JP2014039828A - 超低汚損スルホベタインおよびカルボキシベタイン材料ならびに関連する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】船殻移植生体材料、生物医学的診断センサー、および薬剤送達のためのコーティングにおいて有用な超低汚損材料及び該材料を含有する超低汚損皮膜並びに表面に該皮膜を有する装置の提供。
【解決手段】スルホベタイン又はカルボキシベタイン基を含有するアクリレート、アクリルアミド、ビニル化合物、エポキシド等をモノマーとして、(a)基材表面にラジカル開始剤を末端に持つ単分子層を形成すること;及び(b)ラジカル開始剤を末端に持つ単分子層上で、上記モノマーを重合することにより、スルホベタイン又はカルボキシベタイン材料の単分子層を含む超低汚損表面を有する基材を提供する。この基材は、前記表面が約1nm2より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。
【選択図】なし
【解決手段】スルホベタイン又はカルボキシベタイン基を含有するアクリレート、アクリルアミド、ビニル化合物、エポキシド等をモノマーとして、(a)基材表面にラジカル開始剤を末端に持つ単分子層を形成すること;及び(b)ラジカル開始剤を末端に持つ単分子層上で、上記モノマーを重合することにより、スルホベタイン又はカルボキシベタイン材料の単分子層を含む超低汚損表面を有する基材を提供する。この基材は、前記表面が約1nm2より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。
【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本願は、2005年8月25日に出願した米国仮特許出願60/711,613号(これは、その全体が参考として本明細書に援用される。)の利益を主張する。
本願は、2005年8月25日に出願した米国仮特許出願60/711,613号(これは、その全体が参考として本明細書に援用される。)の利益を主張する。
発明の背景
タンパク質吸着に対する表面抵抗は、船殻、移植生体材料、生物医学的診断およびセンサー、バイオ分離、および薬剤送達のためのコーティングなどの多くの適用にとって重要である。たとえば海洋生物汚損は、抵抗上昇による推進燃料の損失から速度および航続距離についての能力低下にまで及ぶ問題を導く。多くの親水性表面はタンパク質吸着を低下させることができる。しかし、これらの表面はしばしば、細胞、細菌または他の微生物の望ましくない付着を予防するのに十分ではない。表面上の少量のタンパク質でさえも、望ましくない汚損の付着と伝搬を導き得る。たとえば血液適合性のために血小板接着を阻止するには5−10ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着が必要であり、これらの適用のために超低汚損表面が求められる。汚損防止材料は、これらの材料で被覆した表面から非特異的タンパク質吸着を予防する能力を有する。タンパク質吸着および細胞/微生物付着に対する表面または材料抵抗は、海洋用途、卓越した適合性を有する生体材料、および高い特異性を備えたバイオセンサーのための環境に優しい抗汚損または非汚損塗料の開発にとって決定的に重要である。
タンパク質吸着に対する表面抵抗は、船殻、移植生体材料、生物医学的診断およびセンサー、バイオ分離、および薬剤送達のためのコーティングなどの多くの適用にとって重要である。たとえば海洋生物汚損は、抵抗上昇による推進燃料の損失から速度および航続距離についての能力低下にまで及ぶ問題を導く。多くの親水性表面はタンパク質吸着を低下させることができる。しかし、これらの表面はしばしば、細胞、細菌または他の微生物の望ましくない付着を予防するのに十分ではない。表面上の少量のタンパク質でさえも、望ましくない汚損の付着と伝搬を導き得る。たとえば血液適合性のために血小板接着を阻止するには5−10ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着が必要であり、これらの適用のために超低汚損表面が求められる。汚損防止材料は、これらの材料で被覆した表面から非特異的タンパク質吸着を予防する能力を有する。タンパク質吸着および細胞/微生物付着に対する表面または材料抵抗は、海洋用途、卓越した適合性を有する生体材料、および高い特異性を備えたバイオセンサーのための環境に優しい抗汚損または非汚損塗料の開発にとって決定的に重要である。
伝統的に、海洋用途のための最良の汚損防止コーティングはTBT(トリブチルチン)ベースの塗料である。特に沿岸河口やマリーナなどの水交換率の低い領域で、非標的海洋生物へのTBTの作用に対する環境的懸念の高まりにより、米国を含む多くの国々でTBT汚損防止コーティングが制限されてきた。現在の市場におけるTBT不含の汚損防止塗料は、銅粒子または酸化第一銅などの非スズ系殺生物剤に基づく。これらの塗料は銅を水中に浸出させるので、これらの殺生物剤は海洋環境に有害であり、それらの適用は大きく制限されている。非毒性の汚損除去シリコーンおよびフッ素化コーティングが現在開発中である。しかし、これらのコーティングは高速で移動する船舶に対してのみ有効である。汚損は静的構造または陸地に近い海水中を緩やかに移動する船で最も容易に起こるので、これらのコーティングの適用は極度に制限される。海洋微生物が付着しない、環境に優しい汚損防止コーティングが求められている。
様々なポリマーが生物医学分野において生体適合性材料として使用されてきた。しかし、ごくわずかな候補物質だけが「非汚損材料」または「超低汚損材料」とみなされている。ポリ(エチレングリコール)(PEG)に基づく材料が最も一般的に使用される非汚損材料である。PEGまたはオリゴ(エチレングリコール)(OEG)改変表面は、非特異的タンパク質吸着に抗するために広範に検討されてきた。立体排除効果は、PEGポリマーがタンパク質吸着に耐性である理由の1つとみなされた。OEG自己組織化単分子層(SAM)の試験は、タンパク質吸着に対する表面抵抗のためにはOEG鎖の適切な表面密度が必要であり、OEG鎖の周囲の密接に結合した水層が主として大きな反発水和力の原因であることを示す。しかし、PEGまたはOEG基は、特に酸素と遷移金属イオンの存在下で、比較的速やかに自己酸化し、最も生化学的に関連する溶液は遷移金属イオンを含む。また、グラフトPEGブラシは室温でタンパク質耐性を示すが、35℃以上ではタンパク質反発特性を失う。PEG以外の選択的非汚損材料を探索することは非常に興味深い。
ホスホリルコリン(PC)に基づくポリマーまたは表面は、タンパク質吸着を低下させることが示された。それらは、細胞膜の外側で認められる、ホスホリルコリン頭部を含むので、バイオミメティック汚損耐性材料とみなされる。ホスホリルコリン(PC)に基づく材料に関する研究の大部分は、MPC−co−BMA(ブチルメタクリレート)などの、側鎖に位置するPC基とのメタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)ベースのコポリマーに関してである。MPCベースのコポリマーはコンタクトレンズにおいて商業的に使用されてきた。選択的アプローチは、金上でPC末端の自己組織化単分子層(SAM)を形成することである。メチル末端SAM上のものに関してML(単分子層)の18%という低いフィブリノゲン吸着が報告された。PCベースの材料の水和作用も、タンパク質吸着に対するそれらの耐性の理由であると思われる。しかし、ホスホエステル基は加水分解を受けやすく、また2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)などのPCモノマーは水分感受性であって、合成や取り扱いが容易ではない。長期的な材料安定性を必要とする適用のためにPC以外の新しい材料を開発することが望ましい。
ホスホリルコリンに基づくポリマーと同様に、スルホベタインポリマーは、カチオンおよびアニオン基の両方が同じモノマー残基上に存在する、ポリベタインポリマーに属する。MPCと比較して、スルホベタインメタクリレート(SBMA)はより合成しやすく、取り扱いも容易である。しかし、SBMAポリマーはPCポリマーよりも汚損耐性ではないと思われた。SBMAポリマーの過去の試験の大部分は、それらを基材に結合するためまたは機械的強度を与えるために他の疎水性モノマーとのコポリマーに集中していたが、汚損防止材料または生体適合性材料としてのスルホベタインの潜在的可能性は過小評価されてきた。
セグメント化ポリウレタン(SPU)は、その優れた機械的性質のゆえに、特に心臓血管装置において、広く使用される生体適合材料の1つである。一連の試験は、表面グラフト化、高分子ブレンドまたは相互侵入高分子網目(IPN)によるMPCベースのポリマーとのその生体適合性の改善に関して報告した。Ishiharaと共同研究者達は、もとのSPUと比較して安定な架橋網目を形成し、血小板付着を有効に低減するMPC/SPUフィルムの広汎な試験を実施した。非特許文献1(Morimoto,K.ら、Biomaterials 23:4881−87,2002);非特許文献2(Morimoto,K.ら、Biomaterials 25:5353−61,2004)。MPCモノマーの水分感受性のゆえに、超低汚損特性を有するMPC/SPUフィルム以外の新しいSPUベースの材料を開発することが望ましい。
それゆえ、超低汚損材料に対する需要が存在する。このように、超低汚損材料は、船殻、移植生体材料、生物医学的診断センサー、および薬剤送達のためのコーティングにおいて有用な超低汚損表面を作製するときに使用できる。これらや他の目的が以下に述べる本発明によって達成される。
Morimoto,K.ら、Biomaterials 23:4881−87,2002
Morimoto,K.ら、Biomaterials 25:5353−61,2004
発明の要旨
本発明は、超低汚損スルホベタインおよびカルボキシベタイン材料、超低汚損スルホベタインおよびカルボキシベタイン材料で被覆した超低汚損表面および表面を作製する方法、および超低汚損表面を有する装置を提供する。
本発明は、超低汚損スルホベタインおよびカルボキシベタイン材料、超低汚損スルホベタインおよびカルボキシベタイン材料で被覆した超低汚損表面および表面を作製する方法、および超低汚損表面を有する装置を提供する。
1つの態様では、本発明は、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料で被覆した表面を有する基材を提供する。基材は、少なくともその上にスルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を有する表面を有する。表面は約1nm2より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。1つの実施形態では、表面は約10ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。1つの実施形態では、表面は約5ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。1つの実施形態では、表面は約0.3ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。
1つの実施形態では、スルホベタイン材料はポリ(スルホベタイン)である。スルホベタイン材料は、スルホベタインアクリレート、スルホベタインアクリルアミド、スルホベタインビニル化合物、スルホベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択される1またはそれ以上のモノマーから製造できる。1つの実施形態では、モノマーはスルホベタインメタクリレートである。
1つの実施形態では、カルボキシベタイン材料はポリ(カルボキシベタイン)である。カルボキシベタイン材料は、カルボキシベタインアクリレート、カルボキシベタインアクリルアミド、カルボキシベタインビニル化合物、カルボキシベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択される1またはそれ以上のモノマーから製造できる。1つの実施形態では、モノマーはカルボキシベタインメタクリレートである。
1つの実施形態では、スルホベタイン材料は、ポリ(スルホベタイン)を含むジブロックコポリマーである。1つの実施形態では、ジブロックコポリマーはポリ(プロピレンオキシド)を含む。
1つの実施形態では、スルホベタイン材料は相互侵入高分子網目である。1つの実施形態では、カルボキシベタイン材料は相互侵入高分子網目である。相互侵入高分子網目は、ポリウレタン、シリコーン、ポリエステル、ポリエチレンおよびポリアミドから成る群より選択されるポリマーを含み得る。
1つの実施形態では、スルホベタイン材料は、ポリ(スルホベタイン)またはポリ(カルボキシベタイン)の少なくとも1つを含む高分子ブレンドである。
もう1つの態様では、本発明は、表面に共有結合した層(たとえば単分子層)に結合したスルホベタインまたはカルボキシベタインポリマーで被覆された表面を有する基材を提供する。1つの実施形態では、スルホベタインまたはカルボキシベタインポリマーは単分子層に共有結合される。1つの実施形態では、単分子層は自己組織化単分子層である。1つの実施形態では、ポリマーはポリ(スルホベタイン)である。もう1つの実施形態では、ポリマーはポリ(カルボキシベタイン)である。1つの実施形態では、基材は、表面の単分子層を形成する固定化化合物に共有結合したスルホベタインまたはカルボキシベタインポリマーを含む表面を有する。
本発明のもう1つの態様では、架橋ポリマーヒドロゲルが提供される。1つの実施形態では、ヒドロゲルは架橋ポリ(スルホベタイン)ヒドロゲルである。もう1つの実施形態では、ヒドロゲルは架橋ポリ(カルボキシベタイン)ヒドロゲルである。
さらなる態様では、本発明は、低汚損表面を作製するための方法を提供する。1つの実施形態では、その方法は、(a)基材表面にラジカル開始剤を末端に持つ単分子層を形成すること;および(b)ラジカル開始剤を末端に持つ単分子層上で、スルホベタインまたはカルボキシベタインであるモノマーを重合することを含む。モノマーは、スルホベタインアクリレート、スルホベタインアクリルアミド、スルホベタインビニル化合物、スルホベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択できるか、またはカルボキシベタインアクリレート、カルボキシベタインアクリルアミド、カルボキシベタインビニル化合物、カルボキシベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択できる。1つの実施形態では、単分子層は自己組織化単分子層である。
1つの実施形態では、前記方法は、(a)基材表面に、末端にヒドロキシ基を有する単分子層を形成すること;(b)ヒドロキシ末端単分子層を、ラジカル開始剤を末端に持つ単分子層に変換すること;および(c)ラジカル開始剤単分子層上でモノマーを重合することを含む。前記モノマーは、上述したようなスルホベタインまたはカルボキシベタインであり得、単分子層は自己組織化単分子層であり得る。
もう1つの実施形態では、前記方法は、(a)基材表面に、末端にアルキル基を有する単分子層を形成すること;(b)末端にアルキル基を有する単分子層を第一ジブロックコポリマーで処理すること;および(c)末端にアルキル基を有する単分子層を第二ジブロックコポリマーで処理することを含む。1つの実施形態では、第一ジブロックコポリマーは、[疎水性モノマー]l−ブロック−[親水性モノマー]mコポリマーを含む。1つの実施形態では、第一ジブロックコポリマーは、[プロピレンオキシド]l−ブロック−[スルホベタインメタクリレート]mコポリマーを含む。1つの実施形態では、第二ジブロックコポリマーは、[疎水性モノマー]l−ブロック−[親水性モノマー]nコポリマーを含む。1つの実施形態では、第二ジブロックコポリマーは、[プロピレンオキシド]l−ブロック−[スルホベタインメタクリレート]nコポリマーを含む。これらのポリマーに関して、lは10−30の整数であり、mは10−100の整数であり、nは10−50の整数であり、およびmはnより大きい。
低汚損表面を作製するために有用な新規ブロックコポリマーも提供される。
本発明の他の態様では、低汚損表面を有する装置および材料が提供される。装置および材料は、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の少なくとも1つの単分子層を含み、約1nm2より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する表面を有する。代表的な装置および材料は、移植可能材料、コンタクトレンズ、インビボセンサー、船殻、組織スカフォールド、埋め込み型医療装置、膜、非ウイルス性遺伝子送達担体、粒子および塗料を含む。1つの実施形態では、本発明は、低汚損表面を有する粒子を含む塗料で被覆された船殻を提供し、前記表面は、ルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の少なくとも1つの単分子層を含み、約1nm2より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含む表面を有する基材であって、前記表面が約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、前記基材。
