JP2015226542A - ヘアピンコンフォメーションを有するキメラプライマーおよびその使用法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】標的特異的プライマー配列;標的特異的プライマー配列の5'にあるアンチタグ配列;アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;及びアンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカーを含む第一の核酸分子と、標的特異的プライマー配列;標的特異的プライマー配列の5'にあるユニバーサルアンチタグ配列;ユニバーサルアンチタグ配列の5'にあるユニバーサルタグ配列;及び間にあるブロッカーを含む第二の核酸分子と、ユニバーサルタグ配列に相補的なユニバーサルアンチタグ配列;及び標識を含む第三の核酸分子を含む組成物。標識が蛍光標識であり、マイクロスフェアに共有結合で付着したアンチタグ配列をさらに含む、組成物。
【選択図】なし
Description
本発明は、一般に、遺伝学および分子生物学の領域に関する。より具体的には、核酸の増幅および検出のための方法および組成物に関する。
核酸の増幅および検出の技術は、変異および多形についてのDNA試料の分析において高頻度に利用されている。それらは、DNAまたはRNAの分析による、感染性病原体であるものを含む細菌、ウイルス、および真菌の検出およびタイピングにおいても利用されている。対立遺伝子特異的PCR(AS-PCR)および対立遺伝子特異的プライマー伸長(ASPE)のようなアプローチは、異型ヌクレオチドを含有している配列または野生型ヌクレオチドを含有している対応する配列のいずれかのプライマー伸長を選択的に達成するよう選択されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、変異および多形を検出する。そのようなアプローチは、例えば、米国第5,595,890号(特許文献1)、第5,639,611号(特許文献2)、および第5,137,806号(特許文献3)に記載されており、それらの開示は参照により組み入れられる。
[本発明1001]
(a)標的特異的プライマー配列;
(b)標的特異的プライマー配列の5'にあるアンチタグ配列;
(c)アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;および
(d)アンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー
を含む核酸分子。
[本発明1002]
アンチタグ配列およびタグ配列が各々8〜30ヌクレオチド長である、本発明1001の核酸分子。
[本発明1003]
アンチタグ配列が12ヌクレオチド長である、本発明1002の核酸分子。
[本発明1004]
アンチタグ配列およびタグ配列が各々24ヌクレオチド長である、本発明1002の核酸分子。
[本発明1005]
ブロッカーがiSp18モエティまたはiMe-isodCモエティである、本発明1001の核酸分子。
[本発明1006]
(a)マイクロスフェア;
(b)マイクロスフェアに共有結合で付着した第一のアンチタグ核酸;
(c)第一のアンチタグ核酸とハイブリダイズしたタグ核酸;
(d)タグ配列の3'に共有結合で付着したブロッカー;
(e)ブロッカーの3'に共有結合で付着した、第一のアンチタグ核酸の少なくとも8個の連続するヌクレオチドと同一の配列を有する第二のアンチタグ核酸;
(f)第二のアンチタグ核酸の3'に共有結合で付着した標的特異的核酸;ならびに
(g)アンチタグ核酸および標的特異的核酸の配列に相補的な配列を含む、第二のアンチタグ核酸および標的特異的核酸とハイブリダイズした核酸分子
を含む組成物。
[本発明1007]
マイクロスフェアが蛍光標識されている、本発明1006の組成物。
[本発明1008]
マイクロスフェアが磁性である、本発明1006の組成物。
[本発明1009]
第二のアンチタグ核酸および標的特異的核酸とハイブリダイズした核酸分子が、レポーター分子に共有結合で連結されている、本発明1006の組成物。
[本発明1010]
(a)(i)第一の標的特異的プライマー配列;
(ii)標的特異的プライマー配列の5'にあるアンチタグ配列;
(iii)アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;および
(iv)アンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー
を含む、プライマー対の第一のメンバーである第一の核酸分子と;
(b)(i)第二の標的特異的プライマー配列;
(ii)標的特異的プライマー配列の5'にあるユニバーサルアンチタグ配列;
(iii)アンチタグ配列の5'にあるユニバーサルタグ配列;および
(iv)アンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー
を含む、プライマー対の第二のメンバーである第二の核酸分子と;
(c)(i)ユニバーサルタグ配列に相補的なユニバーサルアンチタグ配列;および
(ii)標識
を含む第三の核酸分子と
を含む組成物。
[本発明1011]
標識が蛍光標識である、本発明1010の組成物。
[本発明1012]
蛍光標識がCy3標識である、本発明1011の組成物。
[本発明1013]
