JP2014000082A - シンターゼ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】新規のテルペンシンターゼには重要なアミノ酸残基を含む活性部位ポケットがあり、該アミノ酸残基が目的のテルペノイド反応中間体および反応産物を生成するように改変される。シンターゼの改変は、例えば、活性部位に基質が結合したまたは結合していない、タバコの5-エピ-アリストロケンシンターゼの三次元座標に基づいて設計される。変異型シンターゼをコードする遺伝子は、使用する形質転換系とは関係なく、発現制御配列(植物プロモーター調節エレメント)をベクターに含ませることによって植物細胞中で該遺伝子を発現するように適合された遺伝子転移ベクターに導入される。
【選択図】なし
Description
本出願は、1998年9月18日付けの仮出願第60/100,993号、1999年4月22日付けの仮出願第60/130,628号、および1999年8月23日付けの仮出願第60/150,262号の優先権の利益を主張するものである。
イソプレノイド化合物はさまざまな生物(例えば、植物、細菌、真菌など)によって産生される有機分子である。これまでに23,000種を超えるイソプレノイド分子が特徴づけられており、毎年何十、何百もの新しい構造が同定されている。これらの分子は種々の役割を果たすことができる。例えば、モノテルペン類は芳香剤や香味料として使用される。セスキテルペン類とジテルペン類はフェロモン、防御用薬剤、視覚色素、抗腫瘍薬、シグナル伝達経路の成分として作用しうる。トリテルペン類は膜の構成成分として、さらにステロイドホルモンと胆汁酸の前駆物質として重要な機能を果たしている。ポリプレノール類は光感受性物質およびコファクター側鎖として機能し、また天然ポリマーとしても存在しうる。
チドのいずれか1つでありうる。前記方法はさらに、該改変型ポリペプチドとイソプレノイド基質とを、該基質が該ポリペプチドに結合するのに有効な条件下で接触させること;および該改変型ポリペプチドの、該イソプレノイド基質からの反応産物の生成を触媒する能力を測定すること;を含む。イソプレノイド基質はモノテルペン、セスキテルペン、またはジデルペンでありうる。
表1は、テルペンシンターゼの活性部位において見出された19個のα-炭素についてのX線結晶構造座標である。
ついてのX線結晶構造座標である。
列番号22)とTEASの残基265-535とのアライメントである。
847と配列番号26とのアライメントである。
配列番号1は、タバコの5-エピ-アリストロケンシンターゼ(TEAS)タンパク質のDNAコード配列である。Genbank受託番号:Q40577。
コード配列である。Genbank受託番号:AF051900。
本明細書中では以下の用語が用いられる。
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、およびリシンである。特に指示しない限り、本出願中で言及する全てのアミノ酸はL形である。本明細書中では、天然に存在するアミノ酸について言及するために、3文字または1文字の略語を用いることがある。これらの略語は当業界で公知である。
下で使用できる。
チジン残基(His-タグ技法)の使用を含みうる。
l of mean force)が含まれる。
変異型TEAS遺伝子の生成
構築物の生成および発現
全ての変異型酵素を、QuickChange方法(Stratagene)により構築した。記載したもの以外は製造元の説明書に従った。突然変異は、DNA配列決定により確認し、所望の突然変異を含むプラスミドを使用してBL-21(DE3)発現細胞を形質転換した。タンパク質を発現させ、精製し、-80℃にて保存した。
新たに構築したプラスミドを発現細胞に移すために、4つのプレート全てからコロニーを掻き取り、液体LB培地中で37℃にて8時間増殖させる8mL培養を開始するのに使用した。この培養物から精製されたプラスミドを、20マイクロリットルのコンピテントBL-21(DE3)細胞を形質転換するのに使用した。
シンターゼポリペプチドの発現および単離
