JP2013502932A - 治療用dll4結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、DLL4に結合することができる抗体、CDR移植された抗体およびこの結合断片を含む、DLL4に結合するタンパク質を提供する。好ましくは、本明細書に記載される結合タンパク質は高親和性でDLL4に結合する。さらに好ましくは、本発明に従った結合タンパク質はDLL4を中和することができる。本発明は、ヒトDLL4結合タンパク質を含む、DLL4結合タンパク質を作製し使用する方法も提供する。有利には、本発明は、ヒト化DLL4結合タンパク質を調製する必要性をなくし、それによってヒト化DLL4結合タンパク質に伴う面倒を取り除く。
CDR−H1:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7(配列番号99)、
(X1はSまたはNであり;
X2はS、GまたはNであり;
X3はS、N、T、GまたはRであり;
X4はYであり;
X5はYまたはHであり;
X6はWであり;および
X7はGである。);
CDR−H2:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16(配列番号100)、
(X1はDであり;
X2はIであり;
X3はY、NまたはSであり;
X4はYであり;
X5はT、N、A、I、SまたはRであり;
X6はGであり;
X7はS、N、TまたはGであり;
X8はTであり;
X9はYであり;
X10はYであり
X11はNであり;
X12はPであり;
X13はSであり;
X14はLであり;
X15はKであり;および
X16はS、N、DまたはGである。);
CDR−H3:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11(配列番号101)、
(X1はE、Y、F、Q、W、LまたはAであり;
X2はD、A、S、G、V、EまたはNであり;
X3はV、M、L、PまたはAであり;
X4はI、A、P、R、S、K、Q、V、G、MまたはEであり;
X5はL、Y、FまたはMであり;
X6はR、G、S、QまたはAであり;
X7はGであり;
X8はG、AまたはSであり;
X9はS、A、L、V、RまたはGであり;
X10はDであり;および
X11はY、D、S、N、H、E、R、L、P、C、I、M、T、QまたはKである。);
CDR−L1:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11(配列番号102)、
(X1はSであり;
X2はGであり;
X3はQ、EまたはDであり;
X4はR、S、G、M、K、LまたはTであり;
X5はLであり;
X6はGであり;
X7はDまたはEであり;
X8はKであり;
X9はYであり;
X10はAまたはVであり;および
X11はSである。);
CDR−L2:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7(配列番号103)、
(X1はEまたはQであり;
X2はDであり;
X3はS、L、T、A、EまたはFであり;
X4はK、T、E、N、Q、SまたはMであり;
X5はRであり;
X6はPであり;および
X7はSである。);
ならびに
CDR−L3:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9(配列番号104)、
(X1はQであり;
X2はAであり;
X3はWであり;
X4はDであり;
X5はR、S、M、E、N、GまたはKであり;
X6はDまたはEであり;
X7はT、V、A、SまたはMであり;
X8はG、AまたはCであり;および
X9はVである。)
からなる群から選択される少なくとも1つまたは複数のCDRを含む、ヒトDLL4に結合することができる抗原結合ドメインを含む結合タンパク質に関する。
配列番号111の残基23−33番(CDR−L1);配列番号111の残基49−55番(CDR−L2);配列番号111の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号117(CDR−H1);配列番号118(CDR−H2);配列番号119(CDR−H3);配列番号121(CDR−H1);配列番号122(CDR−H2);配列番号123(CDR−H3);配列番号125(CDR−H1);配列番号126(CDR−H2);配列番号127(CDR−H3);配列番号129(CDR−H1);配列番号130(CDR−H2);配列番号131(CDR−H3);配列番号133(CDR−H1);配列番号134(CDR−H2);配列番号135(CDR−H3);配列番号137(CDR−H1);配列番号138(CDR−H2);配列番号139(CDR−H3);配列番号141(CDR−H1);配列番号142(CDR−H2);配列番号143(CDR−H3);配列番号145(CDR−H1);配列番号146(CDR−H2);配列番号147(CDR−H3);配列番号149(CDR−H1);配列番号150(CDR−H2);配列番号151(CDR−H3);配列番号153(CDR−H1);配列番号154(CDR−H2);配列番号155(CDR−H3);配列番号157(CDR−H1);配列番号158(CDR−H2);配列番号159(CDR−H3);配列番号161(CDR−H1);配列番号162(CDR−H2);配列番号163(CDR−H3);配列番号165(CDR−H1);配列番号166(CDR−H2);配列番号167(CDR−H3);配列番号169(CDR−H1);配列番号170(CDR−H2);配列番号171(CDR−H3);配列番号173(CDR−H1);配列番号174(CDR−H2);配列番号175(CDR−H3);配列番号177(CDR−H1);配列番号178(CDR−H2);配列番号179(CDR−H3);配列番号181(CDR−H1);配列番号182(CDR−H2);配列番号183(CDR−H3);配列番号185(CDR−H1);配列番号186(CDR−H2);配列番号187(CDR−H3);配列番号189(CDR−H1);配列番号190(CDR−H2);配列番号191(CDR−H3);配列番号193(CDR−H1);配列番号194(CDR−H2);配列番号195(CDR−H3);配列番号197(CDR−H1);配列番号198(CDR−H2);配列番号199(CDR−H3);配列番号201(CDR−H1);配列番号202(CDR−H2);配列番号203(CDR−H3);配列番号205(CDR−H1);配列番号206(CDR−H2);配列番号207(CDR−H3);配列番号209(CDR−H1);配列番号210(CDR−H2);配列番号211(CDR−H3);配列番号213(CDR−H1);配列番号214(CDR−H2);配列番号215(CDR−H3);配列番号217(CDR−L1);配列番号218(CDR−L2);配列番号219(CDR−L3);配列番号221(CDR−L1);配列番号222(CDR−L2);配列番号223(CDR−L3);配列番号225(CDR−L1);配列番号226(CDR−L2);配列番号227(CDR−L3);配列番号229(CDR−L1);配列番号230(CDR−L2);配列番号231(CDR−L3);配列番号233(CDR−L1);配列番号234(CDR−L2);配列番号235(CDR−L3);配列番号237(CDR−L1);配列番号238(CDR−L2);配列番号239(CDR−L3);配列番号241(CDR−L1);配列番号242(CDR−L2);配列番号243(CDR−L3);配列番号245(CDR−L1);配列番号246(CDR−L2);配列番号247(CDR−L3);配列番号249(CDR−L1);配列番号250(CDR−L2);配列番号251(CDR−L3);配列番号253(CDR−L1);配列番号254(CDR−L2);配列番号255(CDR−L3);配列番号257(CDR−L1);配列番号258(CDR−L2);配列番号259(CDR−L3);配列番号261(CDR−L1);配列番号262(CDR−L2);配列番号263(CDR−L3);配列番号265(CDR−L1);配列番号266(CDR−L2);配列番号267(CDR−L3);配列番号269(CDR−L1);配列番号270(CDR−L2);配列番号271(CDR−L3);配列番号273(CDR−L1);配列番号274(CDR−L2);配列番号275(CDR−L3);配列番号277(CDR−L1);配列番号278(CDR−L2);配列番号279(CDR−L3);配列番号281(CDR−L1);配列番号282(CDR−L2);配列番号283(CDR−L3);配列番号285(CDR−L1);配列番号286(CDR−L2);配列番号287(CDR−L3);配列番号289(CDR−L1);配列番号290(CDR−L2);配列番号291(CDR−L3);配列番号293(CDR−L1);配列番号294(CDR−L2);配列番号295(CDR−L3);配列番号297(CDR−L1);配列番号298(CDR−L2);配列番号299(CDR−L3);配列番号301(CDR−L1);配列番号302(CDR−L2);配列番号303(CDR−L3);配列番号305(CDR−L1);配列番号306(CDR−L2);配列番号307(CDR−L3);配列番号309(CDR−L1);配列番号310(CDR−L2);配列番号311(CDR−L3);配列番号313(CDR−L1);配列番号314(CDR−L2);配列番号315(CDR−L3);
配列番号334の残基31−37番(CDR−H1);配列番号334の残基52−67番(CDR−H2);配列番号334の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号335の残基23−33番(CDR−L1);配列番号335の残基49−55番(CDR−L2);配列番号335の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号336の残基31−37番(CDR−H1);配列番号336の残基52−67番(CDR−H2);配列番号336の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号337の残基23−33番(CDR−L1);配列番号337の残基49−55番(CDR−L2);配列番号337の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号338の残基31−37番(CDR−H1);配列番号338の残基52−67番(CDR−H2);配列番号338の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号339の残基23−33番(CDR−L1);配列番号339の残基49−55番(CDR−L2);配列番号339の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号340の残基31−37番(CDR−H1);配列番号340の残基52−67番(CDR−H2);配列番号340の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号341の残基23−33番(CDR−L1);配列番号341の残基49−55番(CDR−L2);配列番号341の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号342の残基31−37番(CDR−H1);配列番号342の残基52−67番(CDR−H2);配列番号342の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号343の残基23−33番(CDR−L1);配列番号343の残基49−55番(CDR−L2);配列番号343の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号344の残基31−37番(CDR−H1);配列番号344の残基52−67番(CDR−H2);配列番号344の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号345の残基24−34番(CDR−L1);配列番号345の残基50−56番(CDR−L2);配列番号345の残基89−97番(CDR−L3);
配列番号346の残基31−37番(CDR−H1);配列番号346の残基52−67番(CDR−H2);配列番号346の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号347の残基23−33番(CDR−L1);配列番号347の残基49−55番(CDR−L2);配列番号347の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号348の残基31−37番(CDR−H1);配列番号348の残基52−67番(CDR−H2);配列番号348の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号349の残基24−34番(CDR−L1);配列番号349の残基50−56番(CDR−L2);配列番号349の残基89−97番(CDR−L3);
配列番号350の残基31−37番(CDR−H1);配列番号350の残基52−67番(CDR−H2);配列番号350の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号351の残基24−34番(CDR−L1);配列番号351の残基50−56番(CDR−L2);配列番号351の残基89−97番(CDR−L3);
配列番号352の残基31−37番(CDR−H1);配列番号352の残基52−67番(CDR−H2);配列番号352の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号353の残基24−34番(CDR−L1);配列番号353の残基50−56番(CDR−L2);配列番号353の残基89−97番(CDR−L3);
配列番号354の残基31−37番(CDR−H1);配列番号354の残基52−67番(CDR−H2);配列番号354の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号355の残基24−34番(CDR−L1);配列番号355の残基50−56番(CDR−L2);配列番号355の残基89−97番(CDR−L3);
配列番号356の残基31−37番(CDR−H1);配列番号356の残基52−67番(CDR−H2);配列番号356の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号357の残基23−33番(CDR−L1);配列番号357の残基49−55番(CDR−L2);配列番号357の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号358の残基31−37番(CDR−H1);配列番号358の残基52−67番(CDR−H2);配列番号358の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号359の残基23−33番(CDR−L1);配列番号359の残基49−55番(CDR−L2);配列番号359の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号360の残基31−37番(CDR−H1);配列番号360の残基52−67番(CDR−H2);配列番号360の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号361の残基23−33番(CDR−L1);配列番号361の残基49−55番(CDR−L2);配列番号361の残基88−96番(CDR−L3)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含む。
VH E9 CDR組
CDR−H1:配列番号1の残基31−37番
CDR−H2:配列番号1の残基52−67番
CDR−H3配列番号1の残基100−110番
VL E9 CDR組
CDR−L1:配列番号111の残基23−33番