複数の異なる標的配列の増幅のための複数のプライマー対を含む組成物であって、各プライマー対が、
(a)(i)第一の標的特異的プライマー配列;
(ii)標的特異的プライマー配列の5'にあるアンチタグ配列;
(iii)アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;および
(iv)アンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー
を含む第一の核酸分子と;
(b)(i)第二の標的特異的プライマー配列;
(ii)標的特異的プライマー配列の5'にあるユニバーサルアンチタグ配列;
(iii)アンチタグ配列の5'にあるユニバーサルタグ配列;および
(iv)アンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー
を含む第二の核酸分子と;
(c)(i)ユニバーサルタグ配列に相補的なユニバーサルアンチタグ配列;および
(ii)標識
を含む標識されたユニバーサルアンチタグ分子と
を含む、前記組成物。
[本発明1014]
複数のコード化されたマイクロスフェアに共有結合で付着した複数のアンチタグ核酸分子をさらに含み、複数のアンチタグ分子が、複数のプライマー対のタグ配列に相補的なアンチタグ配列を含み、かつアンチタグ核酸分子の各々の同一性が、それが共有結合で付着しているコード化されたマイクロスフェアのコード化から決定され得る、本発明1013の組成物。
[本発明1015]
標的核酸を増幅する方法であって、
(a)(i)第一の標的特異的プライマー配列;標的特異的プライマー配列の5'にあるアンチタグ配列;アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;およびアンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー、を含む第一のプライマーと;
(ii)第二の標的特異的プライマー配列を含む第二のプライマーと
を含む第一のプライマー対を準備する工程;
(b)レポーターを準備する工程;
(c)固体支持体に付着したアンチタグ配列を含む捕獲複合体を準備する工程;ならびに
(d)標的核酸の増幅に適した条件の下で、第一のプライマー対、レポーター、捕獲複合体、および標的核酸を含む試料を組み合わせることにより、標的核酸を増幅する工程
を含む、前記方法。
[本発明1016]
増幅された核酸を捕獲複合体のアンチタグ配列とハイブリダイズさせる工程をさらに含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
レポーターが第二のプライマーに付着している、本発明1015の方法。
[本発明1018]
レポーターがdNTPに付着している、本発明1015の方法。
[本発明1019]
レポーターがDNAインターカレーターである、本発明1015の方法。
[本発明1020]
固体支持体がマイクロスフェアである、本発明1015の方法。
[本発明1021]
ビーズが磁性であり、かつ蛍光標識されている、本発明1020の方法。
[本発明1022]
標的核酸の増幅が、鎖交換活性を有するがエキソヌクレアーゼ活性は有しないポリメラーゼにより触媒される、本発明1015の方法。
[本発明1023]
増幅された核酸を検出する工程をさらに含む、本発明1016の方法。
[本発明1024]
増幅された核酸の検出が、捕獲複合体に結合した増幅された核酸配列の画像化を含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
試料が少なくとも一つの第二の標的核酸を含む、本発明1015の方法。
[本発明1026]
少なくとも一つの第二のプライマー対が、標的核酸の増幅に適した条件の下で、第一のプライマー対、レポーター、捕獲複合体、および標的核酸を含む試料と組み合わせられる、本発明1025の方法。
[本発明1027]
異なる増幅された標的核酸を、識別可能な捕獲複合体の異なるアンチタグ配列とハイブリダイズさせる工程をさらに含む、本発明1026の方法。
[本発明1028]
捕獲複合体が空間的に識別可能である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
捕獲複合体が光学的に識別可能である、本発明1027の方法。
[本発明1030]
試料中の微生物を検出する方法であって、
(a)各プライマー対が、
(i)第一の標的特異的プライマー配列;標的特異的プライマー配列の5'にあるアンチタグ配列;アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;およびアンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー、を含む第一のプライマーと;
(ii)第二の標的特異的プライマー配列;標的特異的プライマー配列の5'にあるユニバーサルアンチタグ配列;アンチタグ配列の5'にあるユニバーサルタグ配列;およびアンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー、を含む第二のプライマーと
を含む、複数の異なる微生物からの複数の異なる標的核酸配列の増幅のための複数のプライマー対を準備する工程;
(b)(i)ユニバーサルタグ配列に相補的なユニバーサルアンチタグ配列;および
(ii)標識
を含む標識されたユニバーサルアンチタグ分子を準備する工程;
