JP2013511991A5 - - Google Patents
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Description
本発明は、母体および胎児の遺伝子材料の混合物中の標的配列の差分検出(differential detection)方法であって、a)母体および胎児の遺伝子材料の両方を含む母体組織を得る工程;b)遺伝子材料を個別のサンプルに分配する工程であって、各サンプルが、平均して、サンプルあたり約1つ以下の標的配列を含み、個別のサンプルが既知の標的配列に対するプライマー組および/または既知の基準配列に対する基準プライマー組を含む、分配する工程、c)増幅反応を行う工程、d)個別のサンプル中の標的配列または基準配列の存在を検出する工程、およびe)検出された標的配列の検出された基準配列に対する比を比較して、差分量の標的配列を決定する工程を含む、方法を含む。前記方法は、さらに、検出された標的配列の検出された基準配列に対する比を比較して差分量の標的配列を決定する工程であって、検出された標的配列の検出された基準配列に対する相違が胎児の遺伝子異常を示す、決定する工程を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は胎児異数性の検出方法である。いくつかの場合では、標的配列は異数性のマーカーであり、基準配列は母体および胎児の遺伝子材料中の二倍体である。母体組織は、母体の末梢血、血漿、もしくは血清、または本明細書中に記載の他の組織であり得る。いくつかの実施形態では、反応サンプルは、乳濁液中の水相中に存在する。いくつかの場合では、標的配列または基準配列の存在の検出は、さらに、in situでの蛍光標識を有する核酸とのハイブリッド形成を含む。いくつかの場合では、反応サンプル数は少なくとも約10,000である。いくつかの場合では、工程b)〜e)を、異なる標的配列に対するプライマー組を使用して繰り返す。いくつかの場合では、反応体積は、特定の標的配列に対する各プライマー組を有する1つを超えるプライマー組を含む。いくつかの場合では、反応体積は、特定の基準配列に対する各プライマー組を有する1つを超える基準プライマー組を含む。使用することができるプライマー組の例には、ヒト21番染色体、ヒト18番染色体、ヒト13番染色体、またはヒトX染色体に特異的なプライマー組が含まれる。いくつかの場合では、異数性は、検出された標的配列の基準配列に対する比が1を超える場合に検出される。いくつかの場合では、異数性は、検出された標的配列の基準配列に対する比が1未満の場合に検出される。いくつかの場合では、標的配列は、CFTR、第VIII因子(F8遺伝子)、βグロビン、血色素症、G6PD、神経線維腫症、GAPDH、βアミロイド、またはピルビン酸キナーゼ遺伝子の少なくとも一部である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
遺伝子材料集団内の標的ポリヌクレオチドのコピー数を検出する方法であって、
a.第1のライゲーションプローブを第1の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
b.第2のライゲーションプローブを第2の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
c.前記第1および第2のライゲーションプローブをライゲーション反応に供して1つ以上のライゲーションした産物を得る工程、
d.前記1つ以上のライゲーションした産物を2つ以上の区分に分割する工程、
e.前記1つ以上のライゲーションした産物内の領域を増幅して増幅された産物を得る工程、
f.前記増幅された産物を含む前記区分の数を決定する工程、および
g.前記区分の前記数に基づいて前記第1の標的ポリヌクレオチドのコピー数を計算する工程
を含む、方法。
(項目2)
前記標的ポリヌクレオチドを前記2つ以上の区分に分割しない、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記増幅過程中に前記2つ以上の区分が実質的にインタクトなままである、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記決定工程(f)中に前記2つ以上の区分が実質的にインタクトなままである、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記第1および第2のライゲーションプローブをそれぞれ前記第1の標的ポリヌクレオチドに結合させるようにデザインする、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記分割工程(d)が前記標的ポリヌクレオチド分子の分割を含まない、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記2つ以上の区分が前記ライゲーションした産物から開始される増幅反応を含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記第1のライゲーションプローブを種内の個体間で保存されているポリヌクレオチド配列に結合させるようにデザインする、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記区分が少なくとも2つの不混和性流体の混合物内に存在する水滴である、項目1に記載の方法。
(項目11)
連続油相が前記水滴を含む、項目10に記載の方法。
(項目12)
少なくとも4つのライゲーションプローブを前記第1の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目13)
少なくとも4つのライゲーションプローブを前記第1の標的ポリヌクレオチドに結合し、少なくとも4つのライゲーションプローブを前記第2の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記第1のライゲーションプローブを前記第1の標的ポリヌクレオチド内の第1の領域に結合させるようにデザインし、前記第2のライゲーションプローブを前記第1の標的ポリヌクレオチド内の第2の領域に結合させるようにデザインし、前記第1および第2の領域が同一の配列を有さない、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが前記第2の標的ポリヌクレオチドと同一ではない、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが試験染色体であり、前記第2の標的ポリヌクレオチドが基準染色体である、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記試験染色体が21番染色体、13番染色体、18番染色体、およびX染色体からなる群から選択される、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22番染色体、X、およびY染色体からなる群から選択される染色体である、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが染色体のセグメントである、項目1に記載の方法。
(項目20)
前記染色体のセグメントが胎児異数性に関連する、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記ライゲーション反応によって前記第1のライゲーションプローブの5’領域を前記第1のライゲーションプローブの3’領域にライゲーションして環状のライゲーションした産物を得る、項目1に記載の方法。
(項目22)
前記ライゲーション反応によって前記第1のライゲーションプローブの5’領域を前記第2のライゲーションプローブの3’領域にライゲーションして前記第1および第2のライゲーションプローブの少なくとも一部を含む線状のライゲーションした産物を得る、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記第1のライゲーションプローブの前記5’領域および前記3’領域を、それぞれ、前記第1の標的ポリヌクレオチド内の近接配列に結合させるようにデザインする、項目21に記載の方法。
(項目24)
前記第1のライゲーションプローブの前記5’領域および前記3’領域を、それぞれ、前記第1の標的ポリヌクレオチド内の隣接配列に結合させるようにデザインする、項目21に記載の方法。