特に記載しない限り、変異型および非変異型TEASタンパク質は、大腸菌において発現させ、金属キレート化、陰イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。
実施例3
シンターゼポリペプチドの結晶化および構造解析
結晶成長およびマイクロ播種(microseeding):全ての結晶化の試みを、懸滴気化拡散(hanging-drop vapor diffusion)方法により行った。濃縮タンパク質を、プラスチックカバースリップ上で、等容量(それぞれ2〜5μL)の貯蔵溶液と混合した。次に、0.5〜1.0 mLの貯蔵溶液を含むプラスチックの24ウェル組織培養プレートのウェル上でカバースリップを反転させ、ウェルとカバースリップとの間を真空グリースの層で密封した。プレートを4℃でインキュベートし、その間、気化拡散により懸滴中のタンパク質濃度を徐々に高めた。様々な沈殿剤および添加塩を含むpHが4.5〜9の範囲の約300の異なる貯蔵溶液を、TEAS(配列番号12)の結晶化についてアッセイした。TEASは、15%PEG 8000、100 mM MOPSO(3-[N-モルホリノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、200 mM酢酸マグネシウム、1mM DTT、pH6.9〜7.3)の貯蔵溶液で結晶化した。マイクロ播種のために、既存の結晶を数μLの沈殿剤溶液中で破砕し、50マイクロリットルにまで希釈した。大きい粒子を除去するための初期遠心分離の後、懸濁液を追加の沈殿剤溶液で連続希釈し、少容量の希釈種ストックをそれぞれの新しい結晶化小滴に添加した。マクロ播種(macroseeding)のために、既に早い速度で成長していない結晶(通常、小滴をセットしてから2週間後)を、2〜3滴の貯蔵溶液に連続的に通すことにより「濯いだ」。次に、結晶を、タンパク質および貯蔵溶液を含む新しい小滴に移し、初期成長時のように貯蔵溶液に対して平衡させた。個々の結晶は、内部順序(internal order)の程度が異なった。場合によっては、いくつかの結晶をスクリーニングして、低いモザイク度(mosaicity)でよく回折した結晶を同定した。
)は結晶により数オングストローム変動するが、平均してa=126Å、c=122Å
である)に属していた。非複合化TEAS構造を、2 mM FHPの存在下で成長させた結晶から回収したデータ(表10)に対して、初め2.8Åにまで精製した(表11)。活性部位における電子密度により、FHP、A-CおよびJ-Kループ、ならびにNH2末端にある9つの追加の残基の明確なモデリングが可能であった。精製したTEAS-FHPモデルは、残基17〜548、3つのMg2+イオン、150の水分子、ならびに1つのFHP分子から構成されていた。結合基質の存在下におけるTEASの三次元座標を表10に示す。FHPの不在下でのTEASの三次元座標を表11に示す。
テルペンシンターゼ酵素アッセイ
VogeliおよびChappell, Plant Physiol.94: 1860(1990)ならびにVogeliら, Plant Physiol. 93:182(1990)に記載されたアッセイに基づき、シンターゼ活性のアッセイを行った。一般に、放射性標識(3Hまたは14C)基質を、マグネシウム塩の緩衝化溶液(特に他のものが記載されない限り200mM Tris, pH8, 50mM塩化マグネシウム、1mM DTT)中で室温にて酵素と共にインキュベートした後、炭化水素生成物をヘキサン等の有機溶媒中に選択的に抽出した。このヘキサン抽出物を一般にシリカゲルで処理して、基質の非酵素的加水分解により生成されたプレニルアルコールおよび他の含酸素化合物(これらはヘキサン中に非効率的に分配される(partition))を除去した。このヘキサン相の中に存在する炭化水素生成物をシンチレーションカウンターにより定量した。
DTT, pH8.0を用いて行った。モノテルペンシンターゼアッセイは、典型的には
、3H GPPおよび酵素を用いて行った。タンパク質によるGPPの非特異的結合についての対照として、酵素ではなくBSAを用いて全く同じ反応を設定した。
