PT2429317T - Composições ricas em ácidos gordos ómega-3 com um teor baixo de ácido fitânico - Google Patents

Composições ricas em ácidos gordos ómega-3 com um teor baixo de ácido fitânico Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
COMPOSIÇÕES RICAS EM ÁCIDOS GORDOS ÓMEGA-3 COM UM TEOR BAIXO DE ÁCIDO
FITÂNICO
SETOR TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao procedimento para obter composições ricas em ácidos gordos ómega 3 com teor em ácido fitânico abaixo de 90 pg por grama de óleo. Apresente invenção também se refere à obtenção de composições ricas em DHA com um teor de ácido fitânico inferior a 90 pg por grama de óleo, mais especificamente entre 650-950 mg/g, isto é, entre 65 % e 95 % de DHA em peso e valores de PhA inferiores a 90 pg, preferentemente inferiores a 5 pg por grama do óleo que forma a composição. As composições obtidas são utilizadas no campo dos suplementos alimentares, produtos nutricionais e produtos farmacêuticos devido à sua ação profilática e efeito terapêutico.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Ácidos gordos ómega 3 são uma família de ácidos gordos polinsaturados cuja característica comum consiste em que a última ligação dupla está localizada na terceira ligação C-C começando desde o grupo metilo final do ácido gordo. Os ácidos gordos ómega 3 são essenciais, isto é, o corpo humano não pode produzi-los internamente e, portanto, é necessário tomá-los através da dieta ou através de composições. Devido à sua natureza polinsaturada, os ácidos gordos ómega 3 têm funções físico-químicas muito particulares no corpo humano (por exemplo, um ponto de fusão muito baixo) e, portanto, têm sido amplamente estudados. Hoje em dia, sabe-se que existem até 10 ácidos gordos ómega 3 (por exemplo, ácido esteárico), embora a sua presença no corpo humano seja em quantidades muito pequenas e a sua atividade fisiológica seja muito baixa ou ausente, exceto para DHA e/ou EPA. O ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico ou EPA, bem como 4,7,11,13, 16,19-docosahexaenoico ou DHA são os ácidos gordos ómega 3 com a maior parte das funções fisiológicas, especialmente DHA, que tem funções específicas na retina, esperma, tecido nervoso, etc.
Ambos o DHA e EPA têm funções fisiológicas comuns, embora o DHA tenha funções fisiológicas especificas que nenhum outro ácido gordo tem, particularmente nos fotorecetores, tecido nervoso e esperma, entre outros. A ingestão de doses elevadas de DHA aumenta os niveis de EPA, embora o contrário não aconteça; adicionalmente, o DHA não altera a síntese de outros ácidos gordos (Voss et ai., 1992).
Desde a perspetiva fisiológica, o DHA é o ácido gordo ómega 3 mais interessante desde o ponto de vista biológico para o consumo humano. Uma vez que o DHA e EPA estão presente nas mesmas fontes de alimentos e uma vez que o EPA é mais abundante, inicialmente o EPA foi aquele que mais chamou à atenção, sendo mais fácil de obter. Contudo, o conhecimento sobre estes dois ácidos gordos ao longo dos últimos 15 anos, aumentou significativamente o interesse pelo DHA e pela sua purificação necessária uma vez que, além das exceções, na sua maioria está presente em não mais do que 10-15 % das gorduras nas fontes de alimentos mais abundantes. A maioria das fontes para obtenção de ácidos gordos ómega 3 ricos em DHA são de origem marinha: microalgas (por exemplo, Schizochytrium sp., Crypthecodinium sp. , Ulkenia sp. , Euglena sp.), crustáceos (por exemplo, krill Euphausia superba), peixes gordos (por exemplo, Thunnus ibynnus thynnus ou atum vermelho) e mamíferos marinhos; em adição a cogumelos e leveduras (por exemplo, Yarrowia lipolytica) e bactérias (por exemplo, Lactobacillus spp.). A fonte mais abundante com a pureza mais elevada e mais adequada para a obtenção de ácidos gordos ómega 3 ricos em DHA para o consumo humano é o peixe, uma vez que a produção é de 140 milhões de toneladas de peixe e marisco por ano (FAO, 2007) e estima-se que a produção de óleo de peixe seja responsável por 1 milhão de toneladas por ano (IFFO, International Fishmeal & Fish oil Organisation) . O peixe mais adequado é o atum e outras espécies com o teor mais elevado de Ómega 3, estando a percentagem de DHA além de 20 % em peso; além disso, uma vez que são produtos alimentares, exibem a garantia e segurança mais elevada na saúde pública. Por outro lado, em conjunto com o peixe, o krill representa a maior reserva e biomassa de DHA do planeta. Contudo, a exploração do krill para obter ácidos gordos ómega 3 representa um sério e conhecido risco para as cadeias tróficas e o desenvolvimento de espécies e peixes necessários para a dieta humana. Uma possibilidade no futuro consistiria em obter tal krill em fábricas de krill, onde não existiria qualquer risco para as cadeias tróficas e, adicionalmente, se poderia reproduzir num ambiente livre de contaminante que normalmente existiriam nas águas marinhas.
Numerosos autores consideram que o DHA é um nutriente deficiente na maioria das dietas em todo o mundo. Mas, em adição à sua relevância como um tratamento nas doenças deficientes em DHA, a sua ação fisiológica torna-o no cofator mais importante para o tratamento e prevenção da doença neurodegenerativa tal como o Alzheimer ou esquizofrenia; doenças degenerativas da retina, cancro, doenças autoimunes, doenças inflamatórias dermatológicas e articulares crónicas, doenças renais e urológicas (próstata), alopecia androgénica, alterações na fertilidade masculina e feminina, transtorno de atenção primário ou hiperatividade, desenvolvimento intelectual e cognitivo, bem como necessário para o desenvolvimento visual e particularmente para a região macular, doenças cardiovasculares, diabetes e hipertrigliceridemia.
Para o tratamento de numerosas patologias, é necessário utilizar doses dezenas de vezes mais elevadas em relação aquelas obtidas apenas com a dieta (geralmente > 2-4 gramas), o que torna necessária a obtenção de composições de DHA com elevadas purezas de modo a alcançar o consumo de doses adequadas (isto é, para obter uma dose de 4 gramas de DHA a partir de composições com 20 % de óleo, seria necessário tomar 20 gramas de óleo ou 40 géis moles convencionais de 500 mg).
Os ácidos gordos polinsaturados são altamente instáveis na sua forma livre, de modo que a sua absorção oral requer estabilização, que pode ser alcançada através de esterificação ou ligação a outras moléculas tais como glicerol e etanol, que as torna mais estáveis e aumenta a sua biodisponibilidade. O primeiro veiculo (glicerol) permite uma pureza mais elevada (triglicéridos), estabilidade e exibe uma biodisponibilidade máxima, evitando a presença de álcool, que é particularmente importante em casos nos quais são necessárias doses elevadas e quando, em numerosas aplicações, a sua utilização é crónica, além de em mulheres grávidas e crianças. Os triglicéridos são ingeridos em concentrações centenas de vezes mais elevadas como parte do alimento normal e são a fonte nutricional natural e farmacocinética de ácidos gordos nos tecidos alvo. A farmacocinética dos triglicéridos é máxima e permite a pureza máxima da substância ativa, DHA, e portanto os diglicéridos de DHA exibem a melhor absorção e têm mais implicações fisiológicas e metabólicas.
Em paralelo a uma sensibilidade aumentada em relação à conexão entre a alimentação e a saúde, existe uma aceitação crescente do peixe como uma fonte nutricional saudável. 0 peixe é uma importante fonte de proteínas de alta qualidade, minerais e vitaminas, em adição aos ácidos gordos ómega 3 polinsaturados, cujos benefícios para a saúde são bem reconhecidos. Contudo, um estudo recente realça o risco associado com os contaminantes ambientais tais como mercúrio e dioxinas, que são conhecidos por se acumularem nos peixes. A síntese de ácidos gordos e a cadeia trófica nos organismos vivos são responsáveis pelas propriedades físico-químicas das membranas e da sua adaptação fisiológica para as condições ambientais (por exemplo, temperatura). Os ácidos gordos com o ponto de fusão (PF) encontrado nos fosfolípidos e gorduras de organismos vivos são ácido pristânico (PA), ácido fitânico (PhA), EPA, DHA, ácido araquidónico (AA) e ácido esteárico (SDA), que conferem condições fisiológicas ótimas sob baixas temperaturas. Os organismos utilizam duas estratégias químicas para obter ácidos gordos com um PF muito baixo: metilação e a insaturação de ácidos carboxílicos. Tendo em consideração as condições extremas encontradas nos organismos de origem marinha, não é surpreendente que as fontes mais ricas de tais ácidos gordos se encontrem principalmente em águas marinhas frias. Neste sentido, os ácidos gordos com o PF mais baixo encontrados na natureza, alimentos e nos produtos derivados das gorduras tais como óleos de origem marinha, são os ácidos gordos de cadeia ramificada longa (018) com vários grupos metilo, dos quais PhA é o que está presente nas concentrações mais elevadas e os ácidos gordos ómega 3 lineares de cadeia longa (018) , onde os dois mais relevantes devido à sua concentração e abundância são DHA e EPA. 0 PhA está presente na dieta humana ou em tecidos animais onde pode passar através da clorofila das plantas. 0 PhA é formado a partir do álcool correspondente, fitol e é oxidado para formar PA, o que explica porque é comum encontrar PA e PhA em conjunto. 0 PhA está envolvido numa patologia humana, Síndrome de Refsum, que é caracterizada por uma acumulação de PhA no sangue e tecidos, tendo-se descoberto subsequentemente que está conectada com uma deficiência na via de alfa-oxidação no fígado.
Enquanto a maioria dos alimentos contêm menos do que 5 pg de PhA/g, aqueles com o teor mais elevado excedem 1 mg de PhA/g, e no caso do peixe ele excede 750 pg/g, sendo esta quantidade proporcional à percentagem de gordura. É considerado como o alimento com a concentração mais elevada de PhA e de risco mais elevado (Grupo III) para o consumo em doenças tais como Retinite Pigmentosa (RP) e defeitos na oxidação de PhA tal como doença de Refsum. Por outro lado, os processos para a separação das gorduras na produção do óleo de peixe, aumentam significativamente a concentração de PhA.
Sabe-se que a fração gorda dos peixes é a principal fonte dos ácidos gordos ómega 3 DHA e EPA na dieta, mas também é a principal fonte de PhA. Fontes com o teor mais elevado de EPA e DHA representam a maioria da ingestão de DHA e EPA, estando associadas, ao mesmo tempo, com a fonte de concentrações e ingestão mais elevadas de PhA. Ambos o DHA e PhA partilham as mesmas fontes, muito além dos produtos para utilização alimentar e farmacêutica, encontrando assim as concentrações mais elevadas de DHA e PhA nos produtos de origem marinha e microbiana. Normalmente, o PhA é encontrado em conjunto com EPA e DHA. As bactérias, fungos e microalgas são os organismos na natureza com a concentração mais elevada de PhA. Os óleos derivados a partir de microrganismos com um teor rico em DHA e a menor proporção de PhA, excedem frequentemente os 100 pg/g.
Todas as dietas ocidentais estudadas, incluindo a Mediterrânea, têm uma ingestão diária de 100-150 mg de DHA, enquanto numerosos autores estabelecem uma necessidade diária de 200-300 mg. O DHA é o único nutriente para o qual praticamente toda a população no mundo inteiro tem uma deficiência na sua dieta.
Um ponto muito importante que não é normalmente utilizado na literatura é que o DHA da dieta é 100 % de origem animal, uma vez que não existe DHA nas fontes de alimento vegetais (exceto para algumas algas que não são utilizadas como alimentos). Portanto, a necessidade nos vegetarianos é muito mais elevada, particularmente em veganos estritos, nos quais podem ser encontrados os níveis mais baixos. A sua deficiência é ainda maior e considerada por alguns autores como um marcador, na doença Retinite Pigmentosa (RP) bem como em doenças metabólicas neurodegenerativas associadas com defeitos peroxissomais.
Dado o interesse generalizado na purificação de ácidos gordos ómega 3, principalmente DHA, EPA ou ambos, durante décadas existiram numerosas patentes e procedimentos regulares para obter óleos refinados ricos em DHA e EPA para obter purezas mais elevadas.
Contudo, como mostrado na figura 3, os óleos refinados e purificados que existem no mercado e que são obtidos com processos patenteados e Boas Práticas de Fabrico (Good Manufacturing Practice, GMP) , contêm elevados níveis de PhA, mesmo naqueles óleos com uma alta pureza de DHA.
Efeitos negativos do PhA na saúde. 0 PhA é um fator de risco para a saúde pública uma vez que induz cancro da próstata, mama, cólon... bem como distúrbios neurológicos e visuais (Lloyd-MD et ai., 2008; Allen-NE et ai., 2008; Thornburg-G et ai., 2006; Xu-J et ai., 2005). Em adição,é citotóxico (Komen-JC et al., 2007; Schonfeld et Reiser, 2006; Schonfeld et al., 2006, Heinz, 2005; Elmazar & Nau, 2004) . A ingestão de PhA é um fator de risco para o desenvolvimento e/ou evolução de doenças: oftalmológicas (retina, cataratas, olhos secos...), alterações olfativas e auditivas, neurológicas (Alzheimer, encefalopatia...) e alterações psiquiátricas, alterações nefrológicas, cardiovasculares (anormalidades elétricas S. de Purkinje alterações do músculo liso, cardiopatia isquémica, aterosclerose), miopatias e amiotrofia grave, alterações ósseas, alterações hepáticas, alterações da fertilidade masculina e feminina, doenças autoimunes e inflamatórias crónicas (doença de Crohn, colite ulcerosa, LES) e cancro (próstata, cólon, mama, rim, ovário, alguns tipos de leucemia, etc.).
Os mecanismos exatos pelos quais PhA é tóxico para os tecidos neurossensoriais e nervosos, coração, rim, fígado, intestino músculo liso e estriado, próstata, mama, esperma, pulmões e sistema ósseo está a ser gradualmente elucidada. Os mecanismos melhor conhecidos estão conectados com a expressão excessiva de marcadores tumorais (a alfa metilacil CoA racemase (AMACAR) ou a SPC-2) e a ação protonofórica de desacoplamento da cadeia de transporte de eletrões da cadeia respiratória de transporte de eletrões nas mitocôndrias e nas membranas citoplasmáticas (por exemplo, fototransdução na retina). A uma dose muito baixa, 0 PhA é uma das moléculas com a indução mais elevada de stress oxidativo ín vivo, ele potência a teratogénese e é um bom indutor de aterosclerose e morte por insuficiência cardíaca. 0 PhA é diretamente tóxico para as mitocôndrias e exibe uma atividade aterogénica potente. 0 PhA tem uma atividade do tipo de rotenona no desacoplamento do complexo I na fosforilação oxidativa na membrana mitocondrial interna, resultando na produção subsequente de espécies reativas ao oxigénio e a lipoperoxidação in vivo de DHA e outros ácidos gordos polinsaturados ou PUFA (Kahler-S et ai., 2005) . Ele reduz os níveis de DHA nos fosfolípidos, principalmente nos fotorrecetores e tecido nervoso, aumentando a sensibilidade à isquemia, a lesões de reperfusão cardiovascular e à oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDLox), aumentando a atividade anti-inflamatória de macrófagos, reduzindo a atividade energética e metabólica (inibindo a fosforilação oxidativa) e induzindo a mutação do ADN mitocondrial. Esta atividade metabólica tóxica explica, por si mesma, porque os fotorrecetores, epitélio pigmentado, tecido nervoso, coração (células de Purkinje), rim, fígado, ovário, esperma, pulmões... todos os tecidos ricos em mitocôndrias, são os primeiros a ser afetados nos pacientes com elevadas concentrações de PhA. O PhA induz a apoptose mediada por Ca2+ nas células de Purkinje (Powers-J.M et ai. 1999) e morte cardíaca súbita em modelos animais. O PhA produz isquemia, apoptose do músculo liso vascular, é aterogénico e particularmente cardiotóxico. Uma deficiência na proteína de transporte de esterol-2 (SPC-2) produz morte cardíaca súbita pela acumulação de PhA em ratinhos . O PhA induz a apoptose em culturas celulares de células musculares lisas (VSMC) em seres humanos, ratinhos e porcos. A atividade alterada da reabsorção de Ca2+ e a apoptose de osteoclastos devido a PhA resulta em anormalidades ósseas. As proteínas ligadas a Ca2+ nas membranas dos segmentos exteriores dos fotorrecetores, onde a calmodulina está particularmente concentrada, são responsáveis pelo fluxo de Ca2+ que controla múltiplos eventos nos fotorrecetores, incluindo fototransdução e transdução sináptica. A função da calmodulina é mediada por numerosas proteínas ligadas a ela incluindo GTPases. Quando a concentração de calmodulina é reduzida nos fotorrecetores, ocorrem defeitos na visão, particularmente na adaptação à luz e escuridão. 0 PhA é diretamente tóxico para as células ganglionares ciliares que afetam os nervos ganglionares parassimptáticos na região posterior da orbita ocular, responsável pela contração pupilar e pela acomodação da visão (presbiopia, hipermetropia, fotossensibilidade, etc) . 0 PhA interfere com a função das células ciliares, corpos basais e proteínas ligadas a microtúbulos necessários para a biogénese dos cílios, mediado pela interação dos diferentes tipos de miosina e prenilação de Rab GTPases nos cílios primários dos fotorrecetores, afetando o transporte de proteínas essenciais tais como opsina, células olfatórias, cóclea, células renais, sistema respiratório, esperma, microvilosidades intestinais, bem como em relação ao movimento de melanossomas no epitélio pigmentado na retina. A RP, que exibe alterações no metabolismo de PhA, é um modelo da alteração das células ciliares, encontrando-se anomalias do axonema do esperma e das células ciliares dos bastonetes, afetando a renovação dos segmentos externos dos bastonetes que dependem do corpo ciliar, resultando em dano visual irreversível. Igualmente, na RP com síndromes não associados, são encontradas alterações dos potenciais evocados auditivos e alterações da audiometria compatível com alterações cocleares características das células ciliares. As alterações significativas do corpo ciliar resultam em RP e surdez de uma forma que é comparável com a síndrome de Usher e outras síndromes como em pacientes não associados com síndromes com alterações auditivas. A proteínas-G pequenas da família Rho e Rab requerem a adição destas frações de isoprenilo nos seus terminais C para a função de GTPase normal. As vias de sinalização de Rho GTPase são criticamente necessárias para direcionamento da intervenção terapêutica nas doenças nefrológicas, distúrbios neurológicos (mielinização), progressão do cancro, doenças cardiovasculares, doenças infeciosas, etc. 0 PhA e outros isoprenoides perturbaram a sinalização de
Rho-GTPase, particularmente a via de Rac, numa via oposta a DHA e estatinas. 0 PhA altera as Rho-GTPases de uma forma comparável com algumas toxinas bacterianas no epitélio e mucosa digestiva e respiratória para desenvolver os processos invasivos e infeciosos; processos tumorais e metástases (por exemplo, prostáticas, mamárias), lesões renais (glomerulares, tubulares, etc.) e desmielinização.
Estas GTPases são o mecanismo principal que explica porque o DHA sem PhA é mais eficaz do que o resto de DHA com PhA nas numerosas aplicações da presente inovação.
Seguindo esta mesma linha, PhA e PA são controladores dos principais e mais potentes mediadores dos fenótipos de inflamação e angiogénese. A indução da angiogénese, TNF alfa, GBP-1, GBP-2 e citoquinas inflamatórias (Cl) por PhA e PA é um fator determinante para o desenvolvimento de cancro (metástases), doenças autoimunes, doenças inflamatórias, doenças infeciosas, renais, pulmonares e neurológicas. 0 PhA torna-se em PA por oxidação e ambos o PhA e PA, induzem a apoptose mediada pela formação de UNAM da óxido nítrico sintase e elevadas concentrações da proteína dentro de 2 horas a partir do tratamento (Idel et ai., 2002) . Além disso, O PhA e PA controlam os principais e mais potentes mediadores dos fenótipos de angiogénese e inflamação. Igualmente, PhA e PA são os indutores mais potentes da ativação e secreção do fator de necrose tumoral α (TNFa) (Idel et ai., 2002) . A expressão da proteína de ligação a guanilato humana (GBP)-1 é altamente induzida pelas citoquinas inflamatórias (ICs) e, portanto, podem caracterizar as células ativadas por IC. A GBP-1 é um novo marcador de ativação celular que caracteriza o fenótipo ativado por IC das células endoteliais. A GBP-1 é um importante regulador da resposta anti-angiogénica das células endoteliais às ICs. A GBP-1 é uma proteína citoplasmática e a sua expressão nas células endoteliais é seletivamente induzida pelo interferão-gama, interleucina-lalfa, interleucina-lbeta, ou TNF-alfa mas não por outras citoquinas, quimiocinas, ou fatores de crescimento. O PhA e PA são indutores de TNF alfa e de interferão gama. A expressão de GBP-1 está altamente associada com as células endoteliais vasculares mas não foi detetável na pele, mas foi altamente induzida em vasos de doenças cutâneas com uma elevada componente inflamatória incluindo psoriase, reações adversas a fármacos e sarcoma de Kaposi. Foi demonstrado que a expressão de GBP-1 e da metaloproteinase da matriz-1 (MMP-1) está inversamente relacionada in vitro e in vivo, e que a GBP-1 inibe seletivamente a expressão de MMP-1 nas células endoteliais, mas não a expressão de outras proteases. 0 último descobrimento indicou que a inibição da formação de capilares deve-se, especificamente, à repressão da expressão de MMP-1 por GBP-1, e não é afetada pela atividade anti-proliferativa do domínio helicoidal de GPB-1 (Guenzi et ai., 2003). 0 PhA potência os efeitos teratogénicos do ácido retinoico (Elmazar e Nau, 2004) , sendo particularmente relevante, já que o DHA, que está frequentemente associado com o PhA, é recomendado durante a gravidez, amamentação e alimentação das crianças. A retinose pigmentar (RP) é um modelo ideal para estudar a toxicidade de PhA na presença de DHA, tal como será visto mais adiante neste documento. As propriedades físico-químicas de PhA torna-o num competidor importante de DHA quando se torna incorporado na posição 2 de fosfolípidos (a posição habitual de DHA nos fotorrecetores). 0 PhA tem um número elevado de uniões de rotação livre (14) e tem um ponto de cristalização muito baixo, permitindo uma elevada fluidez na membrana. Contudo, o PhA carece da conformação estrutural característica do DHA para as interações de Van der Waals, com a hélice-alfa de rodopsina, necessária para a sua mobilidade na membrana e estrutura terciária. Como uma consequência, PhA reduz a atividade da rodopsina e da fototransdução. O PhA tem a capacidade de desacoplar as membranas dos fotorrecetores resultando numa falha na fototransdução (hiperpolarização continua) encontrada na RP. O PhA não é sensível à degradação pela oxidação e é resistente a condições distróficas tais como aquelas encontradas na RP. Isto acontece especialmente em casos de deficiência em DHA, tal como na RP, consequência da distrofia, onde é a única doença na qual existe uma deficiência em DHA, sendo considerada como um marcador da doença. 0 PhA modifica a função dos fotorrecetores através da sua incorporação com os fosfolípidos e triglicéridos, deslocando o DHA (McColl e Converse, 1995; Powers et al., 1999, Monning et ai., 2004) e reduzindo os níveis de DHA devido à lipoperoxidação e dano mitocondrial induzido pelo PhA. 0 PhA também tem a capacidade tóxica de atuar como um transportador de protões (agente de desacoplamento) não apenas nas mitocôndrias mas nas membranas dos fotorrecetores (Gutknecht-J, 1988), alterando assim a polarização dos segmentos externos dos fotorrecetores.
Deslocamento de DHA por PhA. 0 PhA modifica a função dos fotorrecetores através da sua incorporação nos fosfolipidos e triglicéridos, deslocando assim o DHA do segundo carbono dos fosfolipidos nas membranas dos ROS e nas mitocôndrias. Portanto, o deslocamento de DHA das membranas por PhA altera a função dos fotorrecetores, comportando-se como um antagonista na fototransdução, alterando a homeostasia do cálcio e a regeneração da rodopsina. 0 deslocamento de DHA por PhA é um dos vários mecanismos de ação em algumas doenças (por exemplo, RD = Doença de Refsum) sendo um mecanismo parcialmente patogénico.
Enquanto o DHA é um inibidor da apoptose bem como um fator neurotrófico ou de sobrevivência para os fotorrecetores, 0 PhA é um dos indutores mais potentes de oxidação e apoptose in vivo, interferindo de uma forma antagonista com os mecanismos de ação de DHA. Os níveis de PHA no óleo interferem com a atividade de DHA, uma vez que a capacidade do DHA para inibir a apoptose na retina é reduzida pela presença de PhA de uma forma dependente da dose. 0 PhA produz a apoptose nos fotorrecetores em modelos animais com RP produzindo um dano irreversível nas mitocôndrias. Sob estas condições, os péptidos responsáveis pela sobrevivência dos fotorrecetores são incapazes de inibir a apoptose. Contudo, o DHA é o único ácido gordo que neutraliza as espécies reativas na retina sob condições distróficas. 0 PhA é particularmente tóxico nas retinas distróficas e o DHA reduz os seus efeitos. Foi provado que o DHA é um inibidor do stress oxidativo e do dano mitocondrial irreversível que causa a degeneração dos fotorrecetores (Rotstein et al. 2003).
Como tal, pode concluir-se que o PhA além de ser citotóxico, é um antagonista do DHA com todas as implicações envolvidas. Especificamente, o PhA de uma forma antagonista a DHA, induz a apoptose através das mitocôndrias.
Na presente invenção foram desenvolvidas duas experiências pré-clínicas induzindo a apoptose em fotorrecetores com Paraquat (Figura 1) e MNU (Figura 2) , de modo a estudar o efeito anti-apoptose in vitro e in vivo de DHA em conexão com a concentração de PhA. Em ambas as experiências demonstra-se que a capacidade anti-apoptose do DHA nos fotorrecetores está inversamente correlacionada com a concentração de PhA. A atividade anti-apoptose mais elevada é obtida com concentrações entre 0 e 20 pg/g, aqui a razão Bcl-2/Bax foi significativamente mais baixa do que nos ratinhos alimentados com < 5 pg/g.
