JP6174313B2

JP6174313B2 - 細胞培養シート

Info

Publication number: JP6174313B2
Application number: JP2012245193A
Authority: JP
Inventors: 剣萍グン; 孝幸黒川; 泰吾赤崎; 猿渡　欣幸; 欣幸猿渡
Original assignee: Osaka Organic Chemicals Ind.,Ltd.; Hokkaido University NUC
Current assignee: Osaka Organic Chemicals Ind.,Ltd.; Hokkaido University NUC
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2017-08-02
Anticipated expiration: 2032-11-07
Also published as: JP2014091823A

Description

本発明は、親水性に優れるのみならず、マクロファージの付着性が小さく、さらに成長させた細胞を剥がす際に剥がしやすいという優れた性質を有する細胞培養シートに関する。

損傷した組織などの修復のために、種々の細胞を移植する試みが行なわれている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患によって損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）などの移植細胞の利用が試みられている。しかし、移植細胞を細胞懸濁液の状態で組織に投与したとき、移植細胞の注入効率が低く、レシピエント組織が穿刺によって損傷するおそれがあり、さらに広範囲での組織の修復が困難であることが指摘されている。

そこで、近年、スキャフォールドを利用して形成された細胞構造物および細胞をシート状に成形することによって得られる細胞シートが開発されている。この細胞シートは、例えば、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シート、角膜損傷に対する角膜上皮細胞シート、内視鏡によって食道癌を切除した後に使用される口腔粘膜細胞シートなどに利用することが検討されている。

細胞シートは、一般に培養基材上で形成され、当該細胞シート上には細胞が培養される。当該細胞シートは、実際に治療の際に用いるときには培養基材から単離する必要がある。細胞シートを培養基材から単離させる方法としては、例えば、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を用いて細胞シートを培養基材から単離させる方法、スクレーパー、ピペットなどを用いて機械的に細胞シートを培養基材から剥離する方法などが知られている。

しかしながら、これらの方法によれば、細胞シートを培養基材から単離するときに細胞シートが損傷したり、細胞の生存率が低下したりするため、培養基材の材質およびその構造を改良することにより、細胞シートを容易に培養基材から単離させることができる手段が検討されている。例えば、前記手段として、温度応答性高分子化合物であるＮ−イソプロピルアクリルアミド（以下、ＮＩＰＡＭという）は、低温状態では膨潤し、液状となるが、３４℃付近の温度で相転移し、急激に収縮してゲル化する性質を有することから、３７℃の温度でゲル化させたＮＩＰＡＭ上で培養した細胞を当該ＮＩＰＡＭごとに別の細胞層に重ねた後、培養温度を３４℃以下の温度に下げることにより、ＮＩＰＡＭを取り除き、細胞同士を直接重ねることが提案されている（例えば、非特許文献１−３参照）。しかし、ＮＩＰＡＭは、生体適合性が十分であるとはいえないため、細胞の培養中にマクロファージがＮＩＰＡＭに付着することによって炎症性タンパクの分泌が促進され、患者に適用したときに免疫拒絶反応が生じるおそれがある。

細胞培養支持体として、天面を有する複数の凸部と当該複数の凸部間に形成される凹部とを備え、前記凹部の開口部の寸法が、培養される細胞が潜入することができない寸法であり、前記該細胞シートが剥離可能である細胞培養支持体が提案されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、この細胞培養支持体は、大量に生産するのに不向きであり、また高価であるという欠点を有するのみならず、生体適合性が十分であるとはいえないため、培養中にマクロファージが当該細胞培養支持体に付着することによって炎症性タンパクの分泌が促進されることから、患者に適用したときに免疫拒絶反応が生じるおそれがある。

また、タンパク質、血球などの生体成分との相互作用が小さく、生体適合性に優れた医療用材料として、Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタインを含有するモノマー組成物を重合させることによって得られるポリマーを基材表面で形成させた医療用材料が提案されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、この医療用材料は、細胞の接着量が少ないことからマクロファージなどの細胞が付着しにくいことが考えられるが、その表面の柔軟性が小さいことから、当該材料の表面上で成長させた細胞を当該材料から剥がす際に、細胞が傷つくおそれがある。