(項目25)
前記隣接配列が少なくとも1つのヌクレオチドによって分離される、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記ライゲーション反応が、前記第1のライゲーションプローブの前記5’領域と前記3’領域との間の領域中にヌクレオチドを組み込むためのテンプレート駆動ギャップ充填反応をさらに含む、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記第1のライゲーションプローブが酵素によって切断可能な部位を含む、項目1に記載の方法。
(項目28)
酵素によって切断可能な前記部位が1つ以上のウラシルを含む、項目27に記載の方法。
(項目29)
酵素によって切断可能な前記部位が制限部位を含む、項目27に記載の方法。
(項目30)
前記第1のライゲーションプローブがパッドロックプローブである、項目1に記載の方法。
(項目31)
前記第1のライゲーションプローブが分子反転プローブである、項目1に記載の方法。
(項目32)
酵素反応を行って線状ポリヌクレオチドを除去する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目33)
酵素反応を行って一本鎖ポリヌクレオチドを除去する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目34)
前記第1のライゲーションプローブを第1のシグナル伝達因子にコンジュゲートし、前記第2のライゲーションプローブを第2のシグナル伝達因子にコンジュゲートする、項目1に記載の方法。
(項目35)
前記第1のシグナル伝達因子が第1の色調の蛍光マーカーであり、前記第2のシグナル伝達因子が第2の色調の蛍光マーカーである、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記決定工程(f)が、前記第1のライゲーションプローブを第1のシグナル伝達因子で検出する工程および前記第2のライゲーションプローブを第2のシグナル伝達因子で検出する工程を含む、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記第1のライゲーションプローブが複数のライゲーションプローブを含み、各プローブが第1の染色体の異なる領域に向けられ、前記第2のライゲーションプローブが複数のライゲーションプローブを含み、各プローブが第2の染色体の異なる領域に向けられる、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが試験染色体であり、前記第2の標的ポリヌクレオチドが基準染色体である、項目35に記載の方法。
(項目39)
前記第1および第2のライゲーションプローブを同一のシグナル伝達色を有するシグナル伝達因子とコンジュゲートする、項目14に記載の方法。
(項目40)
遺伝子材料集団内の標的ポリヌクレオチドのコピー数を検出する方法であって、
a.第1のライゲーションプローブを第1の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
b.第2のライゲーションプローブを第2の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
c.前記第1および第2のライゲーションプローブをライゲーション反応に供して1つ以上のライゲーションした産物を得る工程、
d.前記1つ以上のライゲーションした産物を連続油相内の2つ以上の水滴に分割する工程、
e.前記1つ以上のライゲーションした産物内の配列を増幅して増幅された産物を得る工程、
f.前記増幅された産物を含む2つ以上の水滴の数を決定する工程、および
g.前記第1の標的ポリヌクレオチドのコピー数を計算する工程
を含む、方法。
(項目41)
前記標的ポリヌクレオチドを前記2つ以上の水滴に分割しない、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記増幅工程(e)中または前記決定工程(f)中に、前記2つ以上の水滴が実質的にインタクトなままである、項目40に記載の方法。
(項目43)
前記2つ以上の水滴が平均して1つを超えるライゲーションしたプローブを含み、前記方法が、アルゴリズムを使用して水滴あたりの標的にライゲーションしたプローブの平均数を計算する工程をさらに含む、項目40に記載の方法。
(項目44)
工程(d)の前記2つ以上の水滴が4,000滴超を含む、項目40に記載の方法。
(項目45)
前記4,000滴超を100,000水滴/ml超の密度で単一のチャンバー内で互いに合わせる、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記液滴は単分散液滴である、項目40に記載の方法。
(項目47)
前記方法は、1,000コピー未満の前記第1の標的ポリヌクレオチドを含む遺伝子材料集団内の前記第1の標的ポリヌクレオチドを検出することができる、項目40に記載の方法。
(項目48)
前記2つ以上の水滴が平均して1つを超えるライゲーションしたプローブを含み、前記方法が、アルゴリズムを使用して水滴あたりの標的にライゲーションしたプローブの平均数を計算する工程をさらに含む、項目40に記載の方法。
(項目49)
前記2つ以上の水滴の直径は、それぞれ、平均して、50nmと300μmとの間である、項目40に記載の方法。
(項目50)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが遺伝子障害に関連する染色体セグメントである、項目40に記載の方法。
(項目51)
前記ライゲーション反応によって前記第1のライゲーションプローブの5’領域を前記第1のライゲーションプローブの3’領域にライゲーションする、項目40に記載の方法。
(項目52)
前記第1のライゲーションプローブがパッドロックプローブである、項目40に記載の方法。
(項目53)
前記第1のライゲーションプローブが分子反転プローブである、項目40に記載の方法。
(項目54)
前記2つ以上の水滴が相当数のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたビーズを含まない、項目40に記載の方法。
(項目55)
前記連続油相が陰イオン性フルオロ界面活性剤を含む、項目40に記載の方法。
(項目56)
前記陰イオン性フルオロ界面活性剤が陰イオン性フルオロ界面活性剤のアンモニウム塩であるクライトックス(商標)である、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記クライトックスが、クライトックスAS、クライトックスFSH、およびクライトックスFSHのモルホリノ誘導体からなる群から選択される、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記油相がフッ素化油を含む、項目40に記載の方法。
(項目59)
前記2つ以上の水滴がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたマイクロビーズを含まない、項目40に記載の方法。
(項目60)
胎児の遺伝子状態を検出する方法であって、
a.標的ポリヌクレオチドを含む母体および胎児の遺伝子材料の混合物を得る工程、
b.前記混合物を前記標的ポリヌクレオチドに結合するターゲティングオリゴヌクレオチドと合わせる工程、
c.前記ターゲティングオリゴヌクレオチドを反応体積に細分割する工程であって、前記反応体積の少なくとも1つが前記標的ポリヌクレオチドや前記ターゲティングオリゴヌクレオチドを含まない、細分割する工程、
d.前記反応体積内で増幅反応を行う工程、
e.前記反応体積内の前記標的ポリヌクレオチドまたは前記ターゲティングオリゴヌクレオチドの存在を検出する工程、および
f.前記混合物中の前記標的ポリヌクレオチドの相対レベルを決定して、胎児の遺伝子状態を検出する工程
を含む、方法。
(項目61)
前記反応体積が連続油相内の水滴である、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがプライマー対を含む、項目60に記載の方法。
(項目63)
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがライゲーションプローブを含む、項目60に記載の方法。