TEAS W273Sの活性
TEAS W273Sのジテルペンシンターゼ活性:TEAS W273S酵素および放射性標識GGPPを上記のようにインキュベートし、ヘキサンで炭化水素生成物を抽出した。次に含酸素生成物を酢酸エチルで抽出した。野生型TEASを用いた反応で定量した結果は、緩衝液のみを用いた反応のものよりも低かった。一方、TEAS W273Sの定量結果は、ヘキサン抽出および酢酸エチル抽出の両方において非常に高かった。W273SによりGGPPから形成された炭化水素生成物は、酸により触媒されたGGPPからのジホスフェートの減少によって生成された生成物とは異なるものであった。図3を参照されたい。
TEAS C440W/W273Sの活性
TEAS C440W/W273Sのジテルペンシンターゼ活性:突然変異型TEAS C440W/W273S
タンパク質は、440位にトリプトファン残基および273位にセリン残基を含む。0.5μモル3H GGPP, 様々な濃度の非標識GGPP(Echelon)および酵素を用い、GGPPを用いてアッセイを行った。反応物を室温にて60分間インキュベートした。TEAS C440/W273S突然変異型タンパク質は、GGPPをヘキサン-抽出可能生成物に変換したが、野生型酵素はこの変換を行わなかった。これらの結果は、その生成物のプロフィールが野生型TEASに比べて変化したことを示した。二重突然変異体によるGGPP代謝回転のヘキサン抽出可能生成物を、Ag-TLCにより分析した。この生成物は、加水分解生成物であるゲラニルゲラニオール(Rf=0.0)とは異なる2種(Rf=0.11および0.28)を含んでいた。TEAS C440W/W273SによりGGPPから生成された生成物が加水分解生成物ゲラニルゲラニオールではないことを証明するために、サンプルをAg-TLCにより分析した。100μlの緩衝液中に3H GGPP(5μm)および酵素(40μm)を含む反応を、室温にて一晩インキュベートした。対照として、3H GGPPを反応緩衝液のみの中、およびpH1.5に調節した反応緩衝液の中で、インキュベートした。酵素的反応物および対照反応物を両方ともヘキサンで抽出し、銀染色TLCプレート上にスポッティングし、上記のように現像および露光を行った。図3に示す結果は、TEAS C440W/W273Sにより形成された生成物が、ゲラニルゲラニルジホスフェートの非酵素的分解により生成されたものと異なっていたことを示すものであった。
14C FPP(9μm)および酵素(160μm)を含む反応緩衝液(20μl)を用い、基
質としてFPPを用いて反応を行った。室温にて30分間インキュベートした後、TEAS C440W/W273Sによって作製された生成物をAg-TLCにより分析した。この二重突然変異体の生成物のプロフィールは、TEAS W273Sのものと似ており、それに更にRfが0.57である主な生成物が加わった。この新しい生成物は、5-エピ-アリストロケンおよびベティスピラジエンの何れとも異なるものであった。他の幾つかの生成物も形成され、そのうちの多くは銀染色TLCの際にゆっくり移動した。図4を参照されたい。
TEAS C440Wの活性
TEAS C440Wのジテルペンシンターゼ活性:TEAS C440Wを用いた酵素アッセイを、実施例6に記載したように実施した。図3に示すように、160μmの酵素および9μmの放射性標識GGPP(体積20μl)と共に室温にて一晩インキュベートした後、Ag-TLCによってヘキサン-抽出可能生成物は検出されなかった。
TEAS W273Eの活性
TEAS W273Eのセスキテルペンシンターゼ活性:基質としてFPPを用いてTEAS W273Eにより作製された生成物を測定する反応を、放射性標識したFPPを用いて本質的には上記のように行った。これらの結果は、5-エピ-アリストロケン以外に少なくとも1つの生成物が形成されたことを示した。また該結果は、FPPによるTEASのアルキル化が起こったことも示した。このアルキル化は、反応混合物中のMgCl2の存在に依存するものであった。対照実験において、煮沸したW273E-TEAS、ならびに野生型TEASおよびBSAは、アルキル化されなかった。これらの結果は、アルキル化が273位で起こったこと、および273位のアミノ酸残基はこの活性部位の一部であることを示す。
