)을 위한 것으로, 상기 생성물이 어린선의 유도제인 PhA가 없고, 그리고 DHA의 감염억제, 면역조절 및 세포소멸 억제 효과를 나타내며, 여기서 몇몇 유형의 어린선은 또한 안구 표면과 각막에 시각 명시(ocular manifestations)를 나타낸다.
실시예 17: 호흡기 및 천식에서 PhA 없는 DHA 조성물의 용도
DHA가 특별히 농축되어 있는 표적 조직들에서 또는 미토콘드리아 활성이 높은 조직에서, DHA는 이와 같은 조직들(즉, 광수용체, 신경세포, 폐포, 푸르키네 세포, 네프론, 수지상 세포, 타격을 입은 근세포, 간세포, 정자, 난자)의 기능적 활성을 증가시킨다. DHA가 이와 같은 세포 유형의 기능을 향상시키고, 한편 PhA는 그들의 미토콘드리아 활성의 감소를 통해 그들의 활성 및 정상적 기능을 감소시킨다.
이와 같이, DHA는 아토피성 피부염뿐만 아니라 하부 호흡계 질환 및 천식의 원인이 되는 공기-알레르기 유발 항원에 대한 과민감성 면역 반응을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 게다가, DHA는 수지상 세포에서의 작용을 통한 감염성 질환의 예방에 특별한 효과를 발휘하여, 감염 및 기관지 천식을 감소시킨다. 수지상 세포의 기능(항균성 작용, 멸균성, 거부반응의 예방, 항종양성)을 향상시킬 뿐만 아니라, DHA는 또한 호흡기 기능을 향상시켜, 특히 천식 및 만성 호흡기질환(EPOC)에 효능이 있다. DHA로의 치료는 만성 호흡기질환 및 천식에서 환기능력을 향상시킨다(Kompauer et al., 2008).
따라서, 낭포성 섬유증의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 사용은 상당히 권장할 만한데, 그 이유는 이와 같은 질병이 DHA가 결핍되어 있을 뿐만 아니라 만성 염증이 자주 발생하기 때문이다. 본 발명의 조성물은 PhA가 없기 때문에, 이것은 좀 더 강력한 감염 억제 효과를 낳는다. DHA는 본 발명에 기술된 서로 다른 세포 유형에서 특이적 기능들을 갖는다. 그러나, DHA에 의한 수지상 세포의 모듈화는 인간 질병에 보조 애쥬번트 및 예방책으로서 DHA로의 치료에 대한 가장 유의미한 일반적인 작용 메커니즘이고, 특히 PhA가 없을 때 그러한데, 후자가 수지상 세포의 기능을 변화시키고 감염에 대한 민감도를 증가시키기 때문이다.
실시예 18: 소화기 및 염증성 대장 질환( IBD )에서 PhA 없는 DHA 조성물의 사용
프로스타글란딘, 사이토카인 및 염증성 대장 질환(IBD)에서의 섬유소 용해성 및 항혈소판제로서의 항상성의 조절에 DHA의 치료 효과는 아마도 의학 문헌에 제일 먼저 알려진 응용이었을 것이다. DHA는 기타 PUFA에 비해 이점을 제공하는데, 특히 DHA의 고용량(1일 4g 초과)일 때, EPA 합성의 3 시리즈로부터 프로스타글란딘의 활성을 증가시키고; 또한 2 시리즈로부터 프로스타글란딘을 억제하고 그것의 유도체도코사노이드로부터 그것 자체의 활성을 갖는다. DHA는 또한 장 배상 세포 및 장세포의 분비 활성을 제어한다. 이와 같은 질환에서, 예방용 치료가 장시간 필요하다. 이와 같은 의미에서, DHA로의 치료는 상당히 충분한데, 그 이유는 시리즈 1의 가장 강력한 항-염증성 프로스타글란딘의 합성에 필요한 감마-리놀렌산(오메가 6)과 같은 다른 필수 지방산의 합성을 감소시키지 않기 때문이고, 여기서 그것의 합성은 EPA와 같은 다른 오메가-3 지방산에 의해 억제된다.
