JP2014240428A - 付加環化を用いたモノマーおよびオリゴヌクレオチドの化学修飾 - Google Patents

付加環化を用いたモノマーおよびオリゴヌクレオチドの化学修飾 Download PDF

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Abstract

【課題】 リガンドとオリゴヌクレオチドとを共役させるための化合物およびプロセスを提供する。
【解決手段】本発明は、「クリック」ケミストリーをとおして、様々なリガンドとオリゴヌクレオチド、例えばｉＲＮＡ剤とを共役するために、リボース置換として使用できる、またはユニバーサル塩基として使用できる化合物に関する。本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩ）に示す構造を有する化合物を特徴とする。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００８年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／０９９，４９７号の優先権の利益を主張する。
本発明は、「クリック」ケミストリーを用いたリガンドとオリゴヌクレオチドとの共役の分野に関する。
オリゴヌクレオチド化合物は、医学分野において重要な治療用途を有する。オリゴヌクレオチドは、特定の疾病に関与する遺伝子をサイレンシングさせるために使用することができる。遺伝子サイレンシングは、翻訳を抑制することによってタンパク質の形成を防止する。重要なことに、遺伝子サイレンシング剤は、疾病に結び付けられるタンパク質の機能を抑制する、従来の小さな有機化合物に代わる有望なものである。ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡは、遺伝子サイレンシングによってタンパク質の形成を防止するオリゴヌクレオチドである。
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を遮断することができるという知見を説明するために、Ｆｉｒｅおよび共同研究者によって最初に作り出された用語である（非特許文献１および２）。短鎖ｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物における、遺伝子特異的な転写後サイレンシングを誘導し、遺伝子機能を調査するための新しい手段を提供している。ＲＮＡｉは、サイレンシングトリガーと類似しているメッセンジャーＲＮＡを破壊するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）、配列特異的な、多成分性ヌクレアーゼによって媒介される。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短鎖ＲＮＡ（約２２個のヌクレオチド）を含有することで知られているが、この活性のタンパク質成分は、依然として不明である。
ｓｉＲＮＡ化合物は様々な診断および治療目的に対する有望な薬剤である。ｓｉＲＮＡ化合物を遺伝子の機能を同定するために使用することができる。さらに、ｓｉＲＮＡ化合物は、病原遺伝子をサイレンシングすることによって作用する医薬品の新タイプとして膨大な可能性を提供する。研究は、中枢神経系疾病、炎症性疾患、代謝疾患、腫瘍学、感染症、および眼疾患を含む多くの疾病の治療のための干渉ＲＮＡ治療薬を開発するために現在進行中である。
多くの疾病（例えば、癌、造血障害、内分泌疾患、および免疫異常）は、特定の遺伝子もしくは遺伝子群の異常もしくは別の不要発現または活性から起こる。例えば、疾病は不正に制御した遺伝子発現、タンパク質の突然変異体の形の発現、またはウイルス性、細菌性、もしくは他の病原体由来の遺伝子の発現を介して生じることができる。ＲＮＡｉ経路は、かかる遺伝子の不要発現を抑制するまたは低下するために使用することができる（非特許文献３および４）。
さらなる態様において、本発明は対象における疾病または疾患を治療するための方法に関する。その方法は、疾病を発症しているまたは発症する危険性のある対象を同定すること、修飾したヌクレオチドまたは上記の結合のうちの１つ以上および薬学的に許容される担体を有する免疫的選択的ｉＲＮＡ剤を含有する医薬組成物を投与すること、を含む。対象は、上記のようにサイトカインまたは細胞表面受容体（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体）等の成長因子の発現の増加に対して監視することによる等、免疫システム、例えば免疫賦活性または免疫制御反応に対する影響に対して、監視することができる。対象のサイトカインは、対象のＴ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または天然キラー細胞から発現されたものであり得る。アッセイは、対象からの血液または血清試料を使用して実施することができる。疾病または疾患は、例えば臓器、組織、または骨髄移植を受けた患者において、免疫システムを刺激することが特に望ましくないものであり得る。別の代替案としては、疾病または疾患は、例えば癌またはウイルス性の疾病を患う患者において、免疫システムを刺激することが特に望ましいものであり得る。一実施形態において、対象は易感染性であり、ヌクレオチド修飾を含むｉＲＮＡ剤は、ヌクレオチド修飾を含まないｉＲＮＡ剤よりも大きい範囲で、細胞において免疫応答を刺激する。対象はヒト等の哺乳動物であり得る。
好ましい実施形態では、免疫的選択ｉＲＮＡ剤の投与は、対象に存在する疾病または疾患の治療のためである。別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤の投与は予防的治療のためである。
したがって、抗ウイルス性反応、特にＩ型のＩＦＮ反応を刺激することが可能であるポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチドを提供することが、本発明の目的である。ウイルス感染等の疾病および疾患の防止および治療のために、患者において抗ウイルス性反応、特にＩ型のＩＦＮ産生を含むことが可能である医薬組成物を提供することが、本発明の別の目的である。腫瘍を治療するために医薬組成物を提供することが、本発明の目的でもある。
疾病および／または疾患は、感染、腫瘍、アレルギー、多発性硬化症、および免疫異常を含むがこれらに限定されない。
感染は、ウイルス感染、細菌感染、炭疽、寄生虫感染、真菌症、およびプリオン感染を含むがこれらに限定されない。
ウイルス感染は、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ＨＩＶ−ＡＩＤＳ、ポリオウイルス、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、および天然痘ウイルスによる感染を含むがこれらに限定されない。抑制するために標的にすることができる（＋）鎖ＲＮＡウイルスの例は、ピコルナウイルス、カリシウイルス、ノダウイルス、コロナウイルス、アルテリウイルス、フラビウイルス、およびトガウイルスを含むがこれらに限定されない。ピコルナウイルスの例は、エンテロウイルス（ポリオウイルス１）、ライノウイルス（ヒトライノウイルス１Ａ）、ヘパトウイルス（Ａ型肝炎ウイルス）、カルジオウイルス（脳心筋炎ウイルス）、アフトウイルス（口蹄疫疾病ウイルスＯ）、およびパレコウイルス（ヒトエコーウイルス２２）を含む。カリシウイルスの例は、ベジクロウイルス（ブタ水疱疹ウイルスウイルス）、ラゴウイルス（ウサギ出血病ウイルス）、「ノーウォーク様ウイルス」（ノーウォークウイルス）、「サッポロ様ウイルス」（サッポロウイルス）、および「Ｅ型肝炎様ウイルス」（Ｅ型肝炎ウイルス）を含む。ベータノダウイルス（シマアジ神経壊死症ウイルス）は、代表的なノダウイルスである。コロナウイルスは、コロナウイルス（トリ伝染性気管支炎ウイルス）およびトロウイルス（ベルンウイルス）を含む。アルテリウイルス（ウマ動脈炎ウイルス）は、代表的なアルテリウイルスである。トガウイルスは、アルファウイルス（シンドビスウイルス）およびルビウイルス（風疹ウイルス）を含む。最後に、フラビウイルスは、フラビウイルス（黄熱病ウイルス）、ペスチウイルス（ウシウイルス性下痢症ウイルス）、およびヘパシウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス）を含む。
ある実施形態では、ウイルス感染は、慢性Ｂ型肝炎、慢性Ｃ型肝炎、ＨＩＶ感染、ＲＳＶ感染、ＨＳＶ感染、ＶＳＶ感染、ＣＭＶ感染、およびインフルエンザ感染から選択される。
一実施形態において、防止されるおよび／または治療される感染は、ウイルスおよび／または細菌によって起きる上気道感染である。別の実施形態では、防止されるおよび／または治療される感染は鳥類インフルエンザである。
細菌感染は、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、シュードモナスを含むがこれらに限定されない。
一実施形態において、細菌感染は細胞内細菌感染である。細胞内細菌感染は、マイコバクテリア（結核）、クラミジア、マイコプラズマ、リステリア、および黄色ブドウ球菌等の通性細胞内細菌等の、細胞内細菌による感染を指す。
寄生虫感染は、蠕虫感染、特に腸管虫感染を含むがこれに限定されない。
腫瘍は良性および悪性腫瘍（すなわち癌）の両方を含む。
癌は、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、上皮内新生物、白血病、リンパ腫、肝癌、肺癌、メラノーマ、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、および腎癌を含むがこれらに限定されない。
ある実施形態では、癌は、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、悪性メラノーマ、扁平上皮癌腫、腎細胞癌腫、前立腺癌腫、膀胱細胞癌腫、乳癌腫、卵巣癌腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肝細胞癌腫、基底細胞癌、結腸癌腫、子宮頸部異形成、およびカポジ肉腫（ＡＩＤＳ関連および非ＡＩＤＳ関連）から選択される。
アレルギーは、呼吸アレルギー、接触アレルギー、および食物アレルギーを含むがこれらに限定されない。
免疫異常は、自己免疫疾病、免疫不全、および免疫抑制を含むがこれらに限定されない。
自己免疫疾病は、糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎，角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、腟炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候、突発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬、後部ブドウ膜炎、および間質性肺線維症を含むがこれらに限定されない。 免疫不全は、自発性免疫不全、後天性免疫不全（ＡＩＤＳを含む）、薬剤性免疫不全（移植に使用される免疫抑制剤および癌を治療するために使用される化学療法薬によって誘発されるもの等）、慢性血液透析によって引き起こされる免疫抑制、外傷、または外科手技を含むがこれらに限定されない。
免疫抑制は、細胞毒性化学療法による骨髄抑制を含むがこれに限定されない。
ｓｉＲＮＡは近年出版された発表された多数の例で、抗ウイルス性治療の可能性として非常に効果的であることが示された。ウイルス性ゲノムにおける標的に対して作られるｓｉＲＮＡ分子は、インフルエンザ（非特許文献５〜７）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）（非特許文献８）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（非特許文献９）、Ｃ型肝炎ウイルス（非特許文献１０および１１）、およびＳＡＲＳコロナウイルス（非特許文献１２）の動物モデルにおいてオーダー分だけによってウイルス性力価を劇的に削減する。
これらのおよび他の核酸ベースのセラピーを使用するための機会は、非常に期待でき、現在の、従来の医療では扱われることができない医学的問題に対する解決法を提供する。疾病関連の遺伝子の数の増加の位置および配列は、同定され、様々な疾病に対する核酸ベースの治療の臨床試験は、現在進行中である。
Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９１，８０６−８１１ Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５，１８８−２００ Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ．，２００３，６７，６５７−６８５ Ａｌｉｓｋｙ＆Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００４，４，４５−５１ Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，８６７６−８６８１ Ｔｏｍｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，８６８２−８６８６ Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，４９５−５０５ Ｂｉｔｋｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１，５０−５５ Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１００２−１００７ Ｋａｐａｄｉａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，２０１４−２０１８ Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，２７８３−２７８８ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１，９４４−９５１
様々なリガンドとオリゴヌクレオチドとの結合のために開発された異なる合成戦略にも関わらず、リガンドオリゴヌクレオチド共役体の合成は、決してわずかではなく、有機化学および固相合成における豊富な専門的知識を必要とする。実際の進展は多種多様のリガンドおよびオリゴヌクレオチドに対して利用することができる共役反応を使用することであろう。アルキンおよびアジ化物のＨｕｉｓｇｅｎ１、３双極性付加環化、［クリック」反応は、穏やかな条件下で２つの分子の不可逆的な共役のために特に魅力的である。「クリック」ケミストリーは、オリゴヌクレオチドと炭水化物、ペプチドおよびタンパク質、蛍光標識および脂質とを共役するために効率的な戦略として近年浮上した。したがって、リガンドとオリゴヌクレオチドとの結合のために「クリック」ケミストリーに利用することができる新しい試薬の明確な必要性がある。本発明は、この重要な目的に向けられる。
本発明は、「クリック」ケミストリーをとおして、様々なリガンドとオリゴヌクレオチド、例えばｉＲＮＡ剤とを共役するために、リボース置換として使用できる、またはユニバーサル塩基として使用できる化合物に関する。これらの化合物は、本明細書において「クリック担体」と呼ばれる。
例えば、本発明は、式（Ｉ）に示す構造を有する化合物を特徴とする。
式中、
ＸはＯ、Ｓ、ＮＲＮまたはＣＲＰ ２であり、
Ｂはそれぞれ存在ごとに独立して水素、任意に置換された天然または非天然核酸塩基、任意に置換されたトリアゾールまたは任意に置換されたテトラゾール、ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ（ＣＨ２Ｂ１）３、ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ２Ｂ１）３であり、Ｂ１はハロゲン、メシル酸塩、Ｎ３、ＣＮ、任意に置換されたトリアゾールまたは任意に置換されたテトラゾールであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ存在ごとに独立してＨ、ＯＲ６、Ｆ、Ｎ（ＲＮ）２、Ｎ３、ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｎ３、−Ｊ−リンカー−ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８、−Ｊ−リンカー−シクロアルキン、−Ｊ−リンカー−ＲＬ、または−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬであり、
Ｊは存在しないか、Ｏ、Ｓ、ＮＲＮ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＳＯ、ＮＨＳＯ２、ＮＨＳＯ２ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）Ｏ、もしくはＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）であり、
Ｒ６はそれぞれ存在ごとに独立して水素、ヒドロキシル保護基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−式（Ｉ）、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、またはＰ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチドであり、
ＲＮはそれぞれ存在ごとに独立してＨ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたヘテロアリール、またはアミノ保護基であり、
ＲＰはそれぞれ存在ごとに独立してＨ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、または任意に置換されたヘテロアリールであり、
Ｑは存在しないか、またはそれぞれ存在ごとに独立して
であり、
ＲＬは水素またはリガンドであり、
Ｒ８はＮまたはＣＲ９であり、
Ｒ９はＨ、任意に置換されたアルキル、もしくはシリルであり、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ存在ごとに独立してＯ、Ｓ、または任意に置換されたアルキルである、
但し、Ｂが未置換の天然塩基である場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、または−リンカー−Ｑ−ＲＬである。
一態様において、本発明は、式（Ｉａ）に示す構造を有する化合物を特徴とする。
式中、Ｔ１およびＴ２はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ９アルキル、Ｃ２−Ｃ９アルケニル、Ｃ２−Ｃ９アルキニル、置換したＣ１−Ｃ９アルキル、置換したＣ１−Ｃ９アルケニルおよび置換したＣ２−Ｃ９アルキニルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘ、およびＢは以前に定義された通りである。
一実施形態において、本発明は、式（ＩＩ）に示す構造を有する化合物を特徴とする。
ＡおよびＢはそれぞれ存在ごとに独立して水素、保護基、任意に置換された脂肪族、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−ヌクレオシド、または−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−オリゴヌクレオチドであり、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ存在ごとに独立してＯ、Ｓ、または任意に置換されたアルキルであり、
Ｊ１およびＪ２は、独立してＯ、Ｓ、ＮＲＮ、任意に置換されたアルキル、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）Ｏ、またはＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）であり、
は、環式基または非環式基であり、好ましくは、環式基はピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１、３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択され、好ましくは、非環式基はセリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択され、
Ｑはそれぞれ存在ごとに独立して
であり、
Ｌ１０およびＬ１１は独立して存在しないかまたはリンカーである。
本発明の別の実施形態では、薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせて、治療上の本発明のｉＲＮＡ剤の有効量を含む、開示された医薬組成物が存在する。本発明のさらに別の実施形態では、化合物を調製するためのプロセスを記載する。
一本鎖オリゴヌクレオチドの代表的なクリック−共役体の概略図。５’末端との複数の共役および複数のものの全ての組み合わせは、リンカー骨格設計で可能であり、したがってリガンドが結合する。化学を選択することおよび共役の順序で、ヘテロ−リガンド（別々のリガンドまたはハイブリッドリガンド）共役が行われる。 二本鎖オリゴヌクレオチドの代表的なクリック−共役体の概略図。５’末端との複数の共役および複数のものの全ての組み合わせは、リンカー骨格設計で可能であり、したがってリガンドが結合する。化学を選択することおよび共役の順序で、ヘテロ−リガンド（別々のリガンドまたはハイブリッドリガンド）共役が行われる。 銅を含まないクリックケミストリーに対する環ひずみアルキン。 クリックケミストリーを使用した、リガンドとアンタゴｍｉｒ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡとの３’−の共役。使用されるアルキンは、鎖式または環状制約される。銅がない場合にクリック反応に対して使用された環状制約されたもの。経路１。リガンド−アジ化物と固形支持体の結合後、固相合成、脱保護、およびオリゴヌクレオチドの精製。経路２。リガンド−アジ化物と固体結合のオリゴヌクレオチドとの共役後、脱保護および精製。経路３。合成後のリガンド−アジ化物とオリゴヌクレオチドを有するアルキンとの共役。相補鎖を用いたアニーリングは、ｓｉＲＮＡを与える。共役する一本鎖の直接使用は、共役体のアンタゴｍｉｒおよびアンチセンスの適用を可能にする。Ｌはリンカー骨格であり、ＸはＯまたはＳであり、Ｒはリガンドであり、ｐは環炭素の置換の有無に関わらずゼロまたは３〜８である。環は、Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＳＯ、ＳＯ２等のヘテロ原子を有することもできる。環炭素上の置換は、ＱがＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２、ＣＯＯＭｅ、ＮＨ（アルキル）、パーフルオロ置換である場合、Ｆ、ＯＭｅ、ＣＯＱとの単一または双生児のジ置換である。環状アルキンのサイトテザリングは、ＯｒｇａｎｉｃＬｅｔｔｅｒｓ，２００８，１０，３０９７−９９においてＳｌｅｔｔｅｎとＢｅｒｔｏｓｚｚによって説明される窒素原子であり得る。アルキンと固体結合したアジ化物とのの逆共役は、別のアプローチである、または逆共役はポスト合成を介して達成することができる。いくつかの場合において、他の位置異性体は、入ってくるアジ化物の性質およびアルキンの性質に依存する主要産物または唯一の産物として期待される。別の場合において、産物は同じ反応から形成することができる２つの位置選択的産物の等モル混合物であり得る。銅を含まないクリックケミストリーのための環ひずみ環状アルキンを使用するために関連した参照は、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ｐｈｏｔｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｓｔａｒ ｐｏｌｙｍｅｒｓ．ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００８，（２６），３０６４−３０６６；Ｓｌｅｔｔｅｎ ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｓｚｚｉ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ａ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ａｚａｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ ｆｏｒ Ｃｕ−ｆｒｅｅ ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，１０，３０９７−９９；Ｂａｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ ｃｈｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｄｙｎａｍｉｃ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００７，１０４（４３），１６７９３；Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｚｉｄｅｓ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６， １，６４４、およびＣｈｅｎ，Ｆｉｓｈ ‘ｎ ｃｌｉｃｋｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，４（７），３９１−９２、を含む。 クリックケミストリーを使用した、リガンドとアンタゴｍｉｒ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡとの５’−の共役。使用されるアルキンは、環状制約の鎖式である。銅がない場合にクリック反応に対して使用された環状制約されたもの。経路１。リガンド−アジ化物と固形支持体結合のオリゴヌクレオチドとの共役後、脱保護およびオリゴヌクレオチドの精製。経路２。合成後のリガンド−アジ化物とオリゴヌクレオチドを有するアルキンとの共役。相補鎖を含むアニーリングは、ｓｉＲＮＡを与える。共役する一本鎖の直接使用は、共役体のアンタゴｍｉｒおよびアンチセンスの適用を可能にする。詳細な説明について図４を参照。 脱塩基リンカーおよびクリックケミストリーを使用してリガンドとアンタゴｍｉｒ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡとの共役。脱塩基リンカーおよびクリックケミストリーを使用してリガンドとアンタゴｍｉｒ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡとの共役。Ｒは、リガンドであり、使用されるアルキンは、環状制約の鎖式である。銅がない場合にクリック反応に対して使用された環状制約されたもの。詳細については、図４のレジェンドを参照。 ｓｉＲＮＡのリガンド結合点を表す概略図。 オリゴヌクレオチドのリガンド結合点を表す概略図。 クリックケミストリーによるリガンドとオリゴヌクレオチドの結合のための共役戦略。 クリックケミストリーに対する脱塩基リンカー。 クリックケミストリーに対する脱塩基リンカー。 クリックケミストリーによるリガンド共役のＨＰＬＣ解析。 精製したクリックケミストリー共役のＨＰＬＣ解析 アジド標識したオリゴヌクレオチドを表す概略図。 クリックケミストリーによってアジド標識したオリゴヌクレオチドと共役する６−カルボキシフルオセイン−プロパルギルアミンを表す概略図。 ６−カルボキシフルオセイン−プロパルギルアミンとアジ化物標識したオリゴヌクレオチドとの間のクリックケミストリー反応の粗産物のＬＣ−ＭＳ解析。 ＲＮＡアルキンとの遊離スペルミンアジ化物のクリック反応の逆相ＨＰＬＣ解析。 アルキンとＢｏｃ保護スペルミン−アジ化物との共役の粗い反応混合物の逆相ＨＰＬＣ（ａ）およびＬＣ−ＭＳ解析。 表６の修飾したＲＮＡ配列を作製するために使用する特別なアミダイトおよびＣＰＧを表す概略図。 ＲＮＡ−アルキン骨格を作製するために使用する特別なアミダイトおよびＣＰＧを表す概略図。これらのモノマーを組み込んだ配列は、表７に示す。 図２１（ａ）は表８および９の修飾したＲＮＡ配列を作製するためのクリック反応に使用される例示的なアジ化物を表す概略図であり、（ｂ）はクリック反応後のモノマーを表す概略図である。 オリゴヌクレオチドに組み込まれた後の修飾したモノマーを表す概略図。これらのモノマーを組み込んだ配列は、表１０に示す。 修飾したＲＮＡ（配列番号３８）を表す概略図。 精製されたクリック産物のＲＰ−ＨＰＬＣ解析（表１１を参照）（解析条件、１反応完了は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定された（ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ４カラム、１５０ｘ３．９ｍｍ Ｉ．Ｄ．、５μｍ、３００Å、緩衝液Ａ：５０ｍＭ ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０、緩衝液Ｂ：ＡＣＮ、勾配：２４分で０〜７０％緩衝液Ｂ、３０℃、１ｍＬ／分）。 精製されたクリック産物（配列番号１１３、７５−７６、８２−８３、および９５−９８）のＲＰ−ＨＰＬＣ解析（表１１を参照）（解析条件、１反応完了は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定された（ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ４カラム、１５０ｘ３．９ｍｍ Ｉ．Ｄ．、５μｍ、３００Å、緩衝液Ａ：５０ｍＭ ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０、緩衝液Ｂ：ＡＣＮ、勾配：２４分で０〜７０％緩衝液Ｂ、３０℃、１ｍＬ／分）。 選択した修飾したｓｉＲＮＡの用量反応曲線。
一実施形態において、本発明の化合物は上記に図示されるように式ＩまたはＩＩによって表される化合物である、またはその薬学的に許容される塩、エステルもしくはプロドラッグである。
あるいは、式Ｉ、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグは、以下のように表することができる。
一実施形態において、ＸはＯ、Ｓ、ＮＲＮ、またはＣＲＰ ２である。
一実施形態において、Ｂは水素、任意に置換された天然もしくは非天然核酸塩基、任意に置換されたトリアゾール、または任意に置換されたテトラゾール、ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ（ＣＨ２Ｂ１）３、ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ２Ｂ１）３であり、式中Ｂ１は独立してハロゲン、メシル酸塩、Ｎ３、ＣＮ、任意に置換されたトリアゾール、または任意に置換されたテトラゾールであり、式中核酸塩基を−Ｊ−リンカー−Ｎ３、−Ｊ−リンカー−ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８、−Ｊ−リンカー−シクロアルキン、−Ｊ−リンカー−ＲＬ、−リンカー−Ｑ−ＲＬ、または−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬによってさらに置換することができる。Ｂ１は、水素でもあり得る。
一実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立してＨ、ＯＲ６、Ｆ、Ｎ（ＲＮ）２、Ｎ３、ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｎ３、−Ｊ−リンカー−ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８、−Ｊ−リンカー−シクロアルキン、−Ｊ−リンカー−ＲＬ、−リンカー−Ｑ−ＲＬ、または−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬである。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立してＲ６であることもできる。
一実施形態において、Ｊは存在しないか、Ｏ、Ｓ、ＮＲＮ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＳＯ、ＮＨＳＯ２、ＮＨＳＯ２ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）Ｏ、またはＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）である。
一実施形態において、Ｒ６は水素、ヒドロキシル保護基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−式（Ｉ）、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、またはＰ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチドである。
一実施形態において、ＲＮはＨ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたヘテロアリール、またはアミノ保護基である。
一実施形態において、ＲＰは独立してＨ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、または任意に置換されたヘテロアリールである。
一実施形態において、Ｑは
である。
一実施形態において、ＲＬは水素またはリガンドである。
一実施形態において、Ｒ８はＮまたはＣＲ９である。
一実施形態において、Ｒ９はＨ、任意に置換されたアルキル、またはシリルである。
一実施形態において、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、または任意に置換されたアルキルである。
式Ｉの本実施形態において、Ｑ、−Ｎ３、−ＣＮ、−Ｃ≡Ｒ８、任意に置換されたトリアゾール、または任意に置換されたテトラゾールは化合物において少なくとも一度は存在しなければならない。例えば、Ｒ１は、少なくとも１つの事例において、Ｎ３、ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｎ３、−Ｊ−リンカー−ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８、−リンカー−Ｑ−ＲＬ、または−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬであり、Ｒ２は、少なくとも１つの事例において、Ｎ３、ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｎ３、−Ｊ−リンカー−ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８、−リンカー−Ｑ−ＲＬ、または−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬであり、Ｒ３は、少なくとも１つの事例において、Ｎ３、ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｎ３、−Ｊ−リンカー−ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８、−リンカー−Ｑ−ＲＬ、または−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬであり、Ｒ４は、少なくとも１つの事例において、Ｎ３、ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｎ３、−Ｊ−リンカー−ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８、−リンカー−Ｑ−ＲＬ、または−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬであり、Ｒ５は、少なくとも１つの事例において、Ｎ３、ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｎ３、−Ｊ−リンカー−ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８、−リンカー−Ｑ−ＲＬ、または−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬであり、Ｂは、少なくとも１つの事例において、任意に置換されたトリアゾール、または任意に置換されたテトラゾール、ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ（ＣＨ２Ｂ１）３、ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ２Ｂ１）３、式中、Ｂ１はＮ３、ＣＮ、任意に置換されたトリアゾールまたは任意に置換されたテトラゾールであり、式中核酸塩基は−Ｊ−リンカー−Ｎ３、−Ｊ−リンカー−ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８、−リンカー−Ｑ−ＲＬ、または−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬによってさらに置換される、またはこれらの組み合わせ。一実施形態において、Ｒ１は−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬまたは−リンカー−Ｑ−ＲＬである。したがって、一実施形態において、Ｒ２は−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬまたは−リンカー−Ｑ−ＲＬであり、一実施形態において、Ｒ３は−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬまたは−リンカー−Ｑ−ＲＬであり、一実施形態において、Ｒ４は−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬまたは−リンカー−Ｑ−ＲＬであり、一実施形態において、Ｒ５は−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬまたは−リンカー−Ｑ−ＲＬであり、一実施形態において、Ｂは−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬまたは−リンカー−Ｑ−ＲＬを含む。
別の実施形態では、担体は式（ＩＩＩ）に示すようにリボース糖である。本実施形態において、化合物、例えばクリック−担体化合物は、ヌクレオシド／ヌクレオチドまたはヌクレオシド／ヌクレオチド類似体である。
一実施形態において、同じ化合物のＲ２およびＲ４はロックされた核酸（ＬＮＡ）と同様の「ロックされた」化合物を形成するために一緒に結合される。
一実施形態において、Ｒ１およびＲ４はＨである。
一実施形態において、Ｒ１は−Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、または−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬであり、ＢはＨである。
一実施形態において、同じ化合物のＲ２およびＲ４はロックされた核酸（ＬＮＡ）と同様の「ロックされた」化合物を形成するために一緒に結合される。
一実施形態において、Ｂが水素の場合、Ｒ１は−Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７）−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、または−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬである。
一実施形態において、ＢはＨである。
一実施形態において、ＢはＣ５の位置においてピリミジン置換される。
一実施形態において、Ｒ２はＯＲ６であり、Ｒ３は−Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、または−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬであり、ＲＬは存在する。
一実施形態において、Ｒ３はＯＲ６であり、Ｒ２は−Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、または−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬであり、ＲＬは存在する。
一実施形態において、Ｒ２はＯＨである。
一実施形態において、Ｒ９はＨである。
一実施形態において、Ｒ５は−Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、または−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬであり、ＲＬは存在する。
一実施形態において、Ｒ５は−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｆＣ≡ＣＲ９であり、ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ４は−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｆＣ≡ＣＲ９であり、ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ３は−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｆＣ≡ＣＲ９であり、ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ２は−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｆＣ≡ＣＲ９であり、ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ１は−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｆＣ≡ＣＲ９であり、ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｂは−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｆＣ≡ＣＨで置換される核酸塩基であり、ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ５は
であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ４は
であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ３は
であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ２は
であり、ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ１は
であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｂは
で置換される核酸塩基であり、ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｂは
で置換される核酸塩基である。
一実施形態において、Ｂは
で置換される核酸塩基である。
一実施形態において、Ｒ５は−Ｏ−（ＣＨ２）ｆＣ≡ＣＲ９であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ４は−Ｏ−（ＣＨ２）ｆＣ≡ＣＲ９であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ３は−Ｏ−（ＣＨ２）ｆＣ≡ＣＲ９であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ２は−Ｏ−（ＣＨ２）ｆＣ≡ＣＲ９であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ１は−Ｏ−（ＣＨ２）ｆＣ≡ＣＲ９であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｂは−Ｏ−（ＣＨ２）ｆＣ≡ＣＨで置換される核酸塩基であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ５は
であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ４は
であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ３は
であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ２は
であり、式中ｆは１−２０である。
一実施形態において、Ｒ１は
であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｂは
で置換される核酸塩基であり、式中ｆは１〜２０である。
一実施形態において、ｆは１、２、３、４、または５である。好ましい実施形態では、式中ｆは１である。
一実施形態において、Ｑは
である。
一実施形態において、Ｑは
である。
一実施形態において、Ｑは
である。
一実施形態において、Ｑは
である。
一実施形態において、式（Ｉ）のリボース糖は式（Ｉ’）
に示す構造を有し、変数は式（Ｉ）に対して上記に定義される通りである。
一実施形態において、式（Ｉ）のリボース糖は式（Ｉ’ａ）
に示す構造を有する。
式中、Ｔ１およびＴ２はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ９アルキル、Ｃ２−Ｃ９アルケニル、Ｃ２−Ｃ９アルキニル、置換したＣ１−Ｃ９アルキル、置換したＣ１−Ｃ９アルケニル、および置換したＣ２−Ｃ９アルキニルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘ、およびＢは以前に定義された通りである。
一実施形態において、式（Ｉ）のリボース糖は、式（Ｉ’’）
に示す構造を有し、変数は式（Ｉ）に対して上記に定義される通りである。
一実施形態において、式（Ｉ）のリボース糖は式（ＩＩ’ａ）に示される構造を有し、
式中、Ｔ１およびＴ２はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ９アルキル、Ｃ２−Ｃ９アルケニル、Ｃ２−Ｃ９アルキニル、置換したＣ１−Ｃ９アルキル、置換したＣ１−Ｃ９アルケニルおよび置換したＣ２−Ｃ９アルキニルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘ、およびＢは以前に定義された通りである。
一実施形態において、式（Ｉ）のクリック−担体化合物がオリゴヌクレオチドの５’末端にある場合、オリゴヌクレオチドはクリック−担体化合物のＲ５位置において結び付けられる。
一実施形態において、式（Ｉ）のクリック−担体化合物がオリゴヌクレオチドの３’末端にある場合、オリゴヌクレオチドはクリック−担体化合物のＲ３またはＲ２の位置で結び付けられる。
一実施形態において、式（Ｉ）のクリック−担体化合物がオリゴヌクレオチドの末端の位置にない場合、化合物のＲ５の位置は、片方はオリゴヌクレオチドの３’−または２’−の位置に結び付けられ、化合物のＲ２またはＲ３の位置はもう一方のオリゴヌクレオチドの５’−位置に結び付けられる。
一実施形態において、２つの異なるクリック−担体化合物は相補官能基を含み、相互にクリックされる。一実施形態において、相補官能基はあるクリック−化合物のＲ５位置および二次化合物のＲ２またはＲ３の位置にある。一実施形態において、相補官能基はあるクリック−化合物のＲ５の位置および二次化合物のＲ５の位置にある。一実施形態において、相補官能基はあるクリック−化合物のＲ２またはＲ３の位置、および二次化合物のＲ２またはＲ３の位置にある。
いくつかの実施形態において、Ｂはリンカーと担体を結ぶクリック−担体の一部を形成することができる。例えば、−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬプリン核酸塩基のＣ２、Ｃ６、Ｃ７、もしくはＣ８の位置、またはピリミジン核酸塩基のＣ２、Ｃ５、またはＣ６の位置において存在することができる。リンカーは、核酸塩基に直接、またはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ Ｃ（Ｏ）ＮＨなどの１つ以上の介在基を介して間接的に、結合することができる。ある実施形態では、上記のクリック−担体において、Ｂはウラシリル、またはユニバーサル塩基、例えばアリール部分、例えば任意に追加置換基を有するフェニル、例えば１つ以上のフルオロ基である。
一実施形態において、本発明は式（ＩＶ）に示す構造を有する化合物を特徴とする。
式中、Ｒ１０およびＲ２０はそれぞれ存在ごとに独立して水素、任意に置換された脂肪族、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＸは第１の実施形態に定義された通りである。
一実施形態において、本発明は式（ＩＶａ）に示す構造を有する化合物を特徴とする。
式中、Ｔ１およびＴ２は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ９アルキル、Ｃ２−Ｃ９アルケニル、Ｃ２−Ｃ９アルキニル、置換したＣ１−Ｃ９アルキル、置換したＣ１−Ｃ９アルケニル、および置換したＣ２−Ｃ９アルキニルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１０、Ｒ２０、およびＸは以前に定義された通りである。
一実施形態において、本発明は式（Ｖ）に示す構造を有する化合物を特徴とする。
式中、Ｂ１はハロゲン、Ｎ３、ＣＮ、任意に置換されたトリアゾール、または任意に置換されたテトラゾールである。Ｂ１はメシル酸塩でもあり得る。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が第１の実施形態に定義された通りである。
一実施形態において、本発明は式（Ｖａ）に示す構造を有する化合物を特徴とする。
式中、Ｂ１はハロゲン、Ｎ３、ＣＮ、任意に置換されたトリアゾール、または任意に置換されたテトラゾールであり、Ｔ１およびＴ２はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ９アルキル、Ｃ２−Ｃ９アルケニル、Ｃ２−Ｃ９アルキニル、置換したＣ１−Ｃ９アルキル、置換したＣ１−Ｃ９アルケニル、および置換したＣ２−Ｃ９アルキニルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は以前に定義した通りである。
一実施形態において、担体は式（ＶＩ）に示されるピロリン環系を基づくことができる。
式中、Ｅ存在しないかもしくはＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、またはＳＯ２ＮＨであり、
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、およびＲ１８はそれぞれ存在ごとに独立してＨ、−ＣＨ２ＯＲａ、またはＯＲｂであることができ、
ＲａおよびＲｂはそれぞれ存在ごとに独立して水素、ヒドロキシル保護基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−式（Ｉ）、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、またはＰ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチドであり、
Ｒ３０はそれぞれに発生に対して独立して−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、−リンカー−ＲＬ、またはＲ３１であり、
Ｑは存在しないか、またはそれぞれ存在ごとに独立して
であり、
ＲＬは水素またはリガンドであり、
Ｒ８はＮまたはＣＲ９であり、
Ｒ９はＨ、任意に置換されたアルキル、もしくはシリルであり、
Ｒ３１は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（Ｎ（Ｒ３２）２）（ＣＨ２）ｈＮ（Ｒ３２）２であり、
Ｒ３２はそれぞれ存在ごとに独立してＨ、−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、−リンカー−ＲＬ、またはＲ３１であり、
ｆおよびｈはそれぞれ存在ごとに独立して１〜２０であり、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ存在ごとに独立してＯ、Ｓ、または任意に置換されたアルキルである。
ピロリンベースのクリック−担体に対して、Ｒ１１は−ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ３はＯＲｂである、またはＲ１１は−ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ９はＯＲｂである、またはＲ１１は−ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ１７はＯＲｂである、またはＲ１３は−ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ１１はＯＲｂである、またはＲ１３は−ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ１５はＯＲｂである、またはＲ１３は−ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ１７はＯＲｂである。ある実施形態では、ＣＨ２ＯＲａおよびＯＲｂをジェミナルに置換することができる。４−ヒドロキシプロリンベースの担体に対して、Ｒ１１は−ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ１７はＯＲｂである。ピロリン−および４−ヒドロキシプロリンベースの化合物は、したがって結合（例えば、炭素炭素結合）を含むことができ、結合回転は特定の連鎖、例えば環が存在することから生じる制限について限定される。したがって、ＣＨ２ＯＲａおよびＯＲｂは、上記に描写される対形成のうちのいずれかにおいてお互いに関してシスまたはトランスであり得る。その結果、全てのシス／トランス異性体は特に含まれる。化合物は、１つ以上の不斉中心も含むことができ、したがってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一鏡像異性体、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として発生する。全てのかかる化合物の異性体は、特に含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＲａおよびＯＲｂを有している中心は、両方ともＲ配置を有することができる、または両方ともＳ配置をふくむことができる、または１つの中心は、Ｒ配置を有することができ、他の中心はＳ配置を有することができ、逆もまた同じである）。