特開２００８−１１７６６号公報特開２０１０−５７７４５号公報

清水達也ら著、「バイオサイエンスとバイオインダストリー」、５８巻、８５１頁、一般財団法人バイオインダストリー、２０００年大和雅之ら著、「蛋白質核酸酵素」、４５巻、７２頁、共立出版株式会社、２０００年大和雅之ら著、「蛋白質核酸酵素」、４５巻、１６２頁、共立出版株式会社、２０００年

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、親水性に優れているのみならず、マクロファージの付着性が小さく、柔軟性にも優れた水性ゲル基材を提供することを課題とする。本発明は、また、親水性に優れているのみならず、マクロファージの付着性が小さく、さらに柔軟性にも優れ、成長させた細胞を容易に剥がすことができる細胞培養シートを提供することを課題とする。

本発明は、
（１）基材として式(I):

（式中、Ｒ¹ 、Ｒ ³ およびＲ ⁴はメチル基、Ｒ²はエチレン基、Ｒ ⁵はメチレン基、Ｘは酸素原子を示す）
で表わされる親水性モノマーおよび架橋性モノマーを含有するモノマー成分を重合させてなる架橋ポリマーを有効成分として含有する水性ゲル基材が用いられてなる細胞培養シートであって、前記架橋性モノマーが、アルキレン基の炭素数が１〜４のアルキレンビス(メタ)アクリルアミドであることを特徴とする細胞培養シート
に関する。

本発明の水性ゲル基材は、親水性に優れているのみならず、マクロファージの付着性が小さく、柔軟性にも優れるという優れた効果を奏する。本発明の細胞培養シートは、前記水性ゲル基材が用いられていることから、親水性に優れているのみならず、マクロファージの付着性が小さく、さらに柔軟性にも優れているので、成長させた細胞を当該細胞培養シートから容易に剥がすことができるという優れた効果を奏する。

本発明の水性ゲル基材は、前記したように、式(I):

（式中、Ｒ¹は水素原子または炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ²は炭素数１〜８のアルキレン基、Ｒ³およびＲ⁴はそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ⁵は炭素数１〜４のアルキレン基、Ｘは酸素原子または−ＮＨ−基を示す）
で表わされる親水性モノマーおよび架橋性モノマーを含有するモノマー成分を重合させてなる架橋ポリマーを有効成分として含有することを特徴とする。

なお、本明細書において、「架橋ポリマーを有効成分として含有する」は、本発明の水性ゲル基材が架橋ポリマーを有効成分として含有し、本発明の目的が阻害されない範囲内で、当該架橋ポリマー以外の成分が含まれていてもよいことを意味する。

本発明の水性ゲル基材は、前記架橋ポリマーが用いられているので、親水性に優れているのみならず、マクロファージの付着性が小さく、柔軟性にも優れている。また、本発明の細胞培養シートは、前記水性ゲル基材が用いられていることから、親水性に優れているのみならず、マクロファージの付着性が小さく、さらに柔軟性にも優れているので、成長させた細胞を当該細胞培養シートから容易に剥がすことができる。

本発明の水性ゲル基材および細胞培養シートがこのように優れた性質を有する理由は、定かではないが、おそらく以下の理由に基づくものと考えられる。

すなわち、従来の細胞培養シートでは、マクロファージが当該細胞培養シートに直接接触することから、マクロファージが当該細胞培養シートに付着するものと考えられる。これに対して、本発明の水性ゲル基材および細胞培養シートでは、水性ゲル基材に用いられている架橋ポリマーが親水性に優れているのみならず、当該水性ゲル基材の表面上に薄い水膜が存在することにより、水性ゲル基材の表面上にマクロファージを載せたとき、マクロファージと当該水性ゲル基材とが直接接触することが妨げられるため、マクロファージが当該細胞培養シートに付着することが防止されることに基づくものと考えられる。さらに、本発明の細胞培養シートは、柔軟性にも優れていることから、例えば、ピンセットなどで細胞を当該細胞培養シートから容易に剥がすことができる。

したがって、本発明の水性ゲル基材は、親水性に優れており、水との馴染みがよいので、その表面上で水膜が形成されやすいのみならず、当該水性ゲル基材自体がその表面上に薄い水膜を形成するという性質を有するので、表面上で形成された水膜によってマクロファージが水性ゲル基材に付着することを防止することができることから、本発明の水性ゲル基材は、細胞培養シートに好適に使用することができる。