CDR−L2:配列番号111の残基49−55番
CDR−L3:配列番号111の残基88−96番
VH E9.4 CDR組
CDR−H1:配列番号117
CDR−H2:配列番号118
CDR−H3:配列番号119
VL E9.4 CDR組
CDR−L1:配列番号229
CDR−L2:配列番号230
CDR−L3:配列番号231
VH E9.11 CDR組
CDR−H1:配列番号121
CDR−H2:配列番号122
CDR−H3:配列番号123
VL E9.11 CDR組
CDR−L1:配列番号233
CDR−L2:配列番号234
CDR−L3:配列番号235
VH E9.14 CDR組
CDR−H1:配列番号125
CDR−H2:配列番号126
CDR−H3:配列番号127
VL E9.14 CDR組
CDR−L1:配列番号237
CDR−L2:配列番号238
CDR−L3:配列番号239
VH E9.17 CDR組
CDR−H1:配列番号129
CDR−H2:配列番号130
CDR−H3:配列番号131
VL E9.17 CDR組
CDR−L1:配列番号241
CDR−L2:配列番号242
CDR−L3:配列番号243
VH E9.18 CDR組
CDR−H1:配列番号133
CDR−H2:配列番号134
CDR−H3:配列番号135
VL E9.18 CDR組
CDR−L1:配列番号245
CDR−L2:配列番号246
CDR−L3:配列番号247
VH E9.19 CDR組
CDR−H1:配列番号137
CDR−H2:配列番号138
CDR−H3:配列番号139
VL E9.19 CDR組
CDR−L1:配列番号249
CDR−L2:配列番号250
CDR−L3:配列番号251
VH E9.22 CDR組
CDR−H1:配列番号141
CDR−H2:配列番号142
CDR−H3:配列番号143
VL E9.22 CDR組
CDR−L1:配列番号253
CDR−L2:配列番号254
CDR−L3:配列番号255
VH E9.48 CDR組
CDR−H1:配列番号145
CDR−H2:配列番号146
CDR−H3:配列番号147
VL E9.48 CDR組
CDR−L1:配列番号257
CDR−L2:配列番号258
CDR−L3:配列番号259
VH E9.65 CDR組
CDR−H1:配列番号149
CDR−H2:配列番号150
CDR−H3:配列番号151
VL E9.65 CDR組
CDR−L1:配列番号261
CDR−L2:配列番号262
CDR−L3:配列番号263
VH E9.66 CDR組
CDR−H1:配列番号153
CDR−H2:配列番号154
CDR−H3:配列番号155
VL E9.66 CDR組
CDR−L1:配列番号265
CDR−L2:配列番号266
CDR−L3:配列番号267
VH E9.71 CDR組
CDR−H1:配列番号157
CDR−H2:配列番号158
CDR−H3:配列番号159
VL E9.71 CDR組
CDR−L1:配列番号269
CDR−L2:配列番号270
CDR−L3:配列番号271
VH E9.13 CDR組
CDR−H1:配列番号161
CDR−H2:配列番号162
CDR−H3:配列番号163
VL E9.13 CDR組
CDR−L1:配列番号217
CDR−L2:配列番号218
CDR−L3:配列番号219
VH E9.16 CDR組
CDR−H1:配列番号165
CDR−H2:配列番号166
CDR−H3:配列番号167
VL E9.16 CDR組
CDR−L1:配列番号221
CDR−L2:配列番号222
CDR−L3:配列番号223
VH E9.38 CDR組
CDR−H1:配列番号169
CDR−H2:配列番号170
CDR−H3:配列番号171
VL E9.38 CDR組
CDR−L1:配列番号225
CDR−L2:配列番号226
CDR−L3:配列番号227
VH E9.2B CDR組
CDR−H1:配列番号173
CDR−H2:配列番号174
CDR−H3:配列番号175
VL E9.2B CDR組
CDR−L1:配列番号273
CDR−L2:配列番号274
CDR−L3:配列番号275
VH E9.1F CDR組
CDR−H1:配列番号177
CDR−H2:配列番号178
CDR−H3:配列番号179
VL E9.1F CDR組
CDR−L1:配列番号277
CDR−L2:配列番号278
CDR−L3:配列番号279
VH E9.10H CDR組
CDR−H1:配列番号181
CDR−H2:配列番号182
CDR−H3:配列番号183
VL E9.10H CDR組
CDR−L1:配列番号301
CDR−L2:配列番号302
CDR−L3:配列番号303
VH E9.5E CDR組
CDR−H1:配列番号185
CDR−H2:配列番号186
CDR−H3:配列番号187
VL E9.5E CDR組
CDR−L1:配列番号293
CDR−L2:配列番号294
CDR−L3:配列番号295
VH E9.10C CDR組
CDR−H1:配列番号189
CDR−H2:配列番号190
CDR−H3:配列番号191
VL E9.10C CDR組
CDR−L1:配列番号281
CDR−L2:配列番号282
CDR−L3:配列番号283
VH E9.7E CDR組
CDR−H1:配列番号193
CDR−H2:配列番号194
CDR−H3:配列番号195
VL E9.7E CDR組
CDR−L1:配列番号289
CDR−L2:配列番号290
CDR−L3:配列番号291
VH E9.12B CDR組
CDR−H1:配列番号197
CDR−H2:配列番号198
CDR−H3:配列番号199
VL E9.12B CDR組
CDR−L1:配列番号297
CDR−L2:配列番号298
CDR−L3:配列番号299
VH E9.10E CDR組
CDR−H1:配列番号201
CDR−H2:配列番号202
CDR−H3:配列番号203
VL E9.10E CDR組
CDR−L1:配列番号285
CDR−L2:配列番号286
CDR−L3:配列番号287
VH E9.6A CDR組
CDR−H1:配列番号205
CDR−H2:配列番号206
CDR−H3:配列番号207
VL E9.6A CDR組
CDR−L1:配列番号305
CDR−L2:配列番号306
CDR−L3:配列番号307
VH E9.7A CDR組
CDR−H1:配列番号209
CDR−H2:配列番号210
CDR−H3:配列番号211
VL E9.7A CDR組
CDR−L1:配列番号309
CDR−L2:配列番号310
CDR−L3:配列番号311
VH E9.8H CDR組
CDR−H1:配列番号213
CDR−H2:配列番号214
CDR−H3:配列番号215
VL E9.8H CDR組
CDR−L1:配列番号313
CDR−L2:配列番号314
CDR−L3:配列番号315
VH E9.1 CDR組
CDR−H1:配列番号334の残基31−37番
CDR−H2:配列番号334の残基52−67番
CDR−H3:配列番号334の残基100−110番
VL E9.1 CDR組
CDR−L1:配列番号335の残基23−33番
CDR−L2:配列番号335の残基49−55番
CDR−L3:配列番号335の残基88−96番
VH E9−SE1 CDR組
CDR−H1:配列番号336の残基31−37番
CDR−H2:配列番号336の残基52−67番
CDR−H3:配列番号336の残基100−110番
VL E9−SE1 CDR組
CDR−L1:配列番号337の残基23−33番
CDR−L2:配列番号337の残基49−55番
CDR−L3:配列番号337の残基88−96番
VH E9−SE2 CDR組
CDR−H1:配列番号338の残基31−37番
CDR−H2:配列番号338の残基52−67番
CDR−H3:配列番号338の残基100−110番
VL E9−SE2 CDR組
CDR−L1:配列番号339の残基23−33番
CDR−L2:配列番号339の残基49−55番
CDR−L3:配列番号339の残基88−96番
VH E9−SE3 CDR組
CDR−H1:配列番号340の残基31−37番
CDR−H2:配列番号340の残基52−67番
CDR−H3:配列番号340の残基100−110番
VL E9−SE3 CDR組
CDR−L1:配列番号341の残基23−33番
CDR−L2:配列番号341の残基49−55番
CDR−L3:配列番号341の残基88−96番
VH E9−SE4 CDR組
CDR−H1:配列番号342の残基31−37番
CDR−H2:配列番号342の残基52−67番
CDR−H3:配列番号342の残基100−110番
VL E9−SE4 CDR組
CDR−L1:配列番号343の残基23−33番
CDR−L2:配列番号343の残基49−55番
CDR−L3:配列番号343の残基88−96番
VH E9−SE5 CDR組
CDR−H1:配列番号344の残基31−37番
CDR−H2:配列番号344の残基52−67番
CDR−H3:配列番号344の残基100−110番
VL E9−SE5 CDR組
CDR−L1:配列番号345の残基24−34番
CDR−L2:配列番号345の残基50−56番
CDR−L3:配列番号345の残基89−97番
VH E9−SE6 CDR組
CDR−H1:配列番号346の残基31−37番
CDR−H2:配列番号346の残基52−67番
CDR−H3:配列番号346の残基100−110番
VL E9−SE6 CDR組
CDR−L1:配列番号347の残基23−33番
CDR−L2:配列番号347の残基49−55番
CDR−L3:配列番号347の残基88−96番
VH E9−SE7 CDR組
CDR−H1:配列番号348の残基31−37番
CDR−H2:配列番号348の残基52−67番
CDR−H3:配列番号348の残基100−110番
VL E9−SE7 CDR組
CDR−L1:配列番号349の残基24−34番
CDR−L2:配列番号349の残基50−56番
CDR−L3:配列番号349の残基89−97番
VH E9−SE8 CDR組
CDR−H1:配列番号350の残基31−37番
CDR−H2:配列番号350の残基52−67番
CDR−H3:配列番号350の残基100−110番
VL E9−SE8 CDR組
CDR−L1:配列番号351の残基24−34番
CDR−L2:配列番号351の残基50−56番
CDR−L3:配列番号351の残基89−97番
VH E9−FR1 CDR組
CDR−H1:配列番号352の残基31−37番
CDR−H2:配列番号352の残基52−67番
CDR−H3:配列番号352の残基100−110番
VL E9−FR1 CDR組
CDR−L1:配列番号353の残基24−34番
CDR−L2:配列番号353の残基50−56番
CDR−L3:配列番号353の残基89−97番
VH E9−FR2 CDR組
CDR−H1:配列番号354の残基31−37番
CDR−H2:配列番号354の残基52−67番
CDR−H3:配列番号354の残基100−110番
VL E9−FR2 CDR組
CDR−L1:配列番号355の残基24−34番
CDR−L2:配列番号355の残基50−56番
CDR−L3:配列番号355の残基89−97番
VH E9.71 CDR組
CDR−H1:配列番号356の残基31−37番
CDR−H2:配列番号356の残基52−67番
CDR−H3:配列番号356の残基100−110番
VL E9.71 CDR組
CDR−L1:配列番号357の残基23−33番
CDR−L2:配列番号357の残基49−55番
CDR−L3:配列番号357の残基88−96番
VL E9.71(M)CDR組
CDR−H1:配列番号358の残基31−37番
CDR−H2:配列番号358の残基52−67番
CDR−H3:配列番号358の残基100−110番
VL E9.71(M)CDR組
CDR−L1:配列番号359の残基23−33番
CDR−L2:配列番号359の残基49−55番
CDR−L3:配列番号359の残基88−96番
VH E9.71(L)CDR組
CDR−H1:配列番号360の残基31−37番
CDR−H2:配列番号360の残基52−67番
CDR−H3:配列番号360の残基100−110番
VH E9.71(L)CDR組
CDR−L1:配列番号361の残基23−33番
CDR−L2:配列番号361の残基49−55番
CDR−L3:配列番号361の残基88−96番
別の実施形態では、結合タンパク質は、上の群における3つのCDRの任意のVH組から選択される3つのCDRの可変重鎖(VH)組および上の群における3つのCDRの任意のVL組から選択される3つのCDRの可変軽鎖(VL)組を含む。
VH E9 CDR組およびVL E9 CDR組、
VH E9.4 CDR組およびVL E9.4 CDR組、
VH E9.11 CDR組およびVL E9.11 CDR組、
VH E9.14 CDR組およびVL E9.14 CDR組、
VH E9.17 CDR組およびVL E9.17 CDR組、
VH E9.18 CDR組およびVL E9.18 CDR組、
VH E9.19 CDR組およびVL E9.19 CDR組、
VH E9.22 CDR組およびVL E9.22 CDR組、
VH E9.48 CDR組およびVL E9.48 CDR組、
VH E9.65 CDR組およびVL E9.65 CDR組、
VH E9.66 CDR組およびVL E9.66 CDR組、
VH E9.71 CDR組およびVL E9.71 CDR組、
VH E9.13 CDR組およびVL E9.13 CDR組、
VH E9.16 CDR組およびVL E9.16 CDR組、
VH E9.38 CDR組およびVL E9.38 CDR組、
VH E9.2B CDR組およびVL E9.2B CDR組、
VH E9.1F CDR組およびVL E9.1F CDR組、
VH E9.10H CDR組およびVL E9.10H CDR組、
VH E9.5E CDR組およびVL E9.5E CDR組、
VH E9.10C CDR組およびVL E9.10C CDR組、
VH E9.7E CDR組およびVL E9.7E CDR組、
VH E9.12B CDR組およびVL E9.12B CDR組、
VH E9.10E CDR組およびVL E9.10E CDR組、
VH E9.6A CDR組およびVL E9.6A CDR組、
VH E9.7A CDR組およびVL E9.7A CDR組、
VH E9.8H CDR組およびVL E9.8H CDR組、
VH E9−SE1 CDR組およびVL E9−SE1 CDR組、
VH E9−SE2 CDR組およびVL E9−SE2 CDR組、
VH E9−SE3 CDR組およびVL E9−SE3 CDR組、
VH E9−SE4 CDR組およびVL E9−SE4 CDR組、
VH E9−SE5 CDR組およびVL E9−SE5 CDR組、
VH E9−SE6 CDR組およびVL E9−SE6 CDR組、
VH E9−SE7 CDR組およびVL E9−SE7 CDR組、
VH E9−SE8 CDR組およびVL E9−SE8 CDR組、
VH E9−FR1 CDR組およびVL E9−FR1 CDR組、
VH E9−FR2 CDR組およびVL E9−FR2 CDR組、
VH E9.71 CDR組およびVL E9.71 CDR組、
VH E9.71(M)CDR組およびVL E9.71(M)CDR組、および
VH E9.71(L)CDR組およびVL E9.71(L)CDR組
からなる可変ドメインCDR組の群から選択される少なくとも2つの可変ドメインCDR組を含む。
重鎖アクセプターフレームワーク配列、配列番号6−22、
重鎖アクセプター配列、配列番号35−62、
軽鎖アクセプター配列、配列番号23−34および
軽鎖アクセプター配列、配列番号63−98
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
CDRに隣接する残基;
グリコシル化部位残基;
希少残基;
ヒトDLL4と相互作用をすることができる残基;
カノニカル残基;
重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の接触残基;
バーニヤ(Vernier)ゾーン内の残基;および
コチア(Chothia)定義された可変重鎖CDR1とカバット(Kabat)定義された第一の重鎖フレームワーク間を重複する領域における残基