Toxicidade de PhA. Não é necessária uma alteração metabólica ou interação farmacológica ou alimentar da oxidação de PhA de modo a exibir toxicidade, uma vez que a dose nutricional de PhA através de uma dieta convencional, também resulta em variações significativas de PhA e um risco aumentado para a saúde e toxicidade. Numa forma esquemática, a toxicidade de PhA através do seu consumo a baixas doses, está relacionado com as seguintes situações: 1. Dentro do processo oxidativo do PhA está incluída parte do processo fisiopatológico: a indução de AMACAR. O efeito do PhA na saúde também é determinado pela expressão excessiva de determinados marcadores moleculares associados com numerosos cancros de grande valor epidemiológico: cancro da próstata, cancro colorretale de células renais. Existe a evidência de que este mesmo marcador está conectado com os cancros ováricos, de mama e endócrinos relacionados com uma resistência à insulina o PhA é essencial para a sobrevivência de várias linhas celulares tumorais (próstata, rim, mama, cólon, pulmão) resultando na expressão excessiva de AMACAR e SPC-2. Foram descritos casos com deficiências em AMACAR com neuropatia, RP e um aumento no PhA e PA (Ferdinanduse et al., 2000). 2. A falha na oxidação de PhA com uma acumulação aumentada de PhA nos pacientes com RP tal como na doença de Refsum juvenil ou adulta, síndrome de Zellweger, adrenoleucodistrofia neonatal e condrodisplasia punctata rizomélica. 3. Contudo, outras doenças genéticas exibem aumentos no PhA em comparação com a população normal devido aos defeitos peroxissomais tais como em: a) Doenças com mitocondriopatias (Complexo IV), deficiência de COX, sindrome de Leigh, sindrome renal de Fanconi (Fingerhut R et ai., 1994). 4. Mais do que 50 mg/dia de PhA são eliminados através de oxidação e citocromo P450. É bem conhecido que a oxidação de PhA é mediada pelo citocromo P450, mas também é conhecido que existem fortes inibidores do citocromo P450 (por exemplo, azólicos antimicóticos, ácido valproico, cimetidina, eritromicina, sulfametoxazol, opioides, ciclosporina, inibidores de protease, antidepressivos, hiperforina, barbitúricos, anti-histaminicos, tamoxifeno, canabinoides, S-varfarina, etc.)· Assim, determinados fármacos podem aumentar as concentrações de PhA de uma forma significativa. Numerosos tratamentos farmacológicos inibem a degradação metabólica de PhA, acumulando-se e tornando-se principalmente retinotóxico, neuro e cardiotóxico. 0 PhA pode interagir com os antagonistas de cálcio, agentes anti-angiogénicos, imunossupressores e anti-inflamatórios. A rápida oxidação de PhA (oxidação-alfa =90 % da oxidação de PhA) no corpo humano é mediada por diferentes isoenzimas de citocromo P450 (ou seja, CYP2C8). Um dos fármacos mais proeminentes, devido à sua utilização e interesse comercial são os fármacos hipolipemiantes: fibratos e estatinas, inibidores de P450 CYP2C8 que inibe fortemente o metabolismo oxidativo de PhA, resultando numa acumulação de PhA. Os fibratos ativam a β-oxidação em peroxissomas, mas a degradação de PhA necessita a oxidação-alfa que é inibida por fibratos através da inibição do citocromo P450 CYP2C8. É provável que o PhA seja parcialmente responsável pelo seu principal efeito secundário: rabdomiólise. 5. Falhas secundárias na oxidação de PhA: na doença de Alzheimer a atividade das enzimas dependentes de tiamina nos peroxissomas é reduzida, resultando numa quantidade reduzida da hidroxifitanoil-CoA liase necessária para a oxidação de PhA. Em paralelo ao aumento dos niveis de acetilcolina encontrados na doença de Alzheimer, também foi encontrado um aumento dos níveis de PhA. 6. Alterações nutricionais (antimetabolitos: antagonistas de tiamina e tiaminases, acetilcolina) que afetam a diminuição de tiamina, onde a tiamina pirofosfato é um cofator na oxidação de PhA (através de ligases), bem como deficiências em tiamina das quais a melhor conhecidas são aquelas relacionadas com a sindrome de Wernicke-Korsakoff, a doença cardiovascular fatal beribéri e a sindrome neurotóxica devido ao consumo de carpa e salmonideos. Os antagonistas da tiamina são encontrados em substâncias tais como conservantes alimentares (por exemplo, sulfitos) das plantas e alimentos frequentes (por exemplo, chá, uvas, cítricos...), resistentes à ebulição (orto e hidroxifenóis) tais como ácido cafeico, ácido clorogénico e ácido tânico, quercetina e rutina (muito utilizados em farmacologia e como suplementos alimentares); tiaminases dos alimentos (frequentes no peixe, principalmente de pisciculturas, 80 % do consumo), rúmen, produtos láteos e carne de ruminantes: alimentos ricos em PhA); consumo de álcool, sumo de toranja (e numa menor extensão sumo de laranja, tangerina, maçã, uva e os seus derivados) e a cafeína pode aumentar, num menor grau, os depósitos de PhA. Um modelo interessante é uma doença genética que produz deficiência em tiamina e surdez neurossensorial. 0 álcool e piritiamina (antimetabolito da tiamina) apenas requerem 100 pg/ml para produzir uma deficiência grave de tiamina em menos de dois dias. Estas interações chamam à atenção que não é apenas importante avaliar a quantidade de PhA e fitol contida nos alimentos, mas que os alimentos associados com a dieta, tratamentos farmacológicos, suplementos e hábitos alimentares, podem afetar a acumulação de PhA da dieta. 7. Por outro lado, dados epidemiológicos não deixam dúvidas no que diz respeito ao efeito tóxico em doses que são consideradas normais (50-100 mg/dia) , sendo tóxico em doses tão baixas como 0,1 μπιοΐ/mg gordura. Mesmo a concentrações muito mais baixas, o PhA é uma das moléculas com a capacidade mais forte para induzir a oxidação in vivo, interagindo com alguns mecanismos fisiológicos essenciais de DHA e reduzindo os seus níveis in vivo, danificando a sua estrutura através de lipoperoxidação. A concentrações sanguíneas muito baixas 300 gg/ml ou < 1 mmol/1 (<1 % dos ácidos gordos totais) e aprox. 5-10 % dos ácidos gordos totais do tecido nervoso, cria uma grave neuropatia e morte. Em estudos de toxicidade pós-morte associada com a acumulação de PhA (doença de Refsum), os níveis mais altos encontrados em apenas alguns tecidos tinham atingido 8,5 % dos ácidos gordos totais23. A doença de Refsum em ambos adultos e crianças com uma grave acumulação de PhA, é um modelo ideal para estudar a toxicidade por PhA que inclui retinose pigmentosa, nistagmo, hipotonia, ataxia, atraso mental e do crescimento, dismorfias facial e ósseas, hepatomegalia e hipocolesterolemia.
DHA e PhA A toxicidade de PhA está relacionada com doenças e situações onde a ingestão de DHA é recomendada e utilizada, tais como retinose pigmentosa (RP), onde o DHA se comporta como um marcador da doença e o PhA é o agente etiológico de RP. Doenças que comumente requerem DHA para o seu tratamento, são induzidas ao mesmo tempo por PhA. Além das oncológicas, a mais evidente de todas é a RP. Os ácidos gordos de cadeia ramificada PhA e PA, são marcadores em diferentes doenças de RP (Refsum, Adrenoleucodistrofia Neonatal (NALD),
Condrodisplasia punctata rizomélica, Zellweger, Usher IV) associadas com um defeito no metabolismo da oxidação alfa e beta de PA. 0 PhA é a única causa de RP nestes casos.
Durante décadas que se sabe que na RP existem deficiências no DHA em todos os tecidos alvo. Todos os pacientes com RP exibem alterações no metabolismo do DHA e uma parte significativa deles têm concentrações elevadas de PhA o que, até cerca medida, é a causa da evolução da doença. 0 grau de deficiência de DHA não está associado com a evolução e prognóstico da doença. Neste sentido, a RP autossómica dominante não sistémica é a forma mais benigna de todas as formas hereditárias (Tese de doutoramento Cela-Lopez, JM) , mesmo a níveis de DHA que estavam abaixo daqueles tomados numa base esporádica (Schaefer et al. 1995) . Contudo, a ingestão oral de 2 g/dia de DHA em pacientes com XLRP não normaliza os níveis de DHA, devido a uma perda de DHA em retinas distróficas, sendo necessário tomar 4 g/dia de modo a normalizar os níveis de DHA nos fosfolípidos dos eritrócitos. A evolução e prognóstico dos vários tipos de RP, depende da dose farmacológica de DHA e do momento em que se inicia a sua ingestão, bem como dos níveis de PhA. Portanto, pode dizer-se que a concentração de PhA está relacionada com o pior prognóstico na evolução da doença e na perda da função central (região macular). Níveis aumentados de ácido fitânico foram encontrados em tratamentos com "DHA"
Quatro amostras a partir de 4 pacientes chegaram ao laboratório dos inventores para avaliação do efeito benéfico de um tratamento com DHA em duas síndromes com RP. 0 tratamento com 4 g/dia de DHA (4,86 mg fitânico) de quatro pacientes com doença de Refsum juvenil e síndrome de Zellweger durante 3 meses, aumentou a presença de ácidos gordos de cadeia ramificada: fitânico e pristânico em 50 % e 44 %. Numa via paralela, foi observada uma pioria completa da condição clinica: neurológica, surdez e RP (acuidade visual e campo visual). 0 Laboratório de Doença Peroxissomal do Kennedy Krieger Institute (Baltimore), informa rotineiramente, em todos os resultados analíticos, a todos os pacientes que estudam durante o ano, que a ingestão de DHA a partir do peixe aumenta os níveis tóxicos de ácido fitânico e, portanto, eles sempre recomendam DHA a partir de algas. Os dados mostram que os concentrados comerciais de DHA são tóxicos em pacientes com RP associada com defeitos peroxissomais.
Em 1994, a Associação de Pacientes com RP (AARPE Espanha) levou a cabo um estudo com 17 pacientes com RP com e sem síndromes (Refsum, Zellweger, NADL, Kearns, Bordet-Bield, RP autossómica recessiva e RP esporádica) que tinham níveis aumentados de ácido fitânico no plasma. Todos tomaram óleo de DHA com diferentes quantidades de ácido fitânico (desde 5 mg até 11,5 mg por dia) em períodos variáveis de 1 mês até 3 anos. Todos mostraram níveis aumentados de ácido fitânico desde 23 % até 82 %, independentemente do óleo de partida de peixe. Depois de 1 ano, a progressão de RP foi superior ao esperado em pacientes com RP sem síndromes (11 pacientes) (VA 8,3 %) menos, embora naqueles com síndromes (6 pacientes) a perda da função visual tenha sido bastante suscetível de avaliação. Subsequentemente, o tratamento com DHA rico em ácido fitânico foi removido e os pacientes foram separados em dois grupos de acordo com os níveis plasmáticos de ácido fitânico (níveis moderados: 5-30 pg/ml; níveis elevados 30-900 pg/ml). 0 tratamento com 4 g de DHA baixo em ácido fitânico (<90 pg/ml) foi introduzido e os níveis de ácido fitânico e a função visual foram avaliadas. No grupo com níveis fitânicos moderados (não associados com síndromes), foi observada uma redução progressiva dos níveis de ácido fitânico que se tornaram normais dentro de 12 meses (Figura 4). Em paralelo, uma regressão no progresso da doença foi observada com uma função visual comparável à obtida antes do início do tratamento com DHA rico em ácido fitânico. A toxicidade de PhA está ligada com o consumo de fontes ricas em D HA e EPA (por exemplo, atum) uma vez que está presente nos óleos em percentagens muito baixas (aproximadamente 0,1 %) . 0 PhA é encontrado na dieta humana ou nos tecidos animais onde pode derivar a partir da clorofila de extratos vegetais; esta é a forma pela qual se pode acumular nos tecidos animais. 0 PhA é formado a partir de fitol e é oxidado formando ácido pristânico (PA) . Dadas as importantes variações que existem na dieta de gorduras da população (vegetarianos, ovolactovegetarianos, . . . ) , foram verificadas variações nos niveis sanguíneos de PhA (até 6,7 vezes) exclusivamente relacionadas com o consumo de PhA a partir da dieta convencional, onde as dietas vegetarianas exibem até 10 vezes menos PhA enquanto ao mesmo tempo são extremamente deficientes em DHA.
Enquanto o ácido fitânico é um fator de risco para o cancro da próstata, o DHA é um fator protetor para o mesmo tipo de cancro. A evidência ascende aos numerosos estudos moleculares e é suportada pelos dados epidemiológicos e numerosos estudos farmacológicos, alguns dos quais estão muito avançados (Fase II) , no que diz respeito ao papel de DHA em combinação com outros fármacos quimioterapêuticos (celecoxib, Plaquitaxel) na prevenção e tratamento de primeira linha do cancro da próstata bem como cancro gástrico (Ballet et al., 2004; Jones et al., 2007). Igualmente existe suficiente evidência epidemiológica sobre o papel do ácido fitânico na indução do cancro da próstata (Walsh, 2005; Xu et al., 2005; Thornburg et al., 2006; Mobley et al., 2003). Adicionalmente, existem três estudos separados que associam o consumo de peixes gordos, carne vermelha e produtos láteos (fontes com as concentrações mais elevadas de ácido fitânico) com o cancro da próstata.
No campo das patentes, são conhecidos documentos para a purificação de óleos que contêm EPA e DHA, tais como o documento US 4.874.629 (1989) que se refere a um procedimento para o tratamento de óleos que contêm ácidos gordos ómega 3, tais como salmão, sardinhas e outros peixes que contêm EPA e DHA e que na sua essência consiste em: a) submeter o óleo a uma destilação a vácuo a 30-150 °C durante 2-5 horas e colocar o óleo em contacto com um adsorvente selecionado entre gel de silica e ácido silícico para reduzir a elevada temperatura de ebulição e as essências polares mais voláteis e outros constituintes não desejados tais como polímeros, colesterol, pigmentos, pesticidas e metais pesados; e b) subsequentemente recuperar o óleo da mistura. Mais tarde, os mesmos autores, no documento US 5.023.100 aplicam o procedimento anterior de modo a produzir um óleo comestível com EPA e DHA, que pode ser combinado com óleo vegetal e/ou óleo de rosmaninho para melhorar a sua estabilidade oxidativa.
Da mesma forma, o documento US2008/0268117 Al descreve um método para purificar óleos que contêm EPA e DHA que compreende: (a) adicionar ao óleo um álcool alifático de C1-C4, preferentemente etanol numa solução aquosa a 60-70%, a uma temperatura à qual o óleo e álcool se separam em duas fases (ao redor de 10 °C); (b) aquecer a mistura até que o óleo e o álcool se tornem miscíveis (50-80 °C); (c) arrefecer a mistura a uma temperatura na qual o óleo e álcool se separam (aprox. 10 °C) e (d) recuperação da fase oleosa. É especificado que tal processo é especialmente adequado para a preparação de óleos para serem utilizados em alimentos e produtos farmacêuticos devido ao facto de que o processo anteriormente mencionado, elimina os contaminantes orgânicos tais como colesterol e metais pesados tais como mercúrio. De facto, menciona que os óleos preparados de tal forma, são especialmente adequados para preparar uma fórmula infantil (documento US 5.013.569) e composições para o tratamento de artrite reumatoide (documento US 4.843.095).
Existem também documentos para a obtenção de triglicéridos de EPA e DHA, como por exemplo, o documento ES 2035751 T3 que se refere a um procedimento para a preparação de um triglicérido que tem pelo menos um ácido gordo longo C8+ na molécula, caracterizado por uma interesterificação, na presença de uma lipase, o ácido gordo de cadeia longa livre ou um dos seus ésteres de alquilo C1-C4 de cadeia curta com um triglicérido que tem um ou mais ácidos gordos C2-C6 de cadeia curta na molécula e separado por evaporação durante a reação, o ácido gordo de cadeia curta ou o seu éster de alquilo de cadeia curta, e composição na qual o ácido polinsaturado é EPA ou DHA ou uma mistura de ambos. O documento GB 2350610 A descreve a preparação de DHA a partir deste óleo como um triglicérido através de um procedimento que utiliza uma combinação de uma transesterificação dos triglicéridos com um álcool alquílico inferior, destilação e uma transesterificação enzimática seletiva com um álcool alcoxi catalisado por lipases que podem ser imobilizadas. Igualmente, o documento US2008/0114181 AI refere-se a um método para a esterificação de ácidos gordos em triglicéridos com álcoois alifáticos C1-C8 . 0 método utiliza uma resina de permuta iónica ácida como um catalisador, que entra em contacto com a mistura da reação que contém um triglicérido que tem pelo menos 1 % de ácidos gordos livres e um álcool C1-C8, em condições adequadas para a esterificação.
Da mesma forma, é conhecida a obtenção de EPA e DHA como ésteres de etilo, por exemplo no documento US 5.679.809, que descreve um procedimento para a obtenção de um concentrado de ésteres de etilo a partir de ácidos gordos polinsaturados, preferentemente EPA e DHA, que consiste na mistura do óleo que contém os ácidos gordos com etanol na presença de um catalisador para formar um éster etílico do ácido gordo, cuja fase é separada misturando-a com ureia e etanol, que é depois arrefecida até que seja criada uma fase sólida e posteriormente, a fase líquida é separada a partir da qual é obtida uma fração enriquecida com os ácidos polinsaturados desejados. Outro documento que também utiliza ureia para separar os ácidos gordos saturados e a maioria dos monoinsaturados do resto dos ácidos gordos presentes nos óleos de animais marinhos é o EP 0347509 Al, o qual obtém uma mistura de EPA e DHA como produto final. O documento US 5734071 que alcança um produto que contém EPA + DHA a partir de um óleo de peixe utilizando um método semelhante com ureia e o documento ES 2018384 que prepara uma composição com EPA e DHA em quantidades relativas de 1:2 a 2:1, onde estes ácidos gordos constituem 75 % em peso dos ácidos gordos totais, igualmente com a utilização de um método que utiliza concentração por fracionamento com ureia e destilação e/ou extração molecular com fluido em condições supercriticas ou cromatografia. 0 documento ES 2056852 T3 também reivindica um procedimento para a extração do éster etílico de DHA a partir de óleo de peixe, que inclui a transesterificação do óleo de peixe com etanol na presença de ácido sulfúrico, seguida pela extração da mistura com hexano, cromatografia com gel de sílica, tratamento do resíduo em acetona arrefecida até - 40 °C, filtração, evaporação da acetona e destilação molecular em duas etapas a 0,133 Pa, a primeira etapa a 80-100 °C e a segunda a 105-125 °C.
Existe um grande número de documentos que mencionam a utilização de DHA para vários estados de necessidade e doenças previamente mencionados. Como um exemplo, mencionar-se-á o documento CN 1557453 (A) que descreve uma composição para aumento da memória e melhoria do conhecimento que compreende o licopódio serrado, raiz de rhodiola e um concentrado de óleo de peixe com 50 mg de DHA como uma substância ativa. Especifica que fortalece a transmissão da informação entre as conexões sinápticas neuronais, melhorando a resistência frente à anoxia, estabilizando a estrutura das células nervosas e abastecendo tais células nervosas com material nutritivo essencial.
Adicionalmente, o DHA tem sido mencionado em diferentes documentos como tendo propriedades benéficas para a saúde, por exemplo, como uma substância nutritiva para o cérebro humano e para revitalizar a inteligência (CN 1130040 (A)). No documento JP 8098659 (A) menciona-se que o DHA, como um éster ou fosfolipido, tem um efeito melhorado contra o stress. O documento CN 1105205 (A) fornece uma descrição de uma cápsula que contém 11-45 % de DHA puro em conjunto com cálcio, vitaminas e amido, para tonificar o cérebro e ativar a inteligência. O documento ES 2277557 AI refere-se à utilização de DHA para o fabrico de uma composição farmacêutica orientada para o tratamento do dano celular oxidativo.
No estado da técnica, podem ser encontrados documentos para separar e purificar seletivamente EPA e DHA. Assim, o documento EP 1065196 AI refere-se a um processo para separar seletivamente e purificar EPA ou DHA ou os seus ésteres a partir de uma mistura de ácidos ou ésteres que compreende: (a) passar um fluido aquoso com um sal de prata através de uma coluna com terra de diatomáceas, de modo que a prata adira à terra de diatomáceas; (b) passar uma solução com solventes de uma mistura contendo os ácidos gordos altamente insaturados ou os seus derivados através da coluna com terra de diatomáceas e sal de prata, e (c) passar um solvente para separar os ácidos gordos desejados. O documento US 6.846.942 B2 refere-se a um método para a preparação de EPA e DHA puros que compreende: a) dissolver a mistura de DHA e EPA em acetona e adicionar iões de magnésio, o que produz sais de EPA e DHA que têm diferente solubilidade em acetona, b) arrefecer a solução obtida em (a) para precipitar o sal de EPA, c) filtrar o sal de EPA precipitado, e d) acidificar o precipitado obtido para obter EPA puro, e e) evaporar o solvente do filtrado para obter DHA puro. Quando a mistura de EPA e DHA é obtida a partir de um óleo de peixe, ela é primeiramente submetida a uma alcoólise ou saponificação de modo a transformar os triglicéridos em ácidos livres.
Portanto, ainda existe uma necessidade de uma composição que não deverá ser apenas benéfica para a dieta e saúde devido à presença de DHA em quantidades eficazes para a saúde, isto é, com elevadas quantidades de DHA, mas que ao mesmo tempo deverá conter a menor quantidade possível de PhA de modo a prevenir os seus efeitos quando se consume DHA.
OBJETO DA INVENÇÃO
Assim, um primeiro objeto da presente invenção consiste num processo para a obtenção de uma composição rica em ácidos gordos ómega 3 a partir de um óleo de origem marinha, com níveis de PhA abaixo de 90 pg/g, em que o procedimento mencionado compreende as seguintes etapas: a) um óleo de origem marinha é saponificado de modo a obter sais de ácidos gordos. b) os sais de ácidos gordos da etapa a) são acidificados de modo a obter óleo acidificado. c) o óleo acidificado da etapa b) é submetido a ultracentrifugação num gradiente de glicerol a uma temperatura de 10 °C sob vácuo (27 Pa) . d) o gradiente de glicerol da etapa c) é submetido a cristalização a um intervalo de temperatura entre 0 e -57 °C obtendo uma fase sólida e uma fase líquida, onde a fase sólida contém ácidos gordos saturados, ácidos gordos monoinsaturados e PhA e a fase líquida contém ácidos gordos ómega 3 polinsaturados com um teor de PhA inferior a 90 pg/g e) a fase líquida da etapa d) é separada da fase sólida para a sua recuperação através de decantação.
Adicionalmente, o procedimento compreende uma etapa adicional na qual os ácidos gordos ómega 3 são esterif içados para obter triglicéridos ómega 3 com um teor de PhA inferior a 90 pg/g. A etapa a de saponificação do presente objeto da invenção, é levada a cabo numa forma de realização preferida com KOH, água e etanol, agitando a mistura a uma temperatura de 40 °C a 300 rpm durante 1 hora numa atmosfera inerte. Noutra forma de realização preferida, a etapa de acidificação b) é levada a cabo misturando os sais de ácidos gordos na etapa (a) com ácido acético a 60 % numa atmosfera inerte a 200 rpm.
Se a ultracentrifugação da etapa c é isopicnica, isto implica que as condições de centrifugação utilizadas deverão ser 100000 g durante 42 horas. Se a ultracentrifugação é de acordo com o gradiente de densidade sem equilíbrio, então as condições de centrifugação deverão ser de 100000 g durante 24 horas.
Noutra forma de realização preferida, se a etapa de ultracentrifugação é isopicnica, a etapa de cristalização é levada a cabo a uma temperatura de 0 °C.
Noutra forma de realização preferida, se a etapa de ultracentrifugação é isopicnica, a etapa de cristalização é levada a cabo a uma temperatura de -30 °C.
Noutra forma de realização preferida, se a etapa de ultracentrifugação é em gradiente de densidade sem equilíbrio, a etapa de cristalização é levada a cabo a uma temperatura de -30° C.
Um segundo objeto da invenção compreende uma composição, obtida seguindo o procedimento descrito na primeira invenção, de ácidos gordos ómega 3 num intervalo de 65 % até 99 % em peso, com um teor de PhA abaixo de 90 mg/g, preferentemente com um teor em ácidos gordos ómega 3 num intervalo de 75 % até 99 % em peso, mais preferentemente onde os ácidos gordos ómega 3 representam pelo menos 90 % do peso.
Numa forma de realização preferida, a composição obtida de acordo com o procedimento descrito na primeira invenção, compreende ácidos gordos ómega 3 num intervalo de 65 % a 99 % em peso, com um teor de PhA abaixo de 5 mg/g, preferentemente com um teor em ácidos gordos ómega 3 num intervalo de 75 % até 99 % em peso, mais preferentemente onde os ácidos gordos ómega 3 são responsáveis por pelo menos 90 % do peso.
Noutra forma de realização preferida, na composição obtida de acordo com o procedimento descrito na primeira invenção, os ácidos gordos ómega 3 compreendem DHA num intervalo entre 65 % a 95% em peso, com um teor de PhA abaixo de 90 mg/g, preferentemente com um teor de DHA de 75 % a 95 % em peso, mais preferentemente com um teor de DHA de pelo menos 80 % em peso.
Noutra forma de realização preferida, na composição obtida de acordo com o procedimento descrito na primeira invenção, os ácidos gordos ómega 3 compreendem DHA num intervalo de 65 % a 95% em peso com um teor de PhA inferior a 5 mg/g de PhA, preferentemente com um teor de DHA de 75 % a 95 % em peso, mais preferentemente com um teor de DHA de pelo menos 80 % em peso.
Noutra forma de realização preferida, a composição de ácidos gordos ómega 3 obtida de acordo com o procedimento descrito na primeira invenção, adicionalmente compreende EPA num intervalo de 5 a 35 % em peso.
Noutra forma de realização preferida, os ácidos gordos ómega 3 compreendendo a composição de DHA obtida de acordo com o procedimento descrito na primeira invenção, adicionalmente compreende EPA num intervalo de 5 a 35 % em peso.
Numa forma de realização preferida, na composição obtida de acordo com o procedimento descrito na primeira invenção, a percentagem em peso de DHA é de 80,65 % e a percentagem em peso de EPA é de 13,38 %, sendo a percentagem em peso total de ácidos gordos na composição mencionada de 91,75 %.
Numa forma de realização preferida, a composição obtida de acordo com o procedimento descrito na primeira invenção adicionalmente compreende cofatores, extratos e/ou substâncias ativas para utilização farmacêutica ou alimentar.
Numa forma de realização preferida, a composição obtida de acordo com o procedimento na primeira invenção, adicionalmente compreende excipientes e/ou adjuvantes destinados para a utilização farmacêutica ou alimentar.
Um terceiro objeto da invenção refere-se a um suplemento nutricional que compreende as composições descritas no segundo objeto da invenção sob um formato bebível, géis moles ou duros, emulsão aquosa ou pó.
Um quarto objeto da invenção refere-se a um produto alimentar que compreende as composições descritas no segundo objeto da invenção sob um formato bebível, géis moles ou duros, emulsão aquosa ou pó.
Um quinto objeto da invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um composto rico em ácidos gordos ómega 3 de acordo com o segundo objeto da invenção ou conforme obtenível através de um método de acordo com o primeiro objeto da invenção ou um diluente ou portador farmacêutico.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de uma condição alérgica, doenças da superfície do olho e olho seco preferentemente selecionada a partir do grupo que consiste em blefarite, blefaroconjuntivite, conjuntivite, queratite, queratoconjuntivite seca, doenças corneanas, tratamento contra rejeição de transplante da córnea, aumento da densidade corneana celular média através de paquimetria no pré e pós-cirúrgico de cirurgia Lasik.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças degenerativas da retina não associadas com distrofias genéticas, preferentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em degeneração macular húmida ou seca associada com a degeneração derivada da idade, retinopatia diabética, glaucoma, alterações da pressão intraocular, retinopatia associada com miopia, desprendimento da retina, desprendimento retinal regmatogénico em olhos miópicos depois de LASIK, edema macular secundário de origem isquémica, edema macular cistoide ou síndrome de Irvine-Gass, escotoma de Berlin, coroidose, coriorretinite, neuroneurite sifilítica, rubéola, citomegalovirus, melanoma maligno das coroides, venenos de mercúrio (doença de Minamata, acrodinia, síndrome de Hunter-Russell), vasculite retiniana (doença de Eales), retinosquise hemorrágica traumática.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção, para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de distrofias retinianas hereditárias não retinite pigmentosa preferentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em doença de Stargardt, Coroideremia ligada a X, amaurose congénita de Leber, retinosquise ligada a X, distrofia vitrorretiniana de Goldman-Favre, distrofia vitrorretiniana de Wagner e síndrome de Stickler, pars planite familial.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de Retinose Pigmentosa.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de síndromes relacionadas com Retinose Pigmentar.