TEAS Y520Fの活性
TEAS Y520Fのセスキテルペンシンターゼ活性:放射性標識したFPPおよびTEAS Y520F酵素を用いた反応を、本質的には上記のように行った。反応生成物をAg-TLCおよびGC/MSにより分析した。TEAS Y520F反応の主な生成物は、基準ゲルマクレンA(authentic germacrene A)と同じGC保持時間および質量スペクトルを有していた。この生成物のGC保持時間および質量スペクトルは、5-エピ-アリストロケンとは異なっていた。
TEAS Y527Fの活性
TEAS Y527Fの酵素活性:大腸菌細胞中における発現を誘導し、該細胞を音波で破砕して、TEAS Y527F酵素の粗抽出物を作成した。この音波破砕物を透明化し、上清を酵素アッセイに使用した。基質としてGPPを用いたアッセイでは、生成物は観察されなかった。このことは、TEAS Y527Fが、モノテルペンシンターゼ活性を持たないことを示す。基質としてFPPを用いて反応生成物を得た。これらの生成物のAg-TLCによる分析は、5-エピ-アリストロケン以外の生成物がTEAS Y527F酵素により生成されたことを示した。
テルペンシンターゼ配列のアラインメント
BLOSUM62スコアリングマトリックス、ギャップ開始値=11、ギャップ延長値=1、X_ドロップオフ値=50、期待値=10、文字列の長さ=3を用い、およびコンプレキシティーの低い配列のフィルタリングを行わずに、BLASTpプログラム(NCBI)を用いて、TEAS一次アミノ酸配列(配列番号2)の残基265〜535を、リモネンシンターゼの全長アミノ酸配列(配列番号22)とアライメントさせた。表12に示すアラインメントプログラムの出力は、TEAS配列の残基527と残基528(アラインメント出力において263および264の番号を付してある)との間にギャップを含んでいた。残基321、324、345、348、349、427、452、453、454、455、458、492、496、569、572、573、577、579および580は、19 TEAS残基と最も好適なアラインメントを有するものとして選択した。TEASに見られる構造的アスペクトの空間的な配向(即ち図1および表10に示すα-ヘリックス、β-シートおよびループなど)を維持するために、リモネンシクラーゼの残基583ではなく残基580を、TEASの残基528とアライメントするものとして選択した。
=1、X_ドロップオフ値=50、期待値=10、文字列の長さ=3を用い、およびコンプレキシティーの低い配列のフィルタリングを行わずに、BLASTpプログラム(NCBI)を用いて、配列番号44のタキサジエン(taxadiene)一次アミノ酸配列の残基579〜847を含む領域を、ボルニルジホスフェートシンターゼの全長アミノ酸配列(配列番号26)とアライメントさせた。表13に示すアラインメントプログラムの出力は、ボルニルジホスフェートシンターゼ配列の残基453と残基454との間にギャップを含んでいた。ボルニルジホスフェートシンターゼの残基321、324、344、347、348、426、451、452、453、454、457、492、496、568、571、572、576、578および579は、配列番号44の検索領域配列の残基584、587、606、609、610、688、713、714、715、716、719、753、757、831、834、835、839、841および842と最も好適なアラインメントを有するものとして選択した。タキサジエンシンターゼ中に存在すると思われる構造的アスペクトの空間的な配向(即ち図1および表10に示すα-ヘリックス、β-シートおよびループなど)を維持するために、ボルニルジホスフェートシンターゼの残基453および454を、タキサジエンシンターゼの残基715および716とアライメントするものとして選択した。