からなる群から選択されるキーとなる残基に少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含むヒトアクセプターフレームワークを含む。
配列番号1、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、334、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358および360
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン(VH)を含む。
配列番号111、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、216、220、224、272、276、300、292、280、288、296、284、304、308、312、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359および361
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。
配列番号2および配列番号3からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg定常重領域;
配列番号4および配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg定常軽領域;
配列番号1、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、334、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358および360からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg可変重領域;ならびに
配列番号111、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、216、220、224、272、276、300、292、280、288、296、284、304、308、312、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359および361からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg可変軽領域
を含む、ヒトDLL−4に結合することができる結合タンパク質を提供する。
CDR−H1:X1−X2−X3−X4−X5(配列番号105)、
(X1はS、NまたはDであり;
X2はHまたはYであり;
X3はWであり;
X4はMであり;
X5はSまたはHである。);
CDR−H2:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17(配列番号106)、
(X1はI、D、MまたはTであり;
X2はIであり;
X3はSであり;
X4はY、N、S、Q、V、T、HまたはDであり;
X5はDであり;
X6はGであり;
X7はS、R、I、T、G、K、HまたはNであり;
X8はN、Y、S、IまたはTであり;
X9はK、M、N、Q、E、T、R、S、AまたはLであり;
X10はY、DまたはEであり
X11はSまたはYであり;
X12はAであり;
X13はDであり;
X14はSであり;
X15はVであり;
X16はKであり;および
X17はGである。);
CDR−H3:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10(配列番号107)、
(X1はAであり;
X2はG、AまたはRであり;
X3はGであり;
X4はG、SまたはAであり;
X5はNであり;
X6はVまたはMであり;
X7はGであり;
X8はF、L、YまたはMであり;
X9はDであり;および
X10はI、SまたはLである。);
CDR−L1:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11(配列番号108)、
(X1はSであり;
X2はAまたはGであり;
X3はDであり;
X4はK、N、L、Q、M、E、S、T、GまたはDであり;
X5はLであり;
X6はGであり;
X7はT、S、N、A、GまたはEであり;
X8はK、Q、NまたはRであり;
X9はYであり;
X10はVまたはIであり;
X11はSである。);
CDR−L2:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7(配列番号109)、
(X1はQであり;
X2はDであり;
X3はA、G、W、SまたはDであり;
X4はK、M、Q、N、L、T、IまたはEであり;
X5はRであり;
X6はPであり;および
X7はSである。);
ならびに
CDR−L3:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9(配列番号110)、
(X1はQであり;
X2はSまたはAであり;
X3はWであり;
X4はDであり;
X5はR、S、Q、P、A、V、WまたはMであり;
X6はS、G、I、N、RまたはTであり;
X7はDまたはGであり;
X8はV、A、PまたはEであり;および
X9はVである。);
からなる群から選択される少なくとも1つまたは複数のCDRを含む、結合タンパク質に関する。
配列番号112の残基31−35番(CDR−H1);配列番号112の残基50−66番(CDR−H2);配列番号112の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号113の残基23−33番(CDR−L1);配列番号113の残基49−55番(CDR−L2);配列番号113の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号316の残基31−35番(CDR−H1);配列番号316の残基50−66番(CDR−H2);配列番号316の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号317の残基31−35番(CDR−H1);配列番号317の残基50−66番(CDR−H2);配列番号317の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号318の残基31−35番(CDR−H1);配列番号318の残基50−66番(CDR−H2);配列番号318の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号319の残基31−35番(CDR−H1);配列番号319の残基50−66番(CDR−H2);配列番号319の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号320の残基31−35番(CDR−H1);配列番号320の残基50−66番(CDR−H2);配列番号320の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号321の残基31−35番(CDR−H1);配列番号321の残基50−66番(CDR−H2);配列番号321の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号322の残基31−35番(CDR−H1);配列番号322の残基50−66番(CDR−H2);配列番号322の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号323の残基31−35番(CDR−H1);配列番号323の残基50−66番(CDR−H2);配列番号323の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号324の残基31−35番(CDR−H1);配列番号324の残基50−66番(CDR−H2);配列番号324の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号325の残基31−35番(CDR−H1);配列番号325の残基50−66番(CDR−H2);配列番号325の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号326の残基31−35番(CDR−H1);配列番号326の残基50−66番(CDR−H2);配列番号326の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号327の残基23−33番(CDR−L1);配列番号327の残基49−55番(CDR−L2);配列番号327の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号328の残基23−33番(CDR−L1);配列番号328の残基49−55番(CDR−L2);配列番号328の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号329の残基23−33番(CDR−L1);配列番号329の残基49−55番(CDR−L2);配列番号329の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号330の残基23−33番(CDR−L1);配列番号330の残基49−55番(CDR−L2);配列番号330の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号331の残基23−33番(CDR−L1);配列番号331の残基49−55番(CDR−L2);配列番号331の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号332の残基23−33番(CDR−L1);配列番号332の残基49−55番(CDR−L2);配列番号332の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号333の残基23−33番(CDR−L1);配列番号333の残基49−55番(CDR−L2);配列番号333の残基88−96番(CDR−L3)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含む。
VH A10 CDR組
CDR−H1:配列番号112の残基31−35番
CDR−H2:配列番号112の残基50−66番
CDR−H3:配列番号112の残基99−108番
VL A10 CDR組
CDR−L1:配列番号113の残基23−33番
CDR−L2:配列番号113の残基49−55番
CDR−L3:配列番号113の残基88−96番
VH A10.3 CDR組
CDR−H1:配列番号316の残基31−35番
CDR−H2:配列番号316の残基50−66番
CDR−H3:配列番号316の残基99−108番
VL A10.3 CDR組
CDR−L1:配列番号327の残基23−33番
CDR−L2:配列番号327の残基49−55番
CDR−L3:配列番号327の残基88−96番
VH A10.K30 CDR組
CDR−H1:配列番号317の残基31−35番
CDR−H2:配列番号317の残基50−66番
CDR−H3:配列番号317の残基99−108番
VH A10.K42 CDR組
CDR−H1:配列番号318の残基31−35番
CDR−H2:配列番号318の残基50−66番
CDR−H3:配列番号318の残基99−108番
VH A10.9A CDR組
CDR−H1:配列番号319の残基31−35番
CDR−H2:配列番号319の残基50−66番
CDR−H3:配列番号319の残基99−108番
VH A10.8A CDR組
CDR−H1:配列番号320の残基31−35番
CDR−H2:配列番号320の残基50−66番
CDR−H3:配列番号320の残基99−108番
VH A10.1A CDR組
CDR−H1:配列番号321の残基31−35番
CDR−H2:配列番号321の残基50−66番
CDR−H3:配列番号321の残基99−108番
VH A10.5D CDR組
CDR−H1:配列番号322の残基31−35番
CDR−H2:配列番号322の残基50−66番
CDR−H3:配列番号322の残基99−108番
VH A10.3A CDR組
CDR−H1:配列番号323の残基31−35番
CDR−H2:配列番号323の残基50−66番
CDR−H3:配列番号323の残基99−108番
VL A10.3A CDR組
CDR−L1:配列番号330の残基23−33番
CDR−L2:配列番号330の残基49−55番
CDR−L3:配列番号330の残基88−96番
VH A10.6B CDR組
CDR−H1:配列番号324の残基31−35番
CDR−H2:配列番号324の残基50−66番
CDR−H3:配列番号324の残基99−108番
VL A10.6B CDR組
CDR−L1:配列番号331の残基23−33番
CDR−L2:配列番号331の残基49−55番
CDR−L3:配列番号331の残基88−96番
VH A10.3D CDR組
CDR−H1:配列番号325の残基31−35番
CDR−H2:配列番号325の残基50−66番
CDR−H3:配列番号325の残基99−108番
VL A10.3D CDR組
CDR−L1:配列番号332の残基23−33番
CDR−L2:配列番号332の残基49−55番
CDR−L3:配列番号332の残基88−96番
VH A10.4C CDR組
CDR−H1:配列番号326の残基31−35番
CDR−H2:配列番号326の残基50−66番
CDR−H3:配列番号326の残基99−108番
VL A10.4C CDR組
CDR−L1:配列番号333の残基23−33番
CDR−L2:配列番号333の残基49−55番
CDR−L3:配列番号333の残基88−96番
VL A10.L45 CDR組
CDR−L1:配列番号328の残基23−33番
CDR−L2:配列番号328の残基49−55番
CDR−L3:配列番号328の残基88−96番
VL A10.L73 CDR組
CDR−L1:配列番号329の残基23−33番
CDR−L2:配列番号329の残基49−55番
CDR−L3:配列番号329の残基88−96番
別の実施形態では、結合タンパク質は、上の群における3つのCDRの任意のVH組から選択される3つのCDRの可変重鎖(VH)組および上の群における3つのCDRの任意のVL組から選択される3つのCDRの可変軽鎖(VL)組を含む。
VH A10 CDR組およびVL A10 CDR組;
VH A10.3 CDR組およびVL A10.3 CDR組:
VH A10.3A CDR組およびVL A10.3A組;
VH A10.6B CDR組およびVL A10.6B組;
VH A10.3D CDR組およびVL A10.3D CDR組;
VH A10.4C CDR組およびVL A10.4C CDR組;
VH A10.K30 CDR組およびVL A10.3 CDR組;
VH A10.K42 CDR組およびVL A10.3 CDR組;
VH A10.3 CDR組およびVL A10.L45 CDR組;
VH A10.3 CDR組およびVL A10.L73 CDR組;
VH A10.9A CDR組およびVL A10.3 CDR組;
VH A10.8A CDR組およびVL A10.3 CDR組;
VH A10.1A CDR組およびVL A10.3 CDR組;および
VH A10.5D CDR組およびVL A10.3 CDR組からなる可変ドメインCDR組の群から選択される少なくとも2つの可変ドメインCDR組を含む。
重鎖アクセプターフレームワーク配列、配列番号6−22
重鎖アクセプター配列、配列番号35−62
軽鎖アクセプター配列、配列番号23−34および
軽鎖アクセプター配列、配列番号63−98
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
CDRに隣接する残基;
グリコシル化部位残基;
希少残基;
ヒトDLL4と相互作用することができる残基;
カノニカル残基;
重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の接触残基;
バーニヤゾーン内の残基;および