一実施形態において、Ｒ１１はＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ９はＯＲｂである。
一実施形態において、Ｒｂは固形支持体である。
一実施形態において、Ｒ３０は−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｆＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｇＣ≡ＣＲ９であり、式中ｆおよびｇは独立して１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ３０は
であり、式中、ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ３０は
であり、式中、ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ３０は
であり、式中、ｆは１〜２０である。
一実施形態において、Ｒ３０は
である。
一実施形態において、Ｒ３０は
である。
ある好ましい実施形態において、Ｒ３０はＲ３１である。
ある好ましい実施形態において、Ｒ３１は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（Ｎ（Ｒ３２）２）（ＣＨ２）４Ｎ（Ｒ３２）２であり、少なくとも１つのＲ３２は−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｆＣ≡Ｒ８または−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬであり、ＲＬは存在する。
ある好ましい実施形態において、Ｒ３１は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（Ｎ（Ｒ３２）２）（ＣＨ２）４ＮＨ２であり、少なくとも１つのＲ３２は−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｆＣ≡Ｒ８または−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬであり、ＲＬは存在する。
一実施形態において、Ｒ３２は−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｆＣ≡Ｒ８である。
一実施形態において、Ｒ３２は−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）３Ｃ≡Ｈである。
一実施形態において、Ｒ３１は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２である。
一実施形態において、特性の非環状糖交換ベースの化合物、例えば糖交換ベースのクリック−担体化合物は、本明細書においてリボース置換化合物サブユニット（ＲＲＭＳ）化合物の化合物としても称される。好ましい非環状担体は、以下の式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）に示す構造を有することができる。
一態様において、本発明は、式（ＶＩＩ）に示す構造を有する非環状クリック−担体化合物を特徴とする。
式中、
Ｗは存在しないか、Ｏ、Ｓ、およびＮ（ＲＮ）であり、式中、ＲＮはそれぞれ存在ごとに独立してＨ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたヘテロアリール、またはアミノ保護基であり、
Ｅは存在しないかもしくはＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、またはＳＯ２ＮＨであり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ存在ごとに独立して、水素、ヒドロキシル保護基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−式（Ｉ）、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、またはＰ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチドであり、
Ｒ３０はそれぞれに発生に対して独立して−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、−リンカー−ＲＬ、またはＲ３１であり、
Ｑは存在しないか、またはそれぞれ存在ごとに独立して
であり、
ＲＬは水素またはリガンドであり、
Ｒ８はＮまたはＣＲ９であり、
Ｒ９はＨ、任意に置換されたアルキル、もしくはシリルであり、
Ｒ３１は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（Ｎ（Ｒ３２）２）（ＣＨ２）ｈＮ（Ｒ３２）２であり、
Ｒ３２はそれぞれ存在ごとに独立してＨ、−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、またはＲ３１であり、
ｆおよびｈはそれぞれ存在ごとに独立して１〜２０であり、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ存在ごとに独立してＯ、Ｓ、または任意に置換されたアルキルであり、
ｒ、ｓ、およびｔはそれぞれ存在ごとに独立して０、１、２、または３である。
ｒおよびｓが異なる場合、第三炭素はＲまたはＳ配置であり得る。好ましい実施形態において、ｘおよびｙは１であり、ｚはゼロである（例えば担体はセリノールを基にする）。非環状担体は任意に例えばヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキーに置換することができる。
別の態様において、本発明は、式（ＶＩＩＩ）に示す構造を有する非環状クリック−担体化合物を特徴とする。
式中、Ｅは存在しないかもしくはＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、またはＳＯ２ＮＨであり、
ＲａおよびＲｂはそれぞれ存在ごとに独立して水素、ヒドロキシル保護基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−式（Ｉ）、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、またはＰ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチドであり、
Ｒ３０はそれぞれに発生に対して独立して−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、−リンカー−ＲＬ、またはＲ３１であり、
Ｑは存在しないか、またはそれぞれ存在ごとに独立して
であり、
ＲＬは水素またはリガンドであり、
Ｒ８はＮまたはＣＲ９であり、
Ｒ９はＨ、任意に置換されたアルキル、もしくはシリルであり、
Ｒ３１は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（Ｎ（Ｒ３２）２）（ＣＨ２）ｈＮ（Ｒ３２）２であり、
Ｒ３２はそれぞれ存在ごとに独立してＨ、−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、またはＲ３１であり、
ｆおよびｈはそれぞれ存在ごとに独立して１〜２０であり、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ存在ごとに独立してＯ、Ｓ、または任意に置換されたアルキルであり、
ｒおよびｓはそれぞれ存在ごとに独立して０、１、２、または３である。
好ましくは、Ｑ、−Ｎ３、−ＣＮ、または−Ｃ≡Ｒ８は式（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、および（ＶＩＩＩ）の化合物において少なくとも１回は存在する。
本発明に従う他の担体化合物は全ての目的に対して全てが参照により組み込まれる、２００４年８月１０日に出願された同時係属中の米国特許出願第１０／９１６，１８５号、２００４年９月２１日に出願された米国特許出願第１０／９４６，８７３号、２００４年１１月９日に出願された米国特許出願第１０／９８５，４２６号、２００７年８月３日に出願された米国特許出願第１０／８３３，９３４号、２００５年４月２７日に出願された米国特許出願第１１／１１５，９８９号、２００５年４月２９日に出願された米国特許出願第１１／１１９，５３３号の各明細書に記載される。
リンカー
「リンカー」という用語は、化合物の２つの部分を接続する有機質部分を意味する。リンカーは、典型的に直接結合または、酸素もしくは硫黄等の原子、ＮＲ１、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ等のユニット、または１つ以上のメチレンはＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ１）２、Ｃ（Ｏ）、置換したもしくは非置換のアリール、置換したもしくは非置換のヘテロアリール、置換したもしくは非置換のヘテロ環状によって中断されるまたは終結され得る、置換したもしくは非置換のアルキル、置換したもしくは非置換のアルケニル、置換したもしくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール等の原子鎖を含む、但し、Ｒ１は水素、アシル、脂肪族、または置換した脂肪族である。
一実施形態において、リンカーは構造：
−［Ｐ−Ｑ１−Ｒ］ｑ−Ｔ−
によって表され、
式中、
Ｐ、Ｒ、およびＴはそれぞれ存在ごとに独立して存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２Ｏ；ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−（任意に置換されたアルキル）−ＮＨ−、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
であり、
Ｑ１はそれぞれ存在ごとに独立して存在しないか、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｒ１００）（Ｒ２００）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ１００）（Ｒ２００）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であり、
ＲａはＨまたはアミノ酸側鎖であり、
Ｒ１００およびＲ２００はそれぞれ存在ごとに独立してＨ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲＸ）２であり、
ＲＸはそれぞれ存在ごとに独立してＨ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり、
ｑはそれぞれ存在ごとに独立して０〜２０であり、
ｎはそれぞれ存在ごとに独立して１〜２０であり、
ｍはそれぞれ存在ごとに独立して０〜５０である。
一実施形態において、リンカーは構造−［（Ｐ−Ｑ１−Ｒ）ｑ−Ｘ−（Ｐ’−Ｑ１’−Ｒ’）ｑ’］ｑ’’−Ｔを有し、式中、
Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｐ’、Ｒ’、およびＴ’はそれぞれ存在ごとに独立して存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−（任意に置換されたアルキル）−ＮＨ−、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
であり、
Ｑ１およびＱ１’は、それぞれ存在ごとに独立して存在しないか、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｒ１００）（Ｒ２００）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ１００）（Ｒ２００）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であり、
Ｘは切断可能な結合基であり、
ＲａはＨまたはアミノ酸側鎖であり、
Ｒ１００およびＲ２００はそれぞれ存在ごとに独立してＨ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲＸ）２であり、
ＲＸはそれぞれ存在ごとに独立してＨ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり、
ｑ、ｑ’、およびｑ’はそれぞれ存在ごとに独立して０〜２０であり、
ｎはそれぞれ存在ごとに独立して１〜２０であり、
ｍはそれぞれ存在ごとに独立して０〜５０である。
一実施形態において、リンカーは少なくとも１つの切断可能な結合基を含む。
切断可能な結合基
切断可能な結合基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞に侵入する際、リンカーが結合している２つの部分を放出するために切断されるものである。好ましい実施形態では、切断可能な結合基は少なくとも１０回以上、標的細胞においてまたは（例えば細胞内状態を模倣するまたは表すために選択され得る）第１の参照状態の下、対象の血液内、または（例えば血液または血清に見られる状態を模倣するまたは表すために選択され得る）第２の参照の状態の下よりも、好ましくは少なくとも１００回速く切断される。
切断可能な結合基は、切断剤、たとえばｐＨ、レドックスの可能性、または分解分子の存在に影響されやすい。一般的に、切断剤はより蔓延する、または高レベルに見られる、または血清または血液内よりも細胞内の活性である。かかる分解剤の例は、還元によってレドックス切断可能な結合基を分解することができる、特定の基質に対して選択される、または細胞に存在する例えば酸化的もしくは還元的酵素またはメルカプタン等の還元剤を含む基質特異性を有さないレドックス剤、エステラーゼ、エンドソームまたは酸性環境、例えば５ｐＨ以下を生じるものを作ることができる薬剤、一般酸、（基質特異的であり得る）ペプチダーゼ、およびホスファターゼとして作用することによって、酸性の切断可能な結合基を加水分解または分解することができる酵素を含む。
ジスルフィド結合等の切断可能な連鎖基は、ｐＨに影響されやすい。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均細胞内ｐＨは、約７．１〜７．３の範囲で、少し低い。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲のより多くの酸性のｐＨを有し、リソソームは約５．０のさらに酸性のｐＨを有する。いくつかのスペーサーは、好ましいｐＨにおいて切断される連鎖基を有し、その結果、細胞内、または細胞の好ましいコンパートメントに担体オリゴマーからｉＲＮＡ剤を放出するであろう。
スペーサーは、特定の酵素によって切断可能な結合基を含むことができる。スペーサーに組み込まれる結合基の種類は、ｉＲＮＡ剤によって標的にされる細胞に依存することができる。例えば、肝細胞においてｍＲＮＡを標的とするｉＲＮＡ剤は、エステル基を含むスペーサーを介して担体オリゴマーと結び付けられ得る。肝細胞は、エステラーゼに富んでいて、その結果テザーはエステラーゼが豊富でない細胞型においてよりも肝細胞においてより効率的に切断されるであろう。スペーサーの切断は、担体オリゴマーよりｉＲＮＡ剤を放出する、その結果ｉＲＮＡ剤のサイレンシングする活性を強める可能性がある。エステラーゼが豊富な他の細胞型は、肺、腎皮質、および精巣の細胞を含む。
ｉＲＮＡ剤が肝細胞および滑膜細胞等のペプチダーゼに富んでいる細胞型を標的としている場合、ペプチド結合を含有するスペーサーを使用することができる。例えば、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ）の治療に対する等の滑膜細胞を標的としたｉＲＮＡ剤は、ペプチド結合を含むスペーサーを介して担体オリゴマーと結びつけられ得る。
一般に、切断可能な結合基候補の適合性は、結合基候補を切断するために分解剤の能力（または状態）を試験することによって評価することができる。血液中で、または他の非標的組織、例えば対象に投与した場合にｉＲＮＡ剤に曝される組織と接触したときに、切断に抵抗する能力について、切断可能な結合基候補を試験することも望ましいであろう。したがって、第１の条件と第２の条件との間で切断に対する相対的感受性を測定することができ、ここで、第１の条件は標的細胞における切断を示すために選択され、第２の条件は、他の組織または生体液、例えば血液または血清における切断を示すように選択される。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養、臓器もしくは組織培養、または動物の全体において実施することができる。無細胞または培養状態における初期評価を実施するため、および動物の全体におけるさらなる評価によって確認するために有用であり得る。好ましい実施形態において、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外状態を模倣するために選択されたインビトロ状態下で）と比べて、細胞内（細胞内状態を模倣するために選択されたインビトロ状態下で）で少なくとも２、４、１０、または１００回速く切断される。
レドックス切断可能な結合基
切断可能な結合基の１種類は、還元または酸化の際に切断するレドックスの切断可能な結合基である。還元的に切断可能な結合基の例はジスルフィド結合基（−Ｓ−Ｓ−）である。切断可能な結合基候補が適切な「還元的に切断可能な結合基」であるか、例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的薬剤とともに使用することに適しているか測定するため、本明細書に記載される方法を試みることができる。例えば、候補を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または細胞、例えば標的細胞に認められる切断率を模倣する、当業者に知られる試薬を使用する他の還元剤とともにインキュベートされることによって評価することができる。候補を、血液または血清状態を模倣するように選択された条件下でも評価することができる。
好ましい実施形態では、候補化合物は血液中で最大１０％で切断される。好ましい実施形態において、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下）と比べて、細胞において（または細胞内条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下で）少なくとも２、４、１０、または１００倍速く分解される。候補化合物の切断率は、細胞外培地を模倣するために選択した状態と比べて、細胞内培地を模倣するために選択した条件下で酵素反応速度アッセイを使用して測定することができる。
リン酸塩ベースの切断可能な結合基
リン酸塩ベースの結合基はリン酸塩基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞においてリン酸塩基を切断する薬剤の例は、細胞におけるホスファターゼ等の酵素である。リン酸塩ベースの結合基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上記のものと類似している方法を使用して評価され得る。
酸性の切断可能な結合基
酸性の切断可能な結合基は酸性の状態下で切断される結合基である。好ましい実施形態において、酸性の切断可能な結合基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０以下）のｐＨである酸性環境において、または一般酸として作用することができる酵素等の薬剤で、切断される。細胞内で、エンドソームおよびリソソーム等の特異的に低いｐＨの小器官は、酸性の切断可能な結合基に対する切断環境を提供することができる。酸性の切断可能な結合基の例は、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルを含むがこれらに限定されない。酸性の切断可能な基は一般式の−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または−ＯＣ（Ｏ）を有することができる。好ましい実施形態は、エステル（アルコキシ基）の酸素に結合した炭素がアリール基である場合、置換したアルキル基、またはジメチルペンチルもしくはｔ−ブチル等の第三アルキル基を供する。これらの候補は、上記のものと類似している方法を使用して評価され得る。
エステルベースの結合基
エステルベースの結合基は、細胞におけるエステラーゼおよびアミダーゼ等の酵素によって切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例は、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルを含むがこれらに限定されない。エステルの切断可能な結合基は、一般式の−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）−を有することができる。これらの候補は、上記のものと類似している方法を使用して評価され得る。
ペプチドベースの切断基
ペプチドベースの結合基は細胞におけるペプチダーゼおよびプロテアーゼ等の酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能な結合基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド等）およびポリペプチドを産生するためにアミノ酸間で形成されるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質を産生するためにアミノ酸間で形成されるアミド結合の特別な種類である。ペプチドベースの切断基は、一般的に、ペプチドおよびタンパク質を産生するアミノ酸間で形成されるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基の全体を含まない。Ｒ１およびＲ２が２つの隣接アミノ酸のＲ基である場合、ペプチド切断可能な結合基は、一般式の−ＮＨＣＨＲ１Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ２Ｃ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上記のものと類似している方法を使用して評価され得る。
［クリック」反応
本発明の合成方法は、リガンドとクリック−担体化合物とを共役するためのクリックケミストリーを利用する。クリックケミストリー技術は、例えば、本明細書に全てが参考として組み込まれる以下の参照に記載される：
Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．；Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００１）４０：２００４−２０２１．
Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．ａｎｄ Ｓｈｒａｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．ＤｒｕｇＤｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ（２００３）８：１１２−１１３７．
Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，Ｖ．Ｖ．；Ｇｒｅｅｎ Ｌ．Ｇ．；Ｆｏｋｉｎ，Ｖ．Ｖ．ａｎｄ Ｓｈｒａｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００２）４１：２５９６−２５９９．
Ｔｏｒｎｏｅｅ，Ｃ．Ｗ．；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．ａｎｄ Ｍｅｌｄａｌ，Ｍ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２００２）６７：３０５７−３０６４．
Ｗａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００３）１２５：３１９２−３１９３．
Ｌｅｅ，Ｌ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００３）１２５：９５８８−９５８９．
Ｌｅｗｉｓ，Ｗ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００２）４１：１０５３−１０５７．
Ｍａｎｅｔｓｃｈ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００４）１２６：１２８０９−１２８１８．
Ｍｏｃｈａｒｌａ，Ｖ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００５）４４：１１６−１２０。
他のクリックケミストリー官能基を、上記の参照で記載されるもの等、利用することができるが、付加環化反応の使用は、特にアルキニル基を含むアジ化物の反応が好まれる。Ｃｕ（Ｉ）塩の存在下で、末端アルキンおよびアジ化物は、１，３−双極性付加環化を経て１，４−二置換１，２，３−トリアゾールを形成する。Ｒｕ（ＩＩ）塩（例えばＣｕ＊ＲｕＣｌ（ＰＰｈ３）２）の存在下で、末端アルキンおよびアジ化物は、１，３−双極性付加環化を経て１．５−二置換１，２，３−トリアゾールを形成する（Ｆｏｌｋｉｎ，Ｖ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２００５）１２７：１５９９８−１５９９９）。あるいは、１，５−二置換１，２，３−トリアゾールは、アジ化物およびアルキニル試薬を使用して形成され得る（Ｋｒａｎｉｓｋｉ，Ａ．；Ｆｏｋｉｎ，Ｖ．Ｖ．ａｎｄ Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２００４）６：１２３７−１２４０。ヘテロ−ディールス‐アルダー反応または１，３−双極性付加環化反応も使用することができる（例えばＰａｄｗａ，Ａ．１，３−Ｄｉｐｏｌａｒ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｖｏｌｕｍｅ １，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８４）１−１７６、Ｊｏｅｒｇｅｎｓｅｎ，Ｋ．Ａ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２０００）３９：３５５８−３５８８、およびＴｉｅｔｚｅ，Ｌ．Ｆ．ａｎｄ Ｋｅｔｔｓｃｈａｕ，Ｇ．Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）１８９：１−１２０）を参照。
（銅がない場合）お互いに対して本質的に非反応であり、他の官能基および反応状態に非常に耐えるため、共役パートナーとしてアジ化物およびアルキンの選択は特に有利である。この化学的適合性は、アジ化物およびアルキンの多くの異なる種類が、最低限の副反応で相互に共役することができることを確実にすることを助ける。
必要な銅種（Ｉ）は、安定化リガンドで大抵は第一銅塩、例えばＣｕＩ，ＣｕＯＴｆ．Ｃ６Ｈ６、または［Ｃｕ（ＣＨ３ＣＮ）４］［ＰＦ６］として直接添加される（例えばＴｏｒｎｏｅｅ，Ｃ．Ｗ．；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．ａｎｄ Ｍｅｌｄａｌ，Ｍ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２００２）６７：３０５７−３０６４、Ｃｈａｎ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２００４）６：２８５３−２８５５、Ｌｅｗｉｓ，Ｗ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００４）１２６：９１５２−９１５３、Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．（２００５）２０８９−２０９１、Ｄｉｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．（２００６）１２：７５５８−７５６４、およびＣａｎｄｅｌｏｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．（２００８）７４１−７４３を参照）、またはより多くの場合、還元剤で銅（ＩＩ）塩から精製される（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，Ｖ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．（２００２）１１４：２７０８−２７１１、およびＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００２）４１：２５９６−２５９９）。金属銅（例えばＨｉｍｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００５）１２７：２１０−２１６を参照）またはクラスター（例えばＰａｃｈｏｎ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．（２００５）３４７：８１１−８１５、およびＭｏｌｔｅｎｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ（２００６）３０：１１３７−１１３９を参照）も利用され得る。Ｃｈａｓｓａｉｎｇ等は、近年アジ化物−アルキン付加環化に対する触媒として銅（Ｉ）ゼオライトを報告した（Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．（２００８）１４：６７１３−６７２１）。銅（Ｉ）塩はレドックス処理を起こしやすいため、窒素または亜リン酸ベースのリガンドは、付加環化反応の間に活性銅の触媒を保護および安定するために、添加されなければならない。
反応は、非常に簡単である。アジ化物およびアルキンは、大抵は同時に水およびｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ、トルエン、またはＤＭＦ等の共溶媒に混合される。水／共溶媒は、大抵１：１〜１：９の割合である。軽度の加熱は反応時間を短くするが、反応は、大抵夜通し行われる（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｗ．Ｄ．；Ｗｕ，Ｐ．；Ｈａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｖ．；およびＬｉ，Ｊ．Ｇ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．（２００５）８２：１８３３）。水溶液系は、還元剤が必要ないように直接銅（Ｉ）種も使用することができる。反応の状態は、その後大抵、共溶媒としてアセトニトリル（必須ではないが（Ｃｈａｎ，Ｔ．Ｒ．；Ｈｉｌｇｒａｆ，Ｒ．；Ｓｈｒａｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．およびＦｏｋｉｎ，Ｖ．Ｖ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２００４）６：２８５３））およびトリエチルアミン、２，６−ルチジン、ピリジン、およびジイソプロピルアミン等の窒素塩基を必要とする。この場合、銅（Ｉ）種はＣｕＩ、ＣｕＯＴｆ．Ｃ６Ｈ６、または［Ｃｕ（ＣＨ３ＣＮ）４］［ＰＦ６］として供給される（Ｒｏｓｔｏｃｔｓｅｖ，Ｖ．Ｖ．；ＧｒｅｅｎＬ．Ｇ．；Ｆｏｋｉｎ，Ｖ．Ｖ．およびＳｈｒａｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００２）４１：２５９６−２５９９）。
水ベースの方法は、多くの用途に対して魅力的であるが、溶媒系アジ化物−アルキンの付加環化方法は、溶解度および／または他の問題が生じた場合における有用性を見出した、例えば、以下を参照されたい：
Ｍａｌｋｏｃｈ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００５）３８：３６６３．
Ｇｕｊａｄｈｕｒ，Ｒ．；Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｄ．ａｎｄ Ｊ．Ｔ．Ｋｉｎｔｉｇｈ．Ｊ．Ｔ．Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．（２００１）４２：４７９１．
Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ Ｇｒａｙｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００６）１２８：４２３８．
Ｏｐｓｔｅｅｎ，Ｊ．Ａ．；ｖａｎ Ｈｅｓｔ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００５）５７．
Ｔｓａｒｅｖｓｋｙ，Ｎ．Ｖ．；Ｓｕｍｅｒｌｉｎ，Ｂ．Ｓ．ａｎｄ Ｍａｔｙｊａｓｚｅｗｓｋｉ，Ｋ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００５）３８：３５５８．
Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００６）１２８：６５６４．
Ｓｕｍｅｒｌｉｎ，Ｂ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００５）３８：７５４０．
Ｇａｏ，Ｈ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｔｙｊａｓｚｅｗｓｋｉ，Ｋ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００６）３９：４９６０．
Ｇａｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００５）３８：８９７９．
Ｖｏｇｔ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ Ｓｕｍｅｒｌｉｎ，Ｂ．Ｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００６）３９：５２８６．
Ｌｕｔｚ，Ｊ．Ｆ．；Ｂｏｒｎｅｒ，Ｈ．Ｇ．ａｎｄ Ｗｅｉｃｈｅｎｈａｎ，Ｋ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．ＲａｐｉｄＣｏｍｍ．（２００５）２６：５１４．
Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ｇ．；Ｌａｄｍｉｒａｌ，Ｖ．；Ｔａｏ，Ｌ．ａｎｄ Ｈａｄｄｌｅｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．（２００５）２０８９。
クリック反応は、熱的に実施され得る。一態様において、クリック反応は、２５℃〜１００℃の微熱で実行される。一態様において、反応は２５℃〜７５℃、または２５℃〜６５℃、または２５℃〜５０℃で実施することができる。一実施形態において、反応は室温で実施される。別の態様において、クリック反応はマイクロ波を使用して実施することができる。マイクロ波補助クリック反応は、銅の有無に関わらず実施することができる。
一態様において、本発明は、クリック反応を介してクリック−担体化合物とリガンドとの共役方法を提供する。好ましい実施形態では、クリック反応はアジ化物とアルキニル基との付加環化反応であり銅によって触媒される。一実施形態において、等モル量のアルキンおよびアジ化物は、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０：１〜１：１の割合ｖ／ｖ）で混合され、それぞれ０．０５〜０．５モル％の［Ｃｕ（ＣＨ３ＣＮ）４］［ＰＦ６］および銅が反応に添加される。一実施形態において、ＤＣＭ／ＭｅＯＨの割合は、５：１〜１：１である。好ましい実施形態では、ＤＣＭ／ＭｅＯＨの割合は４：１である。一実施形態において、等モル量の［Ｃｕ（ＣＨ３ＣＮ）４］［ＰＦ６］および銅が添加される。好ましい実施形態では、それぞれ０．０５〜０．２５モル％の［Ｃｕ（ＣＨ３ＣＮ）４］［ＰＦ６］および銅が反応に添加される。より好ましい実施形態において、それぞれ０．０５モル％、０．１モル％、０．１５モル％、０．２モル％、または０．２５モル％の［Ｃｕ（ＣＨ３ＣＮ）４］［ＰＦ６］および銅が反応に添加される。
「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素の作用または他の化学物質および／または状態によって、体内またはその細胞内で活性型（すなわち、薬物）に変換される不活性型に調製された治療薬を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンは、Ｇｏｓｓｅｌｉｎらに対して１９９３年１２月９日に公開された国際公開第９３／２４５１０号または国際公開第９４／２６７６４号の各パンフレットおよびＩｍｂａｃｈらに対する米国特許第５，７７０，７１３号明細書に開示される方法によってＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）リン酸塩］の誘導体として調製された。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明のオリゴマー化合物の生理学的におよび薬学的に許容される塩、すなわち親化合物の好ましい生物学的活性を維持しそれに加えて不要中毒学的影響を与えない塩、を指す。オリゴヌクレオチドについて、薬学的に許容される塩の好ましい例およびそれらの使用は、本明細書にずべてが組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号明細書にさらに開示される。
リガンド
様々な実体は［クリック」反応を使用してオリゴヌクレオチド、例えばｉＲＮＡ剤と共役することができる。好ましい実体は様々な場所例えば、３’末端、５’末端、および／または内部の位置でオリゴヌクレオチドと共役することができる。
好ましい実施形態において、リガンドはリンカーを介入してｉＲＮＡ剤に結合される。化合物が成長している鎖に組み込まれる場合、リガンドは化合物上に存在することができる。いくつかの実施形態において、リガンドを「前駆物質」化合物が成長している鎖に組み込んだ後、「前駆物質」化合物に共役することで組み込むことができる。例えば、アジ化物終結リンカー（すなわち、関連リガンドを有さない）を有する化合物、例えば−リンカー−Ｎ３を、成長しているセンスまたはアンチセンス鎖に組み込むことができる。次の作業において、すなわち鎖に前駆体化合物が組み込まれた後、アルキンを有するリガンド、例えば末端アセチレン、例えばリガンド−Ｃ≡ＣＨは次に［クリック」反応によって前駆体化合物に結合することができる。あるいは、化合物リンカーはアルキン、例えば末端アセチレンを含み、リガンドは［クリック」反応を起こすためのアジ化物機能を含む。アジ化物またはアルキン機能を、当業者に知られる方法によってリガンドに組み込むことができる。例えば、アジ化物またはアルキン機能を保有する部分をリガンドと結び付けることができるまたはリガンドにおける官能基を、アジ化物またはアルキンに転換することができる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドが固形支持体に結合されている間、前駆体化合物とリガンドとの結合は生じる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドを保有する前駆物質は、先ず脱保護されるが、リガンド共役が起きる前に精製されない。一実施形態において、オリゴヌクレオチドを保有する前駆体化合物は先ず脱保護され、リガンド共役が起きる前に精製される。ある実施形態では、［クリック」反応はマイクロ波で実施される。
好ましい実施形態において、リガンドは分布、標的または組み込まれるｉＲＮＡ剤の寿命を変更する。好ましい実施形態において、リガンドは、例えばリガンドなどの不在の種と比較して、選択された標的、例えば分子、細胞もしくは細胞型、コンパートメント、例えば細胞性もしくは臓器コンパートメント、組織、臓器、または体の領域に対して親和性を提供する。好ましいリガンドは二重鎖核酸において二重鎖対形成を起こさないであろう。
好ましいリガンドはエンドソーム溶解の性質を有することができる。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解および／または本発明の組成物の輸送、またはエンドソームから細胞の細胞質までのその成分を促進する。エンドソーム溶解リガンドはポリアニオンペプチドまたはｐＨ依存膜活性および膜融合性を示すペプチド模倣であり得る。ある実施形態では、エンドソーム溶解リガンドはエンドソームのｐＨにおける活性高次構造を想定する。「活性」高次構造は、エンドソーム溶解リガンドにおける高次構造が、エンドソームの溶解および／または本発明の組成物の輸送、エンドソームから細胞の細胞質までのその成分を促進することである。例示的なエンドソーム溶解リガンドは、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４−２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１−１５８６）、およびそれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，，２００２，１５５９：５６−６８）を含む。ある実施形態では、エンドソーム溶解成分は電荷における変化またはｐＨにおける変更に対する反応におけるプロトン化を起こすであろう化学基（例えばアミノ酸）を含むことができる。エンドソーム溶解成分は直線状であるまたは分岐することができる。例示的なペプチドベースのエンドソーム溶解リガンドの一次配列は表１に示される。
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性の性質を改善することができ、結果としての天然もしくは修飾したオリゴリボヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性、または本明細書に記載される任意の化合物の組み合わせを含む高分子、および／または天然もしくは修飾したリボヌクレオチドをも改善することができる。
一般にリガンドは、例えば吸収を高めるために、治療の修飾因子、例えば分布を監視するために、診断の化合物またはレポーター基、架橋剤、およびヌクレアーゼ耐性授与部分を含むことができる。一般的な例は、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体を含む。
リガンドは、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、またはグロブリン）等の自然発生する物質、炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、またはヒアルロン酸）、または脂質を含むことができる。リガンドは、合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えばアプタマー）等の組換えまたは合成分子でもあり得る。ポリアミノ酸の例は、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬアスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ジビニルエーテル無水マレイン酸共重合体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチル酢酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンを含む。ポリアミンの例は、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、疑似ペプチドポリアミン、ペプチド模倣物のポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン脂質、カチオンポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファヘリックスのペプチドを含む。
リガンドは標的基、例えば細胞または組織標的薬剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば腎細胞等の特定の細胞型と結合する抗体を含むこともできる。標的基は、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン糖鎖、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣薬、またはアプタマーであることができる。表２はリガンドおよびその関連受容体を標的とした例のいくつかを示す。
リガンドの他の例は、染色、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、ポリ環状芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばコレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセリン、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセリン、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、およびペプチド共役体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換したアルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール共役体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰを含む。
リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク質、またはペプチド、例えばコリガンドに対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば癌細胞、内皮細胞、または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体であることができる。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体をも含むことができる。それらは、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎアセチルガラクトサミン、Ｎアセチルグルコサミン多価マンノース、多価フコース、またはアプタマー等の非ペプチド種を含むことができる。リガンドは例えば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ−κＢの活性化因子であることができる。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を分裂するために、例えば細胞の微小管、微小線維、および／または中間径フィラメントを分裂するために、物質、例えば細胞へｉＲＮＡ剤の吸収を増加させることができる薬物であることができる。薬物は、例えば分類群、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
リガンドは、例えば炎症性反応を活性化することによって細胞へのｉＲＮＡ剤の吸収を増加することができる。かかる影響を有する可能性のある例示的なリガンドは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）、インターロイキン１ベータ、またはガンマインターフェロンを含む。
一態様において、リガンドは脂質または脂質ベースの分子である。かかる脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合する。リガンドと結合するＨＳＡは、標的組織、例えば体の非腎臓標的組織に対する共役体の分布を可能にさせる。例えば、標的組織は肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡと結合する他の分子は、リガンドとして使用されることもできる。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンは使用することができる。脂質もしくは脂質ベースのリガンドは、（ａ）共役体の分解に対する耐性を増加する、（ｂ）標的細胞もしくは細胞膜を標的もしくは輸送を増加することができ、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡとの結合を調整するために使用することができる。
脂質ベースのリガンドは、調節する、例えば共役体と標的組織との結合を制御するために使用することができる。例えば、ＨＡＳとより強く結合する脂質または脂質ベースリガンドは、腎臓に対して標的とされる可能性が低い、そのため体から取り除かれる可能性は低いであろう。ＨＳＡとあまり強く結合しない脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に対して共役体を標的とするために使用することができる。
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡと結合する。好ましくは、共役体が好ましくは非腎臓組織に分布されるように、十分な親和性でＨＳＡと結合される。しかし、ＨＳＡリガンド結合は逆行され得ないほど強い親和性が好ましい。
別の好ましい実施形態では、共役体が腎臓に好ましく分布されるように、脂質ベースのリガンドはＨＳＡと弱く結合するまたは全くしない。腎細胞を標的とする他の部分は、脂質ベースのリガンドの変わりにまたは加えて使用されることもできる。
別の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば増殖細胞によって取り込まれる部分、例えばビタミンである。これらは、例えば悪性または非悪性型、例えば癌細胞の不必要細胞増殖を特徴とする疾患を治療するために特に有用である。例示的なビタミンはビタミンＡ、Ｅ、およびＫを含む。他の例示的なビタミンはＢビタミン、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または癌細胞によって吸収されたその他のビタミンもしくは栄養素を含む。また、ＨＡＳ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）も含む。
別の態様において、リガンドは細胞浸透剤、好ましくはらせん細胞浸透剤である。好ましくは、製剤は両親媒性である。例示的な製剤は、ｔａｔまたはアンテナペディア等のペプチドである。製剤がペプチドの場合、修飾され得、ペプチジル模倣、インバートマー、非ペプチド、または疑似ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含む。らせん製剤は、好ましくは親油性および疎油性相を有するアルファらせん製剤であることが好ましい。
リガンドはペプチドまたはペプチド模倣物であることができる。ペプチド模倣物（本明細書でオリゴペプチド模倣物としても引用される）は、天然ペプチドに似た定義された三次元構造に折りたたむことが可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣物のｉＲＮＡ剤への結合は、細胞認識および吸収の増強をすることによって等、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響することができる。ペプチドまたはペプチド模倣部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る（例については表３を参照）。
ペプチドまたはペプチド模倣物は、例えば細胞浸透ペプチド、カチオンペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチドであり得る（例えば、第一にＴｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅからなる）。ペプチド部分はデンドリマーペプチド、制約されたペプチド、または架橋されたペプチドであり得る。別の代替案としては、ペプチド部分は疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含むことができる。例示的な疎水性ＭＴＳを含有するペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号２６）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含むＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号２７））は、標的部分であることもできる。ペプチド部分は、細胞膜に渡ってペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きい極性分子を保有することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１７７））およびショウジョウバエアンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１１））からの配列は、送達ペプチドとして機能することが可能であることが分かった。ペプチドまたはペプチド模倣物を、ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチド等のＤＮＡのランダム配列によってコードすることができる（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１）。好ましくは組み込まれた化合物ユニットを通してｉＲＮＡ剤につながれたペプチドまたはペプチド模倣物は、アルギニングリシンアスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、またはＲＧＤ模倣物等のペプチドを標的とした細胞である。ペプチド部分は、約５個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸の範囲の長さであることができる。ペプチド部分は、安定または直接立体構造性質を増加させる等の構造修飾を有することができる。以下に記載された構造修飾のいずれかを利用することができる。
