JP2015120706A - 担体免疫グロブリンおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定な配列のアミノ酸配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域;及び、特定な配列のアミノ酸と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、単離された抗原結合タンパク質。
【選択図】図1A
Description
本発明は、薬物動態特性を改善するために1つまたは複数の薬理学的に活性な化学部分に結合できる担体抗体に関する。
「担体」部分とは、非ペプチド有機部分(すなわち、「低分子」)またはポリペプチド薬剤など、薬理学的に活性な化学部分が共有結合または融合できる薬理学的に不活性な分子を指す。薬理学的に活性な化学部分のタンパク質分解もしくは他のインビボ活性を低下させる化学修飾によって薬理学的に活性な部分のインビボ減成を防止もしくは軽減するため、または腎臓クリアランスを低下させるため、インビボ半減期もしくは他の治療的な薬物動態特性を高める(薬理学的に活性な部分の非結合形態と比較して、吸収率を高める、毒性もしくは免疫原性を低減する、溶解度を改善する、ならびに/または製造可能性もしくは保存安定性を増加するなどの)ため、効果的な担体が探究されている。
本明細書において別段の定めがない限り、本出願に関連して使用する科学用語および専門用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。さらに、文脈において別段の必要がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。したがって、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈上はっきりと別段の指摘がされない限り、複数形の指示対象を含む。例えば、「タンパク質(a protein)」という言及は複数のタンパク質を含む;「細胞(a cell)」という言及は複数の細胞集団を含む。
アルゴリズム:Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443−453;
比較行列:上記Henikoff et al., 1992のBLOSUM62;
ギャップペナルティ:12(ただし、末端ギャップペナルティなし)
ギャップ長ペナルティ:4
類似性の閾値:0
完全長の免疫グロブリン軽鎖および重鎖では、可変および定常領域は、アミノ酸が約10個多い「D」領域も含む重鎖とアミノ酸約12個以上の「J」領域により結合している。例えば、Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Pressを参照されたい(すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。各軽鎖/重鎖ペアの可変領域は典型的には抗原結合部位を形成する。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//配列番号86を有する。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//配列番号87を有する。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//配列番号88を有する。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//配列番号89を有する。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//配列番号90を有する。
GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS//配列番号91である(「CL−1」と命名)。
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS//配列番号92を有する。
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS//配列番号93を有する。
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS//配列番号94を有する。
(a)配列番号77、配列番号107、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号123、配列番号129、配列番号144、配列番号145、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、もしくは配列番号185のアミノ酸配列を含むか、またはN末端かC末端、もしくは両端のアミノ酸残基が1個、2個、3個、4個もしくは5個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン重鎖;
(b)配列番号105、配列番号109、配列番号121;配列番号125、もしくは配列番号127のアミノ酸配列を含むか、またはN末端もしくはC末端、または両端のアミノ酸残基が1個、2個、3個、4個もしくは5個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン軽鎖;または
(c)(a)の免疫グロブリン重鎖および(b)の免疫グロブリン軽鎖。
(a)配列番号46、配列番号133、配列番号139、配列番号143、配列番号186、もしくは配列番号187、配列番号366、もしくは配列番号367のアミノ酸配列を含むか、またはN末端かC末端、もしくは両端のアミノ酸残基が1個、2個、3個、4個もしくは5個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン重鎖;
(b)配列番号28、配列番号131、配列番号135、配列番号137;もしくは配列番号141のアミノ酸配列を含むか、またはN末端もしくはC末端、または両端のアミノ酸残基が1個、2個、3個、4個もしくは5個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン軽鎖;または
(c)(a)の免疫グロブリン重鎖および(b)の免疫グロブリン軽鎖。
本明細書に提供する各種重鎖および軽鎖可変領域を表2A〜Bに示す。これらの可変領域はそれぞれ上記の重鎖および軽鎖定常領域に結合して、それぞれ完全な抗体重鎖および軽鎖を形成し得る。さらに、このように産生された重鎖および軽鎖配列はそれぞれ結合して完全な抗体構造を形成し得る。本明細書に提供する重鎖および軽鎖可変領域は、上記に列挙した配列例と異なる配列を有する他の定常ドメインに結合することもできることが理解されるべきである。
(a)重鎖可変領域が配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、もしくは配列番号260の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%同一であるアミノ酸配列を含む;または
(b)軽鎖可変領域が配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、もしくは配列番号240の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%同一であるアミノ酸配列を含む;または
(c)(a)の重鎖可変領域および(b)の軽鎖可変領域。
(a)重鎖可変領域が配列番号262、配列番号264、もしくは配列番号266の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%同一であるアミノ酸配列を含む;または
(b)軽鎖可変領域が配列番号242、配列番号244、配列番号246、もしくは配列番号248の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%同一であるアミノ酸配列を含む;または
(c)(a)の重鎖可変領域および(b)の軽鎖可変領域。
本明細書で開示する抗原結合タンパク質は、1つまたは複数のCDR内にグラフト化、挿入/または結合されるポリペプチドである。抗原結合タンパク質は、1、2、3、4、5または6個のCDRを有することができる。したがって抗原結合タンパク質は、例えば、1つの重鎖CDR1(「CDRH1」)、および/または1つの重鎖CDR2(「CDRH2」)、および/または1つの重鎖CDR3(「CDRH3」)、および/または1つの軽鎖CDR1(「CDRL1」)、および/または1つの軽鎖CDR2(「CDRL2」)、および/または1つの軽鎖CDR3(「CDRL3」)を有することができる。一部の抗原結合タンパク質は、CDRH3とCDRL3の両方を含む。具体的な重鎖および軽鎖CDRを、それぞれ表3A〜B(抗DNP)および表3C〜D(抗KLH)に同定する。
(a)CDRH1は配列番号188、配列番号189、配列番号190、もしくは配列番号191のアミノ酸配列を有する;ならびに/または
(b)CDRH2は配列番号192、配列番号193、配列番号194、もしくは配列番号195のアミノ酸配列を有する;ならびに/または
(c)CDRH3は配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、もしくは配列番号201のアミノ酸配列を有する;ならびに/または
(d)CDRL1は配列番号202、配列番号203、配列番号204、もしくは配列番号205のアミノ酸配列を有する;ならびに/または
(e)CDRL2は配列番号206または配列番号207のアミノ酸配列を有する;ならびに/または
(f)CDRL3は配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、もしくは配列番号212のアミノ酸配列を有する。
(a)CDRH1は配列番号213、配列番号214、もしくは配列番号215のアミノ酸配列を有する;ならびに/または
(b)CDRH2は配列番号216、配列番号217、もしくは配列番号218のアミノ酸配列を有する;ならびに/または
(c)CDRH3は配列番号219、配列番号220、もしくは配列番号221のアミノ酸配列を有する;ならびに/または
(d)CDRL1は配列番号204、配列番号222、配列番号223、もしくは配列番号224のアミノ酸配列を有する;ならびに/または
(e)CDRL2は配列番号206、配列番号225、もしくは配列番号226のアミノ酸配列を有する;ならびに/または
(f)CDRL3は配列番号227、配列番号228、配列番号229、もしくは配列番号230のアミノ酸配列を有する。
HGEGTFTSDQSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG//(配列番号290);
HGEGTFTSDQSSYLEGQAAKEFIAWLQKGRG//(配列番号291);
HGEGTFTSDVSSYQEGQAAKEFIAWLVKGRG//(配列番号292);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAQLVKGRG//(配列番号293);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAQLQKGRG//(配列番号294);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLQKGRG//(配列番号295);
HNETTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG//(配列番号296)
HGEGTFTSDVSSYLENQTAKEFIAWLVKGRG//(配列番号297);
HGEGTFTSDVSSYLEGNATKEFIAWLVKGRG//(配列番号298);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVNGTG//(配列番号299);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKNRT//(配列番号300);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRNGT//(配列番号301);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGTGNGT//(配列番号302);ならびに
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGNGT//(配列番号303)。
ポリクローナル抗体。ポリクローナル抗体は、好ましくは関連抗原およびアジュバントの複数回皮下(sc)または腹腔内(ip)注射した動物において増加する。あるいは、抗原は動物のリンパ節内に直接注射し得る(Kilpatrick et al., Hybridoma, 16:381−389, 1997を参照されたい)。二機能性薬剤または誘導化剤、例えば、マレイミドベンジルスルホコハク酸イミドエステル(システイン残基を介した接合)、N−ヒドロキシコハク酸イミド(リジン残基を介して)、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物または当技術分野において知られている他の薬剤を用いて、免疫化対象種において免疫原性であるタンパク質(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビター)に関連抗原を接合することにより、改善された抗体反応が得られ得る。
(a)ハイブリドーマにより抗原結合タンパク質を発現させる条件下の培養基でハイブリドーマを培養すること;ならびに
(b)培養基から抗原結合タンパク質を回収することであり、これは既知の抗体精製技術(これに限定されないが、本明細書の実施例1に開示のモノクローナル抗体精製技術など)により成し遂げることができる。
ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGTGCGCGCTGT//配列番号102、これはVK−1シグナルペプチド配列MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC//配列番号103をコードする)、複製起点、1つもしくは複数の選択的マーカー遺伝子(例えば、抗生剤もしくは他の薬剤耐性、相補性栄養要求欠陥を付与し得るか、または培地中で入手不能な重要栄養剤を補給し得る)、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終止配列であり、これらはすべて当技術分野において周知である。
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリー作製のための技術開発および線維状バクテリオファージ表面上のコードされた抗体断片のディスプレイにより、ヒト由来抗体を生成する別の手順が提供されている。ファージディスプレイについては、例えば、Dower et al.、WO91/17271号、McCafferty et al.、WO92/01047号、およびCaton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450−6454 (1990)(これらはそれぞれ参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている。ファージ技術により産生された抗体は、通常、抗原結合断片(例えばFvまたはFab断片)として細菌内に産生されるため、エフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、2つの戦略の1つにより導入できる:断片は、哺乳類細胞内における発現のために完全な抗体内か、またはエフェクター機能を惹起できる第二結合部位を有する二重特異性抗体断片内のいずれかに加工できる。
上記のとおり、抗体断片はインタクトな完全長抗体の一部、好ましくはインタクト抗体の抗原結合領域もしくは可変領域を含み、抗体断片から形成される線状抗体および多重特異性抗体を含む。限定されない抗体断片の例としては、抗体が所望の生体活性を保持する限り、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、ドメイン抗体(dAb)、相補性決定領域(CDR)断片、単鎖抗体(scFv)、単鎖抗体断片、マキシボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、線状抗体、キレート化組換え抗体、トリボディまたはバイボディ、細胞内抗体、ナノボディ、小モジュール免疫薬剤(SMIP)、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、VHHを含む抗体、またはそれらの変異タンパク質もしくは誘導体、ならびにポリペプチドへ結合する特異的抗原を付与する上で十分な免疫グロブリンを少なくとも一部含むポリペプチド(CDR配列など)が挙げられる。かかる抗原断片は、完全抗体の修飾により産生してもよいし、組換えDNA技術またはペプチド合成を用いてde novo合成してもよい。
いくつかの実施形態では、多価またはさらには多重特異性(例えば二重特異性、三重特異性など)モノクローナル抗体を産生することが望ましい場合がある。かかる抗体は、標的抗原の少なくとも2つの異なるエピトープに対して特異的に結合し得るか、あるいは2つの異なる分子、例えば標的抗原と細胞表面タンパク質または受容体に結合し得る。例えば、二重特異性抗体は、細胞防御機序を標的発現細胞に集中させるために、標的に結合する腕と、(T細胞受容体分子(例えば、CD2またはCD3)などの白血球上の引き金分子、またはIgGのためのFc受容体(FcγR)、例えばFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)およびFcγRIII(CD16)に結合する別の腕を含み得る。別の例では、二重特異性抗体を、標的抗原を発現する細胞に細胞障害性薬を局在化させるために用いてよい。これらの抗体は、標的結合腕と細胞障害性薬(例えば、サポリン、抗インターフェロン60、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン)に結合する腕を有する。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製できる。