(項目64)
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドが分子反転プローブを含む、項目60に記載の方法。
(項目65)
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがパッドロックプローブを含む、項目60に記載の方法。
(項目66)
前記反応体積が、平均して、1コピーを超えるターゲティングオリゴヌクレオチドを含む、項目60に記載の方法。
(項目67)
前記反応体積が、平均して、1コピーを超える標的ポリヌクレオチドを含む、項目60に記載の方法。
(項目68)
前記反応体積が基準ポリヌクレオチドに対するプライマーをさらに含む、項目60に記載の方法。
(項目69)
前記反応体積が基準ポリヌクレオチドに対するライゲーションプローブをさらに含む、項目60に記載の方法。
(項目70)
前記ライゲーションプローブを前記反応体積内で増幅する、項目63に記載の方法。
(項目71)
前記遺伝子材料が胎児の遺伝子材料を選択的に予め富化させた細胞サンプルに由来しない、項目60に記載の方法。
(項目72)
前記標的ポリヌクレオチドは、18、13、21番染色体、およびX染色体からなる群から選択される染色体内に存在する、項目60に記載の方法。
(項目73)
前記反応体積が油相内の水滴であり、前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがライゲーションプローブであり、工程(f)中の前記決定が前記ライゲーションプローブの増幅された産物を含む液滴の数を基準ポリヌクレオチドに向けられるライゲーションプローブの増幅された産物を含む液滴の数と比較することを含む、項目60に記載の方法。
(項目74)
前記基準ポリヌクレオチドが、胎児の遺伝子異常に関連しない染色体領域である、項目73に記載の方法。
(項目75)
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドへのハイブリッド形成後のライゲーションの際に環状になるライゲーションプローブである、項目60に記載の方法。
(項目76)
ライゲーションしたプローブを含むマイクロカプセルであって、前記マイクロカプセルが、以下:
a.複数のライゲーションプローブを遺伝子サンプル内の標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させる工程、
b.少なくとも1つの前記結合したライゲーションプローブの5’末端を同一または異なる結合したライゲーションプローブの3’末端にライゲーションし、それにより、少なくとも1つのライゲーション産物を得る工程、
c.前記少なくとも1つのライゲーション産物を含む水溶液を液滴生成デバイスに導入する工程、
d.前記少なくとも1つのライゲーション産物を含む水滴を産生するためのデバイスを使用する工程であって、前記水滴が不混和性流体内に存在する、工程、および
e.前記液滴を固相外面を含むマイクロカプセルに変換する工程
によって得られる、マイクロカプセル。
(項目77)
前記変換が50℃超での加熱を含む、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目78)
前記不混和性流体がフッ素化界面活性剤を含む、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目79)
前記不混和性流体がフッ化炭素油を含む、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目80)
前記不混和性流体が陰イオン性フルオロ界面活性剤を含む、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目81)
前記不混和性流体がアンモニウムクライトックスを含む、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目82)
前記マイクロカプセルが、オリゴヌクレオチドに結合したビーズを含まない、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目83)
前記マイクロカプセルが70℃超の温度で実質的にインタクトなままである、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目84)
前記ライゲーションプローブが、遺伝子障害に関連する標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させることができる、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目85)
前記ライゲーションプローブが、胎児異数性に関連する標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させることができる、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目86)
前記遺伝子標的が、21番染色体、13番染色体、18番染色体、およびX染色体からなる群から選択される染色体内に存在する、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目87)
1つ以上の前記ライゲーションプローブがパッドロックプローブである、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目88)
1つ以上の前記ライゲーション産物が環状化プローブである、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目89)
1つ以上の前記ライゲーションプローブが分子反転プローブである、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目90)
2つ以上の水滴を含む油中水混合物であって、前記2つ以上の水滴のうちの少なくとも1つが第1の標的ポリヌクレオチドに向けられる第1のライゲーションプローブを含み、前記2つ以上の水滴のうちの少なくとも1つが第2の標的ポリヌクレオチドに向けられる第2のライゲーションプローブを含む、油中水混合物。
(項目91)
前記第1の標的ポリヌクレオチドおよび前記第2の標的ポリヌクレオチドが同一の分子である、項目90に記載の油中水混合物。
(項目92)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが前記第2の標的ポリヌクレオチドの配列と異なる配列を有する、項目90に記載の油中水混合物。
(項目93)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが前記第2の標的ポリヌクレオチドと同一の配列を有する、項目90に記載の油中水混合物。
(項目94)
前記第1の標的ポリヌクレオチドがゲノムセグメント内に第1の領域を含み、前記第2の標的ポリヌクレオチドが前記ゲノムセグメント内に第2の領域を含み、前記第1の領域が前記第2の領域と同一の配列を有さない、項目90に記載の油中水混合物。
(項目95)
前記油中水混合物がアンモニウムクライトックス界面活性剤をさらに含む、項目90に記載の油中水混合物。
(項目96)
前記アンモニウムクライトックス界面活性剤が前記混合物の油相中に少なくとも0.01%の濃度で存在する、項目90に記載の油中水混合物。
(項目97)
前記油中水混合物が前記第1の標的ヌクレオチドの増幅された産物を含まない、項目90に記載の油中水混合物。
(項目98)
前記第1のライゲーションプローブが分子反転プローブである、項目90に記載の油中水混合物。
(項目99)
前記第1のライゲーションプローブが環状プローブである、項目90に記載の油中水混合物。
(項目100)
前記第1のライゲーションプローブが、酵素切断に供した環状化プローブの線状化産物である、項目90に記載の油中水混合物。
(項目101)
前記酵素切断がウラシル−N−グリコシラーゼまたは制限酵素によって触媒される、項目100に記載の油中水混合物。
参照による引用
本明細書中で言及された全ての刊行物および特許出願は、その全体および各刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参考として援用されることが示されるのと同一の範囲に参考として援用される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