(c)固体支持体に付着したアンチタグ配列を含む複数の捕獲複合体を準備する工程;ならびに
(d)標的核酸配列の増幅に適した条件の下で、複数のプライマー対、標識されたユニバーサルアンチタグ分子、捕獲複合体、および試料を組み合わせることにより、微生物が試料中に存在する場合に、異なる微生物からの標的核酸配列を増幅する工程;
(e)増幅された標的核酸配列を、それぞれの捕獲複合体のそれぞれのアンチタグ配列とハイブリダイズさせる工程;ならびに
(f)それぞれの捕獲複合体に結合した増幅された標的核酸配列を検出することにより、試料中に存在する微生物を検出する工程
を含む、前記方法。
[本発明1031]
微生物が細菌である、本発明1030の方法。
[本発明1032]
微生物が病原体である、本発明1030の方法。
[本発明1033]
微生物がレトロウイルス、ウイルス、または真菌である、本発明1030の方法。
[本発明1034]
試料が患者の試料である、本発明1030の方法。
[本発明1035]
患者の試料が、血液試料、血清試料、または脳脊髄液試料である、本発明1034の方法。
[本発明1036]
試料が環境試料である、本発明1030の方法。
[本発明1037]
環境試料が、水試料または土壌試料である、本発明1036の方法。
[本発明1038]
複数の異なる標的核酸配列が、RNA配列の逆転写により入手されたcDNA配列である、本発明1030の方法。
[本発明1039]
5〜30種のプライマー対を準備する工程を含む、本発明1030の方法。
[本発明1040]
1〜10種の異なる微生物が検出される、本発明1030の方法。
[本発明1041]
遺伝子発現を定量化する方法であって、
(a)mRNAから逆転写されたcDNAを固定化する工程;
(b)固定化されたcDNAに、ユニバーサルプライマー結合配列およびcDNA特異的配列を含む第一のオリゴヌクレオチドと、ユニークプライマー結合配列およびcDNA特異的配列を含む第二のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程;
(c)ライゲートされたオリゴヌクレオチドを形成させるために、第一のオリゴヌクレオチドを第二のオリゴヌクレオチドとライゲートする工程;
(d)ユニバーサルプライマーと、ユニークプライマー配列、ユニークプライマー配列の5'にあるアンチタグ配列、アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;およびアンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー、を含むユニークプライマーとを使用して、ライゲートされたオリゴヌクレオチドを増幅する工程;
(e)アンプリコンのタグ配列を、捕獲複合体のアンチタグ配列とハイブリダイズさせることにより、アンプリコンを捕獲する工程;
(f)アンプリコンを標識する工程;ならびに
(g)標識された捕獲されたアンプリコンを検出し定量化する工程
を含む、前記方法。
[本発明1042]
オリゴdTによりコーティングされたウェルまたはビーズの上でmRNAを捕獲し逆転写する工程を含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
ユニバーサルプライマーがT3プライマーである、本発明1041の方法。
[本発明1044]
捕獲されたアンプリコンの標識がDNA結合色素による、本発明1041の方法。
[本発明1045]
発現が複数の異なる遺伝子について定量化され、異なる遺伝子の各々について、異なるタグ、アンチタグ、および捕獲複合体が存在する、本発明1041の方法。
[本発明1046]
アンプリコンが捕獲の前に標識される、本発明1041の方法。
[本発明1047]
アンプリコンが捕獲の後に標識される、本発明1041の方法。
[本発明1048]
(a)(i)第一の標的特異的プライマー配列;
(ii)標的特異的プライマー配列の5'にあるアンチタグ配列;
(iii)アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;および
(iv)アンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー
を含む、プライマー対の第一のメンバーである第一の核酸分子と;
(b)(i)第二の標的特異的プライマー配列;
(ii)標的特異的プライマー配列の5'にあるアンチタグ配列;
(iii)アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;および
(iv)アンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー
を含む、プライマー対の第二のメンバーである第二の核酸分子と;
(c)(i)第一および第二の核酸分子のタグ配列に相補的なアンチタグ配列;ならびに
(ii)標識
を含む第三の核酸分子と
を含む組成物。
[本発明1049]
標的核酸を増幅する方法であって、
(a)(i)第一の標的特異的プライマー配列;標的特異的プライマー配列の5'にあるアンチタグ配列;アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;アンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー;およびユニバーサルタグ配列に付着した発色団と;