=2、X_ドロップオフ値=50、期待値=10、文字列の長さ=3を用い、およびコンプレキシティーの低い配列のフィルタリングを行わずに、BLASTpプログラム(NCBI)を用いて、TEAS一次アミノ酸配列(配列番号2)の残基265〜535を、δ-セリネンシンターゼの全長アミノ酸配列(配列番号48)とアライメントさせた。アラインメントプログラムの出力を表14に示す。配列番号48の残基300、303、324、327、328、406、431、432、433、434、437、471、475、548、551、552、556、558および559を、配列番号2の残基270、273、294、297、298、376、401、402、403、404、407、440、444、516、519、520、525、527および528と最も好適なアラインメントを有するものとして選択した。
新規なモノテルペンシンターゼ遺伝子の作成
ピネンシンターゼをコードするDNA配列(配列番号20)を用いて、突然変異型ピネンシンターゼ遺伝子のライブラリーを構築する。以下の9個のアミノ酸残基:L、C、C、G、H、S、L、GおよびY(配列番号20の351位、372位、480位、481位、482位、485位、519位、600位および601位に対応する)のうちの1個以上をコードするヌクレオチドにランダム突然変異を導入する。
新規なセスキテルペンシンターゼ遺伝子の作成
カジネンシンターゼをコードするDNA配列(配列番号33)を用いて突然変異型カジネンシンターゼのライブラリーを構築する。以下の9個のアミノ酸残基:W、I、S、G、Y、L、C、LおよびY(配列番号33によりコードされるアミノ酸残基280、301、409、410、411、414、448、527および528に対応する)のうちの1個以上をコードするヌクレオチドにランダム突然変異を導入する。
新規なジテルペンシンターゼ遺伝子の作製
アビエタジエンシンターゼをコードするDNA配列(配列番号56)を用いて突然変異型アビエタジエンシンターゼのライブラリーを構築する。以下の9個のアミノ酸残基:S、S、I、A、L、V、G、FおよびY(配列番号56の593位、614位、722位、723位、724位、727位、761位、840位および841位に対応する)のうちの1個以上をコードするヌクレオチドにランダム突然変異を導入する。
昆虫、哺乳動物および細菌細胞中での突然変異型シンターゼの発現
バキュロウイルス発現ベクターを用いて、実施例12、13および/または14の突然変異型シンターゼをコードする核酸を含む構築物を、昆虫スポドプテラ・フルギペルダ(Spoodoptera frugiperda)の培養細胞中に導入する。該遺伝子の発現後、この突然変異型酵素を各クローンから単離および精製する。
特に記載していないが、当業者であれば、本明細書中に記載および例示した様々な特定の実施形態がいずれも、これらの特定の実施形態以外の特徴を持つようにさらに修正することができることが分かるであろう。
[請求項1]
テルペノイド産物の生成を触媒し、かつ、配列番号2の残基265〜535に対して35%以上の配列同一性を有する領域をもつ単離されたテルペンシンターゼであって、該シンターゼが19個のα-炭素を含み、該19個のα-炭素は下記のÅで表した原子間距離:
の±2.3Åであるα-炭素間の原子間距離を有し、該α-炭素のそれぞれの中心点が半径2.3Åの球内に位置し、該球のそれぞれの中心点が下記の構造座標:
を有し、該α-炭素のそれぞれが関連するR基を有しており(ここで、該19個のα-炭素の位置は、配列番号2のアミノ酸位置270, 273, 294, 297, 298, 376, 401, 402, 403, 404, 407, 440, 444, 516, 519, 520, 525, 527 および528とアラインメントするものである)、該シンターゼが下記のR基の順序配列:
とは異なるR基の順序配列を有することを特徴とする、上記シンターゼ。
[請求項2]
配列番号2の残基265〜535に対して40%以上の配列同一性を有する、請求項1に記載のシンターゼ。
[請求項3]