Numa forma de realização, as distrofias retinianas tratadas são RP não sindrómica como um resultado de mutações específicas e/ou falha na síntese hepática ou transporte de DHA ou como consequência de stress metabólico e são preferentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em todos os tipos Mendelianos de RP sistémica não típica tal como sectorial, bilateral, unilateral, bilateral, inversa, RP autossómica dominante; RP autossómica recessiva; RP ligada a X; RP simples ou esporádica; RP vitrorretiniana; RP punctata albescens; RP sem pigmento; atrofia da coroide; atrofia girada da coroide e/ou retiniana, RP com distrofia dos cones e bastonetes; síndrome de Usher tal como de tipo I, II, III, IV; RP iatrogénica tal como por NP 207, Tioridazina, Cloroquina, Hidroxicloroquina, Clorpromazina.
Noutra forma de realização preferida, as distrofias retinianas tratadas são síndromes genéticas com defeitos peroxissomais com RP e/ou deficiências em DHA e aumentos em PhA e PA que exibem alterações neurológicas, cardiovasculares, músculo-esqueléticas e dermatológicas variáveis e são preferentemente selecionadas a partir do grupo que compreende: sindrome de Zellweger, doença de Refsum Infantil, adrenoleucodistrofia neonatal, distúrbio de biogénese peroxissomal, condrodisplasia punctata rizomélica (RCDP), deficiências em acil-CoA oxidase, deficiências enzimáticas bifuncionais, doença de Refsum, deficiência de β-oxidação, queratoderma ictiosiforme familial (sindrome de Sjogren-Larsson). Doenças com mitocrondriopatias (Complexo IV): deficiência de COX, sindrome de Leigh.
Noutra forma de realização preferida, as distrofias retinianas tratadas são sindromes genéticas com defeitos peroxissomais, mitocondriais e/ou relacionados com RP e alterações retinianas relacionadas e são, preferentemente, selecionadas a partir do grupo que compreende S. de Bassen-kornzweig, S. de Batten ou lipofuscinose, hipoprebetalipoproteinemia, S. de Usher, S. de Hallervorden-Spatz, aceruloplasminemia, S. de Kearns-Sayre, distrofia muscular de Duchenne e Becker, S. de Lawrence-Moon-Bardet-Biedl, S. de Lawrence-Moon, S. de Bardet-Biedl, S. de Grafe, amaurose congénita de Leber, S. de Hallgreen, S. de Cokayne, S. de Alstrom, S. de Pelizaeus-Merzbacher, ataxia cerebelosa, ataxia de Friederich, lipofuscinose (familial maurótica idiopática: Tay-Sachs ou Haltia-Santavuori, Biel-Schowsky-Jansky, E. Vogt-Spielmeyer-Batten-Mayou, doença de Kufs), displasia osteo-neuro-endócrina, mucopolissacaridose (S. de Hurler, S. de Hunter, S. de Scheire, MPS I-H/S, Sanfilippo), S. de Bassen Kornzweig, displasia negro-retiniana, displasia esquelética, S. renal-ocular-esquelética, S. de Edwards, S. Oculo-cerebro-renal ligada a X recessivo ou S. de Lowe, sindrome de Lignac-Fanconi (cistinose), neuropatia axonal gigante, demência familial, tipo dinamarquês, etc.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de uveite e doenças relacionadas, preferentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em irite, pars planite, coroidite, coriorretinite, uveite anterior e/ou posterior, iridociclocoroidite, uveite infeciosa como por brucelose, Herpes Simplex; Herpes zoster, leptospirose, doença de Lyme, síndrome de histoplasmose ocular presumível, sífilis, toxocaríase, toxoplasmose, tuberculose, candidíase, síndromes de uveíte tais como epiteliopatia pigmentar placoide multifocal posterior, retinocoroidopatia do tipo "birdshot", iridociclite heterocrómica de Fuchs, coroidite multifocal e síndrome de panuveíte, síndrome de múltiplos pontos brancos evanescentes, coroidopatia interna ponteada, coroidite serpiginosa, distúrbios sistémicos associados com uveíte tal como espondilite anquilosante, doença de Behcet, doença granulomatosa crónica, entesite, doença inflamatória do intestino, artrite reumatoide juvenil, artrite reumatoide, esclerose múltipla, poliartrite nodosa, artrite psoriática, síndrome de Reiter, sarcoidose, lúpus eritematoso sistémico, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, doença de Whipple, síndromes mascaradas nos segmentos anteriores e/ou posteriores tais como retinoblastoma, desprendimento da retina, melanoma maligno, leucemia, xantogranuloma juvenil, corpo estranho intraocular, linfoma, esclerose múltipla, sarcoma de células do retículo.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças degenerativas da retina e condições oftalmológicas secundárias relacionadas com doenças vasculares preferentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em retinopatia hipertensiva; neuropatia isquémica ótica hipertensiva, coroidopatias hipertensivas como esclerose coroideia, trombose de veia ramificada ou central, estrias de Elschnig e Slegrist, aterosclerose, isquemia cerebral e neuro-oftalmológica, síndrome do arco aórtico, doença de Takayasu, arterite de Takayasu, panarterite, iridociclite, esclerite, neovascularização pré-retiniana produzida por isquemia e que pode resultar em hemorragias vítreas, edema da córnea, efeito de Tyndall no humor aquoso, retinopatia diabética ou glaucoma neovascular, insuficiência carotídea ou isquemia ocular crónica, obstrução da artéria oftálmica, obstrução da artéria retiniana central, distúrbios de coagulação tal como deficiência de proteínas S e C, retinite panoftálmica, coroidite, estase papilar, hemorragias retinianas como mancha de Roth, lesões devido a imunocomplexos, neuropatia ótica, retinopatia isquémica, oftalmoplegia, pseudotumor orbitário, síndrome isquémica ocular, enfarte do lobo occipital, diplopia, edema palpebral, ptose palpebral, telangiectasias das pálpebras, conjuntiva, retina, obstrução aguda da artéria retiniana central, oftálmica ou suas ramificações, obstrução das artérias ciliares posteriores tais como neuropatia ótica-isquémica de origem não artrítica, síndrome de isquemia ocular crónica produzida por hiperfusão e visão turva ou síndrome de Shy-Drager.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção ou perda de acuidade visual não associada com utilização retiniana ou outras oftalmológicas preferentemente selecionada a partir do grupo que consiste em catarata, vitrite, descolamento vítreo, endoftalmite, hipermetropia, miopia e/ou presbiopia.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de distúrbios neurológicos e/ou psiquiátricos particularmente neurodegenerativos preferentemente selecionados a partir do grupo que consiste em neuropatias sensoriais motoras hereditárias, ataxia, espasticidade, neurite, doença de Alzheimer, demência, défice de atenção primário, depressão, transtornos bipolares e esquizotípicos, esclerose múltipla e/ou esclerose lateral amiotrófica.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças oncológicas preferentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em metástases e as linhas tumorais mais prevalentes, cancro colorretal, cancro da próstata, cancro da mama, cancro pulmonar, cancro ovárico, cancro gástrico, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro renal, hepatocarcinoma, cancro cerebral, glioblastoma, melanoma, retinoblastoma, cancro da vesícula biliar, mieloma múltiplo, cancros endócrinos e/ou cancros relacionados com uma resistência à insulina.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de nefropatias (nefrite e nefrose) preferentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em nefropatias por IgA, nefropatia associada a lúpus sistémico eritematoso, insuficiência renal, glomerulopatia, tubulopatia, doença vascular renal e/ou intersticial.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças cardiovasculares, preferentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em alterações isquémicas, arteriosclerose, hipertrigliceridemia, hiperlipemias, arritmias ventriculares, hipertensão, diabetes e/ou doenças cardiovasculares em que os niveis de apoproteina a (apo (a)) estão aumentados.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de sequelas iatrogénicas preferentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em rabdomiólise, hepatotoxicidade, cardiotoxicidade, neurotoxicidade, edema, lipodistrofia, e/ou imunossupressão, associada com estatinas, corticoides, antiretrovirais e/ou imunossupressores.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de fibromialgia e/ou sindrome de fadiga crónica.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de artrose e osteoporose.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças autoimunes, doenças inflamatórias crónicas e musculares esqueléticas preferentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, artrite juvenil, doença de Sjogren, espondilite anquilosante, lúpus eritematoso sistémico, artrose, osteoporose.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças dermatológicas, preferentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em alopecia androgénica, acne rosácea, acne vulgaris, eczemas e/ou psoriase.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de condições alérgicas, asma e/ou doenças respiratórias crónicas.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças do sistema digestivo e doenças inflamatórias do intestino preferentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em gastrite autoimune, virai e/ou tóxica, esofagite, doença de Crohn, colite ulcerativa, colite pseudomembranosa, colite colagenosa, alterações da permeabilidade intestinal, sindromes de má absorção, intolerância e alergias alimentares e/ou hemorroidas.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças parasitárias e infeciosas.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de défice de D HA. Numa forma de realização preferida, tal défice deve-se a sindromes de má absorção gastrointestinal selecionadas a partir do grupo que compreende fibrose cística, sindromes de má absorção intestinal, pancreatite, insuficiência pancreática e/ou colelitíase. Noutra forma de realização preferida, o défice de DHA deve-se a distúrbios alimentares selecionados a partir do grupo que compreende anorexia e/ou bulimia.
Numa terceira forma de realização preferida, o composto deste objeto da invenção refere-se à compensação da deficiência nutricional de DHA observada nas sociedades humanas, preferentemente no grupo que compreende mulheres grávidas, mulheres lactantes e crianças preferentemente durante o primeiro ano de vida.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção como um cofator ou coadjuvante com outros medicamentos para reduzir os seus efeitos secundários e/ou aumentar a sua atividade terapêutica quando associado com: estatinas, fármacos anti-inflamatórios, corticoides, imunossupressores, fármacos antihipertensivos, tratamento como hipolipemiante, anti-inflamatório, doenças autoimunes, alergias, tratamento contra a rejeição de órgãos transplantados e/ou anti-hipertensivos.
Outro objeto da invenção refere-se à utilização de um composto de acordo com o segundo objeto da invenção para melhorar as condições fisiológicas que aumentam a acuidade visual, memória e funções cognitivas, aumentando o desempenho desportivo e reduzindo lesões e/ou reduzindo a fadiga neuromuscular normal.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Capacidade de inibição da apoptose de fotorrecetores (%) por DHA induzida por Paraquat in vitro em diferentes concentrações de PhA (azul) e índice de Bcl-2/Bax (verde) . A linha vermelha mostra o grau de apoptose sem tratamento com DHA. Nesta experiência pode ser claramente visto que os óleos de DHA com < 5 pg/g de PhA têm uma atividade inibitória superior da apoptose do que aqueles com concentrações superiores e o stress oxidativo produzido é também menor. Isto determina que DHA < 5 pg/g in vitro, tem uma atividade fisiológica superior para o tratamento de distrofias retinianas como um inibidor da apoptose.
Figura 2. Capacidade de inibição da apoptose de fotorrecetores (%) por DHA induzida por MNU in vivo em diferentes concentrações de PhA (azul) e índice de Bcl-2/Bax (verde). A linha vermelha mostra o grau de apoptose sem tratamento com DHA. Esta experiência confirma as observações vistas in vitro, concluindo que o consumo oral de DHA < 5 pg/g de PhA tem uma atividade fisiológica superior para o oral de distrofias retinianas como um inibidor da apoptose. Figura 3. Esta figura representa as principais empresas e produtos do mercado, bem como aquelas verificadas como tendo os níveis mais baixos de PhA do mercado quando o estudo foi levado a cabo. A sua qualidade e processos estão garantidos para a maioria dos fabricantes, cumprindo GMPs alimentares e farmacêuticas de acordo com a Farmacopeia Europeia e a FDA, sendo expressamente aprovados para utilização alimentar. São o objeto de patentes e estão a ser estudados sistematicamente na investigação humana. Pode ser visto, que os óleos comerciais com diferentes purezas de DHA, contêm níveis elevados de PhA e significativamente diferente independentemente da pureza de DHA.
Figura 4. Redução dos níveis de PhA em pacientes sem síndromes com DHA < 5 pg/ml. Esta figura mostra a evolução de 11 pacientes com RP sem síndromes associadas com DHA contendo PhA < 5 pg/g previamente tratados com DHA contendo PhA > 5 pg/g. Nesta figura, pode ser visto que os pacientes com RP que tomaram DHA com níveis de PhA > 5 pg/g aumentaram os seus níveis de PhA (TO), mostrando uma redução significativa dos níveis de PhA quando tomando DHA com PhA < 5 pg/g. Isto demonstra que o DHA com PhA < 5 pg/g é seguro como um tratamento em pacientes com RP.
Figura 5. Cálculo do ponto de fusão (PF) através de DSC (Calorimetria de Varrimento Diferencial) dos dois diastereoisómeros de PhA. 0 método de DSC é uma técnica termo-analítica que diferencia o calor necessário para aumentar a temperatura de uma amostra. As funções principais da técnica são o estudo das transições de fase ou do estado físico tal como o ponto de fusão (PF) . Esta técnica exibe uma grande sensibilidade para estimar o PF. Para esta invenção, foram criados dois padrões para cada isómero de PhA, uma vez que não existe nenhum disponível no mercado mundial. 0 PhA a partir de atum foi purificado. 0 gráfico representa o PF de uma amostra que continha > 96,5 % de PhA separado a partir de um óleo rico em DHA (>700 mg/g) a partir de atum, seguindo o procedimento da presente invenção. Uma DSC foi levada a cabo e foram encontrados dois picos claramente diferenciados. De modo a realizá-la, foi cristalizado a -50 °C e ambas as fases separadas que foram analisadas através de GC-MS indicando que eram duas frações de PhA. A técnica de DSC é repetida uma vez mais e de uma forma pura é visto um único pico a -45 °C e -65 °C para cada das fases separadas.
Através de cristalografia observa-se e verifica-se que o isómero PhA(3S) tem um PF a -45 °C e PhA(3R) tem um PF a -65 °C.
Desta forma, através de DSC, foi desenvolvido um método fácil para levar a cabo uma análise quantitativa dos dois isómeros de PhA. Isto torna possível a verificação de que o isómero PhA (3S) pode ser avaliado quanto à seleção da separação mais eficiente de PhA nesta invenção. Sem excluir outros produtos no futuro para a separação de PhA a partir de amostras diferentes de óleo rico em DHA e ómega-3.
Como descrito na presente invenção, os dois isómeros mostram diferentes atividades fisiopatológicas na saúde humana. A determinação dos isómeros através desta análise seria um marcador epidemiológico, clínico e nutricional de grande significado para determinar a atividade de outros marcadores moleculares tais como AMACAR (associado com 3S e não com 3R) em cancro frente à toxicidade de (R3) predominante.
Figura 6. Cristalização fracionária por densidade (FCD): Fracionamento num gradiente de equilíbrio de densidade ou isopícnico de um óleo bruto rico em ómega-3. Fração (a) cor verde, fração (b) cor azul e fração (c) cor laranja. 0 diagrama representa a formação das frações de ácidos gordos produzidas quando o óleo é exposto a uma centrifugação isopícnica. Ácidos gordos ómega 3 (fração c) que correspondem à maior densidade no óleo utilizado no ponto de partida, tornam-se fracionados na parte mais distante do eixo do rotor, enquanto as frações a e b com densidades mais baixas e mais próximas ao eixo do rotor. A cristalização do gradiente e das frações a e b permite a separação da fase líquida, onde os ácidos gordos ómega 3 permanecem na fração c.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método para obter ácidos gordos ómega-3 contendo ácido fitânico em níveis inferiores a 90 pg por grama de óleo. Especificamente, a invenção em causa proporciona um método para o processo de separação dos ácidos gordos ómega-3 presentes em animais marinhos, microrganismos e algas através de um gradiente de temperatura, arrefecendo os extratos até formar uma fase sólida que concentra PhA e ácidos gordos saturados e monoinsaturados, e uma fase líquida, que concentra ácidos gordos ómega-3, preferentemente DHA, essencialmente livre de PhA. 0 processo descrito pode ser utilizado para a obtenção e purificação de quaisquer ácidos gordos insaturados existentes na natureza. É conveniente que o óleo utilizado para a obtenção de ácidos gordos ómega-3, preferentemente D HA, substancialmente livre de PhA, seja tão fresco como possível de modo a evitar uma provável degradação ou oxidação dos ácidos gordos. A maioria dos peixes (essencialmente peixes gordos), culturas de algas unicelulares e krill são inicialmente considerados como sendo as fontes principais de ómega-3. Não obstante, o ómega-3 também pode ser obtido a partir de outras fontes marinhas (por exemplo, atum, bacalhau, salmão, sardinha, peixes vermelhos, baleia, foca, tubarão, algas não unicelulares, etc.), fontes bacterianas e fungos. As fontes mais valiosas são aquelas de origem microbiana (obtidas a partir de culturas e fermentadores controlados), que contêm níveis elevados de PhA e isoprenoides, em conjunto com fontes marinhas. Algumas espécies ainda não utilizadas (por exemplos, algas diatomáceas) despertariam um grande interesse como produtoras de PhA, como o óleo de fígado de bacalhau o faria como uma fonte de pristano. No futuro, poderia ser utilizado óleo a partir de espécies animais, vegetais, microbianas e/ou fúngicas geneticamente modificadas como substâncias fonte para aumentar a produção de ómega-3, especialmente DHA. Os níveis de PhA são elevados em ambos os peixes de piscicultura e selvagens. 0 procedimento, assunto da invenção, consiste em várias fases, embora algumas delas sejam opcionais: 1. Refinação preliminar (opcional): 0 objetivo desta fase consiste na eliminação de gorduras não saponifiçáveis. É exclusivamente aplicável a matérias-primas brutas, não refinadas, tais como óleo de peixe cru. 2. Hidrólise de triqlicéridos e ésteres: 0 objetivo desta fase consiste em permitir o processo para obter ácidos gordos livres a partir do óleo. A hidrólise pode ser: a) saponificação + acidólise ou b) hidrólise por lipase. 0 processo de saponificação formará sais de ácidos gordos. A acidificação formará uma fase de ácidos gordos livres não polares (óleo acidificado), e uma fase polar de sais que serão eliminados abrindo a base do reator. 3. Centrifugação (isopícnica e não isopícnica): 0 óleo acidificado obtido na fase anterior é submetido a ultracentrifugação por gradiente de glicerol nesta fase. A centrifugação pode ser isopícnica ou por gradiente de densidade de não equilíbrio.
Quando a centrifugação é isopícnica, uma cristalização fracionária por gradiente de densidade utilizando um gradiente de glicerol, é levada a cabo, levando ao equilíbrio.
Se depois da centrifugação a temperatura é drasticamente reduzida, num gradiente de glicerol, a 0o C, são obtidas três frações: duas sólidas - uma com ácidos gordos saturados; a segunda, com ácidos gordos insaturados e PhA, que são eliminados, e uma terceira fração líquida com ácidos gordos polinsaturados, contendo entre 65-99 % de ácidos gordos ómega-3 e níveis de 65-85 % de DHA, com menos de 90 pg/g de PhA. A temperatura pode ser reduzida para -30 °C durante 24 h, utilizando um gradiente de glicerol, obtendo duas fases como um resultado: uma fase sólida, contendo ácidos gordos saturados e monoinsaturados, PhA e o gradiente de glicerol, e uma fase líquida, contendo ácidos gordos polinsaturados com níveis de 65-99 % de ácidos gordos ómega-3, com níveis de DHA de 65-85 % contendo menos de 5 pg/g de PhA.
Se a centrifugação é não isopícnica, a temperatura deverá ser reduzida dramaticamente para -30 °C do gradiente de glicerol, quando as duas frações são geradas: uma fração sólida, contendo ácidos gordos saturados e monoinsaturados e PhA, e uma fração líquida, contendo ácidos gordos polinsaturados com níveis de 65-99 % de ácidos gordos ómega-3, com níveis de 65-85 % de DHA contendo menos do que 90 pg/g de PhA. 4. Esterificação de ácidos gordos livres: O objetivo consiste em estabilizar os ácidos gordos como ésteres e ésteres de etilo, ou como triglicéridos (que seriam um primeiro produto final).
Nos processos de purificação de óleo, o PHA não é separado - a menos que uma fase específica seja estabelecida para esse objetivo, uma vez que as propriedades físico-químicas de PhA (C20) são comparáveis com os ácidos gordos ómega-3 de cadeia longa (Cál8) : PF, ponto de fusão, valor de saponificação, índice de iodo, solubilidade em água e outros solventes, polaridade frente aos solventes, rotação ótica, etc. Como um estudo de comparação, o DHA e PhA partilham o mesmo número de ligações de H (2) recetoras e dadoras (1), ligações de rotação livre (14), área de superfície polar (26,3 A2), solubilidade em água a 25 °C (0,001) e volume molar comparativo (347,0 frente a 354,8 cm3), massa molecular (328,49 frente a 312,53), entalpia de vaporização (77,28 frente a 74,2 kj/mol), polarizabilidade (41,97 10“24 frente a 38,09 10“24) , índice de refração (1,52 frente a 1,454) . PhA, PA, EPA, DHA, SDA têm o PF mais baixo entre todos os ácidos gordos, que está entre -40 °C e -80 °C. A eliminação de produtos de saponificação e eliminação de estearina nas gorduras saturadas com base na saponificação e redução de ácidos gordos saturados utilizando complexos de ureia aumenta a concentração de PhA na fração rica em ómega-3. Nos óleos de peixe refinados, todos os casos analisados revelaram um aumento da concentração de PhA (>0,1 %), e apenas em determinados procedimentos obtendo uma elevada pureza de DHA (>700 mg/g), o aumento anteriormente mencionado nos procedimentos de refinação inicial e purificação é reduzido (<0,1 %) (Figura 3). Implica que todos os procedimentos de refinação e purificação levados a cabo com óleo de peixe (por exemplo: com um teor máximo de DHA < 200 mg/g) , o PhA não é eliminado e, pelo contrário, o aumento dos níveis de concentração de ómega-3 produz um aumento proporcional de PhA, dado o facto que PhA tem um comportamento físico-químico altamente comparável ao encontrado no ómega-3, o que não é o caso quando é comparado com o resto de ácidos gordos saturados. A formação de complexos de ureia e as variações metodológicas na cristalização destes complexos estão sob a patente (WO1995/011216) e otimizados devido à sua grande aplicação na indústria, e são amplamente utilizados em processos de purificação de óleo de peixe. Foi provado que a reação de etanol-ureia na formação de complexos de ureia nestes procedimentos provoca a formação de carbamato de etilo ou uretano (EC) e a sua presença nos óleos purificados. O uretano, descoberto há mais de 150 anos, é um agente carcinogénico conhecido e está sob investigação pela FDA (Food and Drug Administration), fazendo parte da lista de substâncias ambientalmente perigosas desde 1980 (CERCLA), como indicado pelos membros da FDA Canas e Yurawecz no editorial. Assim, esta invenção proporciona resultados melhorados dos processos atuais de desodorização e purificação, evitando a utilização frequente, mas indesejável, de processos na indústria tais como processos de desodorização (temperaturas elevadas), purificação e refinação com ureia, que são obviamente inadequados e não recomendados para a eliminação de PhA.
Os processos de refinação e purificação com arrefecimento sob patente são normalmente utilizados a temperaturas acima de -5 °C, e em algumas ocasiões foram levados a cabo a temperaturas de até -20 °C. No entanto, um tal procedimento útil para a separação de ácidos gordos saturados não é aplicável a PhA, uma vez que se concentraria na fração de ómega-3, como EPA, DHA, PhA e PA têm um PF a aprox. -54 °C, -43 °C, -65 °C e -80 °C, respetivamente.
PhA e PA fazem parte dos triglicéridos encontrados nos óleos de peixe comparáveis com ácidos gordos ómega-3. Hoje em dia, os processos de hidrólise enzimática são frequentemente utilizados; é a esterificação seletiva que concentra os ácidos gordos ómega-3 e particularmente DHA. Há muito tempo foi demonstrado que em toda a biologia de PhA, ele tem uma tendência para se posicionar no 2o carbono de triglicéridos e fosfolípidos, conforme encontrado no DHA e outros PUFAs; também se sabe que o PhA e DHA e outros ómega-3 partilham a mesma resistência frente à saponificação e hidrólise enzimática. A lipase pancreática hidrolisa os ácidos gordos de cadeia curta mais rapidamente que os de cadeia longa, enquanto o PhA, PA, DHA, EPA atuam muito lentamente, sendo resistentes à lipolise (Brockerhoff, 1970; Ellingboe e Steinberg, 1972) . Tal resistência é comparável com a encontrada em DHA e PhA (Nus et ai., 2006) , devido aos efeitos esteáricos comparáveis de PhA, PA, DHA e EPA (Faber, 2004 e Bottino-NR et ai., 1967). Além disso, a utilização de processos enzimáticos poderia, tal como outros processos, aumentar os níveis de PhA. Processos tais como a hidrólise completa e lipase não específica são tão eficientes como a saponificação e hidrólise catalisada com sólidos, sem alterar os níveis de PhA.
Por estes motivos, não existem processos que separem o PhA em óleos com ómega-3 e DHA sem alterar a composição do óleo ou através de processos de refinação, necessitando um processo específico para a separação de PhA. A figura 3 mostra que os métodos para obter DHA substancialmente puro (>700 mg/g) resultam em variações que não são eficientes para o propósito da presente invenção. Os métodos cromatográficos são provavelmente a melhor opção, e embora não sejam específicos para separar PhA, são de facto para obter um DHA substancialmente puro. A priori, os métodos de separação industrial por cromatografia não são suficientemente sensíveis para separar PhA e PA com custos razoáveis, encontrando níveis fora do intervalo necessário para esta invenção, tal com ocorre na destilação molecular, tendo ao mesmo tempo, um risco mais elevado de ter níveis elevados de benzo(a)pireno, devido à utilização de temperaturas elevadas. Os métodos de cromatografia mais destacáveis (por exemplo, SFC) baseiam-se na polaridade e efeitos esteáricos. A força de absorção depende não só da polaridade, tempo de lavagem e características de grupo funcional, mas também de fatores esteáricos. Como indicado anteriormente, o PhA e DHA têm funções esteáricas, massa molecular, etc. mais aproximadas a DHA do que EPA e outros ácidos gordos. Dada a baixa concentração de PhA e tendo em conta que em todos os processos a pureza de DHA e EPA também aumenta de uma forma considerável, é pouco surpreendente encontrar uma análise que revele que o PhA está inadequadamente presente também e onde, em alguns casos, a sua presença atinge níveis elevados em todos os óleos de atum, contendo 700 mg/g e encontrando-se, frequentemente, níveis de 400 pg/g, enquanto noutros processos sob patente podem ser encontrados níveis superiores a 1500 pg/g (>0, 1 %) , o que indica um nível de PhA superior do que o encontrado no peixe (atum) cru.
Dada a baixa concentração de PhA {<0,1 %) encontrada em estudos convencionais de grau analítico cromatográfico, o PhA e PA não são determinados. Para esse objetivo é necessário adaptar as técnicas de cromatografia (GC) a um nível muito mais elevado de sensibilidade para a deteção específica de PhA.
Dadas as características físico-químicas de PhA e DHA, seria necessário adaptar a técnica para níveis de pureza muito elevados a um custo muito alto de modo a reduzir o PhA. A partir desta abordagem e sem o custo e a tecnologia industrial necessários, o DHA tem sido purificado a partir de óleos de peixe (especificamente a partir de atum, uma vez que apresenta os níveis de concentração mais elevados de DHA) a partir de técnicas cromatográficas laboratoriais e destilação molecular, até obter 830 mg/g, enquanto foi encontrada uma média aritmética de níveis de PhA de 57 μg/g, mostrando uma elevada variabilidade (+ 31 gg/g). Daí, os métodos de purificação de DHA industriais específicos não são eficientes na eliminação de PhA presente nos óleos de peixe.