(ii)第二の標的特異的プライマー配列;標的特異的プライマー配列の5'にあるアンチタグ配列;アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;アンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー;およびユニバーサルタグ配列に付着した発色団を含む、第二のプライマーと
を含む第一のプライマー対を準備する工程;
(b)(i)第一のプライマー対のタグ配列に相補的なアンチタグ配列;および
(ii)第一のプライマー対の発色団とのフェルスター共鳴エネルギー転移が可能な発色団
を含む標識核酸分子;ならびに
(d)標的核酸の増幅に適した条件の下で、第一のプライマー対、標識核酸分子、および標的核酸を含む試料、を組み合わせることにより、標的核酸を増幅する工程
を含む、前記方法。
[本発明1050]
標的核酸の増幅が、鎖交換活性を有するがエキソヌクレアーゼ活性は有しないポリメラーゼにより触媒される、本発明1049の方法。
[本発明1051]
増幅された核酸を検出する工程をさらに含む、本発明1049の方法。
[本発明1052]
検出がリアルタイムである、本発明1051の方法。
[本発明1053]
試料が少なくとも一つの第二の標的核酸を含む、本発明1049の方法。
[本発明1054]
標的核酸がアンプリコンである、本発明1049の方法。
[本発明1055]
核酸切断反応の切断産物を検出する方法であって、
(a)(i)切断産物特異的配列;
(ii)切断産物特異的配列の5'にあるアンチタグ配列;
(iii)アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;
(iv)アンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー;および
(v)標識
を含むオリゴヌクレオチドプローブを準備する工程;
(b)オリゴヌクレオチドプローブを切断産物とハイブリダイズさせる工程;ならびに
(c)オリゴヌクレオチドプローブの切断産物とのハイブリダイゼーションを検出する工程
を含む、前記方法。
[本発明1056]
標識がFRETドナー分子またはFRETアクセプター分子である、本発明1055の方法。
[本発明1057]
オリゴヌクレオチドプローブを固体支持体上に固定化する工程をさらに含む、本発明1055の方法。
[本発明1058]
固体支持体に連結された相補アンチタグ配列とのタグ配列のハイブリダイゼーションにより、オリゴヌクレオチドプローブが固体支持体上に固定化される、本発明1057の方法。
[本発明1059]
固体支持体がビーズである、本発明1057の方法。
[本発明1060]
切断産物が構造特異的フラップエンドヌクレアーゼにより作成される、本発明1055の方法。
[本発明1061]
切断産物がマングビーンヌクレアーゼまたはS1ヌクレアーゼにより作成される、本発明1055の方法。
[本発明1062]
ライゲーション産物を検出する方法であって、
(a)(i)ライゲーション産物特異的配列;
(ii)ライゲーション産物特異的配列の5'にあるアンチタグ配列;
(iii)アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;
(iv)アンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー;および
(v)標識
を含むオリゴヌクレオチドプローブを準備する工程;
(b)ライゲーション産物はオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするが、ライゲーション産物のライゲートされていないサブユニットはオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしない温度で、オリゴヌクレオチドプローブをライゲーション産物とハイブリダイズさせる工程;ならびに
(c)オリゴヌクレオチドプローブのライゲーション産物とのハイブリダイゼーションを検出する工程
を含む、前記方法。
[本発明1063]
標識がFRETドナー分子またはFRETアクセプター分子である、本発明1062の方法。
[本発明1064]
オリゴヌクレオチドプローブを固体支持体上に固定化する工程をさらに含む、本発明1062の方法。
[本発明1065]
固体支持体に連結された相補アンチタグ配列とのタグ配列のハイブリダイゼーションにより、オリゴヌクレオチドプローブが固体支持体上に固定化される、本発明1064の方法。
[本発明1066]
固体支持体がビーズである、本発明1064の方法。
I. 核酸
A. プライマー
本明細書に記載された方法および組成物において使用されるプライマーは、従来入手可能であったより優れた核酸の増幅および検出を提供するために設計されている。これらのプライマーを使用するアッセイは、プライマー濃度のより少ない最適化を必要とし;より迅速に結果を与え;DNA結合色素を使用した時、より低いバックグラウンドおよびより高い特異的シグナルをもたらし;より高い感度を提供し;産物/標的濃度のより正確な測定を提供し;かつプライマーセットのより高度の多重化を可能にする。「プライマー」という用語は、本明細書において使用されるように、鋳型依存性の過程で新生核酸の合成をプライムすることができる核酸を包含するものである。プライマーは、二本鎖型および/または一本鎖型で提供され得るが、一本鎖型が好ましい。