発明の抗原結合タンパク質は、ペプチボディも含む。「ペプチボディ」という用語は、少なくとも1つのペプチドに結合した抗体Fcドメインを含む分子を指す。ペプチボディの産生については、PCT公開WO00/24782号(2000年5月4日公開)に一般的に記載されている。これらのペプチドはいずれも、リンカーを伴いまたは伴わず、直列で(すなわち、連続的に)結合し得る。システイニル残基を含むペプチドは、別のCys含有ペプチドと架橋し得、この片方または両方がビヒクルに結合し得る。同様に、複数のCys残基を有するペプチドはいずれも、ペプチド間でジスルフィド結合を形成し得る。これらのペプチドはいずれも誘導体化し得、例えばカルボキシル末端はアミノ基とキャッピングし得、システインはキャッピングし得、またはアミノ酸残基はアミノ酸残基以外の部分により置換し得る(例えば、Bhatnagar et al., J. Med. Chem. 39: 3814−9 (1996), and Cuthbertson et al., J. Med. Chem. 40: 2876−82 (1997)を参照されたく、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。ペプチド配列は至適化し得、抗体の親和性成熟に類似しているか、あるいはアラニンスキャニングまたは無作為もしくは部位指向変異により改変され、続くスクリーニングにより最高の結合剤が同定される。Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401−24 (1997)。抗原結合タンパク質の所望の活性を維持しつつ、各種分子を抗原結合タンパク質構造、例えば、抗原結合タンパク質のペプチド部分自体内またはペプチドとビヒクル部分の間に挿入できる。例えば、Fcドメインもしくはその断片、ポリエチレングリコールなどの分子、またはデキストラン、脂肪酸、脂質、コレステロール基、小さな炭水化物、ペプチド、本明細書に記載の検出可能な部分(蛍光剤、放射同位体などの放射標識を含む)、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、干渉(または他の)RNA、酵素、ホルモンなどの他の関連分子を容易に挿入できる。この方法での挿入に適した他の分子は当業者に理解されており、本発明の範囲内に包含される。これは、例えば、任意選択的に適切なリンカーにより結合した2つの連続したアミノ酸間へ所望の分子を挿入することを含む。
(Gly)3Lys(Gly)4(配列番号159);
(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(配列番号156);
(Gly)3Cys(Gly)4(配列番号157);ならびに
GlyProAsnGlyGly(配列番号158)。
GGEGGG(配列番号160);
GGEEEGGG(配列番号161);
GEEEG(配列番号162);
GEEE(配列番号163);
GGDGGG(配列番号164);
GGDDDGG(配列番号165);
GDDDG(配列番号166);
GDDD(配列番号167);
GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS(配列番号168);
WEWEW(配列番号169);
FEFEF(配列番号170);
EEEWWW(配列番号171);
EEEFFF(配列番号172);
WWEEEWW(配列番号173);または
FFEEEFF(配列番号174)。
1)疎水性:ノルロイシン(NorまたはNle)、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
2)中性で親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
3)酸性:Asp、Glu;
4)塩基性:His、Lys、Arg;
5)鎖の方向に影響を与える残基:Gly、Pro;ならびに
6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
例えば、抗原結合タンパク質へ結合した1つもしくは複数の炭水化物部分の添加もしくは欠失、ならびに/または抗原結合タンパク質における1つもしくは複数のグリコシル化部位の添加もしくは欠失により、親ポリペプチドと比較して修飾グリコシル化パターンを有する抗原結合タンパク質変異体も産生できる。
システイン残基(1つまたは複数)は、抗体またはFc含有ポリペプチドのFc領域で除去または誘発され得、その結果、この領域で鎖間ジスルフィド結合形態を除去または増加する。そのように産生されたホモ二量体抗原結合タンパク質は内部移行能力を改善しならびに/または相補性媒介性細胞殺傷および抗体依存性細胞傷害(ADCC)を増大し得る。Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191−1195 (1992) and Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918−2922 (1992)を参照されたい。ホモ二量体抗原結合タンパク質または抗体は、Wolff et al., Cancer Research 53: 2560−2565 (1993)に記載のヘテロ二機能性交差リンカーを用いることによっても調製し得る。あるいは、二重Fc領域を有する抗原結合タンパク質を加工でき、その結果、高まった相補性溶解およびADCC能力を有し得る。Stevenson et al., Anti−CancerDrug Design 3: 219−230 (1989)を参照されたい。
抗DNPまたは抗KLH抗原結合タンパク質の他の特定の共有結合修飾も本発明の範囲内に含まれる。それらは、妥当な場合、抗原結合タンパク質または抗体の化学合成によりまたは酵素もしくは化学切断により作製し得る。他のタイプの共有結合修飾は、選択された側鎖またはN末端残基もしくはC末端残基と反応できる有機誘導化剤と標的アミノ酸残基を反応させることにより導入できる。
本発明の別の態様は、本発明の抗原結合タンパク質をコードする単離核酸、例えばこれらに限定されないが、本発明の抗体または抗体断片をコードする単離核酸などである。かかる核酸は、当技術分野において知られているおよび/または本明細書に開示する組換え技術により作製される。
(a)CDRH1は配列番号188、配列番号189、配列番号190、もしくは配列番号191のアミノ酸配列を含む;
(b)CDRH2は配列番号192、配列番号193、配列番号194、もしくは配列番号195のアミノ酸配列を含む;ならびに
(c)CDRH3は配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、もしくは配列番号201のアミノ酸配列を含む。
(a)CDRL1は配列番号202、配列番号203、配列番号204、もしくは配列番号205のアミノ酸配列を含む;
(b)CDRL2は配列番号206もしくは配列番号207のアミノ酸配列を含む;ならびに
(c)CDRL3は配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、もしくは配列番号212のアミノ酸配列を含む。
(a)CDRH1は配列番号213、配列番号214、もしくは配列番号215のアミノ酸配列を含む;
(b)CDRH2は配列番号216、配列番号217、もしくは配列番号218のアミノ酸配列を含む;ならびに
(c)CDRH3は配列番号219、配列番号220、もしくは配列番号221のアミノ酸配列を含む。
(a)CDRL1は配列番号204、配列番号222、配列番号223、もしくは配列番号224のアミノ酸配列を含む;
(b)CDRL2は配列番号206、配列番号225、もしくは配列番号226のアミノ酸配列を含む;ならびに
(c)CDRL3は配列番号227、配列番号228、配列番号229、もしくは配列番号230のアミノ酸配列を含む。
(a)発現ベクターによりコードされた抗原結合タンパク質を発現させる条件下の培養基で宿主細胞を培養すること;ならびに
(b)培養基から抗原結合タンパク質を回収すること。抗原結合タンパク質の回収は、抗体の既知の精製方法(これらに限定されないが、本明細書の実施例1および他の箇所に開示の抗体精製技術など)により成し遂げられる。
適切な細胞への治療抗原結合タンパク質の送達は、当技術分野において知られている任意の適切なアプローチを用いてエクスビボ、原位置、またはインビボ遺伝子療法を介してもたらすことができる。例えば、インビボ療法において、所望の抗原結合タンパク質もしくは抗体をコードする核酸を、単独またはベクター、リポソーム、もしくは沈殿物と連結するかのいずれかで対象に直接注射し得、いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質化合物の発現が望ましい部位で注射し得る。エクスビボ処置において、対象の細胞を除去し、これらの細胞内に核酸を導入し、直接または、例えば、患者に移植する多孔膜に被包するかのいずれかで修飾細胞を対象に戻す。例えば米国特許第4,892,538号および同第5,283,187号を参照されたい。
本発明の方法の実践に用いられる抗DNPまたは抗KLH抗原結合タンパク質または抗体は所望の送達方法に適した担体を含む医薬組成物および薬剤に製剤化し得る。適切な担体は、抗DNPまたは抗KLH抗原結合タンパク質または抗体と組み合わせた場合、それぞれDNPまたはKLHの高親和性結合を保持し、対象の免疫系と反応しない任意の物質を含む。例としては、滅菌リン酸緩衝生理食塩水、静菌水などの任意のいくつかの標準的な医薬担体が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、水、緩衝水、0.4%生理食塩水、0.3%グリシンなどの各種水性担体を用いてよく、軽度化学修飾などに供するアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの安定性向上のための他のタンパク質を含み得る。
免疫化。XenoMouse(商標)マウスをDNP−KLHにより4週間免疫化して抗DNP抗体を生成し、DNP−リジンに結合する抗体をスクリーニングした。より詳細には、国際特許第WO98/24893号、およびWO00/76310号(これらの開示はすべて、参照により本明細書に組み込まれる)に開示の方法に従い、XenoMouse(登録商標)のXMG2系統の初回免疫化のため、既に記載されている(Mendez et al., Nat. Genet. 15:146−156 (1997);国際特許第WO98/24893号、およびWO00/76310号公開、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)ようにマウスのXenoMouse(商標)XMG2系統を一般に生成し、TiterMax Goldアジュバント(Sigma−Aldrich, Oakville, Ontario)中で乳化した免疫原(マウス1匹当たり10〜30μgの範囲)を用いて、2,4−ジニトロフェニル−キーホールリンペットヘモシアニン(DNP−KLH conjugate; BioSearch Technologies, Novato, CA)で免疫化した。初回免疫化後、続く免疫原(マウス1匹当たり5〜20μg)ブーストをマウスにおいて適切な抗DNP価を導入するために必要なスケジュールおよび期間で投与した。固定化したDNP−BSA(BioSearch Technologies, Novato, CA)を用いた酵素免疫アッセイにより力価を決定し、最終DNP:BSAモル比が30:1であるようにこの結合体を調製した。
5’RACEとして知られているポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅技術(cDNA末端の急速な増幅)により、XenoMouse配列由来のヒト抗KLH抗体を得た。TRIzol試薬(Invitrogen)を用いて、KLH結合モノクローナル抗体を発現する3つのハイブリドーマ;16.3.1、108.1.2および120.6から総RNAを単離してから、RNeasy Miniキット(Qiagen)を用いてさらに精製した。混合した無作為およびオリゴ−dTプライマー第一鎖、RACE ready cDNAをGeneRacerキット(Invitrogen)を用いて調製した。順行プライマー、GeneRacer(登録商標)ネステッドプライマーを用いたAdvantage HF2 DNAポリメラーゼ(Clontech)でcDNAのPCR増幅を実施した:
5’−GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA−3’//(配列番号271);ならびに逆行プライマー:
軽鎖において5’−CTC CTG GGA GTT ACC CGA TTG−3’//(配列番号272)、および重鎖において5’−GAT GGG CCC TTG GTG GAG GCT GAG GAG ACG GTG ACC GTG G−3’//(配列番号273)。PCR反応サイクルは94℃で30秒のcDNA変性からなり、94℃で20秒間;55℃で30秒間;ならびに72℃で90秒間からなる各サイクルの増幅の3サイクル+94℃で20秒間;65℃で30秒間;ならびに72℃で90秒間からなる追加の27サイクルが続く。次いで反応物を72℃で7分間インキュベートして、最終PCRサイクルが続いて完全な延長部を保証する。RACE PCR生成物をpCR4−TOPO(Invitrogen)内にクローン化して、ABI DNA配列決定機器(Perkin Elmer)を用いてそれらの配列を決定した。ベクターNTI 8.0ソフトウェア(Invitrogen)を用いてコンセンサス配列を決定し、完全長抗体鎖PCR増幅プライマーを設計するために用いられる。
5’−AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAC ATG AGG−3’//(配列番号274)であり、およびカルボキシル末端をコードした3’プライマーおよび終止コドン、ならびにNotI制限部位は:
5’−AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAA CAC TCT CCC CTG TTG AA−3’//(配列番号275)であった。
5’−AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAA TTG GGA CTG AG−3’//(配列番号276)であり、カルボキシル末端をコードした3’プライマーおよび終止コドン、ならびにNotI制限部位は:
5’−AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GA−3’//(配列番号277)であった。
5’ TTT TTT TTG CGC GCT GTG ACA TCC AGA TGA CCC AGT C 3’//(配列番号278)、
および3’プライマー 5’ AAA AAA CGT ACG TTT GAT ATC CAC TTT GGT CC 3’//(配列番号279)。
5’ CTG TGT ATT ACT GTG CGA GGT ATA ACT TCA ACT ACG GTA TGG ACG TCT GG 3’//(配列番号280)および(−)鎖プライマー:
5’ CCA GAC GTC CAT ACC GTA GTT GAA GTT ATA CCT CGC ACA GTA ATA CAC AG 3’//(配列番号281)を用いたPCRによりフェニルアラニンに変異し、
重鎖5末端プライマー
5’ AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GGG CT 3’//(配列番号284)および重鎖3’プライマー:
5’ AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GA 3’//(配列番号285)と連結している(+)鎖プライマー:
5’ CTG TGT ATT ACT GTG CGA GGT ATA ACT ACA ACT ACG GTA TGG ACG TCT GG 3’//(配列番号282)および(−)鎖プライマー:
5’ CCA GAC GTC CAT ACC GTA GTT GTA GTT ATA CCT CGC ACA GTA ATA CAC AG 3’//(配列番号283)を用いたPCRによりチロシンに変異した。また、3A4 IgG2重鎖のヒンジ領域のジスルフィドスクランブリングを減らすため、例として、ヒンジシステイン219および220(EU番号付け)を
重鎖5末端プライマー:
5’ AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GGG CT 3’//(配列番号288)および重鎖3’プライマー:
5’ AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GA 3’//(配列番号289)と連結している(+)鎖プライマー:
5’ GGA CAA GAC AGT TGA GCG CAA ATC TTC TGT CGA GTG CCC ACC GTG CCC AG 3’//(配列番号286)および(−)鎖プライマー:
5’ CTG GGC ACG GTG GGC ACT CGA CAG AAG ATT TGC GCT CAA CTG TCT TGT CC 3’//(配列番号287)を用いたPCRにより変異させた。