Existe uma relação indireta entre o consumo de óleo com níveis de pureza elevados em DHA e um consumo inferior de PhA, essencialmente devido ao facto geométrico existente na toma de uma quantidade mais elevada de óleo a partir de óleos de pureza inferior para obter a mesma quantidade de DHA. Além disto, os produtos comerciais com elevada pureza não apresentam qualquer redução dos níveis de PhA. As diferenças entre os métodos utilizados para a refinação ou purificação de DHA e ácidos gordos ómega-3 variam significativamente (Figura 3), embora todos apresentem níveis de concentração superiores ao desejado.
No que diz respeito à presente invenção, foi desenvolvido um processo específico para a separação de PhA, que deverá ser levado a cabo nas fases iniciais, ou fase de refinação, de modo a obter óleo contendo todos os níveis de pureza de DHA e/ou combinações de ómega-3 diferentes, obtendo óleos ricos em DHA e ómega-3 com níveis muito baixos de PhA ou sendo mesmo isentos de PhA (limite de deteção: 5 gg/ml). Assim, este processo pode ser adaptado a todos os processos industriais e a produtos com diferentes níveis de pureza.
Esta invenção também implica que já não seja necessário purificar um ou mais ácidos gordos, ou alterar a composição natural do óleo, para obter um óleo com baixo teor de PhA ou um óleo isento de PhA. Isto é altamente relevante quando se utilizam misturas naturais de ácidos gordos ómega-3 para propósitos alimentares e de saúde. Isto também é um método rentável, uma vez que os processos de desodorização e purificação sobre os ácidos gordos ómega-3 já não são necessários, obtendo um grau alimentar e farmacêutico menos arriscado do que os métodos que são levados a cabo atualmente. A invenção em causa refere-se a um método específico para separar fisicamente o PhA encontrado em qualquer óleo contendo >5 gg PhA/g e rico em ésteres de ácidos gordos ómega-3, para a produção industrial a grande escala de DHA, EPA ou outro ácido gordo ómega-3 a partir de fontes ricas em ómega-3, tais como peixe, algas ou outros microrganismos com níveis baixos ou nulos de PhA.
Tal método utiliza a cristalização para obter uma alteração no estado físico do óleo, mantendo PhA e PA no estado líquido, uma vez que estes têm um PF significativamente mais baixo que DHA e os ácidos gordos ómega-3, ou qualquer outro ácido gordo.
Quadro 1. Referências do PF experimental dos ácidos gordos mais significativos levado a cabo à pressão atmosférica.
Nome_PF_Nome comum_PF_
Ácido láurico (C12) +44 °C Laurato de metilo +6 °C
Ácido mirístico (C14) +54 °C Laurato de etilo +2 °C
Ácido palmítico (C16) +62 °C Palmitato de metilo +35 °C
Ácido esteárico (C18) +69 °C Palmitato de etilo +25 °C
Ácido oleico (C18:l) +14 °C Oleato de metilo -20 °C Ácido linoleico
(C18:2,n6) -8,5 Oleato de etilo -27 °C
Ácido alfa-linoleico -16,5 Linoleato de metilo -35°C (C18:2,n3) Ácido docosahexanoico
(C22:6,n3) -43 °C Linoleato de etilo -38 °C Ácido araquidónico
(C20:4,n6) -49,5°C Linoleato de metilo -40 °C
Ácido eicosapentanoico-54 °C Linolenato de etilo -46 °C (C20:5,n6) Ácido estearidónico Docosahexaenoato de
(C18:4,n3) -57 °C etilo -65 “C
Araquidonoato de
Ácido fitânico (C20) -65 °C etilo -73 °C
Eicosapentaenoato de
Ácido pristânico (C19)-80,5 °C etilo -76 °C
Este é um método interessante em termos da eliminação de PhA do início da cadeia de produção de óleos, especificamente em peixes, que é livre de toxicidade e referido como tendo um risco inferior de formação de ácidos gordos trans e é adequado para a obtenção de um grau alimentar ou farmacêutico. Esta invenção refere-se a um método altamente adaptável para a tecnologia atual, particularmente para as tecnologias farmacêuticas e alimentares, uma vez que a tecnologia a frio já estava a ser utilizada em ambas as indústrias. 0 aumento da pressão no óleo rico em ómega-3 para reduzir o PF e o seu custo energético não é uma opção, já que os PUFAs e DHA são sensíveis à hidrogenação.
Por outro lado, este método em conjunto com a tecnologia industrial contemporânea utilizado para a separação de PhA, permite um aumento do grau de pureza em DHA, EPA e outros ácidos gordos com um PF muito baixo, sem adicionar quaisquer outros processos de purificação adicionais. É também um processo de purificação de ácidos gordos ómega-3 e DHA, principalmente para peixes. A invenção em causa refere-se a ambos óleos refinados e não refinados contendo qualquer proporção de ómega-3, e a óleos submetidos a purificação para a obtenção de um elevado nível de pureza em qualquer dos ácidos gordos ómega-3, preferentemente DHA, ou no teor total de ómega-3. Para esse objetivo, é possível basear-se em gorduras ou óleos que contêm qualquer tipo de éster, principalmente triglicéridos, fosfolípidos e ésteres de etilo. 0 propósito principal consiste em obter óleos de ómega-3, preferentemente com DHA e um elevado nível de pureza (>700 mg/g), níveis baixos ou nulos de PhA (< 5 pg/g) preferentemente associados com ésteres ricos em triglicéridos para obter uma pureza, estabilidade e biodisponibilidade elevadas, sem necessidade de adição de ingredientes não nutricionais com potencial grau de interação, tal como etanol, cuja utilização como alimento é evitada, especialmente entre mulheres grávidas e crianças, enquanto este é o setor populacional onde é mais necessário e utilizado. Os ácidos gordos livres são altamente instáveis à utilização oral, embora a sua utilização como um injetável possa acarretar benefícios (por exemplo, injeção intravítrea). Dado que os princípios ativos da presente invenção são os ácidos gordos ómega-3, particularmente DHA, e tendo em conta que a dose necessária é demasiado elevada para uma utilização terapêutica, os triglicéridos são considerados como sendo uma melhor opção, tal como o é o éster em DHA que permite uma concentração mais elevada do princípio ativo. A ingestão oral de ésteres de etilo é prejudicada, enquanto a ingestão de ácidos gordos naturais na dieta provém dos triglicéridos. A dieta diária implica uma ingestão natural de mais do que 100 gramas de triglicéridos, o que demonstra que o DHA constitui a ingestão mais eficiente entre os mamíferos desde o ponto de vista fisiológico e farmacocinético. 0 DHA de etilo é uma fórmula química raramente utilizada nos seres humanos e na natureza, enquanto a dos triglicéridos é muito mais biodisponivel e não tem os inconvenientes e efeitos secundários associados com o tipo de éster de etilo. 0 DHA como éster de etilo é menos eficiente, é fisiologicamente mais sensível à oxidação, não é um alimento (contém álcool) , não forma parte de qualquer dieta entre os organismos vivos, o seu uso é restrito (não adequado como alimento), interfere com outros ácidos gordos e aumenta a produção de outros ésteres de etil, interfere com outros fármacos e alimentos (por exemplo, café), causa intolerância numa parte significativa da população, tem efeitos secundários uma vez que é um tipo de ingestão de álcool e é um metabolito não oxidativo do etanol induzindo hepatotoxicidade e pancreatite. Este documento refere-se à forma de triglicérido de DHA como um fármaco seguro, saudável e mais eficiente com fonte de ómega-3, enquanto o éster de etilo é um processo intermédio para obter DHA e EPA como triglicéridos. A utilização principal do produto consiste na obtenção de um medicamento, suplemento ou alimento mais saudável e rico em DHA, apresentando uma atividade fisiológica mais elevada, sem interferências ou interações não associadas a DHA, menor capacidade oxidativa in vivo, menor taxa de toxicidade e risco-zero associada com PhA para a saúde pública. De acordo com as inúmeras e recentes provas moleculares, estudos pré-clínicos e epidemiológicos, o PhA é uma substância não nutricional embora esteja presente na dieta, que implica um dos maiores riscos para a saúde.
Este método de separação de PhA é um método de desodorização altamente eficaz. Para levá-lo a cabo, o tratamento do óleo de peixe com solo ou carbono ativado será suficiente, tendo em vista a eliminação dos metais pesados, evitando assim qualquer processo de aquecimento ou desodorização. A invenção em causa implica não apenas a eliminação de PhA e PA mas também a eliminação eficiente das partículas voláteis que causam um odor característico, evitando também processos que possam prejudicar o óleo (temperaturas elevadas) e reduzindo custos já que não são adicionados processos específicos. A base da desodorização do óleo levada a cabo seguindo este processo de separação de PhA é relativa: a) À degradação de proteínas, que têm um PF muito elevado e estão no estado sólido à temperatura ambiente. As proteínas são separadas na fração sólida ou estearina nos óleos de peixe brutos. b) Devido ao facto de que as substâncias voláteis que causam o odor no peixe têm um PF muito baixo. Substâncias tais como heptadienal, octadieno, octeno, heptenal, decatrienal e particularmente dimetilamina e trimetilamina, têm um PF avaliado em -92 °C e -117 °C, respetivamente.
Durante os processos de arrefecimento e solidificação no óleo, as substâncias anteriormente mencionadas serão uma parte da fração líquida que deve ser separada, e que contém estas substâncias voláteis juntamente com o PhA e outros alcenos e álcoois com baixos níveis de PhA. A desodorização é levada a cabo por processo de arrefecimento e não por aquecimento, sem necessidade de qualquer processo de purificação. A presente invenção permite a obtenção de óleos refinados não purificados sem se ter de levar a cabo qualquer processo convencional para desodorização - o que aumenta o risco de alteração dos ácidos gordos polinsaturados (temperaturas elevadas). 0 PhA está presente fundamentalmente em triglicéridos (>80 % aprox.) e outros ésteres, detetados na forma livre em pequenas quantidades, aparecendo na mesma posição (C-2) em ambos os triglicéridos e fosfolípidos nos óleos, a mesma que os ácidos gordos PUFA e devido às suas características físico-químicas comparáveis. A extração de PhA, tal como em todos os processos de purificação de DHA e ómega-3, não pode ser levada a cabo diretamente a partir de triglicéridos, contendo ácidos gordos ómega-3 com diferente PF de acordo com a sua mistura. Depois, os ácidos gordos devem ser previamente obtidos por hidrólise dos triglicéridos que fazem parte dos óleos ou gorduras de modo a formar ácidos gordos livres através de transesterificação (catalítica) para formar ésteres a partir de álcoois ou através de hidrólise (catalítica) para obter os ácidos livres. Podem surgir duas situações:
Transesterificação e formação de ésteres de ácidos gordos (por exemplo, etanol): Não obstante, embora possa ser levada a cabo a partir de ésteres alcoólicos obtidos a partir de transesterificação catalítica (por exemplo, etanol), o PF nos ácidos gordos é consideravelmente reduzido para aprox. >20 °C, dependendo do tipo de álcool (Quadro 1). Este facto implica um custo energético superior, de modo a solidificar óleo com DHA, a temperatura deve ser reduzida 20 °C mais baixa do que em casos onde os ácidos gordos são livres.
Hidrólise catalítica (por exemplo: saponificação + acidificação) para a obtenção de ácidos gordos livres: A hidrólise catalítica é um método vastamente aplicado a óleos de peixe tomando como base qualquer método convencional amplamente desenvolvido e utilizado na indústria atual. Qualquer ácido orgânico de grau alimentar ou farmacêutico poderia servir como catalisador, tal como ácido acético, ou catalisadores sólidos tais como resinas de permuta iónica (resina de estireno), ou catálise enzimática por lipase (por exemplo, Novozyme 435) seja imobilizada ou em solução.
Os óleos de peixe têm gorduras não saponifiçáveis contendo colesterol, PCBs, vitaminas A e D, etc., que devem ser eliminados dos óleos ricos em DHA ou em ómega-3 com o objetivo de obter um grau alimentar ou farmacêutico. Um método amplamente utilizado, rentável e eficiente para separar gorduras não saponifiçáveis (estearina) nos processos de refinação é a hidrólise completa por saponificação de óleo de peixe em meio moderadamente alcalino, a baixas temperaturas e num ambiente inerte para evitar a alteração de ácidos gordos polinsaturados. Desta maneira, a hidrólise necessária nos processos de refinação é útil para proceder com a separação de PhA nesta invenção.
Devido a isto, a invenção em causa foi iniciada a partir de hidrólise de triglicéridos e ésteres encontrados em óleo de peixe num meio moderadamente alcalino (por exemplo, hidróxido de potássio ou hidróxido de sódio) a baixa temperatura, para obter um óleo líquido e para favorecer a hidrólise (ou seja, 40 °C-90 °C), até à hidrólise e saponificação completas dos ácidos gordos. A mistura resultante contém sais (potássicos ou sódicos) a partir de ácidos gordos que não são adequados para o procedimento descrito nesta invenção já que alteram o PF nos ácidos gordos, portanto a acidificação ou hidrólise catalisada é levada a cabo pela utilização de ácidos orgânicos não oxidativos (por exemplo, ácido acético) adicionando-o à mistura agitada vigorosamente para obter ácidos gordos na forma livre. É possível proceder à destilação a vácuo em óleo para separar os ácidos gordos livres (por exemplo, 2 mmHg) e atmosfera inerte para evitar qualquer dano aos ácidos gordos PUFA livres. Não obstante, este método facilita a separação da fase sólida, contendo estearina e gorduras não saponifiçáveis, por decantação e centrifugação, e da fase líquida, que contém o óleo acidificado, lavando-a repetidamente, contendo acetato de sódio ou potássio. Isto garantiria a conservação do glicerol. 0 glicerol é mais seguro que os solventes de grau alimentar ou farmacêutico, e implica um método muito mais fácil dado a sua presença necessária em ambas a fase inicial e final do produto. Mas o aspeto mais notável é que o glicerol permite uma separação por gradiente de densidade, o que favorece a cristalização de forma muito mais eficiente que em métodos de fracionamento atualmente utilizados com outras substâncias químicas (por exemplo, ureia), fracionando ácidos gordos saturados e monoinsaturados, e particularmente, para a separação de PhA e ómega-3. 0 glicerol num óleo acidificado é o agente crioprotetor mais seguro e um bom humectante, que favorece a cristalização de ácidos gordos saturados na fase de separação de PhA. Além disso, a presente invenção adiciona glicerol ao óleo acidificado de modo a favorecer o fracionamento por gradiente de densidade, o que também ajuda a desenvolver, não apenas a fração por gradiente de centrifugação, mas também a cristalização.
Quanto à centrifugação por gradiente de densidade utilizada na presente invenção, é necessário um gradiente que reúna determinadas características: baixa massa molecular (reduz o tempo de centrifugação), baixa viscosidade, densidade mais alta do que nos solutos (ácidos gordos) , transparência sob luz UV e boas propriedades solventes. 0 glicerol, que tem uma densidade elevada (1,25 g/cm3), atua como um meio para o fracionamento por gradiente de densidade ou separação de moléculas até 1,15 g/cm3 conforme se deteta no caso de ácidos gordos encontrados em óleos ricos em ómega-3. 0 glicerol pode ser misturado com água ou qualquer outro solvente para reduzir significativamente o seu ponto eutéctico (isto é, a dissolução de glicerol a 65 % em água reduz o PF desde +18 °C até -47 °C), o que o faria estar no estado liquido durante o processo de cristalização. 0 glicerol numa pequena fração de solvente permite a redução da viscosidade (Quadro 2), comportando-se com um gradiente ideal na centrifugação isopicnica. A viscosidade também pode ser reduzida aumentando a temperatura, especialmente durante a fase de arrefecimento desta invenção. É um gradiente inicial para o fracionamento por centrifugação de ácidos gordos por gradiente de densidade e cristalização. A composição dos ácidos gordos, chave no teor destes óleos, não revela diferenças significativas na massa molecular mas em densidade (três frações de ácidos gordos) . 0 seu PF comporta-se de modo semelhante, otimizando consideravelmente a cristalização destes ácidos gordos próximo do PF. Entre ambas as técnicas de centrifugação por gradiente de densidade (zonal ou isopicnica), a mais adequada para esta invenção é a isopicnica, já que provoca frações de acordo com a densidade porque não existem diferenças significativas na massa molecular entre PhA (312,53 g/mol) e DHA (328,5 g/mol) e o EPA (302,4 g/mol) necessárias para a técnica zonal. Não obstante, pode ser utilizada para a separação de ácidos gordos saturados e monoinsaturados e no limite da técnica (8 %) para a separação de DHA e EPA (embora nesta invenção tenham sido separados da mesma forma que outras moléculas com diferenças de massa molecular <10 % (Fuentes-Arderiu et al., 1998)
Nesta invenção, o fracionamento por gradiente de densidade é levado a cabo antes da cristalização de modo a formar 3 frações de acordo com a densidade correspondente às frações de óleo principal: ácidos gordos saturados e monoinsaturados e ómega-3. Isto causaria a fração e modificação do ponto eutéctico da mistura de ácidos gordos do óleo, otimizando numa proporção elevada a solidificação de frações de acordo com o seu PF. Este procedimento também é eficiente quando se otimiza a separação de PhA a partir de ómega-3, sem utilizar qualquer solvente.
Quadro 2 Correlação de viscosidade-temperatura para soluções de glicerol-água (mPa) (Dorsey, 1940)
Separação de PhA e purificação de ácidos gordos ómega-3 por: 1 -cristalização fracionária de acordo com as suas diferentes densidades utilizando um gradiente de densidade.
Métodos de separação de ácidos gordos encontrados nos óleos são especialmente complicados para levar a cabo, particularmente em casos quando os ácidos gordos partilham propriedades fisico-quimicas que são essenciais em métodos de separação: destilação, cristalização, extração com solventes ou cromatografia. A cristalização fracionária é um processo para a separação de diferentes substâncias cuja solubilidade é diferente em termos de variações de temperatura. Apesar do facto de que a base da cristalização fracionária se refere a esta propriedade fisico-quimica, na realidade a cristalização fracionária consiste na separação de dois ou mais compostos químicos de acordo com o seu PF diferente. 0 método proposto nesta invenção ainda não foi descrito antes, já que sugere um método no qual dois ou mais componentes podem ser separados, fracionando-os em termos de densidade e não solubilidade, de acordo com variações de temperatura. Devido a isto, a invenção denomina-se Cristalização Fracionária por Densidade (Fractional Crystallization by Density, FCD). 0 método descrito poderia ser utilizado para separação dos componentes: a) com propriedades semelhantes (por exemplo, soluções homogéneas) em relação a interações complexas que resultam em variações do diagrama de composição eutéctica, ou b) mesmo em composições heterogéneas com diferente solubilidade mas onde qualquer dos componentes é altamente sensível às variações ou aumentos de temperatura. A invenção em causa refere-se especificamente à separação de uma determinada composição homogénea de óleo em duas ou mais composições, variando o seu ponto eutéctico e procedendo para variações de temperatura através da aplicação de um processo de arrefecimento e separação por cristalização fracionária. 0 propósito principal consiste em separar uma fração composta por ácidos gordos saturados e monoinsaturados e PhA, que contém um ponto eutéctico mais elevado do que uma fração contendo ácidos gordos ómega-3.
A cristalização e densidade resultaram ser as propriedades mais diferenciais quando se separam ácidos gordos ómega-3, PhA e ácidos gordos saturados. Esta invenção permite a separação em frações de ácidos gordos ou micelas (de acordo com a lipossolubilidade do gradiente) contendo uma elevada proporção de ácidos gordos com uma densidade inferior como ácidos gordos saturados e monoinsaturados e PhA de ácidos gordos ómega-3, com uma densidade mais elevada. Estas duas composições, que podem ser puras ou não (mistura de diferentes ácidos gordos) , têm diferentes pontos eutécticos em relação ao PF e à concentração da composição individual dos ácidos gordos; duas frações de diferentes composições podem ser separadas por cristalização fracionária.
Este processo também é particularmente eficiente para a separação de substâncias ainda mais pequenas por cristalização fracionária, de acordo com a densidade. Tal é o caso especifico da presente invenção, quando um dos componentes PhA (3S) em baixos níveis de concentração tem um PF semelhante do que um ou mais componentes (DHA). Nesta invenção, pode ser aplicada a ultracentrifugação por densidade isopícnica ou não isopícnica. A aplicação de solventes normalmente utilizados para obter DHA com elevados níveis de pureza não é necessária no processo da presente invenção.
Opção 1: Cristalização fracionária por ultracentrifugação de gradiente de densidade isopícnica A centrifugação demonstrou ser 90 % mais rentável em relação aos produtos químicos, 70 % em termos de carga de trabalho humana, 60 % mais rápida e mais ecológica uma vez que não utiliza solvente para a separação de ácidos gordos livres e gorduras (Feng et al., 2004) . A centrifugação e refrigeração são amplamente utilizadas na indústria alimentar. Nesta invenção é possível favorecer a separação e cristalização dos ácidos gordos ómega-3 e PhA com ou sem solventes. Tem havido uma utilização generalizada de ultracentrifugação a grande escala na indústria farmacêutica. Deverá ser notado que a ultracentrifugação permite a separação de diferentes frações de ácidos gordos antes da cristalização. A utilização da centrifugação para a separação de macromoléculas é bem conhecida, mas não foi ainda utilizada para a separação de moléculas muito pequenas tais como ácidos gordos com massa molecular semelhante e densidade diferente. Foi separado 99 % de DDT, um composto lipossolúvel com uma massa molecular comparável com aquela dos ácidos gordos, por ultracentrifugação de gradiente de densidade Ficoll (Adamich et al., 1974) . Nesta invenção, os ácidos gordos com massa molecular semelhante (com 300 daltons) são fracionados por ultracentrifugação de gradiente de densidade isopícnica. Óleo acidificado contendo ácidos gordos livres serão utilizados na fase especifica desta invenção: separação de PhA a partir de óleo rico em ómega-3. Neste método, o estado físico do óleo é alterado por cristalização do próprio óleo, contendo ácidos gordos ómega-3 (por exemplo, DHA), mantendo PhA e PA num estado líquido e separando especificamente o PhA e PA da cristalização de frações de DHA, EPA, PhA (3S) . Esta técnica permite a obtenção de DHA e EPA com elevados graus de pureza >95 % e >99 %, ou um triglicérido de grau alimentar ou farmacêutico (>850 mg/g), sem PhA (< 5 mg/g). A perda dispendiosa de ácidos gordos ómega-3 também pode ser evitada.
Os ácidos gordos têm propriedades de auto-nucleação e não possuem a qualidade de sobrefusão. O ponto de fusão (PF) e o ponto de congelação são o mesmo. Devido a isto, para levar a cabo a purificação de ácidos gordos ómega-3 isentos de PhA, seria suficiente obter duas ou mais frações com diferentes pontos eutécticos que permitiram o processo de purificação mencionado anteriormente.
Os ácidos gordos saturados têm um PF elevado (>18 °C) , enquanto nos ácidos gordos monoinsaturados, o PF é >13 °C. Além disso, a composição em ácidos gordos saturados e monoinsaturados em óleo acidificado bruto é >50 % (para aqueles de origem de algas) e frequentemente atinge níveis de 70 % (óleos de peixe). Não obstante, a presença e quantidade numerosa de espécies de ácidos gordos ómega-3, reduz significativamente o ponto eutéctico, que resulta num processo de cristalização de arrefecimento ineficaz a temperaturas muito baixas, tal como -20 °C.
Por outro lado, conforme pode ser observado no Quadro 1, o PF no PhA é 20 °C mais elevado e 10 °C mais baixo do que os PFs no DHA e EPA, respetivamente. Contudo, os isómeros de PhA presentes em determinados óleos (por exemplo, óleos de peixe) diminuem em aprox. 2 °C a diferença existente entre PhA (3S) e o DHA.
Dado o facto que o óleo não cumpre as condições para cristalização dos seus componentes ou ácidos gordos com solubilidade semelhante para o fracionamento, é levada a cabo uma cristalização fracionária por densidade da fração de ácidos gordos. Portanto, com esta invenção, o método de desodorização é otimizado, bem como a purificação de óleo contendo ómega-3 e cristalização fracionária de DHA e ómega-3.
Para este propósito, é inicialmente levada a cabo uma centrifugação fracionária por gradiente de densidade ou isopicnica por gradiente autoformado. Esta é uma técnica utilizada para a separação de moléculas de massa molecular semelhante mas diferentes densidades não apenas em processos laboratoriais, mas também em processos industriais farmacêuticos essenciais, para purificação e separação de proteínas e criação de vacinas, entre outras aplicações.
Nesta técnica, o óleo é dissolvido numa solução isocrática e sob uma força centrífuga, os ácidos gordos foram um gradiente de acordo com a sua densidade e não de acordo com a sua massa molecular, devido ao facto de que se distribuem no reator durante a centrifugação, A principal premissa consiste em que a densidade de gradiente máxima (por exemplo, glicerol) deverá exceder sempre a densidade dos ácidos gordos. A centrifugação por gradiente de densidade permite que os ácidos gordos se movam ao longo do gradiente até que atinjam um ponto onde a sua densidade e aquela do gradiente sejam a mesma (isopicnica) . Neste momento, terá lugar a separação por cristalização, já que a separação convencional deverá ser feita muito cuidadosamente e poderia causar uma contaminação indesejada do óleo ómega-3.
Um gradiente contendo um solvente parcialmente apoiar (por exemplo, heptanol) pode ser utilizado para criar uma mistura de gradiente de óleo homogéneo e auxiliar na separação de ácidos gordos individuais sem a formação de micelas. Desta maneira, existe uma dispersão dos ácidos gordos livres, obtendo uma fração mais pura em ácidos gordos ómega-3, sem PhA e perdas. Contudo, isto apresenta duas dificuldades: a separação do gradiente no produto final e o facto de que a separação molecular de ácidos gordos livres requer um tempo de ultracentrifugação mais prolongado. Devido à primeira razão, uma das condições normais dos gradientes é a solubilidade em água. Quando se utiliza um gradiente solúvel em lípidos, pode ser separado durante o processo final após este procedimento e desde que contenha um PF diferencial com a fração a ser separada. 0 gradiente utilizado para a presente invenção é de glicerol, já que é produzido durante este processo, que é barato e seguro para utilização alimentar e farmacêutica, sem descartar qualquer outro gradiente para este propósito (por exemplo, sacarose), sendo a sua elevada viscosidade a maior inconveniência em ambos casos. Quando se utiliza o glicerol como um gradiente, ele dever ser refrigerado a 10 °C ou abaixo do PF do glicerol (18 °C) durante a ultracentrifugação. Contudo, comporta-se muito bem como um liquido superfundido em dissolução com água e outros solventes.
Nesta invenção, são utilizadas várias misturas de solvente com glicerol para reduzir a viscosidade e diminuir o PF do gradiente. Particularmente, é a utilização de solventes que favorece a cristalização, mas acima de tudo, para reduzir o ponto eutéctico e viscosidade do gradiente. A utilização de solventes com um grau alimentar e farmacêutico elevado, como misturas de glicerol/água, isopropanol ou outros álcoois, é recomendável mas não excludente. Os solventes tais como misturas de glicerol/água e acetona têm um comportamento anfipático e humectante superior como solventes que estimula a cristalização dos ácidos gordos, especialmente nas temperaturas necessárias na presente invenção, já que têm um PF muito baixo (-95 °C).