本発明の水性ゲル基材は、架橋ポリマーを有効成分として含有するものである。架橋ポリマーは、式(I)で表わされる親水性モノマーおよび架橋性モノマーを含有するモノマー成分を重合させることによって得られる。

式(I)で表わされる親水性モノマーにおいて、Ｒ¹は水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。炭素数１〜４のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。Ｒ¹のなかでは、水性ゲル基材の親水性を向上させ、マクロファージの付着を抑制する観点から、好ましくはメチル基およびエチル基、より好ましくはメチル基である。

式(I)で表わされる親水性モノマーにおいて、Ｒ²は、炭素数１〜８のアルキレン基である。炭素数１〜８のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基、ｔｅｒｔ−ブチレン基、ｎ−ペンテン基、シクロペンテン基、ｎ−ヘキセン基、イソヘキセン基、シクロヘキセン基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。Ｒ²のなかでは、水性ゲル基材の親水性を向上させ、マクロファージの付着を抑制する観点から、好ましくは炭素数１〜６のアルキレン基、より好ましくは炭素数１〜４のアルキレン基、さらに好ましくはメチレン基およびエチレン基、さらに一層好ましくはエチレン基である。

式(I)で表わされる親水性モノマーにおいて、Ｒ³およびＲ⁴は、それぞれ独立して、炭素数１〜４のアルキル基である。炭素数１〜４のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。Ｒ³のなかでは、水性ゲル基材の親水性を向上させ、マクロファージの付着を抑制する観点から、好ましくはメチル基およびエチル基、より好ましくはメチル基である。

式(I)で表わされる親水性モノマーにおいて、Ｒ⁵は、炭素数１〜４のアルキレン基である。炭素数１〜４のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基、ｔｅｒｔ−ブチレン基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。Ｒ⁵のなかでは、水性ゲル基材の親水性を向上させ、マクロファージの付着を抑制する観点から、好ましくはメチレン基およびエチレン基、より好ましくはメチレン基である。

式(I)で表わされる親水性モノマーにおいて、Ｘは、酸素原子または−ＮＨ−基である。Ｘのなかでは、水性ゲル基材の親水性を向上させ、マクロファージの付着を抑制する観点から、酸素原子が好ましい。

式(I)で表わされる親水性モノマーとしては、例えば、Ｎ−アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン、Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン、Ｎ−アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン、Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン、Ｎ−アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−β−Ｎ−エチルカルボキシベタイン、Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−β−Ｎ−エチルカルボキシベタイン、Ｎ−アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアンモニウム−β−Ｎ−エチルカルボキシベタイン、Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアンモニウム−β−Ｎ−エチルカルボキシベタインなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの親水性モノマーは、それぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。親水性モノマーは、例えば、特開平９−９５４７４号公報、特開平９−９５５８６号公報、特開平１１−２２２４７０号公報などに記載の方法で容易に調製することができる。

式(I)で表わされる親水性モノマーのなかでは、水性ゲル基材の親水性を向上させ、マクロファージの付着を抑制する観点から、Ｒ¹がメチル基、Ｒ²がエチレン基、Ｒ³およびＲ⁴がメチル基、Ｒ⁵がメチレン基、Ｘが酸素原子である親水性モノマー、より具体的には、Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタインが好ましい。

架橋性モノマーとしては、例えば、メチレンビスアクリルアミド、メチレンビスメタクリルアミドなどのアルキレン基の炭素数が１〜４のアルキレンビス(メタ)アクリルアミドなどの(メタ)アクリロイル基を２個以上、好ましくは２個有する（メタ）アクリルアミド化合物；エチレンジアクリレート、エチレンジメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、ジエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタクリレート、プロピレングリコールジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、プロピレングリコールジメタクリレート、プロピレングリコールジアクリレート、プロピレングリコールジメタクリレート、１，４−ブタンジオールジアクリレート、１，４−ブタンジオールジメタクリレート、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジメタクリレート、１，９−ノナンジオールジアクリレート、１，９−ノナンジオールジメタクリレート、２−ｎ−ブチル−２−エチル−１，３−プロパンジオールジアクリレート、２−ｎ−ブチル−２−エチル−１，３−プロパンジオールジメタクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、トリプロピレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジアクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレートなどの（メタ）アクリロイル基を２個以上、好ましくは２個または３個有する（メタ）アクリレート化合物；ジアリルアミン、トリアリルアミンなどの炭素−炭素二重結合を２個以上、好ましくは２個または３個有するアミン化合物；ジビニルベンゼン、ジアリルベンゼンなどの炭素−炭素二重結合を２個以上、好ましくは２個または３個有する芳香族化合物などの多官能モノマーが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの架橋性モノマーは、それぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。