コチア定義された可変重鎖CDR1とカバット定義された第一重鎖フレームワーク間で重複する領域における残基
からなる群から選択されるキーとなる残基に少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含むヒトアクセプターフレームワークを含む。好ましくは、前記キーとなる残基は、2H、4H、24H、26H、27H、29H、34H、35H、37H、39H、44H、45H、47H、48H、49H、50H、51H、58H、59H、60H、63H、67H、69H、71H、73H、76H、78H、91H、93H、94H、2L、4L、25L、29L、27bL、33L、34L、36L、38L、43L、44L、46L、47L、48L、49L、55L、58L、62L、71L、87L、89L、90L、91L、94L、95Lからなる群から選択される。
配列番号2および配列番号3からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg定常重領域;
配列番号4および配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg定常軽領域;
配列番号112、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325および326
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg可変重領域ならびに
配列番号113、327、328、329、330、331、332および333
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg可変軽領域
を含む、
ヒトDLL−4に結合することができる結合タンパク質を提供する。
別の実施形態は、上に開示される結晶化されたDLL4結合タンパク質、結晶化された抗体構築物または結晶化されたタンパク質コンジュゲート(抗体コンジュゲートを含む)を含む有効量の組成物を哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物を治療するための方法を提供する。
CDR−L1アミノ酸配列を同定する:
VL領域のアミノ末端からほぼ24アミノ酸残基で開始する;
CDR−L1配列の前の残基は常にシステイン(C)である;
CDR−L1配列の後の残基は常にトリプトファン(W)残基であり、典型的にはTrp−Tyr−Gln(W−Y−Q)であるが、Trp−Leu−Gln(W−L−Q)、Trp−Phe−Gln(W−F−Q)、およびTrp−Tyr−Leu(W−Y−L)もある;
長さは典型的には10から17アミノ酸残基である。
CDR−L2アミノ酸配列を同定する:
常にCDR−L1の末端の16残基後から開始する;
CDR−L2配列前の残基は一般にはIle−Tyr(I−Y)であるが、Val−Tyr(V−Y)、Ile−Lys(I−K)およびIle−Phe(I−F)もある;
長さは常に7アミノ酸残基である。
CDR−L3アミノ酸配列を同定する:
常にCDR−L2の末端の33アミノ酸後から開始する;
CDR−L3アミノ酸配列前の残基は常にシステイン(C)である;
後の残基は常に、Phe−Gly−X−Gly(F−G−X−G)(配列番号374)であり、Xは任意のアミノ酸である;
長さは典型的には7から11アミノ酸残基である。
CDR−H1アミノ酸配列を同定する:
VH領域のアミノ末端からほぼ31アミノ酸残基および常にシステイン(C)の9残基後から開始する;
前の残基は常にCys−X−X−X−X−X−X−X−X(配列番号375)であり、Xは任意のアミノ酸;
後の残基は常にTrp(W)、典型的にはTrp−Val(W−V)であるが、Trp−Ile(W−I)およびTrp−Ala(W−A)もある;
長さは典型的には5から7アミノ酸残基である。
CDR−H2アミノ酸配列を同定する:
常にCDR−H1の末端の15アミノ酸残基後から開始する;
前の残基は典型的にはLeu−Glu−Trp−Ile−Gly(L−E−W−I−G)(配列番号376)であるが、他の変動もある;
後の残基はLys/Arg−Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala−Thr/Ser/Ile/Ala(K/R−L/I/V/F/T/A−T/S/I/A)である;
長さは典型的には16から19アミノ酸残基である。
CDR−H3アミノ酸配列を同定する:
常にCDR−H2の末端の33アミノ酸残基後および常にシステイン(C)の3つ後から開始する;
前の残基は常にCys−X−X(C−X−X)であり、Xは任意のアミノ酸であり、典型的にはCys−Ala−Arg(C−A−R)である;
後の残基は常にTrp−Gly−X−Gly(W−G−X−G)(配列番号377)であり、Xは任意のアミノ酸である;
長さは典型的には3から25アミノ酸残基である。
抗体(「Ab」)+抗原(「Ag」)→Ab−Ag
Ab+Ag←Ab−Ag。
本発明の一態様は、高親和性で、遅い解離速度で、および/または高中和能力でDLL4に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体、またはこの抗原結合部分を提供する。有利には、DLL4に結合するこのようなヒト抗体またはこの抗原結合部分は、投与された治療DLL4結合タンパク質に対して患者の免疫系が最小の応答しかないまたはまったく応答しないヒト患者に投与することが可能なヒト治療薬として用途が見つかる。したがって、患者は反復投与の経過中このように完全にヒトDLL4結合タンパク質の恩恵を得ることができる。本発明の別の態様は、DLL4に結合するキメラ抗体およびDLL4に結合するCDR移植された抗体、またはこの抗原結合部分を提供する。好ましくは、前記抗体またはこの部分は単離された抗体である。好ましくは、本発明の抗体は、中和ヒト抗DLL4抗体である。
本発明の抗体は本技術分野で公知のいくつかの技法のうちのいずれかにより作製し得る。好ましい方法は、本明細書の実施例2に例示されているPROfusion mRNAディスプレイ技術である。別の方法は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の機能的相補体を坦持するトランスジェニックげっ歯類(例えば、トランスジェニックマウス)をヒトDDL4またはこの抗原部分を用いて免疫し、続いて標準ハイブリドーマ技術によりヒトDLL4に結合する完全なヒトモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを作製することである。このような方法により得られる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する。このような方法によれば、完全なヒトDLL4結合タンパク質が提供されて、モノクローナルDLL4抗体分子の非ヒト抗原性の供給源を減らすために他の方法であれば1回または複数回のヒト化を実施する必要性が取り除かれる。したがって、複数の種由来の材料を利用する技法はそれほど好ましくないが、使用し得る。
モノクローナル抗体は、ハイブリッドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術またはこれらの組合せの使用など、本分野で公知の多様な技術を用いて調製することが可能である。例えば、モノクローナル抗体は、本分野において公知であり、例えば、Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,second edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,1988);Hammerling,et al.,in:Monoclonal Antibodies and T−CeIl Hybridomas 563−681頁(Elsevier,N.Y.,1981)(前記参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。)に教示されているものなど、ハイブリッドーマ技術を用いて作製することが可能である。
本発明の別の態様では、組換え抗体は、米国特許第5,627,052号;PCT出願番号WO 92/02551;Babcook et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93:7843−7848頁(1996)に記載されているように、当技術分野で選択リンパ球抗体法(the selected lymphocyte antibody method(SLAM))と呼ばれる手法を使用して単一の単離されたリンパ球から作製される。この方法では、対象の抗体を分泌する単細胞、例えば、セクションI.A.1(上記)に記載されている免疫された動物のいずれか1つに由来するリンパ球は、抗原特異的溶血プラークアッセイを使用してスクリーニングされ、抗原DLL4、DLL4のサブユニットまたはその断片は、ビオチンなどのリンカーを使用してヒツジ赤血球に結合され、DLL4に対する特異性を有する抗体を分泌する単細胞を同定するのに使用される。対象の抗体分泌細胞の同定に続いて、重鎖および軽鎖可変領域cDNAは、逆転写酵素PCR(RT−PCR)により細胞から救出され、次にこれらの可変領域は、COSまたはCHO細胞などの哺乳動物宿主細胞において、適切な免疫グロブリン定常領域(例えば、ヒト定常領域)という状況で発現されることが可能である。増幅された免疫グロブリン配列で形質移入され、インビボで選択されたリンパ球に由来する宿主細胞は、次いで、例えば、DLL4に対する抗体を発現する細胞を単離するために、形質移入された細胞をパニングすることによって、インビトロで、さらに分析および選択を行うことが可能である。増幅された免疫グロブリン配列は、さらに、インビトロでのアフィニティー成熟方法によるなど、インビトロで操作することが可能である。例えば、PCT公開WO97/29131およびPCT公開WO00/56772を参照。
本発明の別の実施形態において、抗体は、DLL4抗原を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座のいくつかまたはすべてを含む非ヒト動物を免疫することによって産生される。好ましい実施形態において、非ヒト動物は、XENOMOUSE(登録商標)トランスジェニックマウス(ヒト免疫グロブリン遺伝子座の巨大断片を含み、マウス抗体産生を欠失している改変されたマウス系統)である。例えば、Green et al.Nature Genetics 7:13−21頁(1994)ならびに米国特許第5,916,771号;第5,939,598号;第5,985,615号;第5,998,209号;第6,075,181号;第6,091,001号;第6,114,598号および第6,130,364号を参照されたい。PCT公開WO91/10741;WO94/02602;WO96/34096;WO96/33735;WO98/16654;WO98/24893;WO98/50433;WO99/45031;WO99/53049;WO00/09560;およびWO00/37504も参照されたい。XENOMOUSE(登録商標)トランスジェニックマウスは、完全なヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を生成する。XENOMOUSE(登録商標)トランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座およびx軽鎖遺伝子座のメガ塩基サイズの生殖系列配置YAC断片の導入を通じて、ヒト抗体レパートリーの約80%を含有する。その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Mendez et al.,Nature Genetics,15:146−156頁(1997);Green and Jakobovits,J.Exp.Med.188:483−495頁(1998)を参照されたい。
本発明の抗体を作製するために、インビトロ法も使用することが可能であり、抗体ライブラリーは、所望のDLL4結合特異性を有する抗体を同定するためにスクリーニングされる。組換え抗体ライブラリーのこのようなスクリーニングの方法は、本分野において周知であり、例えば、米国特許第5,223,409号(Ladner et al.);PCT公開WO92/18619(Kang et al.);PCT公開WO91/17271(Dower et al.);PCT公開WO92/20791(Winter et al.);PCT公開WO92/15679(Markland et al.);PCT公開WO93/01288(Breitling et al.);PCT公開WO92/01047(McCafferty et al.);PCT公開WO92/09690(Garrard et al.);Fuchs et al.,Bio/Technology,9:1370−1372頁(1991);Hay et al.,Hum.Antibod.Hybridomas,3:81−85頁(1992);Huse et al.,Science,246:1275−1281頁(1989);McCafferty et al.,Nature,348:552−554頁(1990);Griffiths et al.,EMBO J.,12:725−734頁(1993);Hawkins et al.,J.Mol.Biol.,226:889−896頁(1992);Clackson et al.,Nature,352:624−628頁(1991);Gram et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576−3580頁(1992);Garrad et al.,Bio/Technology,9:1373−1377頁(1991);Hoogenboom et al.,Nuc.Acid Res.,19:4133−4137頁(1991);Barbas et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978−7982頁(1991);米国特許出願公開第2003/0186374号;およびPCT公開WO97/29131(これらは各々、その内容が参照により本明細書に組み込まれる。)に記載されている方法が含まれる。
本発明の抗体は、当技術分野で公知のいくつかの技法のうちのいずれによっても作製され得る。例えば、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター(複数可)が標準技法により宿主細胞にトランスフェクトされる、宿主細胞からの発現。「トランスフェクション」という用語の様々な形は、外来性DNAを原核または真核宿主細胞に導入するために一般に使用される多種多様な技法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAEデキストラントランスフェクションおよび同類のものを包含するものとする。本発明の抗体を原核宿主細胞でも真核宿主細胞でも発現させることは可能であるが、真核細胞における抗体の発現のほうが好ましく、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞においてである。なぜならば、このような真核細胞(および、特に哺乳動物細胞)は原核細胞よりも正確にフォールディングされ免疫学的に活性な抗体を組立て分泌する可能性が高いからである。
ヒトDLL4に結合する単離された完全なヒト抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、表4のクローンE9およびA10で示されている(下の実施例参照)。E9およびA10抗体の単離された抗DLL4抗体CDR配列は、本発明に従って単離され、E9およびこの親和性成熟クローン由来のまたはA10およびこの親和性成熟クローン由来のCDR配列を含むポリペプチドを含むDLL4結合タンパク質の2つの新規ファミリーを確立している。E9モノクローナル抗体およびこの親和性成熟誘導体の可変領域およびCDRは表4、8、14、18および19に列挙されている。A10モノクローナル抗体およびこの親和性成熟誘導体の可変領域およびCDRは表4、9および10に列挙されている。ヒトDLL4に関して好ましいDLL4結合および/または中和活性を有する本発明に従った結合タンパク質を作製し選択するために、本発明の結合タンパク質を作製しその結合タンパク質のDLL4結合および/または中和特徴を評価するための当技術分野で公知の、本明細書に具体的に記載されている方法を含むが、これらに限定されない標準法を使用し得る。