(項目2)
前記表面が約10ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、項目1に記載の基材。
(項目3)
前記表面が約5ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、項目1に記載の基材。
(項目4)
前記表面が約0.3ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、項目1に記載の基材。
(項目5)
前記スルホベタイン材料がポリ(スルホベタイン)である、項目1に記載の基材。
(項目6)
前記スルホベタイン材料が、スルホベタインアクリレート、スルホベタインアクリルアミド、スルホベタインビニル化合物、スルホベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択される1またはそれ以上のモノマーから調製される、項目1に記載の基材。
(項目7)
前記モノマーがスルホベタインメタクリレートである、項目6に記載の基材。
(項目8)
前記カルボキシベタイン材料がポリ(カルボキシベタイン)である、項目1に記載の基材。
(項目9)
前記カルボキシベタイン材料が、カルボキシベタインアクリレート、カルボキシベタインアクリルアミド、カルボキシベタインビニル化合物、カルボキシベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択される1またはそれ以上のモノマーから調製される、項目1に記載の基材。
(項目10)
前記モノマーがカルボキシベタインメタクリレートである、項目9に記載の基材。
(項目11)
前記スルホベタイン材料が、ポリ(スルホベタイン)を含むジブロックコポリマーである、項目1に記載の基材。
(項目12)
前記スルホベタイン材料が、ポリ(スルホベタインメタクリレート)およびポリ(プロピレンオキシド)を含むジブロックコポリマーである、項目1に記載の基材。
(項目13)
前記スルホベタイン材料が相互侵入高分子網目である、項目1に記載の基材。
(項目14)
前記相互侵入高分子網目が、ポリウレタン、シリコーン、ポリエステル、ポリエチレンおよびポリアミドから成る群より選択されるポリマーを含む、項目11に記載の基材。
(項目15)
前記カルボキシベタイン材料が相互侵入高分子網目である、項目1に記載の基材。
(項目16)
前記スルホベタイン材料が、ポリ(スルホベタイン)またはポリ(カルボキシベタイン)の少なくとも1つを含む高分子ブレンドである、項目1に記載の基材。
(項目17)
前記表面の単分子層を形成する固定化化合物に共有結合したスルホベタインまたはカルボキシベタインのポリマーを含む基材を有する基材。
(項目18)
架橋ポリ(スルホベタイン)ヒドロゲル。
(項目19)
架橋ポリ(カルボキシベタイン)ヒドロゲル。
(項目20)
(a)基材表面にラジカル開始剤を末端に持つ単分子層を形成すること;および
(b)該ラジカル開始剤を末端に持つ単分子層上で、スルホベタインまたはカルボキシベタインであるモノマーを重合すること
を含む、低汚損表面を作製するための方法。
(項目21)
前記モノマーが、スルホベタインアクリレート、スルホベタインアクリルアミド、スルホベタインビニル化合物、スルホベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択される、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記モノマーが、カルボキシベタインアクリレート、カルボキシベタインアクリルアミド、カルボキシベタインビニル化合物、カルボキシベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択される、項目20に記載の方法。
(項目23)
(a)基材表面に、末端にアルキル基を有する単分子層を形成すること;
(b)該末端にアルキル基を有する単分子層を第一ジブロックコポリマーで処理すること;および
(c)該末端にアルキル基を有する単分子層を第二ジブロックコポリマーで処理すること
を含む、低汚損表面を作製するための方法。
(項目24)
前記第一ジブロックコポリマーが[疎水性モノマー] l −ブロック−[親水性モノマー] m コポリマーを含み、前記第二ジブロックコポリマーが[疎水性モノマー] l −ブロック−[親水性モノマー] n コポリマーを含み、前記式中、lは10−30の整数であり、mは10−100の整数であり、nは10−50の整数であり、およびmはnより大きい、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記第一ジブロックコポリマーが[プロピレンオキシド] l −ブロック−[スルホベタインメタクリレート] m コポリマーを含み、前記第二ジブロックコポリマーが[プロピレンオキシド] l −ブロック−[スルホベタインメタクリレート] n コポリマーを含み、前記式中、lは10−30の整数であり、mは10−100の整数であり、nは10−50の整数であり、およびmはnより大きい、項目23に記載の方法。
(項目26)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する薬剤送達担体。
(項目27)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する移植可能材料。
(項目28)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有するコンタクトレンズ。
(項目29)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有するインビボセンサー。
(項目30)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する船殻。
(項目31)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する組織スカフォールド。
(項目32)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する移植可能な医療装置。
(項目33)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する膜。
(項目34)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する非ウイルス性遺伝子送達担体。
(項目35)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する粒子。
(項目36)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する粒子を含む塗料。
(項目37)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する粒子を含む塗料で被覆された船殻。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含む表面を有する基材であって、前記表面が約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、前記基材。
(項目2)
前記表面が約10ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、項目1に記載の基材。
(項目3)
前記表面が約5ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、項目1に記載の基材。
(項目4)
前記表面が約0.3ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、項目1に記載の基材。
(項目5)
前記スルホベタイン材料がポリ(スルホベタイン)である、項目1に記載の基材。
(項目6)
前記スルホベタイン材料が、スルホベタインアクリレート、スルホベタインアクリルアミド、スルホベタインビニル化合物、スルホベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択される1またはそれ以上のモノマーから調製される、項目1に記載の基材。
(項目7)
前記モノマーがスルホベタインメタクリレートである、項目6に記載の基材。
(項目8)
前記カルボキシベタイン材料がポリ(カルボキシベタイン)である、項目1に記載の基材。
(項目9)
前記カルボキシベタイン材料が、カルボキシベタインアクリレート、カルボキシベタインアクリルアミド、カルボキシベタインビニル化合物、カルボキシベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択される1またはそれ以上のモノマーから調製される、項目1に記載の基材。
(項目10)
前記モノマーがカルボキシベタインメタクリレートである、項目9に記載の基材。
(項目11)
前記スルホベタイン材料が、ポリ(スルホベタイン)を含むジブロックコポリマーである、項目1に記載の基材。
(項目12)
前記スルホベタイン材料が、ポリ(スルホベタインメタクリレート)およびポリ(プロピレンオキシド)を含むジブロックコポリマーである、項目1に記載の基材。
(項目13)
前記スルホベタイン材料が相互侵入高分子網目である、項目1に記載の基材。
(項目14)
前記相互侵入高分子網目が、ポリウレタン、シリコーン、ポリエステル、ポリエチレンおよびポリアミドから成る群より選択されるポリマーを含む、項目11に記載の基材。
(項目15)
前記カルボキシベタイン材料が相互侵入高分子網目である、項目1に記載の基材。
(項目16)
前記スルホベタイン材料が、ポリ(スルホベタイン)またはポリ(カルボキシベタイン)の少なくとも1つを含む高分子ブレンドである、項目1に記載の基材。
(項目17)
前記表面の単分子層を形成する固定化化合物に共有結合したスルホベタインまたはカルボキシベタインのポリマーを含む基材を有する基材。
(項目18)
架橋ポリ(スルホベタイン)ヒドロゲル。
(項目19)
架橋ポリ(カルボキシベタイン)ヒドロゲル。
(項目20)
(a)基材表面にラジカル開始剤を末端に持つ単分子層を形成すること;および
(b)該ラジカル開始剤を末端に持つ単分子層上で、スルホベタインまたはカルボキシベタインであるモノマーを重合すること
を含む、低汚損表面を作製するための方法。
(項目21)
前記モノマーが、スルホベタインアクリレート、スルホベタインアクリルアミド、スルホベタインビニル化合物、スルホベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択される、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記モノマーが、カルボキシベタインアクリレート、カルボキシベタインアクリルアミド、カルボキシベタインビニル化合物、カルボキシベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択される、項目20に記載の方法。
(項目23)
(a)基材表面に、末端にアルキル基を有する単分子層を形成すること;
(b)該末端にアルキル基を有する単分子層を第一ジブロックコポリマーで処理すること;および
(c)該末端にアルキル基を有する単分子層を第二ジブロックコポリマーで処理すること
を含む、低汚損表面を作製するための方法。
(項目24)
前記第一ジブロックコポリマーが[疎水性モノマー] l −ブロック−[親水性モノマー] m コポリマーを含み、前記第二ジブロックコポリマーが[疎水性モノマー] l −ブロック−[親水性モノマー] n コポリマーを含み、前記式中、lは10−30の整数であり、mは10−100の整数であり、nは10−50の整数であり、およびmはnより大きい、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記第一ジブロックコポリマーが[プロピレンオキシド] l −ブロック−[スルホベタインメタクリレート] m コポリマーを含み、前記第二ジブロックコポリマーが[プロピレンオキシド] l −ブロック−[スルホベタインメタクリレート] n コポリマーを含み、前記式中、lは10−30の整数であり、mは10−100の整数であり、nは10−50の整数であり、およびmはnより大きい、項目23に記載の方法。
(項目26)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する薬剤送達担体。
(項目27)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する移植可能材料。
(項目28)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有するコンタクトレンズ。
(項目29)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有するインビボセンサー。
(項目30)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する船殻。
(項目31)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する組織スカフォールド。
(項目32)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する移植可能な医療装置。
(項目33)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する膜。
(項目34)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する非ウイルス性遺伝子送達担体。
(項目35)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する粒子。
(項目36)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する粒子を含む塗料。
(項目37)
前記表面が、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm 2 より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm 2 未満のフィブリノゲン吸着を有する、低汚損表面を有する粒子を含む塗料で被覆された船殻。
本発明の前記態様および付随する利点の多くは、添付の図面と合わせて、以下の詳細な説明を参照することによってよりよく理解され、より容易に認識される。
図1は、表面(金)に開始剤を末端に持つ自己組織化単分子層(SAM)を製造するための2つの方法(1工程および2工程法)の略図である;
図2は、本発明に従った表面開始原子移動ラジカル重合(ATRP)によって代表的ポリ(スルホベタイン)材料で被覆した表面を製造するための方法の略図である;
図3は、本発明に従って相互侵入高分子網目(IPN)フィルムを製造するための方法の略図である:(a)20℃でジメチルアセトアミド(DMA)からの溶媒蒸発によってセグメント化ポリウレタン(SPU)フィルムを作製する;(b)20℃にてスルホベタインメタクリレート(SBMA)モノマー、2−ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)モノマー、GDGDA架橋剤および光開始剤を含むメタノール溶液中でSPUフィルムをインキュベートする;(c)可視光での光重合;(d)SPU/ポリ(SBMA)のIPNを提供する;
図4は、本発明に従って表面開始原子移動ラジカル重合(ATRP)により代表的ポリ(カルボキシベタイン)(CBMA)で被覆した表面を作製するための方法の略図である;
図5Aおよび5Bは、表面プラズモン共鳴(SPR)測定(時間の関数としての波長シフト)によって得た本発明の代表的表面(ポリ(スルホベタイン)被覆表面)へのフィブリノゲンの吸着を比較するグラフである:図5Aは、裸金表面(裸金)、固定化開始剤1を有する金表面(Br−SAM)、およびポリ(SBMA)でグラフト化した表面への、PBS緩衝液(0.15M、pH7.4)中の1mg/mLフィブリノゲンの吸着を示す(SBMA7.5mmol、ビピリジン(BPY)2mmolおよびCuBr 1mmolを含むCH3OH/H2O 25mL中に1時間液浸したBr−SAM表面での重合によって作製した、表面重合後、SPRの1mmの波長シフトは0.15mg/m2吸着タンパク質に等しい);
図5Aおよび5Bは、表面プラズモン共鳴(SPR)測定(時間の関数としての波長シフト)によって得た本発明の代表的表面(ポリ(スルホベタイン)被覆表面)へのフィブリノゲンの吸着を比較するグラフである:図5Bは、本発明の代表的表面(ポリ(スルホベタイン)被覆表面)への、PBS緩衝液(0.15M、pH7.4)中の1mg/mLフィブリノゲンの吸着を示す;