ＲＧＤペプチド部分を、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞等の腫瘍細胞を標的とするために使用することができる（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９−４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む様々な他の組織の腫瘍をｉＲＮＡ剤の標的にすることを容易にすることができる（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ８：７８３−７８７，２００１）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、腎臓をｉＲＮＡ剤の標的にすることを容易にするであろう。ＲＧＤペプチドは直線状または環状であり得、修飾される、例えば、特異的組織を標的とすることを容易にするためにグリコシル化またはメチル化され得る。例えば、グリコシル化されたＲＧＤペプチドは、αＶβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ剤を送達することができる（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６−３３６，２００１）。
増殖細胞において濃縮されたマーカーを標的にするペプチドを使用することができる。例えば、ペプチドおよびペプチド模倣物を含むＲＧＤは、癌細胞、特に
インテグリンを示す細胞を標的とすることができる。したがって、ＲＧＤペプチド、Ｄ−アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣物を含むＲＧＤ、ＲＧＤペプチドを含む環状ペプチドを使用することもできる。ＲＧＤに加えて、
インテグリンリガンドを標的にする他の部分を使用することができる。一般的に、かかるリガンドを、増殖細胞および血管新生を制御するために使用することができる。ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他の癌遺伝子、例えば本明細書に記載される癌遺伝子を標的とするこの種のリガンドの好ましい共役体。
「細胞浸透ペプチド」は、細胞、例えば細菌性もしくは真菌細胞等の微生物細胞、またはヒト細胞等の哺乳動物細胞に浸透することができる。微生物細胞に浸透するペプチドは、例えば、αらせん直線状ペプチド（例えばＬＬ−３７またはＣｅｒｏｐｉｎ Ｐ１）、ジスルフィド結合を含有するペプチド（例えば、αデフェンシン、βデフェンシン、またはバクテネシン）、または１つまたは２つのみの支配的なアミノ酸（例えば、ＰＲ−３９またはインドリシジン）を含有するペプチドであり得る。細胞浸透ペプチドは、核移行シグナル（ＮＬＳ）も含むことができる。例えば、細胞浸透ペプチドは、ＨＩＶ−１ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来するＭＰＧ等の二分両親媒性ペプチドであることができる（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤および／または担体オリゴマーにつながれた標的ペプチドは、両親媒性α−らせんペプチドであり得る。例示的な両親媒性αらせんペプチドは、セクロピン、リコトキシン（ｌｙｃｏｔｏｘｉｎ）、パラダキシン、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ）、Ｓ．ｃｌａｖａペプチド、メクラウナギ腸管抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン２、デルマセプチン、メリチン、プルロシジン（ｐｌｅｕｒｏｃｉｄｉｎ）、Ｈ２Ａペプチド、ツメガエルペプチド、エスクレンチニス（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｉｓ）１、およびカエリン（ｃａｅｒｉｎ）を含むがこれらに限定されない。要因の多くは、好ましくはらせん安定の完成性を維持すると考えられるであろう。例えば、らせん安定残基の最大数は、利用され（例えば、ロイシン、アラニン、またはリシン）、らせん不安定残基の最小数は、利用されるであろう（例えば、プロリン、または環状化合物ユニット）。キャッピング残基は、検討され（例えばグリシンは例示的なＮキャッピング残基であり、および／またはＣ末端アミド化を、らせんを安定するために必要以上のＨ結合を提供するために使用することができる。ｉ±３、またはｉ±４位置によって単離された対立する電荷を含む残基間の塩橋の形成は、安定を提供することができる。例えば、リジン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、またはヒスチジン等のカチオン残基は、陰イオン性残基グルタミン酸またはアスパラギン酸を含む塩橋を形成することができる。
ペプチドおよびペプチド模倣物のリガンドは、天然発生または修飾したペプチド、例えばＤもしくはＬペプチドを有するもの、α、β、もしくはγペプチド、Ｎメチルペプチド、アザペプチド、１つ以上のアミド、すなわちペプチドを有するペプチド、１つ以上の尿素、チオ尿素、カルバミン酸、もしくはスルホニル尿素結合と交換される結合、または環状ペプチドを含む。
標識リガンドは、特異的受容体を標的とすることが可能である任意のリガンドであり得る。例は、葉酸、ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ３、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、ＧａｌＮＡｃクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター、またはアプタマー等の糖のクラスター。クラスターは、２つ以上の糖ユニットの組み合わせである。標的リガンドは、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、内皮、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、およびＨＤＬリガンドも含む。リガンドは、核酸、例えばアプタマーを基にすることもできる。アプタマーは、未修飾であるか、または本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有することができる。
エンドソーム放出剤は、イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、膜融合ペプチド、ポリカルボキシレート、ポリカチオン、遮蔽されるオリゴまたはポリカチオンもしくはアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、オルトエステル、遮蔽されるまたは曝露されるカチオンまたは陰イオン性電荷を含むポリマー、遮蔽されるまたは曝露されるカチオンまたは陰イオン性電荷を含むデンドリマーを含む。
ＰＫ修飾薬は薬物動態修飾薬を表す。ＰＫ修飾薬は、脂肪親和性、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミン等を含む。例示的ＰＫ修飾薬は、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチン等を含むがこれらに限定されない。多くのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドは、血清タンパク質と結合することで知られる、したがって主鎖においてホスホロチオエート結合の複数を含む短オリゴヌクレオチド、例えば約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基のオリゴヌクレオチドは、リガンドとして（例えばリガンドを調節するＰＫとして）本発明も受け入れられる。
さらに、血清成分（例えば血清タンパク質）と結合するアプタマーは、リガンドを調節するＰＫとして本発明も受け入れられる。
本発明を受け入れられる他のリガンドは、全ての目的に対して全てが参照により組み込まれる２００４年８月１０日に出願された同時係属中の米国特許出願第１０／９１６，１８５号、２００４年９月２１日に出願された同第１０／９４６，８７３号、２００７年８月３日に出願された同第１０／８３３，９３４号、２００５年４月２７日に出願された同第１１／１１５，９８９号、および２００７年９月２１日に出願された同第１１／９４４，２２７号の各明細書に記載される。
２つ以上のリガンドが存在する場合は、全てのリガンドは同じ性質を有すること、異なる性質を有する、またはいくつかのリガンドは同じ性質を有するが他は異なる性質を有することができる。例えば、リガンドは標的性質を有し、エンドソーム溶解活性を有する、または性質を調節するＰＫを有することができる。好ましい実施形態では、全てのリガンドは異なる性質を有する。
リガンド、例えばクリック担体化合物を含む化合物は、オリゴヌクレオチド、例えばｉＲＮＡ剤の任意の位置において存在することができる。いくつかの実施形態において、クリック担体化合物は、ｉＲＮＡ剤の５’または３’末端等の終端において存在することができる。クリック担体化合物はｉＲＮＡ剤の内部位置において存在することもできる。二本鎖ｉＲＮＡ剤に対して、クリック担体化合物を１つのまたは両方の鎖に組み込むことができる。いくつかの実施形態において、二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖はクリック担体化合物を含む。他の実施形態において、二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、クリック担体化合物を含む。
いくつかの実施形態において、リガンドを、核酸塩基、糖部分、または核酸分子のインターヌクレオシド結合と共役することができる。プリン核酸塩基またはその誘導体との共役は、環内および環外原子を含む任意の位置で発生することができる。いくつかの実施形態において、プリン核酸塩基の２−、６−、７−、または８−の位置は、共役体部分に結合する。ピリミジン核酸塩基またはその誘導体との共役は、任意の位置で発生することもできる。いくつかの実施形態において、ピリミジン核酸塩基の２−、５−、および６−の位置を、共役体部分と置換することができる。ヌクレオシドの糖部分との共役は、任意の炭素原子で発生することができる。共役体部分に結合することができる糖部分の炭素原子の例は、２’、３’、および５’の炭素原子を含む。１’の位置は脱塩基残基等の共役体部分に結合することもできる。インターヌクレオシド結合は、共役体部分を有することもできる。リンを含有する結合（例えばリン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミド酸等）に対して、共役体部分はリン原子に直接またはリン原子に結合されたＯ、Ｎ、またはＳ原子に結合することができる。アミンもしくはアミドを含有するインターヌクレオシド結合（例えばＰＮＡ）に対して、共役体部分はアミンもしくはアミドの窒素原子または隣接する炭素原子に結合することができる。
オリゴマー化合物の共役体を調製するための方法がいくつもある。一般的に、オリゴマー化合物は、共役体部分における反応基でオリゴマー化合物における反応基（例えばＯＨ、ＳＨ、アミン、カルボキシル、アルデヒド等）に接触することによって共役体部分に結合する。いくつかの実施形態において、１つの反応基は求電子性であり、他は求核性である。
例えば、求電子基はカルボニルを含有する機能であり得、求核基アミンまたはチオールであり得る。結合基の有無の関係なしに、核酸と関係オリゴマー化合物との結合の方法は、例えば、本明細書において全体が参照により組み込まれるＭａｎｏｈａｒａｎのＡｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ ＬｅＢｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９９３，Ｃｈａｐｔｅｒ １７等の文献によく記載される。
オリゴヌクレオチドの共役体の調製を教える代表的な米国特許は、それぞれが本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，１４９，７８２号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号、同第５，６７２，６６２号、同第５，６８８，９４１号、同第５，７１４，１６６号、同第６，１５３，７３７号、同第６，１７２，２０８号、同第６，３００，３１９号、同第６，３３５，４３４号、同第６，３３５，４３７号、同第６，３９５，４３７号、同第６，４４４，８０６号、同第６，４８６，３０８号、同第６，５２５，０３１号、同第６，５２８，６３１号、および同第６，５５９，２７９号の各明細書を含むがこれらに限定されない。
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用されるとき、「オリゴヌクレオチド」という用語は、全てが本明細書に定義される未修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはヌクレオシド代替を指す。修飾はｉＲＮＡ剤と関連して記載されるが、これらの修飾はアンチセンス、アンタゴｍｉｒ、アプタマー、リボザイム、およびデコイオリゴヌクレオチド等の本発明の他のオリゴヌクレオチドに適用されることもできると理解される。多数の修飾ＲＮＡおよびヌクレオシド代替は記載されるが、好ましい例はヌクレアーゼ分解に対して未修飾ＲＮＡよりも大きい抵抗を有するものを含む。好ましい例は、２’糖修飾を有するもの、一本鎖オーバーハングにおける修飾、好ましくは３’一本鎖オーバーハング、または特に一本鎖の場合、１つ以上のリン酸塩基またはリン酸塩基の１つ以上の類似体を含む５’修飾を含む。
本明細書で使用されるとき、「ｉＲＮＡ剤」は、標的遺伝子、好ましくは内在性または病原体標的ＲＮＡの発現を下方制御することができるＲＮＡ剤に切断され得るＲＮＡ剤である。理論に縛られることを望まないが、ｉＲＮＡ剤は、当業者にＲＮＡｉ、または転写前もしくは翻訳前のメカニズムと称されることもある標的ｍＲＮＡの転写後の切断を含む多くのメカニズムのうちの１つ以上によって作用することができる。ｉＲＮＡ剤は一本鎖を含むことができる、または一つ以上の鎖を含むことができる、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤であることができる。ｉＲＮＡ剤が一本鎖である場合、１つ以上のリン酸塩基または１つ以上のリン酸塩基の類似体を含む５’修飾を含むことが特に好ましい。ｉＲＮＡ剤は二本鎖である場合、二本鎖領域は二本鎖領域における２つ以上の鎖、例えば２つの鎖、例えば３つの鎖を含むことができる。
ｉＲＮＡ剤は、標的遺伝子に対する十分な相同性の領域を含み、ｉＲＮＡ剤、またはその断片が標的遺伝子の下方制御を媒介することができるように、ヌクレオチドに関して十分な長さであるべきである。（解説を簡単にするために、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドという用語は、本明細書でＲＮＡ剤の１つ以上の化合物サブユニットに関連して使用されることがある。本明細書における「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語の使用は、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代替の場合、１つ以上の位置における修飾ヌクレオチドまたは代替交換部分も指すことが理解されるであろう。）したがって、ｉＲＮＡ剤は、少なくとも部分的およびいくつかの実施形態において、標的ＲＮＡに対して完全に、相補的である領域であるまたは含む。ｉＲＮＡ剤と標的との間に完全相補性があることは必要ではないが、一致は、例えば標的ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡのＲＮＡｉ切断によって直接配列特異的サイレンシングするためにｉＲＮＡ剤またはその切断製品を可能にするために十分でなければならない。
ｉＲＮＡ剤は、多くの場合、修飾されるまたはクリック担体化合物に加えてヌクレオシド代替を含むであろう。ｉＲＮＡ剤の一本鎖領域は、多くの場合修飾されるまたはヌクレオシド代替を含む、例えば不対領域またはヘアピン構造の領域、例えば２つの相補的領域に連結する領域は、修飾またはヌクレオシド代替を有することができる。１つ以上のｉＲＮＡ剤の３’または５’終端、例えばエキソヌクレアーゼに対して安定するため、またはＲＩＳＣに進入するためにアンチセンスｓＲＮＡ剤を支持するための修飾も支持される。修飾はＣ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、脱塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特別なビオチンまたはホスホラミダイトとして生じる、および合成の間複数の共役を可能にする別のＤＭＴ保護ヒドロキシル基を有するフルオレセイン試薬を含むことができる。
本明細書で使用されるとき、「一本鎖ｉＲＮＡ剤」は、単一分子で構成されているｉＲＮＡ剤である。ｉＲＮＡ剤は鎖内対形成で形成される二重鎖領域を含む、例えば、ヘアピンまたはパンハンドル構造である、または含むことができる。一本鎖ｉＲＮＡ剤は、標的分子に関して好ましくはアンチセンスである。好ましい実施形態において、一本鎖ｉＲＮＡ剤は５’リン酸化である、または５’終端でホスホリル類似体を含む。５’リン酸塩修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングに矛盾しないものを含む。適切な修飾は、５’モノリン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’二リン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’三リン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’グアノシンキャップ（７メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または未修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’モノチオリン酸塩（ホスホロチオエート、（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’モノホスホロジチオエート塩（ホスホロジチオエート、（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）、任意の酸素／硫黄交換モノリン酸塩の追加組み合わせ、二リン酸塩および三リン酸塩（例えば、５’アルファチオ三リン酸塩、５’ガンマチオ三リン酸等）、５’ホスホロアミド酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’アルキルホスホン酸塩（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’アルキルエーテルホスホン酸塩（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチル等、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）を含む。（これらの修飾は、複数鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と使用されることもできる。）
本明細書で使用されるとき、「複数鎖ｉＲＮＡ剤」は、２つ以上の鎖、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤を含むｉＲＮＡ剤である。鎖は、二重鎖領域を形成し、ヘアピン、パンハンドル構造、ループ、またはバルジを含むことができる。ｉＲＮＡ剤の少なくとも１つの鎖は、標的分子に関して、好ましくはアンチセンスである。
複数鎖ｉＲＮＡ剤の１つのみ、２つのみ、または全ての鎖を修飾することが望ましいであろう。場合によっては、それらは同じ修飾または同じ種類の修飾を有するであろうが、他の場合は、異なる鎖は異なる修飾を有するであろう、例えば一部の場合、一つの鎖のみを修飾することが望ましい。いくつかの鎖のみを修飾する、例えば不活性化することが望ましいであろう、例えば鎖は不活性化するおよび活性ｉＲＮＡ／タンパク質またはＲＩＳＣの形成を防止することができるために修飾される。これは、例えば５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで修飾によって、鎖の５’リン酸化を防止する修飾で達成され得る（Ｎｙｋａｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＡＴＰ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｅｌｌ １０７，３０９−３２１を参照。）。リン酸化を防止する他の修飾は、使用されることもできる、例えば単にＯ−Ｍｅよりも、５’−ＯＨをＨで置換する。あるいは、リン酸ジエステラーゼが、連鎖を切断し、機能ｉＲＮＡ５’末端放出することができるため、これは望ましくないかもしれないが、大型の巨大基は、５’リン酸塩に添加され得、リン酸ジエステル連鎖に変化する。アンチセンス鎖修飾は、５’リン酸化ならびに本明細書に論じられる他の５’修飾のいずれか、特定に一本鎖ｉＲＮＡ分子の項に論じられる５’修飾を含む。
場合によっては、異なる鎖は、異なる修飾を含むであろう。複数の異なる修飾を、鎖のそれぞれに含むことができる。ある鎖における修飾は、相互に異なることができ、他の鎖における様々な修飾と異なることもできる。例えば、１つの鎖は修飾、例えば本明細書に記載される修飾を有することができ、異なる鎖は異なる修飾、例えば本明細書に記載される修飾を含むことができる。他の場合、１つの鎖は、２つ以上の異なる修飾を有することができ、別の鎖は、他の鎖における少なくとも２つの修飾と異なる修飾を含むことができる。
ｉＲＮＡ剤が分子の一方または両方の末端において一本鎖または不対領域を含むように、鎖が選択されることが好ましい。したがって、ｉＲＮＡ剤は、好ましくはオーバーハング、例えば１つまたは２つの５’または３’のオーバーハング、しかし好ましくは２〜３のヌクレオチドの３’のオーバーハングを含有するために対にされた、鎖を２つ以上含有する。ほとんどの実施形態は３’オーバーハングを有するであろう。好ましいｉＲＮＡ剤は、それぞれの末端に１個または好ましくは２個または３個のヌクレオチド長の、一本鎖のオーバーハング、好ましくは３’のオーバーハングを有するであろう。オーバーハングは、１つの鎖が他よりも長い、または同じ長さの２つの鎖がねじれ型であるため生じることができる。
鎖間の二重鎖領域の好ましい長さは、６〜３０個のヌクレオチド長である。好ましい二重鎖領域は、１５〜３０、最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２２、および２３個のヌクレオチド長である。他の好ましい二重鎖領域は、６〜２０個のヌクレオチド、最も好ましくは６、７、８、９、１０、１１、および１２ヌクレオチド長である。複数鎖のｉＲＮＡ剤では、形成された異なる二重鎖は異なる長さを有することができる、例えば鎖ＡとＢとの間に形成された二重鎖領域は、鎖ＡとＣとの間に形成された二重鎖領域よりも異なる長さを有することができる。
２つより多くの鎖の二重鎖剤を含むｉＲＮＡ剤において、同じ長さであり、長いｄｓＲＮＡの天然ダイサー処理製品を構築することができる。ｉＲＮＡ剤の２つ以上の鎖の実施形態は、連結される、例えば共有結合的な連結も含まれる。必要な二本鎖領域および好ましくは３’のオーバーハングを提供するヘアピンまたは他の一本鎖構造も本発明内である。
核酸はサブユニットのポリマーまたは化合物であるため、以下に記載される多くの修飾は核酸内で繰り返される位置、例えば塩基の修飾、またはリン酸塩部分、またはリン酸塩部分の非架橋酸素において発生する。場合によっては、修飾は核酸の全ての対象位置において発生されるであろうが、多くの場合および実際はほとんどの事例で発生しないであろう。一例として、修飾は３’または５’末端の位置にのみ発生することができ、内部不対領域にのみ発生することができ、末端領域にのみ、例えば末端ヌクレオチド上の位置において、または鎖の最後の２、３、４、５、または１０個のヌクレオチドにおいて発生することができる。修飾は二本鎖領域、一本鎖領域、または両方において発生することができる。修飾はＲＮＡ剤の二本鎖領域においてのみ発生することができる、またはＲＮＡ剤の一本鎖領域においてのみ発生することができる。例えば、非架橋酸素の位置におけるホスホロチオエート修飾は一方または両方の終端においてのみ発生することができ、末端領域でのみ、例えば末端ヌクレオチド上の位置においてまたは鎖の最後の２、３、４、５、または１０個のヌクレオチドにおいて、発生することができ、二本鎖および一本鎖領域、特に終端において発生することができる。５’末端またはその複数を、リン酸化することができる。
いくつかの実施形態において、例えば安定を増強すること、オーバーハングにおける特定の塩基を含むこと、または一本鎖オーバーハングにおいて、例えば５’または３’オーバーハング、または両方において、修飾したヌクレオチドまたはヌクレオチド代替を含むことが特に好ましい。例えば、オーバーハングにおいてプリンヌクレオチドを含むことは望ましいことであり得る。いくつかの実施形態において、例えば本明細書に記載される修飾で、３’または５’のオーバーハングにおける全てまたはいくつかの塩基は修飾されるであろう。修飾は例えばリボース糖の２’のＯＨ基における修飾の使用、例えばデオキシリボヌクレオチドの使用、例えばリボヌクレオチドの代わりにチミジン、およびリン酸塩基、例えばホスホチオエート修飾における修飾を含むことができる。オーバーハングは標的配列と相同である必要はない。
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉｒ）は、植物および動物のゲノムにおけるＤＮＡから転写される小さいＲＮＡ分子の高度に保存された種類であるが、タンパク質に翻訳されない。プレマイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡに処理される。処理されたマイクロＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる一本鎖〜１７〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡ分子であり、発症、細胞増殖、アポトーシス、および分化の主要制御因子として同定された。それらは、特異的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域と結合することによって、遺伝子発現の制御において役割を果たすと考えられている。ＲＩＳＣは翻訳抑制、転写物切断、または両方を通して、遺伝子発現の下方制御を媒介する。ＲＩＳＣは、幅広い範囲の真核生物の核において転写サイレンシングにも結びつけられる。
マイクロＲＮＡは宿主における病原体の調節にも結びつけられる。例えば、Ｊｏｐｌｉｎｇ，Ｃ．Ｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）ｖｏｌ．３０９，ｐｐ１５７７−１５８１を参照。理論に縛られることを望まないが、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ模倣物、および／または抗マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドの投与は、病原体の生存率、成長、発症、および／または複製の調節を引き起こす。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドはマイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ模倣物、および／または抗マイクロＲＮＡであり、マイクロＲＮＡは宿主マイクロＲＮＡである。
これまでに同定されたｍｉＲＮＡ配列の数は大きく、増加しており、それらの説明に役立つ実例は、例えば、“ｍｉＲＢａｓｅ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ，Ｇｒｏｃｏｃｋ ＲＪ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ Ｓ，Ｂａｔｅｍａｎ Ａ，Ｅｎｒｉｇｈｔ ＡＪ．ＮＡＲ，２００６，３４，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１４０−Ｄ１４４、“Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ．ＮＡＲ，２００４，３２，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１０９−Ｄ１１１、およびワールドワイドウェブｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｄｏｔ．ｓａｎｇｅｒ．ｄｏｔ．ａｃ．ｄｏｔ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／においても見出すことができる。
リボザイム
リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を持つ特異的触媒ドメインを有するオリゴヌクレオチドである（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｅｃｈ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８７ Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９８７Ａｐｒ ２４；４９（２）：２１１−２０）。少なくとも６つの基本的な種類の天然発生酵素ＲＮＡは現在知られている。一般に、酵素核酸は標的ＲＮＡと先ず結合することによって作用する。かかる結合は、標的ＲＮＡを切断するために作用する分子の酵素部分の近くに保持される酵素核酸の標的結合部分を通して発生する。したがって、酵素核酸は、先ず認識し、そして標的ＲＮＡを、相補的塩基対形成を通じて結合し、正しい部位に結合された時点で、標的ＲＮＡを切断するために酵素的に作用する。かかる標的ＲＮＡの戦略的な切断は、コードされたタンパク質の直接合成をする能力を破壊するであろう。酵素核酸が結合しそのＲＮＡ標的を切断した後、別の標的を探すためにそのＲＮＡから放出され、繰り返し結合し新しい標的を切断することができる。
任意の標的配列を標的にしたリボザイムの産生の方法は、当該技術分野において既知である。リボザイムは、国際公開第９３／２３５６９号および国際公開第９４／０２５９５号の各パンフレットに記載されるように設計され得、それぞれ具体的に本明細書に参照により組み込まれ、その中に記載されるようにインビトロおよびインビボで試験されるために合成される。
アプタマー
アプタマーは、高い親和性および特異性で、対象の特定の分子に結合する核酸またはペプチド分子である（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５（１９９０）；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８（１９９０））。ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーは、うまく産生され、大きいタンパク質から小さい有機分子までの多くの異なる実体と結合する。Ｅａｔｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：１０−１６（１９９７）、Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：３２４−９（１９９９）、およびＨｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２０−５（２０００）を参照。アプタマーは、ＲＮＡまたはＤＮＡベースであることができる。一般的に、アプタマーは、小分子、タンパク質、核酸、およびさらに細胞、組織、および生物等の様々な分子標的と結合するために、インビトロ選択のラウンドを繰り返してまたは同等に、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）で操作された。アプタマーは、合成、組換え、および精製方法を含む、任意の既知の方法で調製され得、単独でまたは同じ標的に対して特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用することができる。さらに、本明細書でより詳細に記載される、「アプタマー」という用語は具体的に、ある規定の標的と２つ以上の既知のアプタマーを比べることによって生じる共通配列を含有する「二次アプタマー」を含む。
デコイオリゴヌクレオチド
転写因子は、周囲のゲノムＤＮＡがなくても、それらの比較的短い結合配列を認めるため、特定の転写因子の共通結合配列を有する短いオリゴヌクレオチドは、生細胞において遺伝子発現を操縦するための道具として使用され得る。この戦略は、標的因子によって認められて結合されるかかる「デコイオリゴヌクレオチド」の細胞内送達に関与する。デコイによる転写因子のＤＮＡ結合部位の占領は、標的遺伝子のプロモーター領域と次に結合することができない転写因子を与える。デコイは、転写因子によって活性化される遺伝子の発現を抑制するため、または転写因子の結合によって抑制される遺伝子を上方制御するため、治療薬として使用され得る。デコイオリゴヌクレオチドの例は、Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０００，１０６：１０７１−１０７５に見出すことができ、本文献は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
ｍｉＲＮＡ模倣物
ｍｉＲＮＡ模倣物は、１つ以上のｍｉＲＮＡの遺伝子調節活性を模倣するために使用され得る分子の種類を表す。したがって、「マイクロＲＮＡ模倣物」という用語は、ＲＮＡｉ経路に侵入することができる合成非コードＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲＮＡは、内在性ｍｉＲＮＡの源からの精製によって得られない）および制御遺伝子発現を指す。ｍｉＲＮＡ模倣物は、成熟分子（例えば一本鎖）または模倣前駆物質（例えばｐｒｉまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）として設計され得る。
一設計において、ｍｉＲＮＡ模倣物は、二本鎖分子であり（例えば、約１６〜約３１個の間のヌクレオチド長の二重鎖領域とともに）、あるｍｉＲＮＡの成熟鎖と同定される１つ以上の配列を含む。二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物は、二本鎖オリゴヌクレオチドに対して上記されるものに似た設計を有する。
一実施形態において、ｍｉＲＮＡ模倣物は、１６〜３１個の間のヌクレオチドの二重鎖領域および以下の化学修飾パターンのうちの１つ以上を含む。センス鎖は、（センスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２の２’−Ｏ−メチル修飾およびＣおよびＵの全てを含み、アンチセンス鎖修飾は、ＣおよびＵの全ての２’Ｆ修飾、オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸化、および２ヌクレオチド３’オーバーハングと関連する安定したヌクレオチド間結合を含む。
スーパーｍｉｒ（Ｓｕｐｅｒｍｉｒ）
スーパーｍｉｒは、実質的にｍｉＲＮＡと同一であるヌクレオチド配列を有し、その標的に関してアンチセンスであるオリゴヌクレオチド、例えば一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖を指す。この用語は、同様に機能する少なくとも１つの非天然発生部分を含むオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、スーパーｍｉｒは、センス鎖を含まない、および別の好ましい実施形態では、スーパーｍｉｒはかなりの範囲で自己ハイブリッド形成しない。本発明に特性付けられたスーパーｍｉｒは二次構造を有すことができるが、生理学的状態下で、実質的に一本鎖である。実質的に一本鎖であるスーパーｍｉｒは、スーパーｍｉｒの約５０％未満（例えば、約４０％、３０％、２０％、１０％、または５％未満）が、それ自身と二重鎖にすると言う点で一本鎖である。スーパーｍｉｒは、ヘアピンセグメント、例えば配列を含むことができ、好ましくは３’末端で自己ハイブリッド形成でき、二重鎖領域、例えば少なくとも１、２、３、または４の二重鎖領域、および好ましくは８、７、６、または５個のヌクレオチド未満、例えば５個のヌクレオチドを形成する。二重鎖領域は、リンカー、例えばヌクレオチドリンカー、例えば３、４、５、または６ｄＴ、例えば修飾ｄＴによって結合され得る。別の実施形態では、スーパーｍｉｒは、例えば３’および５’末端の一方または両方において、または一方の末端および非末端において、またはスーパーｍｉｒの真ん中において、短いオリゴ、例えば５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド長で二重鎖にされる。
アンチｍｉｒまたはｍｉＲＮＡ抑制剤
「アンチｍｉｒ」「マイクロＲＮＡ抑制剤」または「ｍｉＲ抑制剤」という用語は、同義語であり、オリゴヌクレオチドまたは特異的ｍｉＲＮＡの活性を妨げる修飾したオリゴヌクレオチドを指す。抑制剤は、一本鎖、二本鎖（ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖）、およびヘアピン設計を含む、様々な配置を採用することができ、一般に、マイクロＲＮＡ抑制剤は、標的にするために、ｍｉＲＮＡの成熟鎖（または鎖）と相補的である配列または配列部分のうちの１つ以上を含み、さらに、ｍｉＲＮＡ抑制剤は成熟ｍｉＲＮＡの逆相補体である配列と５’および３’に位置する追加配列も含むことができる。追加配列は、成熟ｍｉＲＮＡ由来のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡにおいて成熟ｍｉＲＮＡに隣接する配列の逆相補体であることができる、または追加配列は、（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、またはｄＴの混合物を有する）任意の配列であることができる。いくつかの実施形態において、追加配列の一方または両方は、ヘアピンを形成することができる任意の配列である。したがって、いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡの逆相補体である配列は、ヘアピン構造によって５’側および３’側上で隣接される。マイクロＲＮＡ抑制剤は、二本鎖の場合、反対の鎖においてヌクレオチド間のミスマッチを含むことができる。さらに、マイクロＲＮＡ抑制剤は、細胞の抑制剤の吸収を容易にするために共役体部分と結び付けることができる。
ヘアピンｍｉＲＮＡ抑制剤を含むマイクロＲＮＡ抑制剤は、それぞれが参照により本明細書に全てが組み込まれる、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎらの“Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ａｒｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＲＩＳＣ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”ＲＮＡ１３：７２３−７３０（２００７）および国際公開第２００７／０９５３８７号、および国際公開第２００８／０３６８２５号の各パンフレットに詳細が記載される。当業者は、所望のｍｉＲＮＡに対してデータベースから配列を選択し、本明細書に開示される方法に対して有用な抑制剤を設計することができる。
アンタゴｍｉｒ
アンタゴｍｉｒは、強化された組織および細胞吸収等のＲＮＡｓｅ保護および薬理的性質に対して様々な修飾を持つＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。それらは、例えば、糖の完全２’−Ｏ−メチル化、ホスホロチオエート骨格、および例えば、３’末端におけるコレステロール部分に関して、普通のＲＮＡとは異なる。好ましい実施形態では、アンタゴｍｉｒは、全てのヌクレオチドにおける２’−Ｏ−メチル修飾、３’末端におけるコレステロール部分、５’末端における最初の２つの位置における２つのホスホロチオエート骨格結合、および分子の３’末端における４つのホスホロチオエート結合を含む。アンタゴｍｉｒは、アンタゴｍｉｒおよび内在性ｍｉＲＮＡを含む、二重鎖を形成することによって、内在性ｍｉＲＮＡを効率的にサイレンシングさせるために使用され得、その結果ｍｉＲＮＡ誘発遺伝子サイレンシングを防止する。アンタゴｍｉｒ媒介ｍｉＲＮＡサイレンシングの例は、全て参照によりその全体が本明細書に明確に組み込まれるＫｒｕｔｚｆｅｌｄｔらのＮａｔｕｒｅ，２００５，４３８：６８５−６８９に記載されるｍｉＲ−１２２のサイレンシングである。
Ｕ１アダプター
Ｕ１アダプターはポリＡ部位を抑制し、標的遺伝子の末端エクソンおよびＵ１ｓｎＲＮＰのＵ１小核ＲＮＡ成分と結合する「Ｕ１ドメイン」における部位と相補的である標的ドメインを含む二機能性オリゴヌクレオチドである（本明細書に参照により全てが明確に組み込まれるＧｏｒａｃｚｎｉａｋ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７（３），２５７−２６３）。Ｕ１ ｓｎＲＮＰは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡエクソンイントロン境界に結合することによってスプライソソーム形成における初期段階を方向付けるために主に機能するリボヌクレオタンパク質の複合体である（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｓｉｍｐｓｏｎ，１９９８，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ４９：７７−９５）。Ｕ１ｓｎＲＮＡ塩基の５’末端のヌクレオチド２〜１１は、ｐｒｅ ｍＲＮＡの一本鎖領域の５’末端と対になる。一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドはＵ１アダプターである。一実施形態において、Ｕ１アダプターは少なくとも１つの他のＲＮＡｉ剤と組み合わせて投与され得る。
免疫賦活性オリゴヌクレオチド
本発明の核酸は、哺乳動物または他の患者であることができる対象に投与された場合、免疫応答を誘発することができる免疫賦活性オリゴヌクレオチド（一本または二本鎖）を含む免疫賦活性であり得る。免疫応答は、自然または適応免疫応答であることができる。免疫システムは、より自然免疫システムに分類され、脊椎動物の適応免疫システムを取得し、後者はさらに体液性細胞成分に分類される。特定の実施形態において、免疫応答は、ムコサールであることができる。
免疫応答を誘発するために、標的ポリヌクレオチドの発現とそれらが特異的に結合し削減することが必要でない場合、免疫賦活性核酸は、非配列特異的であると考えられる。したがって、ある免疫賦活性核酸は、天然発生遺伝子またはｍＲＮＡの領域に相当する配列を含むことができるが、それらはまだ非配列特異的な免疫賦活性核酸であると考えることができる。
一実施形態において、免疫賦活性核酸またはオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドまたはＣｐＧジヌクレオチドは、非メチル化またはメチル化され得る。別の実施形態では、免疫賦活性核酸は、メチル化したシトシンを有するＣｐＧジヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含む。一実施形態において、核酸は、単一ＣｐＧジヌクレオチドを含み、ＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシンはメチル化される。
別の実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、５’末端におけるリン酸塩またはリン酸塩修飾を含む。理論に縛られることを望まないが、修飾または未修飾５’リン酸塩を含むオリゴヌクレオチドは、非ウイルス性または非細菌性反応、特に、ＲＩＧ−Ｉを調節することによって、Ｉ型のＩＦＮ、ＩＬ−１８、および／またはＩＬ−１βの誘発を誘発する。
ＲＮＡ活性化因子
近年の調査で、ｄｓＲＮＡが遺伝子発現、「小ＲＮＡ誘発遺伝子活性」またはＲＮＡａと称されたメカニズムも活性化することができることが見出された。例えば、Ｌｉ，Ｌ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．（２００６），１０３（４６）：１７３３７−４２およびＬｉ Ｌ．Ｃ．（２００８）“Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”．ＲＮＡ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｈｉｄｄｅｎ Ｌａｙｅｒ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ．Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．ＩＳＢＮ９７８−１−９０４４５５−２５−７を参照。ｄｓＲＮＡ標的遺伝子プロモーターは、関連遺伝子の強力な転写活性化を誘発することが示された。ＲＮＡａを引き起こす内在性ｍｉＲＮＡは、ヒトにおいても認められた。Ｃｈｅｃｋ Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ（２００７）．４４８（７１５６）：８５５−８５８。
別の驚くべき観察は、ＲＮＡａによる遺伝子活性化は、長続きすることである。遺伝子発現の誘発は、１０日を超えて持続することが分かった。ＲＮＡａの持続効果は、ｄｓＲＮＡ標的部位における後成的な変化に起因される可能性がある。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ活性化因子であり、オリゴヌクレオチドは、遺伝子の発現を増加する。一実施形態において、増加した遺伝子発現は、生存率、成長開発、および／または繁殖を抑制する。
三重鎖形成オリゴヌクレオチド
近年の調査で、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）が、配列特異的な方法で二本鎖らせんＤＮＡにおけるポリプリン／ポリピリミジン領域を認め、結合することができる設計をされ得る。これらの認識ルールは、Ｍａｈｅｒ ＩＩＩ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）ｖｏｌ．２４５，ｐｐ７２５−７３０、Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）ｖｏｌ．２３８，ｐｐ６４５−６３０、Ｂｅａｌ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）ｖｏｌ．２５１，ｐｐ１３６０−１３６３、Ｃｏｎｎｅｙ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）ｖｏｌ．２４１，ｐｐ４５６−４５９、およびＨｏｇａｎ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＰ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ３７５４０８によって概説される。介入物および骨格置換の導入等のオリゴヌクレオチドの修飾、および結合状況の最適化（ｐＨおよびカチオン濃度）は、電荷反発および不安定等のＴＦＯ活性に対する固有の障壁を克服するために助け、合成オリゴヌクレオチドが特異的配列に対して標的とされ得ることが近年しめされた（近年のレビューは、Ｓｅｉｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ２００３；ｌ １２：４８７−９４を参照）。一般に、三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、配列一致を有する：
オリゴ ３’−Ａ Ｇ Ｇ Ｔ
二重鎖 ５’−Ａ Ｇ Ｃ Ｔ
二重鎖 ３’−Ｔ Ｃ Ｇ Ａ。
しかし、Ａ−ＡＴおよびＧ−ＧＣの三塩基が最大の三重鎖らせん安定を有することが示された（Ｒｅｉｔｈｅｒ ａｎｄ Ｊｅｌｔｓｃｈ， ＢＭＣ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２，Ｓｅρｔｌ２，Ｅｐｕｂ）。同著者は、三重鎖形成は、Ａ−ＡＴおよびＧ−ＧＣルールに従って設計されたＴＦＯが非特異的三重鎖を形成しないことが明らかにし、実際に配列特異的であることを示した。
したがって、任意のある配列に対して、三重鎖形成配列は、考案され得る。三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは２５個、さらにより好ましくは３０個以上、最大で５０個または１００個のヌクレオチドまでのヌクレオチド長である。
標的ＤＮＡを含む三重らせん構造の形成は、立体的なおよび機能的な変化、遮断転写の開始および伸長を誘発し、内在性ＤＮＡにおいて所望の配列変化を導入することを許し、遺伝子発現の特異的な下方制御を生じる。ＴＦＯで処理された細胞における遺伝子発現のかかる抑制の例は、哺乳動物細胞におけるエピソームｓｕｐＦＧｌの遺伝子欠損および内在性ＨＰＲＴ遺伝子（Ｖａｓｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９；２７：１１７６−８１、およびＰｕｒｉ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１；２７６：２８９９１−９８）、ならびに前立腺癌病因学において重要であるＥｔｓ２転写因子の発現の配列および標的特異性の下方制御（Ｃａｒｂｏｎｅ，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２００３；３１：８３３−４３）、ならびに炎症誘発性ＩＣＡＭ−Ｉ遺伝子（Ｂｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ，ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００２；２７７：３２４７３−７９）を含む。さらに、ＶｕｙｉｓｉｃｈとＢｅａｌは、近年配列特異的ＴＦＯがｄｓＲＮＡと結合することができ、ＲＮＡ依存性キナーゼ等のｄｓＲＮＡ依存性酵素の活性を抑制することを示した（Ｖｕｙｉｓｉｃｈ ａｎｄ Ｂｅａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０００；２８：２３６９−７４）。
さらに、上述の原理に従って設計されたＴＦＯは、ＤＮＡ修復に作用することができる定方向突然変異誘発を誘発することができる、したがって内在性遺伝子の発現の下方制御および上方制御の両方を提供する（Ｓｅｉｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３；１１２：４８７−９４）。設計、合成、および有効なＴＦＯの投与の詳細は、本明細書に全てが組み込まれるＦｒｏｅｈｌｅｒらに対する米国特許出願公開第２００３／０１７０６８号、および同第２００３／００９６９８０号、ならびにＥｍａｎｕｅｌｅらに対する第２００２ ０１２８２１８号および同第２００２／０１２３４７６号の各明細書、Ｌａｗｎに対する米国特許第５，７２１，１３８号明細書において見出すことができる。
特定の修飾は、以下により詳細に論じられる。本明細書における修飾はｉＲＮＡ剤に関連して記載されるが、これらの修飾は本発明の担体オリゴヌクレオチドを修飾するためにも受け入れられる。
リン酸塩基
リン酸塩基は負荷電種である。電荷は、２つの非架橋酸素原子上に均一に分布される。しかし、リン酸塩基は異なる置換基で酸素のうちの１つを交換することによって修飾され得る。このＲＮＡリン酸塩骨格への修飾の結果は、核酸分解に対するオリゴリボヌクレオチドの耐性を増加させることであり得る。したがって理論に縛られることを望まないが、いくつかの実施形態において、非対称電荷分布を含む無電荷リンカーまたは電荷リンカーを生じる変化を導入することが望ましくあり得る。
修飾したリン酸塩基の例は、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸塩、ボラノリン酸塩エステル、水素ホスホン酸塩、ホスホロアミド酸、アルキルまたはアリールホスホン酸塩およびリン酸トリエステルを含む。ホスホロジチオエートは、硫黄によって交換された非架橋酸素の両方を有する。ホスホロジチオエートにおけるリン中心は、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を防止するアキラルである。ジアステレオマー形成は、個々のジアステレオマーはヌクレアーゼに対する様々な耐性を示す製剤を生じることができる。さらに、キラルリン酸塩基を含有するＲＮＡのハイブリダイゼーション親和性は、対応する未修飾ＲＮＡ種と比べて低くあり得る。したがって、理論に縛られることを望まないが、キラル中心、例えばホスホロジチオエート形成を除去する、両方の非架橋酸素の修飾は、ジアステレオマー混合物を産生することができないことが望ましくあり得る。したがって、非架橋酸素は、独立してＳ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリール）のうちのいずれか１つであり得る。硫黄と非架橋酸素との交換は好ましい。