なお、本明細書において、「（メタ）アクリ」は、「アクリ」または「メタクリ」を意味する。

架橋性モノマーのなかでは、水性ゲル基材の親水性を向上させ、マクロファージの付着を効率よく抑制する観点から、(メタ)アクリロイル基を２個以上有する（メタ）アクリルアミド化合物、（メタ）アクリロイル基を２個以上有する（メタ）アクリレート化合物、炭素−炭素二重結合を２個以上有するアミン化合物および炭素−炭素二重結合を２個以上有する芳香族化合物が好ましく、(メタ)アクリロイル基を２個以上有する（メタ）アクリルアミド化合物、（メタ）アクリロイル基を２個以上有する（メタ）アクリレート化合物および炭素−炭素二重結合を２個以上有するアミン化合物がより好ましく、(メタ)アクリロイル基を２個以上有する（メタ）アクリルアミド化合物および（メタ）アクリロイル基を２個以上有する（メタ）アクリレート化合物がさらに好ましく、(メタ)アクリロイル基を２個以上有する（メタ）アクリルアミド化合物さらに一層好ましく、アルキレン基の炭素数が１〜４のアルキレンビス(メタ)アクリルアミドが特に好ましい。これらの架橋性モノマーは、それぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。

また、炭素数が１〜４のアルキレンビス(メタ)アクリルアミドのなかでは、水性ゲル基材の親水性を向上させ、マクロファージの付着を効率よく抑制する観点から、メチレンビスアクリルアミドおよびメチレンビスメタクリルアミドがより好ましい。これらのアルキレンビス(メタ)アクリルアミドは、それぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。

親水性モノマー１００重量部あたりの架橋性モノマーの量は、水性ゲル基材の親水性を向上させ、マクロファージの付着を効率よく抑制するとともに、柔軟性を付与し、成長させた細胞を容易に剥がすことができるようにする観点から、好ましくは０．１〜５重量部、より好ましくは０．３〜３重量部である。

モノマー成分には、本発明の目的が阻害されない範囲内で他のモノマーが含まれていてもよい。他のモノマーとしては、例えば、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、アクリル酸エチル、メタクリル酸エチル、アクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸イソブチル、メタクリル酸イソブチル、アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル、メタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル、アクリル酸ネオペンチル、メタクリル酸ネオペンチル、アクリル酸オクチル、メタクリル酸オクチル、アクリル酸ラウリル、メタクリル酸ラウリル、アクリル酸ラウリル、メタクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、メタクリル酸ステアリル、アクリル酸セチル、メタクリル酸セチルなどのアルキル基の炭素数が１〜１８の（メタ）アクリル酸アルキルエステル；アクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸シクロヘキシルなとの炭素数６〜１２のシクロアルキル基を有するシクロアルキル（メタ）アクリレート；アクリル酸ベンジル、メタクリル酸ベンジルなどのアリール基の炭素数が６〜１２の（メタ）アクリル酸アリールエステル；アクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ヒドロキシプロピル、メタクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル酸ヒドロキシブチル、メタクリル酸ヒドロキシブチルなどのヒドロキシアルキル基の炭素数が２〜６の（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキル；アクリル酸メトキシエチル、メタクリル酸メトキシエチル、アクリル酸メトキシブチル、メタアクリル酸メトキシブチルなどのアルコキシアルキル基の炭素数が２〜８の（メタ）アクリル酸アルコキシアルキル；アクリル酸エチルカルビトール、メタクリル酸エチルカルビトールなどのアルキル基の炭素数が１〜４の（メタ）アクリル酸アルキルカルビトール；Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−メチルメタアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルメタクリルアミド、Ｎ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−オクチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルメタクリルアミドなどのアルキル基の炭素数が１〜１２のアルキル（メタ）アクリルアミド：Ｎ−ブトキシメチルアクリルアミド、Ｎ−ブトキシメチルメタアクリルアミドなどのアルコキシ基の炭素数が１〜６のアルコキシ（メタ）アクリルアミド；アクリロイルモルホリン、メタクリロイルモルホリンなどの（メタ）アクリロイルモルホリン；ジアセトンアクリルアミド、ジアセトンメタクリルアミドなどのジアセトン（メタ）アクリルアミド；スチレン、メチルスチレンなどのスチレン系モノマー；イタコン酸メチル、イタコン酸エチルなどの（メタ）アクリル酸アルキルエステル以外のアルキル基の炭素数が１〜４の脂肪酸アルキルエステル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどの脂肪酸ビニルエステル；Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルカプロラクタムなどの窒素原子含有モノマーなどの単官能モノマーなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの他のモノマーは、それぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。