図6は、結合開始剤を有する(1)および結合開始剤を有さない(2)、本発明の代表的表面(ポリ(スルホベタイン)被覆表面)へのフィブリノゲン吸着のSPRセンサーグラム(時間の関数として波長シフトを示すグラフ)である(2つの基材は、CH3OH/H2O 25mL中のSBMA2.0mmol、BPY0.1mmolおよびCuBr0.05mmolとの重合のために17時間同じ反応器内に入れた;
図7は、金基材上の開始剤1 SAMのタッピング方式原子間力顕微鏡(TM−AFM)画像である(走査範囲:1μm×1μm)(表面は、10mM開始剤1溶液中で24時間調製し、その後エタノールとTHFで洗った);
図8は、SBMA濃度および重合時間の関数としての本発明の代表的表面のポリマーフィルムの厚さおよびフィブリノゲン吸着を比較するグラフである:ポリ(SBMA)の厚さは偏光解析法によって測定し(黒い記号)、フィブリノゲン吸着はSPRによって測定しており(白い記号)(0.1M SBMA重合に関して:CH3OH/H2O 25mL中SBMA2.5mmol、BPY1mmolおよびCuBr0.05mmol;0.3M SBMA重合に関して:CH3OH/H2O 25mL中SBMA7.5mmol、BPY2mmolおよびCuBr1mmol)、報告する%ML(単分子層)フィブリノゲン吸着はCH3SAMへの吸着である。
図9は、本発明の代表的ブロックコポリマーの製造の略図である:(a)20℃での、THF中の2−ブロモイソブチリルとモノヒドロキシキャップポリプロピレンオキシド(PPO)の反応、および(b)20℃での、メタノール中のATRPによるPPOとSBMAのブロック共重合;
図10は、本発明の代表的ブロックコポリマー、PO20−SBMA35ジブロックコポリマーの1H NMRスペクトル(D2O)である;
図11は、基材表面への本発明の代表的コポリマー、PO20−SBMA20(コポリマーA)の吸着、それに続くフィブリノゲン吸着のインサイチュー評価を示すSPRセンサーグラムである;
図12は、20℃でATRPによって製造した本発明の3つの代表的コポリマー、PPO−b−ポリ(SBMA)ジブロックコポリマーのための水性ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)曲線(ポリエチレングリコール参照):コポリマーA、Mn=6490、Mw/Mn=1.232;コポリマーB、Mn=11183、Mw/Mn=1.255;およびコポリマーC、Mn=15114、Mw/Mn=1.353;
図13は、25℃で、本発明の3つの代表的コポリマー(コポリマーA、BおよびC)に関する溶液中のPPO−b−ポリ(SBMA)濃度(Cppo−b−ポリ(SBMA))の関数として、物理的に吸着させたPPO−b−ポリ(SBMA)で被覆した表面へのフィブリノゲン吸着(SPR測定値)を示すグラフである;
図14は、Cppo−b−ポリ(SBMA)=1.0mg/mlにて、本発明の代表的コポリマーで被覆した表面への25℃でのフィブリノゲン吸着に関するSPRセンサーグラムである(A;コポリマーA、B:コポリマーB、C:コポリマーC、C+A:コポリマーAで埋め戻した(backfilled)コポリマーC)(各々についての最終SPR波長シフトをカッコ内に示す、SPR応答の1nmの波長シフトは15ng/cm2吸着タンパク質に等しい);
図15は、CH3末端SAM表面へのコポリマーCの吸着、および高いポリ(スルホベタイン)表面密度とタンパク質吸着への高い耐性を達成するためのコポリマーAによる埋め戻しを示す略図である;
図16は、本発明の代表的表面(コポリマーA被覆表面)へのいくつかのタンパク質(フィブリノゲン、ウシ血清アルブミン(BSA)およびリゾチーム)の吸着を示すSPRセンサーグラムである(各々についての最終波長シフトをカッコ内に示す、SPR応答の1nmの波長シフトは15ng/cm2吸着タンパク質に等しい);
図17は、タンパク質吸着を比較する棒グラフである(ガラス上の代表的ポリ(スルホベタイン)材料に関して固相酵素免疫検定法(ELISA)によって測定した:ATRPによって作製したポリ(スルホベタイン)(SBMA ATRP);本発明の代表的ポリ(スルホベタイン)ヒドロゲル(SBMAヒドロゲル)、代表的ポリ(スルホベタイン)コーティング(SBMAコーティング)、および比較用エポキシプライマーコーティング(エポキシプライマー);
図18は、実施例5で述べるように作製した、非被覆ガラス(ガラス)、エポキシプライマーコーティング(Ref)、本発明の代表的ポリ(スルホベタイン)/エポキシ被覆表面(ガラス)(SBMA/エポキシコーティング)、およびATRPによって作製したポリ(スルホベタイン)(SBMA ATRP)への、時間(1、3および6時間)の関数としてのUlva胞子付着を比較する棒グラフである;
図19Aおよび19Bは、本発明の代表的ポリ(スルホベタイン)/エポキシ被覆表面(図19B)およびエポキシプライマー被覆表面(図19A)での発芽胞子(sporelings)の成長を比較する;
図20A−20Cは、スライドガラスの中心部への水ジェット噴霧器からの200kPa水圧への暴露後、ガラス(図20A)、エポキシプライマー被覆表面(図20B)、および本発明の代表的ポリ(スルホベタイン)/エポキシ被覆表面(図20C)への発芽胞子の付着強度を比較する;
図21は、本発明の代表的ポリ(スルホベタイン)/エポキシ被覆表面(ガラス)(SBMA/エポキシコーティング)およびバイオフィルム(生物膜)対照標準(バイオフィルム)上に残存する幼若H.elegansの平均パーセンテージを比較する棒グラフであり、コーティングを100Paに等しい壁せん断応力に4分間暴露した。
図22は、ポリスチレン(PS)を対照標準としてELISAから判定した様々な材料表面への相対的ヒトフィブリノゲン吸着を示すグラフである:SPU(非改変)、セグメント化ポリウレタンフィルム;IPN−I、70mol%のSBMAモノマー比、1.0mol/Lのインキュベーション濃度を含むメタノール溶液中、20℃で24時間、SPUフィルムをインキュベートすることによって作製したIPNフィルム;IPN−II、70mol%のSBMAモノマー比、2.0mol/Lのインキュベーション濃度および90容積%のメタノールと5容積%の水の混合溶媒を含む溶液中、20℃で24時間、SPUフィルムをインキュベートすることによって作製したIPNフィルム;HEMAヒドロゲル、2−ヒドロキシエチルメタクリレートヒドロゲル;およびSBMAヒドロゲル、本発明の代表的ポリ(スルホベタイン)ヒドロゲル(スルホベタインメタクリレート);
図23Aは、20℃にて0.5mol/Lのインキュベーション濃度および70mol%のSBMAモノマー比で、3つの溶媒:メタノール(○);1:1容積比の混合エタノール/メタノール(△);および1:1容積比の混合イソプロパノール/メタノール(□)に関するインキュベーション時間の関数としての本発明の代表的相互侵入高分子網目への相対的タンパク質吸着を比較するグラフである;
および図23Bは、対応するIPNフィルムに対するSPUフィルムの膨潤比を比較するグラフである;
図24は、20℃で24時間の、70mol%のSBMAモノマー比を有するメタノール溶液中のインキュベーション濃度の関数としての本発明の代表的相互侵入高分子網目への相対的タンパク質吸着を比較するグラフである;
図25Aは、20℃にて70mol%のSBMAモノマー比および0.5mol/Lまたは1.0mol/Lのインキュベーション濃度を有するメタノール溶液中でのインキュベーション時間の関数としての本発明の代表的相互侵入高分子網目への相対的タンパク質吸着を比較するグラフである;および
図25Bは、対応するドライIPNフィルムの膨潤比と重量増加を比較するグラフである;
図26は、20℃で24時間の1mol/lのインキュベーション濃度で、SBMAモノマー比(mol%)の関数としての本発明の代表的相互侵入高分子網目への相対的タンパク質吸着を比較するグラフである;
図27は、非改変SPUフィルムのスペクトルに対して、表面から0および20μmのIPN−Iフィルムについてのラマンスペクトルを比較する;
図28は、表面プラズモン共鳴(SPR)測定(時間の関数としての波長シフト)によって得た本発明の代表的表面(ポリ(カルボキシベタイン)被覆表面)へのいくつかのタンパク質(フィブリノゲン、リゾチームおよびhCG)の吸着を比較するグラフである:PBS(150mM、pH7.4)からの1mg/mLフィブリノゲン、1mg/mLリゾチームおよび20μg/mLの吸着;
図29は、本発明の代表的表面、ポリ(スルホベタイン)またはポリ(カルボキシベタイン)被覆表面を提供するために開始剤でシラン化したガラス表面からのATRPによる表面グラフト化を作製するための方法の略図である;
図30A−30Dは、10%ウシ胎仔血清(FBS)中の組織培養ポリスチレン(TCPS)(図30Aおよび30B)および本発明の代表的ポリ(スルホベタイン)ヒドロゲル(ポリ(SBMA)ヒドロゲル)(図30Cおよび30D)への内皮細胞付着を比較する画像であり、図30Aおよび30Cは1日後であり、図30Bおよび30Dは5日後である;
図30A−30Dは、10%ウシ胎仔血清(FBS)中の組織培養ポリスチレン(TCPS)(図30Aおよび30B)および本発明の代表的ポリ(スルホベタイン)ヒドロゲル(ポリ(SBMA)ヒドロゲル)(図30Cおよび30D)への内皮細胞付着を比較する画像であり、図30Aおよび30Cは1日後であり、図30Bおよび30Dは5日後である;および
図31は、本発明のポリ(カルボキシベタイン)材料を作製する上で有用なカルボキシベタインメタクリレート(CBMA)の化学構造および1H−NMRスペクトルの説明図である。
図31は、本発明のポリ(カルボキシベタイン)材料を作製する上で有用なカルボキシベタインメタクリレート(CBMA)の化学構造および1H−NMRスペクトルの説明図である。
発明の詳細な説明
本発明は、低汚損表面、低汚損表面を作製する上で有用な材料、低汚損表面を作製するための方法、および低汚損表面を使用するための方法を提供する。低汚損表面はスルホベタインおよびカルボキシベタイン材料を含む。
本発明は、低汚損表面、低汚損表面を作製する上で有用な材料、低汚損表面を作製するための方法、および低汚損表面を使用するための方法を提供する。低汚損表面はスルホベタインおよびカルボキシベタイン材料を含む。
本発明は、超低汚損表面を提供する。ここで使用する、「低汚損表面」および「超低汚損表面」という用語は、タンパク質吸着に耐性である表面を指す。タンパク質吸着に耐性である超低汚損表面はまた、細胞付着、細菌および他の微生物の付着、およびバイオフィルム形成に対しても耐性である。
本発明の超低汚損表面は、表面を超低汚損にする1またはそれ以上の物質で処理された表面である。超低汚損表面を与えるために表面を処理するのに有用な適切な物質は、両性イオン物質を含む。両性イオン物質は、典型的には等量の正電荷と負電荷を含む電気的に中性の物質である。本発明の超低汚損表面を作製する上で有用な代表的両性イオン物質は、スルホベタイン材料(硫酸の負電荷とアンモニウムの正電荷)およびカルボキシベタイン材料(カルボキシの負電荷とアンモニウムの正電荷)を含む。
1つの態様では、本発明は、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料で被覆された表面を有する基材を提供する。基材は、その上にスルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を備えた表面を有する。表面は、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の少なくとも1つの完全な単分子層で被覆される。単分子層は自己組織化単分子層であり得る。
本発明の表面の利点は、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の十分に制御された密度から生じる。表面被覆材料の十分に制御された密度は本発明の表面の特徴である。被覆材料の十分に制御された密度は表面に低汚損特性を与える。ここで使用する、「十分に制御された密度」という用語は、被覆材料の少なくとも1つの完全な単分子層で被覆され、実質的に欠陥がない(すなわち単一欠陥が約1nm2を超えない)表面を表わす。ここで使用する、「欠陥」という用語は、非汚損被覆材料(たとえば非汚損基)で覆われていない表面上の領域と定義される。一般に、表面上に物質の層が存在するとき、欠陥の大きさはタンパク質吸着に対する表面の耐性に関連する:欠陥のサイズが小さいほどタンパク質耐性が大きい。十分に制御された密度を有する本発明の代表的超低汚損表面は、単一欠陥が約1nm2を超えない(すなわち各々の単一欠陥が約1nm2未満である)、欠陥を含む。
本発明の超低汚損表面は、スルホベタインまたはカルボキシベタイン被覆材料の十分に制御された密度を有する。本発明の表面はタンパク質吸着に対して耐性である。本発明のタンパク質吸着耐性の超低汚損表面の1つの尺度は、単位面積当たりの表面に吸着するフィブリノゲンの量である。本発明の表面は、約30ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。1つの実施形態では、表面は約10ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。1つの実施形態では、表面は約5ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。1つの実施形態では、表面は約0.3ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。
本発明の代表的低汚損表面は、約30ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。1つの実施形態では、スルホベタイン材料で被覆された表面は、約30ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。もう1つの実施形態では、スルホベタイン材料で被覆された表面は、約10ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。もう1つの実施形態では、スルホベタイン材料で被覆された表面は、約5ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。もう1つの実施形態では、スルホベタイン材料で被覆された表面は、約0.3ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。1つの実施形態では、カルボキシベタイン材料で被覆された表面は、約30ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。もう1つの実施形態では、カルボキシベタイン材料で被覆された表面は、約10ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。もう1つの実施形態では、カルボキシベタイン材料で被覆された表面は、約5ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。もう1つの実施形態では、カルボキシベタイン材料で被覆された表面は、約0.3ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する。
1つの実施形態では、スルホベタイン材料はポリ(スルホベタイン)である。スルホベタイン材料は、スルホベタインアクリレート、スルホベタインアクリルアミド、スルホベタインビニル化合物、スルホベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択される1またはそれ以上のモノマーから製造できる。
1つの実施形態では、カルボキシベタイン材料はポリ(カルボキシベタイン)である。カルボキシベタイン材料は、カルボキシベタインアクリレート、カルボキシベタインアクリルアミド、カルボキシベタインビニル化合物、カルボキシベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択される1またはそれ以上のモノマーから製造できる。
1つの実施形態では、スルホベタイン材料は、ポリ(スルホベタイン)を含むジブロックコポリマーである。1つの実施形態では、ジブロックコポリマーはポリ(プロピレンオキシド)を含む。
1つの実施形態では、スルホベタイン材料は相互侵入高分子網目である。1つの実施形態では、カルボキシベタイン材料は相互侵入高分子網目である。相互侵入高分子網目は、ポリウレタン、シリコーン、ポリエステル、ポリエチレンおよびポリアミドから成る群より選択されるポリマーを含み得る。
1つの実施形態では、スルホベタイン材料は、ポリ(スルホベタイン)またはポリ(カルボキシベタイン)の少なくとも1つを含む高分子ブレンドである。
ここで述べる材料と方法を用いて様々な表面を超低汚損にし得る。超低汚損にすることができる代表的表面は、金属および金属酸化物表面、セラミック表面、合成および天然高分子表面、ガラス表面、ガラス繊維表面、シリコーン/シリカ表面、および炭素系材料の表面を含む。代表的な天然高分子表面は、コラーゲン、フィブリン、および組織工学の使用に適する他の炭水化物表面を含む。代表的な炭素系材料表面は、炭素繊維、ナノチューブ、およびかさの高い球体(bulky ball)表面を含む。