CDR−H1:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7(配列番号99)、
(X1はSまたはNであり;
X2はS、GまたはNであり;
X3はS、N、T、GまたはRであり;
X4はYであり;
X5はYまたはHであり;
X6はWであり;および
X7はGである。);
CDR−H2:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16(配列番号100)、
(X1はDであり;
X2はIであり;
X3はY、NまたはSであり;
X4はYであり;
X5はT、N、A、I、SまたはRであり;
X6はGであり;
X7はS、N、TまたはGであり;
X8はTであり;
X9はYであり;
X10はYであり
X11はNであり;
X12はPであり;
X13はSであり;
X14はLであり;
X15はKであり;および
X16はS、N、DまたはGである。);
CDR−H3:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11(配列番号101)、
(X1はE、Y、F、Q、W、LまたはAであり;
X2はD、A、S、G、V、EまたはNであり;
X3はV、M、L、PまたはAであり;
X4はI、A、P、R、S、K、Q、V、G、MまたはEであり;
X5はL、Y、FまたはMであり;
X6はR、G、S、QまたはAであり;
X7はGであり;
X8はG、AまたはSであり;
X9はS、A、L、V、RまたはGであり;
X10はDであり;および
X11はY、D、S、N、H、E、R、L、P、C、I、M、T、QまたはKである。);
CDR−L1:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11(配列番号102)、
(X1はSであり;
X2はGであり;
X3はQ、EまたはDであり;
X4はR、S、G、M、K、LまたはTであり;
X5はLであり;
X6はGであり;
X7はDまたはEであり;
X8はKであり;
X9はYであり;
X10はAまたはVであり;および
X11はSである。);
CDR−L2:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7(配列番号103)、
(X1はEまたはQであり;
X2はDであり;
X3はS、L、T、A、EまたはFであり;
X4はK、T、E、N、Q、SまたはMであり;
X5はRであり;
X6はPであり;および
X7はSである。);
ならびに
CDR−L3:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9(配列番号104)、
(X1はQであり;
X2はAであり;
X3はWであり;
X4はDであり;
X5はR、S、M、E、N、GまたはKであり;
X6はDまたはEであり;
X7はT、V、A、SまたはMであり;
X8はG、AまたはCであり;および
X9はVである。)
からなる群から選択される少なくとも1つまたは複数のCDRを含む。
CDR−H1:X1−X2−X3−X4−X5(配列番号105)、
(X1はS、NまたはDであり;
X2はHまたはYであり;
X3はWであり;
X4はMであり;および
X5はSまたはHである。);
CDR−H2:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17(配列番号106)、
(X1はI、D、MまたはTであり;
X2はIであり;
X3はSであり;
X4はY、N、S、Q、V、T、HまたはDであり;
X5はDであり;
X6はGであり;
X7はS、R、I、T、G、K、HまたはNであり;
X8はN、Y、S、IまたはTであり;
X9はK、M、N、Q、E、T、R、S、AまたはLであり;
X10はY、DまたはEであり
X11はSまたはYであり;
X12はAであり;
X13はDであり;
X14はSであり;
X15はVであり;
X16はKであり;および
X17はGである。);
CDR−H3:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10(配列番号107)、
(X1はAであり;
X2はG、AまたはRであり;
X3はGであり;
X4はG、SまたはAであり;
X5はNであり;
X6はVまたはMであり;
X7はGであり;
X8はF、L、YまたはMであり;
X9はDであり;および
X10はI、SまたはLである。);
CDR−L1:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11(配列番号108)、
(X1はSであり;
X2はAまたはGであり;
X3はDであり;
X4はK、N、L、Q、M、E、S、T、GまたはDであり;
X5はLであり;
X6はGであり;
X7はT、S、N、A、GまたはEであり;
X8はK、Q、NまたはRであり;
X9はYであり;
X10はVまたはIであり;および
X11はSである。);
CDR−L2:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7(配列番号109)、
(X1はQであり;
X2はDであり;
X3はA、G、W、SまたはDであり;
X4はK、M、Q、N、L、T、IまたはEであり;
X5はRであり;
X6はPであり;および
X7はSである。);
ならびに
CDR−L3:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9(配列番号110)、
(X1はQであり;
X2はSまたはAであり;
X3はWであり;
X4はDであり;
X5はR、S、Q、P、A、V、WまたはMであり;
X6はS、G、I、N、RまたはTであり;
X7はDまたはGであり;
X8はV、A、PまたはEであり;および
X9はVである。);
からなる群から選択される少なくとも1つまたは複数のCDRを含む、ヒトDLL4に結合することができる抗原結合ドメインを含むDLL4結合タンパク質を提供する。
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体などの抗体の異なる部分が異なる動物種由来である分子である。例えば、Morrison、Science、229:1202−1207頁(1985);Oi et al.、BioTechniques、4:214頁(1986);Gillies et al.,J.Immunol.Methods、125:191−202頁(1989);米国特許第5,807,715号、米国特許第4,816,567号、および米国特許第4,816,397号を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライスすることにより、「キメラ抗体」の作製のために開発された技法を使用することが可能である。例えば、Morrison et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:6851−6855頁(1984);Neuberger et al.、Nature、312:604−608頁(1984);Takeda et al.、Nature、314:452−454頁(1985)を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。
本発明の単離された抗DLL4抗体CDR配列を使用してCDR移植された抗体を作製し、元の抗体の特性を調節し得る。このような特性には、結合動態、親和性、生物学的活性、種交差反応性、分子交差反応性、エピトープ、物理化学的性質、薬物動態特性、薬物力学的性質または薬理学的性質が含まれるが、これらに限定されない。CDR移植された抗体は、VHおよび/またはVLのCDR領域のうちの1つまたは複数が元の抗DLL4抗体のCDR配列で置き換えられている、ヒト抗体または非ヒト霊長類抗体由来の重および軽鎖可変領域配列を含む。任意のヒトまたは非ヒト霊長類抗体由来のフレームワーク配列は、CDR移植のための鋳型としての役目を果たし得る。しかし、このようなフレームワーク上で直鎖置換を行うと、抗原に対する結合親和性をある程度消失することが多い。ヒトまたは他の種抗体が元のヒト抗体に対して相同であるほど、CDRと新しいヒトフレームワークまたは非ヒト霊長類フレームワークを組み合わせた場合に親和性または他の特性を減少するおそれのある歪みをCDRに導入する可能性はそれだけ少なくなる。したがって、CDRを除いてヒト可変領域フレームワークと置き換わるために選ばれる可変フレームワークは、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも30%配列同一性を有するのが好ましい。CDRを除いてヒト可変領域フレームワークと置き換わるために選ばれる可変フレームワークは、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも40%配列同一性を有するのがさらに好ましい。CDRを除いてヒト可変フレームワークと置き換わるために選ばれる可変領域フレームワークは、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも50%配列同一性を有するのがさらに好ましい。CDRを除いてヒト可変フレームワークと置き換わるために選ばれる可変領域フレームワークは、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも60%配列同一性を有するのがさらに好ましい。CDRを除いて新しいヒトまたは非ヒト霊長類および元のヒト可変領域フレームワークは、少なくとも70%配列同一性を有するのがさらに好ましい。CDRを除いて新しいヒトまたは非ヒト霊長類および元のヒト可変領域フレームは、少なくとも75%配列同一性を有するのがさらに好ましい。CDRを除いて新しいヒトまたは非ヒト霊長類および元のヒト可変領域フレームワークは、少なくとも80%配列同一性を有するのが最も好ましい。元のヒト抗DLL4抗体のCDRを移植するために高度に相同なヒトまたは非ヒト霊長類フレームワークを使用しても、それでも得られた移植された抗体が抗原に対する結合親和性をある程度失う場合がある。このような場合、親和性を回復するためには、新たに移植された抗体の対応する位置に元の抗体の少なくとも1つまたは複数のキーフレームワーク残基(複数可)置換を含む必要がある。このようなキーとなる残基は、
CDRに隣接する残基;
グリコシル化部位残基;
希少残基;
ヒトDLL4と相互作用することができる残基;
カノニカル残基;
重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の接触残基;
バーニヤゾーン内の残基;および
コチア定義された可変重鎖CDR1とカバット定義された第一重鎖フレームワーク間で重複する領域の残基
からなる群から選択し得る。
本発明の組成物はヒト化抗体を作製する必要性を取り除くが、ヒト化DLL4抗体は本発明の組成物を使用して調製し得る。ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子である。公知のヒトIg配列は、ワールドワイドウェブ(www.)を介して利用できるウェブサイト、例えば:ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;atcc.org/phage/hdb.html;sciquest.com/;abcam.com/;antibodyresource.com/onlinecomp.html;public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html;mgen.uni−heidelberg.de/SD/IT/IT.html;whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm;library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html;hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/;path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html;antibodyresource.com/;mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html;immunologylink.com/;pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html;biotech.ufl.edu/.about.hcl/;pebio.com/pa/340913/340913.html;nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/;m.ehimeu.acjp/.about.yasuhito−/Elisa.html;biodesign.com/table.asp;icnet.uk/axp/facs/davies/lin−ks.html;biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html;isac−net.org/sites_geo.html;aximtl.imt.uni−marburg.de/.about.rek/AEP−Start.html;baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html;recab.uni−hd.de/immuno.bme.nwu.edu/;mrc−cpe.cam.ac.uk/imt−doc/pu−blic/INTRO.html;ibt.unam.mx/vir/V_mice.html;imgt.cnusc.fr:8104/;biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html;antibody.bath.ac.uk/;abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html;unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/Slide01.html;cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/;nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm;path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html;ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;biosci.missouri.edu/smithgp/index.html;cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Web−pages/Pept/spottech.html;jerini.de/fr roducts.htm;patents.ibm.com/ibna.html;Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)(各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。)に開示されている。このような導入された配列は、免疫原性を低下させるために、または結合、親和性、結合速度、解離速度、結合力、特異性、半減期もしくは本分野で公知の他のいずれかの適切な特性を減少、増強もしくは修飾するために使用することが可能である。