リン酸塩リンカーは、窒素（架橋ホスホロアミド酸）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）および炭素（架橋メチレンホスホン酸塩）と、架橋酸素（すなわち、リン酸塩とヌクレオシドとを結合する酸素）との交換によって修飾されることもできる。交換は、結合酸素のどちらか、または両方の結合酸素において発生することができる。架橋酸素がヌクレオシドの３’酸素である場合、炭素との交換は好ましい。架橋酸素がヌクレオシドの５’酸素である場合、窒素との交換は好ましい。
リン酸塩基の交換
リン酸塩基は、連結子を含有する非リンによって交換され得る。理論に縛られることを望まないが、電荷リン酸ジエステル基が核酸分解における反応中心であるため、中性構造模倣物との交換は増強したヌクレアーゼ安定性を与えるべきであることが考えられる。また、理論に縛られることを望まないが、いくつかの実施形態において電荷リン酸塩基が中性部分と交換される変化を導入することが望ましくあり得る。
リン酸塩基を交換することができる部分の例は、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバミン酸、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホン酸塩、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノを含む。好ましい交換は、メチレンカルボニルアミノおよびメチレンメチルイミノ基を含む。
リン酸塩と結び付けられる酸素の少なくとも１つが交換された、またはリン酸塩基が非亜リン酸基と交換された修飾リン酸塩結合は、「非リン酸ジエステル骨格連鎖」としても称される。
リボリン酸塩骨格の交換
オリゴヌクレオチド模倣骨格は、構築されることもでき、リン酸塩リンカーおよびリボース糖は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチド代替と交換される。理論に縛られることを望まないが、繰り返し電荷される骨格の不在は、ポリアニオン（例えばヌクレアーゼ）を認めるタンパク質と結合することを減弱することが考えられる。また、理論に縛られることを望まないが、いくつかの実施形態において、塩基が中性代替骨格によってテザーされる変化を導入する。例は、モフィリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代替を含む。好ましい代替は、ＰＮＡ代替である。
糖修飾
修飾ＲＮＡは、リボ核酸の糖基のうちの全てまたはいくつかの修飾を含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、修飾されるまたは多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基と交換され得る。理論に縛られることを望まないが、ヒドロキシルが２’−アルコキシドイオンを形成するために脱プロトンされることがすでにできないため、強化された安定性が、期待される。２’アルコキシドは、リンカーリン原子に対する分子内求核攻撃による分解を触媒することができる。また、理論に縛られることを望まないが、いくつかの実施形態が２’の位置におけるアルコキシド形成が可能ではない変化を導入することが望ましくあり得る。
「オキシ」２’ヒドロキシル基修飾の例は、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えばＲ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ、例えばメチレンブリッジによって２’ヒドロキシルが同じリボース糖の４’炭素と連結される「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）、Ｏアミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎアミン、（例えばアミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）を含む。メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）のみを含有するオリゴヌクレオチドが頑強なホスホロチオエート修飾で修飾されたものに相当するヌクレアーゼ安定性を示すことは注目に値する。
「デオキシ」修飾は、水素（すなわち部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分と特に関連するデオキシリボース糖）、ハロ（例えばフルオロ）、アミノ（例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２アミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）、シアノ、メルカプト、アルキルチオアルキル、チオアルコキシ；ならびに例えばアミノ機能と任意に置換され得るアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルを含む。好ましい置換基は、２’メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
糖基は、リボースにおける対応する炭素と反対の立体化学的配置を持つ炭素の１つ以上も含有することができる。したがって、修飾ＲＮＡは、糖として例えばアラビノースを含有するヌクレオチドを含むことができる。
修飾ＲＮＡは、Ｃ−１’において核酸塩基が不在の「脱塩基」糖も含むことができる。これらの脱塩基糖は、１つ以上の構成糖原子において修飾をさらに含有することができる。
ヌクレアーゼ耐性を最大限にするために、２’の修飾は１つ以上のリン酸塩リンカー修飾（例えばホスホロチオエート）と組み合わせて使用され得る。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、２つ以上の異なる修飾を含有するものである。
修飾は、ｉＲＮＡ剤における１つ以上の部位において別の実体とリボース構造との大量交換を伴うこともできる。
末端修飾
オリゴヌクレオチドの３’および５’末端は、修飾され得る。かかる修飾は、３’末端、５’末端または分子の両方の末端において存在することができる。それらは、全ての末端リン酸塩またはリン酸塩基の１つ以上の原子の修飾または交換を含むことができる。例えばオリゴヌクレオチドの３’および５’末端は、標識部分、例えばフルオロフォア（例えばピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３またはＣｙ５染色）または（例えば硫黄、ケイ素、ホウ素、またはエステルを基にした）保護基等の他の機能的な分子的実体と共役され得る。機能的な分子的実体は、リン酸塩基および／またはスペーサーを介して糖に結合することができる。スペーサーの末端原子は、リン酸塩基または糖のＣ−３’もしくはＣ−５’Ｏ、Ｎ、ＳまたはＣ基の結合原子と接続または交換することができる。あるいは、スペーサーは、ヌクレオチド代替（例えばＰＮＡ）の末端原子と接続または交換することができる。これらのスペーサーまたはリンカーは、例えば−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えばｎ＝３または６）、脱塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルフォリノ、またはビオチン、およびフルオレセイン試薬を含むことができる。スペーサー／リン酸塩機能的な分子的実体スペーサー／リン酸塩アレイがｉＲＮＡ剤の２つの鎖の間に挿入された場合、このアレイは、ヘアピンタイプＲＮＡ剤においてヘアピンＲＮＡループと置換することができる。３’末端は、−ＯＨ基であることができる。理論に縛られることを望まないが、ある部分の結合が輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性の性質を改善できると考えられる。また、理論に縛られることを望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端変化を導入することが望ましくあり得る。末端修飾の他の例は、染色、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、ポリ環状芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性担体（例えばコレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセリン、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセリン、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸，Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド共役体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジンイミダゾール共役体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）を含む。
末端修飾は、本明細書の他の部分で論じられるものを含むいくつかの理由で、活性を調節または分解に対する耐性を調節するために添加され得る。
活性を調節するために有用な末端修飾は、リン酸塩またはリン酸塩類似体との５’末端の修飾を含む。例えば好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤、特にアンチセンス鎖は５’リン酸化または５’プライム終端におけるホスホリル類似体を含む。５’リン酸塩修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングと矛盾しないものを含む。適切な修飾は、５’モノリン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’二リン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’三リン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’グアノシンキャップ（７メチル化または非メチル化した）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）および任意の修飾または未修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’モノチオリン酸塩（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’モノホスホロジチオエート塩（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄交換したモノリン酸塩、二リン酸塩および三リン酸塩（例えば５’アルファチオ三リン酸塩、５’ガンマチオ三リン酸塩等）、５’ホスホロアミド酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’アルキルホスホン酸塩（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’アルキルエーテルホスホン酸塩（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチル等、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）の任意の追加組み合わせを含む。
末端修飾は、分布を監視するために有用でもあり、そのような場合、添加される好ましい基は、フルオロフォア、例えばフルオレセインまたはＡｌｅｘａ染色、例えばＡｌｅｘａ４８８を含む。末端修飾は、吸収を増強するために有用でもあり、有用な修飾はコレステロールを含む。末端修飾は、ＲＮＡ剤と別の部分を架橋結合するために有用であり、有用な修飾はマイトマイシンＣを含む。
核酸塩基
アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルは、ＲＮＡに見られる最も共通の塩基である。これらの塩基は、改善された性質を有するＲＮＡを提供するために、修飾されるまたは交換され得る。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドは、これらの塩基とともに、または合成および天然核酸塩基（例えばイノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、イソグアニシン、またはツベルシジン）および上記修飾のうちのいずれか１つとともに調製され得る。あるいは、上記の塩基のうちのいずれかの置換または修飾類似体、例えば本明細書に記載される「特異な塩基」、「修飾塩基」、「非天然塩基」および「ユニバーサル塩基」は採用され得る。例としては、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよび２−アミノプロピルアデニンを含むＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、Ｎ６、Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化した塩基を含むがこれらに限定されない。。さらにプリンおよびピリミジンは、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されたもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されたもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されたものを含む。
一般的に、塩基変更は、安定性を促進するためにはあまり好ましくないが、他の理由、例えばいくつか、例えば２，６−ジアミノプリンおよび２アミノプリンは蛍光性であるために、有用であることができる。修飾塩基は、標的特異性を削減することができる。これは、ｉＲＮＡ剤の設計において考慮すべきである。
カチオン基
修飾は、リン酸塩または修飾リン酸塩骨格部分の糖、塩基、および／またはリン原子に対する１つ以上のカチオン基の結合も含むことができる。カチオン基は、天然、特異なまたはユニバーサル塩基上の置換ができる任意の原子に結合することができる。好ましい位置は、ハイブリダイゼーションを妨げない、すなわち、塩基対形成に対して必要な水素結合相互作用を妨げない場所である。カチオン基は、例えば環状または非環状糖代替における糖のＣ２’位置または類似位置を介して結合することができる。カチオン基は、例えばＯ−アミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）に由来するプロトン化したアミノ基；アミノアルコキシ、例えばＯ（ＣＨ２）ｎアミン、（例えばアミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）；アミノ（例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；またはＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）を含むことができる。
例示的な修飾およびｉＲＮＡ剤内の配置
いくつかの修飾を、例えば鎖の内部位置、またはｉＲＮＡ剤の鎖の５’または３’末端における特定の位置において、好ましくはｉＲＮＡ剤上に含むことができる。ｉＲＮＡ剤上の修飾の好ましい位置は、薬剤上に好ましい性質を与えることができる。例えば、特定の修飾の好ましい位置は、最適な遺伝子サイレンシング性質、または増加したエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を与えることができる。本明細書および以下に記載される修飾は、複数のリボヌクレオチド上に含まれる修飾の唯一の修飾、もしくは単一型であることができる、または修飾は本明細書および以下に記載される１つ以上の他の修飾と結合させることができる。例えば、複数鎖ｉＲＮＡ剤の１つの鎖における修飾は、複数鎖ｉＲＮＡ剤の別の鎖における修飾と異なることができる。同様に、１つの鎖における２つの異なる修飾は、ｉＲＮＡ剤の異なる鎖における修飾と異なることができる。限定なしの他の追加の一意的な修飾を、ｉＲＮＡ剤の鎖に組み込むことができる。
ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ鎖における任意のヌクレオチドに対して骨格修飾を含むことができる。例えば、ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤の１つ以上のヌクレオチド間の結合におけるホスホロチオエート連鎖またはＰアルキル修飾を含むことができる。ヌクレオチドは、末端ヌクレオチド、例えばセンスもしくはアンチセンス鎖の最終位置におけるヌクレオチド、または内部ヌクレオチドであり得る。
ｉＲＮＡ剤は、糖修飾、例えば２’または３’糖修飾を含むことができる。例示的な糖修飾は、例えば、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、２’デオキシヌクレオチド、（例えば２´デオキシフルオロヌクレオチド）、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、２’−Ｏ−ＮＭＡ、２’−ＤＭＡＥＯＥ、２’アミノプロピル、２’ヒドロキシ、または２’アラフルオロもしくはロックされた核酸（ＬＮＡ）、拡張型核酸（ＥＮＡ）、ヘキソース核酸（ＨＮＡ）、もしくはシクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）を含む。２’修飾は、好ましくは２’ＯＭｅであり、より好ましくは、２’デオキシフルオロである。修飾が２’ＯＭｅの場合、修飾は、好ましくはセンス鎖上に存在する。修飾が２’フルオロである場合、修飾はｉＲＮＡ剤の任意の鎖上にあり得る。２’アラフルオロ修飾は、好ましくはｉＲＮＡ剤のセンス鎖に存在するであろう。ｉＲＮＡ剤は、３’糖修飾、例えば３’ＯＭｅ修飾を含むことができる。好ましくは３’ＯＭｅ修飾は、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖上に存在する。
ｉＲＮＡ剤は、５’メチルピリミジン（例えば５’メチルウリジン修飾または５’メチル−シトジン）修飾を含むことができる。
本明細書に記載される修飾は、単一ｉＲＮＡ剤上で結合され得る。例えば、ｉＲＮＡ剤は、ホスホロチオエート連鎖および２’糖修飾、例えば２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆ修飾を有することができる。別の例において、ｉＲＮＡ剤は少なくとも１つの５−Ｍｅ−ピリミジンおよび２’−糖修飾、例えば２’−Ｆまたは２’−ＯＭｅ修飾を含むことができる。
ｉＲＮＡ剤は、３’脱塩基カチオン修飾等の、カチオン修飾等の、核酸塩基修飾を含むことができる。カチオン修飾は、ｉＲＮＡ剤の１つ以上の末端ヌクレオチドにおける、例えばアルキルアミノｄＴ（例えばＣ６アミノｄＴ）、アリルアミノ共役体、ピロリジン共役体、フタルイミド、ポルフィリン、またはヒドロキシプロリノル共役体であることができる。アルキルアミノｄＴ共役体がｉＲＮＡ剤の末端ヌクレオチドに結合する場合、共役体は、好ましくはｉＲＮＡ剤のセンスまたはアンチセンス鎖の３’末端に結合する。ピロリジンリンカーがｉＲＮＡ剤の末端ヌクレオチドに結合する場合、リンカーは好ましくはセンス鎖の３’もしくは５’末端、またはアンチセンス鎖の３’末端に結合する。ピロリジンリンカーがｉＲＮＡ剤の末端ヌクレオチドに結合する場合、リンカーは好ましくはセンス鎖３’または５’末端上に存在し、アンチセンス鎖の５’末端に存在しない。
ｉＲＮＡ剤は、脂肪親和性、テルペン、タンパク質結合剤、ビタミン、炭水化物、またはペプチド等の、少なくとも１つの共役体を含むことができる。例えば、共役体は、ナプロキセン、ニトロインドール（またはスタッキング相互作用に寄与する別の共役体）、葉酸、イブプロフェン、またはＣ５ピリミジンリンカーであり得る。共役体は、グリセリド脂質共役体（例えばジアルキルグリセリド誘導体）、ビタミンＥ共役体、またはチオコレステロールでもあり得る。一般的に、以下に反対の記述がある場合を除いて、共役体がセンスまたはアンチセンス鎖の末端ヌクレオチド上に存在する場合、共役体は好ましくはセンス鎖の５’もしくは３’末端上またはアンチセンス鎖の５’末端上に存在し、好ましくは、共役体はアンチセンス鎖の３’末端上に存在しない。
共役体がナプロキセンであり共役体がセンスまたはアンチセンス鎖の末端ヌクレオチド上にある場合、共役体は、好ましくはセンスまたはアンチセンス鎖の５’または３’末端上に存在する。共役体がコレステロールであり、共役体がセンスまたはアンチセンス鎖の末端ヌクレオチド上に存在する場合、コレステロール共役体は、好ましくはセンス鎖の５’または３’末端上に存在し、好ましくはアンチセンス鎖上には存在しない。コレステロールは、ピロリジンリンカー、セリノールリンカー、ヒドロキシプロリノルリンカー、またはジスルフィド連鎖によってｉＲＮＡ剤に共役され得る。ｄＵコレステロール共役体は、ジスルフィド連鎖によってｉＲＮＡ剤と共役されることもできる。共役体がコラン酸であり、共役体がセンスまたはアンチセンス鎖の末端ヌクレオチド上に存在する場合、コラン酸は、好ましくはセンス鎖の５’もしくは３’末端、またはアンチセンス鎖の３’末端に結合する。一実施形態において、コラン酸は、センス鎖の３’末端、およびアンチセンス鎖の３’末端に結合する。
ｉＲＮＡ剤の１つ以上のヌクレオチドは、２’−５’連鎖を有することができる。好ましくは、２’−５’連鎖はセンス鎖である。２’−５’連鎖がｉＲＮＡ剤の末端ヌクレオチド上に存在する場合、２’−５’連鎖はセンス鎖の５’末端上に発生する。
ｉＲＮＡ剤は、好ましくはアンチセンス鎖ではなく、センス鎖上にＬ糖を含むことができる。
ｉＲＮＡ剤は、メチルホスホン酸塩修飾を含むことができる。メチルホスホン酸塩がｉＲＮＡ剤の末端ヌクレオチドに存在する場合、メチルホスホン酸塩はｉＲＮＡ剤のセンスまたはアンチセンス鎖の３’末端に存在する。
ｉＲＮＡ剤は、デオキシリボヌクレオチドで１つ以上のリボヌクレオチドを交換することによって修飾され得る。好ましくは、隣接デオキシリボヌクレオチドはホスホロチオエート結合によって連結され、ｉＲＮＡ剤はセンスまたはアンチセンス鎖上の４連続以上のデオキシリボヌクレオチドを含まない。
ｉＲＮＡ剤は、イノシン置換に対して、ジフルオロトリル（ＤＦＴ）修飾、例えば２，４−ジフルオロトリルウラシル、またはグアニジンを含むことができる。
ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１つの５’−ウリジンアデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチドを含むことができ、ウリジンは２’修飾ヌクレオチド、または末端５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチドであり、５’−ウリジンは２’修飾したヌクレオチド、または末端５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチドであり、５’−シチジンは２’修飾ヌクレオチド、または末端５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチドであり、５’−ウリジンは２’修飾ヌクレオチド、または末端５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチドであり、５’−シチジンは２’修飾ヌクレオチド、または末端５’−シチジン−ウリジン−３’（５’−ＣＵ−３’）ジヌクレオチドであり、５’シチジンは２’修飾ヌクレオチド、または末端５’−ウリジン−シチジン−３’（５’−ＵＣ−３’）ジヌクレオチドであり、５’−ウリジンは２’修飾ヌクレオチドである。ｉＲＮＡ剤において、化学的に修飾したヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル化したヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、修飾したヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチド、２´−デオキシフルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、２’−Ｏ−ＮＭＡ、２’−ＤＭＡＥＯＥ、２’−アミノプロピル、２’−ヒドロキシ、または２’−アラ−フルオロ、またはロックされた核酸（ＬＮＡ）、拡張された核酸（ＥＮＡ）、ヘキソース核酸（ＨＮＡ）、またはシクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）であり得る。修飾したジヌクレオチドがｉＲＮＡ剤のセンスまたはアンチセンス鎖の末端上に発生する場合、これらの修飾を含むｉＲＮＡ剤は、特にエキソヌクレアーゼ活性に対して安定され、それ以外ではエンドヌクレアーゼ活性に対して特に安定される。
ｉＲＮＡ剤は、例えばｉＲＮＡ剤の一方の末端が３’もしくは５’オーバーハングを有し、ｉＲＮＡ剤のもう一方の末端が平滑末端である、単一オーバーハングを有することができる、またはｉＲＮＡ剤は、例えばｉＲＮＡ剤の両末端は、ジヌクレオチドオーバーハング等の３’もしくは５’オーバーハングを有する、二重オーバーハングを有することができる。別の代替案としては、ｉＲＮＡ剤の両末端は、平滑末端を有することができる。不対ヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエートジヌクレオチド連鎖を有することができ、不対ヌクレオチドのうちの少なくとも１つを、２’−位置において化学的に修飾することができる。ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、センスおよびアンチセンス鎖のうちの１つまたは両方における、ホスホロチオエートジヌクレオチド結合を含むことができる。複数鎖ｉＲＮＡ剤の様々な鎖を、リンカー、例えばヘキサエチレングリコールリンカー、ポリ−（オキシホスフィニコ−オキシ−１，３−プロパンジオール）リンカー、アリルリンカー、またはポリエチレングリコールリンカー等の、化学リンカーで接続することができる。
ヌクレアーゼ耐性化合物
ｉＲＮＡ剤は、対象の体内に認められる例えばヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによって、分解を抑制するために修飾される化合物を含むことができる。これらの化合物は、本明細書においてＮＲＭ、または化合物もしくは修飾を促進するヌクレアーゼ耐性と称される。これらの修飾の多くの場合は、ｉＲＮＡ剤の他の性質、例えばタンパク質、例えば輸送タンパク質、例えば血清アルブミン、もしくはＲＩＳＣのメンバー（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と相互作用する能力、または相互に二重鎖を形成する、または別の配列、例えば標的分子で二重鎖を形成する第１および第２の配列の能力も調節するであろう。
理論に縛られることを望まないが、ｉＲＮＡ剤における糖、塩基、および／またはリン酸塩骨格の修飾が、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ耐性を増強することができ、輸送タンパク質およびＲＩＳＣ複合体の機能的な成分のうちの１つ以上との相互作用を増強することができることが考えられる。好ましい修飾は、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ耐性を増加するものであり、したがってＲＩＳＣ複合体との相互作用前に、ｉＲＮＡ剤の半減期を延長するが、同時にＲＩＳＣ複合体においてエンドヌクレアーゼ活性に対してｉＲＮＡ剤の耐性を与えない。また、理論に縛られることを望まないが、アンチセンス鎖の３’および／または５’末端における、またはそれらの近くの修飾の配置は、上記に描写される好ましいヌクレアーゼ耐性基準を満たすｉＲＮＡ剤を得ることができると考えられる。また、理論に縛られることを望まないが、例えばセンス鎖の中央における修飾の配置は、オフターゲットを引き起こすことが比較的少ないｉＲＮＡ剤を得ることができると考えられる。
本明細書に記載される修飾を、任意のＲＮＡおよび本明細書に記載されるＲＮＡ様分子、例えばｉＲＮＡ剤、担体オリゴヌクレオチドに組み込むことができる。ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖が、本明細書に記載される修飾のうちの１つ以上を含むことができる、ハイブリッド形成されたセンスおよびアンチセンス鎖を含む二重鎖を含むことができる。アンチセンス鎖は、３’末端および／または５’末端における、および／または鎖のどちらかの末端から１〜６（例えば１〜５、１〜４、１〜３、１〜２）個のヌクレオチドを発生する１つ以上の位置における修飾を含むことができる。センス鎖は、３’末端および／または５’末端における、および／または鎖の２つの末端の間の介在位置のうちのいずれか１つにおける修飾を含むことができる。ｉＲＮＡ剤は、２つのハイブリッド形成されたアンチセンス鎖を含む二重鎖も含むことができる。第１および／または第２のアンチセンス鎖は、本明細書に記載される修飾のうちの１つ以上を含むことができる。したがって、片方および／または両方のアンチセンス鎖は、３’末端および／または５’末端における、および／または鎖のどちらかの末端から１〜６（例えば１〜５、１〜４、１〜３、１〜２）個のヌクレオチドを発生する１つ以上の位置における修飾を含むことができる。特定の配置は以下に記載される。
上記に描写され好ましいヌクレアーゼ耐性基準を満たすｉＲＮＡ剤を生成するために有用であり得る修飾は、糖、塩基、および／またはリン酸塩骨格の以下の化学および／または立体化学修飾のうちの１つ以上を含む。
（ｉ）キラル（ＳＰ）チオエート。したがって、好ましいＮＲＭは、非架橋位置、例えば標準的に酸素によって占められる位置であるＳｐまたはＲｐにおいてヘテロ原子を含有する修飾したリン酸塩基の特定のキラル形に対して濃縮されたまたは純粋なものを含むヌクレオチド二量体を含む。ヘテロ原子は、Ｓ、Ｓｅ、Ｎｒ２、またはＢｒ３であり得る。ヘテロ原子がＳである場合、濃縮されたまたはキラルに純粋なＳｐ連鎖が好ましい。濃縮されたとは、好ましい形成の少なくとも７０、８０、９０、９５、または９９％を意味する。かかるＮＲＭは、以下に詳細が記載される。
（ｉｉ）糖、塩基、および／またはリン酸塩または修飾したリン酸塩骨格部分のリン原子に対する１つ以上のカチオン基の結合。したがって、好ましいＮＲＭは、カチオン基において誘導体化した末端位置における化合物を含む。アンチセンス配列の５’末端が末端−ＯＨまたはリン酸塩基を有すべきであるため、このＮＲＭは好ましくはアンチセンス配列の５’末端において使用されない。基は、例えばピリミジンの５’位置またはプリンの７−位置において、例えば他の鎖上の相補的塩基と相互作用する表面から離れて、Ｈ結合形成およびハイブリダイゼーションで干渉を最小限にする塩基上の位置において結合されるべきである。こららは、以下に詳細が記載される。
（ｉｉｉ）終端における非リン酸塩結合。したがって、好ましいＮＲＭは、非リン酸塩結合、例えばリン酸塩結合よりも大きな切断に対する耐性を与える４原子鎖を含む。例は、３’ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２−５’および３’ＣＨ２−ＮＨ−（Ｏ＝）−ＣＨ２−５’を含む。
（ｉｖ）３’−架橋チオリン酸塩および５’−架橋チオリン酸塩。したがって、好ましいＮＲＭはこれらの構造を含むことができる。
（ｖ）Ｌ−ＲＮＡ、２’〜５’結合、逆結合、ａヌクレオシド。したがって、他の好ましいＮＲＭは、ＬヌクレオシドおよびＬ−ヌクレオシドに由来する二量体ヌクレオチド、２’〜５’リン酸塩、非リン酸塩および修飾したリン酸塩結合（例えばチオリン酸塩、ホスホロアミド酸、およびリン酸ホウ素）、逆結合、例えば３’〜３’または５’〜５’結合を有する二量体、糖、例えばアルファ連鎖を有する本明細書に記載の構造上の１’部位においてアルファ連鎖を有する化合物を含む。
（ｖｉ）共役基。したがって、好ましいＮＲＭは、例えば糖、塩基、または骨格を介して化合物で共役される、例えば標的部分または本明細書に記載される共役するリガンドを含むことができる。
（ｖｉｉ）脱塩基結合。したがって、好ましいＮＲＭは、脱塩基化合物、例えば本明細書に記載される脱塩基化合物（例えば核酸塩基不在の化合物）、本明細書に記載される芳香族またはヘテロ環状またはポリヘテロ環状芳香族化合物を含むことができる。
（ｖｉｉｉ）５’−ホスホン酸塩および５’−リン酸塩プロドラッグ。したがって、好ましくはリン酸塩基の１つ以上の原子が、保護基または基が対象の体内における成分、例えば対象の体内に存在するカルボキシエステラーゼまたは酵素の作用の結果、削除される保護基で誘導体化された、末端位置、例えば５’位置において、好ましいＮＲＭは化合物を含む。例えば、カルボキシエステラーゼが、リン酸塩のＯに隣接する炭素を攻撃するチオエートアニオンの生成が得られ、非保護リン酸塩の生成が得られる保護分子を切断するリン酸塩プロドラッグ。
１つ以上の異なるＮＲＭ修飾を、ｉＲＮＡ剤またはｉＲＮＡ剤の配列に導入することができる。ＮＲＭ修飾を配列またはｉＲＮＡ剤において１回以上使用することができる。いくつかのＮＲＭは、ハイブリダイゼーションと相互作用するため、組み込まれる全数は、ｉＲＮＡ剤の二重鎖形成の受け入れ可能なレベルが維持されるようにあるべきである。
いくつかの実施形態において、ＮＲＭ修飾は、末端、切断部位または対象における所望の配列または遺伝子を標的としない、配列の切断領域（センス鎖または配列）に導入される。これはオフターゲットサイレンシングを削減することができる。
参考文献
一般的な参考文献
本発明に従って使用されるオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドを、固相合成で合成することができる、例えば“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８４、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９１（特にＣｈａｐｔｅｒ１、Ｍｏｄｅｒｎ ｍａｃｈｉｎｅ−ａｉｄｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ２、Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ３、２’−Ｏ−−Ｍｅｔｈｙｌｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ４、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ５、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ６、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏ−２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ、およびＣｈａｐｔｅｒ ７、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｓを参照。他の特に有用的な合成手順、試薬、遮断基、および反応条件は、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３−２３１１、およびＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３−６１９４、またはそれらにおいて参照される文献に記載される。
国際公開第００／４４８９５号、国際公開第０１／７５１６４号、または国際公開第０２／４４３２１号の各パンフレットに記載される修飾は、本明細書に使用することができる。
本明細書に記載される全ての文献、特許、および公開された特許出願の開示は、本明細書に参照により組み込まれる。
リン酸塩基の参考文献
ホスフィナートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，５０８，２７０号明細書に記載される。アルキルホスホン酸塩オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第４，４６９，８６３号明細書に記載される。ホスホラミダイトオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，２５６，７７５号または米国特許第５，３６６，８７８号明細書に記載される。リン酸トリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，０２３，２４３号明細書に記載される。ボラノリン酸塩オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，１３０，３０２号および同第５，１７７，１９８号の各明細書に記載される。３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミド酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，４７６，９２５号明細書に記載される。３’−デオキシ−３’−メチレンホスホン酸塩オリゴリボヌクレオチドは、Ａｎ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１，６６，２７８９−２８０１に記載される。硫黄架橋ヌクレオチドの調製は、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１９８８，７，６５１およびＣｒｏｓｓｔｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８９，３０，４６９３に記載される。
糖基の参考文献
２’修飾に対する修飾を、Ｖｅｒｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，６７，９９−１３４およびその中における全ての文献に見出すことができる。リボースに対する特異的修飾を、以下の参照に見出すことができる。２’−フルオロ（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１−８４１），２’−ＭＯＥ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１９９６，７９，１９３０−１９３８）、「ＬＮＡ」（Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９９，３２，３０１−３１０）。
リン酸塩基の交換の参考文献
本明細書にＭＭＩ結合オリゴリボヌクレオシドとしても同定されるメチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシド、本明細書にＭＤＨ結合オリゴリボヌクレオシドとしても同定されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシド、および本明細書にアミド−３結合オリゴリボヌクレオシドとしても同定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、および本明細書にアミド−４結合オリゴリボヌクレオシドとしても同定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、ならびに例えばＭＭＩおよびＰＯまたはＰＳ結合の変化を有する混合された骨格化合物は、米国特許第５，３７８，８２５号、第５，３８６，０２３号、第５，４８９，６７７号の各明細書および公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４２９４号、および同第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３０５号（国際公開第９２／２０８２２号、および９２／２０８２３号としてそれぞれ公開された）に記載されるとおり調製することができる。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号、および同第５，２６４，５６４号の各明細書に記載されるとおりに調製することができる。エチレンオキシド結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号明細書に記載されるとおり調製することができる。シロキサン交換は、Ｃｏｒｍｉｅｒ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８８，１６，４５８３に記載される。炭酸塩交換は、Ｔｉｔｔｅｎｓｏｒ，Ｊ．Ｒ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃ１９７１，１９３３に記載される。カルボキシメチル交換は、Ｅｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ １９７２，１９９１に記載される。カルバミン酸交換は、Ｓｔｉｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８９，１７，６１２９に記載される。
リン酸塩−リボース骨格の交換の参考文献
シクロブチル糖代替化合物は、米国特許第５，３５９，０４４号明細書に記載されるとおりに調製することができる。ピロリジン糖代替は、米国特許第５，５１９，１３４号明細書に記載されるとおりに調製することができる。モルフォリノ糖代替は、米国特許第５，１４２，０４７号および同第５，２３５，０３３号の各明細書、および他の関係した特許開示に記載されるとおり調製することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、それ自体は知られており、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ （ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５−２３に言及される様々な手順のうちのいずれかに従って調製することができる。米国特許第５，５３９，０８３号明細書に従って調製されることもできる。
末端修飾の参考文献
末端修飾は、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２，１０３−１２８（２００２）、およびそれらにおける文献に記載される。
塩基の参考文献
Ｎ−２置換プリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５９，２５５号明細書に記載されるとおり調製することができる。３−デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５７，１９１号明細書に記載されるとおり調製することができる。５，６−置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，６１４，６１７号明細書に記載されるとおり調製することができる。５−プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４８４，９０８号明細書に記載されるとおり調製することができる。さらなる参考文献は、塩基修飾の上記の項において開示される。
オリゴヌクレオチド産生
本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、液体相または固相の有機合成を使用して調製することができる。有機合成は、非天然または修飾したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が容易に調製される利点を提供する。当該技術分野で既知のかかる合成に対する他の意味は、追加でまたは代わりに採用することができる。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびアルキル化した誘導体等の他のオリゴヌクレオチドを調製するために、同様の技術を使用することも知られている。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド化合物は、２段階の手順を使用して調製することができる。先ず、二本鎖分子の個々の鎖は、別々に調製される。次に、成分の鎖がアニーリングされる。
合成方法に関わらず、オリゴヌクレオチドは、製剤に対して適切である液体（例えば、水溶液および／または有機溶液）において調製することができる。例えば、ｉＲＮＡ調製剤を沈殿し、純粋な再蒸留水において再溶解し、凍結乾燥することができる。乾燥したｉＲＮＡを、目的の製剤処理に対して適切な溶液において再懸濁することができる。
特定の修飾したオリゴヌクレオチドの合成についての教育は、以下の米国特許または特許出願済みのポリアミン共役オリゴヌクレオチドに対して作成された米国特許第５，１３８，０４５号および同第５，２１８，１０５号の各明細書、キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製のための化合物に対して作成された米国特許第５，２１２，２９５号明細書、修飾した骨格を有するオリゴヌクレオチドに対して作成された米国特許第５，３７８，８２５号明細書および同第５，５４１，３０７号、還元的共役体を介した骨格−修飾したオリゴヌクレオチドおよびその調整に対して作成された米国特許第５，３８６，０２３号明細書、３−デアザプリン環系およびその合成方法を基にした修飾した核酸塩基に対して作成された米国特許第５，４５７，１９１号明細書、Ｎ−２置換プリンを基にした修飾した核酸塩基に対して作成された米国特許第５，４５９，２５５号明細書、キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するためのプロセスに対して作成される米国特許第５，５２１，３０２号明細書、ペプチド核酸に対して作成される米国特許第５，５３９，０８２号明細書、ベータ−ラクタム骨格を有するオリゴヌクレオチドに対して作成される米国特許第５，５５４，７４６号明細書、オリゴヌクレオチドの合成ための方法および材料に対して作成される米国特許第５，５７１，９０２号明細書、アルキルチオ基を有するヌクレオシド、かかる基をヌクレオシドの任意の様々な位置に結合された他の部分に対してリンカーとして使用することができることに対して描画される米国特許第５，５７８，７１８号明細書、高キラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドに対して作成される米国特許第５，５８７，３６１号および同第５，５９９，７９７号の各明細書、２’−Ｏ−アルキルグアノシンおよび２，６−ジアミノプリン化合物を含む関係する化合物の調製に対するプロセスに対して作成される米国特許第５，５０６，３５１号明細書、Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに対して作成される米国特許第５，５８７，４６９号明細書、３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに対して作成される米国特許第５，５８７，４７０号明細書、共役される４’−脱メチルヌクレオシド類似体に対して作成される米国特許第５，２２３，１６８号および米国特許第５，６０８，０４６号の各明細書、骨格−修飾したオリゴヌクレオチド類似体に対して作成される米国特許第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号の各明細書、およびとりわけ、２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成方法に対して作成される米国特許第６，２６２，２４１号および同第５，４５９，２５５号の各明細書に見出すことができる。
ある化合物における全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際は１種類以上の修飾が、単一オリゴヌクレオチド化合物またはその単一ヌクレオチドにでさえも組み込まれ得る。
送達の経路
解説を簡略化するために、この項における製剤、組成物、および方法は、未修飾ｉＲＮＡ剤に関して主に論じられる。しかしこれらの製剤、組成物、および方法は、本発明の他のオリゴヌクレオチド、例えば修飾したｉＲＮＡ剤、アンチセンス、アンタゴｍｉｒ、アプタマー、リボザイムで、実行され得、かかる実行は、本発明内であることが理解されるべきである。ｉＲＮＡを含む組成物を、様々な経路によって対象に送達することができる。例示的な経路は、静脈内、局所的、直腸、肛門、腟、鼻、肺、眼部を含む。
本発明のｉＲＮＡ分子は、投与に対して適切な医薬組成物に組み込まれ得る。かかる組成物は、典型的に１種以上のｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される担体」という言葉は、薬学的な投与と矛盾しない任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、非細菌および抗真菌剤、等張性および吸収を遅らせる薬剤等を含むことを目的とする。薬学的活性物質に対するかかる培地および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の培地または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用は検討される。補足活性化合物は、組成物に組み込まれることもできる。
本発明の医薬組成物を、局所的または全身治療が望ましいか否か、および治療される範囲によって様々な方法で投与することができる。投与は、局所的（眼部、腟、直腸、鼻腔内、経皮性を含む）、経口または非経口であり得る。非経口投与は、静脈点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射、またはくも膜下腔内もしくは脳室内投与を含む。
投与の経路および部位を、標的を増強するために選択することができる。例えば、筋肉細胞を標的にするためには、対象の筋肉への筋肉内注射は、正しい選択であろう。肺細胞は、エアロゾル形でｉＲＮＡを投与することによって標的にされる可能性がある。血管内皮細胞は、ｉＲＮＡでバルーンカテーテルをコーティングすることによって標的にされ得、ＤＮＡを機械的に導入する。
局所的投与のための製剤は、経皮性パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐薬、スプレー、液体、および粉末を含むことができる。従来の薬学的担体、水性、粉末、または油性基剤、増粘剤等は、必要または望ましくあり得る。コーティングされたコンドーム、手袋等も有用であり得る。
経口投与のための組成物は、粉末もしくは顆粒、水における懸濁液もしくは溶液、シロップ、エリキシル剤もしくは非水系培地、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ、またはトローチ剤を含む。錠剤の場合、使用することができる担体は、ラクトース、クエン酸ナトリウムおよびリン酸塩を含む。デンプン等の様々な錠剤分解物質、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク等の平滑剤は、錠剤において一般的に使用される。カプセル剤形の経口投与について、有用的な希釈液はラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。水性懸濁液が経口使用に必要な場合、核酸組成物を乳化および懸濁剤と組み合わすことができる。必要な場合、ある甘味料および／または調味料を添加することができる。
くも膜下腔内または脳室内投与に対する組成物は、緩衝液、希釈液、および他の適切な添加物も含むことができる無菌水溶液を含むことができる。
非経口投与に対する製剤は、緩衝液、希釈液、および他の適切な添加物も含むことができる無菌水溶液を含むことができる。脳室内注入を、例えば、リザーバーに取り付けられている脳室内カテーテルによって促進することができる。静脈内使用について、溶質の総濃度は調製等張を与えるために制御されるべきである。
眼部投与について、軟膏または点眼液を、アプリケーターまたは点眼剤等の当業者に知られる眼部送達システムによって送達することができる。かかる組成物は、ヒアルロン酸等のムコミメティック（ｍｕｃｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはポリ（ビニルアルコール）、ソルビン酸等の防腐剤、ＥＤＴＡもしくは塩化ベンジルクロム、希釈液および／または担体の大抵の量を含むことができる。
局所的送達
解説を簡略化するために、この項における製剤、組成物、および方法は、未修飾ｉＲＮＡ剤に関して主に論じられる。しかしこれらの製剤、組成物、および方法は、本発明の他のオリゴヌクレオチド、例えば修飾したｉＲＮＡ剤、アンチセンス、アプタマー、アンタゴｍｉｒ、リボザイムで、実行され得、かかる実行は、本発明内であることが理解されるべきである。好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、局所的投与を介して対象に送達される。「局所的投与」は、対象の表面に直接製剤を接触することによる対象への送達を指す。最も一般的な局所的送達の形は、皮膚に対してであるが、本明細書に開示される組成物は、体の他の表面、例えば、眼、粘膜、体腔の表面、または内面に、直接塗ることができる。上記の通り、最も一般的な局所的送達は、皮膚に対してである。用語は、局所的および経皮性を含むがこれらに限定されない、投与のいくつかの経路を含む。投与のこれらのモードは、典型的に皮膚の透過障壁の侵入および標的組織または層への効率的な送達を含む。局所的な投与を、表皮および真皮の侵入ならびに組成物の全身送達を、最終的に達成する手段として用いることができる。局所的投与は、選択的に対象の表皮もしくは真皮、またはその特定の層、または下層組織にオリゴヌクレオチドを送達する手段としても使用することができる。
本明細書で使用されるとき、「皮膚」という用語は、動物の表皮および／または真皮を指す。哺乳動物皮膚は、２つの主な、異なる層からなる。皮膚の外層は、表皮と称される。表皮は、角質層、顆粒膜層、有棘層、基底層からなり、角質層は皮膚の表面にあり基底層は表皮の最深部にある。表皮は、体の位置によって５０μｍ〜０．２ｍｍの間の厚さである。