PhA 없는 DHA는 항-감염성 활성(세균, 바이러스, 균류, 기생충 억제)의 증가를 나타내고, 이것은 특히 용량이 4g/일보다 클 때 파악될 수 있다. 여러 장 염증성 질환은 만성 감염과 관련이 있다(즉, 헬리코박터 파이로리, 클로스트리디움 스포로제네스 등). 본 발명에서, 성인 및 아동의 궤양성 대장염, 위막성 대장염, 크론병, 교원성 대장염, 과민성 대장 증후군, 위염 및 식도염에 대한 연구들을 수행하였다.
상기 연구를 수행하기 위해, 급성 질환의 치료를 위한 DHA의 경구 투여량으로 1일 PhA 없는 DHA 4g에서 더 많게는 최대 1일 8g까지 사용하였다. (특히 직장염의 경우) 적은 양의 코르티코이드(즉, 5~10mg/일)와 함께 DHA의 직장 투여는 과민대장증후군에 효능 있는 치료법이 되었다.
궤양성 대장염을 앓고 있는 32세 여성 환자는 차도 없이 6년간 병을 앓은 병력을 갖고 있는데, 6년 동안 전신 코르티코 요법으로 치료를 받았고, 수술을 제안 받았다. 이 여성 환자는 8주 동안 코르티코이드와 함께 PhA 없는 DHA 12g/일로 치료를 받았고, 다코르틴(Dacortin) 10mg으로 시작하여, 15일에 2.5mg까지 감소시켰다. 치료 후 첫 48시간 내에, 출혈 및 복부 통증의 현저한 감소가 있었고, 20일째,출혈이 완전히 멈추었다. 8주 후, 생검을 실시한 결과, 염증성 활성의 유의미한 감소가 관측되었다. 코르티코 요법을 쓰지 않은 채, 최초의 투여량 12g/일을 그 후 8주 동안 매주 DHA 1g씩 감소시켜, 유지 용량 4g/일까지 감소시켜, 2년 동안 이 용량을 유지하였고, 그 기간 동안 궤양성 대장염은 불활성 상태를 유지하였다.
코르티코이드와 스태틴으로의 과민대장증후군의 치료에서 보조 애쥬번트로서의 DHA 사용은 전자의 용량을 감소시키고 지방 이영양증과 같은 부차적 효과의 감소를 가능하게 한다. PhA가 없는 DHA는 게다가 스태틴과 상호작용하지 않고, 특히심바스태틴과 관련된 횡문근융해증과 간 장애의 위험을 감소시키고, 그렇기 때문에 레트로바이러스성 치료와 관련된 지방 이영양증에 사용이 금지된 스태틴을 사용할 필요를 감소시킨다. DHA는 과트리글리세라이드 혈증을 감소시키고, LDL 콜레스테롤 분획을 감소시키지 않으면서 지단백 프로파일을 향상시키는데, 단 상당한 고용량(1일 8g 초과) 또는 체세포 돌연변이종과 결합될 때는 예외이다(Yates-A et al., 2009). 고용량(1일 8g 초과)의 DHA의 사용에 대한 대안은 1~4g/일의 사용 또는 저용량의 스태틴(즉, 심바스태틴 5mg)의 공동 사용일 수 있고, 이것은 지방 이영양증의 치료(즉, 항-레트로바이러스 및 코르티코이드로의 치료)에 효능이 있는 용량이다.
PhA 없는 DHA 4g/일과 코르티코이드로 3개월 이상 환자 7명의 치료가 일반적인 지방 이영양증의 형성을 감소시켰다.