テルペノイド産物の生成を触媒し、かつ、配列番号2の残基265〜535に対して40%以上の配列同一性を有する領域をもつ単離されたテルペンシンターゼであって、配列番号2のアミノ酸位置270, 273, 294, 297, 298, 376, 401, 402, 403, 404, 407, 440, 444, 516, 519, 520, 525, 527 および528のアミノ酸残基とアラインメントする該シンターゼの一つ以上のアミノ酸残基が、下記のR基の順序配列:
とは異なるR基の順序配列を有することを特徴とする、上記シンターゼ。
[請求項4]
配列番号2の残基265〜535に対して50%以上の配列同一性を有する、請求項3に記載のシンターゼ。
[請求項5]
配列番号2の残基265〜535に対して60%以上の配列同一性を有する、請求項3に記載のシンターゼ。
[請求項6]
配列番号2の残基265〜535に対して70%以上の配列同一性を有する、請求項3に記載のシンターゼ。
[請求項7]
配列番号2の残基265〜535に対して80%以上の配列同一性を有する、請求項3に記載のシンターゼ。
[請求項8]
テルペノイド産物の生成を触媒し、かつ、配列番号33によってコードされるアミノ酸残基272〜540に対して40%以上の配列同一性を有する領域をもつ単離されたテルペンシンターゼであって、配列番号33によってコードされるアミノ酸位置277、280、301、304、305、383、408、409、410、411、414、448、452、524、527、528、532、534および535のアミノ酸残基とアラインメントする該シンターゼの一つ以上のアミノ酸残基が、下記の残基の順序配列:
とは異なる残基であることを特徴とする、上記シンターゼ。
[請求項9]
テルペノイド産物の生成を触媒し、かつ、配列番号42のアミノ酸残基319〜571に対して40%以上の配列同一性を有する領域をもつ単離されたテルペンシンターゼであって、配列番号42のアミノ酸位置324、327、348、351、352、430、455、456、457、458、461、495、499、571、574、575、579、581および582のアミノ酸残基とアラインメントする該シンターゼの一つ以上のアミノ酸残基が、下記の残基の順序配列:
とは異なる残基であることを特徴とする、上記シンターゼ。
[請求項10]
テルペノイド産物の生成を触媒し、かつ、配列番号52のアミノ酸残基264〜533に対して40%以上の配列同一性を有する領域をもつ単離されたテルペンシンターゼであって、配列番号52のアミノ酸位置269、272、293、296、297、375、401、402、403、404、407、441、445、517、520、521、525、527および528のアミノ酸残基とアラインメントする該シンターゼの一つ以上のアミノ酸残基が、下記の残基の順序配列:
とは異なる残基であることを特徴とする、上記シンターゼ。
[請求項11]
テルペノイド産物の生成を触媒し、かつ、配列番号56のアミノ酸残基585〜853に対して40%以上の配列同一性を有する領域をもつ単離されたテルペンシンターゼであって、配列番号56のアミノ酸位置590、593、614、617、618、696、721、722、723、724、727、761、765、837、840、841、845、847および848のアミノ酸残基とアラインメントする該シンターゼの一つ以上のアミノ酸残基が、下記の残基の順序配列:
とは異なる残基であることを特徴とする、上記シンターゼ。
[請求項12]
テルペノイド産物の生成を触媒し、かつ、配列番号28のアミノ酸残基265〜536に対して40%以上の配列同一性を有する領域をもつ単離されたテルペンシンターゼであって、配列番号28のアミノ酸位置270、273、294、297、298、376、401、402、403、404、407、440、444、518、521、522、528、530および531のアミノ酸残基とアラインメントする該シンターゼの一つ以上のアミノ酸残基が、下記の残基の順序配列:
とは異なる残基であることを特徴とする、上記シンターゼ。
[請求項13]