好ましくは、本発明の抗DLL4抗体は、例えば、本技術分野で公知のいくつかのインビボおよびインビトロアッセイのうちのいずれか1つにより評価される、腫瘍血管新生活性を減らすまたは中和する高い能力を示す。DLL4活性の中和を評価することは、本技術分野で公知のいくつかのインビトロおよびインビボアッセイを介して評価することが可能である。DLL4活性の中和を評価するための例となるパラメータには、Notch受容体とのDLL4相互作用および/または約少なくとも10−6M;少なくとも10−7M;または少なくとも10−8のIC50値でNotchシグナル伝達経路を阻害する抗体が含まれるが、これらに限定されない。
本発明に記載されているDLL4抗体およびその抗体部分を含むDLL4結合タンパク質は、ヒトDLL4およびマウスDLL4に結合することができるので、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)または組織免疫組織化学など当技術分野で知られている慣用のイムノアッセイのいずれかを用いて、試料中(例えば、血液、血清または血漿などの混合物、溶液または生物学的試料中で)のDLL4を検出または測定するために使用することが可能である。本発明は、試料をDLL4結合タンパク質に接触させ、ヒトDLL4および/もしくはマウスDLL4に結合しているDLL4結合タンパク質または非結合結合タンパク質のどちらかを検出して、それにより試料中のヒトDLL4および/またはマウスDLL4を検出することを含む、試料中のヒトDLL4および/またはマウスDLL4を検出するための方法を提供する。本明細書に記載されているDLL4結合タンパク質は、結合したまたは結合していないDLL4結合タンパク質の検出を促進するために、検出可能な物質で直接または間接的に標識され得る。適切な検出可能な物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれる。適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが含まれる。発光物質の例には、ルミノールが含まれる;および適切な放射性材料の例には、3H、14C、 35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Hoまたは153Smが含まれる。
本発明は、本発明のDLL4結合タンパク質および医薬として許容される担体を含む医薬組成物も提供する。本発明のDLL4結合タンパク質を含む医薬組成物は、疾患を診断し、検出し、もしくはモニタリングし、疾患または1つもしくはそれ以上のその症候を予防し、治療し、管理し、もしくは軽減する上で、および/または研究において使用されるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、組成物は、1つまたは複数の本発明のDLL4結合タンパク質を含む。別の実施形態において、医薬組成物は、1つまたは複数の本発明の結合タンパク質、およびDLL4および/またはDLL4活性が有害である疾患を治療するための、本発明の結合タンパク質以外の1つまたは複数の予防または治療剤を含む。好ましくは、予防剤または治療剤は、癌または腫瘍などの疾患または1つもしくはそれ以上のその症候の予防、治療、管理または軽減に有用であることが知られており、または疾患または1つもしくはそれ以上のその症候の予防、治療、管理または軽減においてこれまで使用されており、もしくは現在使用されている。これらの実施形態に従えば、組成物は、担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。
DLL4抗体の機能的活性を判定するのに使用されるインビトロアッセイ
実施例1.1:BIACORE(登録商標)表面プラズモン共鳴技術を使用する親和性決定
BIACORE(登録商標)表面プラズモン共鳴アッセイ(Biacore、Inc.、Piscataway、New Jersey、US)は、結合速度および解離速度定数の動態測定値を用いて抗体の親和性を決定する。精製された組換えDLL4細胞外ドメインへのDLL4抗体の結合は、25℃でランニングバッファーHBS−EPB(10mM HEPES[pH7.4]、150mM NaCl、3mM EDTA、0.1mg/ml BSAおよび0.005%界面活性剤P20)を使用してBiacore(登録商標)装置(Biacore 2000、Biacore 3000、またはBiacore T100のいずれか;GE Healthcare、Piscataway、New Jersey、US)を用いた表面プラズモン共鳴を基礎とする測定により決定される。例えば、10mM酢酸ナトリウム(pH4.5)中に希釈されたほぼ9000 RUのヤギ抗ヒトFc特異的ポリクローナル抗体(Thermo Fisher Scientific Inc.、Rockford、Illinois、US)は、製造業者の使用説明書および手順に従って標準アミンカップリングキットを25μg/mlで使用して、CM5研究等級のバイオセンサーチップ全体に直接固定化された。バイオセンサー表面上の未反応部分はエタノールアミンを用いてブロックされる。動態解析では、1対1ラングミュア結合モデルから導き出される反応速度式は、Scrubber2(BioLogic Software)、Biacore Biaevaluation 4.0.1ソフトウェアまたはBiacore T100 Evaluationソフトウェアを使用して複数の抗原注入物に同時にフィットされる(グローバルフィット解析を使用して)。精製された抗体は、ヤギ抗ヒトFc反応表面にわたる捕捉のためにランニングバッファーに希釈される。リガンドとして捕捉される抗体(1μg/ml)は10μl/分の流速で反応マトリックス全体に注入される。前記アッセイ中、すべての測定値は捕捉表面単独(すなわち、捕捉された抗DLL4抗体なしで)に対して照合された。会合および解離速度定数、Kon(M−1s−1)およびKoff(s−1)は80μl/分の連続流速下で決定される。速度定数は、3倍連続希釈として、1.23−900nMの範囲の異なる抗原濃度で、緩衝液のみの注入物を含んで(二重照合のために使用される)動態結合測定を行うことにより導かれる。次に、抗体と標的抗原間の反応の平衡解離定数KD(M)は、以下の式:KD=Koff/Konにより速度論的速度定数から計算される。結合は時間の関数として記録され、速度論的速度定数が計算される。このアッセイでは、106M−1s−1もある結合速度およびわずか10−6s−1の解離速度を測定することが可能である。
方法1(捕捉ELISA)
96ウェルNunc−Immunoプレート(#439454)をD−PBS(Gibco#14190)中ヒトIgGに対する5μg/ml抗体(Fcg断片特異的、Jackson ImmunoResearch、#109−005−098、100μl/ウェル)を用いて被膜し、4℃で一晩インキュベートした。ELISAプレートは洗浄緩衝液(PBS、0.05%Tween−20)で3回洗浄し、次に25℃で1時間、200ml/ウェル ブロッキング緩衝液(D−PBS、1%BSA、1mM CaCl2、0.05%Tween−20)を用いてブロックした。プレートは3回洗浄され、25℃で1時間、100μl/ウェルDLL4抗体(0.0001−100nM、ブロッキング緩衝液中10倍連続希釈)と一緒にインキュベートされ、その後再び3回洗浄された。捕捉されたDLL4抗体を含有するプレートは25℃で1時間、ビオチン標識されたヒトDLL4細胞外ドメイン(ブロッキング緩衝液中10nM、100μl/ウェル)と一緒にインキュベートされ、3回洗浄され、25℃で1時間、HRPをコンジュゲートされたストレプトアビジン(KPL#474−3000、ブロッキング緩衝液中1対10000希釈、100μl/ウェル)と一緒にインキュベートされた。最終洗浄後、プレートは100μl/ウェルELISA基質(1−Step Ultra TMB−ELISA、Pierce#340280)と一緒にインキュベートされた。反応は25℃で2分後、100μl/ウェル 2N H2SO4を用いて停止され、吸光度は450nmで読み取られた。データはGraphpad Prismソフトウェアを使用して解析され、EC50値が報告された。
96ウェル銅被膜プレート(Thermo Scientific #15143)は使用前に洗浄緩衝液(PBS、0.05%Tween−20)を用いて3回洗浄され、次に25℃で1時間、PBS中1μl/mlのヒトDLL4−hisまたはマウスDLL4−hisまたはcynoDLL4−hisの100μl/ウェルと一緒に攪拌しながらインキュベートされた。次にプレートは3回洗浄された。次に、100μl/ウェルの組換えラット/ヒトキメラまたは組換えヒト抗DLL4抗体は、25℃で1時間、攪拌しながらプレートに添加され(0.00164−27nM、ELISA緩衝液=PBST中4倍連続希釈、10%Superblock(Pierce#37515))その後再び3回洗浄された。プレートは、25℃で1時間、攪拌しながらヤギ抗ヒトHRP(Pierce#31412)(ELISA緩衝液中1対40000希釈、100μl/ウェル)と一緒にインキュベートされ、その後3回洗浄された。最終洗浄後、プレートは100μl/ウェルELISA基質(Sigma#T8665)と一緒にインキュベートされた。反応は25℃で8分後、100μl/ウェル 1N HClを用いて停止され、吸光度は450nmで読み取られた。データはGraphpad Prismソフトウェアを使用して解析され、EC50値が報告された。
細胞表面DLL4を過剰発現している安定した細胞系統は、組織培養フラスコから収穫され、4回洗浄され、1%ウシ血清アルブミンおよび1mM CaCl2(FACS緩衝液)を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁された。1.5×105細胞は、氷上で60分間、FACS緩衝液中様々な濃度の抗体と一緒にインキュベートされた。細胞は2回洗浄され、50μLのR−フィコエリトリンコンジュゲートされた抗ラットIgG、F(ab’)2断片(FACS緩衝液中1対200希釈)(Jackson ImmunoResearch、West Grove、Pennsylvania、US、カタログ番号112−116−072)が添加された。氷上でのインキュベーション(4℃、60分)に続いて、細胞は3回洗浄され、FACS緩衝液中に再懸濁された。蛍光は、Becton Dickinson FACSCalibur−HTS(Becton Dickinson、San Jose、California、US)を使用して測定された。データはGraphpad Prismソフトウェアを使用して解析され、EC50値は、DLL4発現細胞に結合する最大DLL4抗体の50%に到達するための抗体の濃度として報告された。
96ウェルNunc−Immunoプレート(huDLL4 ELISAでは#439454)および96ウェルCostarプレート(muDLL4 ELISAでは#9018)は16nMヒトNotch−1(R&D Systems #3647−TK、D−PBS中100μl/ウェル)を用いて被膜され、4℃で一晩インキュベートされた。次に、プレートは洗浄緩衝液(PBS、0.05% Tween−20)を用いて3回洗浄され、25℃で1時間、200μl/ウェル ブロッキング緩衝液(D−PBS、1%BSA、1mM CaCl2、0.05% Tween−20))でブロックされた。ブロッキング中、ビオチン標識されたヒトDLL4細胞外ドメイン(14nM)は25℃で1時間、抗体(30pM−66nM、ブロッキング緩衝液中3倍連続希釈)と攪拌しながら混合された。アッセイプレートはブロッキング後洗浄され、DLL4/抗体混合物と一緒にインキュベートされた(100μl/ウェル、攪拌しながら25℃で1時間)。プレートは再び洗浄され、HRPをコンジュゲートされたストレプトアビジン(Fitzgerald#65R−S104PHRPx、ブロッキング緩衝液中1対5000に希釈される)100μl/ウェルは25℃で1時間攪拌しながら添加された。最終洗浄後、プレートは100μl/ウェル基質(TMB Sigma#8665)を使用して展開され、反応は、25℃での8分間インキュベーション後(muDLL4 ELISAでは)および25℃での20分間インキュベーション後(huDLL4 ELISAでは)100μl/ウェル 1N HClを使用して停止され、吸光度は450nmで読み取られた。データはGraphpad Prismソフトウェアを使用して解析され、IC50値は、Notch1に結合しているDLL4の50%減少を達成するための抗体の濃度として報告された。
Notchブロッキングアッセイ:簡潔に述べると、細胞表面DLL4を過剰発現している安定した細胞系統は、組織培養フラスコから収穫され、1%ウシ血清アルブミンおよび1mM CaCl2を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(FACS緩衝液)に再懸濁された。HEK293−hDLL4またはHEK293−mDLL4細胞は、FACS緩衝液中1.5×105細胞/ウェルで96ウェルプレート(v形底)に分注された。細胞を遠心沈降させ上清を破棄した後、適切に希釈された50μLの精製されたIgGは各ウェルに添加され、氷上4℃で60分間インキュベートされ、続いてhDLL4−293Gでは0.2μg/mLのNotch−ビオチンを50μl/ウェル、またはmDLL4−293Gでは2.0μl/mLのNotch−ビオチンを50μl/ウェル(最終で1.0または0.1μg/mL)添加し、氷上4℃でさらに1時間インキュベートされた。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄後、50μLのR−フィコエリトリンコンジュゲートされたストレプトアビジン(FACS緩衝液中1対150希釈)(Jackson ImmunoResearch、West Grove、Pennsylvania、US、カタログ番号016−110−084)が添加された。氷上でのインキュベーション(4℃、60分)に続いて、細胞は3回洗浄され、FACS緩衝液に再懸濁された。蛍光は、Becton Dickinson FACSCalibur−HTS(Becton Dickinson、San Jose、CA)を使用して測定された。データはGraphpad Prismソフトウェアを使用して解析され、IC50値は、DLL4発現細胞に結合しているNotchの50%減少に到達するための抗体の濃度として報告された。
組織培養プレート、96ウェル、はD−PBS(Gibco#14190)中1.67mg/mlのヒトDLL4細胞外ドメインの100μl/ウェルで被膜され、4℃で一晩インキュベートされた。プレートはD−PBSを用いて1回洗浄され、4000EA.hy926細胞/ウェルは抗体の非存在下または存在下で播種された。細胞増殖は、CyQUANT細胞増殖アッセイキット(Invitrogen、#C35007)を使用して4日後に測定された。条件培地におけるsVEGFR1発現は、製造業者(R&D Systems#DVR100B)の推奨を通じてELISAキットにより検出された。sVEGFR1のレベルは、細胞増殖の違いを説明するために、CyQUANTアッセイにより決定されるRFUに正規化された。
96ウェル黒色クリア底組織培養プレートは、Notch応答性プロモーターにより推進されるルシフェラーゼを発現する操作されたEA.hy926細胞を7000細胞/ウェルで一晩播種された。200nMから連続希釈された抗体は、完全長DLL4を発現する5000HEK293G細胞/ウェルの等量と15分間混合された。293G/DLL4細胞は、試験抗体の存在下で24時間EA.hy926Notchレポーター細胞と同時培養された。ルシフェラーゼ活性は、Promega’s基質(Promega#E2940)により解析された。
PEG沈降法
体積排除の原理に従って固体タンパク質の相分離を誘導するためのPEGの使用は、タンパク質の可溶性を評価する実行可能なアプローチを表す。PEGは、他の沈殿剤よりも、外気温でのタンパク質の最小変性(タンパク質の三次構造に影響を及ぼさない)および4℃から30℃の範囲内では温度管理を必要としない、すなわち実験台の外気温で沈殿実験を実施することが可能であることを含むいくつかの利点を有する。
タンパク質が溶液から沈殿するのが観察されるまで、またはフィルターユニット内でタンパク質を濃縮させることが可能な最小容積に到達するまで溶液中のタンパク質を濃縮させるAmicon遠心濾過器を使用することにより、真正溶解度は決定される。後者では、15mL Amicon遠心濾過器はほぼ50μlの最小容積を有し、4mL Amicon遠心濾過器はほぼ15μlの最小容積を有している。