실시예 19: 스포츠 의학에서 PhA 없는 DHA 조성물의 사용
스포츠 의학에서 DHA의 역할에 대한 관심이 증가하고 있는데, 그 이유는 DHA가 지단백 프로파일을 개선하고, 콜레스테롤을 감소시키고, 심 주기(cardiac frequency)를 제어할 때 푸르키네 세포 제어에 역할을 하고, 환기 기능 및 근세포에서의 호기성 대사를 향상시키기 때문이다. 프로 선수들을 대상으로 실시한 DHA 연구는 DHA가 고지혈증 활성이 더 큰 지방산이고, 이것이 생리학 및 생리적 병리학에서 DHA의 역할에 대한 연구와 일치되게, 호기성 능력을 향상시킴을 나타냈다. 구조화된 지질의 형태로 저용량(1일 0.5g)으로 만성 복용한 DHA는 일반적인 그리고 심지어 집중적인 육체적 노력 동안 항상성을 대체하는 데 중요한 보완물일 수 있다(Lopez-Roman et al., 2008).
이와 같은 연구들의 기반은 PhA가 특히 본 발명에 기술된 길항제인 작용 메커니즘이다. 따라서, 이론적인 측면에서, 본 발명의 DHA는 스포츠 생리학에서 더 큰 활성을 갖는다. 본 발명에 기술된 바와 같이, PhA는 강력한 독성을 가지고, 미토콘드리아 전자 수송 사슬에서 비가역 손상을 초래하여, 산화성 인산화의 심각한 감소를 일으키는데, 이것은 스포츠 성적 및 스포츠 의학에서의 호기성, 근육 및 심혈관계 대사에 아주 중요한 요소이다. PhA는 전도 지연 및 심인성 급사와 관련이 있다(Monning et al., 2004).
실시예 20: 갑상선 병증에 PhA 없는 DHA 조성물의 사용
현재, 갑상선염 발병률이 현저히 증가하고 있고, 이것은 증상이 있거나 없는 갑상선 기능이 정상인 인구에서 항갑상선 항체의 존재 하에 갑상선 기능 항진증과 갑상선 기능 저하증을 유도한다. 본 발명에서는 RP 환자에게서 항-TPO 항체의 존재(항갑상선 과산화효소 항체)와 DHA 결핍 사이의 관계가 기술되어 있다. 이와 같은 관계는 또한 갑상선 병증과 비정상적 수치의 항-갑상선 항체를 갖는 RP 환자에게서 측정되었다. DHA는 갑상선 기능 저하증의 경우 비만의 문제를 개선시키고, 심장보호 효과가 있고, 갑상선 병을 앓는 환자들에게서 지단백 프로파일을 개선시킨다.
PhA 없는 DHA 4g/일로의 치료는 DHA 결핍 및 비정상적인 수치의 항갑상선 항체를 갖거나 또는 갖지 않는, 17~49세의 자각 증상이 없는, 갑상선 기능 항진증 및 갑상선 기능 저하증 치료(사례에 따라 즉, Tyrodril 및 사이록신)를 받고 있는 환자 11명에게서 확고히 하였다. 치료 6개월 후, 사이록신으로의 치료 때문에 갑상선 기능 항진증뿐만 아니라 갑상선 기능 저하증 환자들(방사능 요오드에 의해 유도) 모두에게서 모든 환자는 항갑상선 항체의 유의미한 감소와 심 리듬 증상의 현저한 감소를 나타냈다.
실시예 21: 심혈관계 질환에서 PhA 없는 DHA 조성물의 사용
DHA는 심혈관계 위험 요소들, 당뇨 등을 막는 데 보조인자로서 효과를 나타내지만, 한편 이와 같은 조짐들의 치료에 유의미한 임상적 효과를 나타내는지는 입증되지 않았다. 그러나, DHA는 심혈관계 질환이 있는 환자들의 사망률 및 병적 상태를 감소시킨 바 있다. DHA는 이와 같은 위험 요인들과 관련이 있는 동맥경화 효과를 감소시킨다. 특히, 당뇨의 경우에 그러한데, 그것의 혈관형성 억제 효과와 망막(당뇨병성 망막증)에서의 신경세포 성장 인자 및 신경보호 인자 (당뇨병성 신경병증) 때문이다.