本明細書に開示された核酸は、例えば、化学合成、酵素的作製、または生物学的作製のような、当業者に公知の任意の技術により調製され得る。合成核酸(例えば、合成オリゴヌクレオチド)の非限定的な例には、ホスホトリエステル化学、ホスファイト化学、またはホスホラミダイト化学を使用したインビトロ化学合成、および参照により本明細書に組み入れられるEP266,032に記載されたような固相技術により、または各々参照により本明細書に組み入れられる、Froehler et al.,1986および米国特許第5,705,629号により記載されたようなデオキシヌクレオシドH-ホスホネート中間体を介して作成された核酸が含まれる。オリゴヌクレオチド合成の様々な異なる機序は、例えば、各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,659,774号、第4,816,571号、第5,141,813号、第5,264,566号、第4,959,463号、第5,428,148号、第5,554,744号、第5,574,146号、第5,602,244号に開示されている。
配列特異的核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、遺伝学的異常、変異、および疾患傾向の指標としての特定の遺伝子配列の検出のために使用される。さらに、それらは、様々な生物学的媒介物および感染性病原体の検出のために使用される。本明細書において使用されるように、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、または「ハイブリダイズすることができる」とは、二本鎖もしくは三本鎖の分子、または部分的な二本鎖もしくは三本鎖の性質を有する分子の形成を意味するものと理解される。「アニールする」という用語は、本明細書において使用されるように、「ハイブリダイズする」と同義である。「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、または「ハイブリダイズすることができる」という用語には、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」という用語、および「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」という用語が包含される。
A. 標識
核酸を検出するためには、適切な検出系と組み合わせて核酸を利用することが有利であろう。プライマーへ組み入れられた認識モエティ、増幅中に増幅された産物へ組み入れられた認識モエティ、またはプローブに付着させられた認識モエティは、核酸分子の同定において有用である。フルオロフォア、発色団、ラジオフォア、酵素タグ、抗体、化学発光/電気発光標識、アフィニティ標識等のような、「レポーター」とも呼ばれる、多数の異なる標識が、この目的のために使用され得る。当業者は、これらの標識および本明細書中に述べられないその他の標識が、本発明において成功裡に使用され得ることを認識するであろう。アフィニティ標識の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない:抗体、抗体断片、受容体タンパク質、ホルモン、ビオチン、ジゴキシゲン(digoxigen)、DNP、またはアフィニティ標識に結合する任意のポリペプチド/タンパク質分子。
本発明のある種の態様は固体支持体を含む。固体支持体は遺伝子チップまたはマイクロアレイのような平面アレイであり得る。アレイおよび遺伝子チップテクノロジーは、固体基質上に固定化された多様な一本鎖オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする能力について、多数の核酸試料を迅速にスクリーニングする手段を提供する。これらの技術には、多数の遺伝子を迅速かつ正確に分析するための定量的な方法が含まれる。そのテクノロジーは、ハイブリダイゼーションによりDNA試料をスクリーニングするために一本鎖DNAの相補結合特性を利用する(Pease et al.,1994;Fodor et al.,1991)。基本的に、アレイまたは遺伝子チップは、一本鎖のDNA分子またはRNA分子のアレイが付着させられた固体基質からなる。スクリーニングのためには、チップまたはアレイを、一本鎖のDNA試料またはRNA試料と接触させ、それを、ストリンジェントな条件の下でハイブリダイズさせる。次いで、どのプローブがハイブリダイズしたかを決定するため、チップまたはアレイをスキャンする。チップまたは平面アレイの上のプローブの同一性は、チップまたは平面アレイにおける空間的な位置(即ち、x座標、y座標)により既知となる。
いくつかの態様において、固体支持体はマイクロスフェアであり得る。マイクロスフェアに基づくアッセイも、当業者に公知のテクノロジーにより分析され得る。例えば、ある種の態様において、Luminex xMAP(登録商標)テクノロジーが使用され得る。Luminexテクノロジーは、蛍光的にコード化されたマイクロスフェアに固定化された核酸産物の検出を可能にする。二つのスペクトル的に区別される蛍光色素により、各々10の異なる強度で、マイクロスフェアを染色することにより、100の蛍光的に区別されるマイクロスフェアの集団が生成される。これらの個々の集団(セット)は、個々の検出配列を表すことができ、各セット上のハイブリダイゼーションの大きさが個々に検出され得る。ハイブリダイゼーション反応の大きさは、典型的には、第三のスペクトル的に区別されるフルオロフォアである、第三のレポーターを使用して測定される。レポーター分子は、マイクロスフェア上の分子に付着することにより反応の程度についてのシグナルを発する。マイクロスフェアおよびレポーター分子の両方が標識されているため、デジタルシグナル処理は、各反応について、シグナルの定量的データへのリアルタイムの翻訳を可能にする。Luminexテクノロジーは、例えば、全て参照により具体的に組み入れられる、米国特許第5,736,330号、第5,981,180号、および第6,057,107号に記載されている。