表皮の下は、表皮よりも非常に厚い真皮である。真皮は、線維束の形のコラーゲンから主になる。コラーゲン束は、取り分け、血管、毛細リンパ管、腺、神経終末、および免疫学的活性細胞に対する支持を提供する。
臓器としての皮膚の主な機能のうちの１つは、体への物質の侵入を制御することである。皮膚の主要な透過性障壁は、分化の様々な状態における細胞の多くの層から形成される角質層によって提供される。角質層における細胞間の空間は、皮膚透過性障壁をさらに増強するために封鎖する格子状の形成に配置される異なる脂質で満たされる。
皮膚によって提供される透過性障壁は、約７５０Ｄａよりも多い分子量を有する分子に対して大いに不透過であるようである。大きな分子が皮膚の透過性障壁を通過するためには、通常の浸透以外のメカニズムを、使用しなければならない。
いくつかの因子によって、投与された薬剤に対して皮膚の透過性を測定する。これらの因子は、治療された皮膚の特徴、送達剤の特徴、薬物と送達剤との間および薬物と皮膚との間の両方の相互作用、投与された薬物の用量、治療の形式、および治療後の療法を含む。表皮および真皮を選択的に標的にするためには、事前に選択した層に対して薬物の浸透を可能にする１つ以上の浸透エンハンサーを含む組成物を製剤化することが、場合によって可能である。
経皮性送達は、脂溶性治療の投与に対して重要な経路である。真皮は、表皮よりも透過性があり、したがって吸収は、擦過した、火傷したまたは剥皮した皮膚を介してより速い。炎症および皮膚に対して血流を増加する他の生理的な状態は、経皮性吸着も増強する。この経路を通した吸収を、油性媒体（塗油）の使用によってまたは１つ以上の浸透エンハンサーの使用を介して増強することができる。経皮性経路を通した本明細書に開示される組成物を送達するための他の効果的な方法は、皮膚の水和および制御された放出局所的パッチの使用を含む。経皮性経路によって、全身および／または局所療法のために、本明細書に開示される組成物を送達する潜在的に有効な手段を提供する。
さらに、イオン導入（電場の影響を受けて生物学的膜を介してイオン性溶質を伝達する）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．１６３）、フォノフォレシスまたは超音波導入（生物学的膜、特に皮膚および角膜を横断して様々な治療薬の吸収を増強するための超音波の使用）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１，ｐ．１６６）、および投与位置と関連する媒体の特徴の最適化および投与の部位での保持（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．１６８）は、皮膚およびムコサール部位を横断して局所的に投与した組成物の輸送を増強するために有用な方法であり得る。
提供される組成物および方法は、培養または保存された皮膚組織において、および動物においてインビトロで、様々なタンパク質の機能および遺伝子を検査するためにも使用することができる。本発明は、任意の遺伝子の機能を検査するために適用することができる。本発明の方法は、治療的にまたは予防的にも使用することができる。例えば、乾癬、扁平苔癬、毒性の表皮壊死融解症、多形性紅斑、基底細胞癌腫、扁平上皮癌、悪性メラノーマ、パジェット病、カポジ肉腫、肺線維症、ライム病、および皮膚のウイルス性、真菌および細菌感染等の疾病を被ることで知られているまたはその疑いがある動物の治療。
肺送達
解説を簡略化するために、この項における製剤、組成物、および方法は、未修飾ｉＲＮＡ剤に関して主に論じられる。しかしこれらの製剤、組成物、および方法は、本発明の他のオリゴヌクレオチド、例えば修飾したｉＲＮＡ剤、アンチセンス、アプタマー、アンタゴｍｉｒ、リボザイムで、実行され得、かかる実行は、本発明内であることが理解されるべきである。ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤を含む組成物を、肺送達によって対象へ投与することができる。肺送達組成物を、分散内の組成物、好ましくはｉＲＮＡが肺胞領域を介して直接血液循環に吸収されることが容易であり得る肺に到達することができるように、分散の患者によって吸入によって送達することができる。肺送達は、肺の疾病を治療するために、全身送達および局所的送達の両方に対して有効であり得る。
肺送達は、噴霧された、エアロゾル化した、ミセルおよび乾燥粉末ベースの製剤の使用を含む、異なるアプローチによって達成することができる。送達は、液体噴霧器、エアロゾルベースの吸入器、および乾燥粉末分散装置で達成することができる。定量噴霧式装置は、好ましい。アトマイザまたは吸入器を使用する利点のうちの１つは、装置が内蔵型であるため、混入の可能性が最小限であることである。乾燥粉末分散装置は、例えば、乾燥粉末として容易に製剤化することができる薬物を送達する。ｉＲＮＡ組成物は、それ自身でまたは適切な粉末担体との組み合わせによって、凍結乾燥または吹き付け乾燥させた粉末として安定保存することができる。吸入のための組成物の送達を、装置に組み込まれる場合、投与追跡、順守監視および／またはエアロゾル薬剤の投与中に、患者に対して投与をトリガーすることを可能にするタイマー、投与カウンター、時間測定装置、または時間表示を含むことができる投与時期の要素によって媒介することができる。
「粉末」という用語は、自由流動し、吸入装置において容易に分散され得、次に肺胞への浸透を許すために粒子が肺に到達することができるように対象によって吸入される細かく分散した固体粒子からなる組成物を意味する。したがって、粉末は「呼吸用」であると考えられている。好ましくは、平均粒子の大きさは、好ましくは比較的均一の楕円体型分布を含む、直径約１０μｍ未満である。より好ましくは、直径は約７．５μｍおよび最も好ましくは、約５．０μｍである。大抵は、粒子の大きさ分布は、直径約０．１μｍ〜約５μｍの間、特に約０．３μｍ〜約５μｍである。
「乾燥」という用語は、組成物が重量（％ｗ）水で約１０％未満、大抵は約５％ｗ未満、および好ましくは約３％ｗ未満の含水量を有することを意味する。乾燥組成物は、粒子がエアロゾルを形成するために、吸入装置に容易に分散するようにあり得る。
「治療的に有効な量」という用語は、予想される生理学的反応を与えるために、治療される対象において所望のレベルの薬物を提供するために必要である組成物に存在する量である。
「生理学的に有効な量」という用語は、所望の対症または治療効果を与える対象に送達される量である。
「薬学的に許容される担体」という用語は、担体が肺において著しく有害な毒性効果なしに肺に取り入れられ得ることを意味する。
担体として有用な薬学的な賦形剤の種類は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の安定剤、炭水化物、アミノ酸、およびポリペプチド等の充てん剤、ｐＨ調整剤または緩衝液、塩化ナトリウム等の塩を含む。これらの担体は、結晶の形または無定形であり得る、または２つの混合物であり得る。
特に有益な充てん剤は、適合性炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含む。適切な炭水化物は、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボース等の単糖；ラクトース、トレハロース等の二糖；２−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン等のシクロデキストリン；およびラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン等の多糖；マンニトール、キシリトール等のアルジトールを含む。炭水化物の好ましい基は、ラクトース、トレハロース、ラフィノースマルトデキストリン、およびマンニトールを含む。適切なポリペプチドは、アスパルテームを含む。アミノ酸は、アラニンおよびグリシンを含むが、グリシンが好ましい。
本発明の組成物の少量の成分である添加物は、噴霧乾燥中に、および粉末の分散性を改善するために立体配座安定性に含まれ得る。これらの添加物は、トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニン等の疎水性アミノ酸を含む。
適切なｐＨ調整剤または緩衝液は、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム等の有機酸および塩基から調製される有機塩を含むが、クエン酸ナトリウムが好ましい。
ミセルｉＲＮＡ製剤の肺投与は、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロエタン、ジメチルフルオロプロパン、テトラフルオロプロパン、ブタン、イソブタン、ジメチルエーテル、および他の非ＣＦＣ等の噴霧剤ならびにＣＦＣ噴霧剤を含む定量噴霧式スプレー装置を介して達成することができる。
経口または経鼻送達
解説を簡略化するために、この項における製剤、組成物、および方法は、未修飾ｉＲＮＡ剤に関して主に論じられる。しかしこれらの製剤、組成物、および方法は、本発明の他のオリゴヌクレオチド、例えば修飾したｉＲＮＡ剤、アンチセンス、アプタマー、アンタゴｍｉｒ、リボザイムで、実行され得、かかる実行は、本発明内であることが理解されるべきである。経口および鼻粘膜の両方は、他の投与の経路に優る利点を提供する。例えば、これらの膜を通して投与された薬物は、急速に作用の開始を行い、治療の血漿レベルを提供し、肝代謝の初回通過効果を回避し、適さない胃腸（ＧＩ）環境に対して薬物の曝露を回避する。追加の利点は、薬物を容易に投与し、局所化し、削除することができるように、膜部位に容易にアクセスできることを含む。
経口送達において、組成物は経口腔、例えば舌の腹側表面の膜および口腔底または頬の裏層を構成する頬粘膜を含む舌下の粘膜の表面を標的にすることができる。舌下の粘膜は、比較的に透過性がある、したがって急速な吸収および多くの薬物の受け入れられる生物学的利用率を与える。さらに、舌下の粘膜は簡便で、受け入れられ、容易にアクセス可能である。
経口粘膜を介して透過させる分子の能力は、分子の大きさ、脂溶性、およびペプチドタンパク質のイオン化に関するようである。１０００ダルトン未満の小分子は、粘膜を急速に横断するようである。分子の大きさが大きくなるにつれ、透過性は急速に減る。脂溶性の化合物は、非脂溶性分子よりも透過性がある。最大限の吸収は、電荷において分子が非イオン化または中性である場合に発生する。したがって荷電分子は、経口粘膜を介して吸収するために最大の課題を提示する。
ｉＲＮＡの医薬組成物を、定量噴霧式スプレーディスペンサー、上記のとおり混合されたミセルの薬学的な製剤、および噴霧剤から、吸入なしで腔に噴霧することによってヒトの頬側腔にも投与することができる。一実施形態において、ディスペンサーを、先ず薬学的な製剤および噴霧剤を頬側腔に噴霧する前に振とうする。
装置
解説を簡略化するために、この項における装置、製剤、組成物、および方法は、未修飾ｉＲＮＡ剤に関して主に論じられる。しかしこれらの製剤、組成物、および方法は、本発明の他のオリゴヌクレオチド、例えば修飾したｉＲＮＡ剤、アンチセンス、アプタマー、アンタゴｍｉｒ、リボザイムで、実行され得、かかる実行は、本発明内であることが理解されるべきである。ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓＲＮＡ剤（例えば前駆物質、例えばｓＲＮＡ剤またはｉＲＮＡ剤に加工することができるより大きなｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、ｓＲＮＡ剤、またはその前駆物質をコードするＤＮＡ）を、装置、例えば移植されたまたはそうでなければ対象に置かれた装置において処分することができる。例示的な装置は、脈管構造に導入された装置、例えば血管組織の管腔に挿入された、または装置自身がステント、カテーテル、心臓弁、および他の血管装置を含む脈管構造の一部を形成する装置を含む。これらの装置、例えばカテーテルまたはステントは、肺、心臓、または足の脈管構造に置かれる。
他の装置は、非血管装置、例えば腹膜に移植される、または臓器または腺性組織、例えば人工臓器における装置を含む。装置はｉＲＮＡに加えて治療物質を放出できる、例えば装置はインスリンを放出することができる。
他の装置は、人工関節、例えば股関節、および他の整形外科移植片を含む。
一実施形態において、ｉＲＮＡを含む組成物の単位投与または測定された投与は、移植装置によって分配される。装置は、対象内のパラメータを観察するセンサーを含むことができる。例えば、装置は、ポンプ、例えば任意に関連した電子機器を含むことができる。
腎臓等の組織、例えば細胞または臓器を、ｉＲＮＡ剤でエクスビボ治療することができ、対象に投与または移植することができる。
組織は、自己、同種、または異種間の組織であることができる。例えば、組織（例えば腎臓）を、移植片対宿主病を削減するために治療することができる。他の実施形態において、組織は同種であり、組織は腎臓における等、組織における不必要の遺伝子発現によって特徴付けられる疾患を治療するために治療される。別の例において、造血細胞、例えば骨髄造血細胞を含有する組織を、不必要の細胞増殖を抑制するために治療することができる。
治療された組織の導入、自己または移植に関わらず、他のセラピーと組み合わせられ得る。
いくつかの実行において、ｉＲＮＡ治療した細胞は、例えば細胞が移植片を離れることを防止する半透明の多孔性隔膜によって、他の細胞から遮断するが、体から分子を細胞に到達し細胞から産生された分子が体に入ることを可能にする。一実施形態において、多孔性隔膜はアルギン酸から形成される。
一実施形態において、避妊具はｉＲＮＡ剤で覆われているまたはそれを含有する。例示的な装置は、コンドーム、ペッサリー、ＩＵＤ（埋め込み型子宮内避妊器具、スポンジ、腟鞘、および避妊具を含む。一実施形態において、ｉＲＮＡは精子または卵子を不活性化するために選ばれる。別の実施形態では、ｉＲＮＡは、ウイルス性または病原体ＲＮＡ、例えばＳＴＤのＲＮＡに対して相補的となるために選ばれる。場合によっては、ｉＲＮＡ組成物は殺精子剤を含むことができる。
製剤
本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤を、対象に投与するために製剤化することができる。解説を簡略化するために、この項における製剤、組成物、および方法は、未修飾ｉＲＮＡ剤に関して主に論じられる。しかしこれらの製剤、組成物、および方法は、本発明の他のオリゴヌクレオチド、例えば修飾したｉＲＮＡ剤、アンチセンス、アプタマー、アンタゴｍｉｒ、リボザイムで、実行され得、かかる実行は、本発明内であることが理解されるべきである。
製剤化したｉＲＮＡ組成物によって、様々な状態を想定することができる。いくつかの例において、組成物は、少なくとも部分的に結晶、均一に結晶および／または無水（例えば、水８０、５０、３０、２０、または１０％未満）である。別の例において、ｉＲＮＡは水相において、例えば水を含む溶液において、存在する。
水相または結晶性の組成物は、例えば送達媒体、例えばリポソーム（特に水相に対して）または粒子（例えば結晶性組成物に対して適切であり得る微小粒子）に組み込まれる。一般的に、ｉＲＮＡ組成物は、目的の投与方法に適合する方法で製剤化される。
特定の実施形態において、組成物は以下の方法のうちの少なくとも１つによって調製される。噴霧乾燥、凍結真空乾燥、真空乾燥、蒸発、流動層乾燥、もしくはこれらの技術の組み合わせ、または脂質での超音波処理、凍結乾燥、凝縮および他の自己組織化。
ｉＲＮＡ調製を、別の薬剤、例えば別の治療薬またはｉＲＮＡ、例えばｉＲＮＰを形成するためにｉＲＮＡと複合体を形成するタンパク質を安定する薬剤と組み合わせて製剤化することができる。さらに他の薬剤は、キレート剤、例えばＥＤＴＡ（例えばＭｇ２＋等の二価カチオンを削除するため）、塩、リボヌクレアーゼ抑制剤（例えばＲＮＡｓｉｎ等の広特異性リボヌクレアーゼ抑制剤）等を含む。
一実施形態において、ｉＲＮＡ調製は別のｉＲＮＡ剤、例えば第２遺伝子に対して、または同一遺伝子に対してＲＮＡｉを媒介することができる第２のｉＲＮＡを、含む。さらに他の調製は、少なくとも３、５、１０、２０、５０、または１００以上の異なるｉＲＮＡ種を含むことができる。かかるｉＲＮＡは、異なる遺伝子の同様の数に対してＲＮＡｉを媒介することができる。
一実施形態において、ｉＲＮＡ調製は少なくとも第２の治療薬（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ以外の薬剤）を含む。例えば、ウイルス性疾病の治療のためのｉＲＮＡ組成物、例えばＨＩＶは、既知の非ウイルス性薬剤（例えばプロテアーゼ抑制剤または逆転写酵素阻害剤）を含む可能性がある。別の例において、癌の治療のためのｉＲＮＡ組成物は化学療法薬をさらに含む可能性がある。
本発明に適している他の製剤は、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１１号、２００８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９，７４８号、２００８年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／０４７，０８７号、および２００８年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／０５１，５２８号の各明細書に記載される。２００７年１０月３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号の明細書も本発明に適している製剤を記載する。
医薬組成物
一実施形態において、本発明は前項に記載されるとおり、本発明のオリゴヌクレオチド、例えばｉＲＮＡ剤を含有する医薬組成物、および以下に記載される薬学的に許容される担体に関する。修飾したｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物は、標的遺伝子の発現によって発生した疾病を治療するために有用である。本発明のこの態様において、本発明のｉＲＮＡ剤は以下に記載したとおり製剤化される。医薬組成物は、標的遺伝子の発現を抑制するために十分な用量で投与される。
本発明の医薬組成物は、標的遺伝子の発現または活性を抑制するために十分な用量で投与される。本発明のｉＲＮＡ剤を含有する組成物を、意外にも低容量で投与することができる。１日当たり体重１キログラムにつき最大用量５ｍｇのｉＲＮＡ剤は、標的遺伝子の発現または活性を十分に抑制する、または完全に抑圧することができる。
一般的に、修飾したｉＲＮＡ剤の適切な用量は、１日当たりレシピエントの体重の１キログラムにつき、０．００１〜５００ミリグラムの範囲（例えば、１キログラムにつき約１マイクログラム〜１キログラムにつき約５００ミリグラム、１キログラムにつき約１００マイクログラム〜１キログラムにつき約１００ミリグラム、１キログラムにつき約１ミリグラム〜１キログラムにつき約７５ミリグラム、１キログラムにつき約１０マイクログラム〜１キログラムにつき約５０ミリグラム、または１キログラムにつき約１マイクログラム〜１キログラムにつき約５０マイクログラム）であろう。医薬組成物を、１日１回投与することができる、またはｉＲＮＡ剤を、１日を通して２、３、４、５、６以上のサブ用量で、適切な間隔で投与することができる。その場合、それぞれのサブ用量に含有されるｉＲＮＡ剤は、１日当たりの総量を達成するために同様に少なくなくてはならない。用量単位は、例えばｉＲＮＡ剤の徐放を数日間提供する従来の徐放性製剤を使用して、数日間の送達のために配合されることもできる。徐放性製剤は、当該技術分野で周知である。本実施形態において、用量単位は、一致する複数の１日量を含有する。
当業者は、ある因子が、感染または疾病の重症度、以前の治療、全体的な健康および／または対象の年齢、および他の存在する疾病を含むがこれらに限定されない対象を効果的に治療するために必要な用量およびタイミングに影響を与えることを理解するであろう。さらに、組成物の治療に有効な量での対象の治療は、単一治療または一連の治療を含むことができる。本発明によって包含される個々のｉＲＮＡ剤に対する有効な用量およびインビボ半減期の見積もりは、従来の方法論または本明細書に記載される適切な動物モデルを使用してインビボでの試験に基づいて、作成することができる。
マウス遺伝学の進展は、様々なヒト疾病の調査のために、多くのマウスモデルを生成した。例えば、マウスリポジトリは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｈａｒｌａｎ，Ｍｕｔａｎｔ Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ（ＭＭＲＲＣ）Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋおよびｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｕｓｅ Ｍｕｔａｎｔ Ａｒｃｈｉｖｅにおいて見出すことができる。かかるモデルは、ｉＲＮＡ剤のインビボでの試験に対してならびに治療に有効な量を決定するために使用することができる。
本発明によって包含される医薬組成物を、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮性、気道（エアロゾル）、眼部、直腸、腟、および局所的（頬側および舌下を含む）投与を含む、経口または非経口経路を含むがこれに限定されない、当該技術分野で既知の任意の方法で投与することができる。好ましい実施形態において、医薬組成物は静脈内または内部非経口注入または注射によって投与される。医薬組成物は、実質内、くも膜下腔内、および／または定位的注射によって投与されることもできる。
経口投与について、本発明において有用なｉＲＮＡ剤は、一般的に、錠剤もしくはカプセル剤の形、粉末もしくは顆粒として、または水溶液もしくは懸濁液として提供される。
経口使用のための錠剤は、不活性な希釈液、崩壊剤、結合剤、平滑剤、甘味料、調味料、着色料、および防腐剤等の薬学的に許容される賦形剤と混合した活性成分を、含むことができる。コーンスターチおよびアルギン酸は適切な崩壊剤であるが、適切な不活性希釈液は、炭酸ナトリウムおよびカルシウム、リン酸ナトリウムおよびカルシウム、ならびにラクトースを含む。平滑剤は、存在する場合、一般的に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクであるであろうが、結合剤は、デンプンおよびゼラチンを含むことができる。必要に応じて、錠剤を、消化管における吸収を遅らせるために、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリル等の物質で覆うことができる。
経口使用のためのカプセル剤は、活性成分が固形希釈液および軟ゼラチンカプセル剤と混合される硬ゼラチンカプセル剤を含み、活性成分は水またはピーナッツ油、流動パラフィン、またはオリーブ油等の油と混合される。
筋肉内、腹腔内、皮下、および静脈内の使用について、本発明の医薬組成物は、一般的に、適切なｐＨおよび等張性に緩衝した無菌の水溶液または懸濁液に提供される。適切な水性媒体は、リンゲル液および等張性塩化ナトリウムを含む。好ましい実施形態では、担体は独占的に水性緩衝液からなる。これに関して、「独占的」とは、標的遺伝子またはウイルスを内部に持つ細胞におけるｉＲＮＡ剤の吸収に影響するまたはそれを媒介する可能性がある、助剤またはカプセル封じ材料が存在しないことを意味する。かかる物質は、例えば、以下に記載されるリポソームまたはカプシド等のミセル構造を含む。微量注入、リポフェクション、ウイルス、ウイロイド、カプシド、カプシド、または他の助剤がｉＲＮＡ剤を細胞培養へ導入されることを必要とするが、意外にもこれらの方法および薬剤は、インビボでのｉＲＮＡ剤の吸収に対して必要ではない。本発明のｉＲＮＡ剤は、多くは、薬剤が毒性または有害な副作用に関連する細胞にｉＲＮＡ剤の吸収を媒介するために助剤の使用を必要としないため、特に有利である。本発明による水性懸濁液は、セルロース誘導体、ナトリウムアルギン酸、ポリビニルピロリドおよびトラガカント等の懸濁剤、ならびにレシチン等の湿潤剤を含むことができる。水性懸濁液に対する適切な防腐剤は、エチルおよびｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートを含む。
医薬組成物は、移植片およびマイクロカプセル化した送達システムを含む制御された放出製剤等、体からの急速な除去に対してｉＲＮＡ剤を守るカプセル剤も含むことができる。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の、生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤の調製のための方法は、当業者には明らかであろう。物質は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．から商業的に得られることもできる。（ウイルス性抗原に対してモノクローナル抗体で感染細胞を標的としたリポソームを含む）リポソーム懸濁液は薬学的に許容される担体として使用されることもできる。これらは、当業者に知られている方法によって、例えば、本明細書において参照により組み込まれる米国特許第４，５２２，８１１号明細書、国際公開第９１／０６３０９号パンフレット、および欧州特許出願公開第４３０７５号明細書に記載される通りに調製することができる。
ｉＲＮＡ剤の毒性および治療の有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に効果的な用量）の測定をするために、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的手順によって測定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比としても表現することができる。高い治療指数を示すｉＲＮＡ剤は、好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒトに使用される用量の範囲を製剤化するために使用することができる。本発明の組成物の用量は、好ましくはほとんどあるいは全く毒性のないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。用量は、採用された剤形および利用される投与の経路によってこの範囲内で変動することができる。本発明の方法で使用される任意のｉＲＮＡ剤について、治療に有効な量は細胞培養アッセイから最初に見積もられ得る。用量は、ｉＲＮＡ剤または適切な場合、細胞培養で測定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の抑制を達成する試験ｉＲＮＡ剤の濃度）を含む（例えば、減少したポリペプチド濃度を達成する）標的配列のポリペプチド産物の循環する血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて製剤化することができる。かかる情報は、ヒトにおける有用な用量を、より正確に測定するために使用することができる。血漿のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
それらの個々のまたは複数の投与に加えて、上記に論じた通り、本発明に関係するｉＲＮＡ剤を、ウイルス感染および疾病を治療するために効果的な他の既知の製剤と組み合わせて投与することができる。いずれにしても、投与する医師は、当該技術分野で既知の、または本明細書に記載される有効性の標準測定値を使用して観察された結果を基に、ｉＲＮＡ剤の投与の量およびタイミングを調整することができる。
併用療法
一態様において、本発明の組成物は、併用療法に使用することができる。「併用療法」という用語は、（限定されないが第２のおよび異なる抗悪性腫瘍薬等の）他の生物学的な活性成分および（限定されないが手術または放射線治療等の）非薬物セラピーと併せて、対象の化合物の投与を含む。例えば、本発明の化合物は、他の薬学的な活性化合物、好ましくは本発明の化合物の効果を増強することができる化合物と併せて使用することができる。本発明の化合物を、同時に（単一調製または別々の調製として）または他の薬物治療に対して連続して投与することができる。一般に、併用療法は、単一サイクルまたは治療過程の間に、２つ以上の薬物の投与に直面する。
本発明の一態様において、対象化合物を、様々な疾病の状態と関与したタンパク質キナーゼを調節する１つ以上の別々の薬剤と併せて投与することができる。かかるキナーゼの例は、セリン／スレオニン特異的キナーゼ，受容体チロシン特異的キナーゼ、および非受容体チロシン特異的キナーゼを含むがこれらに限定されない。セリン／スレオニンキナーゼは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、減数分裂特異的キナーゼ（ＭＥＫ）、ＲＡＦ、およびオーロラキナーゼを含む。受容体キナーゼファミリーの例は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＥｒｂＢ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、Ｘｍｒｋ、ＤＥＲ、Ｌｅｔ２３）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体（例えばＦＧＦ−Ｒｌ、ＧＦＦ−Ｒ２／ＢＥＫ／ＣＥＫ３、ＦＧＦ−Ｒ３／ＣＥＫ２、ＦＧＦ−Ｒ４／ＴＫＦ、ＫＧＦ−Ｒ）、肝細胞成長／散乱係数因子受容体（ＨＧＦＲ）（例えばＭＥＴ、ＲＯＮ、ＳＥＡ、ＳＥＸ）、インスリン受容体（例えばＩＧＦＩ−Ｒ）、Ｅｐｈ（例えばＣＥＫ５、ＣＥＫ８、ＥＢＫ、ＥＣＫ、ＥＥＫ、ＥＨＫ−Ｉ、ＥＨＫ−２、ＥＬＫ、ＥＰＨ、ＥＲＫ、ＨＥＫ、ＭＤＫ２、ＭＤＫ５、ＳＥＫ）、ＡｘＩ（例えばＭｅｒ／Ｎｙｋ、Ｒｓｅ）、ＲＥＴ；および血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）（例えばＰＤＧＦα−Ｒ、ＰＤＧβ−Ｒ、ＣＳＦｌ−Ｒ／ＦＭＳ、ＳＣＦ−Ｒ／Ｃ−ＫＩＴ、ＶＥＧＦ−Ｒ／ＦＬＴ、ＮＥＫ／ＦＬＫ１、ＦＬＴ３／ＦＬＫ２／ＳＴＫ−１）を含む。非受容体チロシンキナーゼファミリーは、ＢＣＲ−ＡＢＬ（例えばｐ４３ａｂｌ、ＡＲＧ）；ＢＴＫ（例えばＩＴＫ／ＥＭＴ、ＴＥＣ）；ＣＳＫ、ＦＡＫ、ＦＰＳ、ＪＡＫ、ＳＲＣ、ＢＭＸ、ＦＥＲ、ＣＤＫ、およびＳＹＫを含むがこれらに限定されない。
本発明の別の態様において、対象化合物を、非キナーゼ生物学的標的またはプロセスを調節する１つ以上の薬剤と併せて投与することができる。かかる標的は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、熱ショックタンパク質（例えばＨＳＰ９０）、およびプロテアソームを含む。
一実施形態において、対象化合物をＺｏｌｉｎｚａ、Ｔａｒｃｅｖａ、Ｉｒｅｓｓａ、Ｔｙｋｅｒｂ、Ｇｌｅｅｖｅｃ、Ｓｕｔｅｎｔ、Ｓｐｒｙｃｅｌ、Ｎｅｘａｖａｒ、Ｓｏｒａｆｉｎｉｂ、ＣＮＦ２０２４、ＲＧ１０８、ＢＭＳ３８７０３２、Ａｆｆｍｉｔａｋ、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＡＧ２４３２２、ＰＤ３２５９０１、ＺＤ６４７４、ＰＤ１８４３２２等の１つ以上の生物学的標的を抑制する抗悪性腫瘍薬（例えば小分子、モノクローナル抗体、アンチセンスＲＮＡ、および融合タンパク質）と併用することができる。
Ｏｂａｔｏｄａｘ、ＡＢＴ７３７、およびＡＥＥ７８８。かかる併用は、任意の薬剤１つで達成した有効性を越えて治療の有効性を増強することができ、耐性突然変異体の出現を防止するまたは遅らせることができる。
ある好ましい実施形態において、本発明の化合物は、化学療法薬と併用して投与される。化学療法薬は、腫瘍学の分野における治療の広範囲を包含する。これらの薬剤は、腫瘍を収縮する、手術後に残された残りの癌細胞を破壊する、寛解を誘発する、寛解を維持する、および／または癌またはその治療に関する症状を軽減する目的で、疾病の様々な病期において投与される。かかる薬剤の例は、マスタードガス誘導体（メクロレタミン，シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド）等のアルキル化剤、エチレンイミン（チオテパ、ヘキサメチルメラミン）、アルキルスルホン酸塩（ブスルファン）、ヒドラジンおよびトリアジン（アルトレタミン、プロカルバジン、ダカルバジン、およびテモゾロミド）、ニトロソウレア（カルムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン）、イホスファミドおよび金属塩（カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン）；ポドフィロトキシン（エトポシドおよびテニポシド）等の植物性アルカロイド、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）、ならびにカンプトテシン類似体（イリノテカンおよびトポテカン）；クロモマイシン（ダクチノマイシンおよびプリカマイシン）等の抗腫瘍抗生物質、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン、およびイダルビシン）、ならびにマイトマイシン、アクチノマイシン、およびブレオマイシン等の種々の抗生物質；葉酸拮抗薬（メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アミノプテリン）等の抗代謝剤、ピリミジン拮抗薬（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビン）、プリン拮抗薬（６−メルカプトプリン、および６−チオグアニン）およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤（クラドリビン、フルダラビン、メルカプトプリン、クロファラビン、チオグアニン、ネララビン、およびペントスタチン）；トポイソメラーゼＩ阻害剤（イリノテカン、トポテカン）等のトポイソメラーゼ阻害剤およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、テニポシド）；モノクローナル抗体（アレムツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、リツキシマブ、トラスツズマブ、イブリツモマブチウキセタ、セツキシマブ、パニツムマブ、トシツモマブ、ベバシズマブ）；ならびにリボヌクレオチド還元酵素抑制剤（ヒドロキシ尿素）等の種々の抗悪性腫瘍；副腎皮質ステロイド抑制剤（ミトタン）；酵素（アスパラギナーゼおよびペグアスパルガーゼ）；微小管阻害剤（エストラムスチン）；ならびにレチノイド（ベキサロテン、イソトレチノイン、トレチノイン（ＡＴＲＡ）を含むがこれらに限定されない。。ある好ましい実施形態において、本発明の化合物は、化学的予防薬と併用して投与される。化学的予防薬は、体を守るため、または化学療法の副作用を最小限にするために、作用する。かかる薬剤の例は、アミホスチン、メスナ、およびデクスラゾキサンを含むがこれらに限定されない。
本発明の一態様において、対象化合物は、放射線治療と併用して投与される。放射線は、光子（Ｘ線またはガンマ線）または粒子放射線を採用する機械から一般に内部に（癌部近くの放射性物質の移入）または外部に送達される。併用療法が放射線治療をさらに含む場合には、放射線治療は治療薬および放射線治療の組み合わせの相互作用から有益な効果が達成される限り任意の適切な時間において行われ得る。例えば、適切と思われた場合には、場合によって数日間または数週間、放射線治療が時間的に治療薬の投与から削除された場合、有益な効果はさらに達成される。
本発明の化合物が免疫療法薬と併用して使用することができることが理解されるであろう。免疫療法の１つの形は、腫瘍から離れた部位におけるワクチン組成物を投与することによる宿主起源の活性前進腫瘍特異的免疫応答の生成である。単離した腫瘍抗原ワクチンおよび抗イディオタイプワクチンを含む、様々な種類のワクチンは、提案されてきた。別のアプローチは、治療される対象からの腫瘍細胞、またはかかる細胞の誘導体を使用することである（ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｂｙ Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２１：４８７）。米国特許第５，４８４，５９６号明細書において、Ｈａｎｎａ Ｊｒ．らは、再発または転移を防止するため、腫瘍を摘出する、コラゲナーゼで細胞を分散する、細胞を照射する、および約１０７細胞の少なくとも連続的に３回の投与で患者をワクチン接種することを含む、切除可能な癌腫を治療する方法を主張する。
本発明の化合物が、１つ以上の補助的治療薬とともに有利に使用することができることが理解されるであろう。補助的療法に対して適切な薬剤の例は、副腎皮質ステロイド剤（アムシノニド、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロベタゾール、クロベタゾール酢酸、クロベタゾール酪酸、クロベタゾール１７−プロピオン酸、コルチゾン、デフラザコート、デスオキシメタゾン、吉草酸ジフルコルトロン、デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、デソニド、フロ酸、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、ハルシノニド、ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、吉草酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、およびプロピオン酸ハロベタゾール）等のステロイド；トリプタン（例えばスマトリプタンまたはナラトリプタン）等の５ＨＴｉ刺激薬；アデノシンＡｌ刺激薬；ＥＰリガンド；グリシン拮抗薬等のＮＭＤＡ修飾薬；ナトリウムチャンネル遮断薬（例えばラモトリギン）；Ｐ物質拮抗薬（例えばＮＫｉ拮抗薬）；カンナビノイド；アセトアミノフェまたはフェナセチン；５−リポキシゲナーゼ抑制剤；ロイコトリエン受容体拮抗薬；ＤＭＡＲＤ（例えばメトトレキサート）；ガバペンチンおよび関連化合物；三環系抗うつ剤（例えばアミトリプチリン）；神経細胞安定化抗てんかん薬；モノアミン作動性吸収抑制剤（例えばベンラファキシン）；マトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤；ｉＮＯＳまたはｎＮＯＳ抑制剤等の一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）抑制剤；腫瘍壊死因子αの放出または作用の抑制剤；モノクローナル抗体療法等の抗体療法；ヌクレオシド抑制剤（例えばラミブジン）または免疫システム修飾薬（例えばインターフェロン）等の非ウイルス剤；オピオイド鎮痛薬；局部麻酔薬；カフェインを含む刺激物質；Ｈ２拮抗薬（例えばラニチジン）；プロトンポンプ抑制剤（例えばオメプラゾール）；制酸薬（例えば水酸化アルミニウムまたはマグネシウム；整腸剤（例えばシメチコン）；うっ血除去薬（例えばフェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、プソイドエフェドリン、オキシメタゾリン、エピネフリン、ナファゾリン、キシロメタゾリン、プロピルヘキセドリン、またはレボ−デゾキシエフェドリン）；鎮咳剤（例えばコデイン、ヒドロコドン、カルミフェン、カルベタペンタン、またはデキストロメトルファン）；利尿剤；または鎮静または非鎮静抗ヒスタミン薬を含む。
標的遺伝子の発現を抑制する方法
さらに別の態様において、本発明は細胞または生物における標的遺伝子の発現を抑制する方法に関する一実施形態において、方法は、標的遺伝子の発現がサイレンシングされるように、発明オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンス、アプタマー、アンタゴｍｉｒ、もしくはｉＲＮＡ剤；または哺乳動物等の細胞または生物に対してオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物を投与することを含む。発明オリゴヌクレオチド、例えばｉＲＮＡ剤を使用して標的遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法は、前項に記載されたとおり実施することができる。
本実施形態において、発明オリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮性、気道（エアロゾル）、眼部、直腸、腟、および局所的（頬側および舌下を含む）投与を含む経口または非経口経路を含むがそれに限定されない、当該技術分野において既知の任意の方法によって投与することができる。好ましい実施形態において、医薬組成物は静脈内または内部非経口注入または注射によって投与される。医薬組成物は、実質内、くも膜下腔内、および／または定位的注射によって投与されることもできる。
標的遺伝子の発現を抑制するための方法は、サイレンシングさせることを希望する者の任意の遺伝子に適用することができる、その結果標的遺伝子が発現された細胞または生物がＲＮＡ干渉に影響する細胞機構を含む場合は、その発現を特異的に抑制する。サイレンシングするために標的にすることができる遺伝子の例は、接着分子、サイクリンキナーゼ抑制剤、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、翼状らせんファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカインおよびそれらの受容体、成長／分化因子およびそれらの受容体、ならびに神経伝達物質およびそれらの受容体を含むがこれらに限定されない発生遺伝子；（２）ＡＢＬＩ、ＢＣＬ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、およびＹＥＳを含むがこれらに限定されない癌遺伝子；（３）ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＲＢ１、ＴＰ５３、およびＷＴ１を含むがこれらに限定されない腫瘍抑制遺伝子；ならびに（４）ＡＣＰ不飽和化酵素およびヒドロキシラーゼ、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコール脱水素酵素、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコース酸化酵素、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、異性化酵素、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、ならびにキシラナーゼを含むがこれらに限定されない酵素を限定なしに含む。
インビボでの遺伝子抑制に加えて、当業者は、発明オリゴヌクレオチド、例えば本発明のｉＲＮＡ剤は、幅広い種類のインビトロ適用において有用であることを理解するであろう。かかるインビトロ適用は、例えば、科学および商業的な研究（例えば生理学的経路、創薬、および開発の解明）、ならびに医療および獣医診断を含む。一般に、方法は既知の技術（例えば、細胞過程を通して、または電気穿孔およびリポフェクション等の助剤または装置によっての吸収）を使用して細胞にオリゴヌクレオチド、例えばｉＲＮＡ剤を導入し、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るために十分な時間の間細胞を維持することを含む。
定義
本明細書で使用されるとき、「脂肪族」という用語は、最大２４個の炭素原子を含有する直鎖状のまたは分岐した炭化水素基を指し、任意の２つの炭素原子間の飽和は、単、二重、または三重結合である。脂肪族基は、好ましくは１〜約２４個の炭素原子、より典型的に１〜約１２個の炭素原子を含有する。適切な脂肪族基は、直線状または分岐した、置換した、または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル基、および（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキル、または（シクロアルキル）アルケニル等の、ハイブリッドを含むがこれらに限定されない。脂肪族基の直鎖状または分岐した鎖は、窒素、酸素、硫黄、およびリンを含む１つ以上のヘテロ原子で中断することができる。ヘテロ原子によって中断されるかかる脂肪族基は、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、およびポリイミン等のポリアルコキシを含むがこれらに限定されない。本明細書に使用される脂肪族基は、さらなる置換基を任意に含むことができる。
「アルキル」という用語は、Ｎ、Ｏ、またはＳとともに任意に挿入することができる、炭素原子（これらはプロピル、アリル、またはプロパルギルを含むがこれらに限定されない）の指定された数を含有する直鎖状鎖または分岐した鎖であり得る飽和および不飽和非芳香族炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１−Ｃ２０は、基が１〜２０個（両端を含む）の炭素原子を有することができることを指示する。「アルコキシ」といよう用語は、−Ｏ−アルキル遊離基を指す。「アルキレン」という用語は、二価アルキル（すなわち−Ｒ−）を指す。「アルキレンジオキソ」という用語は、Ｒがアルキレンを表す構造−Ｏ−Ｒ−Ｏ−の二価種を指す。「アミノアルキル」という用語は、アミノと置換されたアルキルを指す。「メルカプト」という用語は、−ＳＨ遊離基を指す。「チオアルコキシ」という用語は、−Ｓ−アルキル遊離基を指す。
本明細書で使用されるとき、「環状」という用語は、シクロアルキル基およびヘテロ環式基を含む。環式基の任意の適切な環の位置は、定義された化学構造と共有結合的に結び付けられ得る。
「非環状」という用語は、分岐したまたは非分岐の任意の担体を説明することができ、閉環を形成しない。
「アリール」という用語は、６炭素単環式または１０炭素二環式芳香族環系を指し、それぞれの環の０、１、２、３、または４個の原子を置換基によって置換することができる。アリール基の例は、フェニル、ナフチル等を含む。「アリールアルキル」という用語または「アラルキル」という用語は、アリールを用いて置換したアルキルを指す。「アリールアルコキシ」という用語は、アリールを用いて置換したアルコキシを指す。
本明細書で採用される「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素、例えば、３〜８個の炭素、および例えば、３〜６個の炭素を有する飽和および部分的に不飽和の環状炭化水素基を含み、さらにシクロアルキル基を、任意に置換することができる。シクロアルキル基は、デカリン、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルを含むが限定されない。
「ヘテロアリール」という用語は、単環式の場合１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合１〜６個のヘテロ原子、または三環式の場合１〜９個のヘテロ原子を有する、ヘテロ原子はＯ、Ｎ、またはＳ（例えば、炭素原子および単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれＮ、Ｏ、またはＳの１〜３個、１〜６個、または１〜９個のヘテロ原子）から選択した芳香族５〜８員単環式、８〜１２員二環式、または１１〜１４員三環式の環系を指し、それぞれの環の０、１、２、３、または４個の原子を、置換基によって置換することができる。ヘテロアリール基の例は、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリル等を含む。「ヘテロアリールアルキル」という用語または「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールを用いて置換したアルキルを指す。「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、ヘテロアリールを用いて置換したアルコキシを指す。
「ヘテロシクロアルキル」という用語と「ヘテロ環状」は、互換的に使用することができ、非芳香族３−、４−、５−、６−、もしくは７−員環、または二もしくは三環式基融合システムを指し、（ｉ）それぞれの環は酸素、硫黄および窒素から独立して選択した１〜３個のヘテロ原子を含有し、（ｉｉ）それぞれの５−員環は０〜１個の二重結合を有しそれぞれの６−員環は０〜２個の二重結合を有し、（ｉｉｉ）窒素および硫黄のヘテロ原子を、任意に酸化することができ、（ｉｖ）窒素ヘテロ原子を任意に四級化することができ、（ｉｖ）上記の環のうちのいずれかを、ベンゼン環に融合することができ、（ｖ）残りの環原子は任意にオキソ置換することができる炭素原子である。代表的なヘテロシクロアルキル基は、［１，３］ジオキソラン、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、およびテトラヒドロフリルを含むがこれらに限定されない。かかるヘテロ環式基を、置換したヘテロ環状を投与するためにさらに置換することができる。
「オキソ」という用語は、炭素に付加した場合にカルボニル、窒素に付加した場合にＮ‐オキシド、および硫黄に付加した場合にスルホキシドまたはスルホンを形成する酸素原子を指す。
「アシル」という用語は、置換基によってさらに置換することができるアルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指す。
本明細書で使用されるとき、「シリル」という用語は、式−ＳｉＡ１Ａ２Ａ３によって表され、Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、独立して本明細書に記載される水素もしくは置換したもしくは非置換のアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリール基である。
「置換した」という用語は、ある構造における１つ以上の水素遊離基と、ハロ，アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール，アルキルチオ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ，アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環状、および脂肪族を含むがこれらに限定されない特定の置換基の遊離基との交換を指す。置換基をさらに置換することができることが理解される。
塩基
アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルは、ＲＮＡにおいて認められる最も一般的な塩基である。これらの塩基は、改善された性質を有するＲＮＡを提供するために、修飾されるまたは交換されることができる。例えば、ヌクレアーゼ抵抗性オリゴリボヌクレオチドは、これらの塩基とともに、または合成および天然核酸塩基（例えばイノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、イソグアニシン、またはツベルシジン）および上記修飾のうちのいずれか１つとともに調製されることができる。あるいは、上記の塩基のうちのいずれかの置換または修飾類似体、および「ユニバーサル塩基」を採用することができる。例は、２−アミノアデニン、２−フルオロアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン，７−デアザアデニン、Ｎ６、Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基を含む。さらに、プリンおよびピリミジンは、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されたもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されたもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されたものを含む。
「非天然」核酸塩基という用語は、以下のうちのいずれか１つを指す：２−メチルアデニニル、Ｎ６−メチルアデニニル、２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデニニル、Ｎ６−イソペンテニルアデニニル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニニル、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニニル、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニニル、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデニニル、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデニニル、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデニニル、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデニニル、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニニル、３−メチルシトシニルカルバモイル、５−メチルシトシニルカルバモイル、２−チオシトシニルカルバモイル、５−ホルミルシトシニルカルバモイル、Ｎ４−メチルシトシニルカルバモイル、５−ヒドロキシメチルシトシニルカルバモイル、１−メチルグアニニル、Ｎ２−メチルグアニニル、７−メチルグアニニル、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアニニル、Ｎ２，７−ジメチルグアニニル、Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアニニル、１−メチルグアニニル、７−シアノ−７−デアザグアニニル、７−アミノメチル−７−デアザグアニニル、プソイドウラシリル、ジヒドロウラシリル、５−メチルウラシリル、１−メチルプソイドウラシリル、２−チオウラシリル、４−チオウラシリル、２−チオチミニル５−メチル−２−チオウラシリル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシリル、５−ヒドロキシウラシリル、５−メトキシウラシリル、ウラシリル５−オキシ酢酸、ウラシリル５−オキシ酢酸メチルエステル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシリル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシリルメチルエステル、５−メトキシカルボニルメチルウラシリル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシリル、５−アミノメチル−２−チオウラシリル、５−メチルアミノメチルウラシリル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシリル、５−メチルアミノメチル−２−セレノウラシリル、５−カルバモイルメチルウラシリル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシリル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシリル、３−メチルウラシリル、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウラシリル、５−カルボキシメチルウラシリル、５−メチルジヒドロウラシリル、３−メチルプソイドウラシリル、