遺伝子材料集団内の標的ポリヌクレオチドのコピー数を検出する方法であって、
a.第1のライゲーションプローブを第1の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
b.第2のライゲーションプローブを第2の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
c.前記第1および第2のライゲーションプローブをライゲーション反応に供して1つ以上のライゲーションした産物を得る工程、
d.前記1つ以上のライゲーションした産物を2つ以上の区分に分割する工程、
e.前記1つ以上のライゲーションした産物内の領域を増幅して増幅された産物を得る工程、
f.前記増幅された産物を含む前記区分の数を決定する工程、および
g.前記区分の前記数に基づいて前記第1の標的ポリヌクレオチドのコピー数を計算する工程
を含む、方法。
(項目2)
前記標的ポリヌクレオチドを前記2つ以上の区分に分割しない、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記増幅過程中に前記2つ以上の区分が実質的にインタクトなままである、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記決定工程(f)中に前記2つ以上の区分が実質的にインタクトなままである、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記第1および第2のライゲーションプローブをそれぞれ前記第1の標的ポリヌクレオチドに結合させるようにデザインする、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記分割工程(d)が前記標的ポリヌクレオチド分子の分割を含まない、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記2つ以上の区分が前記ライゲーションした産物から開始される増幅反応を含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記第1のライゲーションプローブを種内の個体間で保存されているポリヌクレオチド配列に結合させるようにデザインする、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記区分が少なくとも2つの不混和性流体の混合物内に存在する水滴である、項目1に記載の方法。
(項目11)
連続油相が前記水滴を含む、項目10に記載の方法。
(項目12)
少なくとも4つのライゲーションプローブを前記第1の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目13)
少なくとも4つのライゲーションプローブを前記第1の標的ポリヌクレオチドに結合し、少なくとも4つのライゲーションプローブを前記第2の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記第1のライゲーションプローブを前記第1の標的ポリヌクレオチド内の第1の領域に結合させるようにデザインし、前記第2のライゲーションプローブを前記第1の標的ポリヌクレオチド内の第2の領域に結合させるようにデザインし、前記第1および第2の領域が同一の配列を有さない、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが前記第2の標的ポリヌクレオチドと同一ではない、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが試験染色体であり、前記第2の標的ポリヌクレオチドが基準染色体である、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記試験染色体が21番染色体、13番染色体、18番染色体、およびX染色体からなる群から選択される、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22番染色体、X、およびY染色体からなる群から選択される染色体である、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが染色体のセグメントである、項目1に記載の方法。
(項目20)
前記染色体のセグメントが胎児異数性に関連する、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記ライゲーション反応によって前記第1のライゲーションプローブの5’領域を前記第1のライゲーションプローブの3’領域にライゲーションして環状のライゲーションした産物を得る、項目1に記載の方法。
(項目22)
前記ライゲーション反応によって前記第1のライゲーションプローブの5’領域を前記第2のライゲーションプローブの3’領域にライゲーションして前記第1および第2のライゲーションプローブの少なくとも一部を含む線状のライゲーションした産物を得る、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記第1のライゲーションプローブの前記5’領域および前記3’領域を、それぞれ、前記第1の標的ポリヌクレオチド内の近接配列に結合させるようにデザインする、項目21に記載の方法。
(項目24)
前記第1のライゲーションプローブの前記5’領域および前記3’領域を、それぞれ、前記第1の標的ポリヌクレオチド内の隣接配列に結合させるようにデザインする、項目21に記載の方法。
(項目25)
前記隣接配列が少なくとも1つのヌクレオチドによって分離される、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記ライゲーション反応が、前記第1のライゲーションプローブの前記5’領域と前記3’領域との間の領域中にヌクレオチドを組み込むためのテンプレート駆動ギャップ充填反応をさらに含む、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記第1のライゲーションプローブが酵素によって切断可能な部位を含む、項目1に記載の方法。
(項目28)
酵素によって切断可能な前記部位が1つ以上のウラシルを含む、項目27に記載の方法。
(項目29)
酵素によって切断可能な前記部位が制限部位を含む、項目27に記載の方法。
(項目30)
前記第1のライゲーションプローブがパッドロックプローブである、項目1に記載の方法。
(項目31)
前記第1のライゲーションプローブが分子反転プローブである、項目1に記載の方法。
(項目32)
酵素反応を行って線状ポリヌクレオチドを除去する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目33)
酵素反応を行って一本鎖ポリヌクレオチドを除去する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目34)
前記第1のライゲーションプローブを第1のシグナル伝達因子にコンジュゲートし、前記第2のライゲーションプローブを第2のシグナル伝達因子にコンジュゲートする、項目1に記載の方法。
(項目35)
前記第1のシグナル伝達因子が第1の色調の蛍光マーカーであり、前記第2のシグナル伝達因子が第2の色調の蛍光マーカーである、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記決定工程(f)が、前記第1のライゲーションプローブを第1のシグナル伝達因子で検出する工程および前記第2のライゲーションプローブを第2のシグナル伝達因子で検出する工程を含む、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記第1のライゲーションプローブが複数のライゲーションプローブを含み、各プローブが第1の染色体の異なる領域に向けられ、前記第2のライゲーションプローブが複数のライゲーションプローブを含み、各プローブが第2の染色体の異なる領域に向けられる、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが試験染色体であり、前記第2の標的ポリヌクレオチドが基準染色体である、項目35に記載の方法。
(項目39)