近UV−CDスペクトル測定は、タンパク質の三次構造について重要な情報を与え、この点に関して最もよく使用されている技法の1つである。CDは、平面偏光放射の左と右の円偏光成分の示差吸光を表す。タンパク質では、近UVCD領域(250−320nm)における発色団は、芳香族アミノ酸、すなわち、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンならびにジスルフィド結合であり、CD効果は発色団が非対称(埋め込み)環境に存在するときに生じる。250−270nmの領域中のシグナルはフェニルアラニン残基に起因し、270−290nmからのシグナルはチロシンに起因し、280−300nmからのシグナルはトリプトファンに起因する。ジスルフィド結合は近UVスペクトル全体に広く弱いシグナルを生じる。近UV−CDスペクトルは、タンパク質間相互作用および/または製剤条件の変化に起因する変化などの三次構造の小さな変化に敏感であり得る。
抗体の熱安定性は、DSC装置を使用して評価された。使用されたDSC装置は、キャピラリーセルを備えた自動VP−DSC機器(Microcal、GE Healthcare Ltd./Microcal、Buckinghamshire、UK)であった。分子のアンフォールディングは、1mg/mLの試料について25℃−95℃の温度範囲にわたり1℃/分スキャン速度を適用して調べられた。用いられた追加の測定パラメータは16秒のフィティング期間、10分のプレスキャンの待機時間であり、測定は非フィードバックモードで実施された。個々の測定につき、下で提供されるプレートフィルスキームを用いて420μLの試料/ブランクがDSC測定試料ホルダーに充填された。得られた温度記録図は、中間温度および異なる遷移のエンタルピーを得るために非二状態モデルにフィットされた。
サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、サイズに基づいてタンパク質を分離した。タンパク質は水系移動相におよびカラムに充填されている多孔性固定相樹脂を通して保持されている。カラム中の保持時間は、タンパク質の水力学的サイズと充填された樹脂床中の孔のサイズの関数である。分子が小さいほど、樹脂内のより小さな孔を貫通することが可能であり、大きな分子よりも長く保持される。カラムから溶出すると、タンパク質はUV吸光度により検出される。前記SEC法は、TSKゲルガード(TOSOH Biosciences、Montgomeryville、Pennsylvania、US、カタログ番号08543)およびTSKゲルG3000SW×L(TOSOH Biosciences、Montgomeryville、Pennsylvania、US、カタログ番号08541)を使用した。移動相は、100mM Na2HPO4、200mM Na2SO4、pH6.8であった。流速は0.25mL/分であった。注入量は20μLの1mg/mL試料であった。カラム温度は室温であった。自動回収装置温度は2−8℃であった。全実行時間は55分であった。検出は、214nm波長のUV吸光度に基づいており、バンド幅は8nmに設定され、バンド幅100nmの360nm基準波長を使用した。
所望の製剤(複数可)中1mg/mlの抗体溶液は、少なくとも4時間、−80℃で凍結され、次に水浴中30℃で融解される。その後、前記溶液は−80℃で再凍結される。これを5サイクル繰り返す。特定の凍結融解サイクル、例えば、2回目および4回目後、前記溶液の一部は、再凍結前にSECによる分析のために回収され得る。凍結融解安定性試験は、変性させる氷−水界面へのタンパク質分子のより大きな曝露に起因する「悪化ケースのシナリオ」を得るために低いタンパク質濃度で実行される。濃度が高くなると、それに比例してタンパク質が氷−水界面に遭遇するのが少なくなり、代わりに他のタンパク質分子と相互作用する。
所望の製剤(複数可)中1mg/mlの抗体溶液は、無菌条件下で0.22μmPVDFフィルターを通され、少なくとも21日間40℃および/または50℃でインキュベートされる。7日目および21日目に、無菌条件下でアリコットは回収されSECによる分析に供される。次に、溶液はインキュベーションに戻される。
PROfusion mRNAディスプレイ技術による抗DLL4ヒトモノクローナル抗体E9およびA10の作製および単離
PROfusion mRNAディスプレイ技術(Chung−Ming Hsieh et al.、米国特許出願公開第2010/0099103号参照)を使用して、プールされたヒト脾臓およびリンパ節抗体ライブラリーはDLL4抗原に対して7ラウンドで選択された:100nMビオチン標識されたヒトDLL4細胞外ドメイン(ラウンド1および2)、50nMビオチン標識されたヒトDLL4細胞外ドメインと50nMビオチン標識されたマウスDLL4細胞外ドメインの混合物(ラウンド3)、100nMビオチン標識されたヒトDLL4細胞外ドメイン(ラウンド4および5)、ヒトDLL4を安定的に発現している293G細胞と100nMビオチン標識されたヒトDLL4細胞外ドメイン(ラウンド6)、ヒトおよびマウスDLL4を安定的に発現しているBAF3細胞(ラウンド7)。A10もE9も抗体ライブラリーのラウンド7選択から同定された(表4)。野生型ヒトIgG1に構築された場合、前記抗体はそれぞれA10.1およびE9.1と新たに命名される。
PROfusion抗体E9およびA10のインビトロ特徴付け
E9およびA10のDLL4抗原結合親和性は、実施例1.1に記載されたBIACORE技術により決定された。下の表5に示されるように、E9およびA10はヒトDLL4(それぞれ3.36および6.68nMのKD)ならびにカニクイザルDLL4(それぞれ4.2および7.8nMのKD)に対して類似の平衡解離定数値を有する。E9はマウスおよびラットDLL4とも交差反応する(それぞれ16および15nMのKD)。
PROfusion抗体E9およびA10の親和性成熟
抗DLL4 E9親和性成熟
配列比較により、DLL4抗体E9はヒト生殖系列VH4−39/JH4およびV2−1/JL6に対する最も高い同一性を共有することが示された。DLL4に対するE9の親和性を改善するために、高変異したCDR残基は、生殖系列VH4−39およびV2−1に対する高い同一性も共有するIgBLASTデータベースにおける他のヒト抗体配列から同定された。次に、対応するE9 CDR残基は、親和性成熟法の使用に適したscFvフォーマットにおいて3つの抗体ライブラリーを作製するために、これらの位置に低縮重度を有するプライマーを用いてPCRにより制限変異誘発に供された。第一のライブラリーはVH CDR1および2における残基30、31、32、33、50、54、56および65(カバット付番)に変異を含有し、第二のライブラリーはVH CDR3における残基95から100、100a、100b、100cおよび102に変異を含有し、第三のライブラリーは3つのVL CDRにおける残基27、30、31、33、52、53、93から96に変異を含有した。ヒト生殖系列フレームワーク配列に対するE9の同一性をさらに増加するために、VL位置103のArgはLysに変異され、VL位置80(A/P)および100(S/Y)でのバイナリー縮重も第三のライブラリーに導入された(表7)。
上記のE9親和性成熟に類似する方法で、配列比較により、DLL4抗体A10はヒト生殖系列VH3−30およびV2−1に対して最も高い同一性を共有していることが示された。それぞれVH3−30およびV2−1由来のヒトVHおよびVλ配列は、NCBI IgBlastデータベースからダウンロードされ、配列ロゴを作製した。これらの配列ロゴを使用して、親和性成熟ライブラリーを作製するためにどの位置がドープされることになるかを決定した。
CDR移植されたE9抗体の構築
E9 VHのCDRはVH3コンセンサスフレームワーク上に移植され(移植されたVH=E9vh3g2)、E9 VLのCDRは、抗DLL4 A10抗体のVL2−1フレームワーク上に(移植されたVL=E9a10vlg2)およびA10生殖系列(E9 VLとの相同性において最も近い生殖系列)のVKフレームワーク上に(移植されたVL=E9AVK)移植された。代わりに、フレームワーク(FW)修復もE9 VHを用いて実施された。すなわち、そのFWは維持されたが、抗体不安定性を引き起こし得るアミノ酸は取り換えられた(修復されたVH=E9VH4r2)。フレームワーク逆変異は、抗体構造および機能性を維持するためにCDR移植とFW修復の両方に組み込まれた(表11および表14)。
親和性成熟抗体E9−71の追加の操作
E9−71(M)およびE9−71(L)
親和性成熟抗DLL4抗体E9−71の重鎖と軽鎖両方がさらに操作された。E9−71重鎖のCDR−H3中のメチオニン(M)は、変異ヌクレオチドを含有するフォワードおよびリバースオーバーラッププライマーを設計することによりロイシン(L)に変異された。変異ヌクレオチドを坦持する2つのプライマーおよび受け入れるベクターに相補的な重複配列を含有する2つの最外側プライマーを使用して全可変領域遺伝子を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が二連続ステップで実施された。
E9−71(M)シグナルペプチド操作
シグナルペプチドラムダ1aは、抗DLL4抗体E9−71(M)の作製のために使用された。代わりのシグナルペプチドも調べられた。インターネット上で利用することが可能なSignal IP3.0サーバー(例えば、worldwide website cbs.dtu.dk/services/SignalP/)または他の数多くの等価なソフトウェアを使用する、ラムダおよびカッパシグナルペプチドファミリー由来の異なるシグナルペプチドを有するE9−71(M)N−末端可変領域のインシリコ構築アミノ酸配列の哺乳動物発現中の正確な抗体切断の割合の予想は本技術分野では公知である。正確な切断の最も高い予想割合を有するシグナルペプチドは、各ファミリーから1つ、すなわち、ラムダファミリーからはラムダ3pが、カッパファミリーからはL23が選択された。2つのアミノ酸変化(グリシンからアルギニンおよびセリンからバリン)を有する元のラムダ1aシグナルペプチドの変異型も選択された。ラムダ1aシグナルペプチドを含有する軽鎖の構築では、受け取りベクターに相補的な重複配列を含有し、そのうちの1つが変異ヌクレオチド配列を含有する2つの最外側プライマーを使用して全可変領域遺伝子を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は一ステップで実施された。ラムダ3pシグナルペプチドおよびカッパL23シグナルペプチドを含有する軽鎖の構築では、シグナルペプチド領域を構築するために2つの重複プライマーが設計され、次に、受け取りベクターに相補的な重複配列を含有する2つの最外側プライマーを使用して全可変領域遺伝子を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が実施された。E9−71可変領域の2つの型は、ラムダ3pおよびカッパL23シグナルペプチドを使用して作製され、1つは完全長可変領域を有し、もう1つは可変領域N末端の最初のセリン(S)が消失していた。完全長可変領域のみがラムダ1aシグナルペプチドを用いて作製された。各cDNAアセンブリー由来のPCR産物はアガロースゲル上で分離され、予想される可変領域cDNAに対応するバンドはサイズ切除され、精製された。可変重領域は、細菌中の相同組換えにより、2つのヒンジ領域アミノ酸変異を含有するヒトIgG1定常領域をコードするcDNA断片上にインフレームで挿入された。これらの変異は位置234(EU付番)でのロイシンからアラニンへの変化および位置235でのロイシンからアラニンへの変化である(Lund et al.、J.Immunol.、147:2657頁(1991))。可変軽鎖領域は、相同組換えにより、ヒトラムダ定常領域と一緒にインフレームで挿入された。細菌コロニーが単離され、プラスミドDNAが抽出され、cDNAインサートはその全体を塩基配列決定された。各抗体に対応する正確な重および軽鎖はHEK−293−6E細胞に同時トランスフェクトされ、完全長E9−71(M)抗ヒトDLL4抗体を一時的に産生した。組換えヒト抗体を含有する細胞上清は、プロテインAセファロースクロマトグラフィーにより精製され、結合した抗体は酸緩衝液の添加により溶出された。抗体はPBS中に透析された。精製されたE9.71(M)抗体は、無傷の抗体配列の確認のためにマススペクトル法(MS)により解析された。下の表20は、E9.71(M)の作製のために使用された異なるシグナルペプチドのアミノ酸配列を示している。下の表21は、マススペクトル法により解析されたE9.71(M)切断部位を示している。
操作されたPROfusion抗体のインビトロ特徴付け
これら操作されたPROfusion抗体の抗原結合親和性は、実施例1.1に記載されたBIACORE技術により決定され、表22に示されている。代表的な抗体のインビトロ活性は、実施例1に記載された他の方法を使用してさらに評価され、結果は表23に示された。
選択されたPROfusion抗体の物理化学的特性
DLL4に特異的なモノクローナル抗体の同一性は下記のようにマススペクトル法により判定された。
軽鎖および重鎖分子量解析:E9−71試料はMilli−Q水を用いて1mg/mLまで希釈された。1μLの1M DTTが20μLの希釈試料に添加された。前記試料は37℃で30分間インキュベートされた。1μLの還元された試料は、Varianジフェニルカラムを用いてAgilent 6510Q−TOF LC/MSシステムに注入された。緩衝液Aは、水中0.02%トリフルオロ酢酸(TFA)、0.08%ギ酸(FA)であった。緩衝液Bは、アセトニトリル中0.02%TFA、0.08%FAであった。勾配は5%Bで開始し、5分間で35%Bまで増加し、15分で38%Bまで増加した。次に、勾配は1分間で95%Bまで増加し、95%Bで4分間とどまり、1分間で5%Bまで減少した。流速は50μL/分であった。マススペクトル器は5キロボルトスプレー電圧で作動され、スキャン範囲は、電荷比に合わせて600から3200質量までであった。22649ダルトンの軽鎖分子量は、アミノ酸YがN末端である理論値によく適合していた。分子量22014ダルトン、22737ダルトンおよび22937ダルトンで3つの小ピークが観測された。22014ダルトンのピークは、N末端6アミノ酸断片と一致していた。マススペクトル器の「フラグメンター値」を下げると、このピークは消滅することができるので、このピークは、ほぼ確実に完全長軽鎖からのインソースフラグメンテーションにより引き起こされた。前記22737ダルトンは、アミノ酸SがN末端である理論値と一致していた。前記22937ダルトンはN末端にアミノ酸「LS」のシグナルペプチド伸長のある軽鎖と一致していた。重鎖分子量は理論値とよく適合していた。観測された分子量は、50263ダルトン、50426ダルトンおよび50588ダルトンであり、162ダルトンに相当する差はグリコシル化が異なる結果であった。
「E9−71のマススペクトル解析」に記載されるのと同じ方法を使用して、E9−71(M)試料を解析した。22645ダルトンの軽鎖分子量は、アミノ酸SがN末端である理論値とよく適合した。分子量22989ダルトンの小ピークが観測され、N末端にアミノ酸「SWA」のシグナルペプチド伸長を有する軽鎖と一致していた。分子量21923ダルトンの非常に小さなピークも観測されたが、マススペクトル器の「フラグメンター値」を下げると、このピークは消滅したので、このピークはインソースフラグメンテーションにより引き起こされた可能性が高かった。重鎖分子量は理論値とよく適合していた。観測された分子量は、50263ダルトン、50426ダルトンおよび50588ダルトンであり、162ダルトンに相当する差はグリコシル化が異なる結果であった。
「E9−71のマススペクトル解析」に記載されるのと同じ方法を使用して、E9−71(L)試料を解析した。22645ダルトンの軽鎖分子量は、アミノ酸SがN末端である理論値とよく適合した。分子量22989ダルトンの小ピークが観測され、N末端にアミノ酸「SWA」のシグナルペプチド伸長を有する軽鎖と一致していた。分子量21923ダルトンの非常に小さなピークも観測されたが、マススペクトル器の「フラグメンター値」を下げると、このピークは消滅したので、このピークはインソースフラグメンテーションにより引き起こされた可能性が高かった。重鎖分子量は理論値とよく適合していた。観測された分子量は、50245ダルトン、50407ダルトンおよび50569ダルトンであり、162ダルトンに相当する差はグリコシル化が異なる結果であった。