本発明のもう1つの態様では、超低汚損表面を作製するために有用な材料が提供される。適切な材料は、表面適用したとき(たとえば表面に共有結合するまたは表面に物理的に吸着させる)、表面をタンパク質吸着耐性にする、両性イオン物質を含む。
ここで使用する、「高分子ブレンド」という用語は、密接に組み合わされた構造的にまたは立体は位置的に異なる特徴を有する2またはそれ以上の高分子鎖を指す。2またはそれ以上の高分子は、高分子ブレンドを形成するための物理的に混合される。
代表的両性イオン材料は、両性イオンモノマーから誘導される高分子を含む。本発明において有用である適切な材料は、スルホベタインポリマーおよびカルボキシベタインポリマーを含む。スルホベタインポリマーはスルホベタイン単位を含み、反応性スルホベタインモノマーを適切に重合することによって作製できる。カルボキシベタインポリマーは、カルボキシベタイン単位を含み、反応性カルボキシベタインモノマーを適切に重合することによって作製できる。
本発明の表面は、スルホベタインおよびカルボキシベタインポリマー材料で被覆される。
スルホベタインポリマー
スルホベタインポリマーを、原子移動ラジカル重合(ATRP)を通して開始剤を末端に有する層(たとえば自己組織化単分子層などの単分子層)にグラフト化する。開始剤を末端に有する層で基材表面を被覆する。次に、スルホベタインモノマーを前記層に重合して、基材表面にスルホベタインポリマーコーティングの層を形成する。層の末端のラジカル開始剤によって原子移動ラジカル重合が開始される。
スルホベタインポリマーを、原子移動ラジカル重合(ATRP)を通して開始剤を末端に有する層(たとえば自己組織化単分子層などの単分子層)にグラフト化する。開始剤を末端に有する層で基材表面を被覆する。次に、スルホベタインモノマーを前記層に重合して、基材表面にスルホベタインポリマーコーティングの層を形成する。層の末端のラジカル開始剤によって原子移動ラジカル重合が開始される。
1つの実施形態では、スルホベタインポリマーは、原子移動ラジカル重合(ATRP)を通して開始剤を末端に有する自己組織化単分子層(SAM)からグラフト化される。ラジカル開始剤を末端に有するSAMで基材表面を被覆する。次に、スルホベタインモノマーをSAMに重合して、基材表面にスルホベタインポリマーコーティングの層を形成する。SAMの末端のラジカル開始剤によって原子移動ラジカル重合が開始される。
ラジカル末端SAMは、1工程または2工程法によって形成できる。1工程法では、開始剤SAMは、ラジカル開始剤を末端に有する分子を、共有結合または非共有結合を通して表面に結合することによって形成される。2工程法では、官能基を末端に有するSAMは、官能基を末端に有する分子を、共有結合または非共有結合を通して表面に結合することによって形成される。官能基を末端に有するSAMを、その後、化学反応によって開始剤を末端に有するSAMに変換する。固定化開始剤を有する表面へのスルホベタインモノマーの重合は、表面にスルホベタインポリマーの層を形成する。代表的な開始剤末端SAMおよびヒドロキシ末端SAMの合成を実施例1で述べ、図1に示す。開始剤被覆表面への代表的スルホベタインポリマーのグラフト化を実施例2で述べ、図2に示す。
超低汚損表面は、十分に制御された開始剤形成および生体重合手法の使用による基材表面からの高分子鎖の伸長後に達成される。代表的な方法は特定成分を有すると述べられているが、本発明の基材表面は様々な表面であり得ること、官能基末端SAMはラジカル開始剤への変換に適するいかなる官能基でもあり得ること、表面の開始剤末端SAMは様々なラジカル開始剤であり得ること、および本発明の被覆材料は様々なスルホベタインポリマーを含み得ることが認識される。
本発明を説明するときに使用する表面は、金被覆基材表面およびガラス表面を含む。他の表面も、本発明の表面を提供するために本発明の方法において使用できることが認識される。
図1に示すように、ATRP開始剤を基材表面に固定化するために2つの方法が使用できる。1つのアプローチは、開始剤を末端に有するチオールを調製し、チオールから基材表面に開始剤末端SAMを形成することである。他方のアプローチは、メルカプトアルコールから基材表面にヒドロキシル末端SAMを形成し、その後ヒドロキシル基とハロゲン化アルキルの反応によって開始剤基を表面にグラフト化する。ラジカル開始剤を末端に持つSAM表面への、スルホベタインモノマー、N−(3−スルホプロピル)−N−(メタクリルオキシエチル)−N,N−ジメチルアンモニウムベタイン(SBMA)の重合は、室温で実施することができ、反応媒質は水または他の極性溶媒であり得、生成物であるスルホベタインポリマーの分子量は制御可能である。
ATRPを通してSBMAを重合した後、タンパク質吸着は0.02nm未満(0.1%MLまたは0.3ng/cm2のフィブリノゲン吸着)に大きく低下した(図5A参照)。リゾチームおよびウシ血清アルブミン(BSA)吸着も表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定し、フィブリノゲン吸着と同様のレベルであることを認めた。この方法により、十分に制御されたポリ(SBMA)ブラシで被覆された超低汚損表面が実現された。ポリ(SBMA)でグラフト化された基材は、実施例で述べるように調製したポリ(SBMA)被覆表面が、それらの超低汚損特性を失うことなく1ヶ月間以上室温で空気中に放置されたまたは水中に液浸されたという事実によって証明されるように、安定である。
開始剤SAMの品質はその後の表面重合およびタンパク質吸着にとって重要である。表面上の非結合開始剤の量はフィブリノゲン吸着に影響を及ぼす(図6)。適切な溶媒による開始剤SAMの処理が、超低汚損表面を実現するために必要である。実施例のSAMは、金被覆基材を、表面の慎重な清掃後、室温でチオールの純粋なエタノール溶液に浸すことによって調製された。表面上の非結合開始剤のパーセンテージは開始剤溶液の濃度に比例する。開始剤SAMを、大部分のSAMの調製におけるように純粋エタノールだけで洗った場合、有意の量の非結合チオール分子が認められた。これらの非結合チオール分子は、開始剤SAMをエタノール、次いでTHFで洗浄した場合には完全に除去され、これは、THFがチオール分子1(図1参照)に関してエタノールよりも良好な溶媒であるためである。原子間力顕微鏡検査(AFM)画像は、表面が、金基材からの欠陥と領域を除き、金上の開始剤SAMに関する特徴がないことを示し、金表面上の非結合チオール分子を伴わない均質な単分子層を指示した(図7)。
表面重合後、ポリマーの厚さは、12nmから、偏光解析法によって正確に測定するには厚すぎるまでの範囲にわたる。図8は、異なるポリマーの厚さを有するこれら2つの重合表面へのフィブリノゲン吸着に関するSPRからの波長シフトの差を示す。非結合チオールを伴う表面から開始されるより厚いポリマー層は、吸着フィブリノゲンの6%MLに相当する、多少のフィブリノゲン吸着(波長の0.9nmシフト)を導く。非結合開始剤を伴わない表面から開始されるポリマー層は、非常に低いタンパク質吸着を有する。非結合チオール分子は、厚いポリマーフィルムの形成を生じさせ得る。鎖内および鎖間イオン接触による両性イオン基の間での強力な分子間相互作用は、厚いポリマーフィルム内で脱水を導き、それゆえタンパク質吸着を導く。
スルホベタインポリマーブラシは迅速に成長した。図8は、種々のSBMA濃度に関する重合時間の関数としてのポリマーの厚さを示す。0.1MのSBMA濃度との反応に関しては、ポリマーフィルムの厚さは反応の開始時に急速に増大し、約8nmで横ばい状態となり、この時点で停止反応が起こると考えられる。0.3MのSBMA濃度に関する反応は約12nmで横ばい状態となった(図8)。より高い濃度との反応は、表面上の厚く不均一なポリマーフィルムを導く。より長い反応時間は、偏光解析法によってフィルムの厚さを測定することを困難にする、溶液全体のゲル化を生じさせることさえあり得る。臭化銅/ビピリジン(CuBr/BPY)錯体を、重合を触媒するために使用した。図8はまた、SPRによって測定したポリ(SBMA)被覆表面へのフィブリノゲン吸着を示す。5−12nmの範囲のポリマーフィルムの厚さを有する表面はすべて、フィブリノゲン吸着に対して高度に耐性であることが示されている。
本発明において有用なスルホベタインポリマーを作製するための代表的モノマーは、スルホベタインメタクリレート(SBMA)、スルホベタインアクリレート、スルホベタインアクリルアミド、スルホベタインビニル化合物、スルホベタインエポキシド、およびヒドロキシル、イソシアネート、アミノまたはカルボキシル基を有する他のスルホベタイン化合物を含む。
代表的重合方法は、原子移動ラジカル重合(ATRP)、可逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)型重合、およびフリーラジカル重合である。重合のための従来のいかなるラジカル開始剤も本発明を実施するために使用し得る。常温または光化学的フリーラジカル重合のための代表的開始剤は、過酸化ベンゾイル、2,2’−アゾ−ビス(2−メチルプロイオニトリル)およびベンゾインメチルエーテルを含む。ATRPのための代表的開始剤は、臭化ブロモイソブチリル(BIBB)などのハロゲン化アルキルを含む。RAFT型重合のための代表的開始剤(すなわち連鎖移動剤(chain rebersible agency(CTA)を伴うフリーラジカル開始剤)は、チオカルボニルチオ化合物を含む。
1つの実施形態では、ポリ(プロピレンオキシド)(PPO)などの疎水性部分と、ポリ(SBMA)などのスルホベタイン部分を含む十分に定義されたジブロックコポリマーは、メチル(CH3)を末端に持つSAMなどの、アルキル末端SAMで被覆された表面に吸着される。この実施形態に関して、疎水性ポリマーセグメントは疎水性表面に結合し、親水性スルホベタイン部分は溶液に暴露される。スルホベタインを含む代表的な十分に定義されたジブロックコポリマーを実施例3で説明し、図9に示す。
適切なSAMで被覆された表面に加えて、他の疎水性材料で被覆された表面(または疎水性表面)も、本発明のコポリマーをそれらの表面に付着させるために使用できる。
超低汚損表面は、基材表面へのジブロックコポリマーの吸着後に実現される。代表的な方法は特定成分を有すると述べられているが、本発明の基材表面は様々な表面であり得ること、表面のCH3末端SAMは末端に疎水性基を有する様々なSAMであり得ること、本発明のジブロックコポリマーは、多様な長さを有する様々なスルホベタインベースの親水性部分と多様な長さを有する何らかの適切な疎水性部分から構成され得ること、およびジブロックコポリマーは何らかの適切な重合方法によって調製され得ることが認識される。
図9に図式的に示すように、ジブロックコポリマーの共重合は、遷移金属化合物が、モノマーを非機能性マクロ開始剤に連続的に連結するためのハロゲン原子の担体として働く、可逆的レドックス工程である。合成において、マクロ開始剤を有するPPO(PPO−Br)を、モノヒドロキシベースのポリ(プロピレングリコール)を2−ブロモイソブチリルブロミドと反応させることによって合成した。11200の分子量を有するSBMAの重合のために、PPO−Brと触媒CuBrの存在下でスルホベタインモノマー(SBMA)を重合してコポリマーを生成した。PPO−b−ポリ(SBMA)ジブロックコポリマーの構造を1H核磁気共鳴(NMR)分光法によって特性決定した。PO20−b−SBMA35についての典型的スペクトルを図10に示す。
メチル末端SAMを、清浄金被覆基材をHS(CH2)8CH3の溶液に浸すことによって金被覆ガラス基材上に形成した。次に、PPO−b−ポリ(SBMA)ジブロックコポリマー溶液を基材表面に流し、続いて、ゆるく吸着されたコポリマーを除去するために緩衝液で洗い流した。この実施例では、物理的に吸着されたコポリマーで被覆された表面へのタンパク質吸着を評価するためのモデル系としてフィブリノゲンを使用した。タンパク質吸着の量は、タンパク質吸着前と吸着後に確立された2つの基線値の差として定義される。図11は、コポリマーAの吸着とそれに続くフィブリノゲン吸着のインサイチュー評価についての典型的SPRセンサーグラムを示す。
疎水性CH3−SAM表面への十分に定義されたジブロックコポリマー、PPO−b−ポリ(SBMA)の物理的吸着を実施した。物理的に吸着されるコポリマーの表面充填密度を制御するため、3つの異なるSBMAベースのブロックコポリマー(PO20−b−SBMA20、PO20−b−SBMA35およびPO20−b−SBMA50と称する)を合成した。ポリ(SBMA)の鎖長を、周囲温度でATRPによる連続的モノマー付加によって制御し、一方PPOの鎖長は一定に保持した。3つのPPO−b−ポリ(SBMA)コポリマーについての合成パラメータと平均分子量を表1に要約する。
ポリ(SBMA)鎖がより長いとき、ポリ(SBMA)/PPOの鎖長比はより高く、ジブロックコポリマーの構造はより対称でない。この2工程反応経路(図9)は、制御された分子量(Mn)と多分散性(Mw/Mn=1.2−1.35)を有するPPO−b−ポリ(SBMA)コポリマーを提供した。低い多分散性は良好に制御された重合精度を指示する。図12は、得られた3つのコポリマーの分子量が6500−15000の範囲であり、低い多分散性を有することを示す。コポリマーPO20−b−SBMAs0、PO20−b−SBMA35およびPO20−b−SBMA50を、図12ではそれぞれコポリマーA、BおよびCと表わしている。3つのSBMAベースのブロックコポリマーは異なる充填密度とタンパク質吸着行動を有すると予測される。コポリマーとタンパク質の両方の吸着量をSPRから得た。
表面充填密度、およびそれゆえタンパク質吸着への0.005−1mg/mLのPPO−b−ポリ(SBMA)溶液濃度の作用を測定した。図13からわかるように、タンパク質吸着は層の化学と構造、すなわち(a)溶液中のPPO−b−ポリ(SBMA)の濃度(CPPO−b−ポリ(SBMA))および(b)ポリ(SBMA)の体積分率[fポリ(SBMA)]によって決定される、SBMA表面密度と(SBMA)/PPO比に依存する。低いCPPO−b−ポリ(SBMA)(たとえばCPPO−b−ポリ(SBMA)が0.02mg/ml未満である)では、タンパク質吸着は、より高い表面SBMA被覆率のゆえに、より高いfポリ(SBMA)のPPO−SBMAジブロックコポリマーに関してより低い。これに対し、高いCPPO−b−ポリ(SBMA)では、より低いfポリ(SBMA)のPPO−b−ポリ(SBMA)ジブロックコポリマーへのタンパク質吸着は急速に低下する。より低い分子量を有するコポリマーAに関して、CPPO−b−ポリ(SBMA)が0.03mg/mlより大きいときは、タンパク質吸着が非常に低い(3ng/cm2)。コポリマーCについては、広範囲のCPPO−b−ポリ(SBMA)にわたってタンパク質吸着はより高いレベル(20.3ng/cm2)のままである。仮説によって限定されるのは望むところではないが、これは、より大きなSBMAセグメントはそれら自体の間に腔を創造し、表面を完全に覆うことができず、タンパク質吸着を導くためであると考えられる。
PPO−b−ポリ(SBMA)の表面充填密度は、タンパク質吸着に対する表面耐性において重要な役割を果たす。図14は、CPPO−b−ポリ(SBMA)=1.0mg/mlについての様々なPPO−b−ポリ(SBMA)被覆表面へのフィブリノゲン吸着に関するSPRセンサーグラムを示す。フィブリノゲン吸着は、コポリマーAおよびBで被覆された表面に対しては非常に低く、コポリマーC表面に対してはより高い。これは、コポリマーCの大きな分子サイズから形成される高い表面充填欠陥によるものである。コポリマーCで被覆した表面をより小さな分子量のコポリマーAで埋め戻したとき(図15に示す)、やはり非常に低いタンパク質吸着が達成された。この結果は、より高いフィブリノゲン吸着が、より高い分子量を有するコポリマーの吸着によって引き起こされるより高い表面空孔によるものであり、これらの腔はより小さな分子量のコポリマーで埋め戻しできることを示唆する。
SBMAを含むコポリマーは、表面SBMA密度が高い場合、タンパク質吸着に耐性であるために理想的である。様々なタンパク質の吸着に対するSBMAベースのコポリマーの耐性を、コポリマーAへの3つのタンパク質、フィブリノゲン、BSAおよびリゾチームの吸着を、様々な分子量(14.3kD−340kD)とpI(4.8−10.9)で測定することによってさらに評価した。図16は、コポリマーAへの3つのタンパク質すべての吸着が0.25nmより低い(約3.75ng/cm2)ことを示す。
ブロックコポリマーに関して、スルホベタイン部分のための代表的モノマーは、スルホベタインメタクリレート(SBMA)、スルホベタインアクリレート、スルホベタインアクリルアミド、スルホベタインビニル化合物、スルホベタインエポキシド、およびヒドロキシル、イソシアネート、アミノまたはカルボキシル基を有する他のスルホベタイン化合物を含む。いかなる疎水性高分子鎖も、本発明のコポリマーのための疎水性部分として使用できる。代表的疎水性部分は、ポリ(プロピレンオキシド)(PPO)、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタンおよびポリアミドを含む。