As misturas de glicerol mais adequadas são aquelas que permitem ao glicerol reduzir a viscosidade, reduzem moderadamente o PF e significativamente a viscosidade. A redução da viscosidade do gradiente é essencial para a resolução de frações e do tempo para o equilíbrio de modo a separar o PhAmais eficientemente. Com misturas de glicerol/água, a proporção ideal é aquela que permite a formação de um líquido superarrefecido ou superfundido, diminuindo o seu PF significativamente: glicerol: 67 % p/p com um PF de -47 °C. Ao mesmo tempo, a densidade é reduzida, encurtando consideravelmente a duração da centrifugação por gradiente de densidade, um resultado económico e seguro. A utilização de outras misturas de glicerol é também possível, utilizando pequenas quantidades de solvente, evitando uma queda de densidade abaixo de DHA (>0,95 g/cm3) de modo que possa ser utilizado como um gradiente, atuando os álcoois como solventes polares de cadeia curta (C1-C5) para a dispersão de micelas, e preferentemente solventes para obter um gradiente parcialmente polar de cadeia média (C6-C8) que permite a dispersão de ácidos gordos livres. A proporção de glicerol nestes álcoois deve ter uma densidade mais elevada e um PF baixo. Uma quantidade de glicerol entre 5 % e 50 % permite uma redução do PF inversamente proporcional no intervalo de temperaturas durante a ultracentrifugação, reduzindo consideravelmente a densidade e viscosidade, mas sendo sempre >1 g/cm3, necessária para esta invenção. Para esta invenção, um gradiente de glicerol a 25 % p/p e um PF de aprox. -7 °C permite uma otimização do procedimento de fracionamento reduzindo o tempo de ultracentrifugação. O glicerol a 50 % p/p é suficiente para obter um PF de aprox. -23 °C e para exceder a redução da temperatura máxima de uma ultracentrifugação a uma escala maior. A utilização de gradientes solúveis em água irá estimular a formação de nanomicelas que reduzirão o tempo de equilíbrio. Contudo, de modo a alcançar o equilíbrio e fracionamento ideal, a composição destas micelas tem de ser altamente homogénea de acordo com a sua densidade. A difusão dos ácidos gordos ocorrerá seguindo um padrão de acordo com a densidade e não escolhido aleatoriamente, modificado pela ultracentrifugação por gradiente de densidade. Tal como ocorreu no gradiente de centrifugação, o gradiente de densidade é formado de acordo com a distância até ao eixo do rotor; o processo inicialmente desenvolve a formação de micelas contendo ácidos gordos com a densidade mais elevada, que formam a fração mais densa e afastada do eixo do rotor. 0 aumento significativo da densidade dos ácidos gordos, especialmente do PhA e ácidos gordos ómega-3 saturados, fazem-na uma técnica eficiente. O principal problema é que uma massa molecular relativamente pequena requer velocidades e durações muito elevadas para obter a separação. Um excesso de tempo não afetará a separação. Contudo, como as moléculas têm uma massa molecular tão baixa, o tempo necessário é elevado (por exemplo, 48 horas), e embora não seja excelente em procedimentos de separação, este tempo pode ser otimizado.
Por meio de uma ultracentrifugação isopícnica aplicada a um óleo rico em ómega-3 bruto, são formadas 3 frações de acordo com a massa molecular e densidade: a) ácidos gordos saturados contendo principalmente ácido mirístico, palmítico e esteárico com uma massa molecular de (228-290 g/mol) e uma densidade inferior à do óleo (0,85-0,86 g/cm3) b) ácidos gordos monoinsaturados com uma massa molecular semelhante e uma densidade ligeiramente mais elevada (0,88-0,89 g/cm3) c) ácidos gordos ómega-3 com uma massa molecular de (300-330 g/mol) e uma densidade mais elevada (0,93-0,95 g/cm3) . 0 PhA é detetado na fração (b) através de uma centrifugação isopicnica com uma densidade de (0,88 g/cm3) .
Isto pode ser realizado com gradientes lineares ou não lineares, contínuos ou descontínuos, tendo-se escolhido para esta invenção o método linear contínuo devido à sua aplicação industrial. A redução do tempo necessário para obter o equilíbrio é essencial nesta invenção. Este é o motivo pelo qual o método mais adequado neste caso é a utilização de rotores verticais, já que reduzem consideravelmente o tempo de equilíbrio. A velocidade da ultracentrifugação pode começar a 30.000 rpm ou 100.000 x g até ser alcançado o equilíbrio. Não existe tempo em excesso nesta técnica. À medida que a ultracentrifugação começa, os ácidos gordos lentamente começam a difundir-se com a ajuda do gradiente. Os ácidos gordos saturados cristalizam lentamente a 20 °C e os ácidos gordos monoinsaturados a 10 °C. A formação do equilíbrio irá aumentar significativamente o ponto eutéctico do óleo no início da ultracentrifugação e com ele a lenta formação de cristais. Os ácidos gordos não variam significativamente em densidade num estado sólido.
Portanto, a ultracentrifugação a 10 °C contribui para a cristalização das fases para descartar (a) e (b), contendo ácidos gordos saturados e monoinsaturados. Portanto, quando o equilíbrio é alcançado, é possível separar a fração líquida contendo o ómega-3 e o gradiente sem risco de contaminação.
Durante a centrifugação, a fração não é sempre completamente cristalizada a 10 °C, já que a mistura de ácidos gordos monoinsaturados e PhA reduz o ponto eutéctico. Por este motivo, é recomendável arrefecer a uma temperatura de entre 0 a -5 °C ou preferentemente a -30 °C, ou a uma temperatura abaixo do ponto eutéctico da fração purificada com ácidos gordos ómega-3, que variará de acordo com a composição entre aproximadamente -44 °C e -57 °C, essencialmente dependendo da composição do DHA e do EPA. 0 processo de arrefecimento pode ser levado a cabo simplesmente arrefecendo a proveta contendo o gradiente em equilíbrio. Contudo, este processo de arrefecimento pode ocorrer durante a ultracentrifugação, já que os ultracentrifugados a uma escala maior permitem uma redução da temperatura até -20 °C, melhorando a cristalização nestas etapas. Contudo, na presente invenção, o processo de arrefecimento ocorre durante ou próximo do ponto de equilíbrio, garantindo desta forma a solidificação do PhA. A definição da temperatura em 20 °C ou menos durante a ultracentrifugação não é excludente nesta invenção. E possível reduzir o tempo de equilíbrio e otimizar o processo de ultracentrifugação através do aumento da temperatura (por exemplo, 60 °C) (entre 20° e 90 °C), uma vez que reduz consideravelmente a viscosidade dos ácidos gordos saturados, particularmente a dos saturados e monoinsaturados, tal como reduz a viscosidade do gradiente (glicerol) , otimizando o fracionamento e reduzindo consideravelmente o tempo de centrifugação até que o equilíbrio seja alcançado.
Podem ser feitas alterações ao processo de centrifugação isopícnica de modo a reduzir a sua duração e otimizar a separação do PhA. A este respeito, a cristalização pode ser alcançada sem atingir o equilíbrio, de modo a reduzir a duração da ultracentrifugação. Normalmente, o tempo necessário para alcançar o equilíbrio é de 48-72 horas, dependendo do gradiente, temperatura, velocidade e rotor utilizado. Dado que o PhA constitui uma fração muito pequena e que não tem em vista a pureza química, é possível obter as especificações desta invenção sem atingir o equilíbrio.
Dentro de 24 horas, ocorreu a maioria do fracionamento dos ácidos gordos ómega-3 e do resto dos ácidos gordos e PhA. Desta maneira, a maioria dos ácidos gordos, incluindo a maioria do PhA é sensível à cristalização a temperaturas abaixo daquelas dos ácidos gordos ómega-3. Desta forma, é possível proceder à cristalização antes do equilíbrio ser alcançado, reduzindo a temperatura (ou seja, °C) da ultracentrifugação durante o tempo que for necessário (por exemplo, 24 horas) de modo a separar a fração líquida contendo ácidos gordos ómega-3 e o gradiente. Os ultracentrifugados a uma grande escala permitem atingir temperaturas de até -20 °C. Desta maneira, também é possível separar o PhA eficazmente e purificar o óleo contendo ácidos gordos ómega-3 sem perder qualquer material.
Opção 2: Cristalização fracionária por ultracentrifugação de gradiente de densidade não isopícnica
Embora seja possível extrair óleos purificados quanto a ómega-3 da fração, o risco de contaminação é elevado. A duração da ultracentrifugação também pode ser reduzido significativamente sem se alcançar um equilíbrio completo ou quase equilíbrio do gradiente de densidade. Desta forma, isto poderia eliminar uma concentração elevada de ácidos gordos saturados e uma parte do PhA, que de acordo com a sua concentração original e isómero (3R), poderia ser suficiente para obter as especificações desta invenção. Não obstante, na maioria das circunstâncias, são obtidos melhores resultados quando se realiza a separação através de cristalização.
Nesta invenção, podem ser estabelecidos ciclos de temperatura diferentes ou pode ser utilizada uma zona de fracionamento para purificar o DHA e EPA. 0 isómero PhA (3S) que pode, normalmente, ser encontrado em pequenas proporções nos óleos de peixe e outros óleos de origem marinha, com a exceção de mamíferos e microrganismos (ou seja, atum rico em DHA), tem o PF próximo ao DHA (Quadro 1 e Figura 5). Este isómero constitui um grande obstáculo para a sua separação por cristalização. Portanto, a separação deste isómero, particularmente quando utilizando esta invenção, requer uma centrifugação isopícnica prévia do óleo, dadas as diferenças nas densidades de PhA (0,882 g/cm3) e DHA (0,943 g/cm3) , enquanto a temperatura do PF do PhA é apenas 2 °C inferior. O ponto eutéctico dos óleos ricos em ómega-3 está abaixo de 40 °C antes de serem fracionados. Com este procedimento de separação é possível obter um comportamento da cristalização das diferentes frações suficientemente diferencial a partir dos pontos eutécticos diferentes das composições de ácidos gordos das frações. O ponto eutéctico da mistura nas frações (a) e (b) aumenta significativamente, em comparação com a composição original dos ácidos gordos, contendo PhA ( — 0,1 %) . Também estão contidos nesta fração, os componentes voláteis responsáveis pelo odor característico dos óleos. 0 dito ponto eutéctico, torna possível a solidificação da fração a temperaturas < -20 °C, mas suficientemente elevadas para separar eficientemente a fração c) dos ácidos gordos ómega-3 com um ponto eutéctico abaixo de -40 °C. Desta forma, o PhA é uma parte da fração sólida (b) ou (b+a) . A fração (b) contém praticamente a totalidade de PhA (dois isómeros) nos óleos, o que permite uma separação altamente eficaz de PhA (3S) que seria muito complicada por cristalização. O tempo de cristalização necessário pode variar entre 18 e 72 horas. A velocidade de arrefecimento deverá ser suficientemente lenta para estimular a cristalização dos ácidos gordos, embora a cristalização de DHA tenha ocorrido em 24 horas com uma redução da temperatura/velocidade de -3,3 °C ou velocidade de arrefecimento inferior. É possível obter um crescimento de cristais de DHA livres, de modo que uma vez separados retêm a fase de líquido mais pequena possível. Este é o motivo pelo qual poderia ser conveniente que se formassem cristais grandes durante o processo, através da lenta diminuição da temperatura. A cristalização pode ser realizada em grandes depósitos, mantidos num armazém frio ou congeladores criogénicos a uma temperatura iniciando-se a -44 °C.
Nos óleos não purificados ou brutos, ou óleos contendo uma proporção elevada de ácidos gordos saturados e/ou monoinsaturados, o PhA é separado através da utilização de um ciclo de temperatura de -30 °C (entre -20 °C e -40 °C) abaixo do PF dos ácidos gordos ómega-3 e do ponto eutéctico do óleo. Assim é como uma fração sólida contendo ácidos gordos saturados + ácidos gordos monoinsaturados + PhA pode ser separada da fração líquida contendo uma pureza elevada de DHA e EPS através de filtração, se necessário. A esta temperatura, o gradiente de glicerol cristaliza, permanecendo no estado líquido apenas a fração com a densidade mais elevada e PF mais baixo com um ómega-3 de pureza elevada, também separando o gradiente dos ácidos gordos ómega-3. Contudo, se for utilizada uma mistura de glicerol/água a 67 % p/p permanecerá líquida, o que permitirá outro processo de centrifugação por gradiente (por exemplo, separação de DHA/EPA ou óleo rico em DHA/PhA) ou regenerar o gradiente para outro processo de separação de PhA noutro lote de óleo.
Este procedimento elimina quase completamente a totalidade dos dois isómeros de PhA. Desta forma obtém-se óleo ómega-3 com elevada pureza nos seus dois componentes principais DHA e EPA (>95 % ou >800 mg/g) De acordo com a razão de DHA/EPA no óleo original pode obter-se: a) Para um óleo contendo essencialmente DHA como único ácido gordo ómega-3 (por exemplo, Schizochytrium sp.) é obtido um DHA >95 % (>850 mg/g) ou >99 % (>900 mg/g). b) Para uma razão de DHA/EPA >3 (por exemplo, no atum) é obtido um óleo rico em DHA >700 mg/g contendo PhA (< 5 pg/g); c) Para uma razão de DHA/EPA entre 1 e 3 (por exemplo, no salmão) é obtido um óleo com DHA <700 mg/g contendo PhA < 90 pg/g; d) Para uma razão de DHA/EPA <1 (por exemplo, no peixe vermelho, anchovas, cavala, sardinha, bacalhau) é obtido um óleo com EPA >400 mg/g e DHA <400 mg/g contendo PhA < 5 pg/g.
Com esta invenção, também é possível fracionar o DHA e EPA, obtendo um DHA e EPA de pureza elevada e teor baixo ou nulo de PhA. O DHA e EPA apresentam uma diferença de 10 % na massa molecular, suficientemente diferente para a ultracentrifugação zonal (Arderiu et al., 1988) . Para isto, é possível realizar um segundo ciclo de arrefecimento, um processo prévio e necessário para a ultracentrifugação por gradiente de densidade zonal a -50 °C ou entre -44 °C e -54 °C, ou a qualquer outra temperatura entre o PF do DHA e o EPA. Independentemente da composição original, é obtida uma elevada pureza de DHA e EPA e uma concentração baixa ou nula de PhA em todos os óleos.
Neste ponto, pode ser adicionado algum antioxidante lipofílico alimentar ou farmacêutico (por exemplo, tocoferóis) de modo a estabilizar a oxidação dos PUFAs. O óleo acidificado com um teor baixo ou nulo de PhA requer uma esterificação imediata dos ácidos gordos livres por alcoólise ou formação de novotriglicéridos, que é o objetivo principal dos inventores, através de qualquer meio convencional levado a cabo na indústria atualmente, enzimático inespecífico ou seletivo ou outro método com um catalisador líquido ou sólido (por exemplo, documento de patente US 20080114181) . No caso do óleo que contém éster de etilo, a re-esterificação também será levada a cabo para obter triglicéridos. 0 diagrama tem exemplos para o desenvolvimento de triglicéridos de DHA > 700 mg/g e < 0,5 pg/g de PhA. Contudo, é possível obter, normalmente, concentrações de DHA > 900 mg/g (o máximo teórico de pureza em DHA no óleo é um triglicérido 100 % puro que poderia conter aprox. 960 mg/g). O procedimento escolhido é o mesmo para todas as matérias-primas, embora a concentração de DHA dependa das matérias-primas escolhidas no principio e do processo opcional para fracionar o DHA para separação de EPA. A este respeito, para todos os óleos de partida contendo DHA/EPA> 3, os processos de purificação do ómega-3 resultará em purezas de DHA> 700 mg/g Exemplos:
Matéria-prima 1: Óleo contendo DHA apenas sem um teor significativo de ácidos gordos ómega-3. • Ou seja: Óleos a partir da biomassa de microrganismos (por exemplo, Schizochytrium sp) contendo triglicéridos DHA > 400 mg/g e PhA > 120 pg/g.
Matéria-prima 2: Óleos ricos em ómega-3 com diferentes razões de DHA/EPA como o único teor significativo de ácidos gordos ómega-3- • DHA/EPA <1. Por exemplo: óleo refinado de peixe vermelho (30 % de ómega-3) contendo triglicéridos de DHA > 100 mg/g; EPA > 150 mg/g e PhA > 1900 pg/g • DHA/EPA <3. Por exemplo: Óleo refinado de atum (30 % de ómega-3) contendo triglicéridos de DHA > 200mg/g; EPA > 60 mg/g e PhA > 1300 pg/g • DHA/EPA <3. Por exemplo: Óleo refinado de atum purificado(70 % de ómega-3) contendo triglicéridos de DHA > 500 mg/g, EPA < 150 mg/g e PhA > 1600 pg/g
Matéria-prima 3: Os óleos purificados de DHA com um baixo teor de EPA > 700 mg/g são produzidos e obtidos regularmente como éter de etilo e formulações purificadas (por exemplo, por destilação molecular). Eles não requerem a purificação de ácidos gordos ómega-2, apenas tem de ser extraído o PhA. • DHA/EPA >7. Por exemplo: Óleo refinado de atum purificado (90 % de ómega-3) contendo triglicéridos de DHA > 700 mg/g, EPA < 150 mg/g e PhA > 3 pg/g O procedimento é simultaneamente isento de PhA e PA, mas como indicado, apenas o PhA apresenta quantidades clinicamente significativas as quais são a razão pela qual sempre se faz referência a PhA e apenas se menciona o PA em resultados e de forma esporádica na patente. 0 PA separa-se no mesmo ponto de fracionamento por cristalização que o PhA. 0 Exemplo 1 mostra quanto PA existia antes e quanto resta na análise final do produto final (exemplo 1).
De modo a ilustrar a invenção, são mostrados extratos diferentes obtidos a partir de óleos diferentes, ricos em DHA e com um baixo teor de PhA. Os seguintes exemplos não são exclusivos da presente invenção. Os extratos obtidos podem ser utilizados, posteriormente, em diferentes formulações galénicas, preferentemente cápsulas, como suplementos para a saúde ou medicamentos para tratamento de doenças diferentes. EXEMPLOS:
Exemplo 1: Procedimento para a obtenção de um extrato contendo triglicéridos com DHA > 700 mg/g e PhA < 5 pg/g, por ultracentrifugação isopicnica e cristalização. A matéria-prima utilizada é óleo de atum bruto (Sanco) não desodorizado e não purificado contendo DHA (210 mg/g), EPA (67 mg/g) e ómega-3 total (285 mg/g). Depois da quantificação dos ácidos gordos no óleo através de cromatografia gasosa e espectrometria de massa, a presença de PhA foi determinada (1,3 mg/g). São estabelecidos dois ciclos de temperatura decrescente pela sua eficácia e de modo a alcançar rapidamente o propósito principal desta inovação de DHA sem PhA. 1. Saponificação
Num reator de 5 litros com um agitador, procede-se à saponificação de 1000 g de óleo de atum bruto com 250 g de KOH, 280 ml de água e 10 ml de etanol para iniciar a reação a uma temperatura de 40 °C sob uma atmosfera inerte (azoto) agitando a mistura a 300 rpm durante 1 hora. 2. Acidificação. Formação de ácidos gordos livres a partir dos seus sais À mistura de potássio obtida na fase anterior foram adicionados 3 litros de ácido acético (ácido não oxidante) a 70 % e misturou-se vigorosamente durante 60 minutos a 200 rpm sob uma atmosfera inerte (azoto). Os sais de acetato de potássio formados, precipitaram e são eliminados através de filtração. Uma vez assente, formam-se duas fases: uma fase apoiar e fase polar com densidade mais elevada contendo o restante do ácido acético, que é eliminado através de uma abertura na base do reator. Depois, a lavagem é realizada adicionando 4 litros de água purificada ao reator e agitando durante 30 minutos a 150 rpm, uma vez assente e formadas duas fases: uma apoiar contendo o óleo e uma apoiar que contém água, na base do reator. A fase apoiar é eliminada através da abertura na base do reator. Posteriormente, realizam-se 4 lavagens adicionais adicionando 4 litros de água até que se obtém um óleo de atum acidificado. 3. Centrifugação isopicnica 0 óleo de atum acidificado obtido na fase anterior é centrifugado a 150 rpm durante 20 minutos formando uma fase sólida ou estearina e uma fase liquida contendo os ácidos gordos livres que são submetidos a vácuo de modo a serem utilizados na próxima etapa. 2400 ml de gradiente são preparados a partir de uma mistura de glicerol/água a 25 % p/p, adicionando 1800 ml de água e 535 ml de glicerol, nos quais se adicionam os ácidos gordos livres obtidos previamente e o glicerol à temperatura ambiente. A mistura é homogeneizada a 3000 g durante 1 hora numa ultracentrifuga Hitachi-Koki CC40 e um rotor C40CT4 Core (H). Posteriormente, o vácuo (27 Pa) e a uma temperatura inicial de 10 °C, a velocidade de centrifugação é aumentada para 1000000 g durante 42 horas. Depois de 24 horas de ultracentrifugação, a temperatura é diminuída abruptamente a 0 °C mantendo-a durante 18 horas até que o equilíbrio seja alcançado. A partir deste processo de centrifugação obtêm-se 2 frações sólidas descartáveis no eixo do rotor, uma delas contendo ácidos gordos saturados e a outra ácidos gordos monoinsaturados e PhA.
De modo a analisar a fase líquida, é obtida uma amostra utilizando uma pipeta. A amostra é submetida a uma análise de GC-MS e subsequentemente são verificadas as concentrações de PhA e DHA, que resultam em <90 pg/mg e 740 mg/g, respetivamente.
Neste caso particular, as frações não são separadas, mesmo que fosse possível obter um produto com uma concentração de PhA inferior a 90 pg/mg e uma concentração de DHA de 740 mg/g, respetivamente. 4. Separação por cristalização dos ácidos gordos ómega-3.
Seguidamente, procede-se ao arrefecimento direto ou brusco do cilindro a uma temperatura de -30 °C durante 24 horas contendo as 3 frações obtidas durante a fase anterior. A esta temperatura são produzidas duas fases: uma sólida e uma liquida. A fração sólida contém os ácidos gordos saturados e monoinsaturados, PhA, ácido pristânico e o gradiente de glicerol, enquanto a fase liquida contem a mistura de ácidos gordos polinsaturados ricos em DHA. A fração liquida, que é a mais afastada do raio do eixo do cilindro, separa-se da fração sólida através da abertura na base do cilindro.
Esta fração liquida contém ácidos gordos ómega-3 ricos em DHA com um teor baixo ou nulo de PhA. Os 281 g de ácidos gordos ricos em DHA obtidos são analisados por GC-MS. A análise indica que o teor de ómega-3 antes e depois da refrigeração a -30 °C é de 96,7 % e 97,2 % respetivamente, e os níveis de PhA estão abaixo de 90 pg/g antes da refrigeração e abaixo de 5 pg/g depois da refrigeração. 5. Esterificação de ácidos gordos livres no óleo em triglicéridos.
Para a esterificação dos ácidos gordos livres obtidos durante a etapa 4 foi utilizado o método descrito no documento de patente US20080114181. Utilizando um condensador de Soxhlet, a resina de estireno é misturada a 5 % com os ácidos gordos livres (200 g) e glicerol (50 g) , introduzindo um termoagitador mecânico na mistura a 185 rpm, 40 °C e 20 minutos. A seguir, foram adicionados à mistura 80 ml de etanol e aumentou-se a temperatura para 60 °C e a agitação para 235 rpm. A reação é mantida durante 24 horas à pressão atmosférica, sob uma atmosfera inerte (azoto). A mistura é depois arrefecida até à temperatura ambiente e a resina ou catalisador é recuperado por filtração do óleo. 0 etanol é eliminado, obtendo-se uma mistura de triglicéridos. É tomada uma amostra do produto final para ser analisada por GC-MS conforme descrito e os resultados obtidos são aqueles mostrados sob o exemplo 1 abaixo (incluindo ácidos gordos livres).
No exemplo 3, a análise de GC-MS do óleo é determinada de modo a determinar a composição dos triglicéridos, glicéridos parciais e ácidos gordos livres obtidos. A partir do procedimento realizado durante as 5 fases obteve-se um óleo completamente desodorizado contendo triglicérido de DHA a uma concentração > 700 mg/g e PhA < 5pg/g e um total de 870 mg/g de ómega-3 (>95 %) .
Exemplo 2: Procedimento continuo de modo a obter DHA >700 mg/g e PhA < 90 pg/g.
Para este exemplo, foi utilizado óleo refinado de peixe vermelho (Sebastes sp.) como uma matéria-prima de partida. (LYSI) com um teor de ómega-3 de 315 mg/g, dos quais 110 mg/g são DHA e 165 mg/g EPA e 1,9 g/kg PhA. 1. Saponificação e 2. Acidificação
Procedeu-se à saponificação e acidificação de 1000 g de peixe vermelho seguindo as mesmas proporções e procedimento utilizado durante o exemplo 1. A partir do óleo acidificado podem ser feitas duas coisas. O óleo purificado é dividido em duas porções idênticas para a separação de PhA e purificação dos ácidos gordos ómega-3, utilizando uma porção para a seguinte etapa: a) Ultracentrifugação isopicnica e cristalização 1. Centrifugação isopicnica
Centrifugaram-se 500 g de óleo acidificado a 150 rpm durante 20 minutos formando uma fase sólida ou estearina (274 g), submetendo a vácuo o sobrenadante liquido contendo os ácidos gordos livres para serem utilizados posteriormente num gradiente de glicerol como indicado no Exemplo 1. Tal como no exemplo anterior, uma vez atingido o equilíbrio, obtêm-se duas fases sólidas contendo ácidos gordos saturados, monoinsaturados e PhA e uma terceira fase líquida contendo ácidos gordos polinsaturados ricos em DHA. 2. Separação por cristalização dos ácidos gordos ómega-3. Procedeu-se ao arrefecimento do cilindro contendo as três fases descritas previamente a uma temperatura de -30 °C durante 24 horas de modo a solidificar o gradiente e, portanto, obter uma fração sólida contendo ácidos gordos saturados, insaturados e PhA e uma líquida contendo ácidos gordos ómega-3. A fração líquida é separada através da abertura na base do cilindro, obtendo-se 156 g de óleo acidificado.
De acordo com as especificações do óleo bruto de peixe vermelho de partida, pode-se estimar que a fração sólida descartada contém ácidos gordos saturados (68 %), ácidos gordos monoinsaturados (31 %) e 2,2 g de PhA. Através de GC-MS analisaram-se os 156 g de óleo acidificado rico em ómega-3 obtido que têm uma pureza em ómega-3 de 98,3 % e níveis de PhA < 90 pg/g. 3. Esterificação de ácidos gordos isentos de triglicéridos (igual que no exemplo 1). 0 processo de esterificação utilizado é aquele descrito na fase 5 do primeiro exemplo. Utilizando um condensador de Soxhlet, misturou-se a resina de estireno a 5 % e os ácidos gordos livres (200 g) e glicerol (50 g) introduzindo um termoagitador mecânico na mistura a 185 rpm, 40 °C e 20 minutos. A seguir, foram adicionados à mistura 80 ml de etanol e aumentou-se a temperatura para 60 °C e a agitação para 235 rpm. A reação é mantida durante 24 horas à pressão atmosférica, sob uma atmosfera inerte (azoto). A mistura é depois arrefecida até à temperatura ambiente e a resina ou catalisador é recuperado por filtração do óleo. O etanol é eliminado, obtendo-se uma mistura de triglicéridos. A partir da amostra obtida para a sua análise por GC-MS determinou-se que o óleo obtido contém menos de 0,4 % de ácidos gordos livres com uma concentração de DHA de 470 mg/g e PhA < 90 pg/g. b) Centrifugação não picnica (em gradiente de densidade sem equilíbrio). 2. Ultracentrifugação A partir do óleo restante obtido durante as etapas 1 e 2 do processo (a) do exemplo, são centrifugados 491 g de óleo acidificado a 150 rpm durante 20 minutos formando uma fase sólida ou estearina (267 g) e uma fase líquida, contendo os ácidos gordos livres, que é submetida a vácuo. Esta fase líquida é adicionada a um gradiente de glicerol, preparado como especificado na etapa 3 do exemplo 1 e é centrifugada a 100000 g x durante 24 horas sem alcançar o equilíbrio. 3. Separação por cristalização dos ácidos gordos ómega-3. Procede-se ao arrefecimento direto do óleo contido no cilindro da centrífuga a -30 °C durante 24 horas. Como resultado, é gerada uma fase sólida, 85 g, que contém os ácidos gordos saturados, monoinsaturados e o PhA e uma fase líquida, 145 g que contêm os ácidos gordos ómega-3. A fração líquida é separada através da abertura na base do cilindro.