モノマー成分を重合させる際の雰囲気は、特に限定がなく、大気であってもよく、あるいは窒素ガス、アルゴンガスなどの不活性ガスであってもよい。

モノマー成分の重合は、例えば、塊状重合法、溶液重合法などによって行なうことができる。モノマー成分を溶液重合法によって重合させる場合には、溶媒が用いられる。溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコールなどのアルコール類；アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのアルキルエーテル類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族化合物類；ｎ−ヘキサン、シクロヘキサンなどの炭化水素化合物；酢酸メチル、酢酸エチルなどの酢酸エステル類などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの溶媒は、それぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。溶媒の量は、当該溶媒の種類によって異なるので一概には限定することができないが、通常、モノマー成分１００重量部あたり、３００〜１０００重量部程度であることが好ましい。

モノマー成分の重合は、例えば、ラジカル重合法、リビングラジカル重合法、アニオン重合法、カチオン重合法、付加重合法、重縮合法などの重合法によって行なうことができる。

モノマー成分を重合させる際には、重合開始剤を用いることができる。重合開始剤としては、例えば、熱重合開始剤、光重合開始剤などが挙げられる。

熱重合開始剤としては、例えば、アゾイソブチロニトリル、アゾイソ酪酸メチル、アゾビスジメチルバレロニトリルなどのアゾ系重合開始剤、過酸化ベンゾイル、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウムなどの過酸化物系重合開始剤などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの重合開始剤は、それぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。

重合開始剤として熱重合開始剤を用いる場合、当該熱重合開始剤の量は、モノマー成分１００重量部あたり、通常、０．０１〜２０重量部程度であることが好ましい。

光重合開始剤としては、例えば、２−オキソグルタル酸、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニルプロパン−１−オン、２−メチル[４−（メチルチオ）フェニル]−２−モルフォリノプロパン−１−オン、２，２−ジメトキシ−１，２−ジフェニルエタン−１−オン、ベンゾフェノン、１−[４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル]−２−ヒドロキシ−２−メチル１−プロパン−１−オン、２−ベンジル−２−ジメチルアミノ−１−（４−モルフォリノフェニル）ブタン−１−オン、ビス（２，６−ジメトキシベンゾイル）−２，４，４−トリメチルペンチルフォスフィンオキサイドなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの重合開始剤は、それぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。

重合開始剤として光重合開始剤を用いる場合、当該光重合開始剤の量は、モノマー成分１００重量部あたり、通常、０．０１〜２０重量部程度であることが好ましい。

モノマー成分の重合温度は、特に限定がなく、通常、５〜８０℃程度の温度であればよい。また、モノマー成分の重合に要する時間は、重合条件によって異なるので一概には決定することができないことから任意である。重合反応は、通常、残存しているモノマーの量が１０重量％以下になった時点で、任意に終了することができる。なお、残存しているモノマーの量は、例えば、シュウ素をモノマーの二重結合に付加し、二重結合含量を測定することによって決定することができる。

以上のようにしてモノマー成分を重合させることにより、架橋ポリマーが得られる。前記で得られた架橋ポリマーをゲル化させることにより、水性ゲル基材が得られる。なお、溶媒として水を用い、モノマー成分を溶液重合させた場合には、直接的に架橋ポリマーからなる水性ゲル基材を得ることができる。また、架橋ゲルに水を添加することにより、架橋ポリマーをゲル化させることによっても水性ゲル基材を得ることができる。しかし、水性ゲル基材の親水性を向上させ、マクロファージの付着を効率よく抑制する観点から、溶媒として水を用い、モノマー成分を溶液重合させることにより、架橋ポリマーからなる水性ゲル基材を得ることが好ましい。