前記第1および第2のライゲーションプローブを同一のシグナル伝達色を有するシグナル伝達因子とコンジュゲートする、項目14に記載の方法。
(項目40)
遺伝子材料集団内の標的ポリヌクレオチドのコピー数を検出する方法であって、
a.第1のライゲーションプローブを第1の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
b.第2のライゲーションプローブを第2の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
c.前記第1および第2のライゲーションプローブをライゲーション反応に供して1つ以上のライゲーションした産物を得る工程、
d.前記1つ以上のライゲーションした産物を連続油相内の2つ以上の水滴に分割する工程、
e.前記1つ以上のライゲーションした産物内の配列を増幅して増幅された産物を得る工程、
f.前記増幅された産物を含む2つ以上の水滴の数を決定する工程、および
g.前記第1の標的ポリヌクレオチドのコピー数を計算する工程
を含む、方法。
(項目41)
前記標的ポリヌクレオチドを前記2つ以上の水滴に分割しない、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記増幅工程(e)中または前記決定工程(f)中に、前記2つ以上の水滴が実質的にインタクトなままである、項目40に記載の方法。
(項目43)
前記2つ以上の水滴が平均して1つを超えるライゲーションしたプローブを含み、前記方法が、アルゴリズムを使用して水滴あたりの標的にライゲーションしたプローブの平均数を計算する工程をさらに含む、項目40に記載の方法。
(項目44)
工程(d)の前記2つ以上の水滴が4,000滴超を含む、項目40に記載の方法。
(項目45)
前記4,000滴超を100,000水滴/ml超の密度で単一のチャンバー内で互いに合わせる、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記液滴は単分散液滴である、項目40に記載の方法。
(項目47)
前記方法は、1,000コピー未満の前記第1の標的ポリヌクレオチドを含む遺伝子材料集団内の前記第1の標的ポリヌクレオチドを検出することができる、項目40に記載の方法。
(項目48)
前記2つ以上の水滴が平均して1つを超えるライゲーションしたプローブを含み、前記方法が、アルゴリズムを使用して水滴あたりの標的にライゲーションしたプローブの平均数を計算する工程をさらに含む、項目40に記載の方法。
(項目49)
前記2つ以上の水滴の直径は、それぞれ、平均して、50nmと300μmとの間である、項目40に記載の方法。
(項目50)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが遺伝子障害に関連する染色体セグメントである、項目40に記載の方法。
(項目51)
前記ライゲーション反応によって前記第1のライゲーションプローブの5’領域を前記第1のライゲーションプローブの3’領域にライゲーションする、項目40に記載の方法。
(項目52)
前記第1のライゲーションプローブがパッドロックプローブである、項目40に記載の方法。
(項目53)
前記第1のライゲーションプローブが分子反転プローブである、項目40に記載の方法。
(項目54)
前記2つ以上の水滴が相当数のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたビーズを含まない、項目40に記載の方法。
(項目55)
前記連続油相が陰イオン性フルオロ界面活性剤を含む、項目40に記載の方法。
(項目56)
前記陰イオン性フルオロ界面活性剤が陰イオン性フルオロ界面活性剤のアンモニウム塩であるクライトックス(商標)である、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記クライトックスが、クライトックスAS、クライトックスFSH、およびクライトックスFSHのモルホリノ誘導体からなる群から選択される、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記油相がフッ素化油を含む、項目40に記載の方法。
(項目59)
前記2つ以上の水滴がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたマイクロビーズを含まない、項目40に記載の方法。
(項目60)
胎児の遺伝子状態を検出する方法であって、
a.標的ポリヌクレオチドを含む母体および胎児の遺伝子材料の混合物を得る工程、
b.前記混合物を前記標的ポリヌクレオチドに結合するターゲティングオリゴヌクレオチドと合わせる工程、
c.前記ターゲティングオリゴヌクレオチドを反応体積に細分割する工程であって、前記反応体積の少なくとも1つが前記標的ポリヌクレオチドや前記ターゲティングオリゴヌクレオチドを含まない、細分割する工程、
d.前記反応体積内で増幅反応を行う工程、
e.前記反応体積内の前記標的ポリヌクレオチドまたは前記ターゲティングオリゴヌクレオチドの存在を検出する工程、および
f.前記混合物中の前記標的ポリヌクレオチドの相対レベルを決定して、胎児の遺伝子状態を検出する工程
を含む、方法。
(項目61)
前記反応体積が連続油相内の水滴である、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがプライマー対を含む、項目60に記載の方法。
(項目63)
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがライゲーションプローブを含む、項目60に記載の方法。
(項目64)
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドが分子反転プローブを含む、項目60に記載の方法。
(項目65)
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがパッドロックプローブを含む、項目60に記載の方法。
(項目66)
前記反応体積が、平均して、1コピーを超えるターゲティングオリゴヌクレオチドを含む、項目60に記載の方法。
(項目67)
前記反応体積が、平均して、1コピーを超える標的ポリヌクレオチドを含む、項目60に記載の方法。
(項目68)
前記反応体積が基準ポリヌクレオチドに対するプライマーをさらに含む、項目60に記載の方法。
(項目69)
前記反応体積が基準ポリヌクレオチドに対するライゲーションプローブをさらに含む、項目60に記載の方法。
(項目70)
前記ライゲーションプローブを前記反応体積内で増幅する、項目63に記載の方法。
(項目71)
前記遺伝子材料が胎児の遺伝子材料を選択的に予め富化させた細胞サンプルに由来しない、項目60に記載の方法。
(項目72)
前記標的ポリヌクレオチドは、18、13、21番染色体、およびX染色体からなる群から選択される染色体内に存在する、項目60に記載の方法。
(項目73)
前記反応体積が油相内の水滴であり、前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがライゲーションプローブであり、工程(f)中の前記決定が前記ライゲーションプローブの増幅された産物を含む液滴の数を基準ポリヌクレオチドに向けられるライゲーションプローブの増幅された産物を含む液滴の数と比較することを含む、項目60に記載の方法。
(項目74)
前記基準ポリヌクレオチドが、胎児の遺伝子異常に関連しない染色体領域である、項目73に記載の方法。
(項目75)
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドへのハイブリッド形成後のライゲーションの際に環状になるライゲーションプローブである、項目60に記載の方法。
(項目76)
ライゲーションしたプローブを含むマイクロカプセルであって、前記マイクロカプセルが、以下:
a.複数のライゲーションプローブを遺伝子サンプル内の標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させる工程、
b.少なくとも1つの前記結合したライゲーションプローブの5’末端を同一または異なる結合したライゲーションプローブの3’末端にライゲーションし、それにより、少なくとも1つのライゲーション産物を得る工程、
c.前記少なくとも1つのライゲーション産物を含む水溶液を液滴生成デバイスに導入する工程、