본 발명의 조성물은 강력한 항부정맥 효과를 나타내고, 특히 이것은 PhA가 없기 때문인데, PhA는 전도 지연 및 심인성 급사를 유도하기 때문이고, 이것은 여러 유형의 부정맥에서 시판 중인 DHA보다 효능이 더 좋다. 본 발명의 화합물, PhA 가 없는 DHA는 부정맥과 혈전증의 예방에 유용하고, 그뿐만 아니라 레이노드 증후군과 같은 일부 혈관 병증의 치료와 고중성지방혈증의 치료에 유용하다. 또한, DHA는 동맥경화 병증과 관련된 심부전, 고혈당증, 고혈압과 관련된 죽상경화증, 당뇨 및 호모시스테인의 높은 수치와 같이 동맥경화증과 관련된 기타 대사성 및 감염성 요인들 및 아포 단백질(a)에 의한 사망률을 감소시킨다. 이것은 특히 대뇌혈관 동맥경화증 및 허혈성 기원의 신경 변성을 가진 환자 2명 (높은 수치(30mg/dl 초과))에서 아포(a) 수치를 감소시켰다. 4g/일로의 치료는 아포(a) 수치를 50% 감소시켰고, 그들이 겪은 재발성 대뇌 경색증과 관련된 인지 기능을 정상화시켰다.
실시예 22: 기생충 및 감염성 질환에서 PhA 가 없는 DHA 조성물의 용도
항기생충 및 항감염성 물질(기생충, 세균, 바이러스 및 균류)로서 DHA의 주요한 작용 메커니즘은 앞서 본 발명에 기술된 바와 같이, 사이토카인, 백혈구, 식세포 작용에 의해 가능해진 그것의 강력한 항염증 효과와 관련된다(Tiesset et al., 2009). PhA는 상피세포 및 점막에 있는 하위 부류(subfamily) Rho로부터 GTPases의 활성을 감소시켜, 세균성, 균류성 및 기생충성 감염에 알맞게 되고, 이 메커니즘은 그들의 주요 감염성 메커니즘으로서 여러 박테리아 독소에 의해 사용된 메커니즘 (수도모나스(Pseudomonas), 클로스트리디움 등) (Engel & Balachandran, 2009; Genth- et al., 2006)이다. PhA는 또한 세포 분열 저지성 물질과 상호작용을 한다. 그렇기 때문에, PhA 활성은 DHA의 활성에 적대적이고, 감염에 있어 아주 특이적이고, 그래서 PhA 없는 DHA는 감염을 막는 데 좀 더 효능이 있다.
PhA와는 반대로, DHA는 염증 반응에 의해 가능해지는 폐 감염에서의 수도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 의한 세균성 감염(Tiesset et al., 2009) 그리고 DHA 특이적 도코사노이드에 의해(Haas-Stapleton, et al. 2007) 가능해진 균류 감염(Bajpai et al., 2009)을 감소시킨다. 헬리코박터 파이로리에 의한 세균성 감염에서, 키르비 바우어(Kirby Bauer)법을 사용한 체외 연구를 통해, DHA는 활성 멸균성 물질임이 입증되었다(Drago et al., 1999). 체외 및 체내 연구는 DHA의 항감염성(바이러스, 균류 및 세균) 및 항기생충성 능력을 밝혀낸다. DHA는 플라모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)에 의한 감염에서 심각하게 감소되고(Hsiao et al., 1991), 추가 감소(25%)가 망막 분해, 치매 및 다른 위험 요인들과 관련된 죽상경화증의 증가와 관련된 것이 알려져 있다. 바이러스성 감염(홍역) 또한 피탄산의 높은 수치와 관련된 바 있다(Pike et al., 1990).