1つの実施形態では、ポリ(SBMA)コーティングを実施例5で述べるように製造した。この実施例は、生物汚損を低減するためまたは生体適合性を上昇させるために単独で使用できるまたは通常の塗料に添加することができるポリSBMAの製造を説明する。ポリマーは、SBMAとAIBNを反応させ、次にラウリルメタクリレートを添加することによって作製した。生成物をろ過し、99g/Lの濃度でキシレンに分散させた。固相酵素免疫検定法(ELISA)は、ポリSBMA被覆表面へのタンパク質吸着の80%以上の低下を示した(結果を図17に示す)。海洋生物汚損アッセイは、ポリSBMAコーティングが海洋微生物の沈着を有意に低減することを示した(図19−21参照)。
実施例5で述べるように作製したポリSBMAは、生物汚損を低減するためにエポキシ系塗料に添加することができる。代表的製剤中の成分を表2に示す。
相互侵入高分子網目
もう1つの態様では、本発明は、相互侵入高分子網目(IPN)で被覆された超低汚損表面を提供する。ここで使用する、「相互侵入高分子網目」(IPN)という用語は、分子規模で少なくとも部分的に織り交ざっているが、互いに共有結合しておらず、化学結合が壊れない限り分離することができない1またはそれ以上の網目を含む高分子を指す。
もう1つの態様では、本発明は、相互侵入高分子網目(IPN)で被覆された超低汚損表面を提供する。ここで使用する、「相互侵入高分子網目」(IPN)という用語は、分子規模で少なくとも部分的に織り交ざっているが、互いに共有結合しておらず、化学結合が壊れない限り分離することができない1またはそれ以上の網目を含む高分子を指す。
1つの実施形態では、スルホベタインポリマーを含む相互侵入高分子網目(IPN)は、スルホベタインモノマーを第二材料のマトリックスに侵入させ、モノマーを重合させることによって提供される。第二材料は、侵入化合物と同じであるかまたは異なっていてもよい。スルホベタインポリマーおよびセグメント化ポリウレタン(SPU)を含む代表的IPNを実施例6で説明し、図3に例示する。
タンパク質吸着に耐性であり、高い機械的強度を有する相互侵入高分子網目(IPN)を、セグメント化ポリウレタン(SPU)を架橋スルホベタインメタクリレート(SBMA)ポリマーで改変することによって作製した。SPUを、IPNフィルムの機械的強度を補強するためのマトリックス成分として使用し、ポリ(SBMA)を、IPNフィルムのタンパク質吸着を低減するために使用した。図3に示すように、SPUフィルムは溶媒蒸発法で調製した。次にSPUフィルムを、SBMAモノマー、2−エチルヘキシルメタクリレート(EHMA)モノマー、グリコール1,3−ジグリセロレートジアクリレート(GDGDA)架橋剤、および光開始剤を含むインキュベーション溶液に液浸した。IPNフィルムを創製するために可視光照射による光重合によってSBMA重合を開始させた。
インキュベーション溶液の総濃度(またはインキュベーション濃度)を、最適結果が得られるように調整した。SBMAモノマー比(mol%)は、SBMAモノマーのモル数をインキュベーション溶液中のSBMAとEHMAモノマーの総モル数で除したものと定義される。実施例では、IPNについての作製条件を最適化するためにSBMAモノマー比を0−100mol%に調整し、GDGDAは1.0×10−2mol/Lに固定した。副反応を排除するため、暗所にて窒素の存在下で光開始剤(たとえばカンホルキノンおよびエチル4−(N,N−ジメチルアミノ)ベンゾエート)をインキュベーション溶液に添加した。光重合のために、SPUフィルムを可視光(λ=400−500nm)で照射してIPNフィルムを形成した。次に、非反応モノマーを除去するために当技術分野で公知の広く確立された後処理手順に従ってIPNフィルムを清掃した。IPNフィルムの化学組成物の深さプロフィールを共焦点ラマン顕微鏡検査によって測定した。IPNフィルム上の吸着タンパク質の量を固相酵素免疫検定法(ELISA)によって測定した。
IPN作製のための工程は一般に2つの段階に分けることができる。最初の段階はより短いインキュベーション時間に関連する。この段階では、インキュベーション溶液からSPUマトリックス中に拡散するポリ(SBMA)の量は主としてSPU膨潤の程度によって制御される。第二段階はより長いインキュベーション時間に結びつく。この段階では、SPUマトリックス内のポリ(SBMA)の量はSPUフィルム内のSBMAの溶解度によって決定される。それゆえ、溶媒の極性がIPN作製において非常に重要な役割を果たし、溶媒極性の相殺取引が存在すると予想される。より極性の低い溶媒中でのインキュベーションは、最初、より高いSPU膨潤(またはマトリックス内へのより高いSBMA拡散またはより低いタンパク質吸着)を生じさせる。しかしまた、長時間のインキュベーション後には、SPUフィルム内のより低いSBMA溶解度(またはSPUマトリックス内のより低いSBMA富化領域またはより高いタンパク質吸着)を有する。インキュベーション溶液は、疎水性SPUを膨潤させることおよび親水性ポリ(SBMA)を溶解することの両方ができるべきであり、IPNフィルムの最良の性能を達成するためには適切な溶媒極性が必要である。
IPNフィルム上の吸着タンパク質の量は、溶媒の極性、インキュベーション時間、SBMAモノマー比およびインキュベーション濃度を含む、インキュベーション条件に依存する。長いインキュベーション時間でより高い極性の混合溶媒中で作製したIPNは非常に低いタンパク質吸着を有すると思われ、SPUフィルム内のSBMA単位の分布を十分に制御したとき、ポリ(SBMA)を含むIPNは非特異的タンパク質吸着に対して高度に耐性であり得ることを示唆する。
作製した各々のIPNフィルム上のタンパク質吸着を、ポリスチレン(PS)を対照標準基材として使用してELISAによって評価した。PS上の吸着と比較した様々な試料についての相対的タンパク質吸着を図22に示す。図22を参照すると、IPNフィルム上のタンパク質吸着は、PSまたは他の非改変SPUフィルム上の吸着と比較して有意に低い。非改変SPUフィルム上の吸着ヒトFgはPS上の82%である。IPNフィルム上のタンパク質吸着はポリ(HEMA)ヒドロゲル上と同様であるかまたはさらに一層低く、一方でIPNフィルムはポリ(HEMA)よりもはるかに良好な機械的性質を有する。タンパク質吸着が最も低いIPNフィルムは、95容積%のメタノールと5容積%の水を含む溶液中、20℃で24時間、SBMAモノマー比70mol%およびインキュベーション濃度2.0mol/LでSPUフィルム(TECOFLEX60)をインキュベートすることによって実現された。ポリ(SBMA)ヒドロゲルも比較のために使用した。ポリ(SBMA)への相対的タンパク質吸着はわずかに1.5%であり、ポリ(SBMA)が非特異的タンパク質吸着に対して高度に耐性であり得ることを示唆した。結果は、ポリ(SBMA)およびSPUを含むIPNが、機械的強度を維持しながら低いタンパク質吸着を達成するための卓越したアプローチであることを示す。
非特異的タンパク質吸着に対するIPNの耐性は、それらの作製において使用される溶媒の極性に強く依存する。IPN試料が非特異的タンパク質吸着に抗する能力は、SPU膨潤の程度とSPUフィルム内のSBMAの溶解度のバランスによって決定される。長いインキュベーション時間に関しては、非特異的タンパク質吸着に対するIPNの耐性は主としてSPUフィルム内のSBMA溶解度によって決定される。より低いタンパク質吸着を有するIPN試料を調製するためにはより極性の溶媒が好ましい。SPUフィルムが、高度に極性のSBMAを含むより極性の溶媒によって長いインキュベーション時間の間に膨潤した後、より多くのSBMAがSPUフィルム内に侵入し、SPUマトリックス内にSBMAに富む領域を形成することができる。短いインキュベーション時間については、IPNへのタンパク質吸着の低下は主としてSPU膨潤の程度によって決定される。より極性の低い溶媒はSPUフィルムをより膨潤させ、より多くのSBMAがフィルム内に拡散することを可能にし、当初のタンパク質吸着の低下を導く。実施例では、作製されたIPNフィルムへのタンパク質吸着の低下に対する溶媒極性の作用を、主として、極性の高いものから順に3種類のインキュベーションを使用して検討した:メタノールはエタノール/メタノールより極性が高く、エタノール/メタノールはイソプロパノール/メタノールより極性が高い。
図23Aに示すように、より極性の溶媒(すなわちメタノール)中で24時間インキュベートしたIPNフィルムでは、2つのより極性の低い混合溶媒(すなわちエタノール/メタノールおよびイソプロパノール/メタノール)から作製したものよりも低いタンパク質吸着が認められた。SBMAモノマーは極性溶媒(メタノール)により良好に溶解して、SPUマトリックスと共にSBMAに富む領域の形成を生じさせ、タンパク質吸着に対するより良好な耐性を与えるので、より多くのSBMA単位が、長いインキュベーションの期間中により極性の溶媒環境においてSPUフィルムに分配され得ると考えられる。膨潤したSPUフィルムとインキュベーション溶液の間の平衡が十分に長いインキュベーション時間で達成され、SPUフィルム内のより高いSBMAモノマー分配を生じさせた。それゆえ、長いインキュベーション期間にわたってタンパク質吸着を低減するためにSPUフィルム内にSBMAに富む領域の形成を達成するには、より極性の環境が好ましい。これはまた、より強力な極性溶媒(すなわち5容積%の水)の添加によって作製したIPNフィルム(IPN−II)が、なぜ図22に示すように非特異的タンパク質吸着をさらに低減し得るかを説明する。IPN−IIは、純粋なメタノール中で作製されたIPN−I、およびHEMAヒドロゲルよりも良好である。純水はSPUフィルムを膨潤させることができないので、IPN作製のための良好な溶媒ではない。95容積%のメタノールと5容積%の水を含む溶媒が、SPU膨潤とSBMA溶解度の良好な妥協策である。
SPU膨潤対インキュベーション時間が図23Bで比較されている。結果は、最初は極性の低い溶媒(たとえばエタノール/メタノールまたはイソプロパノール/メタノール)がSPUフィルムをより急速に膨潤させることを示す。IPN作製の間の膨潤比(%)は、作製されるIPNフィルムと非改変SPUフィルムの間の直径の差を非改変SPUフィルムの直径で除したものと定義される。SPUフィルムは、エタノール/メタノール(またはイソプロパノール/メタノール)溶液中に浸したとき、2時間後にその最大量まで急速に膨潤したことがわかる。同様の程度の膨潤が、24時間後であるが、メタノール溶液中で達成された。膨潤行動はタンパク質吸着の低減と相関し得る。図23Aに示すように、タンパク質吸着の低減は、最初の2時間はメタノール溶液よりもエタノール/メタノール(またはイソプロパノール/メタノール)溶液に浸したSPUフィルムに関してより迅速である。しかし、エタノール/メタノール(またはイソプロパノール/メタノール)溶液中で調製したIPN試料に関するタンパク質吸着の低減は、24時間後のメタノール溶液中で調製した試料に関するほど有意ではない。より極性の低い溶媒(たとえばイソプロパノール)はSPUを膨潤させ、SPUマトリックス内にはるかに速く浸透することができても、SBMAはSPUフィルムの内部でイソプロパノールに富む領域に良好に溶解しない。これは、より多くのSBMAがSPUフィルムに浸透するために膨潤の程度が重要であるのみならず、SPUフィルム内での溶媒の極性も、より多くのSBMAがSPUマトリックスに溶解するために重要な役割を果たすことを明らかに指示する。より極性の溶媒は、長いインキュベーション期間後最終的にSPUマトリックス内へのSBMA浸透を促進することができるが、SPUフィルムの膨潤に関してはるかに緩やかな反応速度を有する。それゆえ、中間的な極性を有する適切な溶媒が、IPN工程の反応速度と熱力学の間のバランスを保つ、IPN作製のためのインキュベーション溶液として望ましい。
インキュベーション溶液の総濃度も、SPUフィルム内のSBMA単位の分散に影響を及ぼし得る。この実施例では、濃度は0.1−3.0mol/Lの範囲であり、それに従って種々のインキュベーション濃度下で作製した様々なIPNフィルムへのタンパク質吸着を評価した。図23に示すように、約1.0mol/Lのタンパク質吸着の有効な低下が認められた。インキュベーション溶液のより低い濃度(0.5mol/L未満)に関しては、IPNフィルム内に形成されるSBMAに富む領域がないため、作製されたIPNフィルムのより高いタンパク質吸着が認められた。より高濃度の溶液(2.0ml/L以上)中でインキュベートしたIPNフィルムに関しては、高度に荷電したSBMAを含む高濃度インキュベーション溶液についての溶媒行動の変化により、タンパク質吸着に対するIPNフィルムの耐性はさらに改善されなかった。図25Aに示すように、1.0mol/L溶液の場合には、溶解力の低い分子が、SPUフィルムを膨潤させ、SPUフィルム内へのSBMA浸透を促進するために使用可能であるので、総濃度1.0mol/Lのインキュベーション溶液から作製したIPNフィルムは0.5mol/L溶液から最初の2時間を超えて作製したものよりも緩やかにタンパク質吸着を低減させた。しかし、24時間のインキュベーション後、タンパク質吸着のより有効な低減が1.0mol/L溶液に関して認められた。IPN作製の間のタンパク質吸着の変化と共に膨潤比および重量増加の変動を比較することは興味深い。IPN作製についての重量増加(%)は、作製されたIPNフィルムと非改変SPUフィルムの間の乾燥重量の差を非改変SPUフィルムの乾燥重量で除したものと定義される。図25Bから、膨潤比、重量増加、および作製されたIPNフィルムのタンパク質吸着の間に相関が存在することがわかる。それらの結果は、インキュベーション時間が上昇すると共に、図25Bにおける膨潤比と重量増加の上昇が図25Aにおけるより低いタンパク質吸着に対応することを明らかに示す。結果はまた、モノマー成分が実際にSPUフィルム内に拡散し、IPNフィルム内にSBMAに富む領域を形成することを示唆する。
図26は、インキュベーション溶液中の種々のSBMAモノマー比が、20℃で24時間のインキュベーション時間と1mol/Lのインキュベーション濃度で、IPNフィルムへのタンパク質吸着に及ぼす作用を示す。インキュベーション溶液中のSBMAモノマー比が上昇すると共に相対的タンパク質吸着が低下した。タンパク質吸着の最大低下は、SBMA対EHMAのモル比が7:3のときに起こった。これらの結果は、より高いSBMAモル比を有するインキュベーション溶液は、タンパク質耐性のためにIPNフィルム内により多くのポリ(SBMA)富化領域を導くことを示す。結果はまた、溶液中にある程度のEHMA単位を含むことはSPUとポリ(SBMA)の間の親和性を増強し得ることを示す。それゆえ、SBMA対EHMAの良好に制御されたモル比は、SPUフィルム内のSBMAに富む領域の分散のためおよび非常に低いタンパク質吸着を有する優れたIPN構造の形成のために重要である。
IPNフィルムを特性決定するために共焦点ラマン分光法を使用した。典型的なスペクトルを図27に示す。ポリ(SBMA)からのS−C化学結合が、IPNフィルムの上部から0および20μmの深さで出現する、605cm−1のラマンシフトで認められたが、非改変SPUフィルについてはそのようなシフトは認められず、ポリ(SBMA)が実際にSPUフィルム内に浸透したことを指示した。上述したように、タンパク質吸着の低下は時間依存的様式を示し(図23Aおよび25A)、膨潤比と重量増加の変動(図25B)とタンパク質吸着の変動の間には相関が存在する。1M濃度の小さなSBMA分子に関しては、SBMAの物理的吸着がかなり急速に起こるはずである。ラマンからの結果と共にこれらの事実は、SBMAが単にSPUフィルムの表面に吸着するのではなく、SPUマトリックス内に浸透することを示唆する。
相互侵入高分子網目を作製する上で有用なスルホベタインポリマーのための代表的モノマーは、スルホベタインメタクリレート(SBMA)、スルホベタインアクリレート、スルホベタインアクリルアミド、スルホベタインビニル化合物、スルホベタインエポキシド、およびヒドロキシル、イソシアネート、アミノまたはカルボキシル基を有する他のスルホベタイン化合物を含む。代表的な基材は、ポリウレタン、シリコーン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリアミドおよびTEFLONを含む。
カルボキシベタインポリマー
スルホベタインポリマーに加えて、カルボキシベタインポリマーも超低汚損表面を作製する上で有用である。
スルホベタインポリマーに加えて、カルボキシベタインポリマーも超低汚損表面を作製する上で有用である。
カルボキシベタインポリマーを、原子移動ラジカル重合(ATRP)を通して開始剤を末端に有する層(たとえばSAMなどの単分子層)にグラフト化する。開始剤を末端に有する層で基材表面を被覆する。次に、スルホベタインモノマーを前記層に重合して、基材表面にスルホベタインポリマーコーティングの層を形成する。層の末端のラジカル開始剤によって原子移動ラジカル重合が開始される。