本発明の態様は、競合結合アッセイフォーマットと併せて使用されてもよい。一般に、このフォーマットは、固体表面に連結された配列と、溶液中の、固体表面に連結された配列に相補的な標識された配列とを含む。このフォーマットでは、アッセイされる試料の中の標的配列を標識する必要はない。むしろ、標的配列の試料中の存在は、それが、固定化された検出配列とのハイブリダイゼーションについて、標識された相補鎖と競合するため、検出される。従って、標的配列が試料中に存在する場合、標的配列を欠く試料と比較して、シグナルは減少する。上記のLuminex xMAPテクノロジーは、競合結合アッセイフォーマットにおいて使用され得る。競合結合アッセイフォーマットにおけるLuminexテクノロジーの使用は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,736,330号および第6,057,107号に記載されている。
上述のように、本発明の様々な局面は、相補的なタグ配列(即ち、タグおよびアンチタグ)を使用する。プライマー、プローブ配列、標的配列等に連結されているタグ相補鎖と特異的にハイブリダイズさせるために使用され得る、固体支持体に付着させられたオリゴヌクレオチドタグの使用を含む、多数のアプローチが開発されている。クロスハイブリダイズしないタグ配列およびアンチタグ配列の適切な選択は、アッセイ、特に、ストリンジェントなクロスハイブリダイズしない挙動を必要とする、高度にパラレルなハイブリダイゼーション環境におけるアッセイにおいて有用である。
ブロッカーモエティは、第二鎖合成中にポリメラーゼがタグ配列領域を通って伸長するのを防止し、従って、タグ配列が、増幅中に一本鎖であり続け、従って、捕獲複合体内の相補アンチタグ配列に自由にハイブリダイズし得ることを可能にする。
以下の実施例は、本発明のある種の態様を示すために含まれる。当業者は、当開示を考慮すれば、開示された具体的な態様に多くの変化を施しても、本発明の本旨および範囲を逸脱することなく、同様のまたは類似の結果を入手し得ることを認識するべきである。
タグ領域およびアンチタグ領域を含むヘアピン形成プライマーを、タグ領域を含むがアンチタグ領域は含まない非ヘアピン形成プライマーと比較するため、並行研究を実施した。これらの「タグ付き」プライマーを、順方向プライマーとして使用した。Cy3標識された逆方向プライマー(400nM)を、それぞれの順方向プライマー(ヘアピン形成または非ヘアピン形成)および検出ビーズと共に添加した後、PCR増幅を行った。標的は、血栓形成傾向遺伝子MTHFRエキソン7であった。27サイクルの後、試料を、緩衝液またはレポーターを他に添加することなく(従って、模擬閉管検出フォーマットを表す)、室温においてLX200(Luminex Corp.)で分析した。
熱変性工程;95℃5分。
サイクリング工程(36サイクル):94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒。
実施例1に記載された27サイクルまでの増幅の後、最初の増幅に用いたのと同じ順方向プライマー(400nM)をさらに試料に追加する、もう一つの研究を実施した。未伸長ヘアピンプライマーが、ビーズとのハイブリダイゼーションに干渉するか否か、およびTIFプライマーが、ハイブリダイゼーションに干渉するか否かを試験するため、ハイブリダイゼーション前、増幅後に、過剰のプライマーの添加を行った。干渉が存在するのであれば、追加されたプライマーが、MFI値を減少させるであろうと予想される。
付加的な量のTIFプライマーまたは12snapプライマーによりシグナルが増加または減少するか否かを決定するため、27サイクルで中止させたPCR反応において、変動する量のプライマー濃度を試験した。結果は、下記表4および5に示される。
(1)Cy3標識された逆方向プライマーが順方向プライマーとハイブリダイズしないこと;および(2)プライマーダイマーが形成されないこと:を確認するため、二つの付加的な研究を実施した。
apta taq PCRにおける上記のPCRカクテルを、16snapプライマー、14snapプライマー、12snapプライマー、およびTIFプライマーの各々について、プライマー領域に相補的な標識されたオリゴをハイブリダイズさせるためのハイブリダイゼーション緩衝液として使用した。表12に示されるように、16snapプライマー、14snapプライマー、および12snapプライマーのヘアピン構造は、ビーズとハイブリダイズする能力を大きく阻害した。
(DeepVentエキソ(-)ポリメラーゼを含む)PCRカクテルを、各プライマーセットについて16のアリコートへ分割する、偽リアルタイムPCRを実施した。各サイクルにおけるシグナルレベルを測定するため、各アリコートを進行的なサイクルでサーマルサイクラーから取り出した。これを高速2段階PCR反応を使用して行い、全部で36サイクルのPCRプロトコルの終了時に室温でLX200(Luminex)でアリコートを測定した。