PhA 없는 DHA는 예방용 화합물 및 항생제 효과의 포텐시에이터(potenciator)로서 사용될 수 있고, 그럼으로써 감염률을 감소시키고 특히 바이러스성 및 균류성 감염에서 재감염을 감소시킨다. 이와 같은 방식에서, 항생 물질의 사용이 감소되고, 그것의 역학적 활성을 향상시키고, 항생제 사용에 부차적인 바이러스성 및 균류성 감염을 피한다. 본 발명의 생성물이 항감염성 효과는 헬리코박터 파이로리 및 부패와 관련된 소화기 병증과 같은, 엄청난 추가-감염성 및 역학적 관련성이 있는 감염의 합병증 및 진화를 감소시킨다.
참고문헌
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Claims (61)

  1. 해양 기원의 기름으로부터 오메가-3 지방산이 풍부하고, 피탄산(PhA) 함량이 90μg/g미만인 조성물을 얻기 위한 방법으로,
    a) 지방산염을 얻기 위해 해양 기원의 기름이 검화(saponified)되고,
    b) 산성화된 기름을 얻기 위해 단계 a)의 지방산염이 산성화되고,
    c) 단계 b)의 산성화된 기름이 27Pa의 진공 하의 온도 10℃에서 글리세롤 구배 중에 초원심분리되고,
    d) 단계 c)의 글리세롤 구배가 온도 범위 0~-57℃에서 결정화되어, 고체상과 액체상을 얻고, 여기서 고체상은 포화 지방산, 일가(mono) 불포화 지방산 및 PhA를 함유하고, 액체상은 다가 불포화 오메가-3 지방산과 함량이 90μg/g미만인 PhA를 함유하고,
    e) 단계 d)의 액체상이 상층액 분리(decantation)를 통해 회수되도록 상기 고체상으로부터 분리되는 단계들을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, PhA 함량이 90μg/g미만인 오메가-3 트리글리세리드를 얻기 위해 오메가-3 지방산이 에스테르화되는 단계를 d) 단계 후 및 e) 단계 전에 추가로 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 a)의 검화 반응이 KOH, 물 및 에탄올로 수행되고, 상기 혼합물을 불활성 대기에서 1시간 동안 300rpm으로 40℃의 온도에서 교반하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 산성화가 단계 a)에서 얻은 지방산염을 불활성 대기에서 200rpm으로 70% 아세트산과 혼합함으로써 수행되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계 c)의 초원심분리가 등밀도(isopycnic)이고 42시간 동안 10000Og에서 수행되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계 c)의 초원심분리가 평형 없는 밀도 구배이고 24시간 동안 10000Og에서 수행되는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 단계 d)의 결정화가 0℃에서 수행되는 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 단계 d)의 결정화가 -3O℃에서 수행되는 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 단계 d)의 결정화가 -3O℃에서 수행되는 것인 방법.