Como resultado deste procedimento e através de uma análise de GC-MS da fase líquida, determinou-se que o produto obtido contém uma pureza de ómega-3 de 92,4 % e níveis de PhA < 90 pg/g. 4. Esterificação de ácidos gordos livres de triglicéridos.
Para esterificar os ácidos gordos livres obtidos na etapa anterior, tal como no Exemplo 1, é utilizado o método descrito no documento de patente US 20080114181. Utilizando um condensador de
Soxhlet, misturou-se a resina de estireno a 5 % e os ácidos gordos livres (200 g) e glicerol (50 g) introduzindo um termoagitador mecânico na mistura a 185 rpm, 40 °C e 20 minutos. A seguir, foram adicionados à mistura 80 ml de etanol e aumentou-se a temperatura para 60 °C e a agitação para 235 rpm. A reação é mantida durante 24 horas à pressão atmosférica. O procedimento ocorre sob atmosfera inerte (azoto). A mistura é depois arrefecida até à temperatura ambiente e a resina ou catalisador é recuperado por filtração do óleo. 0 etanol é eliminado por aquecimento do óleo a 90 °C. A partir da amostra obtida para a sua análise por GC-MS, determinou-se que o óleo obtido contém menos de 0,6% de ácidos gordos livres com uma concentração de DHA de 440 mg/g e PhA < 90 pg/g.
Neste Exemplo 2, uma vez que o produto de partida continha uma quantidade inferior de DHA, o produto final também contém uma quantidade inferior de DHA. Ainda assim, pode-se concluir que, a partir deste procedimento, foi possível obter 4 vezes a quantidade de DHA (desde 110 mg/g até 440 mg/g) e reduzir a de PhA em 200 vezes. Depois de repetir o processo utilizando o produto obtido como produto de partida, é obtida uma composição com 740 mg/g de DHA e menos de 90 pg/g de PhA.
Exemplo 3: Análise do produto
De modo a determinar as quantidades totais de ácidos gordos, foram realizadas as seguintes análises: i) Análise dos ácidos gordos por cromatografia gasosa espectrofotometria de massa (GS-MS): ii)
Reagentes: etanol a 96 %, éter de petróleo, hexano, metanol, KOH a 0,8 mol/1 (Sigma-Aldrich).
Instrumento: Agilent HP 6890 Series GC SYSTEM - 5793 Detetor seletor de massas; HP Analytical CD-ROM MS Chemstation Libraries Versão A.00.00.
Procedimento: 50 mg de ácidos gordos dentro de um tubo de ensaio de 10 ml foram misturados e agitados numa mistura de éter e hexano (2:1), 5 ml de etano e 1 ml de KOH a 0,8 mol/1. Foi adicionada água e centrifugou-se a 3000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e a análise por GC/MS levada a cabo. GC/MS: Coluna cromatográf ica HP-1,17 m x 200 μπι x 0,11 μπι. Temperatura do injetor: 280 °C; Temperatura de interfase: 290 °C; velocidade: 5 °C/min desde 100 °C até 260 °C; coluna de hélio com fluxo de 0,9 ml/min; amostra do injetor: 1 ml; temperatura da fonte de ionização: 230 °C; temperatura do elétrodo 150 °C. iii) Análise do PhA por cromatografia gasosa (GC): EXTRAÇÃO: Num tubo com rosca adiciona-se 1 ml de amostra, 9,5 ml de clorofórmio/metanol (2:1) e 2 ml de KC1, agita-se num vórtice e centrifuga-se durante 20 minutos a 3000 rpm. Separa-se e descarta-se a camada superior (aquosa), filtra-se com papel de filtro sobre sulfato de sódio. Recupera-se o filtrado (fase orgânica) num tubo com uma rosca superior e evapora-se. DERIVATIZAÇÃO: Adiciona-se ao extrato seco 1 ml de trifluoreto de boro em metanol, aquece-se a 100 °C durante 30 minutos e arrefecem-se os tubos. Adicionam-se 3 ml de água e 3 ml de n-hexano, agita-se e deixa-se a repousar. Separa-se e mantém-se a camada superior, adicionam-se à camada superior 3 ml de n-hexano e agita-se. Recolhem-se as fases orgânicas, filtra-se com papel de filtro sobre sulfato de sódio, evapora-se até à secura e dilui-se a amostra com n-hexano, injetam-se 2 ml. INSTRUMENTOS: Cromatógrafo gasoso 6890N da Agilent Technologies com ionização de chama (FID) . Coluna: TRB-WAX 30 m 0,25 mm 0,5 mcm. Padrão: Éster metilico de ácido fitânico (Sigma). Reagente derivatizante: Trifluoreto de boro a 20 % em metanol (Merck). Programa de cromatografia: Temperatura do forno: 205 °C.
Temperatura do injetor: 250 °C. Temperatura do detetor: 260 °C. iii) Análise do produto obtido como resultado do procedimento descrito no exemplo 1. O produto obtido no Exemplo 1 foi analisado por GC-MS quanto aos ácidos gordos e PhA. A % total de ácidos gordos ómega-3 obtidos a partir da análise é a soma de DHA+EPA+SDA+DPA. A composição compreende outros ácidos gordos ómega-3 em frações muito baixas ou não detetáveis devido à técnica, que não são tomados em conta nem na farmacopeia nem na análise (ou seja, C28:8,n3).
Assim, as proporções da composição obtida são: » Ácidos gordos: 91,75 %
Dos quais 80, 65 % são DHA, 13,38 % EPA, 5,07 % outros ómega-3, 0,69 % outros polinsaturados, 0,08 % são outros saturados e 0,08 % monoinsaturados. A % de impurezas de PhA e PA é de <0, 000005 % e <0,000002 % respetivamente. • Outros lípidos não saponificáveis 0,1 % • Glicerol (esterifiçado) 8,1 % • Etanol (esterifiçado) 0,11 % • Excipientes: tocoferóis (3,5 ppm- 0,000003 %) • Impurezas pesadas, dioxinas... (<0,000001 %) iv) Análise toxicologies de benzopireno (GC-MS):
Thermo-Finnigan AS 2000 num ID Focusliner de 5 mm (Restek, EUA) e software Xcalibur 1.2 (ThermoFinnigan Corp.). Coluna cromatográfica 30 m x 0,25 mm (ID) x 0,25 mm, Rtx-5 ms (Restek, EUA). Temperatura do injetor: 280 °C; Temperatura de interfase: 285 °C; velocidade: 25 °C/min desde 75 °C até 150 °C; a uma velocidade de 4 °C/min até 265 °C; e finalmente a uma velocidade de 30 °C/min até 285 °C. Coluna de hélio com um fluxo de 40 cm/seg; amostra do injetor: 1 μΐ; temperatura da fonte de ionização: 200 °C. Operou-se num modo seletivo de ionização (ISM) com uma emissão de 250 mA e uma tensão a 70 eV e uma monitorização de iões m/z ± 0,5. Para a quantificação das amostras de óleo utilizaram-se 20, 50, 100, 500 e 1000 ng/ml de benzopireno. Para o controlo interno utilizou-se perileno-dl2 (200 ng/ml). v) Análise toxicologies de PCB e dioxinss fursno (PCDD/Fs). É realizado um imunoensaio para determinar os PCBs e substâncias relacionadas bem como as dioxinas/furanos utilizando um kit de ensaio de PCB1 e DF1 de CAPE technologies. Para isto, é utilizado um método simplificado (Harrison e Carlson, 2000). vi) Análise toxicologies de metsis pessdos: São tomadas 6 amostras de óleo acidificado e pesa-se 1 g de cada uma delas num cadinho de porcelana de peso conhecido. Mineraliza-se o óleo por calcinação num forno de mufla seguido por uma digestão ácida por pressão atmosférica. O método analítico utilizado foi a voltametria de impulso anódico diferencial (DPASV) com redissolução aniónica com elétrodo de goteio de mercúrio, aplicando um varrimento de potência diferencial entre -1150 e 75 mV. Também se utilizou a espectroscopia atómica de geração de hidreto (HGAAS) para o arsénico e vapor frio para o mercúrio. O líquen Evernia prunastri L (IAEA-336) foi o material de referência, seguindo, em todos os momentos, os métodos e critérios sob a normativa vigente (DOCE, 1990) . Utilizou-se o software para estatística SPSS 12-0 para o Windows XP realizando o teste para amostras independentes e ANOVA de um fator. vii) Análise tóxica do produto obtido no exemplo 1
Exemplo 4: Encapsulação do produto final
Para o consumo oral podem elaborar-se cápsulas de gelatina mole (gelatina, glicerol, água) sem descartar outras tecnologias de cápsula mole vegetal para o encapsulamento de óleos. Outra composição possível para as cápsulas consiste em adicionar ao óleo (>95 %) potenciadores do sabor (por exemplo, 5-6,5 % de óleos essenciais de limão) para preencher cápsulas moles mastigáveis (por exemplo, cobertas em "amostras" de gel 1,5 %-2,5 % de limão) . Com uma análise final de: Energia: 14,7 kcal; Proteínas: 0,283 g; Hidratos de carbono: 0,170 g; Gorduras: 1,4 g; DHA: 1 g
Emulsões com água ou outra substância hidrossolúvel também podem ser feitas misturando-as com potenciadores do sabor para serem consumidas como um líquido bebível e para preparar lipossomas. O produto final também pode ser obtido como um pó. São possíveis outras utilizações diferentes do consumo oral, particularmente como injeções intravenosas e intravítreas como emulsões isotónicas. (solução salina). O produto final desta patente é o desenvolvimento de um suplemento e medicamento contendo 100 % de óleo líquido obtido no Exemplo 1 numa cápsula de gelatina mole transparente, de tamanho 24, oblonga (composição: gelatina, glicerol, água) contendo 1389 mg de óleo dos quais 1000 mg são DHA. Também é possível utilizar cápsulas com um revestimento gastro-resistente.
Esta fórmula pode conter cofatores essenciais para o tratamento de Retinose pigmentar, tais como: taurina,
Beta-alanil-L-histidinato de zinco, ácido lipoico, éster-ascorbato, Pigmentos: a) dipamitato de zeaxantina (ES Lycium barbarum), b) delfidinina (ES Vaccinium mirtillus com um baixo teor de cianidina) , miricetina, naringenina, hesperitina e os seus glicósidos, asiaticósido, ginkgoflavonglicósidos A + B; gaiato de epigalocatequina, derivados de vincamina. i) cofatores utilizados
ii) Extratos utilizados
iii) Análise de substâncias ativas relevantes_
iv) Análise de outras substâncias
ativas na composição_
Através de diferentes mecanismos os diferentes glucósidos desta composição (por exemplo, delfidina e miricetina) aumentam a concentração de DHA na retina e fotorrecetores e inibem a apoptose de fotorrecetores causada pela luz (Laabich et al.r 2007) .
Exemplo 5: Experiências para determinar a atividade inibidora de DHA e os seus mecanismos de acordo com PhA, in vivo (administração oral) ou in vitro: A) Experiência A: Apoptose de fotorrecetores induzida por paraquat
Amplificação do sinal de tiramida (TSA)-FISH PerkinElmer, Boston, MA, EUA) ; anticorpos secundários, anticorpos monoclonais para Bax (sc-7480), Bcl-2 (sc-7382), rodopsina RET-P1 (sc-57433) (Santa Cruz Biotechnology, Inc. - EUA), PhA, ácido docosahexanoico, dicloreto de paraquat, (Sigma-Alldrich). Os solventes e reatores tinham grau de HPLC e analítico.
Culturas purificadas de neurónios de ratos Wistar albinos foram preparadas de acordo com Politi et ai., (1966) e tratadas num meio de poliornitina como em Adler-R (1982) . No primeiro dia de cultura, concentrações iguais de DHA (9 mM) foram adicionadas a culturas de neurónios, com 7 concentrações diferentes de PhA (/ 5/ 20/ 100/ 500/ 2500 e 12500 pgPhA/g óleo) , normalmente encontradas em óleos de origem marinha ricos em DHA, e 2 controlos sem DHA, com ou sem Paraquat. No terceiro dia de cultura, foi adicionado paraquat, incubando-se durante 24 h antes de ser fixado durante uma hora com paraformaldeído numa solução salina tamponada com fosfato (NaCl a 0,9 % em NaH2P04 a 0,01 M [pH 7,4], seguido de 15 minutos com Triton X-100 (0, 1 %) . Na apoptose, a expressão de Bax e Bcl-2 foi determinada e quantificada de acordo com o método de Rotstein-NP et ai. (2003) . Para os estudos citoquímicos, 10 campos/amostras foram aleatoriamente quantificados, onde os resultados representam a média de 3 amostras/placa para cada concentração de DHA com PhA. A capacidade anti-apoptótica de DHA sobre os fotorrecetores está inversamente correlacionada com a concentração de PhA (PhA) (Figura 1) . Pode ser obtida uma maior atividade anti-apoptótica através da utilização de DHA em concentrações de 0 e 4 pg/ml de PhA, onde não foram detetadas diferenças significativas. A atividade anti-apoptótica nos óleos com DHA com 0 e 4 pg/g de PhA é notavelmente mais elevada do que em óleos com DHA com concentrações de b 20 pg/g e > 100 pg/g de PhA, respetivamente, onde a atividade anti-apoptótica de DHA é significativamente reduzida. Em concentrações de PhA de 2500 mg/g a atividade de inibição da apoptose dos fotorrecetores é neutralizada, e em concentrações mais elevadas a apoptose de fotorrecetores é induzida apesar da presença de DHA. O índice Bcl-2/Bax, além de estar inversamente correlacionada com a apoptose de fotorreceptores e o stress oxidativo, indica que DHA em concentrações ^ 20pg/g têm significativamente menos stress oxidativo do que concentrações de h 100 pg/g.
B) Experiência B: Apoptose retiniana induzida por MNU
Foram utilizados os mesmos materiais e imunohistoquímica e métodos de quantificação que na Experiência A. Em vez de se utilizar paraquat para a indução da apoptose, foi utilizada N-nitroso-N-metilureia (MNU) (Sigma-Alldrich). Em vez de se analisarem as culturas in vitro, tal como na Experiência A, foram analisadas retinas a partir de ratos Wistar albinos sacrificados. Para esse fim, 8 ratos S-D com 42 dias de idade foram selecionados e alimentados durante 4 semanas com uma dieta basal padrão. Cada animal foi alimentado de uma forma diferente: um rato foi alimentado com uma dieta padrão de controlo, enquanto para os outros 7 ratos esta dieta foi modificada com DHA a 15 %, tendo diferentes concentrações de PhA como na Experiência A: 0/4/20/100/500/2500/12500 pgPhA/g de óleo. Após estas 4 semanas, foram injetados com uma única injeção intraperitoneal de MNU (75 mg/kg de peso corporal) . Todos os ratos se apresentavam na mesma dieta durante 6 dias, sendo sacrificados no 7o dia, depois de terem estado em jejum durante 24 horas, quando foi levada a cabo a extração das retinas, seguindo-se os processos de fixação e imunohistoquimica como na Experiência A. Para os estudos citoquimicos, 10 campos/amostras foram aleatoriamente quantificados, onde os resultados representam a média de 10 olhos/amostra.
Tal como foi revelado pelos resultados in vitro (Figura 1), a capacidade anti-apoptótica de DHA sobre os fotorrecetores está inversamente correlacionada com a concentração de PhA. 0 comportamento da concentração de PhA nos óleos com DHA in vitro é também comparável com aquela observada in vivo (Figura 2) . Uma maior atividade anti-apoptótica é obtida em concentrações entre 0 e 20 pg/g, onde não existem diferenças significativas mas, tal como foi o caso com os níveis in vitro de 20 pg/g de PhA, a razão Bcl-2/Bax é significativamente mais baixa entre os ratos alimentados com < 5 pg/g. Não existe qualquer neutralização do efeito inibidor da apoptose de DHA. Os ratos alimentados com DHA < 5 pg/g não revelam alterações na atividade anti-apoptótica e marcadores Bax e Bcl-2 em relação a DHA sem PhA adicionado.
Estes dois exemplos confirmam tanto in vivo como in vitro, que o DHA livre de PhA é mais eficaz e seguro no tratamento de doenças degenerativas tais como RP, do que muitas das marcas de DHA no mercado com elevados níveis de PhA. Estes exemplos descrevem mecanismos de ação decisivos de DHA em doenças descritas ao longo desta patente e como o PhA interfere neste efeito. Tudo isto está de acordo com as numerosas evidências epidemiológicas e estudos moleculares e pré-clínicos sobre o efeito prejudicial de PhA e o seu efeito antagonista com o DHA. A atividade de DHA livre de PhA em doenças neurodegenerativas, urogenitais, doenças músculo-esqueléticas, doenças cardiovasculares e as aplicações descritas na presente inovação, é maior do que aquela de DHAs comerciais devido ao efeito antagonista de PhA conforme descrito na presente inovação e particularmente na atividade mitocondrial e anti-apoptose observada nestes exemplos.
Exemplo 6. Utilização de uma composição com um elevado teor de DHA e livre de PhA para o estudo clinico de retinose pigmentar.
Pela primeira vez neste estudo, foram encontradas frequências elevadas de várias alterações tais como: alterações auditivas subclínicas, cardiovasculares (arritmias) graves, prostáticas, hipertensão, diabetes e tiroidite em pacientes com RP sem síndromes associadas.
Ao longo das últimas décadas, foi descoberto que o ácido docosahexanoico (DHA) está reduzido nos pacientes com RP, onde o PhA está aumentado em parte deles. Diferentes estudos de intervenção com animais sugerem benefícios do DHA sob níveis controlados de PhA. 0 DHA é essencial para a sobrevivência dos fotorrecetores e para a fototransdução.
De modo a determinar se a ingestão de DHA com PhA < 5 pg/g a uma dose além da nutricional, poderia tratar a RP e que tipo de vantagens clínicas poderia ter, foi levado a cabo um ensaio clínico seguindo um estudo duplo cego, cruzado, aleatório de intervenção. Foram aleatoriamente escolhidos 40 pacientes com RP, com uma idade média de 46 anos (17-70) . Foram levados a cabo os seguintes testes: eletrorretinograma, potenciais visuais evocados (VEP), perimetria automatizada, acuidade visual (VA), audiómetro, exame oftalmológico clínico e padrão, teste sanguíneo de hemóstase e ácidos gordos. Um estudo duplo cego, cruzado, aleatório de intervenção foi levado a cabo com dois grupos (A e B) que foram tratados com uma dose oral de 740 mg/dia (duas vezes a dose nutricional) de DHA bebível e com menos (<0,20 mg de PhA) durante 10 meses, cada um com um controlo dos hábitos de estilo de vida. Após a conclusão desta primeira fase do estudo, ambos os grupos foram cruzados e a mesma intervenção foi repetida novamente numa segunda fase.
Resultados: Antes do início do estudo, 61 % dos pacientes tiveram EVP anormalmente elevado com atrofia macular. 81 % dos olhos tinham um campo visual <10° dos quais 35,5 % tiveram uma VA h 0,5 (20/40). Os pacientes com cegueira legal de acordo com os valores de VA representaram 25,8 %. Um 6,4 % tiveram uma VA < 20/200. A VA média foi de 0,41 ± 0,22. Nos pacientes com RP 48 % têm uma VA ^ 20/40 aumentando para 62,5 % além dos 60 anos com uma VA média de 0,39±0,21. Produziu-se uma redução anual na VA de 0,06. Um subgrupo de pacientes (n=8) mostrou níveis elevados de PhA e teve uma VA^0,2. Este subgrupo representa os únicos pacientes com RP onde o tratamento com DHA não resultou numa melhoria na VA. Nos pacientes restantes (n = 32), que tiveram níveis normais de PhA, o tratamento com DHA resultou num aumento significativo da VA de 0,055 e 0,119 nos grupos A e B. Todas as formas hereditárias de RP autossómica dominante, simples, autossómica recessiva e esporádica tiveram um aumento na VA: 0,104, 0,091, 0,068 e 0, 025 respetivamente. Olhos comVA1^0,2, VA2=02-0,5, VA3h0,5 aumentaram de uma forma proporcional a sua VA em 0,02, 0,08 e 0,13 respetivamente. Em tais pacientes com níveis normais de PhA, também foram observadas alterações no campo visual embora não tenha havido um aumento significativo da sensibilidade foveal e parafoveal (5,3 %, 9,8 % respetivamente) no grupo A; e (6,6 %, 11,3 % respetivamente) no grupo B. Em ambos grupos, os niveis de colesterol HDL1 aumentaram em 30 %.
Os pacientes com RP têm uma incidência elevada de doenças cardiovasculares, diabetes e hipertiroidismo. Não foram encontrados efeitos adversos. A função visual parece estar mais relacionada com a idade do início dos sintomas do que com a idade do paciente bem como com a concentração de PhA. O tipo dominante tem um prognóstico melhor do que o tipo recessivo. O subgrupo com níveis elevados de PhA tem um prognóstico pior e não mostra qualquer melhoria na VA após o tratamento com 740 mg/dia de DHA. No subgrupo com níveis normais de PhA, 76,5 % dos pacientes melhoraram a sua VA independentemente do padrão hereditário. O tratamento não produziu melhorias no campo visual. Este ensaio piloto parece mostrar que o DHA poderia ser útil no tratamento de pelo menos a função da visão central e para determinar em que dose a distrofia retiniana poderia ser evitada na RP, tendo em conta que um subgrupo de pacientes mostrou níveis elevados de PhA.
Exemplo 7. Farmacocinética de DHA e o efeito sobre a função visual periférica e central na RP e tolerabilidade de DHA em 2 doses: 4 g/dia (60 mg/kg) e 8 g/dia (120 mg/kg) frente a placebo como único tratamento de RP.
Um estudo aleatório, duplo cego, controlado por placebo com um grupo paralelo, a 24 meses de tratamento duplo cego.
Pacientes (n = 18) idade média de 42 anos (24-68) da Associação de RP (AARPE). De 21 pacientes admitidos para o protocolo, 18 foram randomizados para o duplo cego; contudo, 3 foram excluídos da análise de intenção de tratar porque não foi realizada qualquer avaliação dupla cega ou os seus centros careciam de pacientes em todos os grupos de tratamento. Todos os 18 pacientes, foram avaliados quanto a efeitos secundários. Destes, 18 pacientes completaram o tratamento. Um controlo dos hábitos e do DHA e PhA da dieta foi levado a cabo. Foram levados a cabo os seguintes testes: eletrorretinograma, potenciais visuais evocados (VEP), perimetria automatizada, análises toxicológicas e imunológicas, hemostase, e subprodutos de oxidação e ácidos gordos. A variável de resultado primária (função visual central) foi a alteração na média da VA que tinha aumentado em 24 meses. Nos grupos de DHA de 4 g (0,05) e 8 g (0.06), os valores de VA foram significativamente maiores do que para o grupo de placebo (-0,04) (P=0,03 e P<0,05, respetivamente); na variável de resultado secundária (função visual periférica), houve uma alteração no campo visual que tinha aumentado 2 % e 5 % nos grupos de DHA 4 g e 8 g frente a uma diminuição de 1,2 % no grupo de placebo (P=0,15 e P=0,23, respetivamente), embora não seja significativa.
Os grupos de DHA mostraram uma melhoria eletrofisiológica (redução na amplitude bem como redução da latência dos VEP). Não estiveram presentes diferenças clinicamente significativas no grupo de DHA. Todos os pacientes tiveram níveis normais de PhA após o tratamento, exceto para 1 paciente em cada grupo de DHA que tinha níveis elevados de PhA. Nenhum dos pacientes teve problemas de tolerabilidade nem quaisquer efeitos adversos foram observados no placebo ou grupo de DHA. Não foram observadas variações de PhA, exceto nos dois pacientes com níveis elevados que ainda tinham uma redução de 52 % e 48 % no grupo de DHA de 4 g e 8 g, respetivamente. O DHA não produziu alterações significativas nos níveis de AA e outros ácidos gordos ómega-6, aumentando significativamente a concentração de EPA nos grupos de DHA. O aumento no DHA nos tecidos alvo é proporcional à dose terapêutica, onde se observou que os níveis de DHA eram de 5,2, 7,3 vezes mais elevados nos fosfolípidos em comparação com os níveis basais. As concentrações plasmáticas máximas foram alcançadas entre 3 h e 6 h depois da administração oral com alimento de um teor normal de gordura.
Portanto, pode-se concluir que a composição de DHA da invenção é eficaz para melhorar a função central visual na distrofia retiniana, embora devido ao tamanho da amostra e duração do ensaio, não podem ser descartados benefícios na função periférica visual dos pacientes com RP. Também pode ser concluído que, o DHA é bem tolerado como uma terapêutica para a RP; a resposta é claramente dependente da dose.
Exemplo 8. Determinação da eficácia e segurança da composição da invenção em diferentes patologias associadas com distrofias hereditárias retinianas.
No estado da técnica, as distrofias retinianas incluem um amplo grupo de doenças entre as quais podem ser encontradas as seguintes: retinose pigmentar autossómica dominante (AD), retinose pigmentar autossómica recessiva (AR), retinose pigmentar simples (SP), retinose pigmentar ligada ao género (XL), doença de Stargardt (ST), coroidemia, Leber etc.
De modo a levar a cabo o seguinte estudo, foram selecionados 171 pacientes, 76 homens e 85 mulheres, com uma idade média de 45 anos (8-72) a partir do arquivo de pacientes com RP (AARPE) . Os indivíduos foram separados em grupos. 0 primeiro grupo de 97 indivíduos, 41 do sexo masculino e 56 do sexo feminino (14 AD, 26 AR, 44 SP, 1 XL, 7 ST, 1 Refsum, 1 Kearns, 3 Usher) , foram tratados com 4 g/dia da composição da invenção. 0 segundo grupo de 74 indivíduos, 35 do sexo masculino e 39 do sexo feminino (9 AD, 24 AR, 34 SP, 4 ST, 1 Leber, 1 Usher, 1 XL), não receberam qualquer tratamento. Os parâmetros considerados como determinando a eficácia da composição da presente invenção na avaliação da doença, foram a acuidade visual (VA) e o campo visual (VF). Tais parâmetros foram medidos ao longo de 8 anos de duração do estudo, uma vez por ano.
Diferenças específicas foram obtidas na VA e VF para pacientes tratados sob o grupo 1, enquanto os parâmetros do grupo de indivíduos não tratados permaneceram não alterados ou pioraram, tal como se corresponde com a progressão normal da doença. No grupo tratado, houve uma diferença na acuidade visual depois de dois anos, enquanto o campo visual não mostrou diferenças significativas até 6 anos. A ingestão de 4 g/dia de DHA melhora os parâmetros visuais em pacientes com RP e doença de Stargard.
Exemplo 8.1 Corolderemia ligada a X 3 irmãos de 9, 13 e 16 anos de idade com coroideremia ligada a X; mostraram alterações no ERG, cegueira noturna, sem alterações na VA e o mais velho exibiu alterações no campo visual mas com um VF >60 °. Eles iniciaram o tratamento com 2 g/dia de DHA livre de PhA.
Após 6 meses de tratamento, não tinham normalizado os níveis de DHA nos fosfolípidos dos eritrócitos, nem existiam variações no ERG. A dose foi depois aumentada para 4 g/dia durante 6 meses, notando-se um aumento nos níveis de DHA dos fosfolípidos e alterações fotópicas no ERG e uma melhoria do VF no paciente de 16 anos de idade.