3B1、3H4、3C2、3A1および3A4抗体の生成物品質を、還元負荷緩衝液を用いて1.0mmトリス−グリシン4〜20%SDS−PAGE(Novex)上で分析した(図11)。aDNP3H4抗体が安定した細胞系から不均一な生成物を産生したというこれらのデータから、aDNP3H4抗体は担体抗体として良好な候補ではなかったことが示された(均一生成物が望ましいため)。aDNP3A1、3A4、3C2、および3B1ならびにaKLH120.6抗体の生成物品質を、非還元負荷緩衝液を用いて1.0mmトリス−グリシン4〜20%SDS−PAGE(Novex)上で分析した(図12A〜B)。aDNP3C2抗体は例外的な高分子質量物質を伴う不均一生成物を産生し、これは担体抗体として理想的な候補ではないことが示された(高分子質量物質が含まれる生成物は望ましくないため)。加えて、aDNP3B1抗体は、これらの条件下で二重線を示した。次いで、トリス−グリシンSDS−PAGEならびにビス−トリスNuPAGE系の両方を用いて、非還元条件下でaDNP3B1抗体とaDNP3A1抗体を比較した(図13A〜B)。aDNP3B1抗体では、トリス−グリシンSDS−PAGE上のaDNP3A1では観察されなかった二重線がはっきりと生じることが見出された;しかしながら、ビス−トリスNuPAGEにより分析した場合、aDNP3B1抗体はaDNP3A1抗体よりも均一であると考えられ、二重線は分析法のアーチファクトであり得ることが示された。aDNP3B1抗体を室温、85℃、または100℃で非還元試料緩衝液で処置後にトリス−グリシンSDS−PAGEにより分析した場合、二重線は除去されなかった(図14A)。しかしながら、aDNP3B1抗体を通常の0.1%ではなく0.4%SDSゲルの流れる緩衝液を用いてトリス−グリシンSDS−PAGEにより評価した際、二重線は激減し(図14B)、二重線は分析系のアーチファクトであったというさらなる証拠が得られた。
aDNP3A4−F、aDNP3A4−FSSおよびaDNP3B1抗体の薬物動態プロファイルについて、成体Sprague−Dawleyラット(8〜12週齢)に5mg/kgを皮下注射し、投与から0、0.25、1、4、24、48、72、96、168、336、504、672、840および1008時間後に側面尾静脈から血液約250μLをMicrotainer(商標)血清分離管に採取して決定した(図22)。各試料を採取後に室温で維持し、30〜40分凝固させた後に、目盛り付きEppendorf 5417R遠心分離系(Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, NY)を用いて試料を2〜8℃、11,500rpmで約10分間遠心分離した。次いで採取した血清を分析のために(各ラットにおいて)前標識した低温貯蔵管内に移して、−60℃〜−80℃で保存した。PK試験試料から血清試料濃度を測定するため、以下の方法を用いた:2分の1部分黒プレート(Corning3694)を2μg/mLの抗hu FC、Ab1.35.1の1×PBS溶液でコーティングしてから4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、I−Block(登録商標)(Applied Biosystems)で4℃で一晩ブロックした。試料を希釈する必要があった場合は、ラットSD血清で希釈した。標準および試料をI−Block(登録商標)+5%BSAで1:20希釈し380μLの希釈緩衝液とした。プレートを洗浄し、前処置した標準の50μL試料および各試料をAb1.35.1コーティングプレートに移して室温で1.5時間インキュベートした。プレートを洗浄してから、抗hu FC Ab21.1−HRP結合体のI−Block(登録商標)+5%BSA 100ng/mLを50μL添加し、1.5時間インキュベートした。プレートを洗浄してから、ピコ基質50μLを添加後、プレートを照度計で直ちに分析した。すべての抗体の薬物動態プロファイルが良好であったが、aDNP3B1が最高の全体プロファイルを示した。
概して、ヒト使用のためのモノクローナル抗体生成物の製造および検査における考慮点(Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use)(U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administraton, Center for Biologics Evaluation and Research (1997))におけるガイダンスに従い、発明の抗体の各種ヒト組織との交差反応を決定する非GLP予備試験を実施した。抗体による薬剤発現が意図される場合、GLP条件下のより広範な検査が必要である。抗体DNP 3A4−FおよびaKLH120.6の組織交差反応を、試験物質のAlexa Fluor 488標識形態を用いて選択されたヒト組織の凍結切片で検討した(Charles River Laboratories, Preclinical Services, Reno, NV)。(別段の指定のない限り)互いに依存しない2人の正常ヒト組織をSpecial Pathology Services Human Tissue Bank collected by the National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA)、Cureline, Inc. (Burlingame, CA)、Cybrdi (Rockville, MD)、またはRocky Mountain Lions Eye Bank (Aurora, CO)から得た。試験組織は、ヒト小脳、肺、大脳皮質、卵巣(成熟女性由来)、眼部、胎座、消化管(小腸)、皮膚(1人)、心臓、脾臓、腎臓(1人)、甲状腺、肝臓、精巣を含む。新しい凍結ヒト組織切片および対照ビーズブロック(DNP[31]−ウシ血清アルブミン[BSA]ビーズ[陽性]、およびヒト血清アルブミン[HSA]ビーズ[陰性])を冷却器上で切断し、キャピラリーギャップスライド上に乗せて解凍した。組織および対照ビーズのスライドを冷却アセトン中で−10℃〜−25℃で約10分間固定した。固定スライドを少なくとも1時間(〜一晩)乾燥させた。凍結保存の場合、実験の前日に固定スライドを凍結器から除去して使用前に一晩解凍させた。以降の工程はすべて別段の定めがない限り室温で実施した。スライドを1×Morphosave(登録商標)で約15分間インキュベートして組織形態を保持してから、1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回、それぞれ約5分間洗浄した。内因性ペルオキシダーゼをブロックするため、スライドをグルコースオキシダーゼ溶液中で約37℃で約1時間インキュベートした。スライドを1×PBSで2回、それぞれ約5分間洗浄した。内因性ビオチンをアビジンおよびビオチン溶液中の逐次インキュベーション(それぞれ約15分間)によりブロックした。ビオチン内でインキュベーション後、組織切片をブロック抗体溶液で約25分間ブロックした。Alexa Fluor 488−Ab3A4 W101F(抗DNP)、およびAlexa Fluor 488抗KLH(抗KLH Ab)を至適濃度(2.0μg/mL)または至適濃度の5倍(10.0μg/mL)で切片に約25分間適用した。スライドを洗浄緩衝液で3回洗浄してから、二次抗体(ウサギ抗Alexa Fluor 488)で約25分間インキュベートした。二次抗体でインキュベーション後、スライドを洗浄緩衝液で4回洗浄してから、三次抗体(セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG抗体)で約25分間インキュベートし、ジアミノ酪酸(DAB)色素原基質で結合を視覚化した。すべての実験においてDNP(31)−BSAビーズを陽性対照として用いた。HSAビーズを陰性対照として用いた。CD31に対する抗体(抗CD31)、すなわち、血小板内皮細胞接着分子(PECAM−1)染色を介して免疫組織化学に妥当な組織を適格とした。任意の試験抗体の2.0または10.0μg/mL濃度のいずれかで評価したいずれのヒト組織においても特定の染色はなかった。
本発明の例示的な実施形態を含み、一種別の1価、2価および3価構造を比較のために発現させて精製した。それらには、aKLH IgG2/Fc−ShK変異体(図1E:「ヘミボディ」配置の図解を参照されたい)、および抗KLH IgG2−ShK変異体(図1F〜Lを参照されたい)が含まれる。例えば、2価Fc−L10−ShK[1−35]、1価抗キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)免疫グロブリン重鎖−[Lys16]ShK融合抗体(「aKLH HC−[Lys16]ShK Ab」と命名;図1Fを参照されたい)、および1価抗KLH免疫グロブリン軽鎖−[Lys16]ShK抗体(「aKLH LC−[Lys16]ShK Ab」と命名;図1Jを参照されたい)。IgG2 Fc/Fc−ShK変異体(図1Aを参照されたい)、2価Fc−L10−ShK[2−35]、1価Fc/Fc−L10−ShK[2−35]を比較のため、Sullivan et al.、WO2008/088422A2号、特に実施例1、2、および56(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載の、または本明細書に修正されるように組換え方法により作製した。
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSERKVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//(配列番号1)は、標準的なPCR技術を用いて、Kv1.3阻害剤ペプチドShK[2−35]の単量体にインフレーム融合させたかまたは変異ShK[2−35、Q16K]を構築した。PCR反応においてpcDNA3.1(+)CMVi内の元のFc−2×L−ShK[2−35]を鋳型として用いて、ShK[2−35]もしくはShK[2−35、Q16K]および分子の10個のアミノ酸リンカー部分を生成した(Sullivan et al.、WO2008/088422A2号の実施例2、図15A〜Bを参照されたい)。PCR反応においてpcDNA3.1(+)CMVi内の元のFc−2×L−ShK[1−35]を鋳型として用いてShK[1−35]を生成した(Sullivan et al.、WO2008/088422A2号の実施例1、図14A〜B)。これらのShK構築物は、
以下のオリゴ:
5’−CAT GAA TTC CCC ACC ATG GAA TGG AGC TGG−3’(配列番号3);および
5’−CA CGG TGG GCA CTC GAC TTT GCG CTC GGA GTG GAC ACC−3’(配列番号4)
を有するpSelexis−Vh21−hIgG2−Fc鋳型から産生した修飾VH21シグナルペプチドのアミノ酸配列MEWSWVFLFFLSVTTGVHSERKVECPPCP//配列番号2を有する。
GGGGSGGGGSSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//配列番号6)を有する野生型ShK[2−35]を:
GGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGAAGCAGCTGCATCGACACCATCCCCAAGAGCCGCTGCACCGCCTTCCAGTGCAAGCACAGCATGAAGTACCGCCTGAGCTTCTGCCGCAAGACCTGCGGCACCTGC//(配列番号5)のDNA配列によりコードした。このコード配列(配列番号5)を含む断片を、以下のオリゴ(配列番号7および配列番号8)を用いて、ならびにpcDNA3.1(+)CMVi中の元のFc−L10−ShK[2−35]を鋳型として用いて生成した(参照により組み込まれるSullivan et al.、WO2008/088422A2号の実施例2、図15A〜B):
5’−GTC CAC TCC GAG CGC AAA GTC GAG TGC CCA CCG TGC C−3’(配列番号7);および
5’−TCC TCC TCC TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG−3’//(配列番号8)。
5’−GCT GCA CCG CCT TCA AGT GCA AGC ACA GC 3’(配列番号9);および
5’−GCT GTG CTT GCA CTT GAA GGC GGT GCA GC−3’(配列番号10);であり、pcDNA3.1(+)CMVi中の元のFc−L10−ShK[2−35]を鋳型として用いて、DNAコード配列
GGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGAAGCAGCTGCATCGACACCATCCCCAAGAGCCGCTGCACCGCCTTCAAGTGCAAGCACAGCATGAAGTACCGCCTGAGCTTCTGCCGCAAGACCTGCGGCACCTGC//(配列番号11)を生成し、これはN末端リンカー伸張部分:GGGGSGGGGSSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//配列番号12)を有するShk(2−35、K16)アミノ酸配列をコードする(Sullivan et al.、WO2008/088422A2号の実施例2、図15A〜B)。
5’−GTC CAC TCC GAG CGC AAA GTC GAG TGC CCA CCG TGC C−3’(配列番号7);および
5’−TCC TCC TCC TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG−3’(配列番号8)
を用いてShK[1−35]WT断片を生成した(Sullivan et al.、WO2008/088422A2号の実施例1、図14A〜B)。
5’−CAT GCG GCC GCT CAT TAG CAG GTG−3’(配列番号14)のオリゴを用いて、ならびにpSelexis Vh21−hIgG2−Fc鋳型を用いてIgG2Fc領域を生成し、アミノ酸配列
APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK配列番号16)をコードするコード配列:
GCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA//配列番号15を含むDNA断片を得た。
5’−CAT GAA TTC CCC ACC ATG GAA TGG AGC TGG−3’(配列番号3);および
5’−CAT GCG GCC GCT CAT TAG CAG GTG−3’(配列番号14)
と一緒に縫い合わせた。
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSERKVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号17)をコードした。
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSERKVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//配列番号18をコードした;
また、pTT14−VH21SP−IgG2−Fc ShK1−35構築物には、以下の配列:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSERKVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号19)
を有するIgG2 Fc−L10−ShK(1−35)融合ポリペプチドのためのコード配列が含まれた。
5’−CAT AAG CTT CCC ACC ATG GAA TGG AGC TGG−3’(配列番号20);および
5’−CA CGG TGG GCA CTC GAC TTT GCG CTC GGA GTG GAC ACC−3’(配列番号4)を用いて、ならびに上記pSelexis鋳型を用いてVH21シグナルペプチドを生成した。
5’−GTC CAC TCC GAG CGC AAA GTC GAG TGC CCA CCG TGC C−3’(配列番号7);および
5’−CAT GGA TCC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA G−3’(配列番号21)
を用いてFc領域を生成した。
GGATCCGGAGGAGGAGGAAGCCGCAGCTGCATCGACACCATCCCCAAGAGCCGCTGCACCGCCTTCAAGTGCAAGCACAGCATGAAGTACCGCCTGAGCTTCTGCCGCAAGACCTGCGGCACCTGCTAATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCC//(配列番号22)
を含む断片をBamHI/BamHIを用いて切断した。このコード配列(配列番号23)はN末端リンカー配列:
GSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号23)を有するShK(1−35、Q16K)をコードする。
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSERKVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGG//(配列番号25)をコードするコード配列
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCGAGCGCAAAGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGAGGAGGA//(配列番号24)を得た。
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSERKVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号26)をコードした。
(a)N末端VK−1SPシグナルペプチド配列(配列番号103)を組み入れるaKLH120.6κLC(以下の配列番号28):
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC//(配列番号28);