以上のようにして得られる本発明の水性ゲル基材の含水率は、水性ゲル基材の親水性を向上させ、マクロファージの付着を効率よく抑制する観点から、好ましくは０．５〜２０重量％、より好ましくは１〜１５重量％、さらに好ましくは３〜１０重量％である。

本発明の水性ゲル基材には、本発明の目的を阻害しない範囲内で、抗菌剤、着色剤、香料などが適量で含まれていてもよい。

本発明の水性ゲル基材の形状は、任意であり、例えば、前記モノマーを所定の内面形状を有する成形型内に入れて重合させた場合には、当該成形型の内面形状に対応した形状を有する水性ゲル基材を得ることができる。また、前記モノマーを基材上に流延した場合には、フィルム状ないしシート状の水性ゲル基材をすることができる。例えば、本発明の水性ゲル基材を細胞培養シートなどの用途に使用する場合には、水性ゲル基材は、例えば、厚さが５０μｍ〜５ｍｍ程度のシートとして用いることができる。

本発明の水性ゲル基材は、前記したように、親水性に優れているのみならず、マクロファージの付着性が小さいという優れた性質を有することから、例えば、細胞培養シートなどに好適に使用することができる。

本発明の細胞培養シートの好適な製造方法としては、例えば、モノマー成分の水溶液を溶液重合させることにより、架橋ポリマーからなるシート状の水性ゲル基材を製造する方法などが挙げられるが、本発明は、かかる方法のみに限定されるものではない。シート状の水性ゲル基材を製造する方法の具体例としては、モノマー成分の水溶液を溶液重合させる際に、当該モノマー成分の水溶液をシートの厚さに対応する厚さとなるように容器に入れ、当該容器内でモノマー成分を重合させる方法、モノマー成分の水溶液を溶液重合させることによって得られた水性ゲル基材を所望の厚さとなるように延ばすことによってシート状の細胞培養シートとする方法、モノマー成分の水溶液を溶液重合させることによって得られた水性ゲル基材を所望の厚さとなるようにスライスすることにより、シート状の細胞培養シートとする方法などが挙げられるが、本発明は、かかる方法のみに限定されるものではない。

以上のようにして本発明の細胞培養シートが得られる。本発明の細胞培養シートの大きさおよび厚さは、その用途などによって異なることから一概には決定することができない。したがって、本発明の細胞培養シートの大きさおよび厚さは、その用途などに応じて適宜調整することが好ましい。

本発明の細胞培養シートの裏面には、必要により、織布、不織布、樹脂シート、樹脂フィルムなどの補強材が設けられていてもよい。また、本発明の細胞培養シートの裏面に樹脂シート、樹脂フィルムなどの補強材を設ける場合には、細胞培養シートと補強材との親和性を向上させる観点から、例えば、補強材の表面にアニオン性基を有する架橋ポリマーなどからなる架橋ポリマー層が形成されていてもよい。前記アニオン性基を有する架橋ポリマーは、例えば、アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、メチレンビスアクリルアミドなどのモノマー成分を溶液重合法などの重合方法により重合させることによって形成することができる。

本発明の細胞培養シートは、親水性に優れているのみならず、マクロファージの抗付着性にも優れており、ＥＳ細胞を培養する際の分化および脱分化を抑制することができるので、マクロファージの付着抑制用細胞培養シートなどとして好適に使用することができるものである。

次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。

実施例１
厚さが５ｍｍの透明な樹脂フィルムで製造された一辺の長さが１０ｃｍの立方体からなるセルを用意した。

次に、アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）１４．１ｇ、メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ）０．６ｇおよび光重合開始剤として２−オキソグルタル酸０．０１ｇを蒸留水１００ｇに溶解させることにより、溶液Ａを得た。

一方、Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン１８．６ｇ、メチレンビスアクリルアミド０．１５ｇおよび２−オキソグルタル酸０．０１５ｇを蒸留水１００ｇに溶解させることにより、モノマー成分の水溶液（溶液Ｂ）を得た。