Exemplo 8.2 Doença de Stargardt 6 pacientes com doenças de Stargardt com idades entre 21 e 42 anos participaram num estudo cruzado (estudo 3 de RP) previamente descrito. Durante 8 anos, 4 deles não tomaram qualquer tratamento com o produto da presente invenção (DHA), um deles tomou-o durante 8 anos e outro tomou DHA com o cofator descrito na formulação, de forma irregular durante 3 anos. Todos os pacientes que receberam o tratamento, tiveram uma perda progressiva do VA seguindo a progressão natural da doença, mantendo uma VA ^ 20/200 em ambos os olhos (AO). Os pacientes que tomaram DHA durante 8 anos conservaram a VA 2/10 AO durante tal período sem quaisquer variações. O paciente que tomou o tratamento com DHA e a formulação durante 6 meses, melhorou a VA desde 1/10 AO até 3/10 AO. Contudo, após a interrupção do tratamento, a VA piorou, com uma VA de 1/10 dois anos depois de receber o tratamento. O paciente, tomou novamente o tratamento até à atualidade (2,5 anos) aumentando a VA para 2/10.
Exemplo 8.3 Retinosquise hereditária
Dois irmãos de 11 e 13 anos foram diagnosticados com retinosquise mostrando, ao mesmo tempo do diagnóstico, uma VA de 4/10 AO e 6/10 AO, respetivamente. Começaram a tomar voluntariamente 3 g/DHA desta invenção durante 31 meses, conservando uma VA de 5/10 e 8/10 pelo final do tratamento.
Exemplo 9. Utilização da composição da invenção para o tratamento de distrofias retinianas não associadas a distúrbios genéticos. O DHA aumenta a resistência neuronal sob condições isquémicas, reduzindo a atrofia ótica nas neuropatias e distrofia retiniana nas vasculopatias . Além dos efeitos anti-apoptóticos do DHA, ele tem um efeito inibitório sobre as prostaglandinas F2. Os fármacos para o glaucoma e para controlar a pressão intraocular (IOP) são análogas ao DHA, atuando como antagonistas dos recetores de prostanoides vasoconstritores (PGF2). Portanto, o tratamento foi provado em pacientes com retinopatia isquémica proliferativa, neoprostano, uropatia isquémica ótica e desmielinizante, microangiopatia diabética, degeneração macular relacionada com a idade ambas húmida e seca, glaucoma e miopia magna. A descrição de cada caso é longa. Alguns têm de ser tipificados, mas em todos os casos houve uma melhoria da função visual (medida de acordo com VA e VF) e da maculopatia em exames do fundo ocular, tomografia de coerência ótica (OCT) e angiografia. Particularmente, neste grupo de pacientes, a combinação de DHA com a fórmula previamente descrita, torna-se mais necessária devido às alterações reológicas graves da retina e da biodisponibilidade reduzida do DHA na mesma. Além disso, a patologia vascular é a causa principal.
Exemplo 9.1 Edema macular secundário a distrofias retinianas (por exemplo, RP) ou de origem isquémica: Edema macular cistoide (sindrome de Irvine-Gass). Escotoma de Berlin. 6 pacientes com idades compreendidas entre 33 e 75 anos foram diagnosticados pelo menos 12 meses antes de edema macular cistoide e sindrome de Irvine-Gass (CMO) e foram tratados ao longo de 12 meses com corticoides sistémicos, triamcinolona e inibidores da anidrase carbónica (por exemplo, acetazolamida). Nenhum deles sofria de uma distrofia retiniana conhecida. Estes pacientes, pelo menos 24 meses antes do edema macular cistoide tiveram uma VA > 8/10. Antes de receber o tratamento com 4 g/dia de DHA desta invenção, associados com a formulação descrita na invenção, a VA era de 1/10 e 3/10. A duração do tratamento foi de 3 e 12 meses.
Após 3 meses de tratamento, todos os pacientes aumentaram a sua VA. No final do tratamento, todos os pacientes normalizaram a sua VA, alcançando uma VA entre 9/10 e 10/10, que num caso foi mais elevada que a VA anterior ao inicio do edema macular cistoide que ocorreu depois de cirurgia de cataratas. 3 pacientes diagnosticados com RP sofreram de CMO. Foram tratados previamente com o mesmo programa de tratamento como anteriormente descrito. A VA antes do tratamento foi de 1/10, 1/10 e 1,5/10. Depois de 6 meses os três casos aumentaram a VA para 3/10, 6/10 e 7/10. A VA antes de padecer de CMO foi 3/10, 5/10, 7/10. Exemplo 9.2. Pars planite hemorrágica
Uma menina de 8 anos de idade com 32 kg de peso foi diagnosticada com pars planite hemorrágica. Três meses depois do diagnóstico sem quaisquer alterações positivas na progressão clinica, decidiu-se realizar uma intervenção cirúrgica. 10 dias antes da intervenção ela recebe tratamento com 3 g/dia de DHA desta invenção até 24 horas antes da cirurgia (9 dias). No estudo anterior à cirurgia, a melhoria clinica observada pelo especialista, resultou num atraso da cirurgia em 30 dias. Ela tomou, posteriormente, um tratamento com 3 g/dia de DHA com níveis de PhA inferiores a 5 ug/g durante 30 dias, observando-se uma remissão e normalização completa da função visual.
Exemplo 10. Efeito supra-fisiológico da composição da invenção sobre a função visual de pacientes saudáveis.
Em indivíduos saudáveis, o DHA aumenta a fototransdução e a regeneração de rodopsina. 32 indivíduos saudáveis sem distrofia retiniana entre 18 e 45 anos de idade, sem alterações emetrópicas ou hipermetrópicas, receberam tratamento com 4 g/dia de DHA livre de PhA durante 6 semanas e as VA foram estudadas antes e depois do tratamento.
Todos os indivíduos mostraram uma VA no início do tratamento de 10/10. Depois de 6 meses todos obtiveram uma VA superior à unidade (20/16) . Em dois casos houve um estigmatismo de 0, 0 em ambos os olhos. Em 9 indivíduos, a VA excedeu 20/12. Todos aumentaram a sua adaptação noturna (adaptometria).
Também foi detetado um aumento na VA em indivíduos saudáveis com miopia sem alterar a graduação ótica. Em indivíduos jovens com uma miopia em desenvolvimento e em indivíduos com miopia magna, houve uma paragem da miopia depois de um seguimento de 10 anos.
Exemplo 11. Utilização da composição da invenção para o tratamento de condição alérgica, transtornos da superfície ocular e/ou olho seco. 0 efeito do DHA na superfície ocular fornece um efeito mecânico protetor e nutricional, proteção química e um efeito antisséptico. 0 DHA exerce um controlo neurológico, hormonal, imunológico e anti-inf lamatório (prostaglandinas) . 0 DHA desempenha um papel ativo na organização da película lipídica lacrimal, reduzindo a evaporação da fase muco-aquosa, reduzindo a tensão superficial da interfase e como antibacteriano. Inibe a apoptose e controla a secreção das células de Goblet. Normaliza a secreção lipídica e viscosidade das glândulas de Meibom. 0 DHA atua sobre todos os tipos de doenças do olho seco: alergias, hormonais (androgénicas), infeções e metabólicas-dietéticas na composição dos ácidos gordos. 0 DHA inibe a formação de dihidroxitestosterona nas glândulas lacrimais, aumentando ao mesmo tempo os níveis de androgénios. Isto impede a apoptose, necrose e inflamação das glândulas lacrimais. 0 DHA exerce um controlo eficiente na inflamação crónica, alergia e edema da córnea, uma vez que inibe a síntese de leucotrienos (76 %), reduz o PAF plaquetário, prostaglandina E2 (40 %) , reduz a prostaglandina F2 (81 %), e controla o TNF, interleucinas IL-6 e IL-1 b. 50 pacientes entre 20 e 43 anos de idade sem distrofia retiniana e miopia < 9 dioptrias, foram administrados com uma dose de 4 g/dia de DHA como um tratamento pré-Lasik um mês antes de serem submetidos a cirurgia de miopia. Foi levada a cabo uma paquimetria e antes da cirurgia foi observado um aumento médio de 12,4 %. Nalguns casos, a paquimetria antes do tratamento e depois da cirurgia foi semelhante ou ligeiramente mais elevada.
Exemplo 12. Tratamento com a composição da invenção como um coadjuvante em neurologia e psiquiatria.
Além da patologia genética com distúrbios neurológicos previamente descrita, o DHA é deficiente em doenças com distúrbios alimentares, tendo um papel determinante tanto na sua evolução clínica como na remissão como na anorexia e bulimia, bem como em distúrbios esquizotípicos mentais, transtornos da personalidade, transtornos de atenção primários. Através de numerosos estudos observacionais e de intervenção, foi observado que o DHA diminui a depressão, agressividade, défice de atenção primário, aumenta a memória, melhora as capacidades de aprendizagem e reduz o risco de padecer de Alzheimer. 0 DHA acumula-se no cérebro e no tecido nervoso, e o córtex cerebral é a área do organismo onde é mais conservado. 0 seu papel no aumento das sinapses, na inibição da apoptose em condições isquémicas foi extensivamente estudado.
Um total de 30 casos individuais foram estudados para o tratamento da espasticidade com 4 g/dia, 8 g/dia, 15 g/dia de DHA sem DHA na esclerose múltipla e distúrbios da medula espinal: isquemia espinal, tumor espinal, mielite transversa, espondilose cervical, paralisia cerebral ou mielopatia degenerativa.
Em todos os casos estudados, foi obtida uma redução significativa com remissões da espasticidade, rigidez muscular, melhoria da motilidade e redução da dor devido à espasticidade. Todos os pacientes tiveram um historial longo, seguimento clinico e estavam a ser tratados farmacologicamente (por exemplo, baclofeno, interferão, etc.) durante um período de não menos de 2 anos, exibindo no início do tratamento uma má situação clínica na espasticidade e mobilidade. Os resultados mostram que o tratamento é dependente da dose, isto é, aqueles pacientes que receberam doses mais elevadas (15 g/dia) tiveram uma resposta clínica mais rápida (antes de 7 dias) , mobilidade aumentada e remissão da espasticidade de uma forma mais rápida e eficiente do que os pacientes tratados com doses mais baixas (4 g/dia). As três doses estudadas resultaram em melhorias da espasticidade.
Exemplo 13. Tratamento com a composição da invenção como um coadjuvante na terapêutica oncológica: 0 apoio oferecido pelo DHA livre de ácido fitânico como um coadjuvante na oncologia é muito significativo, considerando que o PhA é um fator de risco tumoral em tumores com a prevalência mais elevada. 0 PhA aumenta a atividade tumoral, exibe interações farmacológicas e possivelmente uma maior mortalidade cardiovascular. Atualmente, o DHA já é incluído como um tratamento antitumoral (por exemplo, no cancro da próstata com paclitaxel) devido aos numerosos benefícios que aporta, como a inibição da angiogénese, indução da apoptose em numerosas linhas tumorais, redução de relapsos em linhas tumorais, etc. 0 DHA sem PhA é um cofator na oncologia uma vez que: a) Inibe a angiogénese de uma forma muito eficiente, através de diferentes mecanismos: controlo do metabolismo de prostaglandinas em tumores e potente inibidor do VEGF, redução da intensidade das dores, melhoria do efeito anti-inflamatório de anti-inflamatórios e analgésicos, permitindo doses mais baixas e reduzindo os seus efeitos secundários. b) Induz a apoptose em várias células tumorais, aumentando a citotoxicidade de outros tratamentos citostáticos, antitumorais em doses mais baixas. Reduz a citotoxicidade do tratamento antitumoral, aumentando a sua eficácia e permitindo ciclos de tratamento mais prolongados. c) Embora induza a apoptose nas linhas tumorais de adenocarcinoma do pulmão, próstata, colorrectal, etc. também melhora a função dos tecidos saudáveis nos pulmões, coração, próstata, etc., melhorando significativamente a qualidade de vida dos pacientes. d) 0 DHA livre de PhA reduz diretamente a cardiotoxicidade, neurotoxicidade e hepatotoxicidade. Também tem sido relacionado com uma toxicidade hematopoiética ou medular inferior. e) 0 DHA reduz recaídas das linhas tumorais mais prevalentes (cancro colorrectal, próstata, mama, pulmão, ovário, gástrico, esofágico, etc.) 0 DHA sem PhA usado com retinoides, são coadjuvantes no tratamento de adenocarcinoma de pulmão, particularmente porque a ausência de PHA não induz toxicidade adicional aos retinoides. Os retinoides e DHA têm uma atividade sinérgica em certos cancros do pulmão, cancros mieloproliferativos e colorretais entre outros. 0 DHA tem sido estabelecido como um quimiopreventivo no pulmão (Serini et ai., 2008), cancro do cólon, etc. Em particular, as estatinas são também um agente quimiopreventivo e a presente invenção também utiliza a sua associação. Particularmente porque o PhA induz interações com as estatinas. O DHA e as estatinas têm um efeito potencial como um tratamento quimiopreventivo em tumores principais e numerosos com um grande valor epidemiológico. O seu valor epidemiológico, ainda a ser avaliado, leva a pensar que, atualmente, são agentes importantes na redução do número de casos, de gravidade e prognóstico, redução de metástases, aumento das possibilidades terapêuticas e atraso na evolução e na prevenção de recidivas.
Particularmente o DHA, uma vez que não induz efeitos secundários ou um risco acrescido para a população, tem outros efeitos preventivos importantes de grande valor epidemiológico com a idade (doenças que resultam em cegueira e demência) e, particularmente, uma vez que é o único nutriente que é deficiente na população em geral.
Como um exemplo ilustrativo, mas não limitativo, é feita uma descrição de um caso de um paciente com adenocarcinoma do pulmão com mais de 20 metástases no pulmão inferiores a 1 cm, bem como nos ossos e no fígado. Os 2 anos de historial de tratamento antitumoral antes de tomar um tratamento de DHA livre de PHA mostrou uma pioria com um aumento do número de metástases. Depois da falha dos 3 primeiros ciclos de quimioterapia de resgate, 12 g/ dia de DHA sem PHA foram introduzidos no 4o ciclo de quimioterapia de resgate. No seguinte controlo, às 6 semanas, através de uma TAC abdominal-pélvica, informa-se de que há uma remissão das lesões. Os 7 ciclos do protocolo de resgate são terminados utilizando como um coadjuvante o composto da presente invenção. Em controlos dos últimos 3 anos, a atividade tumoral do paciente continua em remissão. A utilização de DHA livre de PhA como um coadjuvante da terapêutica oncológica, melhora as condições clínicas dos pacientes durante um período mais longo e aumenta as estatísticas da esperança de vida.
Exemplo 14. Utilização da composição da invenção em nefrologia e urologia O tratamento com DHA da nefropatia associada a IgA e da nefropatia associada ao lúpus eritematoso foi descrito há mais de uma década atrás. O DHA inibe a apoptose do nefrónio, reduz lesões isquémicas renais e é uma poderosa substância anti-inflamatória renal em doenças inflamatórias renais (nefrite, glomerulonefrite). O DHA é um coadjuvante ideal para o tratamento de supressão imunológica multifarmacológico no transplante renal. As células dendríticas, em caso de tolerância ou rejeição, estão encarregadas de apresentar os antigénios e são "aquelas que decidem se há rejeição ou tolerância". A modulação das células dendríticas pelo DHA é bem conhecida na prevenção de rejeições, Alzheimer, doenças autoimunes, etc. 0 DHA sem PhA reduz particularmente o risco de infeções de urina. Como resultado da sua função de controlo sobre as prostaglandinas, efeito inibidor sobre a síntese de DHT e em particular, porque é isento de PHA, que é o fator de risco mais elevado para o cancro da próstata, hipertrofia benigna da próstata e alterações da função da próstata, é particularmente eficiente no tratamento e na prevenção de hipertrofia benigna da próstata e na prevenção da disfunção eréctil. A seguir apresenta-se uma descrição de 5 casos nos quais a eficácia de DHA livre de PhA contra diferentes nefropatias é demonstrada.
Exemplo 14.1 Sindrome nefrótica.
Um menino de 12 anos, com diagnóstico de sindrome nefrótica aos 5 anos, controlada com corticoides (15 mg/cada dois dias). Em várias tentativas para cessar o tratamento, a sindrome nefrótica apareceu com níveis graves de proteínas na urina antes de 3 semanas. 0 tratamento foi suspenso e 4 g/dia de DHA livre de PhA foram introduzidos e um seguimento clínico foi realizado. Após 3 meses de tratamento, não haviam sinais de proteínas na urina. Após suspensão do tratamento durante 3 semanas, os sintomas da sindrome nefrótica apareceram e foi assim decidido implementar a composição da presente invenção durante 2 anos adicionais a uma dose de 4 g/dia, mantendo-se durante esse período, sem sinais de atividade nefrótica.
Exemplo 14.2 Insuficiência renal associada a hipertensão maligna.
Paciente do sexo masculino de 38 anos de idade, consumidor regular de cocaína sofre de um episódio de hipertensão maligna. A pressão arterial é controlada e a utilização de medicamentos narcóticos é eliminada. 0 paciente sofre de uma atrofia ótica no olho esquerdo e neurite ótica no olho direito, com uma acuidade visual de 4/10 e insuficiência renal, com um valor de creatinina de 6,9 mg/dl. Após 6 meses de seguimento, nos quais há um aumento na creatinina de 4,5 mg/dl a 6,9 mg/dl, decide-se começar com a diálise. Antes de iniciar a diálise, o tratamento com 8 g/dia de DHA livre de PHA é introduzido. Duas semanas após o início do tratamento, o valor de creatinina foi reduzido para 4,8 mg/dl e é decidido adiar a diálise. Depois de 6 meses com o mesmo regime de DHA livre de PHA os níveis de creatinina eram de 1,8 mg/dl e a acuidade visual do olho direito de 10/10.
Exemplo 14.3 Insuficiência renal crónica associada a nefrite lúpica.
Mulher de 24 anos com uma história de nefrite lúpica desde que tinha 9 anos e com tratamento corticoide permanente e 6 tratamentos completos de cerca de 6 meses com miofenolato e ciclofosfamida ao longo de 18 anos. O tratamento com 8 g/dia de DHA livre de PhA é iniciado quando o valor de creatinina era de 4,6 mg/dl. Após 30 dias, o valor de creatinina foi reduzido a 3,1 mg/dl. No primeiro ano de acompanhamento, os níveis de creatinina foram reduzidos a 1,3 mg/dl. O tratamento é então tomado durante os dois anos seguintes e os valores de creatinina permanecem estáveis. O tratamento é suspenso e 90 dias depois é observada uma creatinina de 3,4 mg/dl, por isso, é decidido restaurar o tratamento com 8 mg/dia de DHA livre de PhA permanentemente associado a 1 mg de prednisolona.
Exemplo 14.4: Transplante renal em paciente com nefrite lúpica.
Paciente do sexo feminino de 33 anos de idade que teve um transplante de rim 6 anos antes, sob um tratamento estável com um valor de creatinina de 1,8 mg/dl na sequência de um tratamento de manutenção com Micofenolato (1 g/dia) e Prograf (7 mg/dia), sofre uma rejeição diagnosticada através de uma biópsia renal e com um aumento da creatinina para 2,9 mg/dl. O tratamento com o Prograf é aumentado e tratamento de corticoterapia é introduzido durante seis meses, sem resultados na biópsia e com um valor médio de creatinina de 2,4 mg/dl. O tratamento com 12 g/dia de DHA livre de PhA é introduzido, verificando-se depois de 7 dias, uma redução da creatinina para 1,7 mg/dl e reduzindo-se os níveis de creatinina a um mínimo de 0,9 mg/dl e uma média de 1,1 mg/dl durante um ano. Uma biópsia renal é realizada sendo negativa quanto à rejeição e um tratamento de manutenção é introduzido com Prograf (7 mg/dia), Micofenolato (500 mg/dia) e 4 g/dia de DHA livre de PhA. No seguimento dos próximos 4 anos, as taxas de creatinina permaneceram num valor médio de 1,17 mg/dl sem evidência de alterações da função renal.
Exemplo 14.5: Transplante renal não associado a uma doença sistémica.
Paciente do sexo feminino de 70 anos idade, que foi submetido a um transplante renal aos 62 anos. Dois anos após o transplante, sofre de dois episódios de rejeição com valores de creatinina entre 2,1 e 2,5 mg/dl. É tratado com corticoterapia. Durante os 4 anos seguintes, o valor de creatinina estabiliza em 1,3 mg/dl. No 6o ano desde o transplante, começa a tomar DHA livre de PhA a uma dose de 4 g/dia, apresentando durante esse período valores de creatinina compreendidos entre 1,1 e 1,2 mg/dl. Após dois anos de tratamento com este medicamento regularmente, observou-se nos 6 meses subsequentes, uma redução nos níveis de creatinina entre 0,97 e 1 mg/dl. A equipa médica determina que o paciente não apresenta sintomas de qualquer rejeição frente ao órgão transplantado.
Exemplo 15. Utilização da composição de DHA livre de PHA em doenças autoimunes, doenças inflamatórias crónicas e doenças ósseas esqueléticas. 0 papel do DHA em inflamações crónicas é amplamente conhecido e foi brevemente descrito ao longo das diferentes secções das aplicações. Mas o papel mais destacado nestes problemas é a regulação das células dendríticas. Neste sentido, o produto da presente invenção é um coadjuvante que reduz a dose e tempo de utilização de imunossupressores de uma forma significativa, particularmente estudada nesta invenção para LES, artrite reumatoide, artrite juvenil, artrite psoriática e por gota; e distrofia muscular. É também muito bem conhecida a função do produto da presente invenção na prevenção e no tratamento da artrose e osteoporose.
Num indivíduo do sexo feminino de 26 anos diagnosticado com LES e com uma história de LES e esclerodermia sistémica com 8 anos de seguimento e tratamento com 4 g/dia de DHA a partir desta invenção, os sinais clínicos desapareceram incluindo a presença de anticorpos antinucleares (ANA).
Exemplo 16. Utilização da composição de DHA livre de PhA em Dermatologia: alopecia androgénica, acne rosácea e acne vulgaris, dermatite atópica, ictiose, eritrodermia, escleroderma, lúpus discoide, dermatomiosite, psoriase.
Na alopecia androgénica (masculina e feminina) a atividade da enzima 5-alfa redutase, responsável pela produção da dihidrotestosterona (DHT) a partir da testosterona, está aumentada. Um aumento de DHT resulta na queda do cabelo. 0 DHA é um inibidor da enzima "5-alfa-redutase" tipo 1 e 2, preservando a atividade androgénica (testosterona) . De modo a inibir esta enzima, uma dose minima de 2 g/dia de DHA sem PhA é necessário, com a dose ótima sendo 4 g/dia; mudanças na perda de cabelo e a inflamação do couro cabeludo podem ser vistas no intervalo de 4 semanas desde o tratamento. A fim de evitar a alopecia, a supressão da expressão deve ser continua, sendo possível a utilização de doses de manutenção mais baixas (1-4 g/dia) . Este tratamento tem a vantagem contra outros inibidores (por exemplo, finasterida), que não reduz os níveis de testosterona necessários para a saúde geral e a função da superfície do olho, da próstata, muscular e do tecido neural; sendo também útil para o tratamento da hipertrofia benigna da próstata. 36 indivíduos do sexo masculino entre 18 e 44 anos e 4 indivíduos do sexo feminino com alopecia androgénica tomaram um tratamento de 4 g/dia de DHA sem PhA durante 5 anos. A queda de cabelo foi estabilizada dentro de 4 semanas em 92,4 % e em 95 % às 6 semanas. Nos indivíduos do sexo masculino, a densidade capilar aumentou em 52,8 % e em 75 % nos indivíduos do sexo feminino. Um acompanhamento foi realizado durante 2 anos, durante os quais não haviam sinais de alopecia.
Nos casos de dermatite atópica, psoriase e alopecia areata, ο efeito anti-inflamatório importante de DHA, devido ao seu controlo do ciclo celular e sobre o sistema imunitário (citocinas, células dendríticas, etc.) está por trás do seu efeito preventivo e utilização como coadjuvante nestas condições.
Um dos elementos que contribuem para os problemas de acne é um aumento da produção de DHT a partir da testosterona por meio da enzima 5-alfa-redutase. Portanto, a absorção de DHA, com base no mesmo mecanismo anteriormente explicado para a alopecia, contribui para melhorar o acne. 0 tratamento com DHA livre de PhA, tanto na sua utilização oral como tópica sobre a pele, é muito eficaz no tratamento do acne, devido às suas propriedades antibacterianas e anti-inflamatórias, bem como a sua capacidade para normalizar a secreção de fluido das glândulas sebáceas da pele, que é controlada por androgénios, os principais agentes envolvidos no acne. Portanto, a utilização tópica sobre a pele 200 mg/cm2 durante 20 minutos 2-5 vezes por semana é particularmente eficaz contra o acne cístico.
Um caso de um indivíduo do sexo feminino de 23 anos com uma história de acne cístico complicado e permanente durante 7 anos, resistente a tratamentos com antibióticos e ácido cis-retinoico. Foi tratada com 4 g/dia de DHA livre de PHA e 2 sessões semanais, onde o mesmo óleo, desodorizado e com sabor a limão, foi aplicado diretamente sobre a pele durante 20 minutos, após o que foi removido. Os sinais de remissão foram detetados dentro da primeira semana e depois de 8 semanas havia apenas um acne residual. O tratamento oral foi mantido durante 9 meses até à remissão total do acne e nenhuma nova atividade do acne pode ser detetada durante pelo menos um ano de acompanhamento. O conhecimento do papel de DHA como um tratamento para alterações do sistema imunitário está em crescimento com o tempo. Particularmente, na dermatite atópica foram realizados ensaios clínicos onde os ácidos gordos, tais como o DHA, reduzem a resposta imunológica através de citocinas (IL-5, IL-13, IL-10 e IFN-gama) em resposta a todos os alérgenos, reduzindo a atividade da dermatite atópica. Particularmente, dermatite atópica e alergias aéreas estão associadas a IL-10, onde o DHA é particularmente eficaz na redução de IL-10 e da reação alérgica (Dunstan et al., 2003 e 2005). O DHA da presente invenção exibe uma atividade alérgica inferior, uma vez que é possível obter um DHA livre de PhA a partir de fontes diferentes do peixe (casos de alergia) e de elevada pureza, desodorizado e altamente reduzido em péptidos e derivados.
Em particular, a composição da invenção é indicada para ictiose (por exemplo, ictiose arlequim, vulgar, congénita eritrodermia ictiosiforme), uma vez que o produto está livre de PHA, um indutor de ictiose e pelo efeito anti-infeciosos, inmunomodulador e anti-apoptose de DHA, onde alguns tipos de ictiose também apresentam manifestações na superfície ocular e córnea.
Exemplo 17: Utilização da composição de DHA livre de PhA em Pneumologia e Asma.
Em tecidos alvo, onde o DHA é especialmente concentrado ou em tecidos onde existe uma elevada atividade mitocondrial, o DHA aumenta a atividade funcional de tais tecidos, (por exemplo, fotorrecetores, neurónios, alvéolos pulmonares, células de Purkinje, nefrónios, células dendríticas, miócitos lisos e estriados, hepatócitos, espermatozóides, óvulos). Embora o DHA melhore a função desses tipos celulares, o PhA reduz a sua atividade e função normal através da redução da sua atividade mitocondrial.
Neste sentido, o DHA é conhecido por reduzir a resposta imunológica de hipersensibilidade a aero-alérgenos que são responsáveis, não só pela dermatite atópica, mas por doenças do trato respiratório inferior e asma. Além disso, o DHA tem um efeito particular na prevenção de doenças infeciosas através da atividade sobre as células dendríticas, redução de infeções e asma brônquica. Bem como melhorar a função das células dendríticas (atividade antiviral, bactericida, prevenção de rejeições, antitumoral), o DHA também melhora a função respiratória, sendo particularmente eficiente na asma e doenças respiratórias crónicas (EPOC). 0 tratamento com DHA melhora a capacidade de ventilação em doenças respiratórias crónicas e asma (Kompauer et ai., 2008).