(b)N末端VK−1SPシグナルペプチド配列(配列番号103)を組み入れるaKLH120.6IgG2 HC(以下の配列番号29):
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//(配列番号29);
および、
(c)IgG2 Fc−L10−ShK(1−35):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSERKVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号30)。
aKLH120.6IgG2−ShK融合抗体の成分(図1Fに図解)は以下の単量体を含有した。
(a)aKLH120.6κLC(上記の配列番号28);
(b)aKLH120.6IgG2 HC(上記の配列番号29);および
(c)以下のHC配列を有するaKLH120.6IgG2−ShK融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号31)。
(a)aKLH120.6κLC(上記の配列番号28);
(b)aKLH120.6IgG2 HC(上記の配列番号29);および
(c)以下の配列を有するaKLH120.6IgG2−ShK[1−35、Q16K]融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号32)。
(a)aKLH120.6κLC(配列番号28);
(b)aKLH120.6IgG2 HC(配列番号29);および
(c)以下のアミノ酸配列を有するaKLH120.6IgG2 HC−ShK[1−35、R1A、I4A、Q16K]融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSASCADTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号304)。
所望の1価aKLH120.6IgG2 HC−ShKアナログ生成物は1本の重鎖のC末端に融合したShKペプチドを有する完全抗体であった。1種類の軽鎖を共有する2つの異なる重鎖を含み、重鎖:軽鎖:重鎖−ShKの比率は1:2:1であった。予期した発現生成物はaKLH120.6IgG2抗体、1価aKLH120.6IgG2 HC−ShKペプチドアナログ、および2価aKLH120.6IgG2 HC−ShKペプチドアナログである。本明細書に記載のとおり、抗体を含む1価aKLH120.6IgG2 HC毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
(a)aKLH120.6κLC(配列番号28);
(b)aKLH120.6IgG2 HC(配列番号29);および
(c)以下の配列を有するaKLH120.6IgG2−ShK[1−35、R1A、Q16K、K30E]融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSASCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRETCGTC//(配列番号305)。
所望の1価aKLH120.6IgG2 HC−ShKアナログ生成物は1本の重鎖のC末端に融合したShKペプチドを有する完全抗体であった。1種類の軽鎖を共有する2つの異なる重鎖を含み、重鎖:軽鎖:重鎖−ShKの比率は1:2:1であった。予期した発現生成物は、aKLH120.6IgG2抗体、1価aKLH120.6IgG2 HC−ShKペプチドアナログ、および2価aKLH120.6IgG2 HC−ShKペプチドアナログである。本明細書に記載のとおり、抗体を含む1価aKLH120.6IgG2 HC毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
(a)aKLH120.6κLC(配列番号28);
(b)aKLH120.6IgG2 HC(配列番号29);および
(c)以下のアミノ酸配列を有するaKLH120.6HC IgG2−ShK[1−35、R1H、I4A、Q16K]融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSHSCADTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号306)。
所望の1価aKLH120.6IgG2 HC−ShKアナログ生成物は1本の重鎖のC末端に融合したShKペプチドを有する完全抗体であった。1種類の軽鎖を共有する2つの異なる重鎖を含み、重鎖:軽鎖:重鎖−ShKの比率は1:2:1であった。予期した発現生成物は、aKLH120.6IgG2抗体、1価aKLH120.6IgG2 HC−ShKペプチドアナログ、および2価aKLH120.6IgG2 HC−ShKペプチドアナログである。本明細書に記載のとおり、抗体を含む1価aKLH120.6IgG2 HC毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
(a)aKLH120.6κLC(配列番号28);
(b)aKLH120.6IgG2 HC(配列番号29);および
(c)以下の配列を有するaKLH120.6IgG2−ShK[1−35、R1H、Q16K、K30E]融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSHSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRETCGTC//(配列番号307)。
所望の1価aKLH120.6IgG2 HC−ShKアナログ生成物は1本の重鎖のC末端に融合したShKペプチドを有する完全抗体であった。1種類の軽鎖を共有する2つの異なる重鎖を含み、重鎖:軽鎖:重鎖−ShKの比率は1:2:1であった。予期した発現生成物は、aKLH120.6IgG2抗体、1価aKLH120.6IgG2 HC−ShKペプチドアナログ、および2価aKLH120.6IgG2 HC−ShKペプチドアナログである。本明細書に記載のとおり、抗体を含む1価aKLH120.6IgG2 HC毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
(a)aKLH120.6κLC(配列番号28);
(b)aKLH120.6IgG2 HC(配列番号29);および
(c)以下の配列を有するaKLH120.6HC(IgG2)−ShK[1−35、R1K、I4A、Q16K]融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSKSCADTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号308)。
所望の1価aKLH120.6IgG2 HC−ShKアナログ生成物は1本の重鎖のC末端に融合したShKペプチドを有する完全抗体であった。1種類の軽鎖を共有する2つの異なる重鎖を含み、重鎖:軽鎖:重鎖−ShKの比率は1:2:1であった。予期した発現生成物は、aKLH120.6IgG2抗体、1価aKLH120.6IgG2 HC−ShKペプチドアナログ、および2価aKLH120.6IgG2 HC−ShKペプチドアナログである。本明細書に記載のとおり、抗体を含む1価aKLH120.6IgG2 HC毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
(a)aKLH120.6κLC(配列番号28);
(b)aKLH120.6IgG2 HC(配列番号29);および
(c)以下のアミノ酸配列を有するaKLH120.6IgG2−ShK[1−35、R1K、Q16K、K30E]融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSKSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRETCGTC//(配列番号309)。
所望の1価aKLH120.6IgG2 HC−ShKアナログ生成物は1本の重鎖のC末端に融合したShKペプチドを有する完全抗体であった。1種類の軽鎖を共有する2つの異なる重鎖を含み、重鎖:軽鎖:重鎖−ShKの比率は1:2:1であった。予期した発現生成物は、aKLH120.6IgG2抗体、1価aKLH120.6IgG2 HC−ShKペプチドアナログ、および2価aKLH120.6IgG2 HC−ShKペプチドアナログである。本明細書に記載のとおり、抗体を含む1価aKLH120.6IgG2 HC毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
(a)aKLH120.6κLC(上記の配列番号28);
(b)aKLH120.6IgG2 HC(上記の配列番号29);および
(c)以下のHC配列を有するaKLH120.6IgG2−ShK[2−35、Q16K]融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号33)。
所望のaKLH120.6IgG2−ShKアナログ生成物は、図1Fに企図する1本の重鎖のC末端に融合したShKペプチドを有する完全抗体である。1種類の軽鎖を共有する2つの異なる重鎖を含み、重鎖:軽鎖:重鎖−ShKの比率は1:2:1であった。予期した発現生成物は、aKLH120.6IgG2、1価aKLH120.6IgG2−ShK、および2価aKLH120.6IgG2−ShKである。本明細書に記載のとおり、1価aKLH120.6IgG2毒素ペプチド(または毒素ペプチドアナログ)融合抗体を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
(a)aKLH120.6κLC(上記の配列番号28);
(b)aKLH120.6IgG1 HC:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//(配列番号34);
および、
(c)aKLH120.6IgG1−ループ−ShK:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELGGRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTCGGTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//(配列番号35)。
(a)aKLH120.6IgG2 HC(配列番号29);
(b)aKLH120.6κLC(配列番号28);および
(c)以下の配列を有するaKLH120.6κLC−ShK[1−35、Q16K]融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号267)。
1価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[1−35、Q16K]生成物のこの実施形態は、図1Jに示すように、1本の軽鎖のC末端に融合したShKペプチドを有する完全抗体であった。1種類の重鎖を共有する2つの異なる軽鎖を含み、軽鎖:重鎖:軽鎖−ShK[1−35、Q16K]の比率は1:2:1であった。予期した発現生成物は、aKLH120.6IgG2、1価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[1−35、Q16K]、および2価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[1−35、Q16K]である。本明細書に記載のとおり、抗体を含む1価aKLH120.6IgG2 LC毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
(a)aKLH120.6IgG2 HC(配列番号29);
(b)aKLH120.6κLC(配列番号28);および
(c)以下の配列を有するaKLH120.6κLC−ShK[2−35、Q16K]融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号268)。
1価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[2−35、Q16K]生成物のこの実施形態は、図1Jに示すように、1本の軽鎖のC末端に融合したShKペプチドを有する完全抗体であった。1種類の重鎖を共有する2つの異なる軽鎖を含み、軽鎖:重鎖:軽鎖−ShK[2−35、Q16K]の比率は1:2:1であった。予期した発現生成物は、aKLH120.6IgG2、1価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[2−35、Q16K]、および2価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[2−35、Q16K]である。本明細書に記載のとおり、抗体を含む1価aKLH120.6IgG2 LC毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
(a)aKLH120.6IgG2 HC(配列番号29);および
(b)上記のaKLH120.6κLC−ShK[1−35、Q16K]融合物(配列番号267)。
2価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[1−35、Q16K]抗体生成物のこの実施形態は、図1Kに示すように、両軽鎖のC末端に融合したShKペプチドを有する完全抗体であった。重鎖:軽鎖−ShK[1−35、Q16K]の比率は1:1であった。予期した発現生成物は、2価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[1−35、Q16K]である。本明細書に記載のとおり、抗体分子を含む2価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[1−35、Q16K]ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
(a)aKLH120.6IgG2 HC(配列番号29);および
(b)上記のaKLH120.6κLC−ShK[2−35、Q16K]融合物(配列番号268)。
2価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[2−35、Q16K]生成物のこの実施形態は、図1Kに示すように、両軽鎖のC末端に融合したShKペプチドを有する完全抗体であった。重鎖:軽鎖−ShK[2−35、Q16K]の比率は1:1であった。予期した発現生成物は、2価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[2−35、Q16K]抗体である。本明細書に記載のとおり、抗体を含む2価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[2−35、Q16K]毒素融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
(a)aKLH120.6IgG2 HC(上記の配列番号29);
(b)上記の配列番号32のアミノ酸を有するaKLH120.6IgG2 HC−Shk[1−35、Q16K]融合物;および
(c)上記の配列番号267のアミノ酸配列を有するaKLH120.6κLC−ShK[1−35、Q16K]融合物。
3価aKLH120.6IgG2 LC−ShK生成物のこの実施形態は、図1Lに示すように、両軽鎖のC末端に融合したShK[1−35、Q16K]ペプチドおよび1本の重鎖を有する完全抗体であった。1種類の軽鎖を共有する2つの異なる重鎖を含み、重鎖:軽鎖−ShK[1−35、Q16K]:重鎖−ShK[1−35、Q16K]の比率は1:2:1であった。予期した発現生成物は2価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[1−35、Q16K]抗体、3価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[1−35、Q16K]抗体、および4価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[1−35、Q16K]抗体であった。本明細書に記載のとおり、抗体分子を含む3価aKLH120.6IgG2 LC毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
a)aKLH120.6IgG2 HC(配列番号29);
(b)上記のaKLH120.6IgG2 HC−Shk[2−35、Q16K]融合物(配列番号33);および
(c)上記のaKLH120.6κLC−ShK[2−35、Q16K]融合物(配列番号268)。
3価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[2−35、Q16K]抗体生成物のこの実施形態は、図1Lに示すように、両軽鎖のC末端に融合したShK[2−35、Q16K]ペプチドおよび1本の重鎖を有する完全抗体であった。1種類の軽鎖を共有する2つの異なる重鎖を含み、重鎖:軽鎖−ShK[2−35、Q16K]:重鎖−ShK[2−35、Q16K]の比率は1:2:1であった。予期した発現生成物は2価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[2−35、Q16K]抗体、3価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[2−35、Q16K]抗体、および4価aKLH120.6IgG2 LC−ShK[2−35、Q16K]抗体であった。本明細書に記載のとおり、抗体分子を含む3価aKLH120.6IgG2 LC毒素ペプチド融合物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC//(配列番号28)をコードする。