1つの実施形態では、本発明は、ポリ(カルボキシベタイン)(たとえばポリ(CBMA))などのカルボキシベタインポリマーに基づくコーティング材料を提供する。1つのほうほうでは、活性官能基を有するカルボキシベタインポリマーを、表面開始ATRP法によって開始剤で被覆された表面にグラフト化する。代表的非汚損カルボキシベタインポリマーを実施例7で説明し、その製造を図4に示す。
両性イオンポリ(カルボキシベタイン)材料は、ポリ(カルボキシベタイン)ポリマーを表面にグラフト化するかまたはポリ(カルボキシベタイン)ベースのヒドロゲルを調製することによって製造される。ポリ(カルボキシベタイン)で被覆した表面またはヒドロゲルは、タンパク質吸着または細胞付着に対して高度に耐性である。
超低汚損カルボキシベタイン表面は、制御された方法でポリ(カルボキシベタイン)ポリマー鎖を表面から成長させるリビング重合手法によって作製できる。実施例では、ポリ(カルボキシベタインメタクリレート)、ポリ(CBMA)を、表面開始ATRP法によって開始剤で被覆された基材表面にグラフト化することによって超低汚損表面を作製した。臭化ブロモイソブチリルとメルカプトウンデカノールを反応させることによってω−メルカプトウンデシルブロモイソブチレートを合成した。ω−メルカプトウンデシルブロモイソブチレートを含む溶液に金基材を浸すことにより、自己組織化を通して開始剤を金基材に固定化した。CBMAモノマーの1つである、2−カルボキシ−N,N−ジメチル−N−(2’−メタクリロイルオキシエチル)エタンアンモニウム内部塩を、2−(N,N’−ジメチルアミノ)エチルメタクリレートをβ−プロピオラクトンと反応させることによって合成した。CBMAモノマーを、ATRPによってラジカル開始剤を末端に有するSAMからグラフト化した。CuBrおよび2,2’−ビピリジン(BPY)をそれぞれ触媒およびリガンドとして使用した。反応物を、メタノールと水の混合溶媒中、室温で温和な条件下に保持した。典型的なATRP重合後、均一なカルボキシベタインポリマーブラシを表面にグラフト化した。ポリマー層の厚さは、偏光解析法によって測定したとき約10−15nmであった。
ポリ(CBMA)グラフト化表面への3つの異なるタンパク質、ヒトフィブリノゲン(340kD、pI=5.5)、リゾチーム(14kD、pI=12)、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG、37kD、pI=4.5)の吸着は、図28に示すように0.3ng/cm2未満に低下する(あるいは波長シフトがSPRセンサーの検出限界である0.02nm未満である)ことが示された。それゆえ、ポリ(CBMA)グラフト化表面はタンパク質吸着に対して高度に耐性である。
本発明において有用なカルボキシベタインポリマーを作製するための代表的モノマーは、2−カルボキシ−N,N−ジメチル−N−(2’−メタクリロイルオキシエチル)エタンアンモニウム内部塩などのカルボキシベタインメタクリレート;カルボキシベタインアクリレート;カルボキシベタインアクリルアミド;カルボキシベタインビニル化合物;カルボキシベタインエポキシド;およびヒドロキシル、イソシアネート、アミノまたはカルボキシル基を有する他のカルボキシベタイン化合物を含む。
カルボキシベタインポリマーは、原子移動ラジカル重合(ATRP)、可逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)型重合、およびフリーラジカル重合を含む重合方法によって作製できる。重合のための従来のいかなるラジカル開始剤も使用し得る。
ポリ(CBMA)またはポリ(SBMA)は、表面開始ATRPによってガラス表面に被覆することができる。通常ガラス基材は清浄化された基材であり、その後2−ブロモ−2−メチル−N−3−[(トリメトキシシリル)プロピル]−プロパンアミドを含む溶液に液浸した。基材を浸漬溶液から取り出し、洗浄して、乾燥した。SBMA(またはCBMA)を、表面開始ATRPによってCuBrおよび2,2’−ビピリジンの存在下に固定化開始剤で2つの基材上で重合した。実施例9は、表面開始ATRPによるスライドガラス上のポリSBMA(またはポリCBMA)コーティングの作製を説明し、図29はこれを例示する。
固相酵素免疫検定法(ELISA)は、ポリSBMA(またはポリCBMA)グラフト化表面へのタンパク質吸着の有意の低下を示した。ポリマーグラフト化ガラス試料上の吸着フィブリノゲンは、通常ガラス試料の4%未満であった。緑藻類胞子と共に6時間インキュベーションした後、ポリSBMAまたはグラフト化表面上に藻類胞子または藻類付着は認められなかった。対照ガラス試料は緑藻類で覆われた。
もう1つの態様では、本発明は架橋ヒドロゲルを提供する。1つの実施形態では、本発明は架橋ポリ(SBMA)ヒドロゲルを提供する。もう1つの実施形態では、本発明は架橋ポリ(CBMA)ヒドロゲルを提供する。
架橋ポリ(SBMA)ヒドロゲルを実施例4で述べるように作製した。SBMAモノマーをテトラエチレングリコールジメタクリレート(TEGDMA)に添加し、次にメタ重亜硫酸ナトリウムおよび過硫酸アンモニウムによって開始されるラジカル重合によって透明なヒドロゲルを作製した。重合後、残留化学物質を除去するための当技術分野で確立された手順に従ってゲルを調製した。上述したポリ(SBMA)ヒドロゲルは、低いタンパク質吸着、および低い内皮細胞付着を有する。
架橋ポリ(CBMA)ヒドロゲルを実施例8で述べるように作製した。CBMAモノマーをテトラエチレングリコールジメタクリレート(TEGDMA)に添加し、次にメタ重亜硫酸ナトリウムおよび過硫酸アンモニウムによって開始されるラジカル重合によって透明なヒドロゲルを作製した。重合後、残留化学物質を除去するための当技術分野で確立された手順に従ってゲルを調製した。ヒドロゲルをディスクにパンチした。試料をフィブロネクチン溶液中でインキュベートし、ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)と共に培養した。その結果は、ポリ(CBMA)ヒドロゲル自体が細胞付着に対して高度に耐性であり、細胞付着のためのタンパク質を導入するように容易に改変され得ることを示す。
さらなる態様では、本発明は超低汚損表面を作製するための方法を提供する。1つの実施形態では、前記方法は、(a)基材表面にラジカル開始剤を末端に有する単分子層を形成すること;および(b)ラジカル開始剤を末端に有する単分子層上で、スルホベタインまたはカルボキシベタインであるモノマーを重合することを含む。モノマーは、スルホベタインアクリレート、スルホベタインアクリルアミド、スルホベタインビニル化合物、スルホベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択できるか、またはカルボキシベタインアクリレート、カルボキシベタインアクリルアミド、カルボキシベタインビニル化合物、カルボキシベタインエポキシド、およびそれらの混合物から成る群より選択できる。1つのジでは、単分子層は自己組織化単分子層である。
1つの実施形態では、前記方法は、(a)基材表面に、末端にヒドロキシ基を有する単分子層を形成すること;(b)ヒドロキシ末端単分子層を、ラジカル開始剤を末端に持つ単分子層に変換すること;および(c)ラジカル開始剤単分子層上でモノマーを重合することを含む。前記モノマーは、上述したようなスルホベタインまたはカルボキシベタインであり得、単分子層は自己組織化単分子層であり得る。
もう1つの実施形態では、前記方法は、(a)基材表面に、末端にアルキル基を有する単分子層を形成すること;(b)末端にアルキル基を有する単分子層を第一ジブロックコポリマーで処理すること;および(c)末端にアルキル基を有する単分子層を第二ジブロックコポリマーで処理することを含む。1つの実施形態では、第一ジブロックコポリマーは、[疎水性モノマー]l−ブロック−[親水性モノマー]mコポリマーを含む。1つの実施形態では、第一ジブロックコポリマーは、[プロピレンオキシド]l−ブロック−[スルホベタインメタクリレート]mコポリマーを含む。1つの実施形態では、第二ジブロックコポリマーは、[疎水性モノマー]l−ブロック−[親水性モノマー]nコポリマーを含む。1つの実施形態では、第二ジブロックコポリマーは、[プロピレンオキシド]l−ブロック−[スルホベタインメタクリレート]nコポリマーを含む。これらのポリマーに関して、lは10−30の整数であり、mは10−100の整数であり、nは10−50の整数であり、およびmはnより大きい。
超低汚損表面を作製するための方法では、表面を超低汚損にする物質で表面を処理するか、または表面を超低汚損にするコーティングを表面上に形成する。
1つの方法では、超低汚損にしようとする表面を、表面を超低汚損にする物質(たとえば化合物またはポリマー)で処理する。この方法では、表面を超低汚損にする物質の一定量で表面を処理する。表面を超低汚損にするために有効な物質を表面に適用し、非共有結合相互作用を通してまたは結合相互作用(たとえば共有結合、イオン結合、静電結合、配位錯体形成)を通して表面に結合する。
前記方法の1つの実施形態では、基材表面を洗い、清浄化して、その後超低汚損コーティング材料の溶液に一定期間浸漬する。生じた、超低汚損材料で被覆された基材表面を洗って乾燥する。前記手順は数回反復することができる。
前記方法のもう1つの実施形態では、基材表面を洗い、清浄化して、その後アルキルチオールの溶液に浸漬する。次に第一ジブロックコポリマー溶液を、疎水性材料(たとえばSAM)で被覆された基材表面に流し、続いて、ゆるく吸着されたコポリマーを除去するために緩衝液で洗い流す。次に第二ジブロックコポリマー溶液を、第一ジブロックコポリマーで被覆された基材表面に流し、続いて、ゆるく吸着されたコポリマーを除去するために緩衝液で洗い流す。
もう1つの方法では、超低汚損にしようとする表面を1またはそれ以上の物質で処理し、表面を超低汚損にするコーティングを表面上に形成するように加工する。この方法では、超低汚損表面を提供するように制御された方法で表面からポリマー鎖を成長させるリビング重合手法を使用してポリマーコーティングを表面にグラフト化する。
基材表面でのポリマー材料のグラフト化は、原子移動ラジカル重合(ATRP)、可逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)型重合、およびフリーラジカル重合などの何らかの従来の重合方法によってであり得る。基材表面のSAMは表面重合のための優れたプラットフォームである。他の疎水性材料(または疎水性表面)も適切である。1つの実施形態では、ポリマーは、ラジカル開始剤を末端に有する自己組織化単分子層(SAM)からグラフト化される。基材表面を、ラジカル開始剤を末端に有するSAMで被覆する。次に基材表面に超低汚損ポリマーコーティングの層を形成するためにモノマーをSAMに重合する。SAMの末端でラジカル開始剤によって原子移動ラジカル重合が開始される。
ここで述べる超低汚損表面および材料は、船殻コーティングなどの海洋用途、コンタクトレンズ、歯科インプラント、薬剤送達、移植材料およびインビボセンサーのためのコーティングなどの生物医学分野において使用し得る。従って、もう1つの態様では、本発明は、スルホベタインまたはカルボキシベタイン材料の単分子層を含み、約1nm2より大きな欠陥を有さず、約30ng/cm2未満のフィブリノゲン吸着を有する1またはそれ以上の表面を備えた、以下を含む装置および材料を提供する:
本発明の超低汚損表面材料を含むように改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する粒子(たとえばナノ粒子);
本発明の超低汚損表面材料を含むように改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有するナノ粒子を含む塗料;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有するナノ粒子を含む塗料で被覆された船殻;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する薬剤担体;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する非ウイルス性遺伝子送達システム;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有するバイオセンサー;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する、微生物懸濁液、ホルモン分離、タンパク質分画、細胞分離、廃水処理、オリゴ糖バイオリアクター、タンパク質限外ろ過および乳加工のための膜などの、バイオプロセスまたはバイオ分離のための装置;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する移植可能なセンサー;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する皮下センサー;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する、乳房インプラント、移植蝸牛刺激装置および歯科インプラントなどのインプラント;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有するコンタクトレンズ;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する組織スカフォールド;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する、人工関節、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカー、左心室補助装置(LVAD)、動脈グラフトおよびステントなどの移植可能な医療装置;および
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する、耳ドレナージ管、栄養管、緑内障ドレナージ管、水頭症シャント、人工角膜、神経誘導管、尿路カテーテル、組織接着剤、創傷包帯およびx線導管などの医療装置。
本発明の超低汚損表面材料を含むように改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する粒子(たとえばナノ粒子);
本発明の超低汚損表面材料を含むように改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有するナノ粒子を含む塗料;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有するナノ粒子を含む塗料で被覆された船殻;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する薬剤担体;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する非ウイルス性遺伝子送達システム;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有するバイオセンサー;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する、微生物懸濁液、ホルモン分離、タンパク質分画、細胞分離、廃水処理、オリゴ糖バイオリアクター、タンパク質限外ろ過および乳加工のための膜などの、バイオプロセスまたはバイオ分離のための装置;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する移植可能なセンサー;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する皮下センサー;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する、乳房インプラント、移植蝸牛刺激装置および歯科インプラントなどのインプラント;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有するコンタクトレンズ;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する組織スカフォールド;
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する、人工関節、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカー、左心室補助装置(LVAD)、動脈グラフトおよびステントなどの移植可能な医療装置;および
本発明の超低汚損表面材料によって改変されたまたは本発明の方法によって作製された表面を有する、耳ドレナージ管、栄養管、緑内障ドレナージ管、水頭症シャント、人工角膜、神経誘導管、尿路カテーテル、組織接着剤、創傷包帯およびx線導管などの医療装置。
以下の実施例は本発明を説明するために提供するものであり、限定のためではない。
代表的開始剤SAMおよびヒドロキシ末端SAM:SAMの調製と開始剤の固定化