ユニバーサル塩基は、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれと塩基対を形成することができ、それらの間に比較的小さな識別を示す。一般に、ユニバーサル塩基は、相互作用を積み重ねることを通して、例えば二重鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ様分子を安定することができる非水素結合、疎水性、芳香族部分である。ユニバーサル塩基は、水素結合置換基も含むことができる。本明細書で使用されるとき、「ユニバーサル塩基」は、アントラセン、ピレン、または以下のうちのいずれか１つを含むことができる。
アンタゴｍｉｒ
アンタゴｍｉｒは、増強した組織および細胞吸収等のリボヌクレアーゼ保護および薬理的性質のための様々な修飾を内部に持つＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。それらは、例えば糖の完全２’−Ｏ−メチル化、ホスホロチオエート骨格、および例えば３’末端におけるコレステロール部分によって通常のＲＮＡと異なる。アンタゴｍｉｒは、内在性ｍｉＲＮＡを効率的にサイレンシングさせるために使用することができる、その結果ｍｉＲＮＡ誘発遺伝子サイレンシングを防止する。アンタゴｍｉｒ媒介ｍｉＲＮＡサイレンシングの例は、本明細書に参照により全体が明確に組み込まれるＫｒｕｔｚｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３８：６８５−６８９に記載されたｍｉＲ−１２２のサイレンシングである。
デコイオリゴヌクレオチド
転写因子がそれらの比較的に短く結合した配列を認めることができるため、周囲のゲノムＤＮＡが不在であっても、特異的な転写因子の共通結合配列を有する短オリゴヌクレオチドを、生細胞における遺伝子発現を操縦するためのツールとして使用することができる。この戦略は、標的因子によって認められ結合されたかかる「デコイオリゴヌクレオチド」の細胞内送達を含む。デコイによる転写因子のＤＮＡ結合部位の占領は、標的遺伝子のプロモーター領域と次に結合することができない転写因子を与える。デコイは、転写因子によって活性化される遺伝子の発現を抑制するため、または転写因子の結合によって抑制される遺伝子を上方制御するため、治療薬として使用することができる。デコイオリゴヌクレオチドの例を、本明細書に参照により明確に組み込まれるＭａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０００，１０６：１０７１−１０７５に見出すことができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡの単鎖は選択された配列に対して少なくとも部分的に相補的である。アンチセンスＲＮＡの場合、それらは結合することによって相補的ＲＮＡ鎖の翻訳を防止する。アンチセンスＤＮＡは、特異的、相補的（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的にするために使用することができる。結合が起こる場合、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを、酵素リボヌクレアーゼＨによって分解することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの利用の例は、本明細書に参照により全体が明確に組み込まれるＤｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，２００２，１：３４７−３５５に見出すことができる。
アプタマー
アプタマーは、特異的な標的分子を結合する核酸分子である。アプタマーは、ＲＮＡまたはＤＮＡベースであることができ、リボスイッチを含むことができる。リボスイッチは、標的小分子を直接結合することができるｍＲＮＡ分子の一部であり、標的の結合は遺伝子の活性に影響する。したがって、リボスイッチを含有するｍＲＮＡは、その標的分子が存在または不在によってそれ自身の活性を制御することに直接関係する。
参考文献
本明細書に記載する全ての刊行物および特許は、それぞれの個々の刊行物または特許が、参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合、本明細書におけるいずれの定義も含み、本出願が優先される。
対応特許
当業者は、日常的実験を超えずに、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認めるか、または解明するであろう。したがって、前述の実施形態は例としてのみ示され、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、具体的に記載され、特許請求されるものとは別様に、本発明を実践可能であることを理解されたい。
本発明を慨して説明したが、本発明のある態様および実施形態の説明を目的として含まれるに過ぎず、本発明を限定することを目的としない、以下の実施例を参照により、より容易に理解されるであろう。したがって、本発明は以下の実施例に限定されていると解釈されるべきではなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意および全ての変更を包含すると解釈されるべきである。
実施例１．脂質のアジ化物の合成
アジ化ドコシル（１）
臭化無水ＤＭＦ（１００ｍＬ）におけるドコシル（１０．０ｇ、２５．６７ミリモル）を、６０℃で、２時間アジ化ナトリウム（８．３５ｇ，１２８．３７ミリモル）を用いて処理した。そして、氷水（１０００ｍＬ）を用いた反応溶液の希釈によって、白色結晶を生じた。吸引漏斗および真空でろ過および乾燥し、白色結晶（９．１１ｇ、２５．９０ミリモル、量）として１を生じた。［Ｍ＋Ｎａ］＋に対するＬＣ−ＭＳ計算値：６２１．２、実測値：６２１．２。
アジ化ステアリル（２）
無水ＤＭＦ（２００ｍＬ）におけるブロモオクタデカン（１０．０ｇ、３０．１０ミリモル）を、アジ化ナトリウム（９．７８ｇ、１５０．５１ミリモル）を用いて６０℃で２時間処理した。そして、氷水を用いた反応溶液の希釈により、白色結晶を生じた。吸引漏斗および真空でろ過および乾燥し、白色結晶として２を生じた。（６．８２ｇ、２３．０７ミリモル、７６％）。
アジ化リノレイル（３）
無水ＤＣＭ（８０ｍＬ）におけるリノレイルアルコール（１０ｍＬ、３２．３ミリモル）を、メタンスルホニルクロライド（２．７５ｍＬ、３５．５ミリモル）およびトリエチルアミン（５．８ｍＬ、４２．０ミリモル）を用いて室温において２時間処理した。ＤＣＭ／水を用いた抽出、硫酸ナトリウムを用いた有機層の乾燥、および蒸発によって、粗メシル酸塩を生じた。この粗製物を、直接次のステップに使用した。
無水ＤＭＦ（３００ｍＬ）における粗製物を、アジ化ナトリウム（１０．５ｇ、１６１．５０ミリモル）を用いて６０℃で１８時間処理した。酢酸エチル／水を用いた抽出、硫酸ナトリウムを用いた有機層乾燥、および蒸発によって暗色の油を生じた。油を、シリカゲル上でクロマトグラフした。ヘキサンを含む溶出剤によって、透明な油（７．５１ｇ、２５．６７ミリモル、８０％（２ステップ））として３を生じた。
アジ化オレイル（４）
無水ＤＣＭ（８０ｍＬ）におけるオレイルアルコール（１０ｍＬ、３２．３０ミリモル）を、メタンスルホニルクロライド（２．７５ｍＬ、３５．５ミリモル）およびトリエチルアミン（５．８ｍＬ、４２．０ミリモル）を用いて室温において４時間処理した。ＤＣＭ／水を用いた抽出、硫酸ナトリウムを用いた有機層の乾燥、および蒸発によって粗メシル酸塩を生じた。この粗製物を、直接次のステップに使用した。
無水ＤＭＦ（３００ｍＬ）における粗製物を、アジ化ナトリウム（１０．５ｇ、１６１．５０ミリモル）を用いて６０℃で１８時間処理した。酢酸エチル／水を用いた抽出、硫酸ナトリウムを用いた有機層乾燥、および蒸発によって暗色の油を生じた。油を、シリカゲル上でクロマトグラフした。ヘキサンを含む溶出剤によって、透明な油（４．００ｇ、１６．３８ミリモル、４４％（２ステップ））として３を生じた。
ヒドロキシヘキシルカルバモイルコレステロール（５）
無水のジクロロメタンにおける１−アミノ−６−ヘキサノール（５．００ｇ、４２．６７ミリモル）を、トリエチルアミン（１１．９ｍＬ、８５．３３ミリモル）およびコレステロールクロロ炭酸塩（１９．１６ｇ、４２．６７ミリモル）を用いて室温において４時間処理した。ＤＣＭ／ブラインを用いた抽出、硫酸ナトリウムを用いた乾燥、および蒸発によって黄色いシロップを生じた。そしてＤＣＭ／ヘキサンを用いた結晶化によって、白色結晶（２０．３ｇ、３８．３１ミリモル、８９％）としてを５生じた。［Ｍ＋Ｎａ］＋５５２．３に対するＬＣ−ＭＳ計算値：、実測値：５５２．３。
アジドヘキシルカルバモイルコレステロール（６）
５（１５．０ｇ、２８．３１ミリモル）を、トリエチルアミン（７．９ｍＬ、５６．６２ミリモル）およびメタンスルホニルクロライド（２．４ｍＬ、３１．１４ミリモル）を用いて室温において４時間処理した。ＤＣＭ／ブラインを用いた抽出、乾燥、真空中での濃縮によって、粗メシル酸塩を生じた。この粗製物を、直接次のステップに使用した。
無水ＤＭＦ（３００ｍＬ）における粗製物を、アジ化ナトリウム（３００ｍＬ）を用いて６０℃で１８時間処理した。酢酸エチル／ブラインを用いた抽出、硫酸ナトリウムを用いた有機層の乾燥、および蒸発によって黄色いシロップを生じた。シロップを１８時間静置した後、シロップを結晶化した。結晶を水を用いて洗浄した。ろ過および吸引漏斗における乾燥および真空によって、黄色い結晶（１３．２４ｇ、２３．８７ミリモル、８４％（２ステップ））として６を生じた。
実施例２．脂質アルキン共役体
基本手順
ＤＭＦにおけるそれぞれのカルボニル酸またはクロロ炭酸塩を、ＨＢＴＵおよびプロパルギルアミンを用いて処理し、対応するアルキンを生じる。
実施例３．脂質アジ化エステル共役体
これらのアジ化物を、ＮＨ４ＯＨ処理後に合成後のために使用するであろう。
エステルを細胞においてエステラーゼを用いて切断するであろう。
基本手順
ＤＣＭにおけるそれぞれの塩化物またはクロロ炭酸塩を、ＴＥＡ（２等量）および１−ブロモヘキサノール（１．１等量）を用いて室温において処理する。水系後処理および濃縮によって粗臭化物を生じた。ＤＭＦにおける臭化物を、アジ化ナトリウム（５等量）を用いて６０℃で処理する。再結晶化によって、対応するアジ化物を生じる。
実施例４．２’／３’−Ｏ−プロパルギルヌクレオシド誘導体の合成
化合物１００ｂ
ピリジン（３５０ｍＬ）における５−メチルウリジン（２０．０ｇ、７７．４５ミリモル）を、クロロトリメチルシラン（４９．４ｍＬ、４２．０７ミリモル）を用いて３０分間、室温において処理した。氷浴においてベンゾイル塩化物（９．９０ｍＬ、１１．９８ミリモル）を溶液に添加した。１８時間後、ＴＬＣモニタリングおよびＬＣ−ＭＳ解析は、反応が完了したことを示した。氷浴において氷水（１００ｍＬ）を溶液に添加した。２時間後、ＴＬＣモニタリングおよびＬＣ−ＭＳ解析は、３つのトリメチルシリルエーテルの切断を示した。溶液を、酢酸エチルおよびブラインを用いて直接摘出した。有機層を、硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル上でクロマトグラフした。ＤＣＭにおける５％ＭｅＯＨを含む溶出剤によって、白い泡（２３．５ｇ、６４．３６ミリモル、８２％）として１００ａを生じた。［Ｍ＋Ｎａ］＋に対するＬＣ−ＭＳ計算値：３８５．１、実測値：３８５．１。
化合物１０１ｂおよび１０２ｂ
ジブチルすずオキシド（２４９ｍｇ、１．００ミリモル）を、１００℃で無水ＤＭＦにおける１００ａ（３３０ｍｇ、０．９１ミリモル）の溶液に添加した。１８時間後、水を用いて反応を停止させた。反応溶液を減圧下で濃縮し、水系後処理せずにシリカゲル上でクロマトグラフした。ＤＣＭにおける１０％ＭｅＯＨを含む溶出剤によって、泡として１０１ｂおよび１０２ｂ（１４０ｍｇ、０．３４ミリモル、３８％）の混合物を生じた。
化合物１０３ｂ
４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（６．００ｇ、１７．７１ミリモル）を、無水ピリジン（２００ｍＬ）における１０１ｂおよび１０２ｂ（５．００ｇ、１２．４８ミリモル）の溶液に添加した。４時間後、ＴＬＣモニタリングは、反応が完了したことを示した。水を用いて反応を停止した後、溶液をＥｔＯＡｃおよびブラインを用いて摘出した。有機層を、減圧下で濃縮し、黄色い残渣を生じた。残渣をＭｅＯＨにおいて７Ｍアンモニアを用いて１８時間室温において処理した。溶液を蒸発し、黄色い残渣を生じた。残渣をシリカゲル上でクロマトグラフした。ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１〜１：２）を含む溶出剤によって、白い泡（３．１６５ｇ、５．４１ミリモル、３０％）として１０３ｂを生じた。［Ｍ＋Ｎａ］＋に対するＬＣ−ＭＳ計算値：６２１．２、実測値：６２１．２。
化合物１０４ｂ
１０３ｂを溶出した後、１０４ｂを溶出した。産生量は７７０ｍｇ（１．３１ミリモル、８％）であった。［Ｍ＋Ｎａ］＋に対するＬＣ−ＭＳ計算値：６２１．２、実測値：６２１．２。
化合物１０５ａ
氷浴において水素化ナトリウム（１．９４ｇ、８１．０８ミリモル）を、無水ＤＭＦにおける５’−Ｏ−ＤＭＴｒウリジン（９．００ｇ、３６．７５ミリモル）の溶液に添加した。１時間活発に撹拌した後、クロロメチルピバレート（１１．８５ｍＬ、８１．０８ミリモル）を氷浴において溶液に添加した。２４時間０℃〜室温において活発に撹拌した後、ＴＬＣモニタリングは、反応が完了したことを示した。溶液を、ＥｔＯＡｃおよび水性塩化アンモニウム溶液を用いて分割した。有機層を硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、減圧下で濃縮し、黄色い残渣を生た。クロマトグラフィーによって１０５ａを生じる。
化合物１０５ｂ
１０５ａと同様の手順によって、１０５ｂを生じる。
化合物１０６ａ
ジブチルすずオキシド（１．１等量）を、ベンゼン／ヘキサン（４：１、ｖ／ｖ）における１０５ａの溶液に添加する。混合物を１２０℃で２０分間マイクロ波によって照射する。反応後、混合物は透明な溶液に変化する。臭化プロパルギル（５等量）およびテトラブチルアンモニウムヨウ化物（５等量）を溶液に添加する。溶液を１２０℃で２．５時間マイクロ波によって照射した。水系後処理およびクロマトグラフィーによって１０６ａを生じる。
化合物１０６ｂ
１０６ａと同様の手順によって、１０５ｂを生じる。
化合物１０７ａ
１０６ａ後、１０７ａを溶出する。
化合物１０７ｂ
１０７ａと同様の手順によって、１０７ｂを生じる。
実施例５．５’−Ｏ−プロパルギルカルバモイルヌクレオシド誘導体の合成
化合物１０８ａ
ピリジン（３５０ｍＬ）における２’−３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（１０．００ｇ、３５．１８ミリモル）を、フェニルクロロ炭酸塩（４．８ｍＬ、３８．７０ミリモル）を用いて室温において２時間処理した。プロパルギルアミン（７．３ｍＬ、１７５．８９ミリモル）を溶液に添加した。１８時間室温において活発に撹拌した後、ＴＬＣモニタリングは反応が完了したことを示した。溶液を、ＤＣＭおよび放置したＮａＨＣＯ３ａｑを用いて直接分割した。有機層を硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、減圧下で濃縮し、暗色の残渣を生じた。残渣をシリカゲル上でクロマトグラフした。ＤＣＭにおける２％ＭｅＯＨを含む溶出剤によって、白い泡（１１．７３ｇ、３２．１０ミリモル、９１％（２ステップ）として１０８ａを生じた。［Ｍ＋Ｈ］＋に対するＬＣ−ＭＳ計算値：３６６．０、実測値：３６６．０。
化合物１０８ｂ
１０８ａと同様の手順によって、１０８ｂを生じる。
化合物１０９ａ
ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）における１０８ａ（１１．７３ｇ、３２．１０ミリモル）を、８０％ＡｃＯＨ（２００ｍＬ）を用いて１８時間還流した。反応の完了を、ＬＣ−ＭＳによって確認した。反応溶液を減圧下で濃縮し、黄色い粘着性のシロップを生じた。シロップをＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を用いて処理し、３０分間超音波処理した。超音波処理によって白色結晶を生じた。ろ過および吸引漏斗における乾燥および真空によって、白色結晶（１０．３４ｇ、３１．７８ミリモル、９９％）として１０９ａを生じた。
化合物１０９ｂ
１０９ａと同様の手順によって、１０９ｂを生じる。
化合物１１０ａ
無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）における１０９ａ（１０．３４ｇ、２８．３０ミリモル）を、硝酸銀（５．７７ｇ、３４．００ミリモル）、ピリジン（１７．０ｍＬ、２０９．４ミリモル）、および第３ブチルジメチルシリルクロライド（４．２７ｇ、２８．３０ミリモル）を用いて室温において１８時間処理した。そして溶液をＤＣＭ／水を用いて分割した。、有機層を硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、減圧下で濃縮し、残渣を生じた。残渣をシリカゲル上でクロマトグラフした。１１０ａおよび３’−Ｏ−異性体（４．００ｇ、３２％）を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１：１）を用いて同時に溶出した。混合物をアルミニウムゲル上でクロマトグラフした。ＤＣＭにおける２％ＭｅＯＨを含む溶出剤によって、純粋な１１０ａを生じた。［Ｍ＋Ｎａ］＋に対するＬＣ−ＭＳ計算値４６２．１：、実測値：４６２．１。
化合物１１０ｂ
１１０ａと同様の手順によって、１１０ｂを生じる。
化合物１１１ａ
無水ＤＣＭ（１２ｍＬ）における１１０ａ（４５２ｍｇ、１．０２ミリモル）を、ジイソプロピルエチルアミン（６１２μｌ、３．４１ミリモル）および２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（３８０ｍＬ、１．７１ミリモル）を用いて室温において６時間処理した。溶液をＤＣＭ／ブラインを用いて抽出した。有機層を硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、減圧下で濃縮し、た黄色い残渣を生じるた。残渣をシリカゲル上でクロマトグラフした。ＴＥＡ／ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（０．５：５０：５０）を含む溶出剤によって、白い泡として１１１ａ（４６９ｍｇ、０．７３ミリモル、７１％）を生じた。
化合物１１１ｂ
１１１ａと同様の手順によって、１１１ｂを生じる。
実施例６．プロパルギルヌクレオシドおよびアジ化物の使用による「クリックした」化合物
化合物１１２ａ
ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（４：１、ｖ／ｖ）（０．５ｍＬ）における１０３ｂ（２５ｍｇ、０．０４ミリモル）を、１（１４ｍｇ、０．０４ミリモル）、テトラキスアセトニトリル銅ヘキサフルオロリン酸塩（３ｍｇ、０．０１ミリモル）、および銅（１ｍｇ、０．０１ミリモル）を用いて処理した。１時間後、溶液をＤＣＭ／ブラインを用いて抽出した。有機層を減圧下で濃縮し、緑色の残渣を生じた。残渣をシリカゲル上でクロマトグラフした。ＤＣＭにおける１％ＭｅＯＨを含む溶出剤によって、白い泡（３６ｍｇ、０．０３７ミリモル、９７％）として１１２ａを生じた。［Ｍ＋Ｎａ］＋に対するＬＣ−ＭＳ計算値：９７２．５、実測値：９７２．５。
化合物１１３
典型的なホスフィチレーションによって１１３を生じる。
化合物１１４
典型的なサクシニル化によって１１４を生じる。
化合物１１５
ＣＰＧに対する典型的な固定化によって１１５を生じる。
化合物１１６
１１２ａと同様の手順によって、１１６を生じる。
化合物１１７
典型的なホスフィチレーションによって１１７を生じる。
化合物１１８
典型的なサクシニル化によって１１８を生じる。
化合物１１９
ＣＰＧに対する典型的な固定化によって１１９を生じる。
化合物１２０ａ
ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（４：１、ｖ／ｖ）（２ｍＬ）における１１０ａ（１００ｍｇ、０．１７ミリモル）を、３（５９ｍｇ、０．１７ミリモル）、テトラキスアセトニトリル銅ヘキサフルオロリン酸塩（１３ｍｇ、０．０３ミリモル）、および銅（２ｍｇ、０．０３ミリモル）を用いて室温において３時間処理した。溶液を減圧下で濃縮し、水系後処理せずに、シリカゲル上でクロマトグラフした。ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１：３）を含む溶出剤によって、泡（１２２ｍｇ、０．１６ミリモル、９８％）として１２０ａを生じた。［Ｍ＋Ｈ］＋に対するＬＣ−ＭＳ計算値：７３１．２、実測値：７３１．２。
化合物１２０ｂ
ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（４：１、ｖ／ｖ）における１１０ａ（５００ｍｇ、１．１４ミリモル）を、３２５（４６０ｍｇ、１．１４ミリモル）、テトラキスアセトニトリル銅ヘキサフルオロリン酸塩（４２ｍｇ、０．１１ミリモル）、および銅（７ｍｇ、０．１１ミリモル）を用いて室温において１８時間処理した。溶液を減圧下で濃縮し、水系後処理せずに直接シリカゲル上でクロマトグラフした。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０：１）を含む溶出剤によって、白い泡（８００ｍｇ、０．８８ミリモル、８８％）として１２０ｂを生じた。
化合物１２１ａ
無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）における１２０ａ（７３０ｍｇ、１．００ミリモル）を、ジイソプロピルエチルアミン（５２５μｌ、３．００ミリモル）および２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルホスホラミダイト（３３５μｌ、１．５０ミリモル）を用いて室温において４時間処理した。溶液をＤＣＭ／ブラインを用いて抽出した。有機層を硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、減圧下で濃縮し、暗色の残渣を生じた。残渣をシリカゲル上でクロマトグラフした。ＴＥＡ／ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（０．５：６０：３０）を含む溶出剤によって、白い泡（４６３ｍｇ、０．５０ミリモル、５０％）として１１６ａを生じた。
化合物１２１ｂ
無水ＤＣＭ（４ｍＬ）における１２０ｂ（４００ｇ、０．４４ミリモル）を、ジイソプロピルエチルアミン（２３０μｌ、１．３３ミリモル）および２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルホスホラミダイト（１５０μｌ、０．６７ミリモル）を用いて室温において６時間処理した。溶液をＤＣＭ／ブラインを用いて分割した。有機層を硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、減圧下で濃縮し、黄色い残渣を生じた。残渣をシリカゲル上でクロマトグラフした。ＴＥＡ／ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（０．５：２：１００）を含む溶出剤によって、白い泡（４０３ｍｇ、０．３６ミリモル、８３％）として１２０ｂを生じた。［Ｍ＋Ｎａ］＋に対するＬＣ−ＭＳ計算値：１１２３．３、実測値：１１２３．３。
実施例７．機能性のアルキンまたはアジ化物を含む糖リガンド
３１９の調製：
ガラクトサミンペンタアセテート３００（５２．００ｇ、１３３．６３ミリモル）を外界温度においてジクロロエタン（３００ｍＬ）に取り入れた。ＴＭＳＯＴｆ（４４．５５ｇ、２００．４４ミリモル）を添加し、混合物を５０℃で９０分間水浴において撹拌し、加熱を止め、混合物を室温において一晩撹拌した。それを氷冷のナトリウム炭酸水素溶液に注ぎ、ジクロロメタンを用いて抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を真空中で取り除き、残渣を一晩高真空下で乾燥し、暗色のゴム（ＴＬＣ：ＣＨＣｌ３における１５％ＭｅＯＨ、Ｒｆ値：０．５，４４．５０ｇ、定量的）として化合物３０１得るた。それをそれ以上の精製なしに次の反応のために使用した。１Ｈ ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩによって、産物形成を確認した。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３４００ＭＨｚ）δ ＝６．０１（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．４６（ｔ、Ｊ＝３．０１Ｈｚ、１Ｈ）、４．９１（ｄｄ、Ｊ＝３．２９、７．３０Ｈｚ、１Ｈ）、４．２６−３．９３（ｍ、４Ｈ）、２．１２（ｓ、３Ｈ）、２．０７（ｓ、６Ｈ）、２．０５（ｓ、３Ｈ）。ＭＳ：Ｃ１４Ｈ１９ＮＯ８に対する分子量計算値：３２９．１１；実測値：３５２．１（Ｍ＋Ｎａ）。
３０３の調製：
化合物３０１（４３．７０ｇ、１３３．５６ミリモル）およびベンジルエステル３０２（４１．７１ｇ、２００．３４ミリモル）を、ジクロロエタン（３００ｍＬ）において溶解し、分子ふるい（５０ｇ）を溶液に添加し、３０分間撹拌した。ＴＭＳＯＴｆ（１４．５０ｇ、６６．７８ミリモル）を添加し、混合物を室温において一晩撹拌した。それを炭酸水素ナトリウムの氷冷溶液に注ぎ、産物をジクロロメタンに抽出し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を真空中で取り除き、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（勾配溶出：２０−１００％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製し、薄茶色の粘着性の液体（６０．５０ｇ、８６％）として、必要な化合物３０３を得た。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６４００ＭＨｚ）δ＝７．７６（ｄ、Ｊ−９．０３Ｈｚ、１Ｈ）、７．２５−７．３８（ｍ、５Ｈ）、５．２０（ｄ、Ｊ＝３．１７Ｈｚ、１Ｈ）、５．０５（ｓ、２Ｈ）、４．９５（ｄｄ、Ｊ＝３．４１、１１．２３Ｈｚ、１Ｈ）、４．４８（ｄ、Ｊ＝８．３０Ｈｚ、１Ｈ）、３．７０−４．２０（ｍ、４Ｈ）、３．３５−３．４５（ｍ、２Ｈ）、２．３３（ｔ、Ｊ＝７．３２Ｈｚ、２Ｈ）、２．０８（ｓ、３Ｈ）、１．９７（ｓ、３Ｈ）、１．８７（ｓ、３Ｈ）、１．７３（ｓ、３Ｈ）、１．５０−１．６３（ｍ、４Ｈ）。ＭＳ：Ｃ２６Ｈ３５ＮＯ１１に対する分子量計算値：５３７．２２；実測値：５６０．２１（Ｍ＋Ｎａ）。
３０４の調製：
化合物３０３（６０．００ｇ、１１１．６８ミリモル）を、メタノール／酢酸エチルの混合物において溶解し、アルゴンを用いて脱気した。Ｐｄ／Ｃ（６．００ｇ、１０ｗｔ％Ｄｅｇｕｓｓａ、湿式）を添加し、一晩、バルーン圧下で水素化した。セライトの小さなパッドを介してろ過し、メタノールを用いて洗浄し、高真空下で、一晩乾燥し、酸（４８．８５ｇ、９８％）を得た。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６４００ＭＨｚ）δ＝１１．９７（ｂｓ、１Ｈ）、７．７８（ｄ、Ｊ−９．２０Ｈｚ、１Ｈ）、５．２１（ｄ、Ｊ＝３．１６Ｈｚ、１Ｈ）、４．９６（ｄｄ、Ｊ＝３．４２、１１．３０Ｈｚ、１Ｈ）、４．４７（ｄ、Ｊ＝８．２６Ｈｚ、１Ｈ）、３．７３−４．２２（ｍ、４Ｈ）、３．３２−３．４５（ｍ、２Ｈ）、２．０９（ｓ、３Ｈ）、１．９８（ｓ、３Ｈ）、１．８７（ｓ、３Ｈ）、１．７５（ｓ、３Ｈ）、１．５１−１．６４（ｍ、４Ｈ）ＭＳ：Ｃ１９Ｈ２９ＮＯ１１に対する分子量計算値：４４７．１７；実測値：４６９．９（Ｍ＋Ｎａ）。酸（５ｇ、１１．１７ミリモル）、プロパルギルアミン（０．６９０ｇ、１２．２９ミリモル）、およびＨＢＴＵ（４．２３ｇ、１１．１７ミリモル）の一部を、ＤＭＦ（５０ｍＬ）において溶解した。ＤＩＥＡを反応混合物に添加し、反応混合物を一晩撹拌する。減圧下で溶媒を取り除き、残渣をジクロロメタンを用いて抽出し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を真空中で取り除き、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、産物３０４を得る。ＭＳ：Ｃ２２Ｈ３２ＮＯ１０に対する分子量計算値：４８４．２１。
３０５の調製：
化合物３０４（３．００ｇ、６．１９ミリモル）を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨの混合物（１：２、２０ｍＬ）において溶解し、ナトリウムメトキシド溶液（２０ｍＬ、ＭｅＯＨにおいて０．５Ｍ）をそれに添加し、混合物を一晩撹拌する。ＡｃＯＨを用いて反応混合物を中和し、減圧下で、溶媒を取り除く。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、必要な産物３０５を得る。ＭＳ：Ｃ１６Ｈ２６ＮＯ７に対する分子量計算値：３５８．３９。
３０７の調製：
化合物３０１（４２．３０ｇ、１２８．４３ミリモル）およびアジドエタノール３０６（２６ｇ、１９２．４５ミリモル）を、ジクロロエタン（３００ｍＬ）において溶解し、分子ふるい（５０ｇ）を溶液に添加し、３０分間撹拌した。ＴＭＳＯＴｆ（１４．２９ｇ、６４．２１ミリモル）を添加し、混合物を室温において一晩撹拌した。それを炭酸水素ナトリウムの氷冷溶液に注ぎ、産物をジクロロメタンに抽出し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を真空中で取り除き、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（勾配溶出：２０〜１００％酢酸エチル／ヘキサンに続いて５〜１０％メタノール／酢酸エチル）によって精製し、薄茶色の粘着性の液体（５９．２３ｇ、９１．００％）として必要な化合物３０７を得た。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６４００ＭＨｚ）δ＝７．７７（ｄ、Ｊ−９．２７Ｈｚ、１Ｈ）、５．２０（ｄ、Ｊ＝３．１５Ｈｚ、１Ｈ）、４．９７（ｄｄ、Ｊ＝３．３９、１１．３４Ｈｚ、１Ｈ）、４．５５（ｄ、Ｊ＝８．６４Ｈｚ、１Ｈ）、３．７２−４．２２（ｍ、５Ｈ）、３．３０−３．６３（ｍ、１１Ｈ）、２．０９（ｓ、３Ｈ）、１．９８（ｓ、３Ｈ）、１．８８（ｓ、３Ｈ）、１．７６（ｓ、３Ｈ）、ＭＳ：Ｃ２０Ｈ３２Ｎ４Ｏ１１：に対する分子量計算値：５０４．２１；実測値：５２７．１（Ｍ＋Ｎａ）。
３０８の調製：
化合物３０７（５．８５ｇ、１１．５９ミリモル）を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨの混合物（１：２、５０ｍＬ）において溶解し、ナトリウムメトキシド溶液（２０ｍＬ、ＭｅＯＨにおいて０．５Ｍ）をそれに添加し、混合物を一晩撹拌する。ＡｃＯＨを用いて反応混合物を中和し、減圧下で、溶媒を取り除いた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ、２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、必要な産物３０８を得た。ＭＳ：Ｃ１４Ｈ２６Ｎ４Ｏ８に対する分子量計算値：３７８．１８；実測値：４０１．１９（Ｍ＋Ｎａ）。
３１１の調製：
ＰＥＧ酸３１０（５．５０ｇ、２．９０８ミリモル）を、ＤＭＦ（５０ｍＬ）において溶解し、ＴＢＴＵ（１．２３ｇ、３．８３ミリモル）、ＨＯＢｔ（０．５２０ｇ、３．８３ミリモル）、およびＤＩＥＡ（３．２ｍＬ、５等量）を混合物に添加し、３〜４分間撹拌した。ＤＭＦにおける３０９の溶液（１．０２ｇ、１．２等量）を混合物に添加し、反応混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣを確認し、溶媒を減圧下で取り除いた。残渣をジクロロメタンにおいて溶解し、炭酸水素ナトリウム溶液（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を用いて洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を真空中で取り除き、（酢酸エチル、後に勾配溶出５〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭが続く）シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、残渣をオフホワイトの固形（３．３０ｇ、５６％）として産物３１１を得た。ＭＳ：Ｃ９０Ｈ１４７Ｎ１３Ｏ４１に対する分子量計算値：２０６５．９８；実測値：２０８９．０９（Ｍ＋Ｎａ）。
３１２の調製：
化合物３１１（０．９２ｇ、０．４４５ミリモル）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）によって溶解し、ナトリウムメトキシド溶液（１０ｍＬ、ＭｅＯＨにおいて０．５Ｍ）をそれに添加し、混合物を一晩撹拌した。反応をＴＬＣで監視し、混合物によってＣＭセファロース樹脂のカラムを通過した。ＭｅＯＨを用いて洗浄し、真空中で溶媒を取り除き、産物３１２（０．４２ｇ、５７％）を得た。ＭＳ：Ｃ７２Ｈ１２９Ｎ１３Ｏ３２に対する分子量計算値：１６８７．８９；実測値：１７１０．９０（Ｍ＋Ｎａ）。
３１３の調製：
化合物３１１（２．００ｇ、０．９６７ミリモル）をＴＨＦ（２０ｍＬ）において溶解し、ＰＰｈ３（０．３８０ｇ、１．４５ミリモル）を添加し、混合物を４８時間撹拌する。出発物質の完全消失を確かめるためにＴＬＣを確認する。水（０．１ｍＬ、５等量）を反応混合物に添加し、２４時間撹拌する。ＴＦＡ（０．１４０ｇ、１．２０ミリモル）およびトルエン（３０ｍＬ）を添加し、減圧下で濃縮する。残渣によってトルエン（２Ｘ３０ｍＬ）を用いて２回同時蒸発し、高真空下で乾燥する。したがって、追加の精製なしに同日に、得られた産物を次の反応に使用することができる。ＭＳ：Ｃ９０Ｈ１４９Ｎ１１Ｏ４１に対する分子量計算値：２０３９．９９。上記の反応の化合物およびプロピノン酸（０．０８１ｇ、１．２等量）をＤＭＦ（２０ｍＬ）において溶解する。ＨＢＴＵ（０．４４０ｇ、１．１６ミリモル）およびＤＩＥＡをそれに添加し、混合物を一晩撹拌する。溶媒を減圧下で取り除く。残渣をジクロロメタンにおいて溶解し、炭酸水素ナトリウム溶液、水を用いて洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥する。溶媒を真空中で取り除き、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、産物３１３を得る。
３１４の調製：
化合物３１１（１．００ｇ、０．４４７ミリモル）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）において溶解し、ナトリウムメトキシド溶液（１０ｍＬ、ＭｅＯＨにおける０．５Ｍ）をそれに添加し、混合物を一晩撹拌する。反応をＴＬＣにより監視し、混合物によってＣＭセファロース樹脂のカラムを通過する。ＭｅＯＨを用いて洗浄し、溶媒を真空中で取り除き、産物３１４を得る。
３１６の調製：
ガラクトーストリクロロアセトイミダート３１５（１０．００ｇ、１３．５３ミリモル）およびベンジルエステル３０２（３．９０ｇ、１４．８８ミリモル）を、トルエン（２Ｘ４０ｍＬ）を用いて２回同時蒸発し、高真空下で乾燥した。無水エーテル（５０ｍＬ）および分子ふるい（２０ｇ）を溶液に添加し、氷浴で冷却する。ＴＭＳＯＴｆ（０．３００ｇ、１．３４９ミリモル）を添加し、混合物を１５分間撹拌する。溶媒を取り除き、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（勾配溶出：２０〜６０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製し、必要な化合物３１６を得る。
３１７の調製：
化合物３１６（５．００ｇ、６．３５ミリモル）をＭｅＯＨに取り込み、Ｐｄ／Ｃを使用して、バルーン圧下で水素化し、酸を得る。粗酸およびプロパルギルアミン（０．３８４ｇ、６．９９ミリモル）およびＨＢＴＵ（２．４０ｇ、６．３５ミリモル）をＤＭＦ（５０ｍＬ）において溶解する。ＤＩＥＡを添加し、反応混合物を一晩撹拌する。溶媒を取り除き、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、必要な産物３１７を得る。
３１８の調製：
化合物３１７（２．００ｇ、２．７２ミリモル）を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨの混合物（１：２、５０ｍＬ）において溶解し、ナトリウムメトキシド溶液（２０ｍＬ、ＭｅＯＨにおいて０．５Ｍ）をそれに添加し、混合物を一晩撹拌する。ＡｃＯＨを用いて反応混合物を中和し、減圧下で、溶媒を取り除く。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ、２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、必要な産物３１８を得る。
３１９の調製：
ガラクトーストリクロロアセトイミダート３１５（１０．００ｇ、１３．５３ミリモル）およびアジドアルコール３０６（２．６０ｇ、１４．８８ミリモル）をトルエン（２Ｘ４０ｍＬ）を用いて２回同時蒸発し、高真空下で乾燥した。無水エーテル（５０ｍＬ）および分子ふるい（２０ｇ）を溶液に添加し、氷浴で冷却した。ＴＭＳＯＴｆ（０．３００ｇ、１．３４９ミリモル）を添加し、混合物を１５分間撹拌し、ＴＬＣを確認し、反応混合物を、ＴＥＡを用いて反応を停止した。溶媒を取り除き、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（勾配溶出：２０〜６０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製し、無色の液体（８．６２３ｇ、８５％）として必要な化合物３１９を得た。ＭＳ：Ｃ４０Ｈ３９Ｎ３Ｏ１２に対する分子量計算値：７５３．２５；実測値：７７６．３０（Ｍ＋Ｎａ）。
３２０の調製：
化合物３１９（４．１９ｇ、５．５５ミリモル）を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨの混合物（１：２、５０ｍＬ）において溶解し、ナトリウムメトキシド溶液（５５ｍＬ、ＭｅＯＨにおいて０．５Ｍ）をそれに添加し、混合物を一晩撹拌する。ＡｃＯＨを用いて反応混合物を中和し、減圧下で、溶媒を取り除いた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ、２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、無色の液体（１．８０ｇ、９６％）として必要な産物３２０を得た。ＭＳ：Ｃ１２Ｈ２３Ｎ３Ｏ８に対する分子量計算値：３３７．１５；実測値：３６０．１５（Ｍ＋Ｎａ）。
３２２の調製：
マンノーストリクロロアセトイミダート３２１（１５．２３ｇ、２０．５５ミリモル）および３０２（４．３６ｇ、１．０２等量）を、トルエンにおいて溶解し、２回、共沸混合物化した。残渣を高真空下で、一晩乾燥した。無水ジエチルエーテル（３０ｍＬ）および分子ふるい（１０ｇ）をそれに添加した。反応混合物を氷水浴において冷却した。ＴＭＳＯＴｆ（０．５ｍＬ、０．１等量）をそれに添加し、混合物を１０分間撹拌した。反応をＴＬＣで監視し、ＴＥＡを用いて反応を停止した。分子ふるいをろ過したものおよび溶媒を減圧下で取り除いた。残渣をクロマトグラフィー（ヘキサン、１５〜２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、無色の液体（１４．５２ｇ、９０％）として化合物３２２を得た。ＭＳ：Ｃ４６Ｈ４２Ｏ１２に対する計算値：７８６．２７、実測値：８０９．２５（（Ｍ＋Ｎａ）。
３２３の調製：
マンノースベンジルエステル（１４．３０ｇ、１８．１７ミリモル）を酢酸エチル（１００ｍＬ）において溶解し、２滴の酢酸をそれに添加した。脱気したＰｄ／Ｃ（１．５０ｇ、１０ｗｔ％Ｄｅｇｕｓｓａ湿式）を添加し、バルーン圧下で２４時間水素化した。反応をＴＬＣおよびＭＡＬＤＩで監視した。それをセライトの小さなパッドを介してろ過し、酢酸エチルを用いて洗浄した。溶媒を取り除き、残渣を高真空下で乾燥し、無色の油（１１．２０ｇ、９０％）として化合物を得た。ＭＳ：Ｃ３９Ｈ３６Ｏ１２に対する計算値：６９６．２２、実測値：７１９．１８（Ｍ＋Ｎａ）。粗酸（４．４０ｇ、６．３５ミリモル）およびプロパルギルアミン（０．３８４ｇ、６．９９ミリモル）およびＨＢＴＵ（２．４０ｇ、６．３５ミリモル）をＤＭＦ（５０ｍＬ）において溶解する。ＤＩＥＡを添加し、反応混合物を一晩撹拌する。溶媒を取り除き、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、必要な産物３２３を得る。
３２４の調製：
化合物３２３（２．００ｇ、２．７２ミリモル）を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨの混合物（１：２、５０ｍＬ）において溶解し、ナトリウムメトキシド溶液（２０ｍＬ、ＭｅＯＨにおいて０．５Ｍ）をそれに添加し、混合物を一晩撹拌する。ＡｃＯＨを用いて反応混合物を中和し、減圧下で、溶媒を取り除く。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、必要な産物３２４を得る。
３２５の調製：
マンノーストリクロロアセトイミダート３２１（１５．００ｇ、２０．２４ミリモル）およびアジドアルコール３０６（４．２５ｇ、１．２等量）をトルエンにおいて溶解し２回、共沸混合物化した。残渣を高真空下で、一晩乾燥した。無水ジエチルエーテル（３０ｍＬ）および分子ふるい（１０ｇ）を混合物に添加した。反応混合物を氷水浴において冷却した。ＴＭＳＯＴｆ（０．５ｍＬ、０．１等量）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。反応をＴＬＣで監視し、ＴＥＡを用いて反応を停止した。分子ふるいをろ過したものおよび溶媒を減圧下で取り除いた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、無色の液体（８．３６ｇ、５５％）として化合物３２５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ＝８．０５（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．１９−７．９２（ｍ、１８Ｈ）、６．００（ｔ、Ｊ＝１０．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．７２（ｄｄ、Ｊ＝３．２、１０．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．６２（ｄｄ、Ｊ＝２、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．２５（ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．５０−４．６５（ｍ、３Ｈ）、３．６０−３．９５（ｍ、１０Ｈ）、３．３６（ｔ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、２Ｈ）。ＭＳ：Ｃ４０Ｈ３９Ｎ３Ｏ１２に対する分子量計算値：７５３．２５；実測値：７７６．２３（Ｍ＋Ｎａ）。
３２６の調製：
化合物３１９（５．３０ｇ、７．０３ミリモル）を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨの混合物（１：２、５０ｍＬ）において溶解し、ナトリウムメトキシド溶液（７０ｍＬ、ＭｅＯＨにおいて０．５Ｍ）をそれに添加し、混合物を一晩撹拌する。ＡｃＯＨを用いて反応混合物を中和し、減圧下で、溶媒を取り除いた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ、２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、無色の液体（１．９８ｇ、８４％）として必要な産物３２０を得た。ＭＳ：Ｃ１２Ｈ２３Ｎ３Ｏ８に対する分子量計算値：３３７．１５；実測値：３６０．１５（Ｍ＋Ｎａ）。
３２９の調製：
ｍＰＥＧ２０００（２０．００ｇ、１０．００ミリモル）およびＴＥＡ（４．０８ｍＬ、３等量）を、ＤＣＭ（１００ｍＬ）において溶解し、氷浴で冷却したそれに対してＤＣＭ（２０ｍＬ）におけるトシルクロライドの溶液（３．００ｇ、１．４５等量）を滴加し、混合物を一晩撹拌した。ＤＣＭを用いて希釈し、水および飽和炭酸水素ナトリウム溶液を用いて洗浄した。硫酸ナトリウム上乾燥し、真空中で溶媒を取り除き、必要なトシレート３２８を得た。トシレートおよびＮａＮ３（２５ｇ）をＤＭＦに取り入れ、耐圧瓶において一晩１００℃で熱した。ＲＢフラスコへ移し、減圧下で溶媒を取り除いた。ＤＣＭを用いて倍散し、ＤＣＭを用いて洗浄した焼結漏斗を介してろ過した。粗産物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、白い粉末（１８．１０ｇ、８２％）として必要な産物を得た。
３３０の調製：
ｍＰＥＧ２０００３２７（２０．００ｇ、１０．００ミリモル）をＤＭＦ（１００ｍＬ）において溶解し、氷浴で冷却した。ＮａＨ（１．００ｇ、過剰、６０％）を添加し、混合物を３０分間撹拌した。臭化プロパルギル（３．００ｇ、１．５等量）およびＴＢＡＩ（２．００ｇ）を添加し、混合物を一晩撹拌した。氷水を用いて反応を停止し、減圧下で溶媒を取り除いた。ＤＣＭにおける残渣を溶解し、水を用いて洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。粗産物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、薄茶色の固形として必要な産物３３０（１８．２０ｇ、８１％）を得た。
４０２の調製：
Ｚアミノカプロン酸４０１（１．００ｇ、３．７６ミリモル）を、ＤＭＦ（５０ｍＬ）において溶解する。ＨＢＴＵ（１．４３ｇ、３．７６ミリモル）およびＤＩＥＡ（３．２６ｍＬ、５．００等量）をそれに添加し、混合物を数分撹拌する。５０ｍＬのＤＭＦにおいてマンノースアミン４００（７．４１ｇ、３．００ミリモル）を溶解し、それを反応混合物に添加し、４８時間撹拌する。溶媒を真空中で取り除き、残渣をＤＣＭにおいて溶解し、ＮａＨＣＯ３溶液および水を用いて洗浄する。無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を減圧下で取り除く。化合物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、必要な化合物４０２を得る。
４０３の調製：
メタノール（５０ｍＬ）に化合物４０２（３．００ｇ、１．１０ミリモル）を取り入れ、１ｍＬの酢酸を添加する。Ｐｄ／Ｃ（０．３００ｇ、１０ｗｔ％Ｄｅｇｕｓｓａ湿式）を使用して、バルーン圧下で水素化し、化合物４０３を得る。
４０４の調製：
化合物４０３（２．００ｇ、０．７７６ミリモル）を、ペプチドの共役状況下で、プロピノン酸と反応させ、化合物４０４を得る。
４０５の調製：
化合物４０４（１．００ｇ、０．３８０ミリモル）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）において溶解し、ナトリウムメトキシド溶液（１０ｍＬ、ＭｅＯＨにおける０．５Ｍ）をそれに添加し、混合物を一晩撹拌する。反応をＴＬＣにより監視し、混合物によってＣＭセファロース樹脂のカラムを通過する。ＭｅＯＨを用いて洗浄し、溶媒を真空中で取り除き、産物４０５を得る。
４０６の調製：
化合物４０３（２．００ｇ、０．７７６ミリモル）を、トリフリック無水物およびアジ化ナトリウムと反応させ、化合物４０６を得る。
４０７の調製：
化合物４０６（１．００ｇ、０．３８４ミリモル）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）において溶解し、ナトリウムメトキシド溶液（１０ｍＬ、ＭｅＯＨにおける０．５Ｍ）をそれに添加し、混合物を一晩撹拌する。反応をＴＬＣにより監視し、混合物によってＣＭセファロース樹脂のカラムを通過する。ＭｅＯＨを用いて洗浄し、溶媒を真空中で取り除き、産物４０７を得る。
４０９の調製：
Ｚアミノカプロン酸４０１（２．１９ｇ、８．２５ミリモル）を、ＤＭＦ（５０ｍＬ）において溶解した。ＨＢＴＵ（３．１３ｇ、８．２５ミリモル）およびＤＩＥＡ（７．１９ｍＬ、５．００等量）をそれに添加し、混合物を数分撹拌した。ＧａｌＮＡｃアミン４０８（１０．１０ｇ、５．５２ミリモル）をＤＭＦの５０ｍＬにおいて溶解し、反応混合物に対して添加し、４８時間撹拌した。ＴＬＣおよびＭＡＬＤＩを産物形成に対して確認した。溶媒を真空中で取り除き、残渣をＤＣＭにおいて溶解し、ＮａＨＣＯ３溶液および水を用いて洗浄した。無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を減圧下で取り除いた。残渣を（酢酸エチルを用いて溶出し、後に５〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭの勾配溶出が続く）シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、オフホワイトの固形（６．２０ｇ、５７％）として必要な化合物４０９を得る。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６４００ＭＨｚ）δ＝７．８９（ｔ、Ｊ＝５．１２Ｈｚ、３Ｈ）、７．８０（ｄ、Ｊ＝９．２７Ｈｚ、３Ｈ）、７．１５−７．４０（ｍ、７Ｈ）、５．２０（ｄ、Ｊ＝３．４１Ｈｚ、３Ｈ）、４．９８（ｓ、２Ｈ）、４．９５（ｄｄ、Ｊ＝３．４０、１１．３０Ｈｚ、３Ｈ）、４．５４（ｄ、Ｊ＝８．６４Ｈｚ、３Ｈ）、３．７２−４．１０（ｍ、１２Ｈ）、３．１０−３．６５（ｍ、５２Ｈ）、２．２８（ｔ、Ｊ＝６．２０Ｈｚ、６Ｈ）、２．０９（ｓ、９Ｈ）、１．９８（ｓ、９Ｈ）、１．８８（ｓ、９Ｈ）、１．７６（ｓ、９Ｈ）、１．０９−１．３０（ｍ、６Ｈ）。ＭＳ：Ｃ８７Ｈ１３６Ｎ８Ｏ４２に対する分子量計算値：１９６４．８８；実測値：１９８７．７５（Ｍ＋Ｎａ）。
４１０の調製：
化合物４０９（６．１０ｇ、３．１０ミリモル）をメタノール（５０ｍＬ）において溶解し、それに１ｍＬの酢酸を添加した。反応混合物を脱気し、Ｐｄ／Ｃ（０．７００ｇ、１０ｗｔ％Ｄｅｇｕｓｓａ湿式）を溶液に添加し、３６時間バルーン圧下で水素化した。反応混合物をセライトの小さなパッドを介してろ過し、ＭｅＯＨを用いて洗浄した。濾液へ、１．２５等量のＴＦＡおよびトルエン（５０ｍＬ）を添加し、溶媒を減圧下で取り除いた。残渣をトルエンを用いて２回同時蒸発し、オフホワイトの固形（６．１０ｇ、定量的）として必要な化合物４１０を得るため、高真空下で一晩乾燥した。この化合物をこれ以上精製なしに、次の反応のためにそれ自体で使用する。ＭＳ：Ｃ７９Ｈ１３０Ｎ８Ｏ４０に対する分子量計算値：１８３０．８４；実測値：１８５３．８１（Ｍ＋Ｎａ）。
４１１の調製：
化合物４１０（２．００ｇ、１．０９ミリモル）を、Ｔｆ２Ｏおよびアジ化ナトリウムと反応させ、化合物４１１を得る。
４１２の調製：
化合物４１１（１．００ｇ、０．５３９ミリモル）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）において溶解し、ナトリウムメトキシド溶液（１０ｍＬ、ＭｅＯＨにおける０．５Ｍ）をそれに添加し、混合物を一晩撹拌する。反応をＴＬＣにより監視し、混合物によってＣＭセファロース樹脂のカラムを通過する。ＭｅＯＨを用いて洗浄し、溶媒を真空中で取り除き、産物４１２を得る。
４１４の調製：
化合物４１３（３．３０ｇ、５．６５ミリモル）をＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃの混合物（６０ｍＬ、１：２）において溶解し、Ｐｄ／Ｃ（５００ｍｇ、Ｄｅｇｕｓｓａ湿式）を添加し、一晩バルーン圧下で水素化した。反応混合物を、セライトの小さなパッドを介してろ過し、溶媒を取り除き、必要な産物４１４を得る。粗産物を追加の精製なしに、次の反応のために使用した。ＭＳ：Ｃ１６Ｈ３３Ｎ３Ｏ３に対する分子量計算値：３１５．２５；実測値：３１６．２２（Ｍ＋Ｈ）。
４１６の調製：
ＧａｌＮＡｃ酸４１５（５．８１ｇ、１２．９９ミリモル）およびＨＢＴＵ（４．９７６ｇ、１３．０２ミリモル）をＤＭＦ（５０ｍＬ）において溶解し、ＤＩＥＡ（６．７９ｍＬ、５等量）をそれに添加し、混合物を数分間撹拌した。ＤＭＦにおいて化合物４１４の溶液をそれに添加し、一晩室温において撹拌した。溶媒を真空中で取り除き、残渣をＤＣＭにおいて溶解し、ＮａＨＣＯ３溶液および水を用いて洗浄した。無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を減圧下で取り除いた。残渣を（酢酸エチルを用いて溶出し、後に３〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭの勾配溶出が続く）シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、オフホワイトの固形（５．２５ｇ、７９％）として必要な化合物４１６を得た。ＭＳ：Ｃ５４Ｈ８７Ｎ５Ｏ２３に対する分子量計算値：１１７３．５８；実測値：１１９６．６０（Ｍ＋Ｎａ）。
４１７の調製：