Por conseguinte, a utilização da composição da presente invenção para o tratamento de fibrose cística é altamente recomendável, uma vez que esta patologia tem uma deficiência de DHA, bem como infeções crónicas frequentes. Uma vez que a composição da presente invenção é livre de PhA, isto resulta num efeito anti-infeciosos mais forte. O DHA tem funções específicas nos diferentes tipos celulares que se descrevem na presente invenção. Contudo, a modulação das células dendríticas pelo DHA é o mecanismo de ação comum mais relevante de tratamentos com DHA como um coadjuvante e medida preventiva em patologias humanas, em particular quando livre de PHA, uma vez que o último altera a função de células dendríticas e aumenta a sensibilidade a infeções.
Exemplo 18: Utilização da composição de DHA livre de PhA no sistema digestivo e doença inflamatória do intestino (IBD)
Os efeitos terapêuticos do DHA na regulação das prostaglandinas, citocinas e homeostasia como fibrinolitico e antiagregante plaquetário em doenças inflamatórias intestinais (IBD) , foram provavelmente as aplicações primeiramente conhecidas na bibliografia médica. 0 DHA oferece a vantagem, sobre outros PUFA, de aumentar a atividade das prostaglandinas da série 3 da síntese de EPA, particularmente em doses elevadas de DHA (> 4 g/dia) ; também inibe as prostaglandinas da série 2 e tem a sua própria atividade dos seus próprios derivados, os docosanoides. 0 DHA também controla a atividade secretória das células de Goblet intestinais e enterocitos. Nestas doenças é necessário um tratamento preventivo é necessário durante longos períodos de tempo. Neste sentido, o tratamento com DHA é muito adequado, uma vez que não reduz a síntese de outros ácidos gordos essenciais tais como ácido gama-linolénico (ómega 6) necessários para a síntese das prostaglandinas mais anti-inflamatórias da série 1, onde a sua síntese é inibida por outros ácidos gordos ómega 3, tais como EPA. 0 DHA sem PhA exibe um aumento da atividade anti-infeciosa: contra bactérias, vírus, fungos e parasitas, que pode ser apreciado em particular com doses superiores a 4 g/dia. Muitas doenças intestinais inflamatórias estão associadas a infeções crónicas (por exemplo, H. pylori, Clostridium sp, etc). Nesta invenção, foram levados a cabo estudos com colite ulcerativa em adultos e crianças, colite pseudomembranosa, Doença de Crohn, colite colagenosa, síndrome de intestino irritável, gastrite e esofagite.
Para a realização deste estudo, foram utilizadas doses orais de DHA onde de 4 g/dia de DHA livre de PHA e doses mais elevadas de até 8 g/dia para o tratamento de casos agudos. A sua utilização retal (particularmente na proctite) combinada com doses baixas de corticosteroides (por exemplo, 5-10 mg/dia) resulta num tratamento eficaz contra IBD.
Um indivíduo do sexo feminino, de 32 anos com colite ulcerativa, com um historial de 6 anos de doença sem remissão, que foi tratada durante 6 anos com corticoterapia sistémica e proposta para cirurgia. Foi tratado com 12 g/dia de DHA livre de PhA durante 8 semanas em conjunto com corticoides, começando com 10 mg de Dacortin e uma redução de 2,5 mg/15 dias. Dentro das primeiras 48 horas após o tratamento, houve uma redução significativa da hemorragia e da dor abdominal e em 20 dias, houve uma remissão completa da hemorragia. Após 8 semanas, uma foi realizada uma biópsia, onde foi observada uma redução significativa da atividade inflamatória. Já sem um tratamento de corticoterapia, a dose inicial de 12 g/dia foi reduzida em 1 g de DHA por semana durante as 8 semanas subsequentes, até atingir uma dose de manutenção de 4 g/dia, que foi mantida durante 2 anos, durante os quais a colite ulcerativa se manteve inativa. A utilização de DHA como coadjuvante no tratamento da IBD com corticoides e estatinas permite reduzir a dose das últimas e os seus efeitos secundários, tais como lipodistrofia. O DHA livre de PhA não interage com as estatinas, além disso, reduz particularmente o risco de rabdomiólise e a hepatopatia associada a sinvastatinas reduzindo, portanto, a necessidade de usar as estatinas, que são contraindicadas na lipodistrofia associada a tratamentos retrovirais. O DHA reduz a hipertrigliceridemia e melhora o perfil lipoproteico sem reduzir a fração de colesterol LDL, exceto em doses muito elevadas (> 8 g/dia) ou quando combinado com o desporto (Yates-A et ai., 2009) . Uma alternativa para o uso de doses elevadas de DHA (para além de 8 g/dia) pode ser a utilização de 1-4 g/dia ou mais em conjunto com uma dose baixa de estatinas (por exemplo, 5 mg de sinvastatina), sendo uma dose eficaz para o tratamento de lipodistrofia (por exemplo, tratamentos com antirretrovirais e corticoides). O tratamento de 7 pacientes com uma dose de 4 g/dia de DHA livre de PhA e corticoides durante mais de 3 meses, reduziu a formação da lipodistrofia habitual.
Exemplo 19: Utilização da composição de DHA livre de PhA na medicina desportiva:
Existe um interesse crescente pelo papel do DHA na medicina desportiva, uma vez que melhora o perfil lipoproteico, reduz o colesterol, desempenha o seu papel no controlo das células de Purkinje ao controlar a frequência cardíaca e melhora a função de ventilação e o metabolismo aeróbio em miócitos. Estudos realizados com DHA em desportistas profissionais mostram que é o ácido gordo com maior atividade hipolipemiante e que melhora a capacidade aeróbica, de acordo com a investigação sobre o papel de DHA na fisiologia e na fisiopatologia. 0 DHA tomado cronicamente em doses baixas (0,5 g/dia) e na forma de um lípido estruturado pode ser um complemento importante na substituição da homeostasia durante o esforço físico moderado e até mesmo intensivo (Lopez-Roman et ai., 2008).
Abase destes estudos está conectada com mecanismos de ação onde o PHA é um antagonista específico descrito na presente invenção. Portanto, a partir de um ponto de vista teórico, espera-se que o DHA da presente invenção tenha uma atividade superior na fisiologia desportiva. Conforme descrito na invenção, PhA tem uma toxicidade poderosa e provoca danos irreversíveis na cadeia de transporte de eletrões mitocondriais, produzindo uma grave redução da fosforilação oxidativa, sendo um ponto crítico no desempenho desportivo e do metabolismo aeróbico, muscular e cardiovascular em medicina desportiva. O PhA está associado a um atraso de condução e morte cardíaca súbita (Mõnning et ai., 2004).
Exemplo 20: Utilização da composição de DHA livre de PhA em patologias da tiroide.
Atualmente, existe um aumento significativo de casos com tireoidite, que induzem hipertiroidismo e hipotiroidismo com presença de anticorpos anti-tiroide numa população de eutiroidismo com e sem sintomas. Nesta invenção, foi descrita uma relação em pacientes de RP entre a presença de anticorpos anti-TPO (anticorpos anti-tiroide peroxidase) anti-TPO e um défice de DHA. Esta relação também foi determinado em pacientes de RP com a patologia da tiroide e níveis anormais de anticorpos anti-tiroide. O DHA melhora os problemas de obesidade em casos de hipotiroidismo, é cardioprotetor e melhora o perfil lipoproteico em pacientes com doença da tiroide. O tratamento com 4 g/dia de DHA sem PhA foi estabelecido em 11 pacientes assintomáticos sob um tratamento de hipertiroidismo e hipotiroidismo (dependendo do caso por exemplo, Tyrodril e Tiroxina) entre 17 e 49 anos, com e sem deficiência de DHA e níveis anormais de anticorpos anti-tiroide. Após 6 meses de tratamento, todos os pacientes mostraram uma redução significativa nos anticorpos anti-tiroide e uma redução significativa nos sintomas do ritmo cardíaco, tanto no hipertiroidismo, como nos pacientes com hipotiroidismo (induzida por iodo radioativo) devido ao tratamento com tiroxina.
Exemplo 21: Utilização da composição de DHA livre de PhA em doenças cardiovasculares
Enquanto o DHA tem um efeito como cofator na prevenção de fatores de risco cardiovasculares, diabetes, etc., não demonstrou ter um efeito clinicamente significativo no tratamento desses sinais. Contudo, reduziu a mortalidade e morbilidade em pacientes com doenças cardiovasculares. 0 DHA reduz o efeito de aterosclerose associado a tais fatores de risco. Particularmente em diabetes, devido ao seu efeito antiangiogénico e fator neurotrófico na retina (retinopatia diabética) e neuroprotetor (neuropatia diabética). A composição da presente invenção tem um efeito antiarrítmico potente, especialmente porque é livre de PhA, uma vez que o PhA induz o atraso na condução e a morte cardíaca súbita, sendo mais eficiente do que o DHA comercial em vários tipos de arritmia. 0 composto da invenção, o DHA livre de PHA, é útil na prevenção de arritmias e trombose, bem como no tratamento de algumas patologias vasculares, tais como a síndrome de Raynaud e para o tratamento de hipertrigliceremia. Em adição, o DHA reduz o número de mortes devido a insuficiência cardíaca associada a patologias ateroscleróticas, hiperglicemia, aterosclerose associada a hipertensão, diabetes e outros fatores metabólicos e infeciosos relacionados com a arteriosclerose, tais como níveis elevados de homocisteína e apoproteína (a). Reduziu particularmente os níveis de apo (a) em 2 pacientes com níveis elevados (> 30 mg/dl) que tiveram arteriosclerose cerebral e alterações neurológicas de origem isquémica. O tratamento com 4 g/dia reduziu em 50 % os níveis de apo (a) e normalizou a função cognitiva associada a enfartes cerebrais recorrentes que sofreram.
Exemplo 22: Utilização da composição de DHA livre de PhA em doenças parasitárias e infeciosas. 0 mecanismo de ação principal de DHA como agente antiparasitário e anti-infecioso (parasitas, bactérias, virus e fungos) está relacionado com o seu efeito anti-inflamatório potente (Tiesset et al., 2009) mediado por citocinas, fagocitose dos leucócitos, tal como anteriormente descrito nesta inovação. O PhA reduz a atividade de GTPases da subfamilia Rho nas células epiteliais e membranas mucosas, o que favorece as infeções bacterianas, fúngicas e parasitárias, um mecanismo que é usado por numerosas toxinas bacterianas como o seu mecanismo de infeção principal (Pseudomonas, Clostridium, etc,) (Engel &amp; Balachandran, 2009; Genth et al., 2006). O PhA também interage com antimitóticos. Portanto, a atividade do PhA é antagónica à de DHA, muito especifica em infeções, e portanto, o DHA livre de PhA é mais eficiente para combater infeções.
De uma forma oposta ao PhA, o DHA reduz infeções bacterianas, como aquelas por Pseudomonas aeruginosa em infeções pulmonares mediadas pela resposta inflamatória (Tiesset et al., 2009) e infeções por fungos (Bajpai et al., 2009) mediadas por docosanoides específicos de DHA (Haas-Stapleton, et al., 2007). Em infeções bacterianas por Helicobacter pylori, o DHA provou ser, por meio de estudos in vitro utilizando o método de Kirby Bauer, uma substância bactericida ativo (Drago et al., 1999) . Os estudos in vitro e in vivo determinam a capacidade anti-infeciosa (vírus, fungos e bactérias) e antiparasitária do DHA. O DHA está gravemente reduzido em infeções por Plasmodium falciparum (Hsiao et al., 1991), e sabe-se que reduções adicionais (25 %) estão associadas a degeneração retiniana, demência e um aumento da aterosclerose associada a outros fatores de risco. As infeções virais (rubéola) também têm sido associadas a níveis elevados de ácido fitânico (Pike et al., 1990). O DHA livre de PhA pode ser utilizado como um composto preventivo e potenciador dos efeitos dos antibióticos, reduzindo os casos de infeções e reinfeções particularmente nas infeções virais e fúngicas. Desta maneira, a utilização de antibióticos é reduzida, melhorando a sua atividade epidemiológica e evitando infeções virais e fúngicas secundárias à utilização de antibióticos. O efeito anti-infecioso do produto desta invenção reduz as complicações e evolução de infeções de grande relevância extra-infeciosa e epidemiológica, tais como a patologia digestiva associada a H. pylori e deterioração.
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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
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Lisboa, 13 de julho de 2016

Claims (61)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Processo para a obtenção de uma composição rica em ácidos gordos ómega 3 a partir de um óleo de origem marinha, com um teor de ácido fitânico (PhA) de menos do que 90 pg/g em que tal processo inclui as seguintes etapas: a) um óleo de origem marinha é saponificado de modo a obter sais de ácidos gordos. b) os sais de ácidos gordos da etapa a) são acidificados de modo a obter óleo acidificado. c) o óleo acidificado da etapa b) é submetido a ultracentrifugação num gradiente de glicerol a uma temperatura de 10 °C sob vácuo a 2 7 Pa. d) o gradiente de glicerol da etapa c) é submetido a cristalização a um intervalo de temperatura entre 0 e -57 °C, obtendo uma fase sólida e uma fase liquida, onde a fase sólida contém ácidos gordos saturados, ácidos gordos monoinsaturados e PhA e a fase liquida contém ácidos gordos ómega 3 polinsaturados com um teor de PhA inferior a 90 pg/g e) a fase liquida da etapa d) é separada da fase sólida para a sua recuperação através de decantação.
  2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que adicionalmente, inclui uma etapa adicional na qual os ácidos gordos ómega 3 são esterifiçados para obter triglicéridos ómega 3 com um teor de PhA inferior a 90 pg/g.
  3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que a saponificação da etapa a) é levada a cabo com KOH, água e etanol, agitando a mistura a uma temperatura de 40 °C a 300 rpm durante 1 hora numa atmosfera inerte.
  4. 4. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3 em que a acidificação da etapa b) é levada a cabo misturando os sais de ácidos gordos obtidos na etapa a), com ácido acético a 70 % numa atmosfera inerte a 200 rpm.
  5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que a ultracentrifugação da etapa c) é isopicnica e é levada a cabo em 100000 g durante 42 horas.
  6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que a ultracentrifugação da etapa c) é num gradiente de densidade sem equilíbrio e é levada a cabo em 100000 g durante 24 horas.
  7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 5 em que a etapa de cristalização d) é levada a cabo a 0 °C.
  8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 5 em que a etapa de cristalização d) é levada a cabo a -30 °C.
  9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 6 em que a etapa de cristalização d) é levada a cabo a -30 °C.
  10. 10. Composição caracterizada por compreender ácidos gordos ómega 3 num intervalo de 65 % e 99 % em peso e um teor de PhA inferior a 90 pg/g.
  11. 11. Composição de acordo com a reivindicação 10, em que o teor de PhA é inferior a 5 pg/g.
  12. 12. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 11, em que o intervalo de ácidos gordos ómega 3 é de 75 % a 99 % em peso.
  13. 13. Composição de acordo com a reivindicação 12, em que o intervalo de ácidos gordos ómega 3 é de 90 % a 99 % em peso.
  14. 14. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 13, em que os ácidos gordos ómega 3 compreendem ácido docosahexanoico (DHA) num intervalo entre 65 % a 95 % em peso.
  15. 15. Composição de acordo com a reivindicação 14, em que o intervalo de DHA é de 75 % a 95 % em peso.
  16. 16. Composição de acordo com a reivindicação 15, em que o intervalo de DHA é de 80-95 % em peso.
  17. 17. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, em que os ácidos gordos ómega-3 incluem adicionalmente ácido eicosapentanoico (EPA) num intervalo de 5 a 35 % em peso.
  18. 18. Composição de acordo com a reivindicação 11, em que o teor total de ácido gordo é 91,75 % em peso dos quais 80,65 % são DHA, 13,38 % são EPA, 5,07 % são outros ácidos gordos ómega-3, 0,69 % são outros ácidos gordos polinsaturados, 0,08 % são outros ácidos gordos saturados e 0,08 % são ácidos gordos monoinsaturados.
  19. 19. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 18, que compreende adicionalmente excipientes e/ou adjuvantes destinados para a utilização alimentar e farmacêutica.
  20. 20. Suplemento nutricional que compreende as composições de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 19 sob a forma de uma bebida, géis moles ou duros, emulsão aquosa ou pó.
  21. 21. Produto alimentar que compreende a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 19, sob a forma de uma bebida, géis moles ou duros, emulsão aquosa ou pó.
  22. 22. Uma composição farmacêutica que compreende uma composição rica em ácidos gordos ómega-3 de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 19 e um diluente ou veículo farmacêutico.
  23. 23. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de condição alérgica do olho, superfície ocular e/ou olho seco.
  24. 24. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 23 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em blefarite, blefaroconjuntivite, conjuntivite, queratite, queratoconjuntivite seca, doenças corneanas, tratamento contra rejeição de transplante da córnea, aumento da densidade corneana celular média através de paquimetria no pré e pós-cirúrgico de cirurgia Lasik.
  25. 25. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de doenças degenerativas da retina não associadas com distrofias genéticas.
  26. 26. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 25 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em degeneração macular húmica e seca associada com a idade, retinopatia associada com diabetes, glaucoma, alterações da pressão intraocular, retinopatia associada com miopia, desprendimento da retina, desprendimento retinal regmatogénico em olhos miópicos depois de LASIK, edema macular secundário de origem isquémica, edema macular cistoide, sindrome de Irvine-Gass, escotoma de Berlin, coroidose, coriorretinite, neuroneurite sifilitica, rubéola, Citomegalovirus, melanoma maligno das coroides, venenos de mercúrio (doença de Minamata, acrodinia, sindrome de Hunter-Russell) , vasculite retiniana (doença de Eales) , ou retinosquise hemorrágica traumática.
  27. 27. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de distrofias de retina hereditárias não retinite pigmentosa.
  28. 28. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 27 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Stargardt, amaurose congénita de Leber, Coroideremia ligada a X, retinosquise ligada a X, distrofia vitrorretiniana de Goldman-Favre, distrofia vitrorretiniana de Wagner e sindrome de Stickler, pars planite familial.
  29. 29. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de retinose pigmentar (RP).
  30. 30. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de sindromes relacionadas com retinose pigmentar.
  31. 31. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 30 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em, RP não sindrómica como um resultado de mutações especificas e/ou falha na síntese hepática ou transporte de DHA ou como uma consequência de stress metabólico, tipos Mendelianos de RP não sistémica típica, RP sectorial não sistémica, RP não sistémica bilateral, RP não sistémica unilateral, RP não sistémica bilateral, RP não sistémica inversa, RP autossómica dominante, RP autossómica recessiva, RP ligada a X, RP simples ou esporádica, RP vitrorretiniana, RP punctata albescens, RP sem pigmento, atrofia da coroide, atrofia girada da coroide e/ou retiniana, RP com distrofia dos cones e bastonetes, sindrome de Usher de tipo I, síndrome de Usher de tipo II, sindrome de Usher de tipo III, sindrome de Usher de tipo IV, RP iatrogénica tal como por NP 207, tioridazina, cloroquina hidroxicloroquina, e clorpromazina, sindromes genéticas com defeitos peroxissomais, com RP e/ou deficiências em DHA e aumentos em PhA e PA que exibem alterações neurológicas, cardiovasculares, músculo-esqueléticas e/ou dermatológicas variáveis, sindrome de Zellweger, doença de Refsum Infantil, adrenoleucodistrofia neonatal, distúrbio de biogénese peroxissomal, condrodisplasia punctata rizomélica (RCDP) , deficiências em acil-CoA oxidase, deficiências enzimáticas bifuncionais, doença de Refsum, deficiência de β-oxidação, queratoderma ictiosiforme familial, sindrome de Sjogren-Larsson, doenças com mitocondriopatias, deficiência de COX e/ou sindrome de Leigh, sindromes genéticas com defeitos peroxissomais, defeitos peroxissomais e/ou relacionados com RP e alterações retinianas relacionadas, síndrome de Bassen-kornzweig, síndrome de Batten ou síndrome de lipofuscinose, hipoprebetalipoproteinemia, síndrome de Usher, síndrome de Hallervorden-Spatz, Aceruloplasminemia, síndrome de Kearns-Sayre, distrofia muscular de Duchenne e Becker, síndrome de Lawrence-Moon-Bardet-Biedl, síndrome de Lawrence-Moon, síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Grafe, síndrome de Hallgreen, síndrome de Cokayne, síndrome de Alstrom, síndrome de Pelizaeus-Merzbacher, ataxia cerebelosa, ataxia de Friederich, lipofuscinose, maurótica familiar idiopática, síndrome de Tay-Sachs, síndrome de Haltia-Santavuori, Biel-Schowsky-Jansky, síndrome de Vogt-Spielmeyer-Batten-Mayou, síndrome de Kufs, displasia osteo-neuro-endócrina, mucopolissacaridose, síndrome de Hurler, síndrome de Hunter, síndrome de Scheire, MPS I-H/S, Sanfilippo, síndrome de Bassen Kornzweig, displasia negro-retiniana, displasia esquelética, síndrome renal-oculo-esquelética, síndrome de Edwards, síndrome Oculo-cerebro-renal ligada a X recessivo ou síndrome de Lowe, síndrome de Lignac-Fanconi (cistinose), neuropatia axonal gigante, e/ou demência familiar, tipo dinamarquês.
  32. 32. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de uveíte e doenças relacionadas.
  33. 33. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 32 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em irite, pars planite, coroidite, coriorretinite, uveite anterior e/ou posterior, iridociclocoroidite, uveite infeciosa, brucelose, Herpes Simplex; Herpes zoster, leptospirose, doença de Lyme, sindrome de histoplasmose ocular presumível, sífilis, toxocaríase, toxoplasmose, tuberculose, candidíase, síndromes de uveite, epiteliopatia pigmentar placoide multifocal posterior aguda, retinocoroidopatia do tipo "birdshot", iridociclite heterocrómica de Fuchs, coroidite multifocal e síndrome de panuveíte, síndrome de múltiplos pontos brancos evanescentes, coroidopatia interna ponteada, coroidite serpiginosa, distúrbios sistémicos associados com uveite tal como espondilite anquilosante, doença de Behcet, doença granulomatosa crónica, entesite, doença inflamatória do intestino, artrite reumatoide juvenil, artrite reumatoide, esclerose múltipla, poliartrite nodosa, artrite psoriática, síndrome de Reiter, sarcoidose, lúpus eritematoso sistémico, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, doença de Whipple, síndromes mascaradas nos segmentos anteriores e/ou posteriores, retinoblastoma, desprendimento da retina, melanoma maligno, leucemia, xantogranuloma juvenil, corpo estranho intraocular, linfoma, esclerose múltipla e/ou sarcoma de células reticulares.
  34. 34. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de doença degenerativa e condições oftalmológicas secundárias relacionadas com doenças vasculares.
  35. 35. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 34 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em retinopatia hipertensiva, neuropatia isquémica ótica hipertensiva, coroidopatias hipertensivas, esclerose coroideia, trombose de veia ramificada ou central, estrias de Elschnig e Slegrist, ateroesclerose, isquemia cerebal e neuro-oftalmológica, síndrome do arco aórtico, doença de Takayasu, arterite de Takayasu, panarterite, iridociclite, esclerite, neovascularização pré-retiniana produzida por isquemia e que pode resultar em hemorragias vítreas, edema da córnea, efeito de Tyndall no humor aquoso, retinopatia diabética proliferativa ou glaucoma neovascular, insuficiência carotídea ou isquemia ocular crónica, obstrução da artéria oftálmica, obstrução da artéria retiniana central, distúrbios de coagulação, deficiência de proteínas S e C, retinite panoftálmica, coroidite, estase papilar, hemorragias retinianas, mancha de Roth, lesões devido a imunocomplexos, neuropatia ótica, retinopatia isquémica, oftalmoplegia, pseudotumor orbitário, sindrome isquémica ocular, enfarte do lobo occipital, diplopia, edema palpebral, ptose palpebral, telangiectasias das pálpebras, conjuntiva, retina, obstrução aguda da artéria retiniana central, oftálmica ou das suas ramificações, obstrução das artérias ciliares posteriores, neuropatia ótica-isquémica de origem não arteritica, sindrome de isquemia ocular crónica produzida por hiperfusão e/ou visão turva ou sindrome de Shy-Drager.
  36. 36. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção da perda de acuidade visual não associada à retina e outras utilizações oftalmológicas não relacionadas com a superfície ocular.
  37. 37. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 36 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em catarata, hipermetropia, miopia, presbiopia, vitrite, descolamento vítreo e/ou endoftalmite.
  38. 38. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de distúrbios neurológicos e/ou psiquiátricos.
  39. 39. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 38 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em neuropatias sensoriais motoras hereditárias, demência, doença de Alzheimer, esclerose múltipla e/ou ataxia.
  40. 40. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de doenças oncológicas.
  41. 41. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 40 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em metástases, as linhas tumorais mais prevalentes, cancro colorretal, cancro da próstata, cancro da mama, cancro pulmonar, cancro ovárico, cancro gástrico, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro renal, hepatocarcinoma, cancro cerebral, glioblastoma, melanoma, retinoblastoma, cancro da vesícula biliar, mieloma múltiplo, cancros endócrinos e/ou cancros relacionados com uma resistência à insulina.
  42. 42. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de nefropatias.
  43. 43. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 42 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em nefropatia por IgA e/ou nefropatia associada a lúpus eritematoso sistémico, insuficiência renal, glomerulopatia, tubulopatia, doença vascular renal e/ou intersticial.
  44. 44. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de doenças cardiovasculares.
  45. 45. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 44 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em, alterações isquémicas, arteriosclerose, hipertrigliceridemia, hiperlipemias, arritmias ventriculares, hipertensão, diabetes e/ou doenças cardiovasculares em que os níveis de apoproteína a (apo (a) ) estão aumentados.
  46. 46. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de doenças iatrogénicas.
  47. 47. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 46 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em rabdomiólise, hepatotoxicidade, cardiotoxicidade, neurotoxicidade, edema, lipodistrofia, e/ou imunossupressão, associada com estatinas, corticoides, antiretrovirais e/ou imunossupressores.
  48. 48. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de fibromialgia e/ou síndrome de fadiga crónica.
  49. 49. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de artrose e osteoporose.
  50. 50. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de doenças autoimunes, doenças inflamatórias crónicas e/ou doenças músculo-esqueléticas.
  51. 51. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 50 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, artrite juvenil, doença de Sjogren, espondilite anquilosante, lúpus eritematoso sistémico, artrose e/ou osteoporose.
  52. 52. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de doenças dermatológicas.
  53. 53. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 52 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em alopecia androgénica, acne rosácea, acne vulgaris, eczemas e/ou psoriase.
  54. 54. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de condições alérgicas, asma e/ou doenças respiratórias crónicas.
  55. 55. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de doenças do sistema digestivo e/ou doenças inflamatórias do intestino.
  56. 56. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 55 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em gastrite autoimune, virai e/ou tóxica, esofagite, doença de Crohn, colite ulcerativa, colite pseudomembranosa, colite colagenosa, alterações da permeabilidade intestinal, sindromes de má absorção, intolerância e alergias alimentares e/ou hemorroidas.
  57. 57. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção de doenças parasitárias e infeciosas.
  58. 58. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção do défice de DHA.
  59. 59. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 58 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em sindromes de má absorção gastrointestinal, fibrose cística, sindromes de má absorção intestinal, pancreatite, insuficiência pancreática, colelitíase, transtornos alimentares, anorexia, bulimia.
  60. 60. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização no tratamento ou prevenção da deficiência nutricional comum em DHA observada nas sociedades humanas, mulheres grávidas, mulheres lactantes e/ou crianças.
  61. 61. Composição de acordo com as reivindicações 10 a 19 para utilização para a melhoria das condições fisiológicas que aumentam a acuidade visual, memória e funções cognitivas, aumentando o desempenho desportivo e reduzindo lesões e/ou reduzindo a fadiga neuromuscular normal.
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