SPRガラスチップまたはシリコンウエハーを、真空下に電子ビーム蒸着によって接着促進クロム層(厚さ2nm)および表面プラズモン活性金層(48nm)で被覆した。SAMの作製の前に、基材を純水エタノールで洗い、紫外光下で清浄化して、水と純水エタノールで洗った。金被覆基材を、慎重な清浄化後に、室温でチオールの純水エタノール溶液に浸すことによってSAMを形成した。この実施例では、2つのSAM:開始剤ω−メルカプトウンデシルブロモイソブチレート(1)SAM(開始剤SAMまたはBr−SAM)および11−メルカプト−1−ウンデカノール(2)SAM(OH−SAM)を基材上に形成した(図1参照)。
SPRガラスチップまたはシリコンウエハーを、真空下に電子ビーム蒸着によって接着促進クロム層(厚さ2nm)および表面プラズモン活性金層(48nm)で被覆した。SAMの作製の前に、基材を純水エタノールで洗い、紫外光下で清浄化して、水と純水エタノールで洗った。金被覆基材を、慎重な清浄化後に、室温でチオールの純水エタノール溶液に浸すことによってSAMを形成した。この実施例では、2つのSAM:開始剤ω−メルカプトウンデシルブロモイソブチレート(1)SAM(開始剤SAMまたはBr−SAM)および11−メルカプト−1−ウンデカノール(2)SAM(OH−SAM)を基材上に形成した(図1参照)。
金表面に開始剤SAMを作製し、重合とタンパク質吸着へのそれらの作用を比較するため、様々な濃度の1溶液と清浄化手順を試験した。規定がない場合、基材を24時間浸漬するために純水エタノール中の1mM 1溶液を使用した。基材を純水エタノール、次いでTHFで洗浄し、窒素流で乾燥した。
ヒドロキシル末端SAMの作製のために、金基材を1mM 2エタノール溶液中に24時間浸漬し、そのご基材をエタノールで洗って、窒素流で乾燥した。ヒドロキシル末端SAMを有する金基材を、無水操作で窒素保護下にBIBBと反応させた(図1)。この反応では、SAM被覆した金基材をピリジン2.1mL(26.5mmol)と共に無水THF25mL中でインキュベートし、その後静かに攪拌しながらBIBB 3.1mL(25mmol)を滴下した。臭化水素酸ピリジンと考えられる、白色沈殿物が反応の初期段階に形成された。反応後、基材をTHF、エタノールおよび脱イオン水で連続的に洗い、窒素流で乾燥した。
開始剤被覆表面への代表的スルホベタインポリマーのグラフト化
SBMA重合。CuBrと固定化開始剤を有する基材を、窒素保護下で乾燥箱内の反応管に入れた。ゴム隔壁栓で密封した管を取り出した。次に、SBMAとBPYを含む脱ガス溶液(1:1容積比の純水とメタノール)を、窒素保護下に注射器を用いて管に移した。反応後、基材を取り出し、エタノールと水で洗って、試料を一晩水中に保持した。試験前に非結合ポリマーを除去するためにPBS緩衝液による通常の洗浄も適用する(図2)。
SBMA重合。CuBrと固定化開始剤を有する基材を、窒素保護下で乾燥箱内の反応管に入れた。ゴム隔壁栓で密封した管を取り出した。次に、SBMAとBPYを含む脱ガス溶液(1:1容積比の純水とメタノール)を、窒素保護下に注射器を用いて管に移した。反応後、基材を取り出し、エタノールと水で洗って、試料を一晩水中に保持した。試験前に非結合ポリマーを除去するためにPBS緩衝液による通常の洗浄も適用する(図2)。
SPRおよびタンパク質吸着。波長インテロゲーションに基づく、特注の表面プラズモン共鳴(SPR)センサーでタンパク質吸着を測定した。SPRチップをプリズムの基部に取り付け、屈折率マッチング液(Cargille)を用いて光学的接触を確立した。2つの独立した平行フローチャネルを有する二チャネルフローセルを、実験の間液体試料を収容するために使用した。ペリスタルティックポンプ(Ismatec)を、液体試料をフローセルの2つのチャネルに送達するために利用した。PBS中1.0mg/mLのフィブリノゲン溶液(0.15M、pH7.4)を0.05mL/分の流速で表面に流した。
タンパク質−表面相互作用をリアルタイムで観測するために表面感受性SPR検出器を使用した。この実施例では、表面濃度(単位面積当たりの質量)の変化を測定するために波長シフトを使用した。HS(CH2)15CH3 SAM上の吸着フィブリノゲンの量(15nm波長シフト)を単分子層(ML)として採用した。測定された表面へのタンパク質吸着を原因として誘導される波長シフトを、HS(CH2)15CH3 SAMに関するものによって%MLに基準化した。分析表面への吸着タンパク質の量がHS(CH2)15CH3 SAMに関する量より大きい場合、%MLは100%より大きくなり得る。
X線光電子分光法(XPS)。金被覆シリコンチップをXPS解析のために使用した。SAM作製のための手順はSPRチップに関するものと同じである。単色A1 Kα X線源を備えるSurface Science Insruments(SSI)S−プローブを用いてXPS分析を実施した。放出電子のエネルギーを、50−150eVのパスエネルギーで半球型電子エネルギー分析器によって測定する。表面上に存在する元素組成物をサーベイスキャンから同定した。すべてのデータは、表面法線から55°の取り出し角で収集した。結合エネルギー(BE)スケールは、C1sスペクトル内のピーク最大値を285.0eVに設定することによって参照する。各々のバッチから多数の試料を分析し、データを平均化した。高分解能C1sスペクトルを、Shirley法によるバックグラウンド除去と一連のガウスピークを用いて適合させた。データ解析ソフトウエアはService Physics,Inc.からであった。
偏光解析法。分光エリプソメータ(Sentech SE−850,GmbH)を用いて偏光解析法を実施した。試料の作製はXPS実験におけるものと同じである。5つの別々のスポットをVIS領域にて3つの異なる入射角(50、60および70°)で測定した。金被覆チップの同じバッチをUV−オゾンクリーナーによって20分間清掃し、エタノールとミリポア水で洗って、窒素で乾燥した。裸の金被覆チップを対照標準として使用した。試験したフィルムの厚さは、Cauchy層モデルを1.45の仮定屈折率で使用して決定した。
タッピング方式原子間力顕微鏡(TM−AFM)。TM−AFMのための金基材を、やく10−7Torrの高真空蒸発器(BOC Edwards Auto306)において新鮮へき開雲母(Asheville−Schoonmaher Mica Co.)への金の蒸着によって作製した。雲母基材を蒸着の前にラジエータヒーターによって325℃に2時間前加熱した。蒸発速度は0.1−0.3nm/秒であり、金フィルムの最終的な厚さは約200nmであった。金被覆基材を使用前にH2フレーム内で1分間アニールした。すべてのTM−AFM画像は、Eスキャナーを備えたNanoscope IV(Veeco,CA)AFMを用いて取得した。共振周波数約270kHz、推力定数20−100N/分、およびチップ先端半径5−10nmでSiカンチレバー(TESP,DI)を使用した。
スルホベタインを含む代表的な十分に定義されたジブロックコポリマー
水溶液中でのSBMAブロック共重合の調製。ATRP法によって制御された重合が達成される(図1)。ジブロックコポリマーの共重合は、遷移金属化合物が、モノマーを単官能性マクロ開始剤に連続的に連結するためのハロゲン原子の担体として働く、可逆的レドックス工程である。マクロ開始剤を有するPPO(PPO−Br)を、モノヒドロキシベースのポリ(プロピレングリコール)をテトラヒドロフラン中の2−ブロモイソブチリルブロミドと反応させることによって合成した。生成物をブラインで3回抽出することによって精製した。11200の分子量を有するSBMAの重合のために、SBMA(2.0g、6.77mmol)を、20℃で窒素下に[SBMA]:[PPO−Br]:[CuBr]:[bpy]=50:l:l:2を用いてメタノール10ml中で重合した。24時間後、残留触媒を除去するために反復して、生じた反応溶液を酸化アルミニウムカラムに通し、エタノール中に沈殿させて、水に再溶解した。溶媒の蒸発後、コポリマーを室温で真空炉において乾燥させ、白色粉末を得た。
水溶液中でのSBMAブロック共重合の調製。ATRP法によって制御された重合が達成される(図1)。ジブロックコポリマーの共重合は、遷移金属化合物が、モノマーを単官能性マクロ開始剤に連続的に連結するためのハロゲン原子の担体として働く、可逆的レドックス工程である。マクロ開始剤を有するPPO(PPO−Br)を、モノヒドロキシベースのポリ(プロピレングリコール)をテトラヒドロフラン中の2−ブロモイソブチリルブロミドと反応させることによって合成した。生成物をブラインで3回抽出することによって精製した。11200の分子量を有するSBMAの重合のために、SBMA(2.0g、6.77mmol)を、20℃で窒素下に[SBMA]:[PPO−Br]:[CuBr]:[bpy]=50:l:l:2を用いてメタノール10ml中で重合した。24時間後、残留触媒を除去するために反復して、生じた反応溶液を酸化アルミニウムカラムに通し、エタノール中に沈殿させて、水に再溶解した。溶媒の蒸発後、コポリマーを室温で真空炉において乾燥させ、白色粉末を得た。
コポリマーの特性決定。PPO−b−ポリ(SBMA)ジブロックコポリマーの構造を、Bruker 300MHz分光計およびD2Oを溶媒として使用して1H核磁気共鳴(NMR)スペクトルによって特性決定した。PO20−b−SBMA35についての典型的スペクトルを図10に示す。結果は、純粋なPPO−b−ポリ(SBMA)ジブロックコポリマーが得られることを示した。作製されたジブロックコポリマーの分子量および分子量分布を、WatersからのVE3580型viscotek示差屈折計検出器に接続されたウルトラヒドロゲル1000およびウルトラヒドロゲル250(分子量の範囲は586Da−884kDaであった)の2つのカラムを用いて、水系ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によって測定した。GPC実験に関して、流速は0.7ml/分、カラム温度は25℃であった。溶離液は、pH8.0の0.1M NaH2PO4および0.1M Na2HPO4から成る水溶液であった。Scientific Polymer Products(Ontario,NY)からのPEG標準品を検定のために使用した。GPCからの3つの合成PPO−b−poly(SBMA)コポリマーの典型的水溶液データを図12に示す。
表面プラズモン共鳴(SPR)センサーによるタンパク質吸着測定。二チャネルテフロン(登録商標)フローセルを有する波長インテロゲーションに基づく特注SPRバイオセンサーを、コポリマーで被覆した表面へのタンパク質吸着を観測するために使用した。この実施例では、光学ガラス基材をセンサーチップとして使用し、真空下に電子ビーム蒸着によって2nm接着促進クロム層および50nm表面プラズモン活性金層で被覆した。CH3末端SAMを、UV−オゾンで清浄化し、金被覆した基材をHS(CH2)8CH3の1.0mMエタノール溶液に一晩浸漬することによって形成した。改変チップをプリズムの基部に取り付け、屈折率マッチング液(Cargille)を用いて光学的接触を確立した。タンパク質吸着測定のために、SPRを最初に2mMリン酸緩衝塩類(PBS)溶液で安定化した。PPO−b−ポリ(SBMA)ジブロックコポリマー溶液を20分間SPR内に流し、その後ゆるく吸着したコポリマーを除去するために2mM PBS溶液で15分間洗い流した。1.0mg/mLタンパク質を20分間流し、その後2mM PBS溶液で15分間洗い流した。この作業において、物理的に吸着されたコポリマーで被覆した表面へのタンパク質吸着を評価するためのモデル系としてフィブリノゲンを使用した。すべてのSPR実験は、室温(約25℃)にて0.05mL/分の流速で実施した。タンパク質吸着の量は、タンパク質吸着の前と後に確立された2つの基線値の差と定義される。図11は、コポリマーAの吸着、それに続くフィブリノゲン吸着のインサイチュー評価についての典型的SPRセンサーグラムである。
代表的スルホベタインヒドロゲル
この実施例では、ポリ(SBMA)ヒドロゲルとタンパク質吸着および細胞付着に対するその耐性を述べる。[2−メタクリロイルオキシ]エチル]ジメチル(3−スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド(SBMA)(1.0g)をPBS緩衝液400μLに溶解し、エチレングリコール600μLおよびテトラ(エチレングリコール)ジアクリレート(TEGDA)20μLと混合した。次に、15%メタ重亜硫酸ナトリウム溶液50μLおよび40%過硫酸アンモニウム溶液50μLを添加した。均一な混合物を、テフロン(登録商標)スペーサーで分けた2つの滅菌スライドガラスに注いだ。完全な密封を確実にするためガラスの縁にクランプを適用した。得られたフィルムを37℃で一晩硬化し、フィルムをDI水で24時間、70%エタノールで24時間、およびディスクに穿孔する前にDI水で広範に浸漬した。
この実施例では、ポリ(SBMA)ヒドロゲルとタンパク質吸着および細胞付着に対するその耐性を述べる。[2−メタクリロイルオキシ]エチル]ジメチル(3−スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド(SBMA)(1.0g)をPBS緩衝液400μLに溶解し、エチレングリコール600μLおよびテトラ(エチレングリコール)ジアクリレート(TEGDA)20μLと混合した。次に、15%メタ重亜硫酸ナトリウム溶液50μLおよび40%過硫酸アンモニウム溶液50μLを添加した。均一な混合物を、テフロン(登録商標)スペーサーで分けた2つの滅菌スライドガラスに注いだ。完全な密封を確実にするためガラスの縁にクランプを適用した。得られたフィルムを37℃で一晩硬化し、フィルムをDI水で24時間、70%エタノールで24時間、およびディスクに穿孔する前にDI水で広範に浸漬した。
上述したポリ(SBMA)ヒドロゲルは、ポリ(HEMA)と同程度に低いタンパク質吸着を有し、低い内皮細胞付着を有する(図30A−30D参照)。
代表的ポリSBMAコポリマー
SBMA(1.22g)およびAIBN(0.05g)をメタノール溶媒(50mL)に溶解し、溶液を窒素で30分間パージした。その後反応混合物を窒素雰囲気下に55℃で1時間攪拌した。次に、イソプロパノール100mL中のラウリルメタクリレート(1.75g)を添加し、反応混合物を窒素雰囲気下に60℃で5時間攪拌し続けた。生成物をろ過し、99g/Lの濃度でキシレンに分散させた。固相酵素免疫検定法(ELISA)は、ポリSBMA被覆表面へのタンパク質吸着の90%以上の低下を示した(図18)。海洋生物汚損アッセイは、ポリSBMA固が海洋微生物の沈着を有意に低下させることを示した(図19−21参照)。
SBMA(1.22g)およびAIBN(0.05g)をメタノール溶媒(50mL)に溶解し、溶液を窒素で30分間パージした。その後反応混合物を窒素雰囲気下に55℃で1時間攪拌した。次に、イソプロパノール100mL中のラウリルメタクリレート(1.75g)を添加し、反応混合物を窒素雰囲気下に60℃で5時間攪拌し続けた。生成物をろ過し、99g/Lの濃度でキシレンに分散させた。固相酵素免疫検定法(ELISA)は、ポリSBMA被覆表面へのタンパク質吸着の90%以上の低下を示した(図18)。海洋生物汚損アッセイは、ポリSBMA固が海洋微生物の沈着を有意に低下させることを示した(図19−21参照)。
ポリSBMAに基づくポリマーは、生物汚損を低減するためにエポキシ系塗料に添加することができる(ポリSBMA/エポキシコーティング)。代表的製剤では、ポリSBMAベースのポリマー分散は、99g/Lの濃度のキシレン中の上述したポリSBMAベースのポリマーであり、エポキシ樹脂は70−80%エポキシ溶液である。TiO2、Fe2O3およびカーボンブラック色素として適しており、および有機粘土構造化剤、シリカ揺変剤も添加することができる。架橋剤は、周囲温度でエポキシ樹脂と反応するポリアミドである。液体汚損防止コーティングは、ブラシまたはスプレーによってエポキシプライマー基材に被覆される。ELISAは、フィブリノゲン吸着の90%以上の低下を示す。図19−21は、非常に低いUlva遊走子沈着、非常に低い発芽胞子成長、および非常に弱い発芽胞子の付着強度を示す。図21は、低い幼弱H.elegans沈着を示す。これらの結果は、ポリSBMA/エポキシコーティングが海洋微生物の生物汚損を有意に低下させたことを示す。
スルホベタインを含む代表的IPNの作製と特性決定
SPUおよびポリ(SBMA)を含むIPNフィルム。図3に示すように、厚さ100μmのSPUフィルムを溶媒蒸発法によって作製した。SPU溶液を、最初にジメチルアセトアミド(DMA)に溶解した5.0重量%SPU粉末から調製した。溶液をスライドガラス上に注型し、スライドを35℃に加熱してフィルムを乾燥した。溶媒のバルクを一晩蒸発させた後、痕跡量のDMAcを除去するためにSPUフィルムを60℃の水浴に24時間入れ、その後真空炉で3日間乾燥した。次にSPUフィルムを、SBMAモノマー、HEMAモノマー、GDGDA架橋剤および光開始剤を含むインキュベーション溶液中に20℃で24時間液浸した。インキュベーション溶液中の極性を低下させながら、水、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールを含む混合溶媒を使用することによって溶媒の極性を変化させた。