化合物４１６（５．１５ｇ、４．４０ミリモル）をＤＣＭ（３０ｍＬ）において溶解し、ＴＦＡ（ＤＣＭの２０ｍＬにおける３０ｍＬ）をそれに添加し、２時間室温において撹拌した。ＴＬＣを確認し、溶媒を取り除いた。トルエンを用いて２回同時蒸発し、高真空下で乾燥した。粗産物を次の反応で使用した。ＭＳ：Ｃ５０Ｈ７９Ｎ５Ｏ２３に対する分子量計算値：１１１７．５２；実測値：１１４０．５５（Ｍ＋Ｎａ）。
４１９の調製：
ＨＢＴＵ媒介ペプチド共役を使用して化合物４１９を４１８および４１７から調製する。
４２０の調製：
化合物４１９（１．００ｇ、０．８０５ミリモル）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）において溶解し、ナトリウムメトキシド溶液（１０ｍＬ、ＭｅＯＨにおける０．５Ｍ）をそれに添加し、混合物を一晩撹拌する。反応をＴＬＣにより監視し、混合物によってＣＭセファロース樹脂のカラムを通過する。ＭｅＯＨを用いて洗浄し、溶媒を真空中で取り除き、産物４２０を得る。
４２２の調製：
ＨＢＴＵ媒介ペプチド共役を使用して化合物４２２を４２１および４１７から調製する。
４２３の調製：
化合物４２２（１．００ｇ、０．８６６ミリモル）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）において溶解し、ナトリウムメトキシド溶液（１０ｍＬ、ＭｅＯＨにおける０．５Ｍ）をそれに添加し、混合物を一晩撹拌する。反応をＴＬＣにより監視し、混合物によってＣＭセファロース樹脂のカラムを通過する。ＭｅＯＨを用いて洗浄し、溶媒を真空中で取り除き、産物４２３を得る。
実施例８．クリック化学に対する葉酸の構成要素
葉酸共役体を含有するアジド官能基を合成するために、以下の戦略を使用した。スキーム１０に示される通り、市販のジアミン３３１から開始し、アジドアミンテザー３３４を合成した。
アミン３３２の合成：
ジオキサン（１Ｌ）における（Ｂｏｃ）２Ｏ（６６ｇ、０．３０３モル）の溶液を、ジオキサン（１Ｌ）におけるジアミンの冷却した（０℃）溶液（４００ｇ、１．８２モル）に４時間以上液滴の様式で添加し、混合物を室温において一晩撹拌した。水系後処理後、カラムクロマトグラフィーによって純粋なモノＢｏｃアミン３３２（８３ｇ、８６％）を得た。ＭＳ：Ｃ１５Ｈ３２Ｎ２Ｏ５に対する分子量計算値：３２０．４２；実測値：３２１．４１（ＭＨ＋）。
アジ化物３３３の合成：
トリフリックアジド原液をＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ４７（２００６）２３８２−２３８５において報告される通りに調製した。アミン（０．９６ｇ、３ミリモル）、炭酸水素ナトリウム（０．８５ｍｇ、１０ミリモル）、および硫酸銅（ＩＩ）五水和物（２２ｍｇ、０．１ミリモル）を水（３ｍＬ）において溶解した。トリフリックアジド原液（５ｍＬ）を添加し、次にメタノール（２０ｍＬ）を追加し、均一系を得た。ＴＬＣおよびＭＳが出発アミンの完全消失を示した後、青い混合物を３０分間撹拌した。反応混合物を回転蒸発器中に濃縮し、シリカゲル（溶出剤：ジクロロメタンメタノール）上で、残渣をクロマトグラフィーによって精製し、油として純粋なアジ化物３３３（１ｇ、９６％）を得た。ＭＳ：Ｃ１５Ｈ３０Ｎ４Ｏ５に対する分子量計算値：３４６．４２；実測値：３４７．４１（ＭＨ＋）。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝４．６８（ｂｓ、１Ｈ）、３．４０−３．３０（ｍ、１２Ｈ）、３．１６（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．００−２．９５（ｍ、２Ｈ）、１．６８−１．５４（ｍ、４Ｈ）、１．０４（ｓ、９Ｈ）。
３３４の合成：
アジ化物３３３（１ｇ、２．８８ミリモル）をエタノール（１０ｍＬ）において溶解し、エーテルにおけるＨＣｌの２Ｍ溶液をこれに添加し、混合物を室温において一晩撹拌した。ＭＳは、出発物質の不在を示した。反応混合物を濃縮した結果、得られた油を、追加の精製なしに次の反応のために、それ自体で使用した。ＭＳ：Ｃ１０Ｈ２３ＣｌＮ４Ｏ３に対する分子量計算値：２４６．１７；実測値：２４７．１７（ＭＨ＋）。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６４００ＭＨｚ）δ＝８．９６（ｂｓ、１Ｈ）、７．９２（ｂｓ、２Ｈ）、３．５２−３．４０（ｍ、１２Ｈ）、３．３７（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．８５−２．７７（ｍ、２Ｈ）、１．８１−１．７０（ｍ、４Ｈ）。
市販のプテロイン酸３３５を、ｔ−ブチルジフェニルシリル基を用いて一過性に保護し、無水イソ酪酸を用いて処理し、次に酸性後処理を行い、グルタミン酸のメチルｔブチルエステルとの共役際に、完全保護葉酸３３８を得た環外アミン保護プテロイン酸３３６を得た。ＴＦＡとｔブチルエステルとの加水分解によって、アジドアミンテザー３３４と共役した酸３３９を得て、油として共役の産物３４０を得た。水酸化リチウム、その後にメチルアミンを用いたこの化合物の処理によって、アジド化合物３４１を得た。
３３６の合成：
プテロイン酸の懸濁液（２５ｇ、６１．２ミリモル）および無水ピリジン（４００ｍＬ）におけるＤＭＡＰ（１１．２５ｇ、９２ミリモル）へ、ＴＢＤＰＳクロライド（４２ｇ、１５３ミリモル）を添加した。無水イソ酪酸（１４．６ｇ、９２ミリモル）を添加し混合物を少し温めた後、反応混合物を室温において３０時間撹拌した。追加の６０ｍＬのピリジンも添加し、反応混合物を室温において一晩撹拌した。ピリジンおよび他の揮発物質を回転蒸発器中に濃縮した後、反応混合物は均一になった。残渣を、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）および酢酸（１００ｍＬ）および水（５００ｍＬ）を用いて２４時間撹拌した。したがって、得られたスラリーをろ過し、残渣を水（５００ｍＬ）、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）を用いて洗浄し、乾燥し、白い固形（２６．１ｇ、８９％）として純粋な産物を得た。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ＝８．８７（ｓ、１Ｈ）、７．９５（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．６７（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ）、５．２１（ｓ、２Ｈ）、２．７９−２．７４（ｍ、１Ｈ）、１．１２（ｄ、Ｊ＝６．８３Ｈｚ、６Ｈ）、１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１８０．７２、１６６．４９、１５９．２５、１４９．８７、１４７．６８、１４２．６９、１３６．３４、１３４．４５、１３０．５４、１２９．１６、１２８．８６、１２７．４９、３４．９６、３３．０９、２６．５２、１８．８８、１８．７４。１９Ｆ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ−・・・６・４．３２．ＭＳ。Ｃ２０Ｈ１７Ｆ３Ｎ６Ｏ５に対する分子量、計算値：４７８．１２、実測値：４７９．１２（ＭＨ＋）。
３３８の合成：
代表的な手順において、プテロイン酸前駆物質３３６（２．４ｇ、５ミリモル）を、無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）において溶解し、ＨＢＴＵ（１．９ｇ、１等量）後にＤＩＥＡ（１ｍＬ、５等量）を添加し、２０分間撹拌した。ＤＭＦ（６ｍＬ）における溶液として、アミンハイドロクロライド３３７（１．２ｇ、１等量）を、この反応混合物に添加した。反応をＴＬＣで監視した（８％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＰＭＡ染色）。反応混合物のＴＬＣは、反応の完了を示した。反応混合物を、活発に撹拌しながら氷にゆっくり注いだ。沈殿産物をろ過し、白い固形として産物３３８（産生量＝２．８５ｇ、８６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ＝１２．３３（ｓ、１Ｈ）、１１．９４（ｓ、１Ｈ）、８．８８（ｓ、１Ｈ）、８．８２（ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９０（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．６８（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、５．２２（ｓ、２Ｈ）、４．４６−４．４０（ｍ、１Ｈ）、３．６２（ｓ、３Ｈ）、２．８６−２．７３（ｍ、１Ｈ）、２．３２（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）２．０５−１．９０（ｍ、２Ｈ）、１．３５（ｍ、９Ｈ）、１．１２（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１８０．７５、１７２．１３、１７１．４５、１６５．６４、１５９．１０、１５４．８０、１４９．９７、１４９．７９、１４７．７２、１４１．７５、１３４．１５、１３０．５３、１２８．７０、１２８．４９、１１７．５０、１１４．６４、７９．７９、５１．９６、５１．９１、３４．９６、３１．２２、２７．６８、２５．７１、１８．７２。ＭＳ．Ｃ３０Ｈ３４Ｆ３Ｎ７Ｏ８に対する分子量、計算値：６７７．６３、実測値：６７６．７２（Ｍ−Ｈ−）。
３３９の合成：
エステル３３８（２ｇ、２．９ミリモル）を、ジクロロメタンにおける２０ｍＬの５０％ＴＦＡにおいて溶解し、ＴＬＣが出発エステルの完全消失を示した後、溶液を室温において３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２：ヘキサン（２：３）から結晶化し、結晶化した産物をろ過し、乾燥し、オフホワイトの粉末として純粋な産物３３９（１．７６ｇ、９６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ＝１２．３２（ｂｓ、１Ｈ）、１１．９４（ｓ、１Ｈ）、８．８８（ｓ、１Ｈ）、８．８４（ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．９０（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．６９（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ）、５．２２（ｓ、２Ｈ）、４．４５−４．４１（ｍ、１Ｈ）、３．６２（ｓ、３Ｈ）、２．７８−２．７５（ｍ、１Ｈ）、２．３５（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）２．０７−１．９２（ｍ、２Ｈ）、１．１２（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１８０．７７、１７３．７０、１７２．１９、１６５．７０、１５９．２１、１５５．５４、１４９．９３、１４９．８４、１４７．７５、１４１．７８、１３４．１８、１３０．５３、１２８．７１、１２８．４９、１１７．５１、１１４．６４、５３．９８、５２．０６、５１．９３、３４．９７、３０．１１、２５．６８、１８．７３。ＭＳ。Ｃ２６Ｈ２６Ｆ３Ｎ７Ｏ８に対する分子量、計算値：６２１．１８、実測値：６２０．１８（Ｍ−Ｈ−）。
３４０の合成：
３３８の合成で使用した同様の手順を使用したアミン３３４（０．６ｇ）と酸３３９（１．２ｇ）との共役によって、薄黄色の泡として共役アジ化物３４０（１．６８ｇ、９３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ＝１２．３４（ｓ、１Ｈ）、１１．９５（ｓ、１Ｈ）、８．８９（ｓ、２Ｈ）、７．９２（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．８１（ｍ、１Ｈ）、７．７０（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、５．２２（ｓ、２Ｈ）、４．４０−４．３４（ｍ、１Ｈ）、３．６２（ｓ、３Ｈ）、３．５０−３．３１（ｍ、１５Ｈ）、３．０９−３．００（ｍ、２Ｈ）、２．８０−２．７２（ｍ、１Ｈ）、２．２０（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）２．１０−１．８９（ｍ、２Ｈ）、１．７６−１．５４（ｍ、４Ｈ）、１．１２（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、６Ｈ）。ＭＳ。Ｃ３６Ｈ４６Ｆ３Ｎ１１Ｏ１０に対する分子量、計算値：８４９．８１、実測値：８５０．２（ＭＨ＋）。
３４１の合成：
アジ化物３４０（１ｇ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）において溶解し、水酸化リチウムの水溶液（２ｍＬの水において１００ｍｇ）を添加し、ＭＳがＳＭの完全消失を示した後、溶液を室温において４時間撹拌した。反応混合物をｐＨ５に酢酸を使用して酸性化し、ＲＭを酢酸エチル（１００ｍＬ）を用いて希釈した。沈殿した産物をろ過し、水および酢酸エチルを用いて洗浄し、真空中で４０℃で一晩乾燥し、オレンジ色の固形として純粋なアジ化物３４１（０．４５５ｇ５５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ＝８．５９（ｓ、１Ｈ）、７．８５（ｂｓ、１Ｈ）、７．７２（ｂｓ、１Ｈ）、７．５６（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、６．８８（ｂｓ、１Ｈ）、６．６５（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、４．４５（ｓ、２Ｈ）、４．００−４．０２（ｍ、１Ｈ）、３．５０−３．３３（ｍ、１４Ｈ）、３．０４−３．００（ｍ、２Ｈ）、２．０７−１．８３（ｍ、４Ｈ）、１．７６−１．５４（ｍ、４Ｈ）。ＭＳ．Ｃ２９Ｈ３９Ｎ１１Ｏ８に対する分子量、計算値：６６９．６９、実測値：６６８．２（Ｍ−Ｈ−）。
別の実施形態では、以下の通りに合成する葉酸を含有したアルキンを合成した。この場合、保護プテロイン酸３３５を、保護リジン３４２と共役し、Ｃｂｚ脱保護上にアミン３４４を得た共役産物３４３を得た。酸３５０とアミン３４４との共役によって、精製および脱保護によって以下に記載された通り産物３４６を得た後、共役産物３４５を得た。
３４３の合成：
３３８の合成のために使用した同様の手順を使用して、リジン誘導体３４２と酸３３５との共役によって、９５％産生量において白い固形として共役産物３４３を得た。
３４４の合成：
Ｐｄ／Ｃを用いた水素化における化合物３４３において、黄色い固形として脱保護アミン３４４を得た。
３４５の合成：
３３８の合成のために使用した手順を使用して、酸３５０とアミン３４４との共役によって、高い産生量で産物３４５を得た。
３４６の合成：
保護基の脱保護を、完全脱保護アルキン３４６を単離するために、３４１の合成のために記載される同様の手順を使用して達成する。
別の実施形態において、葉酸共役したオリゴ構成要素を以下の通りに合成する。構成要素３６２の合成を１１５と同様の手順を使用して実行し、アミダイトの合成を１２１の合成のために記載した通りに実行する。
実施例９．クリックケミストリーに対する脂質構成要素
以下のアセチリンＣＰＧ支持体およびホスホラミダイトを通常の方法で調製した。
化合物３５２の調製
ＤＣＭ（３００ｍＬ）における化合物３５１（８ｇ、１５ミリモル）の溶液を、ヒューニッヒ塩基（２．５等量）、３５０（１．１等量）、およびＨＢＴＵ（１．０５等量）を用いて無事処理した。溶液を室温において一晩撹拌した。水系後処理、そしてカラムクロマトグラフィーによって純粋な化合物３５２を得た。産生量７．３ｇ、７８％。
化合物３５７の調製
化合物３５７を、化合物３５２に対して記載したものと類似した手順を使用して調製した。
化合物３５４の調製
化合物３５４を、化合物３５８に対して記載したものと類似した手順を使用して調製した。産生量５．７ｇ、８４％。
化合物３５８の調製
ヒューニッヒ塩基（２等量）の溶液およびＤＣＭ（５０ｍＬ）における化合物３５７（５．０ｇ、９．７ミリモルをアミダイト試薬（１．５等量）を用いて処理した。１０分間撹拌した後、ＴＬＣは完全反応を示した。水系後処理後、カラムクロマトグラフィーによって、純粋な化合物３５８（６．１ｇ、８８％）を得た。
化合物３５９の調製
ＤＣＭ（１５０ｍＬ）における化合物３５７（２．０７ｇ、４．０３ミリモル）の溶液をＤＭＡＰ（３等量）、そして無水コハク酸（２等量）を用いて処理し、室温において一晩撹拌した。カラムクロマトグラフィーによって、＋ＨＮＥｔ３塩として中間コハク酸（２．５ｇ、８７％）を得た。ＤＭＦ（２００ｍＬ）におけるこの中間体（２．４９ｇ、４．０７ミリモル）の溶液を、ヒューニッヒ塩基（５等量）、ＨＢＴＵ（１等量）、その後５００Å、１４０μモル／ｇＣＰＧ−ＮＨ２（２９．１ｇ、１等量）を用いて無事に処理した。１時間振とうした後、支持体をろ過によって採取した後、１時間振とうすることによって、Ａｃ２Ｏ／ｐｙ（４：１、２００ｍＬ）を用いてキャップした。ろ過による採取、および真空中での乾燥後、２２．４ｇの３５９を得た。負荷は、９０μモル／ｇと計算された。
化合物３５５の調製
化合物３５４を、化合物３５９に対して記載したものと類似した手順を使用して調製した。負荷９１μモル／ｇを含む２２．４ｇを得た。
化合物３６１の調製
化合物３６１を、化合物３５２に対して記載したものと類似した手順を使用して調製した。
化合物３６８の調製
スペルミン３６６（６．０ｇ、３０ミリモル）をＭｅＯＨ（３５０ｍＬ）において溶解し、−７８℃で冷却し、トリフルオロ酢酸エチル（４．１ｍＬ、３５ミリモル）を添加した。溶液を室温に温め、１時間撹拌し、ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）におけるＢｏｃ２Ｏ（３０．５ｇ、４１０ミリモル）の溶液を粗中間体３６７に滴加した。室温において１６時間後、混合物を水性ＮａＯＨの追加によって加水分解した。ＥＡへの抽出後、カラムクロマトグラフィーによって純粋な化合物３（５．７ｇ、３８％）を得た。
実施例１０．クリックケミストリーに対する糖脂質構成要素
５０１を得るため、アセチレン単位を、ペプチド連鎖を通してリソコール酸誘導体５００と共役した。加水分解後、ＧａｌＮＡｃ単位を５０２と共役し、５０３を得る。
化合物５０１：
ＤＭＦ（５０ｍＬ）における５−ヘキシン酸（９０７ｍｇ、８．０９ミリモル）の溶液へＨＢＴＵ（３．０７ｇ、８．０９ミリモル）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（６．７１ｍＬ、３８．５ミリモル）を添加した。５分後、化合物５００（３．０ｇ、７．７ミリモル）を溶液に添加した。反応混合物を室温において１４時間撹拌した。Ｅｔ２Ｏ（３００ｍＬ）およびＮａＨＣＯ３水溶液（１５０ｍＬ）を用いて抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝２：１、Ｒｆ＝０．３７）による精製によって、化合物５０１（３．６３ｇ、７．５０ミリモル、９８％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ７．７０（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．９５−３．９７（ｍ、１Ｈ）、３．５７（ｓ、３Ｈ）、２．７８（ｔ、Ｊ＝２．６Ｈｚ、１Ｈ）、０．８６−２．３４（ｍ、４０Ｈ）、０．６１（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）δ・１７３．６、１７０．７、８４．１、７１．２、５５．９、５５．４、５１．１、４４．２、４２．２、３９．１、３６．３、３５．１、３４．７、３４．５、３４．１、３０．５、３０．３、２７．６、２６．３、２５．７、２４．５、２４．４、２３．７、２３．４、２０．６、１８．０、１７．４。Ｃ３１Ｈ５０ＮＯ３（Ｍ＋Ｈ）＋に対する分子量、計算値４８４．３８、実測値４８４．３。
市販のアジ化物単位５０４を、リソコール酸誘導体５００と共役し、５０５を得た。加水分解後、５０６によってＧａｌＮＡｃ単位と共役し、アジド基５０７を含有する糖脂質分子を得るであろう。
オレイル−リソコール酸アセチレン誘導体５０９を、プロパルギルアミンを使用して標準ペプチド共役によって５０８から調製するであろう。市販のジアミンを保護し、対応するアジド誘導体５１２に変換するであろう。オレイル−リソコール酸アジ化物誘導体５１３を精製するために、アジ化物を５０８と共役するであろう。
別のオレイル−リソコール酸誘導体５１４を、プロパルギルアミンおよびアジド化合物５１２を用いて機能し、５１５および５１６をそれぞれ得るであろう。
リソコール酸エステル５１７を、化合物５１８を生成するために、プロパルギルアミンと共役した。カルバミン酸結合を通してアジド化合物５１２と５１７との結合し、５１９を得る。
化合物５１８：
化合物５１７のヒドロキシル基の活性化を、ＣＨ２Ｃｌ２においてＮ，Ｎ′−炭酸ジサクシンイミジルおよびトリエチルアミンを使用して実施した。水系後処理後、粗物質（３．０３ｇ、５．８８ミリモル）をＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）において溶解した。その後、トリエチルアミン（１．６４ｍＬ、１１．７６ミリモル）およびプロパルギルアミン（０．５２４ｍＬ、７．６４ミリモル）を溶液に添加した。反応混合物を室温において１４時間撹拌した。水系後処理およびカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝５：１〜２：１）による精製によって、化合物５１８（２．２５ｇ、４．７７ミリモル、８１％）を得た。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ７．４４（ｔ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４３−４．５１（ｍ、１Ｈ）、３．７３−３．７５（ｍ、２Ｈ）、３．５７（ｓ、３Ｈ）、３．０８（ｔ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、２．１６−２．３６（ｍ、２Ｈ）、０．８６−１．９３（ｍ、３２Ｈ）、０．６１（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）δ・１７３．６、１５５．５、８１．５、７３．６、７２．７、５５．９、５５．４、５１．１、４２．２、４１．２、３９．９、３５．３、３４．７、３４．５、３４．１、３２．３、３０．５、３０．３、２９．６、２７．６、２６．６、２６．５、２５．９、２３．７、２３．０、２０．３、１８．０、１１．８。Ｃ２９Ｈ４５ＮＮａＯ４（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値４９４．３２、実測値４９４．２。
オレイル−リソコール酸ＧａｌＮＡｃ構成要素を、スキーム１９によって合成するであろう。化合物５２３を化合物５０８から調製した（Ｒｅｎｓｅｎ，Ｐ．Ｃ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００４，４７，５７９８−５８０８）。簡潔に、エチルイミノジアセテートと５０８との標準ペプチド共役によって５２０を得た。エステル加水分解によって対応する二酸５２１を得た。二酸を、アンヒドロ中間体５２２を通して、ＧａｌＮＡｃと共役し、５２３を得た。５２３をプロパルギルアミンおよびアジド化合物５１２を用いて機能し、５２４および５２５をそれぞれ得るであろう。
化合物５２０の調製：
化合物５０８（１０．５ｇ、１６．４ミリモル、Ｒｅｎｓｅｎ，Ｐ．Ｃ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００４，４７，５７９８−５８０８）およびＣＨ２Ｃｌ２（１７０ｍＬ）におけるＨＢＴＵ（６．５４ｇ、１７．２ミリモル）の溶液をｉＰｒ２ＮＥｔ（１４．３ｍＬ、８２．１ミリモル）およびジエチルイミノジアセテート（３．２６ｇ、１７．２ミリモル）を用いて無事に処理し、６９時間室温において撹拌することができた。水系後処理後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、Ｒｆ＝０．４７）によって化合物５２０を得た。
産生量：１１．１ｇ、８３％。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ５．６６（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．３３−５．３６（ｍ、２Ｈ）、４．１４−４．２６（ｍ、９Ｈ）、０．８６−２．３８（ｍ、７１Ｈ）、０．６４（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ１７４．０、１７２．１、１６９．４、１６９．０、１２９．９、１２９．７、６１．６、６１．２、６０．８、５６．４、５６．１、５０．２、４７．９、４４．９、４２．７、４０．１、３９．７、３８．１、３７．１、３５．６、３５．３、３５．０、３１．９、３１．４、３０．９、３０．６、２９．７、２９．６７、２９．６０、２９．５、２９．３、２９．２４、２９．２２、２９．１、２８．１、２７．２、２７．１、２６．７、２６．１、２５．９、２４．８、２４．１、２２．６、２１．０、１８．４、１４．１８、１４．１６、１４．１１、１４．０９、１２．０。Ｃ５０Ｈ８７Ｎ２Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋に対する分子量、計算値８１１．６６、実測値８１１．６。
化合物５２１の調製：
化合物５２０（６．０５ｇ、７．４６ミリモル）を、ＴＨＦ（１１０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２２ｍＬ）において水酸化リチウム一水和物（１．２５ｇ、２９．８ミリモル）を用いて処理した。４時間後、７０ｍＬのアンバーライトＩＲ−１２０（ｐｌｕｓ）イオン交換樹脂を添加し、その後１０分間撹拌した。得られた透明な溶液をろ過し、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏおよび蒸発を用いて洗浄した。トルエンを用いた同時蒸発によって、白い固形として化合物５２１を得た。
産生量：４．８１ｇ、８５％。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ５．９９（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．３２−５．３６（ｍ、２Ｈ）、４．１３−４．２４（ｍ、５Ｈ）、０．８６−２．３７（ｍ、６５Ｈ）、０．６４（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ１７５．３、１７３．７、１７３．０、１７１．５、１３０．０、１２９．７、１０７．９、６７．７、５６．４、５５．９、４５．６、４２．７、４０．１、３９．８、３８．１、３６．９、３５．６、３５．３、３５．０、３１．９、３０．９、３０．４、２９．８、２９．７５、２９．７０、２９．６、２９．５、２９．４、２９．３、２９．２、２９．１、２８．２、２７．３、２７．２、２６．７、２６．１、２６．０、２５．９、２４．２、２４．１、２３．９、２２．７、２１．０、１８．４、１４．１、１２．０。Ｃ４６Ｈ７７Ｎ２Ｏ６（Ｍ−Ｈ）に対する分子量、計算値７５３．５８、実測値７５３．５。
化合物５２３の調製：
ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）における化合物５２１（５８３ｍｇ、０．７７２ミリモル）の溶液に、室温において、ＣＨ２Ｃｌ２（０．７７２ｍＬ、０．７７２ミリモル）の１Ｍ ＤＣＣ溶液を、添加し、反応混合物を中間体５２２を形成するため、１．５時間撹拌した。そして、化合物５（１．５０ｇ、０．７７２ミリモル）およびＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）におけるＥｔ３Ｎ（０．３７７ｍＬ、２．７０ミリモル）の溶液を添加した。反応混合物を一晩撹拌した。化合物５２３を産生するために、粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％Ｅｔ３Ｎを含むＣＨ２Ｃｌ２における５％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．２４）によって精製した。産生量：１．６２ｇ、トリエチルアンモニウム塩として７９％。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ５．６８（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．２９−５．３４（ｍ、５Ｈ）、５．１５−５．１８（ｍ、３Ｈ）、４．７７−４．７９（ｍ、３Ｈ）、３．４１−４．１６（ｍ、５９Ｈ）、２．９３−３．２４（ｍ、６Ｈ）、０．８５−２．５６（ｍ、１１７Ｈ）、０．６１（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ１７４．９、１７３．５、１７２．２、１７１．６、１７０．８、１７０．４３、１７０．３６、１２９．９、１２９．７、１０１．６３、１０１．５８、７０．６３、７０．６０、７０．５、７０．３、６９．８、６９．６９．２９、６９．２６、６９．２２、６９．１、６８．７５、６８．６７、６７．３、６６．８０、６６．７５、６２．９、６１．６、５９．６、５６．４３、５６．３７、５６．１、５６．０、５３．４、５２．７、５０．６３、５０．５６、４５．６、４４．９、４２．７、４０．１１、４０．０７、４０．０５、３９．８、３９．７、３９．３０、３９．２７、３９．１、３８．１、３７．１、３６．５、３５．６、３５．４４、３５．３８、３５．０、３１．９、３１．４、３０．６、２９．７２、２９．６７、２９．５、２９．３、２９．２、２９．１、２８．２、２７．２、２７．１、２６．７、２６．１、２５．９、２５．３、２４．８、２４．１５、２４．１１、２３．２、２２．６、２１．０、２０．９、２０．７、１８．５、１４．１、１２．０、８．５、７．７。Ｃ１２５Ｈ２０５Ｎ１０Ｏ４５Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ）＋に対するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ計算値：２５８９．４０、実測値：２５８８．７６。
クリックケミストリーに対するプソイドウリジン構成要素
プソイドウリジンにおけるＮ１を、メチルアクリレートを用いてアルキル化し、５２６を得た。このエステルを加水分解し、対応する酸誘導体５２７を得た。プロパルギルアミンおよびアジド化合物を用いた５２７の標準ペプチド共役は、クリックケミストリーを通して、共役に対してそれぞれ５２８および５２９を得るであろう。
化合物５２６：
１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ８．５、７８０ｍＬ）およびＥｔＯＨ（９４０ｍＬ）におけるプソイドウリジン（２０ｇ、８１．９ミリモル）の溶液に、メチルアクリレートを滴加した。反応混合物を一晩撹拌した。１６時間後、ＴＬＣは完全反応を示した。溶媒を取り除き、真空中で乾燥し、白い泡を得た。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２における１０％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．２３）によって精製し、５２６（２６．６ｇ、８０．５ミリモル、９８％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ４、４００ＭＨｚ）δ７．７７（ｄ、Ｊ＝０．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．５８（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５（ｔ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．０５（ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．９８−４．０２（ｍ、２Ｈ）、３．９１−３．９４（ｍ、１Ｈ）、３．８０（ｄｄ、Ｊ＝１２．０Ｈｚ、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、３．６７（ｓ、３Ｈ）、３．６６（ｄｄ、Ｊ＝１２．０Ｈｚ、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、２．７３−２．７７（ｍ、２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ１７３．１、１６５．４、１５２．５、１４５．８、１１２．９、８５．６、８１．５、７５．６、７２．６、６３．３、５２．５、４６．２、３３．７。Ｃ１３Ｈ１９Ｎ２Ｏ８（Ｍ＋Ｈ）＋に対する分子量、計算値３３０．１１、実測値３３１．０。
化合物５２７：
ＴＨＦ（１００ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２０ｍＬ）における化合物５２６（５．００ｇ、１５．１ミリモル）の溶液に、水酸化リチウム一水和物（１．０３ｇ、２５．５ミリモル）を添加した。反応混合物を一晩撹拌した。追加の水酸化リチウム一水和物（５００ｍｇ、１１．９ミリモル）を添加した。２時間後、反応混合物をアンバーライトＩＲ−１２０（ｐｌｕｓ）イオン交換樹脂を用いて処理した。樹脂をろ過し、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏを用いて洗浄した。濾液を蒸発し、白い固形（４．７８ｇ、定量的）として化合物５２７を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ１１．３４（ｓ、１Ｈ）、７．７５（ｓ、１Ｈ）、４．９２−４．９３（ｍ、１Ｈ）、４．７０−４．７２（ｍ、１Ｈ）、４．４５（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．８０−３．９３（ｍ、４Ｈ）、３．６８−３．７２（ｍ、１Ｈ）、３．６１（ｄｄ、Ｊ＝１２．０Ｈｚ、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．４７（ｄｄ、Ｊ＝１２．０Ｈｚ、４．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．１７（ｄ、Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、２．５９（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）δ１７２．１、１６３．０、１５０．４、１４３．６、１１１．４、８３．２、７９．０、７３．７、７０．４、６１．３、４４．１、３２．７。Ｃ１２Ｈ１５Ｎ２Ｏ８（Ｍ−Ｈ）−に対する分子量、計算値：３１５．０８、実測値：３１５．１。
実施例１１．オリゴヌクレオチドとの共役のためのスペルミンアジドの合成
クリックケミストリーを使用した生体結合体化のため、アジ化物含有スペルミン誘導体を合成した。
化合物５３１：
アセトニトリル（８０ｍＬ）におけるアジ化ナトリウム（４．３６ｇ、６７ミリモル）の懸濁液を、氷浴において冷却した。トリフルオロメタンスルホン酸無水物（１５．７ｇ、９．４ｍＬ、５５．６ミリモル）を、１０分間以上滴下漏斗を使用して混合物へ、滴加した。反応を氷浴において２時間実行した後、反応混合物を、沈殿物を取り除くためにろ過した。沈殿を２０ｍＬのアセトニトリルを用いて洗浄した。トリフリックアジドを含有した混合アセトニトリル溶液を、次のアジド移動反応のために直接使用した。
スペルミン（５３０、１１．２５ｇ、５５．６ミリモル）を、アセトニトリル（５０ｍＬ）において溶解した。その後、硫酸銅五水和物（１３９ｍｇ、０．５５６ミリモル）およびトリエチルアミン（１５．５ｍＬ、１１１．２ミリモル）を撹拌しながら、溶液に添加した。混合物を氷浴において冷却し、その後上記の調製したトリフリックアジド溶液を、混合物へゆっくり添加した。反応混合物を室温まで温めることを可能にし、一晩実行した。二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（６０．７ｇ、２７８ミリモル）をゆっくり溶液に添加し、反応混合物を２時間撹拌した。蒸発後、粗製物をＥｔＯＡｃおよびＨ２Ｏを用いて抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝２：１、Ｒｆ＝０．４６）によって精製し、５３１（１３．１２ｇ、２４．８ミリモル、４５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ６．７７（ｂｒｓ、１Ｈ）、３．３０−３．３４（ｍ、２Ｈ）、３．１１−３．１９（ｍ、８Ｈ）、２．８６−２．９０（ｍ、２Ｈ）、１．７１−１．７２（ｍ、２Ｈ）、１．５４−１．５６（ｍ、２Ｈ）、１．３７−１．３９（ｍ、２９Ｈ）。Ｃ２５Ｈ４８Ｎ６ＮａＯ６（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値５５１．３５、実測値５５１．２。
化合物５３１ｂ：
ＴＨＦ（２０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１ｍＬ）における化合物５３１（１．５ｇ、２．８４ミリモル）の溶液へ、トリフェニルホスフィン（１．４９ｇ、５．６８ミリモル）を添加した。反応混合物を一晩室温において撹拌した。蒸発後、粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝４：１、Ｒｆ＝０．７０）によって精製し、５３１ｂ（１．１３ｇ、２．２５ミリモル、７９％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ６．７８（ｂｒｓ、１Ｈ）、３．１０−３．１５（ｍ、８Ｈ）、２．８７−２．８９（ｍ、２Ｈ）、２．４８−２．５１（ｍ、２Ｈ）、１．３７−１．５５（ｍ、３５Ｈ）。Ｃ２５Ｈ５１Ｎ４Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋に対する分子量、計算値５０３．３８、実測値５０３．２。
化合物５３２：
ＣＨ２Ｃｌ２（３６ｍＬ）における化合物５３１（１．３７ｇ、２．５９ミリモル）の溶液へ、トリフルオロ酢酸（４ｍＬ）をゆっくり０℃で添加した。反応混合物を室温において５時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、粗製物をＥｔ２Ｏにおいて沈殿し、化合物５３２（９５０ｍｇ、１．６７ミリモル、６４％）をＴＦＡ塩として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ８．７８（ｂｒｓ、２Ｈ）、８．６８（ｂｒｓ、２Ｈ）、７．９３（ｂｒｓ、３Ｈ）、３．４８（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．９４−２．９５（ｍ、１０Ｈ）、１．８２−１．９３（ｍ、４Ｈ）、１．６２（ｂｒｓ、４Ｈ）。Ｃ１０Ｈ２５Ｎ６（Ｍ＋Ｈ）＋に対する分子量、計算値２２９．２１、実測値２２９．３。
化合物５３３：
ピリジン（５ｍＬ）において化合物５３２（３２４ｍｇ、０．５６８ミリモル）の溶液へ、トリフルオロ酢酸無水物（０．３１６ｍＬ、２．２７ミリモル）を０℃で滴加した。反応混合物を室温において１４時間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２およびＮａＨＣＯ３水溶液を用いた抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１、Ｒｆ＝０．３４）によって精製し、粗製物を化合物５３３（２１４ｍｇ、０．４１４ミリモル、７３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ９．４８−９．５３（ｍ、１Ｈ）、３．１８−３．４３（ｍ、１２Ｈ）、１．７５−１．８０（ｍ、４Ｈ）、１．５１−１．５４（ｍ、４Ｈ）。１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ−７０．９１、−７０．９５、−７０．９７、−７１．０１、−７１．０４、−７１．１５、−７１．１７、−７７．２３、−７７．２５、−７７．３８。Ｃ１６Ｈ２１Ｆ９Ｎ６ＮａＯ３（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値５３９．１４、実測値５３９．０。
アジド基を含有する拡張したスペルミン類似体も、合成した。
化合物５３５：
アセトニトリル（８ｍＬ）におけるアジ化ナトリウム（４３６ｍｇ、６．７０ミリモル）の懸濁液を、氷浴において冷却した。その後、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（０．９４ｍＬ、５．５６ミリモル）をゆっくり混合物へ添加した。反応を氷浴において２時間実行した後、反応混合物を、沈殿物を取り除くためにろ過した。沈殿を２０ｍＬのアセトニトリルを用いて洗浄した。トリフリックアジドを含有した混合アセトニトリル溶液を、次のジアゾ移動反応のために直接使用した。
化合物５３４（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，４８，２５８９−２５９９；５ｇ、６．９７ミリモル）を、アセトニトリル（３０ｍＬ）において溶解した。その後、硫酸銅五水和物（２８ｍｇ、０．１１２ミリモル）およびトリエチルアミン（７．７５ｍＬ、５５．６ミリモル）を溶液へ添加した。混合物を氷浴において冷却し、その後上記の調製したトリフリックアジド溶液を、混合物へゆっくり添加した。反応混合物を室温まで温めることを可能にし、一晩実行した。この溶液の半分（〜３２ｍＬ）を異なるフラスコへ移した後、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１．５２ｇ、６．９８ミリモル）をゆっくり添加し、反応混合物を２時間撹拌した。蒸発後、残渣をＥｔＯＡｃおよびＨ２Ｏを用いて抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、真空中で濃縮した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１、Ｒｆ＝０．３５）によって精製し、５３５（２８１ｍｇ、０．３３３ミリモル、５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ６．７３（ｂｒｓ、１Ｈ）、３．０５−３．３３（ｍ、１８Ｈ）、２．８６−２．８８（ｍ、２Ｈ）、１．３６−１．７０（ｍ、５７Ｈ）。Ｃ４１Ｈ７８Ｎ８ＮａＯ１０（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値８６５．５７、実測値８６５．５。
化合物５３６：
ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）における化合物５３５（２７５ｍｇ、０．３２６ミリモル）の溶液へ、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を０℃で滴加した。反応混合物を０℃で３０分間、その後室温において９０分間撹拌した。溶媒を取り除いた後、粗製物をＥｔ２Ｏにおいて沈殿し、化合物５３６（２３５ｍｇ、０．２５７ミリモル、７９％）をＴＦＡ塩として得た。１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）δ３．５０（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．０９−３．１５（ｍ、１８Ｈ）、２．０６−２．１０（ｍ，６Ｈ）、１．９４−１．９７（ｍ、２Ｈ）、１．７６（ｂｒｓ、４Ｈ）。Ｃ１６Ｈ３９Ｎ８（Ｍ＋Ｈ）＋に対する分子量、計算値３４３．３３、実測値３４３．２。
化合物５３７：
ピリジン（３ｍＬ）において化合物５３６（２００ｍｇ、０．２１９ミリモル）の溶液へ、トリフルオロ酢酸無水物（０．２４５ｍＬ、１．７５ミリモル）を０℃で滴加した。反応混合物を室温において１４時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：２、Ｒｆ＝０．３４）によって精製し、化合物５３７（１２７ｍｇ、０．１５４ミリモル、７０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ９．４５−９．５３（ｍ、１Ｈ）、３．３０−３．４４（ｍ、１２Ｈ）、３．２２（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、１．８０−１．８９（ｍ、８Ｈ）、１．５５（ｂｒｓ、４Ｈ）。１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ−７０．９０、−７０．９２、−７０．９６、−７０．９８、−７１．０６、−７１．１１、−７１．１３、−７１．１６、−７１．２０、−７１．３４、−７７．２６、−７７．２８、−７７．４１。Ｃ２６Ｈ３３Ｆ１５Ｎ８ＮａＯ５（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値８４５．２２、実測値８４５．３。
アジド機能を含むオリゴアミン誘導体を、以下の通りに合成した。
化合物５３８：
メタノール（３００ｍＬ）における化合物５３４（４０ｇ、５５．８ミリモル）の溶液へ、トリエチルアミン（６４ｍＬ）およびアクリロニトリル（７．３５ｍＬ、１１１．６ミリモル）を添加した。反応物を室温において１４時間撹拌した。その後、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３７．１ｇ、１７０ミリモル）を℃でゆっくり添加し、混合物を室温において１４時間撹拌した。水系後処理後、粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：４、Ｒｆ＝０．７２）によって精製し、５３８（２３．９ｇ、２３．４ミリモル、４２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ３．４０（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、４Ｈ）、３．０９−３．１５（ｍ、２０Ｈ）、２．６９（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、４Ｈ）、１．３６−１．６５（ｍ、６６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）δ・１７０．３、１５４．５、１１９．０、７９．１、７８．３、７８．２、５９．７、４５．０、４４．１、４２．４、２８．０、２７．９、２０．７、１４．１。Ｃ５２Ｈ９４Ｎ８ＮａＯ１２（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値１０４５．６９、実測値１０４５．５。
化合物５３９：
メタノール（８０ｍＬ）における化合物５３８（７．８８ｇ、７．７０ミリモル）および酢酸（１０ｍＬ）の溶液を、１４時間水素ガス圧力５０ｐｓｉにおいてＰｄ（ＯＨ）２／Ｃ（８．０ｇ）上で水素化した。セライトを介してろ過後、濾液を真空中で濃縮した。残渣をＣＨＣｌ３（３００ｍＬ）および１Ｍ ＮａＯＨ（４０ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を分離し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、粘性油として化合物５３９（７．９０ｇ、７．６６ミリモル、９９％）を生成するために濃縮した。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ３．６２（ｂｒｓ、４Ｈ）、３．０８−３．１４（ｍ、２４Ｈ）、１．３６−１．６３（ｍ、７０Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）δ・１５４．６、１５４．５、１５４．４、７９．１、７８．３、７８．２、４６．３、４４．３、３８．５、３０．８、２８．０、２７．２、２５．１。Ｃ５２Ｈ１０３Ｎ８Ｏ１２（Ｍ＋Ｈ）＋に対する分子量、計算値１０３１．７７、実測値１０３１．５。
化合物５４１：
メタノール（７２ｍＬ）における化合物５３９（７．４０ｇ、７．１８ミリモル）の溶液へ、トリエチルアミン（２．５ｍＬ、１８．０ミリモル）、硫酸銅五水和物（１８ｍｇ、０．０７２ミリモル）、およびイミダゾール−１−スルホニルアジドハイドロクロライド（９０３ｍｇ、４．３１ミリモル）を添加した。反応混合物を、室温において２時間撹拌した（５４０；Ｃ５２Ｈ１０１Ｎ１０Ｏ１２（Ｍ＋Ｈ）＋に対する分子量、計算値１０５７．７６、実測値１０５７．５）。その後、エチルトリフルオロ酢酸（２．６０ｍＬ、２１．５ミリモル）を添加し、混合物を室温において２時間撹拌した。水系後処理後、粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１、Ｒｆ＝０．３８）によって精製し、５４１（１．７５ｇ、１．５２ミリモル、２１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ９．３８（ｂｒｓ、１Ｈ）、３．１０−３．３３（ｍ、２８Ｈ）、１．３１−１．７１（ｍ、７０Ｈ）。１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ−７７．２７。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）δ・１５６．３、１５５．９、１５４．５、１５４．４、１２０．２、１１７．３、１１４．５、７８．４、７８．３、７８．２、６３．４、４８．４、４６．３、４４．２、３７．０、２７．９、２７．３、２５．１。Ｃ５４Ｈ９９Ｆ３Ｎ１０ＮａＯ１３（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値１１７５．７２、実測値１１７５．３。
化合物５４２：
ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）における化合物５４１（１．７５ｇ、１．５２ミリモル）の溶液へ、トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）をゆっくり０℃で添加した。反応混合物を０℃で１時間、その後室温において６時間撹拌した。真空中で溶媒の除去によって、白い泡として化合物５４２を生成した。この物質を追加の精製なしに次の反応のために使用した。Ｃ２４Ｈ５２Ｆ３Ｎ１０Ｏ（Ｍ＋Ｈ）＋に対する分子量、計算値５５３．４３、実測値５５３．３。
化合物５４３：
ピリジン（２０ｍＬ）における化合物５４２（１．５２ミリモル）の溶液に、トリフルオロ酢酸無水物（２．１１ｍＬ、１５．２ミリモル）を０℃で滴加した。反応混合物を室温において１４時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、粗製物をＣＨ２Ｃｌ２およびＨ２Ｏを用いて抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、その後ろ過し、真空中で濃縮した。粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）によって精製し、化合物５４３（１．４５ｇ、１．２８ミリモル、８５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ９．４３−９．５１（ｍ、１Ｈ）、３．３２−３．３８（ｍ、２６Ｈ）、３．２１−３．２３（ｍ、２Ｈ）、１．８０−１．８７（ｍ、１２Ｈ）、１．５５（ｂｒｓ、４Ｈ）。１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ−７１．００、−７１．０５、−７１．１３、−７１．２１、−７１．２６、−７１．３２、−７１．３５、−７１．４０、−７７．３２、−７７．３５、−７７．４７。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）・δ１５６．５、１５５．８、１５５．６、１５５．５、１５５．３、１２０．５、１１７．７、１１４．８、１１４．４、１１１．９、４８．３、４７．９、４６．７、４５．９、４４．６、４４．２、４４．０、４３．７、３６．９、３６．４、２７．７、２７．４、２５．９、２５．７、２５．３、２５．０、２４．０、２３．５、２３．３。Ｃ３６Ｈ４４Ｆ２１Ｎ１０Ｏ７（Ｍ−Ｈ）−に対する分子量、計算値１１２７．３１、実測値１１２７．０。
実施例１２：１’−トリアゾリルリボフラノース誘導体の調製
実施例１３．オリゴヌクレオチドとの共役のための機能性ペプチド
表５に示されるペプチドを、クリックケミストリーアプローチを通してオリゴヌクレオチドと共役するために、固形相Ｆｍｏｃ化学に従って合成する。ペプチドＰ１〜Ｐ３は、アジド部分を含有し、ペプチドＰ４〜Ｐ６は、相補的機能基とオリゴヌクレオチドまたは担体分子とを共役するために末端アルキンを含有する。
実施例１４．オリゴヌクレオチド合成後の、合成後のクリックケミストリー支持について
スキーム３９は、クリックケミストリーによるリガンドとオリゴヌクレオチドとの支持結合における代表例を示す。１等量のオリゴヌクレオチド−アルキン（１μモルスケール合成０を、０．２５等量のＣｕＳＯ４および２等量のアスコルビン酸ナトリウムの存在下で、１０等量のＣ２２−アジ化物（ＭｅＯＨ／ＴＨＦ１：１ｖ／ｖ）と反応させた。得られた共役したオリゴヌクレオチド（３３５６１）をＨＰＬＣによって解析し、結果を図１２に示す。共役したオリゴヌクレオチドを８８％純度に、ＨＰＬＣ解析、図１３によって測定した通り、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
実施例１５：クリックケミストリーによる６−カルボキシフルオセインを用いたオリゴヌクレオチドの合成後の標識
ａ．６−カルボキシフルオセイン−プロパルギルアミン（アルキニルＦＡＭ）の合成
ＤＭＦ（１．０ｍＬ）におけるプロパルギルアミンの６．８μｌ（０．１ミリモル）の溶液を、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）および０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（０．２ｍＬ）緩衝液における６−カルボキシフルオセインＮＨＳエステルの２２ｍｇ（０．０４６ミリモル）の溶液に添加した。室温において一晩撹拌した後、溶媒を真空下で取り除いた。少量の反応混合物をＬＣ−ＭＳ解析のために提出した。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ９：１）。ＬＣ−ＭＳ解析によってアルケニルＦＡＭが形成されることを確認する。計測量：４１４．０９、実測量：４１４．０。