d.前記少なくとも1つのライゲーション産物を含む水滴を産生するためのデバイスを使用する工程であって、前記水滴が不混和性流体内に存在する、工程、および
e.前記液滴を固相外面を含むマイクロカプセルに変換する工程
によって得られる、マイクロカプセル。
(項目77)
前記変換が50℃超での加熱を含む、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目78)
前記不混和性流体がフッ素化界面活性剤を含む、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目79)
前記不混和性流体がフッ化炭素油を含む、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目80)
前記不混和性流体が陰イオン性フルオロ界面活性剤を含む、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目81)
前記不混和性流体がアンモニウムクライトックスを含む、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目82)
前記マイクロカプセルが、オリゴヌクレオチドに結合したビーズを含まない、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目83)
前記マイクロカプセルが70℃超の温度で実質的にインタクトなままである、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目84)
前記ライゲーションプローブが、遺伝子障害に関連する標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させることができる、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目85)
前記ライゲーションプローブが、胎児異数性に関連する標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させることができる、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目86)
前記遺伝子標的が、21番染色体、13番染色体、18番染色体、およびX染色体からなる群から選択される染色体内に存在する、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目87)
1つ以上の前記ライゲーションプローブがパッドロックプローブである、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目88)
1つ以上の前記ライゲーション産物が環状化プローブである、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目89)
1つ以上の前記ライゲーションプローブが分子反転プローブである、項目76に記載のマイクロカプセル。
(項目90)
2つ以上の水滴を含む油中水混合物であって、前記2つ以上の水滴のうちの少なくとも1つが第1の標的ポリヌクレオチドに向けられる第1のライゲーションプローブを含み、前記2つ以上の水滴のうちの少なくとも1つが第2の標的ポリヌクレオチドに向けられる第2のライゲーションプローブを含む、油中水混合物。
(項目91)
前記第1の標的ポリヌクレオチドおよび前記第2の標的ポリヌクレオチドが同一の分子である、項目90に記載の油中水混合物。
(項目92)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが前記第2の標的ポリヌクレオチドの配列と異なる配列を有する、項目90に記載の油中水混合物。
(項目93)
前記第1の標的ポリヌクレオチドが前記第2の標的ポリヌクレオチドと同一の配列を有する、項目90に記載の油中水混合物。
(項目94)
前記第1の標的ポリヌクレオチドがゲノムセグメント内に第1の領域を含み、前記第2の標的ポリヌクレオチドが前記ゲノムセグメント内に第2の領域を含み、前記第1の領域が前記第2の領域と同一の配列を有さない、項目90に記載の油中水混合物。
(項目95)
前記油中水混合物がアンモニウムクライトックス界面活性剤をさらに含む、項目90に記載の油中水混合物。
(項目96)
前記アンモニウムクライトックス界面活性剤が前記混合物の油相中に少なくとも0.01%の濃度で存在する、項目90に記載の油中水混合物。
(項目97)
前記油中水混合物が前記第1の標的ヌクレオチドの増幅された産物を含まない、項目90に記載の油中水混合物。
(項目98)
前記第1のライゲーションプローブが分子反転プローブである、項目90に記載の油中水混合物。
(項目99)
前記第1のライゲーションプローブが環状プローブである、項目90に記載の油中水混合物。
(項目100)
前記第1のライゲーションプローブが、酵素切断に供した環状化プローブの線状化産物である、項目90に記載の油中水混合物。
(項目101)
前記酵素切断がウラシル−N−グリコシラーゼまたは制限酵素によって触媒される、項目100に記載の油中水混合物。
参照による引用
本明細書中で言及された全ての刊行物および特許出願は、その全体および各刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参考として援用されることが示されるのと同一の範囲に参考として援用される。
Claims (100)
- 遺伝子材料集団内の標的ポリヌクレオチドのコピー数を検出する方法であって、
a.第1のライゲーションプローブを第1の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
b.第2のライゲーションプローブを第2の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
c.前記第1および第2のライゲーションプローブをライゲーション反応に供して1つ以上のライゲーションした産物を得る工程、
d.前記1つ以上のライゲーションした産物を2つ以上の区分に分割する工程、
e.前記1つ以上のライゲーションした産物内の領域を増幅して増幅された産物を得る工程、
f.前記増幅された産物を含む前記区分の数を決定する工程、および
g.前記区分の前記数に基づいて前記第1の標的ポリヌクレオチドのコピー数を計算する工程
を含む、方法。 - 前記標的ポリヌクレオチドを前記2つ以上の区分に分割しない、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅過程中に前記2つ以上の区分が実質的にインタクトなままである、請求項1に記載の方法。
- 前記決定する工程(f)中に前記2つ以上の区分が実質的にインタクトなままである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1および第2のライゲーションプローブをそれぞれ前記第1の標的ポリヌクレオチドに結合させるようにデザインする、請求項1に記載の方法。
- 前記分割する工程(d)が前記標的ポリヌクレオチド分子を分割する工程を含まない、請求項1に記載の方法。
- 前記2つ以上の区分が前記ライゲーションした産物から開始される増幅反応を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のライゲーションプローブを種内の個体間で保存されているポリヌクレオチド配列に結合させるようにデザインする、請求項1に記載の方法。
- 前記区分が少なくとも2つの不混和性流体の混合物内に存在する水滴である、請求項1に記載の方法。
- 連続油相が前記水滴を含む、請求項9に記載の方法。
- 少なくとも4つのライゲーションプローブを前記第1の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも4つのライゲーションプローブを前記第1の標的ポリヌクレオチドに結合し、少なくとも4つのライゲーションプローブを前記第2の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のライゲーションプローブを前記第1の標的ポリヌクレオチド内の第1の領域に結合させるようにデザインし、前記第2のライゲーションプローブを前記第1の標的ポリヌクレオチド内の第2の領域に結合させるようにデザインし、前記第1および第2の領域が同一の配列を有さない、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の標的ポリヌクレオチドが前記第2の標的ポリヌクレオチドと同一ではない、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の標的ポリヌクレオチドが試験染色体であり、前記第2の標的ポリヌクレオチドが基準染色体である、請求項14に記載の方法。