テルペノイド産物の生成を触媒し、かつ、配列番号32のアミノ酸残基307〜541に対して40%以上の配列同一性を有する領域をもつ単離されたテルペンシンターゼであって、配列番号32のアミノ酸位置278、281、302、305、306、384、409、410、411、412、415、448、452、524、527、528、533、535および536のアミノ酸残基とアラインメントする該シンターゼの一つ以上のアミノ酸残基が、下記の残基の順序配列:
とは異なる残基であることを特徴とする、上記シンターゼ。
[請求項14]
モノテルペン基質からのテルペノイド産物の生成を触媒する、請求項1〜13のいずれかに記載のシンターゼ。
[請求項15]
セスキテルペン基質からのテルペノイド産物の生成を触媒する、請求項1〜13のいずれかに記載のシンターゼ。
[請求項16]
ジテルペン基質からのテルペノイド産物の生成を触媒する、請求項1〜13のいずれかに記載のシンターゼ。
[請求項17]
前記産物が環式テルペノイド炭化水素である、請求項14に記載のシンターゼ。
[請求項18]
前記産物が環式テルペノイド炭化水素である、請求項15に記載のシンターゼ。
[請求項19]
前記産物が環式テルペノイド炭化水素である、請求項16に記載のシンターゼ。
[請求項20]
請求項1〜19のいずれかに記載のシンターゼをコードする単離された核酸。
[請求項21]
請求項20記載の核酸を含む宿主細胞。
[請求項22]
原核細胞、真核細胞、昆虫細胞、および植物細胞から選択される、請求項21記載の宿主細胞。
[請求項23]
請求項1〜19のいずれかに記載のシンターゼを基質と接触させ、それによってイソプレノイド産物の形成を触媒することを含む、イソプレノイド産物の製造方法。
[請求項24]
前記基質がモノテルペン基質、セスキテルペン基質、またはジデルペン基質から選択される、請求項20記載の方法。
[請求項25]
前記テルペノイド産物が、環式テルペノイド炭化水素、非環式テルペノイド炭化水素、環式ヒドロキシル化テルペノイド炭化水素、または非環式ヒドロキシル化テルペノイド炭化水素から選択される、請求項20記載の方法。
Claims (18)
- 配列番号33によってコードされるアミノ酸残基272〜540に対して40%以上の配列同一性を有する領域を持つ単離されたシンターゼであって:
ここで、配列番号33によってコードされる位置277、280、301、304、305、383、408、409、410、411、414、448、452、524、527、528、532、534、および535のアミノ酸とアラインメントする該シンターゼの1以上のアミノ酸残基は、以下の残基の順序配列とは異なる残基であり:
該シンターゼは、テルペノイド産物の生成を触媒し;および
該シンターゼは、配列番号33のポリペプチドによって生成されない産物を生成する、
シンターゼ。 - モノテルペン基質からのテルペノイド産物の生成を触媒する、請求項1〜6のいずれかのシンターゼ。
- セスキテルペン基質からのテルペノイド産物の生成を触媒する、請求項1〜6のいずれかのシンターゼ。
- ジテルペン基質からのテルペノイド産物の生成を触媒する、請求項1〜6のいずれかのシンターゼ。
- 該産物は、環式テルペノイド炭化水素である、請求項7のシンターゼ。
- 該産物は、環式テルペノイド炭化水素である、請求項8のシンターゼ。
- 該産物は、環式テルペノイド炭化水素である、請求項9のシンターゼ。
- 請求項1〜12のいずれかのシンターゼをコードする、単離された核酸。
- 請求項13の核酸を含む宿主細胞。
- 原核細胞、真核細胞、昆虫細胞、および植物細胞から選択される、請求項14の宿主細胞。
- 請求項1−12のいずれかのシンターゼを基質に接触させること、それによって、イソテルペノイド産物の生成を触媒することを含む、イソテルペノイド産物の製造方法。
- 該基質が、モノテルペン基質、セスキテルペン基質、またはジテルペン基質から選択される、請求項16の方法。
- 該テルペノイド産物が、環式テルペノイド炭化水素、環式テルペノイド炭化水素、環式ヒドロキシル化テルペノイド炭化水素、または環式ヒドロキシル化テルペノイド炭化水素である、請求項16または請求項17の方法。
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