5’−AAC AGG GGA GAG TGT GGA GGA GGA GGA TCC GGA G−3’(配列番号269);および
5’−CAT GCG GCC GCT CAT TAG CAG G−3’(配列番号270)
を用いてPCRによりShk[1−35、Q16K]断片を生成した。
以下のオリゴ
5’−CAT TCT AGA CCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG−3’(配列番号43);および
5’−GGA TCC TCC TCC TCC ACC CGG AGA CAG GGA GAG G−3’(配列番号44)
を用いて、
aKLH120.6−VK1SP−IgG2重鎖(配列番号46;以下)をコードするコード配列(配列番号45;以下)を含むpTT5−aKLH120.6−VK1SP−IgG2重鎖(HC)構築物からaKLH−IgG2−重鎖領域をPCRにより増幅した:
ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGTGCCAGATGTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACCACATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTGGGAGCTACTACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT//(配列番号45)、
これはアミノ酸配列
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG//(配列番号46)をコードする。
5’−TCC CTG TCT CCG GGT GGA GGA GGA GGA TCC GGA G−3’(配列番号47);および5’−CAT GCG GCC GCT CAT TAG CAG GTG−3’(配列番号14)を用いて生成した。PCR生成物を1%アガロースゲル上に流した。バンドにアガロースプラグ用の穴を開けてプラグを新しいPCR反応管に入れた。次いで外プライマー配列番号357および配列番号330を用いてPCRによりアガロースプラグを増幅した。次いでPCR生成物をXbaIおよびNotIにより消化して、PCRクリーンアップキット(Qiagen)で精製した。同時に、pTT5ベクター(CMVプロモーターおよびPoly A tailを含むAmgenベクター)をXbaIおよびNotIにより切断した。pTT5ベクターを1%アガロースゲル上に流して、大型断片を切断し、QiagenのGel Purificationキットによりゲル精製した。精製したPCR生成物を大型ベクター断片と結紮して、OneShot Top10細菌に形質転換した。形質転換細菌コロニーからDNAを単離し、XbaIおよびNotI制限酵素による消化に供して、1%アガロースゲル上で分解した。予期したパターンに至るDNAを配列決定用に提出した。いくつかのクローン配列分析において上記配列と100%適合したが、1クローンのみを大規模プラスミド精製用に選択した。最終pTT5−aKLH120.6−VK1SP−IgG2−HC−L10−ShK[1−35]構築物はアミノ酸配列:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号48)
とのIgG2−HC−L10−ShK[1−35]融合ポリペプチドをコードした。
5’−GCT GCA CCG CCT TCA AGT GCA AGC ACA GC 3’(配列番号9);および
5’−GCT GTG CTT GCA CTT GAA GGC GGT GCA GC−3’(配列番号10)
を用いて部位指向変異を実施した。最終構築物pTT5−aKLH120.6−VK1SP−IgG2−HC−L10−ShK[1−35、Q16K]はアミノ酸配列:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号49)
とのIgG2−HC−L10−ShK[1−35、Q16K]融合ポリペプチドをコードした。
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG//(配列番号51)をコードするコード配列:
ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGTGCCAGATGTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACCACATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTGGGAGCTACTACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGAGGA//(配列番号50)を含有した。次いでベクター断片をCalf Intestine Phosphatase(CIP)で処理して5’リン酸基を除去し、フェノール/クロロホルムを抽出してベクター自体の再結紮を防止した。挿入物はIgG2 Fc−L10−ShK(2−35、Q16K)をコードするpTT14−VH21SP−IgG2−Fc−ShK[2−35、Q16K]に由来した:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSERKVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号18)、
また、挿入物はBamHI/BamHIを用いて消化もさせた。挿入ShK[2−35、Q16K]断片をそのベクターからゲル精製して、QiagenのGel Purificationキットでクリーンアップした。精製したDNA挿入物は、アミノ酸配列GSGGGGSSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC(配列番号53)をコードするコード配列GGA TCC GGA GGA GGA GGA AGC AGC TGC ATC GAC ACC ATC CCC AAG AGC CGC TGC ACC GCC TTC AAG TGC AAG CAC AGC ATG AAG TAC CGC CTG AGC TTC TGC CGC AAG ACC TGC GGC ACC TGC TAA TGA//(配列番号52)を含み、大型ベクター断片と結紮して、OneShot Top10細菌に形質転換した。形質転換細菌コロニーからDNAを単離し、BamHI制限酵素による消化に供して、1%アガロースゲル上で分解した。予期したパターンに至るDNAを配列決定用に提出した。いくつかのクローン配列分析において上記配列と100%適合したが、1クローンのみを大規模プラスミド精製用に選択した。最終構築物pTT5−aKLH−IgG2 HC−L10−ShK[2−35、Q16K]はIgG2 HC−L10−ShK[2−35、Q16K]融合ポリペプチド:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号54)をコードした。
5’−AGG AGG AGG AAG CGC CAG CTG CGC CGA CAC CAT CCC C−3’//(配列番号310);および
5’−GGG GAT GGT GTC GGC GCA GCT GGC GCT TCC TCC TCC T−3’//(配列番号311)
を用いて生成した。
Stratagene QuikChange Multi site Directed Mutagenesisキットを製造業者の説明書に従いつつ用いて部位指向変異を実施した。最終pTT5−aKLH120.6−VK1SP−IgG2−HC−L10−ShK[1−35 R1A、I4A、Q16K]構築物はIgG2−HC−L10−ShK[1−35、R1A、I4A、Q16K]融合ポリペプチド(配列番号304)をコードした。
5’−GAG GAG GAG GAA GCG CCA GCT GCA TCG ACA−3’//(配列番号312);
5’−GAG CTT CTG CCG CGA GAC CTG CGG CAC−3’//(配列番号313);
5’−CGA TGC AGC TGG CGC TTC CTC CTC CTC−3’//(配列番号314);および
5’−GTG CCG CAG GTC TCG CGG CAG AAG CTC−3’//(配列番号315)
を用いて上記のとおりShk[1−35、R1A、Q16K、K30E]断片を生成した。
最終pTT5−aKLH120.6−VK1SP−IgG2−HC−L10−ShK[1−35 R1A、Q16K、K30E]構築物はIgG2−HC−L10−ShK[1−35、R1A、Q16K、K30E]融合ポリペプチド(配列番号305)をコードした。
5’−GGA GGA GGA AGC CAC AGC TGC GCC GAC ACC ATC CCC−3’//(配列番号316);および
5’−GGG GAT GGT GTC GGC GCA GCT GTG GCT TCC TCC TCC−3’//(配列番号317)
を用いてShK[1−35、R1H、I4A、Q16K]断片を生成した。
Stratagene QuikChange Multi site Directed Mutagenesisキット(Cat#200531)を製造業者の説明書に従いつつ用いて部位指向変異を実施した。最終pTT5−aKLH120.6−VK1SP−IgG2−HC−L10−ShK[1−35 R1H、I4A、Q16K]構築物はIgG2−HC−L10−ShK[1−35、R1H、I4A、Q16K]融合ポリペプチド(配列番号306)をコードした。
5’−GGA GGA GGA AGC CAC AGC TGC ATC GAC−3’//(配列番号318)および配列番号313;
5’−GTC GAT GCA GCT GTG GCT TCC TCC TCC−3’//(配列番号319)および配列番号315を用いて上記のとおりShk[1−35、R1H、Q16K、K30E]断片を生成した。
最終pTT5−aKLH120.6−VK1SP−IgG2−HC−L10−ShK[1−35 R1H、Q16K、K30E]構築物はIgG2−HC−L10−ShK[1−35、R1H、Q16K、K30E]融合ポリペプチド(配列番号307)をコードした。
5’−CCG GAG GAG GAG GAA GCA AGA GCT GCG CCG ACA CCA TCC CCA AGA−3’//(配列番号320);および
5’−TCT TGG GGA TGG TGT CGG CGC AGC TCT TGC TTC CTC CTC CTC CGG−3’//(配列番号321)
を用いてShk[1−35、R1K、I4A、Q16K]断片を生成した。
Stratagene QuikChange Multi site Directed Mutagenesisキット(Cat#200531)を製造業者の説明書に従いつつ用いて部位指向変異を実施した。最終pTT5−aKLH120.6−VK1SP−IgG2−HC−L10−ShK[1−35 R1K、I4A、Q16K]構築物はIgG2−HC−L10−ShK[1−35、R1K、I4A、Q16K]融合ポリペプチド(配列番号308)をコードした。
5’−CGG AGG AGG AGG AAG CAA GAG CTG CAT CGA CAC CA −3’//(配列番号322)および配列番号313;
5’−TGG TGT CGA TGC AGC TCT TGC TTC CTC CTC CTC CG −3’//(配列番号323)および配列番号315を用いてShk[1−35、R1K、Q16K、K30E]断片を上記のとおり生成した。
最終pTT5−aKLH120.6−VK1SP−IgG2−HC−L10−ShK[1−35 R1H、Q16K、K30E]構築物はIgG2−HC−L10−ShK[1−35、R1K、Q16K、K30E]融合ポリペプチド(配列番号309)をコードした。
順行プライマー:
TGCAGAAGCTTCTAGACCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCCGCAGCTGCATCGACACCATCCCCAAGAGCCGCTGCACCGCCTTCCAGT//(配列番号55);および
逆行プライマー:
CTCCGGATCCTCCTCCTCCGCAGGTGCCGCAGGTCTTGCGGCAGAAGCTCAGGCGGTACTTCATGCTGTGCTTGCACTGGAAGGCGGTGCAGCGGCTCTTGGGGATGGTGTCGAT//(配列番号56)。
順行プライマー:
GTAGGATCCGGAGGAGGAGGAAGCGACAAAACTCACAC//(配列番号57);および
逆行プライマー:
CGAGCGGCCGCTTACTATTTACCCGGAGACAGGGA//(配列番号58)。
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTCGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//(配列番号60)をコードするコード配列
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCCGCAGCTGCATCGACACCATCCCCAAGAGCCGCTGCACCGCCTTCCAGTGCAAGCACAGCATGAAGTACCGCCTGAGCTTCTGCCGCAAGACCTGCGGCACCTGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGAAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGTAA//(配列番号59)を含有した。
5’−GCT GCA CCG CCT TCA AGT GCA AGC ACA GC−3’//(配列番号9);および
5’−GCT GTG CTT GCA CTT GAA GGC GGT GCA GC−3’(配列番号10)
を用いる部位指向変異を実施してShK領域にQ16K変異を産生した。
Stratagene QuikChange Multi site Directed Mutagenesisキットを製造業者の説明書に従いつつ用いた。pCMVi−N末端−ShK[1−35Q16K]−L10−IgG1−Fcのための最終構築物は、以下のシグナルペプチド(VH21SP)−ShK[1−35、Q16K]−L10−IgG1−Fc融合ポリペプチド:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTCGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//(配列番号61)をコードした。
5’−CAT TCT AGA CCA CCA TGG AAT GG−3’(配列番号62);
5’−CAG CTG CAC CTG GCT TCC TCC TCC TCC GG−3’(配列番号63);
およびpCMVi−N末端−ShK[1−35、Q16K]−L10−IgG1−Fc鋳型を用いて産生し、VH21SP−ShK(1−35、Q16K)−L10アミノ酸配列
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTCGGGGSGGGGS//(配列番号65)をコードするコード配列
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCCGCAGCTGCATCGACACCATCCCCAAGAGCCGCTGCACCGCCTTCAAGTGCAAGCACAGCATGAAGTACCGCCTGAGCTTCTGCCGCAAGACCTGCGGCACCTGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGAAGC//(配列番号64)を含む断片を得た。
5’−GGA GGA GGA AGC CAG GTG CAG CTG GTG CAG−3’(配列番号66);
5’−CAT GCG GCC GCT CAT TTA CCC−3’(配列番号67);
およびpTT5−aKLH120.6−HC鋳型を用いてPCR生成物を作製し、アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//(配列番号69)をコードするコード配列
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACCACATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTGGGAGCTACTACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA//(配列番号68)を含むDNA断片を得た。
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTCGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//(配列番号70)をコードした。
5’−CAT TCT AGA CCA CCA TGG AAT GG−3’(配列番号62);および
5’−CAT CTG GAT GTC GCT TCC TCC TCC TCC GG−3’(配列番号71);
ならびにpCMVi−N末端−ShK[1−35Q16K]−L10−IgG1−Fc鋳型を用いて作製し、シグナルペプチド(VH21SP)−ShK(1−35、Q16K)−L10リンカーのためのアミノ酸配列:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTCGGGGSGGGGS//(配列番号65)をコードするコード配列
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCCGCAGCTGCATCGACACCATCCCCAAGAGCCGCTGCACCGCCTTCAAGTGCAAGCACAGCATGAAGTACCGCCTGAGCTTCTGCCGCAAGACCTGCGGCACCTGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGAAGC//(配列番号64)を含むDNA断片を得た。