ｂ．アジド標識オリゴヌクレオチドの合成
アジド標識したオリゴヌクレオチドの略図を図１４に示す。ｓｉＲＮＡの３’末端におけるアジド基を組み込むために、１００μｌの０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．０）における１００ナノモルのアミノ修飾ｓｉＲＮＡ（Ａｌ−３９９１）は、２５μｌのＤＭＦにおける２．０ｕモルのアジドエステルを用いて１５時間、室温においてインキュベートした。１５時間後、試料をＩＥＸ解析によって解析した。反応を完了するために、室温において試料を９時間放置した。２４時間後、試料をＬＣ−ＭＳによって解析し、化合物の完全性を確認する。計測量：７２６９．３５、実測量：７２６８．５６。
ｃ．クリックケミストリー
図１５は、クリックケミストリーによって、アジド標識したオリゴヌクレオチドと共役した６−カルボキシフルオセイン−プロパルギルアミンを示す。１００μｌの水におけるアジド−オリゴヌクレオチド（５．０ナノモル）を、７２時間８０℃で２５μｌの乾燥ＤＭＳＯにおいて１５０倍のアルキニルＦＡＭの過剰量と反応させた。未反応の染色を、ＰＤ−１０カラムにおける分子ふるいクロマトグラフィーによって取り除いた。ＬＣ−ＭＳデータは、アルキニル６−カルボキシフルオセイン（ＦＡＭ）およびアジド標識した一本鎖ＲＮＡ間の１，３−双極性付加環化を、ＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡ、図１６を生成するために、水性状態下で実施したことを示す。フルオレセイン共役オリゴマー（ｎ）：計測量：７６８４、実測量７６８２．３、非共役出発物質（ｂ）：計測量：７２６９、実測量７２７７。
実施例１６：アジド修飾Ｃ６−アミノヒドロキシプロリノル
ＤＭＴｒ保護Ｃ６−アミノプロリノールを、以下の通り対応するアジ化誘導体に変換した。
化合物５４５：
メタノール（５ｍＬ）における化合物５４４（２００ｍｇ、０．３７５ミリモル）の溶液へ、トリエチルアミン（０．１５７ｍＬ、１．１３ミリモル）、硫酸銅五水和物（１ｍｇ、０．００３７５ミリモル）、およびイミダゾール−１−スルホニルアジドハイドロクロライド（９４ｍｇ、０．４５ミリモル）を添加した。反応混合物を室温において１時間撹拌した。産物形成を、質量分析によって確認した。Ｃ３２Ｈ３８Ｎ４ＮａＯ５（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値５８１．２７、実測値５８１．０、Ｃ３２Ｈ３９Ｎ４Ｏ５（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５５９．２９、実測値５５９．０。
実施例１７：トリアゾール結合ヌクレオシド構成要素
化合物５４７：
ピリジン（３０ｍＬ）における化合物５４６（Ｐｒｉｍｅ ｏｒｇａｎｉｃｓ、２．１３ｇ、７．４９ミリモル）の溶液へ、フェニルクロロ炭酸塩（１．０４ｍＬ、８．２４ミリモル）を０℃で添加した。室温において２時間撹拌した後、プロパルギルアミンを０℃で添加した。混合物を室温において１４時間撹拌した。溶媒の除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：２、Ｒｆ＝０．１９）によって精製し、水系後処理および５４７（２．７３ｇ、７．４７ミリモル、９９％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ１１．３７（ｓ、１Ｈ）、７．８８（ｔ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．４６（ｓ、１Ｈ）、６．１９（ｄｄ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、９．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．１７−５．１８（ｍ、１Ｈ）、４．２３−４．２６（ｍ、１Ｈ）、４．１０−４．１５（ｍ、２Ｈ）、３．８１（ｄｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、５．６Ｈｚ、２Ｈ）、３．１３（ｔ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、２．４３−２．４７（ｍ、１Ｈ）、２．２４（ｄｄ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、１３．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．０７（ｓ、３Ｈ）、１．７９（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）δ１７０．０、１６３．６、１５５．５、１５０．５、１３５．６、１０９．９、８３．７、８１．４、８１．１、７４．３、７３．２、６４．２、３５．６、２９．８、１２．２。Ｃ１６Ｈ１９Ｎ３ＮａＯ７（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値３８８．１１、実測値３８８．０。
化合物５４８：
ＴＨＦ（５０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（５０ｍＬ）における、化合物５４７（２．５９ｇ、７．０９ミリモル）および３’−アジドチミジン（１．８９ｇ、７．０９ミリモル）の溶液へＨ２Ｏ（２５ｍＬ）、（＋）−ナトリウムＬ−アスコルビン酸（１４０ｍｇ、０．７０９ミリモル）、および硫酸銅五水和物（３５ｍｇ、０．１４２ミリモル）を添加した。反応混合物を７０℃で２時間熱した。溶媒の除去後、ピリジンを用いた２回の同時蒸発によって、薄黄色の泡（定量的産生量）を得た。物質を次の反応に使用した。解析試料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２における１０％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．３６）によって得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ１１．３８（ｓ、１Ｈ）、１１．３７（ｓ、１Ｈ）、８．１６（ｓ、１Ｈ）、７．９７（ｔ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．８１（ｄ、Ｊ＝０．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．４６（ｄ、Ｊ＝１．２Ｈｚ、１Ｈ）、６．４１（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．１９（ｄｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、８．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．３３−５．３７（ｍ、１Ｈ）、５．２９（ｔ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．１８（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ１Ｈ）、４．０９−４．２９（ｍ、６Ｈ）、３．６６−３．７１（ｍ、１Ｈ）、３．５７−３．６２（ｍ、１Ｈ）、２．６１−２．７３（ｍ、２Ｈ）、２．４４−２．４６（ｍ、１Ｈ）、２．２０−２．２５（ｍ、１Ｈ）、２．０７（ｓ、３Ｈ）、１．８１（ｓ、３Ｈ）、１．７２（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）δ１７０．１、１６３．７、１６３．６、１５５．９、１４９．６、１４５．２、１３６．３、１３５．９、１２４．０、１２２．７、１１０．０、１０９．８、８４．７、８４．０、８３．９、８１．６、７４．６、６４．２、６０．７、５９．４、４７．６、３７．２、３５．９、３５．６、２０．８、１２．２、１２．１。Ｃ２６Ｈ３２Ｎ８ＮａＯ１１（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値６５５．２１、実測値６５５．０。
化合物５４９：
ピリジン（７０ｍＬ）における化合物５４８（〜７．０９ミリモル）の溶液へ、ＤＭＴｒＣｌ（２．７６ｇ、８．１５ミリモル）を添加した。反応混合物を室温において１４時間撹拌した。溶媒の除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２における５％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．２６）によって精製し、水系後処理および５４９（５．６９ｇ、６．０９ミリモル、８６％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ１１．３８（ｓ、２Ｈ）、８．１７（ｓ、１Ｈ）、７．９７（ｔ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．６６（ｓ、１Ｈ）、７．４６（ｓ、１Ｈ）、７．２１−７．３５（ｍ、９Ｈ）、６．８６−６．８７（ｍ、４Ｈ）、６．４２（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．２０（ｄｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、８．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．５４（ｄｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１４．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．１９（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．１０−４．３５（ｍ、６Ｈ）、３．７３（ｓ、６Ｈ）、３．２６−３．３４（ｍ、２Ｈ）、２．７３−２．７７（ｍ、２Ｈ）、２．４４−２．４６（ｍ、１Ｈ）、２．２１−２．２６（ｍ、１Ｈ）、２．０６（ｓ、３Ｈ）、１．７１（ｓ、３Ｈ）、１．５９（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）δ１７０．０、１６３．６、１５５．８、１５０．４、１４５．２、１４４．５、１３５．７、１３５．１、１２６．７、１２２．２、１１３．２、１０９．９、１０９．８、８５．９、８３．８、８３．８、８２．２、８１．４、７４．４、６４．１、６３．０、５９．２、５５．０、３７．２、３５．９、３５．５、２０．８、１２．１、１１．８。Ｃ４７Ｈ４９Ｎ８Ｏ１３（Ｍ−Ｈ）−に対する分子量、計算値９３３．３４、実測値９３３．０。
化合物５５０：
ＣＨ２Ｃｌ２（９０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）における化合物５４９（５．４８ｇ、５．８６ミリモル）の溶液へ、ＭｅＯＨ（２２．８ｍＬ、１１．４ミリモル）における０．５Ｍ ＮａＯＭｅを添加した。反応混合物を室温において１４時間撹拌した。溶媒の除去後、粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２における１０％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．４６）によって精製し、５５０（４．５９ｇ、５．１４ミリモル、８８％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ１１．３９（ｓ、１Ｈ）、１１．３０（ｓ、１Ｈ）、８．１５（ｓ、１Ｈ）、７．８７（ｔ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５（ｓ、１Ｈ）、７．４２（ｓ、１Ｈ）、７．２０−７．３４（ｍ、９Ｈ）、６．８５−６．８７（ｍ、４Ｈ）、６．４０（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．１８−６．２１（ｍ、１Ｈ）、５．５２（ｄｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１４．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７（ｄ、Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．２０−４．３２（ｍ、６Ｈ）、４．０３−４．０６（ｍ、１Ｈ）、３．９１−３．９３（ｍ、１Ｈ）、３．７３（ｓ、６Ｈ）、３．０６−３．２７（ｍ、１Ｈ）、２．７２−２．７６（ｍ、２Ｈ）、２．１９−２．２６（ｍ、１Ｈ）、２．０３−２．０７（ｍ、１Ｈ）、１．７１（ｓ、３Ｈ）、１．５９（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）δ１６３．７、１６３．６、１５６．０、１５０．４、１４５．３、１４４．５、１３５．９、１３５．１、１２６．８、１２２．２、１１３．２、１０９．８、１０９．７、８５．９、８４．２、８３．８、８２．２、７０．４、６３．０、５９．２、５５．０、３８．６、３７．２、３５．９、１２．１、１１．８。Ｃ４５Ｈ４７Ｎ８Ｏ１２（Ｍ−Ｈ）−に対する分子量、計算値８９１．３３、実測値８９１．０。
化合物５５１：
ＣＨ２Ｃｌ２（７５ｍＬ）における化合物５５０（３．５６ｇ、３．９９ミリモル）の溶液へ、ＤＭＡＰ（１．４６ｇ、１２．０ミリモル）および無水コハク酸（７９９ｍｇ、７．９８ミリモル）を添加した。反応混合物を、室温において一晩撹拌した。粗混合物のシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２における５％ＭｅＯＨ／５％Ｅｔ３Ｎ、Ｒｆ＝０．１１）による精製によって、対応するトリエチルアンモニウム塩（４．２９ｇ、３．９２ミリモル、９８％）として化合物５５１を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ１１．３４（ｂｒｓ、２Ｈ）、８．１７（ｓ、１Ｈ）、７．９８（ｔ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５（ｓ、１Ｈ）、７．４５（ｓ、１Ｈ）、７．２０−７．３４（ｍ、９Ｈ）、６．８４−６．８６（ｍ、４Ｈ）、６．４０（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．１９（ｄｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、８．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．５３（ｄｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１４．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．１８（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．０８−４．３２（ｍ、６Ｈ）、３．７２（ｓ、６Ｈ）、３．２３−３．３９（ｍ、２Ｈ）、２．７２−２．７６（ｍ、２Ｈ）、２．４１−２．５４（ｍ、５Ｈ）、２．１９−２．２４（ｍ、１Ｈ）、１．７０（ｓ、３Ｈ）、１．５８（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）δ１７３．７、１７２．１、１６３．７、１６３．６、１５５．８、１５０．４、１４５．２、１４４．５、１３５．７、１３５．１、１２６．７、１２２．２、１１３．２、１０９．８、８５．９、８３．８、８２．２、８１．４、７４．４、６４．２、６３．０、６２．５、５９．２、５２．０、３７．２、３５．８、３５．５、２９．４、２９．２、１２．１、１１．８。Ｃ４９Ｈ５１Ｎ８Ｏ１５（Ｍ−Ｈ）−に対する分子量、計算値９９１．３５、実測値９９１．０。
化合物５５２：
化合物５５１（４．２１ｇ、３．８５ミリモル）を、ＤＭＦ（２５０ｍＬ）において溶解した。ＨＢＴＵ（１．５３ｇ、４．０４ミリモル）そしてｉＰｒ２ＮＥｔ（３．３５ｍＬ、１９．３ミリモル）および最後にＣＰＧ−ＮＨ２（Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＣＰＧ−５８５オングストローム、ＮＨ２負荷＝１２４μモル／ｇ）（３４．２ｇ、４．２４ミリモル）を連続して添加した。混合物を室温において４時間振り、その後固形をろ過によって収集し、ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）、その後５０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）を用いて洗浄し真空中で乾燥した。アミノ残渣を、Ａｃ２Ｏ／ピリジン／Ｅｔ３Ｎ（８０ｍＬ／２４０ｍＬ／１６ｍＬ）を用いて１時間振とうすることによってキャップした。ろ過およびＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）および５０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）をもちいた洗浄、そして一晩真空中で乾燥することによって、化合物５５２（〜３６ｇ、６４μモル／ｇ）を得た。
実施例１８：固形支持体上でクリックケミストリーを通したＲＮＡと遊離スペルミン分子との結合
化合物５５４：
（１）固形支持体上のＲＮＡアルキン、Ａ−３３０７２．１、（１１ｍｇ、０．６２μモル）を、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．６２μモル）およびアスコルビン酸ナトリウム（３．１μモル）の存在下で、スペルミンアジド（５５３、３．５３ｍｇ、６．１８μモル）を用いて処理し、混合物を６５℃で２時間熱したブロック上に保持した。反応の溶媒量をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）（１ｍＬ）の１：１比として維持した。反応後、ビーズをその後に水、メタノール、およびアセトニトリルを用いて洗浄し、室温において乾燥することを可能にした。（２）脱保護：反応したビーズを、水性メチルアミン（１２５μｌ）を用いて２０分間６５℃で処理し、−２０℃で２０分間冷却した。濾液を採取し、ビーズを、ＤＭＳＯ（１００μｌｘ３）を用いて洗浄し、それらを濾液と組み合わせ、−２０℃で１０分間冷却した。トリエチルアミン三ふっ化水素酸塩（１７５μｌ）を組み合わせた濾液へ添加し、混合物を６５℃で２０分間保持した。透析後、粗反応混合物を、逆相ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ、図１７によって解析した。（３）ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ：物質を、２つの緩衝系（０．１Ｍ ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０およびアセトニトリル）、％Ｂ＝０−４０％／２０分、〜１００％／３０分、１ｍＬ／分、直線状勾配、ＵＶ：２６０ｎｍ、カラム：ＸＴｅｒｒａ ＲＰ−１８、４．６ｘ２５０ｍｍを使用して勾配上で解析ＲＰ−ＨＰＬＣへ負荷した。粗物質もＬＣ−ＭＳ（計算量７２２０、実測量７２１９および７２６０）を用いて解析した。
実施例１９：クリックケミストリーを通した固形支持体におけるＲＮＡとＢｏｃ保護スペルミン分子との結合
化合物５５５：
固形支持体におけるｂｏｃ保護スペルミンアジド５３１ａとＲＮＡアルキンＡ−３３０７２．１との間の反応を以下に記載した。Ｂｏｃ保護スペルミンアジドを、クリックケミストリーのためにＲＮＡアルキンとのモデル反応を確立するために使用した。
（１）固形支持体におけるＲＮＡアルキン、Ａ−３３０７２．１、（１１ｍｇ、０．６２μモル）を、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．９３μモル）およびアスコルビン酸ナトリウム（３．１μモル）の存在下でｂｏｃ保護スペルミンアジド（５３１ａ、過剰量）を用いて処理し、混合物を５０℃で１２時間、熱したブロック上に保持した。反応のための溶媒量をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）（１ｍＬ）の１：１比として維持した。反応後、ビーズをその後に水、メタノール、およびアセトニトリルを用いて洗浄し、室温において乾燥することを可能にした。
（２）脱保護：反応したビーズを、水性メチルアミン（１２５μｌ）を用いて２０分間６５℃で処理し、−２０℃で２０分間冷却した。濾液を採取し、ビーズを、ＤＭＳＯ（１００μｌｘ３）を用いて洗浄し、それらを濾液と組み合わせ、−２０℃で１０分間冷却した。トリエチルアミン三ふっ化水素酸塩（１７５μｌ）を組み合わせた濾液へ添加し、混合物を６５℃で２０分間保持した。透析後、粗反応混合物を、逆相ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳによって解析した。
（３）ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ：物質を、２つの緩衝系（０．１Ｍ ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０およびアセトニトリル）、％Ｂ＝０−６０％／２０分、〜１００％／３０分、１ｍＬ／分、直線状勾配、ＵＶ：２６０ｎｍ、カラム：ＸＴｅｒｒａ ＲＰ−１８、４．６ｘ２５０ｍｍを使用して勾配上で解析ＲＰ−ＨＰＬＣへ負荷した。粗物質もＬＣ−ＭＳ（計算量７５２０、実測量７５１９）、図１８を用いて解析した。
実施例２０：クリックケミストリーを通した固形支持体におけるＲＮＡとＴＦＡ保護スペルミン分子との結合
化合物５５６：
固形支持体におけるＴＦＡ−保護スペルミンアジド５３３とＲＮＡアルキンＡ−３７０６８．１との間の反応を以下に記載した。
（１）固形支持体におけるＲＮＡアルキン、Ａ−３７０８６．１、（１１ｍｇ、１μモル）を、ＣｕＳＯ４５Ｈ２Ｏ（１．５μモル）およびアスコルビン酸ナトリウム（５μモル）の存在下でＴＦＡ−保護スペルミンアジド（５３３、過剰量）を用いて処理し、混合物を一晩の間５０℃で熱したブロック上に保持した。反応溶媒量をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）（１ｍＬ）の１：１比として維持した。反応後、ビーズをその後に水、メタノール、およびアセトニトリルを用いて洗浄し、室温において乾燥することを可能にした。
（２）脱保護：反応したビーズを、水性メチルアミン（１２５μｌ）を用いて２０分間６５℃で処理し、−２０℃で２０分間冷却した。濾液を採取し、ビーズを、ＤＭＳＯ（１００μｌｘ３）を用いて洗浄し、それらを濾液と組み合わせ、−２０℃で１０分間冷却した。トリエチルアミン三ふっ化水素酸塩（１７５μｌ）を組み合わせた濾液へ添加し、混合物を６５℃で２０分間保持した。
（３）ＬＣ−ＭＳ：透析後、粗反応混合物をＬＣ−ＭＳによって解析した（計算量７２３５、実測量７２３４）。
実施例２１：クリックケミストリーを通した固形支持体におけるＲＮＡとＴＦＡ保護スペルミン（７個のアミン）との結合
化合物５５７を、実施例１９または２０のものと同様の手順および拡張したスペルミン５４３を利用することによって合成することができる。
実施例２２：オリゴヌクレオチド
１．固相法による一本鎖ＲＮＡの合成
ＲＮＡオリゴヌクレオチド（表６）を、ウリジン（Ｕ）、４−Ｎ−ベンゾイルシチジン（ＣＢｚ）、６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン（ＡＢｚ）および２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル保護ホスホラミダイトを含む２−Ｎイソブチリルグアノシン（ＧｉＢｕ）、および５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−チミジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミダイト（Ｔ）の市販の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミダイトモノマーを用いて、標準ホスホラミダイト化学を使用してＤＮＡ合成機ＡＢＩ３９４において合成した。修飾したＲＮＡホスホラミダイトおよびこの調査で使用したＣＰＧを、図１９および２０に示す。切断および脱保護後、ＲＮＡオリゴヌクレオチドをアニオン交換または逆相高速液体クロマトグラフィー（ＡＸ−ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製し、ＬＣ−ＭＳによって特徴付けた。
２．ＲＮＡアルキン骨格の合成
固形支持リン酸トリエステルアルキン骨格（表７における３’、５’末端位置および内部位置）を、アルキンモノマーが関与する際はいつでも、拡張ヌクレオチド共役時間（３０分）を除く、前項に記載されたものと同様に合成した。合成後、ＣＰＧのごく一部を脱保護し、ＡＸ−ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳを用いて解析した。
３．Ｃｕ（Ｉ）触媒１，３−双極性付加環化反応最適化
クリック反応条件を、ＣＰＧにおいて５’−アルキン修飾したＲＮＡを使用して最適化した（配列番号３３０７２、表８）。出発物質の等量の効果、温度、および溶媒を、配列番号３３０７２のクリック反応において１−アジド−ドコサン（Ｃ２２−アジ化物）を用いて調査した（スキーム３９）。最適化結果を、表９において合成した。この調査において使用される条件においてＴＢＴＡがクリック反応を促進することができることが見出される可能性がある。クリックはＴＢＴＡ（反応第１および２）なしで発生しなかった。Ｃｕ２＋レベルは、あるレベル（反応第５における０．４等量のアルキン）において維持されるべきであり、低すぎるＣｕ２＋レベルは、クリック反応（反応第９）を悪化させる。ＤＭＦ、ＤＭＳＯを、共溶媒として使用することができるが、それらはＴＨＦと同じほど良く示さなかった（反応第５、７、８）ことも、認められた。マイクロ波援助反応は、より早かった。反応は、２日後に完了した。この軽い条件を、いくつかの熱的に非安定なＲＮＡ配列に対して使用することができる（反応第１２〜１３）。要約すれば、Ｃ２２−アジ化物を含むＲＮＡアルキンのクリック反応において我々が認めた最適な条件は、ＲＮＡ−アルキン：アジ化物：Ｃｕ：ＴＢＴＡ：ＮａＡｓｃ（１：２．９：０．４：２．８：３．２）のモル比、Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ／ＴＨＦ（８／８／５ｖ／ｖ／ｖ）において４５分間６０℃におけるマイクロ波援助加熱を含む。
反応最適化後、異なるアジ化物（図２１）を、最適条件においてこのＲＮＡ−アルキンを用いて１，３−双極性付加環化について試験した。全てのクリック反応が、５０％のみ完了した１−アジド−アダマンタンを除く、優れた反応完了率を得たことを示した。表９。その立体環境が遅いクリック反応の原因となると予想された。９０分間に拡張された反応は、反応完了率を改善しなかった（データ表示せず）。
４．Ｃｕ（Ｉ）触媒１，３−双極性付加環化の基本手順
表８（０．６２μモル）における固形支持オリゴアルキンリン酸トリエステル配列番号３３０７２〜３７０８８へ、アジ化物（図２１）（アルキンによる３等量、１．８μモル、ＴＨＦにおける３６μＬの５０ｍＭ溶液）、ＣｕＳＯ４（０．４等量、０．２５μモル、Ｈ２Ｏにおける５μＬの５０ｍＭ溶液）、新たに調製したアスコルビン酸ナトリウム（３．２等量、２．０μモル、Ｈ２Ｏにおける１２μＬの５０ｍＭ溶液）、ＴＢＴＡ（２．８等量、１．７μモル、ＴＨＦにおける３５μＬの５０ｍＭ溶液）の混合物を添加した。水、ＭｅＯＨ、およびＴＨＦを、添加し（約８：８：５ｖ／ｖ／ｖ）、１２００μＬの総容積を得た。得られた調製を、１００Ｗにおいておよび３０秒間の予混合時間、Ｅｘｐｌｏｒｅｒ−４８（ＣＥＭ）マイクロ波合成機を用いて密封ガラス管において熱した。温度を、内部赤外プローブを用いて４５分間６０℃で監視した。溶液を取り除き、ＣＰＧ支持体を、ＴＨＦおよびＭｅＯＨを用いて洗浄し、乾燥した。切断および脱保護後、クリック反応の進行をＲＰ−ＨＰＬＣによって解析し、産物をＬＣ−ＭＳによって特徴付けた。
クリック反応混合物を、４０分間０〜９０％ＡＣＮ（緩衝液Ｂ）勾配を含む半分取ＤｅｌｔａＰａｋＣ４カラム（水）を使用してＲＰ−ＨＰＣＬによって精製した。精製されたＲＮＡを、ＲＰ−ＨＰＣＬおよびＬＣ−ＭＳによって解析した。精製したクリック産物のＨＰＬＣプロファイルを図２３に示した。
表１１は、合成したクリック修飾オリゴヌクレオチドを要約する。
５．３’−エキソヌクレアーゼ安定アッセイ
オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ安定を、当該技術分野において知られており、当業者が利用可能な方法およびプロトコルを使用して容易に測定することができる。
実施例２３：オリゴヌクレオチドのＲＮＡ干渉活性
１．ＲＮＡ干渉評価のためのデュアルルシフェラーゼアッセイ
固相合成およびクリック反応によって得られた修飾を、デュアルルシフェラーゼアッセイにおけるＲＮＡ干渉について評価をした。二重鎖を、９５℃で２分間熱すること、および１Ｘリン酸緩衝食塩水において２時間室温において冷却することによって調製した。（表１２〜１４）。
遺伝子発現を抑制するための修飾ｓｉＲＮＡの能力を、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有したｐＧＬ４ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してデュアルルシフェラーゼアッセイによって調査した。ｓｉＲＮＡ配列を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的にするように設計した。安定的に形質移入されたＨｅＬａ細胞を、ｓｉＲＮＡの指示量を用いて形質移入し、ホタルルシフェラーゼのシグナルを、ウミシイタケルシフェラーゼのものに基準化した。ＨｅＬａＳＳ６細胞を、ホタル（標的）およびウミシイタケ（対照）ルシフェラーゼをコードするプラスミドを用いて、安定的に形質移入した。
ＲＮＡ干渉方法：Ｈｅｌａ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％抗生物質を追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ）において３７℃、５％ＣＯ２において、増殖した。細胞を指数増殖期において維持した。形質移入において約９０％の集密に達するために、細胞を９６ウェルプレート（１ウェルにつき０．１ｍＬ培地）内に蒔いた。形質移入を３７℃で２４時間進行することが可能であり、２日目に、培地をＯＰＴＩＭＥＭ１に変更し、血清培地（ＧＩＢＣＯ）を縮小した。Ｐｒｏｍｅｇａの２つのルシフェラーゼプラスミド、ウミシイタケルシフェラーゼ（ｐＲＬ−ＣＭＶ）、およびホタルルシフェラーゼ（ｐＧＬ３）をそれぞれ対照およびレポーターとして使用した。ｓｉＲＮＡの形質移入を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて接着細胞株の製造者によって説明された通り実施した。最終容積は、１ウェルにつき１５０μｌであった。２日目に、細胞をリポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって媒介される２ｐＭ〜８ｎＭの範囲の変動濃縮のｓｉＲＮＡ、ホタルルシフェラーゼ標的を用いて形質移入した。２４時間後、細胞を、２秒の遅延時間および１０秒の統合時間でプレートルミノメーターを使用して、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ発現の両方に対して解析した。（ＶＩＣＴＯＲ２、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）、図２４。ホタル／ウミシイタケルシフェラーゼ発現率を、未処理の（ｓｉＲＮＡなし）対照に対して遺伝子サイレンシング率を測定するために使用した。生成された値は、３倍の平均を表す。
スクリーニング処理は、全ての化合物を比較対象として親の未修飾二重鎖に対してスクリーンした、一次スクリーンから開始した。親の数倍低いＩＣ５０値を示した、このスクリーンからの強力な二重鎖のうちのいくつかを、二次スクリーンまたは直接比較のために選択した。全ての化合物は、親の二重鎖よりも強力に見えた。しかし、少なくとも５倍改善した効力を示したものは、センス鎖（表１５）における２、１５、および１６の位置におけるＵｄａ（Ｃ２２リンカー）を含む二重鎖であった。化合物の最終セットを我々の最高の修飾ＡＤ３２０２のうちの１つと比較し、これらの化合物が効力においてＡＤ３２０２と合うこと分かるが、Ｕｄａ修飾が活性改善に対して貢献することによる正確なメカニズムは、さらなる調査を通して検討されるであろう。
材料および方法−
細胞および試薬
デュアルＨｅＬａ（ルシフェラーゼ発現のために、ＰＧＬ４プラスミドを形質移入されたＨｅＬａ細胞）
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した組織培養、トリプシンおよびリポフェクタミン２０００
１０％ウシ胎仔血清、１％抗生物質溶液を追加したＤＭＥＭ
ｓｉＲＮＡ治療を１ｍｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した
フェノールレッド、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌ Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキット、０．２５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）なしのＤＭＥＭ。

Claims (24)

  1. 式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ：
    式中、
    Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲＮまたはＣＲＰ ２であり、
    Ｂは、水素、置換または未置換の天然もしくは非天然核酸塩基、置換または未置換のトリアゾール、あるいは置換または未置換のテトラゾール、ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ（ＣＨ２Ｂ１）３、ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ２Ｂ１）３であり、Ｂ１は、独立してハロゲン、メシル酸塩、Ｎ３、ＣＮ、置換または未置換のトリアゾールもしくは置換または未置換のテトラゾールであり、前記核酸塩基は、−Ｊ−リンカー−Ｎ３、−Ｊ−リンカー−ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８、−Ｊ−リンカー−シクロアルキン、−Ｊ−リンカー−ＲＬ、−リンカー−Ｑ−ＲＬ、または−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬによってさらに置換され、
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立してＨ、ＯＲ６、Ｆ、Ｎ（ＲＮ）２、Ｎ３、ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｎ３、−Ｊ−リンカー−ＣＮ、−Ｊ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８、−Ｊ−リンカー−シクロアルキン、−Ｊ−リンカー−ＲＬ、−リンカー−Ｑ−ＲＬ、もしくは−Ｊ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬであり、
    Ｊは存在しないか、Ｏ、Ｓ、ＮＲＮ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＳＯ、ＮＨＳＯ２、ＮＨＳＯ２ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）Ｏ、またはＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）であり、
    Ｒ６は、水素、ヒドロキシル保護基、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、置換または未置換のアラルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−式（Ｉ）、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、またはＰ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチドであり、
    ＲＮは、Ｈ、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のアルキニル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、置換または未置換のアラルキル、置換または未置換のヘテロアリール、またはアミノ保護基であり、
    ＲＰは、独立してＨ、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のアルキニル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、あるいは置換または未置換のヘテロアリールであり、
    Ｑは、
    であり、
    ＲＬは、水素またはリガンドであり、
    Ｒ８は、ＮまたはＣＲ９であり、
    Ｒ９は、Ｈ、置換または未置換のアルキル、またはシリルであり、
    Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立してＯ、Ｓ、あるいは置換または未置換のアルキルであるが、但し、Ｑ、−Ｎ３、−ＣＮ、−Ｃ≡Ｒ８、置換または未置換のトリアゾール、あるいは置換または未置換のテトラゾールが、前記化合物中に少なくとも１つ存在する。
  2. 式（ＩＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ：
    式中、ＡおよびＢはそれぞれ独立して水素、保護基、置換または未置換の脂肪族、置換または未置換のアリール、置換または未置換のヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−ヌクレオシド、または−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−オリゴヌクレオチドであり、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ存在ごとに独立してＯ、Ｓ、あるいは置換または未置換のアルキルであり、
    Ｊ１およびＪ２は、それぞれ独立してＯ、Ｓ、ＮＲＮ、置換または未置換のアルキル、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）Ｏ、またはＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）であり、
    は、環式基または非環式基であり、
    ＲＮは、Ｈ、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のアルキニル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、置換または未置換のアラルキル、置換または未置換のヘテロアリール、またはアミノ保護基であり、
    ＲＰは、独立してＨ、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のアルキニル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、あるいは置換または未置換のヘテロアリールであり、
    Ｑは、
    であり、
    Ｌ１０およびＬ１１は、独立して存在しないかまたはリンカーである。
  3. 式（ＩＩＩ）で表され、
    式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＢは、請求項１ですでに定義された通りである、請求項１記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ。
  4. 式（ＩＶ）で表され、
    式中、Ｒ１０およびＲ２０は、それぞれ独立して水素、置換または未置換の脂肪族、置換または未置換のアリール、あるいは置換または未置換のヘテロアリールであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＸは、請求項１ですでに定義された通りである、請求項１記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ。
  5. 式（Ｖ）で表され、
    式中、Ｂ１は、ハロゲン、Ｎ３、ＣＮ、置換または未置換のトリアゾール、あるいは置換または未置換のテトラゾールであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は請求項１で定義された通りである、請求項１記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ。
  6. 式（ＶＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ：
    式中、Ｅは存在しないか、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、またはＳＯ２ＮＨであり、
    Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、およびＲ１８は、それぞれ独立してＨ、ＣＨ２ＯＲａ、またはＯＲｂであり、
    ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して水素、ヒドロキシル保護基、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、置換または未置換のアラルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−式（Ｉ）、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、またはＰ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチドであり、
    Ｒ３０は、−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、−リンカー−ＲＬ、またはＲ３１であり、
    Ｑは、
    であり、
    ＲＬは、リガンド、−Ｎ３、−ＣＮ、または−Ｃ≡Ｒ８であり、
    Ｒ８は、ＮまたはＣＲ９であり、
    Ｒ９は、Ｈ、置換または未置換のアルキル、またはシリルであり、
    Ｒ３１は、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（Ｎ（Ｒ３２）２）（ＣＨ２）ｈＮ（Ｒ３２）２であり、
    Ｒ３２は、独立してＨ、−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、−リンカー−ＲＬ、またはＲ３１であり、
    ｈは、１〜２０の整数であり、
    Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立してＯ、Ｓ、あるいは置換または未置換のアルキルであるが、
    但し、Ｑ、−Ｎ３、−ＣＮ、または−Ｃ≡Ｒ８が、前記化合物中に少なくとも１つ存在する。
  7. 式（ＶＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ：
    式中、
    Ｗは存在しないか、Ｏ、Ｓ、またはＮ（ＲＮ）であり、ＲＮは、Ｈ、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のアルキニル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、置換または未置換のアラルキル、置換または未置換のヘテロアリール、またはアミノ保護基であり、
    Ｅは存在しないか、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、またはＳＯ２ＮＨであり、
    ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して水素、ヒドロキシル保護基、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、置換または未置換のアラルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−式（Ｉ）、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、またはＰ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチドであり、
    Ｒ３０は、−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、−リンカー−ＲＬ、またはＲ３１であり、
    Ｑは、
    であり、
    ＲＬはリガンドであり、
    Ｒ８はＮまたはＣＲ９であり、
    Ｒ９は、Ｈ、置換または未置換のアルキル、またはシリルであり、
    Ｒ３１は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（Ｎ（Ｒ３２）２）（ＣＨ２）ｈＮ（Ｒ３２）２であり、
    Ｒ３２は、独立してＨ、−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、またはＲ３１であり、
    ｈは、１〜２０の整数であり、
    Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立してＯ、Ｓ、または置換または未置換のアルキルであり、
    ｒ、ｓ、およびｔは、それぞれ独立して０、１、２、または３であるが、
    但し、Ｑ、−Ｎ３、−ＣＮ、または−Ｃ≡Ｒ８は、前記化合物中に少なくとも１つ存在する。
  8. 式（ＶＩＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ：
    式中、Ｅは存在しないか、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、またはＳＯ２ＮＨであり、
    ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して水素、ヒドロキシル保護基、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、置換または未置換のアラルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−式（Ｉ）、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−ヌクレオシド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、（Ｚ１）（−リンカー−ＲＬ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｎ３）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−ＣＮ）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、Ｐ（Ｚ１）（−リンカー−Ｃ≡Ｒ８）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、またはＰ（Ｚ１）（−リンカー−シクロアルキン）−Ｏ−オリゴヌクレオチドであり、
    Ｒ３０は、−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、−リンカー−ＲＬ、またはＲ３１であり、
    Ｑは、
    であり、
    ＲＬはリガンドであり、
    Ｒ８はＮまたはＣＲ９であり、
    Ｒ９は、Ｈ、置換または未置換のアルキル、またはシリルであり、
    Ｒ３１は、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（Ｎ（Ｒ３２）２）（ＣＨ２）ｈＮ（Ｒ３２）２であり、
    Ｒ３２は、Ｈ、−リンカー−Ｑ−リンカー−ＲＬ、またはＲ３１であり、
    ｈは、１〜２０の整数であり、
    Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立してＯ、Ｓ、あるいは置換または未置換のアルキルであり、
    ｒおよびｓは、それぞれ独立して０、１、２、または３であるが、
    但し、Ｑ、−Ｎ３、−ＣＮ、または−Ｃ≡Ｒ８は、前記化合物中に少なくとも１つ存在する。
  9. 前記リガンドが、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン糖鎖、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣薬、およびアプタマーよりなる群から選択される、請求項１または２記載の化合物。
  10. 前記リンカーが、構造−［Ｐ−Ｑ１−Ｒ］ｑ−Ｔ−で表され、
    式中、
    Ｐ、Ｒ、およびＴは、それぞれ独立して存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−（置換または未置換のアルキル）−ＮＨ−、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
    であり、
    Ｑ１は存在しないか、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｒ１００）（Ｒ２００）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ１００）（Ｒ２００）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であり、
    Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり、
    Ｒ１００およびＲ２００は、それぞれ独立してＨ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲＸ）２であり、
    ＲＸは、独立してＨ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり、
    ｑは０〜２０の整数であり、
    ｎは１〜２０の整数であり、
    ｍは０〜５０の整数であるが、
    但し、Ｐ、Ｒ、Ｔ、およびＱ１のうちの少なくとも１つは、前記リンカー中に存在する、請求項１または２記載の化合物。
  11. 前記環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンよりなる群から選択され、前記非環式基は、セリノールまたはジエタノールアミンの誘導体である、請求項２記載の化合物。
  12. 請求項１〜１１のうちのいずれか１項記載の化合物から調製される、オリゴヌクレオチド。
  13. 前記オリゴヌクレオチドは一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。
  14. 前記一本鎖オリゴヌクレオチドは一本鎖ｓｉＲＮＡである、請求項１３記載のオリゴヌクレオチド。
  15. 前記一本鎖オリゴヌクレオチドはマイクロＲＮＡである、請求項１３記載のオリゴヌクレオチド。
  16. 前記オリゴヌクレオチドは二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。
  17. 前記二本鎖オリゴヌクレオチドは二本鎖ｓｉＲＮＡである、請求項１６記載のオリゴヌクレオチド。
  18. 生物における標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を活性化するための組成物であって、請求項１４または１７記載のｓｉＲＮＡを含み、該ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの分解が生じるのに十分な量で投与され、それによって前記生物における標的特異的ＲＮＡｉを活性化する組成物。
  19. 前記標的ｍＲＮＡは、ヒト疾病または疾患に関与するかまたは関与することが予想されるタンパク質のアミノ酸配列を指定することを特徴とする、請求項１８記載の組成物。
  20. 前記疾病または疾患が、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、癌、アレルギー、自己免疫疾病、免疫不全、および免疫抑制から選択されることを特徴とする、請求項１９記載の組成物。
  21. 請求項１〜１１のうちのいずれか１項記載の化合物、および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
  22. 請求項２１記載の医薬組成物、および使用説明書を含む、薬学的キット。
  23. 脊椎動物におけるウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、腫瘍、多発性硬化症、アレルギー、自己免疫疾病、免疫抑制、および免疫不全よりなる群から選択される疾病および／または疾患を防止および／または治療するための細菌ＲＮＡの調製のための、請求項１２記載のオリゴヌクレオチドの使用。
  24. 標識付パッケージ中に請求項１２記載のオリゴヌクレオチドを含み、前記パッケージ上の標識が、前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのウイルスに対して使用できることを示す、キット。
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