  10. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 안검염, 안검 결막염, 결막염, 각막염, 건식 각결막염, 각막질환, 각막 이식 거부반응에 대한 치료, 라식 수술 전후에 각막두께 검사를 통한 평균 각막 세포 밀도의 증가로 이루어진 군에서 선택되는 안구 표면 또는 건조한 눈에서의 알레르기 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  11. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 노화 관련 습식 및 건식 황반 변성, 당뇨 관련 망막 변증, 녹내장, 안압 변동, 근시 관련 망막 변증, 망막 박리, 라식 수술 후 근시안에서 열공성 망막 박리, 허혈 기원의 2차성 황반 부종, 낭포 황반 부종, 어바인-가스 증후군, 베를린 암점, 맥락막염, 맥락망막염, 매독성 시신경 망막염, 홍역, 세포확대 바이러스, 맥락막 악성 흑색종; 미나마타병, 선단동통증 또는 헌터-러셀 증후군의 수은 중독; 일스 병의 망막 혈관염 또는 출혈성 외상성 망막층간 분리로 이루어진 군에서 선택되는 유전적 이영양증과 관련이 없는 망막 퇴행성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  12. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 스타르가르트 병, 레버 선천성 흑암시, X-연관 맥락막 결손, X-연관 망막층간 분리, 골드만-파브르 유리체 망막 위축증, 바그너 유리체 망막 위축증, 및 스틱클러 증후군, 가족성 평면부염으로 이루어진 군에서 선택되는 망막색소 변성증 없는 유전성 망막 위축증의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  13. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 특이적 변이 또는 DHA의 간에서의 합성 또는 이동의 실패의 결과, 또는 대사 장애의 결과로 인한 비-증후군성 망막색소변성증(RP), 멘델 유형의 전형적인 비-전신성 RP, 부채꼴 비-전신성 RP, 양쪽 비-전신성 RP, 한쪽 비-전신성 RP, 양쪽 비-전신성 RP, 반대 비-전신성 RP, 상염색체 우성 RP, 상염색체 열성 RP, X-연관 RP, 단순성 또는 산발성 RP, 유리체 망막 RP, 백점 RP, 색소 없는 RP, 맥락막 위축, 맥락막 이랑(gyrata), 망막 위축, 안진증 동반 RP, 어셔 증후군 유형 I, 어셔 증후군 유형 II, 어셔 증후군 유형 III, 어셔 증후군 유형 IV, 의원성 RP, 시오리다지나(Thioridazina), 클로로킨(CloroKine), 히드록시클로로킨(HidroxycloroKine), 클로로프로마진(Clorpromacine), 다양한 신경계, 심혈관계, 골근격계, 피부계 변성을 나타내는 PhA 및 PA의 증가와 함께 RO와 관련 있는 퍼옥시솜 결함이 있는 유전성 증후군, 젤웨거 증후군, 유아 레프섬 병, 신생아의 부신백질이영양증, 퍼옥시솜 생체내 합성(biogenesis) 장애, 점상 연골 이형성증(RCDP), 아크릴-조효소A 산화효소 결핍, 이작용기성(bifunctional) 촉매 결핍, 레프섬 병, β-산화 결핍, 가족성 어린선양 각질피부증, 쇼그렌-라손 증후군, 미토콘드리아 병증 질환, COX 결핍, 레이 증후군, 퍼옥시솜, 미토콘드리아의 결함을 갖고, RP 및 망막 변성과 관련된 유전적 증후군, 바센-콘츠바이크 증후군, 배튼 또는 리포푸신증 증후군, 저베타지단백혈증, 어셔 증후군, 할러보든-스파츠 증후군, 저세룰로플라스민혈증, 컨스-세이어 증후군, 뒤센 및 베커 근위축증, 로렌스-문-바르데-비들 증후군, 로렌스-문 증후군, 바르데-비들 증후군, 그라페 증후군, 홀그렌 증후군, 코카인 증후군, 알스트롬 증후군, 펠리제우스-메르츠바하 증후군, 소뇌성 운동실조증, 프리드리히 운동실조증, 리포푸신증, 특발성 가족성 흑내장, 테이-삭스 증후군, 할티아-산타부오리(Haltia-Santavuori) 증후군, 빌쇼스키-얀스키, 보그트-스필마이어-배튼-마이오우 증후군, 쿠프스 증후군, 골-신경-내분비 이형증, 점액다당류증, 헐러 증후군, 헌터 증후군, 쉐이레(Scheire) 증후군, MPS I-H/S, 산필리포 증후군, 바센 콘즈베이그(Bassen Kornzweig) 증후군, 흑인-망막 이형증, 골격계 이형증, 신장-안구-골격 증후군, 에드워즈 증후군, X 열성 연관 안구대뇌신장 또는 로위(Lowe) 증후군, 리냑-판코니 증후군(시스틴증), 거대 축삭 신경병증, 및 덴마크 가족형 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 망막색소 변성증 및 관련 증후군의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  14. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 홍채염, 평면부염, 맥락막염, 맥락망막염, 전포도막염, 후포도막염, 홍채모양체맥락막염, 감염성 포도막염, 브루셀라병, 단순포진, 대상포진, 렙토스피라증, 라임병, 추정되는 안구 히스토플라스모시스 증후군, 매독, 톡소카리아증, 톡소플라즈마증, 결핵, 칸디다증, 포도막염 증후군, 급성 후부 다발성 판모양 색소 상피증, 산탄 맥락 망막, 푹스 홍채 이색 모양체염, 다발성 맥락막염 및 전체 포도막염 증후군, 다발성 소실 백반 증후군, 점상 내층 맥락막 병증, 사행성 맥락막염, 및 강직성 척추염, 베체트병, 만성육아종병, 골부착 부위염, 염증성 대장질환, 소아 류머티스성 질환, 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 결절성 다발동맥염, 건선성 관절염, 리이터 증후군, 유육종증, 전신 홍반성 낭창, 보그트-고야나기-하라다 증후군, 휘플 병, 안구의 전안부, 후안부에서의 가면(masquerade) 증후군, 망막 모세포종, 망막 박리, 악성 흑색종, 백혈병, 소아 황색 육아종, 안구내 이물질, 림프종, 다발성 경화증 및 세망 세포 육종으로 구성된 군으로부터 적어도 하나 선택되는 포도막염 관련 전신성 장애로 이루어진 군에서 선택되는 포도막염 및 관련 질환들의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  15. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 고혈압성 망막증, 고혈압성 시신경 허혈성 신경병증, 고혈압성 맥락막 병증, 맥락막 경화증, 분지 또는 중앙 정맥 혈전증, 엘쉬니히 및 시에그리스트(Siegrist) 줄무늬, 죽상경화증, 대뇌 및 신경-안구 허혈증, 대동맥궁 증후군, 다카야수 질환, 다카야수 혈관염, 전층동맥염, 홍채모양체염, 공막염, 허혈증에 의해 생성되고 유리체 출혈로 이어질 수 있는 망막전(preretinal) 신생혈관생성, 각막 부종, 안구 수양액 중의 틴들(Tyndall), 증식성 당뇨병성 망막 병증 또는 신생혈관 녹내장, 경동맥 부전 또는 만성 안구 허혈, 안동맥의 폐색, 중심 망막 동맥의 폐색, 응고 장애, 단백질 S와 C의 결핍, 전안구염 망막염, 맥락막염, 돌기 울혈(papilar stasis), 망막 출혈, 로스 스테인, 면역복합체로 인한 병변, 시신경 병증, 허혈성 망막 병증, 안근마비, 안와 위종양, 안구 허혈성 증후군, 후두엽 경색증, 복시증, 눈꺼풀 부종, 눈꺼풀 하수증, 눈꺼풀 모세혈관 확장증, 결막, 망막, 중심 망막 동맥, 안동맥 또는 안동맥의 분지의 급성 폐색, 후안부 섬모 동맥의 폐색, 비동맥성 허혈 시신경 병증, 저관류 및 흐릿한 시야에 의한 만성 안구 허혈 증후군 또는 샤이-드래거 증후군으로 이루어진 군으로부터 적어도 하나 선택되는 망막 퇴행성 질환 및 혈관 질환 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  16. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 백내장, 원시, 근시, 노안, 유리체염, 유리체 박리 및 안내염으로 이루어진 군에서 적어도 하나 선택되는 시력 손실 및 안과적 용도의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  17. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 유전성 운동 감각 신경병증, 치매, 알츠하이머 병, 다발성 경화증 및 운동 실조증으로 이루어진 군에서 적어도 하나 선택되는 신경 또는 정신 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  18. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 전이, 가장 만연된 종양성 세포주, 결장암, 전립선암, 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 식도암, 췌장암, 신장암, 간암종, 뇌암, 교모세포종, 흑색종, 망막 모세포종, 담낭, 다발성 골수종, 내분비암 및 인슐린 저항과 관련된 암들로 이루어진 군에서 적어도 하나 선택되는 종양 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  19. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, IgA에 의한 신증 또는 전신 홍반성 낭창과 관련된 신증, 신부전증, 사구체 병증, 세뇨관증, 간질 및 신장 혈관 질환으로 이루어진 군에서 적어도 하나 선택되는 신증(nephropathies)의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  20. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 허혈성 변동, 동맥경화증, 과트리글리세라이드 혈증, 과지방혈증, 심실성 부정맥, 고혈압, 당뇨 및 아포단백질 α(아포(α)) 수치가 증가된 것인 심혈관계 질환으로 이루어진 군에서 적어도 하나 선택되는 심혈관계 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  21. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 횡문근변성, 간 독성, 심장 독성, 신경 독성, 부종, 지방 이영양증, 스태틴, 코르티코이드, 항레트로바이러스 및 면역억제제에 관련된 면역억제로 이루어진 군에서 적어도 하나 선택되는 의원성(iatrogenic) 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  22. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 섬유근육통, 만성 피로 증후군, 관절증과 골다공증의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물, 또는 류머티스성 관절염, 소아 관절염, 쇼그렌 병, 강직성 척추염, 전신 홍반성 낭창, 관절증 및 골다공증으로 이루어진 군에서 적어도 하나 선택되는 자가면역 질환, 만성 염증 질환 또는 골근계 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물.
  23. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 남성형 탈모증, 주사비, 여드름, 습진 및 건선으로 이루어진 군에서 적어도 하나 선택되는 피부과 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  24. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 알레르기 질환, 천식 또는 만성 호흡기질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  25. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 자가면역, 바이러스성 또는 독성 위염, 식도염, 크론병, 궤양성 대장염, 위막성 대장염, 교원성 대장염, 장 투과성의 변성, 흡수장애 증후군, 식품 불내성 및 알레르기 및 치질로 이루어진 군에서 적어도 하나 선택되는 소화기 질환 또는 염증성 대장 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  26. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 기생충성 및 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  27. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 소화기계 흡수 장애 증후군, 낭포성 섬유증, 장 흡수장애 증후군, 췌장염, 췌장 기능부전 담석증, 영양 장애, 거식증, 폭식증으로 이루어진 군에서 선택되는 DHA 결핍의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  28. 65~95 중량% 범위로 DHA를 포함하고, 5μg/g 미만의 PhA 함량의 오메가-3-지방산 및 약제학적 희석제 또는 담체를 포함하는, 시력, 기억력 및 인지 기능을 향상시키고, 운동 능력을 증대하고, 병변을 감소시키고, 또는 정상적인 근신경계 피로를 감소시켜서 생리적 상태를 개선하는 임산부, 수유부 또는 아동을 포함하는 인간 사회에게서 관찰되는 일반적인 영양학적 DHA 결핍의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
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  33. 제10항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, DHA의 범위가 75~95 중량%인 것인 약제학적 조성물.
  34. 제33항에 있어서, DHA의 범위가 80~95 중량%인 것인 약제학적 조성물.
  35. 제10항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 오메가-3 지방산이 부가적으로 5~35 중량% 범위의 EPA를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
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  37. 제10항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 부가적으로 약제학적 또는 영양학적 용도를 목적으로 하는 부형제와 애쥬번트 중 적어도 하나를 포함하는 약제학적 조성물.
  38. 드링크제, 소프트겔, 하드겔, 수용성 현탁액 또는 분말의 형태로, 65~99 중량% 범위의 오메가-3 지방산 및 90μg/g 미만의 PhA 함량을 포함하는 조성물을 포함하는 영양 보충제.
  39. 드링크제, 소프트겔 또는 하드겔, 수용성 현탁액 또는 분말의 형태로, 65~99 중량% 범위의 오메가-3 지방산 및 90μg/g 미만의 PhA 함량을 포함하는 조성물을 포함하는 식품.
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