鋳型ならびに以下のオリゴ:
5’−GGA GGA GGA AGC GAC ATC CAG ATG ACC CAG TC−3’(配列番号72);および
5’−CAT CTC GAG CGG CCG CTC AAC−3’(配列番号73)を用いた。
N末端シグナルペプチド:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTCGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC//(配列番号75)
を有するN末端VH21SP−ShK[1−35、Q16K]−L10−aKLH120.6軽鎖(LC)のためのアミノ酸配列をコードするコード配列
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCCGCAGCTGCATCGACACCATCCCCAAGAGCCGCTGCACCGCCTTCAAGTGCAAGCACAGCATGAAGTACCGCCTGAGCTTCTGCCGCAAGACCTGCGGCACCTGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGTTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA//(配列番号74)を含むクローン化PCR断片を生成した。
プラスミドpTT5−aDNP3A4(W101F)IgG2−Shk[1−35Q16K]の作製:
Kv1.3阻害剤毒素ペプチドアナログShK[1−35、Q16K](配列番号76)の単量体にインフレーム融合させたヒト抗2,4−ジニトロフェニル(aDNP)抗体の重鎖をコードするDNA配列を標準的なクローニング技術を用いて構築した。以下のアミノ酸配列:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYNFNYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG//(配列番号77)を有する抗DNP 3A4(W101F)IgG2重鎖の一部(pDC324:aDNP3A4 HC(W101F)およびIgG2Fc−Shk[1−35、Q16K]の一部にpTT5ベクターを結紮する3つの方法によりプラスミドpTT5−aDNP3A4(W101F)IgG2−Shk[1−35、Q16K]を生成した。複数のクローニング部位を放出するSalI/NotIによりpTT5ベクターを切断した。次いでベクターをCalf Intestine Phosphatase(CIP)で処理して背景を減らした。第一挿入物はpDC324由来であった:aDNP3A4 HC(W101F)をSalI/StuIで切断することにより、アミノ酸配列
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYNFNYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKG//(配列番号79)をコードするコード配列
ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGTGCGCGCTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGTATAACTTCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC//(配列番号78)を含むDNA断片を得た。
第二挿入物をStuI/NotIを用いて消化し、以下の切断されたIgG2 Fc−L10−ShK(1−35、Q16K)アミノ酸配列
LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号81)をコードするコード配列
CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGAAGCCGCAGCTGCATCGACACCATCCCCAAGAGCCGCTGCACCGCCTTCAAGTGCAAGCACAGCATGAAGTACCGCCTGAGCTTCTGCCGCAAGACCTGCGGCACCTGCTAATGA//(配列番号80)を含有した。
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYNFNYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//(配列番号82)を有するaDNP3A4(W101F)IgG2 HC−L10−Shk[1−35、Q16K]をコードした。
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRRLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC//(配列番号109)。
薬理学的に活性なポリペプチドのための免疫グロブリン担体として用いられる本発明の抗原結合タンパク質の実施形態は、良好な薬物動態および薬力学特性を提供することが示された。1価もしくは2価Fc−L10−ShK[2−35]、1価もしくは2価Fc−L10−ShK[1−35]、1価もしくは2価Fc−L10−ShK(1−35、Q16K)、1価もしくは2価抗KLH HC−ShK(1−35、Q16K)Ab、1価もしくは2価抗KLH Abループ−[Lys16]ShK融合タンパク質、1価Fc−ShK(1−35 Q16K)/aKLH Abヘテロ三量体、ならびに表7Hに列挙する他の例示的な実施形態を、実施例4に記載の手段により発現させ、単離して精製した。表7HのPEG化および非PEG化毒素ペプチド比較物を以下のとおり合成的に調製した。
ShKに対する抗体。ShK(配列番号361)に対するウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗体を動物のFc−ShKペプチボディ結合体による免疫化により生成した。抗ShK特異的ポリクローナル抗体を抗血清から親和性精製して結合体のShK部分に特異的な抗体のみを単離した。融合およびスクリーニング後、ShKに特異的なハイブリドーマを選択し、単離した。マウス抗ShK特異的モノクローナル抗体をクローン条件培地から精製した。ELISA分析により、精製した抗ShKポリクローナルおよびモノクローナル抗体はShKペプチド単独のみに反応し、Fcとは交差反応しなかった。
(a)ストレプトアビジンマイクロタイタープレートを250ng/mLビオチン化−抗ShKマウスモノクローナル抗体(mAb2.10、Amgen)のIブロック緩衝液[1リットルにつき:1000mL1×PBS、CaCl2、MgCl2非含有、5mLのTween 20(Thermo Scientific)、2gのIブロック試薬(Tropix)]で4℃でコーティングし、一晩撹拌せずにインキュベートした。
(b)プレートをKPL洗浄緩衝液(Kirkegaard & Perry Laboratories)で3回洗浄した。
(c)プールした血清100%を有する標準(STD)、品質管理(QC)および試料希釈を調製してから、Iブロック緩衝液で5分の1に希釈した(前処置)。前処置したSTD、QCおよび試料を洗浄したプレートに添加し、室温で2時間インキュベートした。(STD、QCの連続希釈をプールした血清100%内で調製した。希釈する必要のある試料はプールした血清100%でも調製した。std、QCおよび試料の両方に対して前処置を行い、基質効果を最小化した。)
(d)プレートをKPL洗浄緩衝液で3回洗浄した。
(e)HRP標識ウサギ抗ShKポリクローナルAb、250ng/mLのIブロック緩衝液を添加し、プレートを室温で1時間撹拌しながらインキュベートした。
(f)プレートをKPL洗浄緩衝液で再び3回洗浄し、Femto[Thermo Scientific]基質を添加した。
(g)プレートをLmax II 384(Molecular Devices)照度計で読み込んだ。
(a)ストレプトアビジンマイクロタイタープレートを250ng/mLビオチン化−抗ShKマウスモノクローナル抗体(mab2.10、Amgen)のIブロック緩衝液[1リットルにつき:1000mLの1×PBS、CaCl2、MgCl2非含有、5mLのTween 20(Thermo Scientific)で、2gのIブロック試薬(Tropix)]で4℃で、一晩撹拌せずにコーティングした;
(b)プレートをKPL洗浄緩衝液(Kirkegaard & Perry Laboratories)で3回洗浄した
(c)プールした血清100%を有する標準(STD)、品質管理(QC)および試料希釈を調製してから、Iブロック緩衝液で5分の1に希釈した(前処置)。前処置したSTD、QCおよび試料を洗浄したプレートに添加した。インキュベーションは室温で2時間行った。(STD、QCの連続希釈をプールした血清100%内で調製した。希釈する必要のある試料はプールした血清100%でも調製した。std、QCおよび試料の両方に対して前処置を行い、基質効果を最小化した。);
(d)プレートをKPL洗浄緩衝液で3回洗浄した;
(e)HRP標識Ab35(ヒトIgG Fcに対して)、150ng/mLのIブロック緩衝液を添加し、プレートを室温で1時間撹拌しながらインキュベートした。
(f)プレートをKPL洗浄緩衝液で3回洗浄し、Femto[Thermo Scientific]基質を添加した;
(g)プレートをLmax II 384[Molecular Devices]照度計で読み込んだ。
(a)1×コーティング緩衝液で希釈したCostar3590 96ウェルEIA/RIAプレートを0.1mL/ウェルの2μg/mLヤギ抗HuFc、Fab2、(Sigma I−3391)(10×コーティング緩衝液:1.59g Na2CO3、2.93g NaHCO3のH2O溶液100mL)でコーティングした。プレートを密封して4℃で一晩インキュベートした;
(b)プレートをPBST(PBS+0.1%Tween−20)で3回洗浄し、0.3mLのblotto(PBS、0.1%Tween−20、5%脱脂粉乳)を各ウェルへ添加してブロックし、室温(RT)で撹拌しながら1時間インキュベートした;
(c)プレートをKP洗浄溶液(Cat#50−63−00, KPL, Gaithersburg, MD)で洗浄した;
(d)希釈した血清試料および対照/標準の希釈緩衝液(PBS、0.1%BSA、0.1%Tween−20)+ラット血清で、必要な場合、最終ラット血清10%とし、0.1mL試料を各ウェルへ添加した。プレートを室温で撹拌しながら、1時間インキュベートした;
(e)プレートをKP洗浄溶液(Cat#50−63−00, KPL, Gaithersburg, MD)で洗浄した;
(f)HRP標識二次抗体(Pierce#31416−HRPヤギα−Hu IgG Fc)をPBSTで1:5000希釈してから100μL/ウェルを追加し、RTで撹拌しながら、1時間インキュベートした;
(g)プレートをKP洗浄溶液(Cat#50−63−00, KPL, Gaithersburg, MD)で洗浄してABTS基質(ABTS Microwell Substrate 1−Component, Cat#50−66−018, KPL)100μL/ウェルを添加した;
(h)基質を添加して撹拌した後、適切な時点で、SpectraMax340[Molecular Devices]プレート読取り器でプレートを読み込んだ。
Kv1.7を介したKv1.1発現細胞系。CHO−K1細胞をヒトKv1.3で、またはカウンタースクリーンのため(本明細書の実施例8を参照されたい)、hKv1.4、hKv1.6、もしくはhKv1.7で安定的にトランスフェクトした;HEK293細胞はヒトKV1.3もしくはヒトKv1.1を安定的に発現していた。細胞系はAmgenまたはBioFocus DPI(A Galapagos Company)から得た。hKv1.2を安定的に発現しているCHO K1細胞は、カウンタースクリーンのため、Millipore(Cat#.CYL3015)から購入した。
1.ベースライン電流は安定していなければならない
2.初回ピーク電流は300pA超でなければならない
3.初回Rmおよび最終Rmは300Ohm超でなければならない
4.ピーク電流は第一化合物の添加前に定常状態に達さなければならない。
hKv1.3を安定的に発現しているCHO細胞およびhKv1.1を安定的に発現しているHEK293細胞上で電気生理学的手法を行った。IWQ電気生理学的手法のためのShKアナログおよび結合体を含む「アッセイプレート」の調製手順は以下のとおりであった:0.3%BSAを含む細胞外緩衝液(0.9mM Ca2+および0.5mM Mg2+含有PBS)ですべてのアナログを溶解し、96ウェルポリプロピレンプレートのH列にカラム1〜カラム10に濃度100nMで分配した。カラム11および12を陰性および陽性対照のために保留してから、1:3比で連続希釈してA列で分配した。IonWorks Quattro(IWQ)電気生理学的手法およびデータ分析を以下のとおり成し遂げた:再懸濁した細胞(細胞外緩衝液中)、アッセイプレート、Population Patch Clamp(PPC)パッチプレートならびに適切な細胞内(90mMグルコン酸カリウム、20mM KF、2mM NaCl、1mM MgCl2、10mM EGTA、10mM HEPES、pH7.35)および細胞外緩衝液をIonWorks Quattro上に位置した。アナログをパッチプレートに添加した場合、アッセイプレートから0.1%BSAでさらに3倍希釈して33.3nM〜15pMの範囲の最終試験濃度に達した。アンホテリシンベースの穿孔パッチクランプ手順を用いてCHO−Kv1.3およびHEK−Kv1.1細胞の電気生理記録を取った。IonWorks Quattroの電圧クランプ回路構成を用いて、細胞を膜電位−80mVで保持し、膜電位を400ミリ秒間+30mVに進めることにより電圧活性化K+電流を引き起こした。対照条件下すなわち実験開始時に阻害剤の非存在下、10分インキュベーション後にアナログおよび対照の存在下でK+電流を引き起こした。430〜440ミリ秒の平均K+電流振幅を測定し、データをMicrosoft社のエクセルシートにエクスポートした。各濃度のアナログおよび対照の存在下におけるK+電流振幅を同じウェル中の前化合物の電流振幅のK+電流率として表した。これらの対照値%を濃度関数としてプロット時、各化合物のIC50値は以下の方程式を用いるエクセル適合プログラムにおいて用量反応適合モデル201を用いて算出し得る:
IL−2およびIFN−g分泌に与える毒素ペプチドアナログKv1.3阻害剤の影響を評価するためのEx vivoアッセイ。既に記載されているエクスビボアッセイ(その全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2008/088422A2号の実施例46を参照されたい)を用いて、ShKアナログおよび結合体がヒト全血中のT細胞炎症をブロックする効能を評価した。簡単に述べると、50%ヒト全血液をタプシガルジンで刺激してストア枯渇、カルシウム可動化およびサイトカイン分泌を誘発する。T細胞サイトカイン分泌のブロックにおける分子の効能を評価するため、タプシガルジン刺激を加える30〜60分前に各種濃度のKv1.3ブロックペプチドおよびペプチド結合体をヒト全血液試料でプレインキュベートした。48時間後、37℃、5%CO2で、条件培地を収集し、MesoScale Discoveryから4点電気化学発光免疫アッセイを用いてサイトカイン分泌レベルを決定した。タプシガルジン刺激を用いて、複数ドナーから単離した血液からロバスト的にサイトカインIL−2およびIFN−gを分泌した。タプシガルジン刺激後にヒト全血中に産生されたIL−2およびIFN−gを、細胞内サイトカイン染色および蛍光標示式細胞分取器(FACS)分析により明らかにしたようにT細胞から産生した。
Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3、Kv1.4、Kv1.6およびKv1.7、PatchXpress(商標)、平面パッチクランプ電気生理学的手法。上記の実施例6に記載の方法および細胞を用いるMDCのPatchXpress(商標)7000A電気生理系を用いて、イオンチャネル電流を室温で記録できる。各チャネルの電圧プロトコールを下表7Mに示す。
AMP5 TPO模倣ペプチドを全4つの可能な末端融合配置(図1F〜1K;図45に図解)で本発明の抗KLH抗体に遺伝的に融合した、すなわち、両免疫グロブリン軽鎖単量体および両免疫グロブリン重鎖単量体にN末端融合およびC末端融合し、哺乳類(CHO)細胞内で発現させた。次いで融合物をタンパク質Aクロマトグラフィー(GE Life Sciences)により2価陽イオンを含まないダルベッコのPBS 10カラム容量を洗浄緩衝液として、および100mM酢酸を溶出緩衝液として7℃で用いて精製した。クロマトグラムに基づき溶出ピークをプールして、2Mトリス塩基を用いてpHを約5.0に増大した。次いでプールを少なくとも4容量の水で希釈してからSP−HPセファロースカラム(GE Life Sciences)上に負荷し、10カラム容量のS緩衝液A(20mM酢酸、pH5.0)で洗浄した後、60%S緩衝液B勾配(20mM酢酸、1M NaCl、pH5.0)の20カラム容量を用いて7℃で溶出した。クロマトグラムに基づきプールを作製し、10kDa Slide−A−Lyzers(Pierce)を4℃で用いて物質を20容量超の10mM酢酸、9%ショ糖(pH5.0)に対して透析した。次いで透析物質を0.22μm酢酸セルロースフィルターを介してろ過し、吸光度280nmで濃度を決定した。各抗体50μgを融合していない対照と共にPhenomenex SEC 3000カラム(7.8×300mm)の50mM NaH2PO4、pH6.5、250mM NaCl溶液に注入し、1mL/分で展開して吸光度280nmで観察した(図39)。各抗体の分析を、220Vで展開した1.0mmトリス−グリシン4〜20%SDS−PAGE(Novex)を用いて、還元および非還元負荷緩衝液を用いて、QuickBlue(Boston Biologicals)により染色して行い(図40A〜E)、LC−MSにより質量を決定した(図41A〜D)。