SPUおよびポリ(SBMA)を含むIPNフィルム。図3に示すように、厚さ100μmのSPUフィルムを溶媒蒸発法によって作製した。SPU溶液を、最初にジメチルアセトアミド(DMA)に溶解した5.0重量%SPU粉末から調製した。溶液をスライドガラス上に注型し、スライドを35℃に加熱してフィルムを乾燥した。溶媒のバルクを一晩蒸発させた後、痕跡量のDMAcを除去するためにSPUフィルムを60℃の水浴に24時間入れ、その後真空炉で3日間乾燥した。次にSPUフィルムを、SBMAモノマー、HEMAモノマー、GDGDA架橋剤および光開始剤を含むインキュベーション溶液中に20℃で24時間液浸した。インキュベーション溶液中の極性を低下させながら、水、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールを含む混合溶媒を使用することによって溶媒の極性を変化させた。
インキュベーション溶液の総濃度(またはインキュベーション濃度)を0.1−3.0mol/Lに調整した。SBMAモノマー比(mol%)は、SBMAモノマーのモル数をインキュベーション溶液中のSBMAとEHMAモノマーの総モル数で除したものと定義される。この実施例では、IPNについての作製条件を最適化するためにSBMAモノマー比を0−100mol%に調整し、GDGDAは1.0×10−2mol/Lに固定した。副反応を排除するため、暗所にて窒素の存在下で1.0×10−2mol/Lの光開始剤(たとえばカンホルキノンおよびエチル4−(N,N−ジメチルアミノ)ベンゾエート)をインキュベーション溶液に添加した。光重合のために、SPUフィルムを2枚の雲母シートの間に置き、可視光(λ=400−500nm)で照射した。20℃で120分間の照射後、雲母シートを水中でIPNフィルムから除去し、未反応モノマーを、エタノールとメタノールに交互に数回浸すことによって抽出して、IPNフィルムを真空炉で乾燥した。IPNフィルムの化学組成物の深さプロフィールを、Renishaw in
Via Raman Spectroscopeと倒立Leica DMIRBE Microscopeを組み合わせたラマン顕微分光計を用いて特性決定した。785nmレーザーを励起源として使用し、40x対物レンズを通して試料表面の約1μm光点に焦点を合わせた。試料表面からの散乱光を同じ対物レンズを通して収集した。Raleigh散乱光をホログラフィックノッチフィルターによって遮断した。ラマン光を、65μm開口部と1200l/mm回折格子を備える入射スリットに通し、CCDカメラによって測定した。SPUフィルム内のSBMA単位の分布深さプロフィールのために、フィルムの表面および20μmの増分でフィルム内の焦点面からラマンスペクトルを取得した。
Via Raman Spectroscopeと倒立Leica DMIRBE Microscopeを組み合わせたラマン顕微分光計を用いて特性決定した。785nmレーザーを励起源として使用し、40x対物レンズを通して試料表面の約1μm光点に焦点を合わせた。試料表面からの散乱光を同じ対物レンズを通して収集した。Raleigh散乱光をホログラフィックノッチフィルターによって遮断した。ラマン光を、65μm開口部と1200l/mm回折格子を備える入射スリットに通し、CCDカメラによって測定した。SPUフィルム内のSBMA単位の分布深さプロフィールのために、フィルムの表面および20μmの増分でフィルム内の焦点面からラマンスペクトルを取得した。
固相酵素免疫検定法(ELISA)を用いたタンパク質吸着の評価。IPNフィルムへのヒトフィブリノゲン(Fg)の吸着を、以下で簡単に述べる標準プロトコールに従い、ELISAを用いて評価した。最初に、表面積12mm2のIPNフィルムを24穴組織培養プレートの個々のウエルに入れ、各々のウエルをPBS500μlと共に室温でインキュベートした。次に、IPNフィルムをPBS溶液中1mg/mlのFg500μlに浸漬した。37℃で90分間のインキュベーション後、フィルムをPBS500μlで5回洗浄し、その後Fgによって占められていない領域をブロックするために37℃で90分間ウシ血清アルブミン(BSA)中でインキュベートした。IPNフィルムを再びPBSで5回洗浄し、新しいプレートに移して、5.5μg/mlホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)複合抗Fg(US Biological)を含むPBS500μl中、37℃で30分間インキュベートした。試料をPBS500μlで5回洗浄し、清浄なウエルに移した後、1mg/mlの色原体、o−フェニレンジアミン(ODP)および0.03%過酸化水素を含む0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液(pH5.0)500μlを添加した。37℃で20分間のインキュベーション後、各々のウエルの溶液に1M H2SO4500μlを添加して酵素誘導の呈色反応を停止させ、最後にマイクロプレートリーダーによって490nmでの吸光度を測定した。IPN試料へのタンパク質吸着を、ポリスチレン(PS)プレートへの吸着を対照標準として基準化した。得られた吸着タンパク質の量は、使用したポリクローナル抗ヒトFg上の多数の結合部位の存在のゆえに、実際の量よりも高いと考えられた。
代表的汚損防止カルボキシベタインコーティング
ヒト血漿フィブリノゲンおよびニワトリ卵白リゾチームをSigma−Aldrich(Milwaukee,WI)より購入した。ヒト血漿フィブロネクチンはChemical International(Temecula,CA)より購入した。ヒト絨毛ゴナドトロピン(hCG)およびそのモノクローナルマウス抗体(IgG1アイソタイプ)はScripps Laboratories(San Diego,CA)より購入した。2−(N,N’−ジメチルアミノ)エチルメタクリレート(DMAEM、98%)、β−プロピオラクトン(95%)、臭化銅(I)(99.999%)、臭化ブロモイソブチリル(98%)、11−メルカプト−1−ウンデカノール(97%)、2,2’−ビピリジン(BPY 99%)およびテトラヒドロフラン(THF HPLCグレード)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)および1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDC)は、Sigma−Aldrich(Milwaukee,WI)より購入した。リン酸緩衝食塩水(PBS、0.01Mリン酸塩、0.138M塩化ナトリウム、0.0027M塩化カリウム、pH7.4)はSigma Chemical Co.より購入した。エタノール(無水、200プルーフ)はAAPER
Alcohol and Chemical Co.より購入した。実験で使用する水は、最小低効率18.0MΩcmでMillipore水精製システムを用いて精製した。反応および戦場のためのTHFは、使用前にナトリウムによって乾燥した。
ヒト血漿フィブリノゲンおよびニワトリ卵白リゾチームをSigma−Aldrich(Milwaukee,WI)より購入した。ヒト血漿フィブロネクチンはChemical International(Temecula,CA)より購入した。ヒト絨毛ゴナドトロピン(hCG)およびそのモノクローナルマウス抗体(IgG1アイソタイプ)はScripps Laboratories(San Diego,CA)より購入した。2−(N,N’−ジメチルアミノ)エチルメタクリレート(DMAEM、98%)、β−プロピオラクトン(95%)、臭化銅(I)(99.999%)、臭化ブロモイソブチリル(98%)、11−メルカプト−1−ウンデカノール(97%)、2,2’−ビピリジン(BPY 99%)およびテトラヒドロフラン(THF HPLCグレード)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)および1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDC)は、Sigma−Aldrich(Milwaukee,WI)より購入した。リン酸緩衝食塩水(PBS、0.01Mリン酸塩、0.138M塩化ナトリウム、0.0027M塩化カリウム、pH7.4)はSigma Chemical Co.より購入した。エタノール(無水、200プルーフ)はAAPER
Alcohol and Chemical Co.より購入した。実験で使用する水は、最小低効率18.0MΩcmでMillipore水精製システムを用いて精製した。反応および戦場のためのTHFは、使用前にナトリウムによって乾燥した。
CBMA合成。カルボキシベタインメタクリレート(CBMA)モノマー、2−カルボキシ−N,N−ジメチル−N−(2’−メタクリロイルオキシエチル)エタンアンモニウム内部塩を、2−(N,N’−ジメチルアミノ)エチルメタクリレート(DMAEM、98%)とβ−プロピオラクトン(95%)の反応によって合成した。無水アセトン10mL中のβ−プロピオラクトン0.87g(12mmol)を、無水アセトン50mLに溶解したDMAEM1.57g(10mmol)の溶液に滴下した。反応物を窒素保護下に15℃で約5時間攪拌した。白色沈殿物を無水アセトン50mLおよび無水エーテル100mLで洗った。生成物を減圧下で乾燥してCBMAモノマーを得た。重合までモノマーを2−8℃に保持した。収率:91%。1H NMRを、重水を溶媒として用いてBruker AV300分光計で記録した(図31)。
SPRセンサーでの表面開始重合。SPRガラスチップを、真空下に電子ビーム蒸着によって接着促進クロム層(2nm)および表面プラズモン活性金層(48nm)で被覆した。SAMの作製の前に、基材を純水エタノールで洗い、紫外光下で清浄化して、水と純水エタノールで洗った。金被覆基材を、室温で24時間、1mM ω−メルカプトウンデシルブロモイソブチレートの純水エタノール溶液に浸すことによって開始剤SAMを形成した。重合の前に、基材を純水エタノール、次いでTHFで洗浄し、窒素流で乾燥した。
CuBrと固定化開始剤を有する基材を、窒素保護下で乾燥箱内の反応管に入れた。ゴム隔壁栓で密封した管を取り出した。次に、CBMAとBPYを含む脱ガス溶液(1:1容積比の純水とメタノール)を、窒素保護下に注射器を用いて管に移した。反応後、基材を取り出し、エタノールと水で洗って、試料を一晩水中に保持した。試験前に非結合ポリマーを除去するためにPBS緩衝液による洗浄も適用する。典型的重合のため、基材を、窒素保護下で1時間、CH3OH/H2O(1:1容積比)25mL中のCBMA7.5mmol、BPY2mmolおよびCuBr 1mmolと反応させた。典型的ATRP重合後、均一なカルボキシベタインポリマーブラシをSPRセンサーの金表面にグラフト化した。ポリマー層の厚さは、偏光解析法によって測定したとき約10−15nmであった。
SPR分析およびタンパク質吸着。波長インテロゲーションに基づく、特注の表面プラズモン共鳴(SPR)センサーでタンパク質吸着を測定した。SPRチップをプリズムの基部に取り付け、屈折率マッチング液(Cargille)を用いて光学的接触を確立した。4つの独立した平行フローチャネルを有する四チャネルフローセルを、実験の間液体試料を収容するために使用した。ペリスタルティックポンプ(Ismatec)を、液体試料をフローセルの4つのチャネルに送達するために利用した。PBS中1.0mg/mLのフィブリノゲン溶液を0.05mL/分の流速でセンサー表面に流した。タンパク質−表面相互作用をリアルタイムで観測するためにSPR検出器を使用した。この試験では、表面濃度(または単位面積当たりの質量)の変化を測定するために波長シフトを使用した。
偏光解析法。分光エリプソメータ(Sentech SE−850,GmbH)を用いて偏光解析法を実施した。試料の作製はXPS実験におけるものと同じである。5つの別々のスポットをVIS領域にて3つの異なる入射角(50、60および70°)で測定した。金被覆チップの同じバッチをUV−オゾンクリーナーによって20分間清掃し、エタノールとミリポア水で洗って、窒素で乾燥した。裸の金被覆チップを対照標準として使用した。試験したフィルムの厚さは、Cauchy層モデルを1.45の仮定屈折率で使用して決定した。
代表的カルボキシベタインヒドロゲル
この実施例では、ポリ(CBMA)ヒドロゲルとタンパク質吸着および細胞付着に対するその耐性を述べる。2.7M CBMAモノマーをテトラエチレングリコールジメタクリレート(TEGDMA)(5.9mol%)に添加し、混合溶液(エチレングリコール/エタノール/H2O=3:1:1容積比)中のメタ重亜硫酸ナトリウム(1.2mol%)および過硫酸アンモニウム(2.6mol%)によって開始させたフリーラジカル重合を通してCBMAヒドロゲルを作製した。反応は37℃で12時間実施した。重合後、ゲルを大量のDI水に3日間液浸し、残留化学物質を除去するために毎日水を交換した。次にゲルを滅菌PBS溶液中に平衡させ、滅菌PBS溶液をさらに2日間毎日交換した。ヒドロゲルを直径5mmでディスクに穿孔し、使用まで滅菌緩衝液中で保存した。
この実施例では、ポリ(CBMA)ヒドロゲルとタンパク質吸着および細胞付着に対するその耐性を述べる。2.7M CBMAモノマーをテトラエチレングリコールジメタクリレート(TEGDMA)(5.9mol%)に添加し、混合溶液(エチレングリコール/エタノール/H2O=3:1:1容積比)中のメタ重亜硫酸ナトリウム(1.2mol%)および過硫酸アンモニウム(2.6mol%)によって開始させたフリーラジカル重合を通してCBMAヒドロゲルを作製した。反応は37℃で12時間実施した。重合後、ゲルを大量のDI水に3日間液浸し、残留化学物質を除去するために毎日水を交換した。次にゲルを滅菌PBS溶液中に平衡させ、滅菌PBS溶液をさらに2日間毎日交換した。ヒドロゲルを直径5mmでディスクに穿孔し、使用まで滅菌緩衝液中で保存した。
ヒドロゲルディスクを、ジオキサン/水(14:1)混合物中2mg/ml NHSおよび2mg/ml EDCのジオキサンに室温で1時間液浸した。ヒドロゲルディスクは、ジオキサン/水溶液での浸漬中に収縮した。ディスクを溶液から取り出し、もとのように膨潤させるためミリポア水に浸して、ミリポア水で洗浄し、さらに30分間PBS緩衝液に浸した。試料を4℃で24時間100μg/mLフィブロネクチン溶液に液浸した。
ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)を1×105細胞/mLの密度でゲル表面に接種した。細胞負荷試料を、5%CO2の加湿雰囲気中37℃で培養した。培養2時間目から3日目まで細胞形態を観察した。
ガラス表面の代表的ポリ(SBMA)またはポリ(CBMA)コーティング
通常ガラス基材を20重量%のNaOH溶液に一晩入れ、DI水で洗って、空気中で乾燥した。清浄化した基材を、2−ブロモ−2−メチル−N−3−[(トリメトキシシリル)プロピル]−プロパンアミド0.5gを含む溶液20mL中に液浸した。2時間後、基材を浸漬溶液から取り出し、エタノールでわずかに洗浄した。基材を、オイルフリー真空ポンプによって真空にした真空炉内に100℃で5時間保持した。
通常ガラス基材を20重量%のNaOH溶液に一晩入れ、DI水で洗って、空気中で乾燥した。清浄化した基材を、2−ブロモ−2−メチル−N−3−[(トリメトキシシリル)プロピル]−プロパンアミド0.5gを含む溶液20mL中に液浸した。2時間後、基材を浸漬溶液から取り出し、エタノールでわずかに洗浄した。基材を、オイルフリー真空ポンプによって真空にした真空炉内に100℃で5時間保持した。
CuBr(143mg、1.0mmol)および固定化開始剤を有する2つの基材を窒素保護下で乾燥箱内の50mLフラスコに入れ、ゴム隔壁栓で密封した後、乾燥箱から取り出した。次に、SBMA(1.06g、3.8mmol)またはCBMA(874mg、3.8mmol)と2,2’−ビピリジン(156mg、1mmol)を含む脱ガス溶液(1:1容積比の純水とメタノール、10mL)を、窒素保護下に注射器を用いてフラスコに移した。1時間の反応後、基材を取り出し、エタノール、PBS緩衝液および水で洗浄して、試料を一晩水中に保持した。使用前に基材を窒素流で乾燥した。
固相酵素免疫検定法(ELISA)は、ポリSBMAまたはポリCBMAグラフト化表面へのタンパク質吸着の有意の低下を示した(図18参照)。ポリマーグラフト化ガラス試料上の吸着フィブリノゲンは、通常ガラス試料の4%未満であった。緑藻類胞子と共に6時間インキュベーションしたポリSBMAグラフト化表面上に藻類胞子または藻類付着は認められなかったが、対照ガラス試料は緑藻類で覆われた(図20参照)。
例示的実施形態を説明し、記述したが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく様々な変更を行い得ることは認識される。
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- 本願明細書に記載された発明。
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