- 前記試験染色体が21番染色体、13番染色体、18番染色体、およびX染色体からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記第1の標的ポリヌクレオチドが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22番染色体、X染色体、およびY染色体からなる群から選択される染色体である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の標的ポリヌクレオチドが染色体のセグメントである、請求項1に記載の方法。
- 前記染色体のセグメントが胎児異数性に関連する、請求項18に記載の方法。
- 前記ライゲーション反応によって前記第1のライゲーションプローブの5’領域を前記第1のライゲーションプローブの3’領域にライゲーションして環状のライゲーションした産物を得る、請求項1に記載の方法。
- 前記ライゲーション反応によって前記第1のライゲーションプローブの5’領域を前記第2のライゲーションプローブの3’領域にライゲーションして前記第1および第2のライゲーションプローブの少なくとも一部を含む線状のライゲーションした産物を得る、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のライゲーションプローブの前記5’領域および前記3’領域を、それぞれ、前記第1の標的ポリヌクレオチド内の近接配列に結合させるようにデザインする、請求項20に記載の方法。
- 前記第1のライゲーションプローブの前記5’領域および前記3’領域を、それぞれ、前記第1の標的ポリヌクレオチド内の隣接配列に結合させるようにデザインする、請求項20に記載の方法。
- 前記隣接配列が少なくとも1つのヌクレオチドによって分離される、請求項23に記載の方法。
- 前記ライゲーション反応が、前記第1のライゲーションプローブの前記5’領域と前記3’領域との間の領域中にヌクレオチドを組み込むためのテンプレート駆動ギャップ充填反応をさらに含む、請求項24に記載の方法。
- 前記第1のライゲーションプローブが酵素によって切断可能な部位を含む、請求項1に記載の方法。
- 酵素によって切断可能な前記部位が1つ以上のウラシルを含む、請求項26に記載の方法。
- 酵素によって切断可能な前記部位が制限部位を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記第1のライゲーションプローブがパッドロックプローブである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のライゲーションプローブが分子反転プローブである、請求項1に記載の方法。
- 酵素反応を行って線状ポリヌクレオチドを除去する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 酵素反応を行って一本鎖ポリヌクレオチドを除去する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のライゲーションプローブを第1のシグナル伝達因子にコンジュゲートし、前記第2のライゲーションプローブを第2のシグナル伝達因子にコンジュゲートする、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のシグナル伝達因子が第1の色調の蛍光マーカーであり、前記第2のシグナル伝達因子が第2の色調の蛍光マーカーである、請求項33に記載の方法。
- 前記決定する工程(f)が、前記第1のライゲーションプローブを第1のシグナル伝達因子で検出する工程および前記第2のライゲーションプローブを第2のシグナル伝達因子で検出する工程を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記第1のライゲーションプローブが複数のライゲーションプローブを含み、各プローブが第1の染色体の異なる領域に向けられ、前記第2のライゲーションプローブが複数のライゲーションプローブを含み、各プローブが第2の染色体の異なる領域に向けられる、請求項35に記載の方法。
- 前記第1の標的ポリヌクレオチドが試験染色体であり、前記第2の標的ポリヌクレオチドが基準染色体である、請求項34に記載の方法。
- 前記第1および第2のライゲーションプローブを同一のシグナル伝達色を有するシグナル伝達因子とコンジュゲートする、請求項13に記載の方法。
- 遺伝子材料集団内の標的ポリヌクレオチドのコピー数を検出する方法であって、
a.第1のライゲーションプローブを第1の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
b.第2のライゲーションプローブを第2の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
c.前記第1および第2のライゲーションプローブをライゲーション反応に供して1つ以上のライゲーションした産物を得る工程、
d.前記1つ以上のライゲーションした産物を連続油相内の2つ以上の水滴に分割する工程、
e.前記1つ以上のライゲーションした産物内の配列を増幅して増幅された産物を得る工程、
f.前記増幅された産物を含む2つ以上の水滴の数を決定する工程、および
g.前記第1の標的ポリヌクレオチドのコピー数を計算する工程
を含む、方法。 - 前記標的ポリヌクレオチドを前記2つ以上の水滴に分割しない、請求項39に記載の方法。
- 前記増幅する工程(e)中または前記決定する工程(f)中に、前記2つ以上の水滴が実質的にインタクトなままである、請求項39に記載の方法。
- 前記2つ以上の水滴が平均して1つを超えるライゲーションしたプローブを含み、前記方法が、アルゴリズムを使用して水滴あたりの標的にライゲーションしたプローブの平均数を計算する工程をさらに含む、請求項39に記載の方法。
- 工程(d)の前記2つ以上の水滴が4,000滴超を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記4,000滴超を100,000水滴/ml超の密度で単一のチャンバー内で互いに合わせる、請求項43に記載の方法。
- 前記液滴は単分散液滴である、請求項39に記載の方法。
- 前記方法は、1,000コピー未満の前記第1の標的ポリヌクレオチドを含む遺伝子材料集団内の前記第1の標的ポリヌクレオチドを検出することができる、請求項39に記載の方法。
- 前記2つ以上の水滴が平均して1つを超えるライゲーションしたプローブを含み、前記方法が、アルゴリズムを使用して水滴あたりの標的にライゲーションしたプローブの平均数を計算する工程をさらに含む、請求項39に記載の方法。
- 前記2つ以上の水滴の直径は、それぞれ、平均して、50nmと300μmとの間である、請求項39に記載の方法。
- 前記第1の標的ポリヌクレオチドが遺伝子障害に関連する染色体セグメントである、請求項39に記載の方法。
- 前記ライゲーション反応によって前記第1のライゲーションプローブの5’領域を前記第1のライゲーションプローブの3’領域にライゲーションする、請求項39に記載の方法。
- 前記第1のライゲーションプローブがパッドロックプローブである、請求項39に記載の方法。
- 前記第1のライゲーションプローブが分子反転プローブである、請求項39に記載の方法。
- 前記2つ以上の水滴が相当数のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたビーズを含まない、請求項39に記載の方法。
- 前記連続油相が陰イオン性フルオロ界面活性剤を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記陰イオン性フルオロ界面活性剤が陰イオン性フルオロ界面活性剤のアンモニウム塩であるクライトックス(商標)である、請求項54に記載の方法。
- 前記クライトックスが、クライトックスAS、クライトックスFSH、およびクライトックスFSHのモルホリノ誘導体からなる群から選択される、請求項55に記載の方法。