次に、溶液Ａを前記セルに入れ、その側面から紫外線照射機〔ＵＶＰ（株）製、品番：９５−００４２−１２〕を用いて照度４ｍＷ／ｃｍ²、照射時間６時間、積算光量８６．４Ｊ／ｃｍ²にて紫外線を照射することにより、樹脂フィルム上にアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸−メチレンビスアクリルアミドコポリマーからなる架橋ポリマー層を形成させた。その後、溶液Ｂを前記セルに入れ、均一な組成となるように撹拌した後、再度、セルの側面から前記紫外線照射機を用いて照度４ｍＷ／ｃｍ²、照射時間６時間、積算光量８６．４Ｊ／ｃｍ²にて紫外線を照射することにより、厚さが約１ｍｍの水性ゲル基材を調製した。この水性ゲル基材に対する水の接触角を(株)レスカ製、動的濡れ性試験器（品番：ＷＥＴ−６０００）で測定したところ、当該接触角は、０度であった。このことから、当該水性ゲル基材は、親水性に優れていることが確認された。この水性ゲル基材を細胞培養シートとして用いた。

実施例２
実施例１において、メチレンビスアクリルアミドの量を０．１０ｇに変更したこと以外は、実施例１同様にして水性ゲル基材を調製した。この水性ゲル基材に対する水の接触角を実施例１同様にして測定したところ、当該接触角は、０度であった。このことから、当該水性ゲル基材は、親水性に優れていることが確認された。この水性ゲル基材を細胞培養シートとして用いた。

実施例３
実施例１において、メチレンビスアクリルアミドの量を０．３０ｇに変更したこと以外は、実施例１同様にして水性ゲル基材を調製した。この水性ゲル基材に対する水の接触角を実施例１同様にして測定したところ、当該接触角は、０度であった。このことから、当該水性ゲル基材は、親水性に優れていることが確認された。この水性ゲル基材を細胞培養シートとして用いた。

実施例４
実施例１において、メチレンビスアクリルアミドの代わりにエチレングリコールジアクリレート０．１５ｇを用いたこと以外は、実施例１同様にして水性ゲル基材を調製した。この水性ゲル基材に対する水の接触角を実施例１同様にして測定したところ、当該接触角は、０度であった。このことから、当該水性ゲル基材は、親水性に優れていることが確認された。この水性ゲル基材を細胞培養シートとして用いた。

実施例５
実施例１において、メチレンビスアクリルアミドの代わりにトリアリルアミン０．２０ｇを用いたこと以外は、実施例１同様にして水性ゲル基材を調製した。この水性ゲル基材に対する水の接触角を実施例１同様にして測定したところ、当該接触角は、０度であった。このことから、当該水性ゲル基材は、親水性に優れていることが確認された。この水性ゲル基材を細胞培養シートとして用いた。

比較例１
厚さが５ｍｍの透明な樹脂フィルムで製造された一辺の長さが１０ｃｍの立方体からなるセルを用意した。

一方、アクリルアミド７．０ｇ、メチレンビスアクリルアミド０．６ｇおよび２−オキソグルタル酸０．０１ｇを蒸留水１００ｇに溶解させることにより、モノマー成分の水溶液（溶液Ｂ）を得た。

次に、溶液Ａを前記セルに入れ、その側面から紫外線照射機〔ＵＶＰ（株）製、品番：９５−００４２−１２〕を用いて照度４ｍＷ／ｃｍ²、照射時間６時間、積算光量８６．４Ｊ／ｃｍ²にて紫外線を照射することにより、樹脂フィルム上にアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸−メチレンビスアクリルアミドコポリマーからなる架橋ポリマー層を形成させた。その後、溶液Ｂを前記セルに入れ、均一な組成となるように撹拌した後、再度、セルの側面から前記紫外線照射機を用いて照度４ｍＷ／ｃｍ²、照射時間６時間、積算光量８６．４Ｊ／ｃｍ²にて紫外線を照射することにより、水性ゲル基材を調製した。得られた水性ゲル基材を細胞培養シートとして用いた。

比較例２
厚さが５ｍｍの透明な樹脂フィルムで製造された一辺の長さが１０ｃｍの立方体からなるセルを用意した。

一方、ジメチルアクリルアミド９．９ｇ、メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ）０．４５ｇ、２−オキソグルタル酸０．０１５ｇを蒸留水１００ｇに溶解させることにより、モノマー成分の水溶液（溶液Ｂ）を得た。

比較例３
特開２０１０−５７７４５号公報に記載の「実施例１」に準じてポリマーブラシを有するガラス板を製造し、得られたポリマーブラシを有するガラス板を細胞培養シートとして用いた。