(a)aKLH120.6κLC(上記の配列番号28);
(b)aKLH120.6IgG2 HC(上記の配列番号29);
(c)aKLH120.6IgG1 HC(上記の配列番号34);
(c)以下のアミノ酸配列を有するaKLH120.6IgG2 HC−Amp5:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGQGCSSGGPTLREWQQCRRAQHS//(配列番号324);
(d)以下のアミノ酸配列を有するAmp5−aKLH120.6IgG2 HC(配列番号332):
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQGCSSGGPTLREWQQCRRAQHSGGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG//(配列番号332)。
(e)以下のアミノ酸配列を有するaKLH120.6hIgG1 N297Q−Amp5 Fc(CH3)ループ:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMGGQGCSSGGPTLREWQQCRRAQHSGGTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG//(配列番号341);
(f)以下のアミノ酸配列を有するAmp5−aKLH120.6κLCポリペプチド融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQGCSSGGPTLREWQQCRRAQHSGGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC//(配列番号342)。
AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GGG CT//(配列番号325)であり;および
逆行プライマー配列は:
GCC GCT GCT GCA GCC CTG ACC ACC ACC TCC ACC ACC CGG AGA CAG GGA GAG//(配列番号326)であった。
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGQGC//(配列番号327)であった。
CTC TCC CTG TCT CCG GGT GGT GGA GGT GGT GGT CAG GGC TGC AGC AGC GGC//(配列番号328)であり;および
逆行プライマー配列は:
CTA CTA GCG GCC GCT CAG CTA TGC TGA GCG CGG CG//(配列番号329)であった。PCR2から産生した断片によりコードされたアミノ酸配列は:
LSLSPGGGGGGQGCSSGGPTLREWQQCRRAQHS//(配列番号330)であった。
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGQGCSSGGPTLREWQQCRRAQHS//(配列番号331)。
単量体を含む所望のAMP5−aKLH120.6IgG2 DesK HC生成物(上記の配列番号332)は、1本の重鎖のN末端に融合するAMP5ペプチドを有する完全抗体であり、図1Iの図解を企図し、PFU High Fidelity Ultra(Stratagene製)を用いてPCRの2つの別々のラウンドにより会合した。第一ラウンドのPCRにより3つの断片:VK1sp−AMP5、AMP5−G5、およびG5−aKLH120.6IgG2 DesK HC断片が産生された。これらの断片を産生するために用いたオリゴおよびPCR鋳型を以下に列挙する。ポリメラーゼ連鎖反応1(PCR1)によりVK1sp−AMP5が産生され、VK1spをコードする既存のDNAを鋳型として用いた。この断片も、VK1sp−AMP5−G5−aKLH120.6κ LC構築において用いた点に留意されたい。
AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GGG CT//(配列番号325)であり;および
逆行プライマー配列は:
GCC GCT GCT GCA GCC CTG ACA TCT GGC ACC TCT CAA CC//(配列番号333)であった。PCR1から産生した断片によりコードされたアミノ酸配列は:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQGCSSG//(配列番号334)であった。
GGT TGA GAG GTG CCA GAT GTC AGG GCT GCA GCA GCG GC//(配列番号335)であり;および
逆行プライマー配列は:
CAG CTG CAC CTG ACC ACC ACC TCC ACC GCT ATG CTG AGC GCG//(配列番号336)であった。
WLRGARCQGCSSGGPTLREWQQCRRAQHSGGGGGQVQLV//(配列番号337)であった。
CGC GCT CAG CAT AGC GGT GGA GGT GGT GGT CAG GTG CAG CTG//(配列番号338)であり;および
逆行プライマー配列は:
CTA CTA GCG GCC GCT CAA CCC GGA GAC AGG GAG A//(配列番号339)であった。
RAQHSGGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG//(配列番号340)であった。
WLRGARCQGCSSGGPTLREWQQCRRAQHSGGGGGDIQMTQ//(配列番号345)であった。
CGC GCT CAG CAT AGC GGT GGA GGT GGT GGT GAC ATC CAG ATG ACC CAG//配列番号346)であり;および
逆行プライマー配列は:
AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAA CAC TCT CCC CTG TTG AA//(配列番号347)であった。PCR3から産生した断片のペプチド配列は:
RAQHSGGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC//(配列番号348)であった。
エキセンディン−4ペプチド(HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS//配列番号349)を1kGリンカーを介して抗KLH120.6抗体の軽鎖のN末端に遺伝的に融合し(「Ex−4−1kG−aKLH120.6−Ab」と命名)、哺乳類細胞内で発現させた。図42は、エキセンディン−4(「Ex4」)−1kG−aKLH120.6LC融合構築物の図式マップである。
(a)以下のアミノ酸配列を有するEx−4−1kG−aKLH120.6κLC:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCHGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSG SGSATGGSGSGASSGSGSAT GSDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG IRNDLGWYQQKPGKAPKRLI YAASSLQSGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPEDFATYYCLQHNSYPLTF GGGTKVEIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC//(配列番号355);および
(b)aKLH120.6IgG2 HC(上記の配列番号29)。
SalI
〜〜〜〜〜〜
GTCGACTAGACCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTATTGTGGTTGAGAGGTGCCAGATGTCATGGGGAGGGAACATTTACAAGCGATCTGAGCAAACAAATGGAGGAAGAGGCAGTTAGACTGTTCATTGAATGGCTCAAGAACGGCGGACCGAGTAGTGGTGCTCCGCCTCCCAGCGGATCTGGCAGCGCTACTGGTG
GATCTGGATCGGGTGCATCCTCTGGATCTGGAAGCGCTACCGGATCC//(配列番号351)
〜〜〜〜〜〜
BamHI
AAT GGA TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG TC/(配列番号352);およびAAT GCG GCC GCT CAA CAC TCT CC//(配列番号353)と上記(pTT5−aKLH120.6−VK1SP−κ軽鎖(LC)構築物)のaKLH120.6−Ab LC DNA鋳型から増幅した。
BamHI
〜〜〜〜〜〜
GGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGTTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGAGCGGCCGC//(配列番号368)
〜〜〜〜〜〜
NotI
SalI
〜〜〜〜〜〜
GTCGACTAGACCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTATTGTGGTTGAGAGGTGCCAGATGTCATGGGGAGGGAACATTTACAAGCGATCTGAGCAAACAAATGGAGGAAGAGGCAGTTAGACTGTTCATTGAATGGCTCAAGAACGGCGGACCGAGTAGTGGTGCTCCGCCTCCCAGCGGATCTGGCAGCGCTACTGGTG GATCTGGATCGGGTGCATCCTCTGGATCTGGAAGCGCTACCGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGTTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGAGCGGCCGC//(配列番号354)
〜〜〜〜〜〜
NotI
C681ポリペプチドは、いわゆるアビマー構造のIL−6結合ポリペプチドである。(例えば、Kolkman et al., Novel Proteins with Targeted Binding、米国特許第2005/0089932号;Baker et al., IL−6 Binding Proteins、米国特許第2008/0281076号;Stemmer et al., Protein Scaffolds and Uses Thereof、米国特許第2006/0223114号および米国特許第2006/0234299号を参照されたい)。
(a)aKLH120.6κLC(配列番号28);および
(b)以下のアミノ酸配列を有する(VK−1SP)−C681−(G5)−aKLH120.6IgG2 HC融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCSGGSCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHTGGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG//(配列番号356)。
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCSGGSCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHTGGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTK//(配列番号350)。
(a)aKLH120.6κLC(配列番号28);および
(b)以下のアミノ酸配列を有するaKLH120.6IgG2 HC−C681融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRGSYYWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGSGGSCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT//(配列番号357)。
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGSGGSCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT//(配列番号358)。
(a)aKLH120.6IgG2 HC(配列番号29);および
(b)以下のアミノ酸配列を有するC681−aKLH120.6κLC融合物:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCSGGSCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHTGGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC//(配列番号359)。
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCSGGSCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHTGGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGGGTKVEIKRTVA//(配列番号360)
タンパク質Aセファロース(GE Healthcare)を用いたFc領域の親和性高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)捕獲、続いてトリス緩衝生理食塩水、1mM CaCl2(Teknova)によるカラム洗浄および100mM酢酸、1mM CaCl2(pH3.5)を2.5cm/分で流した溶出工程により条件培地の初回精製を行った。タンパク質を含む留分をプールし、10N NaOHを用いてpHを8.0に調整し、5容量の水でさらに希釈した。物質を0.45μm酢酸セルロースフィルター(Corning)を介してろ過し、陽イオン交換FPLC(SP Sepharose High Performance; GE Healthcare)によりさらに精製した。試料を100%緩衝液A(20mMトリス、1mM、pH8.0)で平衡させたカラム上に負荷し、勾配0〜80%緩衝液B(20mMトリス、1M NaCl、1mM CaCl2、pH8.0)30カラム容量、流速1.5cm/分で溶出した。ピークを含む標的種をプールして、10mMトリス、150mM NaCl、1mM CaCl2(pH8.0)中に製剤化した。N末端HCおよびN末端LCならびにC末端HC融合タンパク質の精製例を図36〜38に示す。非還元SDS−PAGE分析(図36)により、完全に組み立てられた抗体が形成され得ることが示され、還元SDS−PAGE分析により所望の成分が存在することが示される。サイズ排除クロマトグラム(図37)により、精製した生成物の大部分が所望の非凝集状態にあることが示される。最終的に、質量スペクトル分析(図38)により、所望の融合生成物が存在することが示される。まとめると、これらの例により、aKLH120.6抗体は、所望の生成物を形成するアビマーとの融合物を受容できることが示される。
物質。ハイブリドーマ(3A1、3C2、3A4および3B1)または組換えCHO(3A4−F−G2および3B1−G2)のいずれか由来の精製した抗DNP抗体の発現を試験した。抗ヒトIgG、Fcγ−特異性抗体はJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA)から得た。DNP−BSA(ウシ血清アルブミンに結合される2,4−ジニトロフェノール)はBiosearch Technologies, Inc.(Novato, CA)から得た。BIACore 2000, research gradeセンサーチップCM5、界面活性剤P−20(ポリオキシエチレンソルビタン)、HBS−EP(10mM HEPES、0.15M NaCl、3.4mM EDTA、0.005%P−20、pH7.4)、アミンカップリング試薬、10mM酢酸塩(pH4.0)および10mMグリシン(pH1.5)はBIACore, Inc.(Piscataway, NJ)から得た。リン酸緩衝生理食塩水(PBS、1×、塩化カルシウム非含有、塩化マグネシウム非含有)はInvitrogen(Carlsbad, CA)から得た。ウシ血清アルブミン(BSA、分留V、IgG非含有)はSigma (St. Louis, MO)から得た。
本明細書を通して使用する略語は、特定の状況で別段の指定のない限り、以下のとおり定義する。
Ac アセチル(以前はアセチル化残基を指していた)
AcBpa アセチル化p−ベンジル−L−フェニルアラニン
ACN アセトニトリル
AcOH 酢酸
ADCC 抗体依存性細胞傷害
Aib アミノイソ酪酸
bA β−アラニン
Bpa p−ベンゾイル−L−フェニルアラニン
BrAc ブロモアセチル(BrCH2C(O)
BSA ウシ血清アルブミン
Bzl ベンジル
Cap カプロン酸
CBC 全血球計算値
COPD 慢性閉塞性肺疾患
CTL 細胞傷害性Tリンパ球
DCC ジシクロヘキシルカルボジイミド
Dde 1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソ−シクロヘキシリデン)エチル
DNP 2,4−ジニトロフェノール
DOPC 1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン
DOPE 1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン
DPPC 1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン
DSPC 1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン
DTT ジチオスレイトール
EAE 実験的自己免疫性脳脊髄炎
ECL 電気化学発光
ESI−MS エレクトロスプレーイオン化質量分析
FACS 蛍光標示式細胞分取器
Fmoc フルオレニルメトキシカルボニル
HOBt 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
HSL ホモセリンラクトン
IB 封入体
KCa カルシウム活性化カリウムチャネル(IKCa、BKCa、SKCa含有)
KLH キーホールリンペットヘモシアニン
Kv 電位依存性カリウムチャネル
Lau ラウリン酸
LPS リポ多糖類
LYMPH リンパ液
MALDI−MS マトリックス支援レーザー脱離イオン化法質量分析
Me メチル
MeO メトキシ
MeOH メタノール
MHC 主要組織適合複合体
MMP マトリックスメタロプロテイナーゼ
MW 分子量
MWCO 分子量カットオフ
1−Nap 1−ナフチルアラニン
NEUT 好中球
Nle ノルロイシン
NMP N−メチル−2−ピロリジノン
OAc 酢酸塩
PAGE ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBMC 末梢血液単核細胞細胞
PBS リン酸緩衝生理食塩水
Pbf 2,2,4,6,7−ペンダメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PD 薬力学
Pec ピペコリン酸
PEG ポリ(エチレングリコール)
pGlu ピログルタミン酸
Pic ピコリン酸
PK 薬物動態
pY ホスホチロシン
RBS リボソーム結合部位
RT 室温(約25℃)
Sar サルコシン
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
STK セリン−トレオニンキナーゼ
t−Boc tert−ブトキシカルボニル
tBu tert−ブチル
TCR T細胞受容体
TFA トリフルオロ酢酸
THF 胸腺液性因子
Trt トリチル
Claims (60)
- 免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、もしくは配列番号260の配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、単離抗原結合タンパク質。
- 軽鎖可変領域が配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、もしくは配列番号240のアミノ酸配列を含む、請求項1の単離抗原結合タンパク質。
- 重鎖可変領域がCDRH1、CDRH2およびCDRH3と命名された3つの相補性決定領域を含み:
(a)CDRH1は配列番号188、配列番号189、配列番号190、もしくは配列番号191のアミノ酸配列を含む;
(b)CDRH2は配列番号192、配列番号193、配列番号194、もしくは配列番号195のアミノ酸配列を含む;ならびに
(c)CDRH3は配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、もしくは配列番号201のアミノ酸配列を含む、請求項1の単離抗原結合タンパク質。 - 免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域がCDRLl、CDRL2およびCDRL3と命名された3つのCDRを含み:
(a)CDRL1は配列番号202、配列番号203、配列番号204、もしくは配列番号205のアミノ酸配列を含む;
(b)CDRL2は配列番号206もしくは配列番号207のアミノ酸配列を含む;ならびに
(c)CDRL3は配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、もしくは配列番号212のアミノ酸配列を含む、請求項1の単離抗原結合タンパク質。 - 重鎖可変領域がCDRH1、CDRH2およびCDRH3と命名された3つの相補性決定領域を含み、ならびに軽鎖可変領域がCDRLl、CDRL2およびCDRL3と命名された3つのCDRを含み:
(a)CDRH1は配列番号188、配列番号189、配列番号190、もしくは配列番号191のアミノ酸配列を含む;
(b)CDRH2は配列番号192、配列番号193、配列番号194、もしくは配列番号195のアミノ酸配列を含む;
(c)CDRH3は配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、もしくは配列番号201のアミノ酸配列を含む;
(d)CDRL1は配列番号202、配列番号203、配列番号204、もしくは配列番号205のアミノ酸配列を含む;
(e)CDRL2は配列番号206もしくは配列番号207のアミノ酸配列を含む;ならびに
(f)CDRL3は配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、もしくは配列番号212のアミノ酸配列を含む、請求項1の単離抗原結合タンパク質。 - 抗体または抗体断片を含む、請求項1の単離抗原結合タンパク質。
- IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4を含む請求項6の単離抗原結合タンパク質。
- モノクローナル抗体を含む請求項6の単離抗原結合タンパク質。
- キメラまたはヒト化抗体を含む請求項8の単離抗原結合タンパク質。
- ヒト抗体を含む請求項8の単離抗原結合タンパク質。
- (a)配列番号77、配列番号107、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号123、配列番号129、配列番号144、配列番号145、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、もしくは配列番号185のアミノ酸配列を含むか、またはN末端かC末端、もしくは両端のアミノ酸残基が1個、2個、3個、4個もしくは5個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン重鎖;
(b)配列番号105、配列番号109、配列番号121;配列番号125、もしくは配列番号127のアミノ酸配列を含むか、またはN末端かC末端、もしくは両端のアミノ酸残基が1個、2個、3個、4個もしくは5個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン軽鎖;または
(c)(a)の免疫グロブリン重鎖および(b)の免疫グロブリン軽鎖
を含む請求項6の単離抗原結合タンパク質。 - 1から24の、結合された薬理学的に活性な化学部分をさらに含む、請求項1乃至請求項11のうちのいずれかの単離抗原結合タンパク質。
- 薬理学的に活性な化学部分が薬理学的に活性なポリペプチドである、請求項12の単離抗原結合タンパク質。
- 抗原結合ペプチドが組換え産生される、請求項13の単離抗原結合タンパク質。
- 抗原結合タンパク質が少なくとも1本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも1本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン重鎖の一次アミノ酸配列において免疫グロブリン重鎖Fcドメイン内部ループ内に薬理学的に活性なポリペプチドが挿入されている、請求項14の単離抗原結合タンパク質。
- 抗原結合タンパク質が少なくとも1本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも1本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン重鎖のN末端またはC末端に薬理学的に活性なポリペプチドが結合されている、請求項13の単離抗原結合タンパク質。
- 抗原結合タンパク質が少なくとも1本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも1本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン軽鎖のN末端またはC末端に薬理学的に活性なポリペプチドが結合されている、請求項13の単離抗原結合タンパク質。
- 薬理学的に活性なポリペプチドが毒素ペプチド、IL−6結合ペプチド、CGRPペプチドアンタゴニスト、ブラジキニンB1受容体ペプチドアンタゴニスト、PTHアゴニストペプチド、PTHアンタゴニストペプチド、ang−1結合ペプチド、ang−2結合ペプチド、ミオスタチン結合ペプチド、EPO模倣ペプチド、TPO模倣ペプチド、NGF結合ペプチド、BAFFアンタゴニストペプチド、GLP−1もしくはそのペプチド模倣物、またはGLP−2もしくはそのペプチド模倣物である、請求項13の単離抗原結合タンパク質。
- 毒素ペプチドがShKまたはShKペプチドアナログである、請求項18の単離抗原結合タンパク質。
- 請求項1乃至請求項19のうちのいずれかの抗原結合タンパク質、ならびに医薬上許容可能な希釈液、賦形剤もしくは担体、を含む医薬組成物。
- 請求項1乃至請求項4のうちのいずれかの抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
- 請求項5の抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
- 請求項11の抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
- 請求項14乃至請求項19のうちのいずれかの抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
- 請求項21乃至請求項24のうちのいずれかの単離核酸を含むベクター。
- 発現ベクターを含む請求項25のベクター。
- 請求項26の発現ベクターを含む単離宿主細胞。
- (a)発現ベクターによりコードされた抗原結合タンパク質を発現させる条件下の培養基で請求項27の宿主細胞を培養すること;および
(b)培養基から抗原結合タンパク質を回収すること、
を含む方法。 - 請求項11の抗原結合タンパク質を産生するハイブリドーマ。
- (a)ハイブリドーマにより抗原結合タンパク質を発現させる条件下の培養基で請求項29のハイブリドーマを培養すること;および
(b)培養基から抗原結合タンパク質を回収すること、
を含む方法。 - 免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が配列番号262、配列番号264、もしくは配列番号266の配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、単離抗原結合タンパク質。
- 軽鎖可変領域が配列番号242、配列番号244、配列番号246、もしくは配列番号248のアミノ酸配列を含む、請求項31の単離抗原結合タンパク質。
- 重鎖可変領域がCDRH1、CDRH2およびCDRH3と命名された3つの相補性決定領域を含み:
(a)CDRH1は配列番号213、配列番号214、もしくは配列番号215のアミノ酸配列を含む;
(b)CDRH2は配列番号216、配列番号217、もしくは配列番号218のアミノ酸配列を含む;ならびに
(c)CDRH3は配列番号219、配列番号220、もしくは配列番号221のアミノ酸配列を含む、請求項31の単離抗原結合タンパク質。 - 免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域がCDRLl、CDRL2およびCDRL3と命名された3つのCDRを含み:
(a)CDRL1は配列番号204、配列番号222、配列番号223、もしくは配列番号224のアミノ酸配列を含む;
(b)CDRL2は配列番号206、配列番号225、もしくは配列番号226のアミノ酸配列を含む;ならびに
(c)CDRL3は配列番号227、配列番号228、配列番号229、もしくは配列番号230のアミノ酸配列を含む、請求項31の単離抗原結合タンパク質。 - 重鎖可変領域がCDRH1、CDRH2およびCDRH3と命名された3つの相補性決定領域を含み、ならびに軽鎖可変領域がCDRLl、CDRL2およびCDRL3と命名された3つのCDRを含み:
(a)CDRH1は配列番号213、配列番号214、もしくは配列番号215のアミノ酸配列を含む;
(b)CDRH2は配列番号216、配列番号217、もしくは配列番号218のアミノ酸配列を含む;ならびに
(c)CDRH3は配列番号219、配列番号220、もしくは配列番号221のアミノ酸配列を含む;
(d)CDRL1は配列番号204、配列番号222、配列番号223、もしくは配列番号224のアミノ酸配列を含む;
(e)CDRL2は配列番号206、配列番号225、もしくは配列番号226のアミノ酸配列を含む;ならびに
(f)CDRL3は配列番号227、配列番号228、配列番号229、もしくは配列番号230のアミノ酸配列を含む、請求項31の単離抗原結合タンパク質。 - 抗体または抗体断片を含む、請求項31の単離抗原結合タンパク質。
- IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4を含む請求項36の単離抗原結合タンパク質。
- モノクローナル抗体を含む請求項36の単離抗原結合タンパク質。
- キメラまたはヒト化抗体を含む請求項38の単離抗原結合タンパク質。
- ヒト抗体を含む請求項38の単離抗原結合タンパク質。
- (a)配列番号46、配列番号133、配列番号139、配列番号143、配列番号186、もしくは配列番号187、配列番号366、もしくは配列番号367のアミノ酸配列を含むか、またはN末端かC末端、もしくは両端のアミノ酸残基が1個、2個、3個、4個もしくは5個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン重鎖;
(b)配列番号28、配列番号131、配列番号135、配列番号137;もしくは配列番号141のアミノ酸配列を含むか、またはN末端もしくはC末端、または両端のアミノ酸残基が1個、2個、3個、4個もしくは5個欠けている前述の任意の一配列を含む免疫グロブリン軽鎖;または
(c)(a)の免疫グロブリン重鎖および(b)の免疫グロブリン軽鎖、
を含む請求項36の単離抗原結合タンパク質。 - 1から24の、結合された薬理学的に活性な化学部分をさらに含む、請求項31乃至請求項41のうちのいずれかの単離抗原結合タンパク質。
- 薬理学的に活性な化学部分が薬理学的に活性なポリペプチドである、請求項42の単離抗原結合タンパク質。
- 抗原結合ペプチドが組換え産生される、請求項43の単離抗原結合タンパク質。
- 抗原結合タンパク質が少なくとも1本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも1本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン重鎖の一次アミノ酸配列において免疫グロブリン重鎖Fcドメイン内部ループ内に薬理学的に活性なポリペプチドが挿入されている、請求項44の単離抗原結合タンパク質。
- 抗原結合タンパク質が少なくとも1本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも1本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン重鎖のN末端またはC末端に薬理学的に活性なポリペプチドが結合されている、請求項43の単離抗原結合タンパク質。
- 抗原結合タンパク質が少なくとも1本の免疫グロブリン重鎖および少なくとも1本の免疫グロブリン軽鎖を含み、ならびに前記免疫グロブリン軽鎖のN末端またはC末端に薬理学的に活性なポリペプチドが結合されている、請求項43の単離抗原結合タンパク質。
- 薬理学的に活性なポリペプチドが毒素ペプチド、IL−6結合ペプチド、CGRPペプチドアンタゴニスト、ブラジキニンB1受容体ペプチドアンタゴニスト、PTHアゴニストペプチド、PTHアンタゴニストペプチド、ang−1結合ペプチド、ang−2結合ペプチド、ミオスタチン結合ペプチド、EPO模倣ペプチド、TPO模倣ペプチド、NGF結合ペプチド、BAFFアンタゴニストペプチド、GLP−1もしくはそのペプチド模倣物、またはGLP−2もしくはそのペプチド模倣物である、請求項43の単離抗原結合タンパク質。
- 毒素ペプチドがShKまたはShKペプチドアナログである、請求項48の単離抗原結合タンパク質。
- 請求項31乃至請求項49のうちのいずれかの抗原結合タンパク質、ならびに医薬上許容可能な希釈液、賦形剤もしくは担体、を含む医薬組成物。
- 請求項31乃至請求項34のうちのいずれかの抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
- 請求項35の抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
- 請求項41の抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
- 請求項44乃至請求項49のうちのいずれかの抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
- 請求項51乃至請求項54のうちのいずれかの単離核酸を含むベクター。
- 発現ベクターを含む請求項55のベクター。
- 請求項56の発現ベクターを含む、単離宿主細胞。
- (a)発現ベクターによりコードされた抗原結合タンパク質を発現させる条件下の培養基で請求項57の宿主細胞を培養すること;および
(b)培養基から抗原結合タンパク質を回収すること、
を含む方法。 - 請求項41の抗原結合タンパク質を産生するハイブリドーマ。
- (a)ハイブリドーマにより抗原結合タンパク質を発現させる条件下の培養基で請求項59のハイブリドーマを培養すること;および
(b)培養基から抗原結合タンパク質を回収すること、
を含む方法。
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