- 前記油相がフッ素化油を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記2つ以上の水滴がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたマイクロビーズを含まない、請求項39に記載の方法。
- 標的ポリヌクレオチドを含む母体および胎児の遺伝子材料の混合物中の標的ポリヌクレオチドの相対レベルを、胎児の遺伝子状態の指標とする方法であって、
a.標的ポリヌクレオチドを含む母体および胎児の遺伝子材料の前記混合物を前記標的ポリヌクレオチドに結合するターゲティングオリゴヌクレオチドと合わせる工程、
b.前記ターゲティングオリゴヌクレオチドを反応体積に細分割する工程であって、前記反応体積の少なくとも1つが前記標的ポリヌクレオチドおよび前記ターゲティングオリゴヌクレオチドを含まない、細分割する工程、
c.前記反応体積内で増幅反応を行う工程、
d.前記反応体積内の前記標的ポリヌクレオチドまたは前記ターゲティングオリゴヌクレオチドの存在を検出する工程、および
e.前記混合物中の前記標的ポリヌクレオチドの相対レベルを決定する工程
を含む、方法。 - 前記反応体積が連続油相内の水滴である、請求項59に記載の方法。
- 前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがプライマー対を含む、請求項59に記載の方法。
- 前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがライゲーションプローブを含む、請求項59に記載の方法。
- 前記ターゲティングオリゴヌクレオチドが分子反転プローブを含む、請求項59に記載の方法。
- 前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがパッドロックプローブを含む、請求項59に記載の方法。
- 前記反応体積が、平均して、1コピーを超えるターゲティングオリゴヌクレオチドを含む、請求項59に記載の方法。
- 前記反応体積が、平均して、1コピーを超える標的ポリヌクレオチドを含む、請求項59に記載の方法。
- 前記反応体積が基準ポリヌクレオチドに対するプライマーをさらに含む、請求項59に記載の方法。
- 前記反応体積が基準ポリヌクレオチドに対するライゲーションプローブをさらに含む、請求項59に記載の方法。
- 前記ライゲーションプローブを前記反応体積内で増幅する、請求項62に記載の方法。
- 前記遺伝子材料が胎児の遺伝子材料を選択的に予め富化させた細胞サンプルに由来しない、請求項59に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドは、18、13、21番染色体、およびX染色体からなる群から選択される染色体内に存在する、請求項59に記載の方法。
- 前記反応体積が油相内の水滴であり、前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがライゲーションプローブであり、工程(e)中の前記決定が前記ライゲーションプローブの増幅された産物を含む液滴の数を基準ポリヌクレオチドに向けられるライゲーションプローブの増幅された産物を含む液滴の数と比較することを含む、請求項59に記載の方法。
- 前記基準ポリヌクレオチドが、胎児の遺伝子異常に関連しない染色体領域である、請求項72に記載の方法。
- 前記ターゲティングオリゴヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドへのハイブリッド形成後のライゲーションの際に環状になるライゲーションプローブである、請求項59に記載の方法。
- ライゲーションしたプローブを含むマイクロカプセルであって、前記マイクロカプセルが、以下:
a.複数のライゲーションプローブを遺伝子サンプル内の標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させる工程、
b.少なくとも1つの前記結合したライゲーションプローブの5’末端を同一または異なる結合したライゲーションプローブの3’末端にライゲーションし、それにより、少なくとも1つのライゲーション産物を得る工程、
c.前記少なくとも1つのライゲーション産物を含む水溶液を液滴生成デバイスに導入する工程、
d.前記少なくとも1つのライゲーション産物を含む水滴を産生するためのデバイスを使用する工程であって、前記水滴が不混和性流体内に存在する、工程、および
e.前記液滴を固相外面を含むマイクロカプセルに変換する工程
によって得られる、マイクロカプセル。 - 前記変換が50℃超での加熱を含む、請求項75に記載のマイクロカプセル。
- 前記不混和性流体がフッ素化界面活性剤を含む、請求項75に記載のマイクロカプセル。
- 前記不混和性流体がフッ化炭素油を含む、請求項75に記載のマイクロカプセル。
- 前記不混和性流体が陰イオン性フルオロ界面活性剤を含む、請求項75に記載のマイクロカプセル。
- 前記不混和性流体がアンモニウムクライトックスを含む、請求項75に記載のマイクロカプセル。
- 前記マイクロカプセルが、オリゴヌクレオチドに結合したビーズを含まない、請求項75に記載のマイクロカプセル。
- 前記マイクロカプセルが70℃超の温度で実質的にインタクトなままである、請求項75に記載のマイクロカプセル。
- 前記ライゲーションプローブが、遺伝子障害に関連する標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させることができる、請求項75に記載のマイクロカプセル。
- 前記ライゲーションプローブが、胎児異数性に関連する標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させることができる、請求項75に記載のマイクロカプセル。
- 前記遺伝子標的が、21番染色体、13番染色体、18番染色体、およびX染色体からなる群から選択される染色体内に存在する、請求項75に記載のマイクロカプセル。
- 1つ以上の前記ライゲーションプローブがパッドロックプローブである、請求項75に記載のマイクロカプセル。
- 1つ以上の前記ライゲーション産物が環状化プローブである、請求項75に記載のマイクロカプセル。
- 1つ以上の前記ライゲーションプローブが分子反転プローブである、請求項75に記載のマイクロカプセル。
- 2つ以上の水滴を含む油中水混合物であって、前記2つ以上の水滴のうちの少なくとも1つが第1の標的ポリヌクレオチドに向けられる第1のライゲーションプローブを含み、前記2つ以上の水滴のうちの少なくとも1つが第2の標的ポリヌクレオチドに向けられる第2のライゲーションプローブを含む、油中水混合物。
- 前記第1の標的ポリヌクレオチドおよび前記第2の標的ポリヌクレオチドが同一の分子である、請求項89に記載の油中水混合物。
- 前記第1の標的ポリヌクレオチドが前記第2の標的ポリヌクレオチドの配列と異なる配列を有する、請求項89に記載の油中水混合物。
- 前記第1の標的ポリヌクレオチドが前記第2の標的ポリヌクレオチドと同一の配列を有する、請求項89に記載の油中水混合物。
- 前記第1の標的ポリヌクレオチドがゲノムセグメント内に第1の領域を含み、前記第2の標的ポリヌクレオチドが前記ゲノムセグメント内に第2の領域を含み、前記第1の領域が前記第2の領域と同一の配列を有さない、請求項89に記載の油中水混合物。
- 前記油中水混合物がアンモニウムクライトックス界面活性剤をさらに含む、請求項89に記載の油中水混合物。
- 前記アンモニウムクライトックス界面活性剤が前記混合物の油相中に少なくとも0.01%の濃度で存在する、請求項89に記載の油中水混合物。
- 前記油中水混合物が前記第1の標的ヌクレオチドの増幅された産物を含まない、請求項89に記載の油中水混合物。
- 前記第1のライゲーションプローブが分子反転プローブである、請求項89に記載の油中水混合物。
- 前記第1のライゲーションプローブが環状プローブである、請求項89に記載の油中水混合物。
- 前記第1のライゲーションプローブが、酵素切断に供した環状化プローブの線状化産物である、請求項89に記載の油中水混合物。
- 前記酵素切断がウラシル−N−グリコシラーゼまたは制限酵素によって触媒される、請求項99に記載の油中水混合物。
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