実験の期間中、スライド上に直接レンズおよびhex-イルミネーターを有するガラススライドで、リアルタイムPCR実験を実施した。ガラススライドチャンバーを構築し、ガラスをDMDCSを使用して化学的に修飾した後、ポリアデニル酸カリウム塩へ浸漬した。ガラススライドおよびカバーガラスを、インサイチューPCRキットを使用して、粘着性ガスケット(BioRad)とつなぎ合わせた。これらを、スライドグリドル(griddle)が装備されたBioRad DNA Engineサーマルサイクラーに置いた。この特定のスライドグリドルは、96ウェルのうちの1ウェルの上で直接、それに空けられた孔を有していた。露出したウェルは黒く塗られた。バックグラウンド反射光を低下させるため、ガラスチャンバーを、グリドル内の孔の上に直接置いた。CCDカメラおよび光源をDNA Engineサーマルサイクラーに連結することにより、リアルタイムPCRユニットを構築した。hex-イルミネーターを、ガラススライドの上に直接置き、PCR反応の期間中、そこに残した。以下のカクテルを、25μL容量ガラスチャンバーに置いた:
(表15)
反対鎖の伸長により、標識されたユニバーサルプローブに結合するユニバーサルタグ配列を含有しているプライマーにおいて使用される、ヘアピンのステム領域の長さの最適化を評価した。逆方向プライマーヘアピンステム領域の長さ、およびユニバーサルレポータープローブの長さの最適の長さを見出すため、異なるステム長を有する一連のプライマー、および異なる長さを有するユニバーサルレポータープローブを、比較のために反応させた。
8mM MgCl2
1×Qiagen PCR緩衝液
5000個のビーズ
200nMのプライマー
200nMのユニバーサルレポータープローブ
リアルタイム定量的PCRにおける髄膜炎菌DNA(ATCC700532D-5)の希釈系列を、閉管において実施した。この実験は、鋳型DNAの変動するインプット濃度を区別するために、定量的リアルタイムPCRを実施する能力を証明した。PCRカクテルは、各25uL反応物が以下のものを含有するよう調製された:
8mM MgCl2
1×Qiagen PCR緩衝液
各領域の5000個のビーズ
200nMのプライマー
200nMのユニバーサルレポータープローブ
以下の結果は、病原体の検出のためのヘアピン形成プライマーを多重化する能力を証明する。髄膜炎菌、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)を検出するための三重髄膜炎アッセイを設計した。3種のプライマーセットを同一反応物中に多重化した。アッセイの特異性を証明するため、別々の細菌種からのゲノムDNAを、個々の反応物中に置いた。
Claims (36)
- (a)(i)第一の標的特異的プライマー配列;
(ii)標的特異的プライマー配列の5'にあるアンチタグ配列;
(iii)アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;および
(iv)アンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー
を含む、プライマー対の第一のメンバーである第一の核酸分子と;
(b)(i)第二の標的特異的プライマー配列;
(ii)標的特異的プライマー配列の5'にあるユニバーサルアンチタグ配列;
(iii)ユニバーサルアンチタグ配列の5'にあるユニバーサルタグ配列;および
(iv)ユニバーサルアンチタグ配列とユニバーサルタグ配列との間にあるブロッカー
を含む、プライマー対の第二のメンバーである第二の核酸分子と;
(c)(i)ユニバーサルタグ配列に相補的なユニバーサルアンチタグ配列;および
(ii)標識
を含む第三の核酸分子と
を含む組成物。 - 標識が蛍光標識である、請求項1記載の組成物。
- マイクロスフェアに共有結合で付着したアンチタグ配列をさらに含む、請求項1記載の組成物。
- 複数の異なる標的配列の増幅のための複数の異なるプライマー対と、複数の固体支持体に共有結合で付着した複数の異なるアンチタグ核酸分子とを含む組成物であって、複数の異なるアンチタグ分子が、複数の異なるプライマー対の異なるタグ配列に相補的なアンチタグ配列を含み、固体支持体が、コード化されたマイクロスフェアであり、かつ異なるアンチタグ核酸分子の各々の同一性が、それが共有結合で付着しているコード化されたマイクロスフェアのコード化から決定され得る、請求項3記載の組成物。
- 該アンチタグ配列と該タグ配列が10〜40ヌクレオチド長である、請求項1記載の組成物。
- 該アンチタグ配列が24ヌクレオチド長であり、かつ、該タグ配列が8〜16ヌクレオチド長である、請求項5記載の組成物。
- 該タグ配列が12、14、または16ヌクレオチド長である、請求項5記載の組成物。
- 該ユニバーサルアンチタグ配列と該ユニバーサルタグ配列が10〜40ヌクレオチド長である、請求項1記載の組成物。
- 該ユニバーサルアンチタグ配列が24ヌクレオチド長であり、かつ、該ユニバーサルタグ配列が8〜16ヌクレオチド長である、請求項8記載の組成物。
- 該ユニバーサルタグ配列が12、14、または16ヌクレオチド長である、請求項8記載の組成物。
- 標的核酸を増幅する方法であって、
(a)(i)第一の標的特異的プライマー配列;標的特異的プライマー配列の5'にあるアンチタグ配列;アンチタグ配列の5'にあるタグ配列;およびアンチタグ配列とタグ配列との間にあるブロッカー、を含む第一のプライマーと;