比較例４
細胞培養シートとして、ポリスチレン製の細胞培養シートを用いた。

比較例５
細胞培養シートとして、プラズマ放電による表面処理が施されたポリスチレン製の細胞培養シートを用いた。

次に、各実施例または各比較例の細胞培養シートをシャーレの底に敷き、以下のマクロファージの接着性の評価方法に基づいてマクロファージの接着性を評価した。

〔マクロファージの接着性の評価方法〕
５.０×１０⁴セル／ｍＬのマクロファージを各実施例または各比較例の細胞培養シートに載せ、３７℃の雰囲気中で２４時間培養した後、純水で細胞培養シートを水洗した。水洗した細胞培養シートに残存している細胞の数を数えることにより、接着性を評価した。

その結果、各実施例で得られた細胞培養シートでは、いずれも、マクロファージの残存数が０セル／ｍＬであり、マクロファージの接着がまったく認められなかった。これに対し、比較例１で得られた細胞培養シートでは、接着したマクロファージの数は１０セル／ｍＬ、比較例２で得られた細胞培養シートでは、接着したマクロファージの数は４セル／ｍＬ、比較例３で得られた細胞培養シートでは、接着したマクロファージの数は０セル／ｍＬ、比較例４で用いた市販の細胞培養シートでは、接着したマクロファージの数は３８セル／ｍＬ、比較例５で用いた市販の細胞培養シートでは、接着したマクロファージの数は１４３セル／ｍＬであった。

以上の結果から、各実施例で得られた細胞培養シートは、いずれも親水性に優れており、さらにマクロファージの接着性が小さく、マクロファージが接着しがたいことから、マクロファージが細胞培養シートに接着することによってマクロファージが変質することを抑制し、炎症性タンパクの分泌を抑制することができることがわかる。

次に、各実施例で得られた細胞培養シートおよび比較例３で得られた細胞培養シートについて、その表面の鉛筆硬度を調べた。その結果、各実施例で得られた細胞培養シートの表面の鉛筆硬度は、いずれも、４Ｂであったのに対し、比較例３で得られた細胞培養シートの表面の鉛筆硬度は９Ｈであったことから、各実施例で得られた細胞培養シートは、いずれも、柔軟性に優れていることが確認された。

また、ピンセットを用いて細胞培養シートからの成長させた細胞の剥がしやすさを調べたところ、各実施例で得られた細胞培養シートでは、成長させた細胞をピンセットでシートから容易に剥がすことができたのに対し、比較例３で得られた細胞培養シートでは、その表面が硬いため、成長させた細胞をピンセットでシートから剥がすことが困難であり、無理に剥がそうとすると細胞に傷をつけるおそれがあった。

次に、各実施例で得られた細胞培養シートを用い、前記マクロファージの接着性の評価方法で水洗した際に生成した洗浄水からマクロファージを回収し、当該マクロファージを各実施例で得られた細胞培養シートに載せ、３７℃の雰囲気中で２４時間培養したところ、マクロファージを増殖させることができることが確認された。このことから、各実施例で得られた細胞培養シートを用いれば、マクロファージを再度播種しても当該マクロファージを増殖させることができることがわかる。

その後、前記で得られたマクロファージを各実施例で得られた細胞培養シートに再度播種し、増殖させた後、マクロファージの接着性を前記と同様にして評価した。その結果、マクロファージの残存数が０セル／ｍＬであり、マクロファージの接着が認められなかった。このことから、各実施例で得られた細胞培養シートは、いずれも繰り返して使用することができるものであることがわかる。

本発明の細胞培養シートは、親水性に優れているのみならず、マクロファージの付着性が小さく、さらに柔軟性にも優れ、成長させた細胞を容易に剥がすことができるので、例えば、ＥＳ細胞を培養する際の分化および脱分化を抑制する細胞培養シートなどとして使用することが期待されるものである。

Claims

基材として式(I):
（式中、Ｒ¹ 、Ｒ ³ およびＲ ⁴はメチル基、Ｒ²はエチレン基、Ｒ ⁵はメチレン基、Ｘは酸素原子を示す）
で表わされる親水性モノマーおよび架橋性モノマーを含有するモノマー成分を重合させてなる架橋ポリマーを有効成分として含有する水性ゲル基材が用いられてなる細胞培養シートであって、前記架橋性モノマーが、アルキレン基の炭素数が１〜４のアルキレンビス(メタ)アクリルアミドであることを特徴とする細胞培養シート。