(ii)第二の標的特異的プライマー配列を含む第二のプライマーと
を含む第一のプライマー対を準備する工程;
(b)レポーターを準備する工程;
(c)固体支持体に付着したアンチタグ配列を含む捕獲複合体を準備する工程;ならびに
(d)標的核酸の増幅に適した条件の下で、第一のプライマー対、レポーター、捕獲複合体、および標的核酸を含む試料を組み合わせることにより、標的核酸を増幅する工程
を含む、前記方法。 - 増幅された核酸を捕獲複合体のアンチタグ配列とハイブリダイズさせる工程と、増幅された核酸を検出する工程とをさらに含む、請求項11記載の方法。
- レポーターが第二のプライマー、dNTP、またはDNAインターカレーターに付着している、請求項11記載の方法。
- 固体支持体がマイクロスフェアである、請求項11記載の方法。
- マイクロスフェアが磁性であり、かつ蛍光標識されている、請求項14記載の方法。
- 増幅された核酸の検出が、捕獲複合体に結合した増幅された核酸配列の画像化を含む、請求項12記載の方法。
- 試料中の少なくとも一つの第二の標的核酸を増幅および検出する工程をさらに含み、
(a)少なくとも一つの第二のプライマー対を、標的核酸の増幅に適した条件の下で、第一のプライマー対、レポーター、捕獲複合体、および、標的核酸を含む試料と組み合わせる工程であって、第二のプライマー対の第一のプライマーが、第一のプライマー対の第一のプライマーの第一の標的特異的なプライマー配列、第一のアンチタグ配列、および第一のタグ配列とは異なる第三の標的特異的なプライマー配列、第二のアンチタグ配列、および第二のタグ配列を含む、工程、ならびに
(b)異なる増幅された標的核酸を、識別可能な捕獲複合体の異なるアンチタグ配列とハイブリダイズさせる工程
を含む、請求項11記載の方法。 - 捕獲複合体が空間的に識別可能である、請求項17記載の方法。
- 捕獲複合体が光学的に識別可能である、請求項17記載の方法。
- 第二のプライマーが、第二の標的特異的プライマー配列の5'にあるユニバーサルアンチタグ配列、ユニバーサルアンチタグ配列の5'にあるユニバーサルタグ配列、およびユニバーサルアンチタグ配列とユニバーサルタグ配列との間にあるブロッカーをさらに含み、かつ、レポーターが、ユニバーサルタグ配列に相補的なユニバーサルアンチタグ配列と標識とを含む、請求項11記載の方法。
- 該アンチタグ配列と該タグ配列が10〜40ヌクレオチド長である、請求項11記載の方法。
- 該アンチタグ配列が24ヌクレオチド長であり、かつ、該タグ配列が8〜16ヌクレオチド長である、請求項21記載の方法。
- 該タグ配列が12、14、または16ヌクレオチド長である、請求項21記載の方法。
- 該ユニバーサルアンチタグ配列と該ユニバーサルタグ配列が10〜40ヌクレオチド長である、請求項20記載の方法。
- 該ユニバーサルアンチタグ配列が24ヌクレオチド長であり、かつ、該ユニバーサルタグ配列が8〜16ヌクレオチド長である、請求項24記載の方法。
- 該ユニバーサルタグ配列が12、14、または16ヌクレオチド長である、請求項24記載の方法。
- 標的核酸の増幅が、鎖交換活性を有するがエキソヌクレアーゼ活性は有しないポリメラーゼにより触媒される、請求項11記載の方法。
- 標的核酸を増幅する方法であって、
(a)(i)第一の標的特異的プライマー配列;標的特異的プライマー配列の5'にあるユニバーサルアンチタグ配列;ユニバーサルアンチタグ配列の5'にあるユニバーサルタグ配列;ユニバーサルアンチタグ配列とユニバーサルタグ配列との間にあるブロッカー;およびユニバーサルタグ配列に付着した発色団、を含む第一のプライマーと;
(ii)第二の標的特異的プライマー配列;標的特異的プライマー配列の5'にあるユニバーサルアンチタグ配列;ユニバーサルアンチタグ配列の5'にあるユニバーサルタグ配列;ユニバーサルアンチタグ配列とユニバーサルタグ配列との間にあるブロッカー;およびユニバーサルタグ配列に付着した発色団を含む、第二のプライマーと
を含む第一のプライマー対を準備する工程;
(b)(i)第一のプライマー対のユニバーサルタグ配列に相補的なユニバーサルアンチタグ配列;および
(ii)第一のプライマー対の発色団とのフェルスター共鳴エネルギー転移が可能な発色団
を含む標識核酸分子;ならびに
(d)標的核酸の増幅に適した条件の下で、第一のプライマー対、標識核酸分子、および標的核酸を含む試料、を組み合わせることにより、標的核酸を増幅する工程
を含む、前記方法。 - 標的核酸の増幅が、鎖交換活性を有するがエキソヌクレアーゼ活性は有しないポリメラーゼにより触媒される、請求項28記載の方法。
- 増幅された核酸を検出する工程をさらに含む、請求項28記載の方法。
- 検出がリアルタイムである、請求項30記載の方法。
- 試料が少なくとも一つの第二の標的核酸を含む、請求項28記載の方法。
- 標的核酸がアンプリコンである、請求項28記載の方法。
- 該ユニバーサルアンチタグ配列と該ユニバーサルタグ配列が10〜40ヌクレオチド長である、請求項28記載の方法。
- 該ユニバーサルアンチタグ配列が24ヌクレオチド長であり、かつ、該ユニバーサルタグ配列が8〜16ヌクレオチド長である、請求項34記載の方法。
- 該ユニバーサルタグ配列が12、14、または16ヌクレオチド長である、請求項34記載の方法。
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