「E9−71のマススペクトル解析」に記載されるのと同じ方法を使用して、E9−71(M)−3試料を解析した。22558ダルトンの軽鎖分子量は、理論値とよく適合した。分子量21923ダルトンの非常に小さなピークも観測されたが、マススペクトル器の「フラグメンター値」を下げると、このピークは消滅したので、このピークはインソースフラグメンテーションにより引き起こされた可能性が高かった。重鎖分子量は理論値とよく適合していた。観測された分子量は、50263ダルトン、50426ダルトンおよび50588ダルトンであり、162ダルトンに相当する差はグリコシル化が異なる結果であった。
12mgのE9、E9−71、E9−1FおよびE9−19ならびに5.5mgのE9−2Bを含有する溶液が得られた。E9はIgG1変異アイソタイプである。すべての溶液の容積は、Amicon 30K 15mlチューブを用いて超遠心分離により1ml未満に減らされた。
E9−19:132mg/ml;vol=0.05ml;pH=5.06
E9−71:193mg/ml;vol=0.05ml;pH=5.32
E9−2B:64mg/ml;vol=0.1ml;pH=5.29
E9−1F:100mg/ml;vol=0.1ml;pH=5.31
E9−2BもE9−1Fもその他の3つよりも濃縮するのにはるかに長い時間が必要であった。このことから、製剤条件下ではその粘度は高いことが示唆され得る。
E9:5℃ではおよび室温に戻されたときには透明のままであった。
E9−71:5℃ではおよび室温に戻されたときには透明のままであった。
E9−1F:5℃ではごくわずかな量の濁りを示したが、20分後に室温に戻されたときには透明になった。
E9−2B:5℃ではごくわずかな量の濁りを示したが、20分後に室温に戻されたときには透明になった。
E9−19:5℃でははっきりした濁りを示したが、20分後に室温に戻されたときには透明になった。
E9−71についての真正溶解度スクリーニング結果
E9−71では、溶液中4mgはAmicon遠心分離フィルターを用いて60mg/mlまで濃縮された。25℃でも5℃での1日の保管後も沈殿も濁りも観察されなかった。
近UV−CDを、1mg/mlのE9、E9−19、E9−71、E9−2BおよびE9−1F試料上で実施した。スペクトルのプロファイルは、適切にフォールディングされた抗体について典型的に観察されたS字形を示している。この技法から、前記抗体についてはミスホールディングを示すものは何も観察されていない。
DSCを、1mg/mlのE9、E9−19、E9−71、E9−2BおよびE9−1F試料上で実施した。前記結果は表27に与えられている。開始は、アンフォールディングが始まる温度である。IgG抗体も、典型的に3つのアンフォールディング遷移(Tm)を示し、無傷の抗体のアンフォールディングはFc断片でのCH2ドメインの溶解、Fc断片でのCH3ドメインの溶解およびFab断片の溶解を伴う。開始値は、E9、E9−19およびE9−71が最も安定していることを示している。典型的には、高いほうのTm値を有するクローンは、低いほうのTm値を有するクローンよりも好ましい。
凍結融解ストレスに対する安定性は、1mg/mlのE9、E9−19、E9−71、E9−2BおよびE9−1F試料について評価された。表28は、5回の凍結融解サイクル後の試料のSEC解析の結果を示している。試験された抗体すべてが凍結融解ストレスに対して安定していた。5回の凍結融解サイクル後でもモノマーの明らかな消失は観察されなかった。
昇温での安定性は、1mg/mlのE9、E9−19、E9−71、E9−2BおよびE9−1F試料について評価された。表29には、時間0でのおよび40℃と50℃での7日および21日後の試料のSEC解析の結果が示されている。前記抗体すべての分解動態により、50℃で21日後のモノマーの割合のほぼ8%減少が明らかにされた。
抗DLL4抗体のげっ歯類PK評価
抗DLL4抗体の薬理動態特性を評価するために、SCIDベージュマウス(抗体あたりn=3)は、マウスDLL4に対する抗体の交差反応性に応じて、抗体の単回腹腔内(IP)用量を5または30mg/kg濃度のどちらかで投与された。長期的血清試料(時点あたりHBS−EP+緩衝液中1対50で希釈された5μlの全血)は、21日間にわたり各動物から収集された。血清濃度は、DLL4特異的Biacoreプラットフォームを使用して決定された。簡潔に述べると、ヒトDLL4はセンサーチップに固定化され、試料は、5分間、1分あたり5μlでフローセル上に注入され、得られた結合レベルは測定され、標準と比較された。血清濃度時間プロファイルを使用して、薬物動態パラメータCmax(ピーク血清濃度)、CL(クリアランス)、およびt1/2(抗体半減期)を推定し、表30に要約されている。E9とA10 PROfusion抗体の両方では、その薬物動態特性は、親和性成熟の進行中CDR−操作を通じて改善された。
抗DLL4抗体治療はインビトロで内皮細胞出芽を増加させた
HUVEC(継代2−3、Lonza)のインビトロ血管新生活性を調べるために、線維素ゲルビーズ出芽アッセイを記載された通りに実施した(Nakatsu et al.、Microvasc.Res.、66:102−112頁(2003)。簡潔に述べると、フィブリノーゲン溶液は、アプロチニン(4U/ml)およびスロンビン(50U/ml)を用いて再構成された。Cytodex3ビーズ(Amersham Pharmacia Biotech)は、ビーズあたり350から400HUVECを用いて一晩被膜された。96ウェル組織培養プレートのウェルあたり約20HUVEC被膜ビーズが、フィブリンクロットに埋め込まれた。80%コンフルエントの正常なヒト線維芽細胞(NHLF、Lonza)由来の条件培地をゲル上に蒔いた。15μg/mlのDLL4抗体および対照抗体KLHを前記ウェル上に添加した。10日目および12日目に、倒立顕微鏡およびNikon CCDカメラを用いて画像が撮像された。E9およびA10抗体を用いたDLL4抑制により、インビトロでの内皮細胞出芽が増強される(データは示されていない)。
DLL4抗体治療はインビボで腫瘍増殖を抑制した
腫瘍増殖に対する抗DLL4抗体の効果は、SCIDベージュマウスに移植された皮下Calu−6移植片腫瘍上で評価された。簡潔に述べると、2×106細胞は、メスSCIDベージュマウスの右後部横腹の皮下に接種された。腫瘍は14−18日間で確立させ、その時点で腫瘍体積は電子キャリパー測定を使用して決定された。腫瘍サイズは、式:L×W2/2を使用して計算された。マウスは、動物の各コホートが処置の開始に先立って等価な平均腫瘍体積(典型的には180と250mm3の間)を有するように処置群に割り当てられた(群あたりn=10)。次に動物は2週間の間週2回(合計で4用量)抗DLL4抗体を腹腔内に投与された。腫瘍体積は、各群の平均腫瘍体積が2,000mm3以上の終点に到達するまで、実験期間中平均で週2回測定された。結果は表31に示されている。PROfusion抗体のE9シリーズでは、改善された薬物動態(実施例9に示されている)を有する抗体はインビボでより強力な抗腫瘍活性を有する傾向がある。
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱せずに他の具体的な形態において体現されてもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載されている本発明を限定するというよりはむしろ、すべての点において例示していると考えるべきである。よって、本発明の範囲は、前述の記載によるというよりはむしろ、添付される特許請求の範囲によって示され、したがって、特許請求の範囲の意味および均等の範囲内にあるすべての変更は本明細書に包含されることが意図される。
Claims (186)
- ヒトDLL4に結合可能な抗原結合ドメインを含む結合タンパク質であって、前記抗原結合ドメインが、
CDR−H1:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7(配列番号99)、
(X1はSまたはNであり;
X2はS、GまたはNであり;
X3はS、N、T、GまたはRであり;
X4はYであり;
X5はYまたはHであり;
X6はWであり;および
X7はGである。);
CDR−H2:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16(配列番号100)、
(X1はDであり;
X2はIであり;
X3はY、NまたはSであり;
X4はYであり;
X5はT、N、A、I、SまたはRであり;
X6はGであり;
X7はS、N、TまたはGであり;
X8はTであり;
X9はYであり;
X10はYであり
X11はNであり;
X12はPであり;
X13はSであり;
X14はLであり;
X15はKであり;および
X16はS、N、DまたはGである。);
CDR−H3:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11(配列番号101)、
(X1はE、Y、F、Q、W、LまたはAであり;
X2はD、A、S、G、V、EまたはNであり;
X3はV、M、L、PまたはAであり;
X4はI、A、P、R、S、K、Q、V、G、MまたはEであり;
X5はL、Y、FまたはMであり;
X6はR、G、S、QまたはAであり;
X7はGであり;
X8はG、AまたはSであり;
X9はS、A、L、V、RまたはGであり;
X10はDであり;および
X11はY、D、S、N、H、E、R、L、P、C、I、M、T、QまたはKである。);
CDR−L1:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11(配列番号102)、
(X1はSであり;
X2はGであり;
X3はQ、EまたはDであり;
X4はR、S、G、M、K、LまたはTであり;
X5はLであり;
X6はGであり;
X7はDまたはEであり;
X8はKであり;
X9はYであり;
X10はAまたはVであり;および
X11はSである。);
CDR−L2:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7(配列番号103)、
(X1はEまたはQであり;
X2はDであり;
X3はS、L、T、A、EまたはFであり;
X4はK、T、E、N、Q、SまたはMであり;
X5はRであり;
X6はPであり;および
X7はSである。);
ならびに
CDR−L3:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9(配列番号104)、
(X1はQであり;
X2はAであり;
X3はWであり;
X4はDであり;
X5はR、S、M、E、N、GまたはKであり;
X6はDまたはEであり;
X7はT、V、A、SまたはMであり;
X8はG、AまたはCであり;および
X9はVである。)
からなる群から選択される少なくとも1つまたは複数のCDRを含む、前記結合タンパク質。 - 前記少なくとも1つのCDRが、
配列番号1の残基31−37番(CDR−H1);配列番号1の残基52−67番(CDR−H2);配列番号1の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号111の残基23−33番(CDR−L1);配列番号111の残基49−55番(CDR−L2);配列番号111の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号117(CDR−H1);配列番号118(CDR−H2);配列番号119(CDR−H3);
配列番号121(CDR−H1);配列番号122(CDR−H2);配列番号123(CDR−H3);
配列番号125(CDR−H1);配列番号126(CDR−H2);配列番号127(CDR−H3);
配列番号129(CDR−H1);配列番号130(CDR−H2);配列番号131(CDR−H3);
配列番号133(CDR−H1);配列番号134(CDR−H2);配列番号135(CDR−H3);
配列番号137(CDR−H1);配列番号138(CDR−H2);配列番号139(CDR−H3);
配列番号141(CDR−H1);配列番号142(CDR−H2);配列番号143(CDR−H3);
配列番号145(CDR−H1);配列番号146(CDR−H2);配列番号147(CDR−H3);
配列番号149(CDR−H1);配列番号150(CDR−H2);配列番号151(CDR−H3);
配列番号153(CDR−H1);配列番号154(CDR−H2);配列番号155(CDR−H3);
配列番号157(CDR−H1);配列番号158(CDR−H2);配列番号159(CDR−H3);
配列番号161(CDR−H1);配列番号162(CDR−H2);配列番号163(CDR−H3);
配列番号165(CDR−H1);配列番号166(CDR−H2);配列番号167(CDR−H3);
配列番号169(CDR−H1);配列番号170(CDR−H2);配列番号171(CDR−H3);
配列番号173(CDR−H1);配列番号174(CDR−H2);配列番号175(CDR−H3);
配列番号177(CDR−H1);配列番号178(CDR−H2);配列番号179(CDR−H3);
配列番号181(CDR−H1);配列番号182(CDR−H2);配列番号183(CDR−H3);
配列番号185(CDR−H1);配列番号186(CDR−H2);配列番号187(CDR−H3);
配列番号189(CDR−H1);配列番号190(CDR−H2);配列番号191(CDR−H3);
配列番号193(CDR−H1);配列番号194(CDR−H2);配列番号195(CDR−H3);
配列番号197(CDR−H1);配列番号198(CDR−H2);配列番号199(CDR−H3);
配列番号201(CDR−H1);配列番号202(CDR−H2);配列番号203(CDR−H3);
配列番号205(CDR−H1);配列番号206(CDR−H2);配列番号207(CDR−H3);
配列番号209(CDR−H1);配列番号210(CDR−H2);配列番号211(CDR−H3);
配列番号213(CDR−H1);配列番号214(CDR−H2);配列番号215(CDR−H3);
配列番号217(CDR−L1);配列番号218(CDR−L2);配列番号219(CDR−L3);
配列番号221(CDR−L1);配列番号222(CDR−L2);配列番号223(CDR−L3);
配列番号225(CDR−L1);配列番号226(CDR−L2);配列番号227(CDR−L3);
配列番号229(CDR−L1);配列番号230(CDR−L2);配列番号231(CDR−L3);
配列番号233(CDR−L1);配列番号234(CDR−L2);配列番号235(CDR−L3);
配列番号237(CDR−L1);配列番号238(CDR−L2);配列番号239(CDR−L3);
配列番号241(CDR−L1);配列番号242(CDR−L2);配列番号243(CDR−L3);
配列番号245(CDR−L1);配列番号246(CDR−L2);配列番号247(CDR−L3);
配列番号249(CDR−L1);配列番号250(CDR−L2);配列番号251(CDR−L3);
配列番号253(CDR−L1);配列番号254(CDR−L2);配列番号255(CDR−L3);
配列番号257(CDR−L1);配列番号258(CDR−L2);配列番号259(CDR−L3);
配列番号261(CDR−L1);配列番号262(CDR−L2);配列番号263(CDR−L3);
配列番号265(CDR−L1);配列番号266(CDR−L2);配列番号267(CDR−L3);
配列番号269(CDR−L1);配列番号270(CDR−L2);配列番号271(CDR−L3);
配列番号273(CDR−L1);配列番号274(CDR−L2);配列番号275(CDR−L3);
配列番号277(CDR−L1);配列番号278(CDR−L2);配列番号279(CDR−L3);
配列番号281(CDR−L1);配列番号282(CDR−L2);配列番号283(CDR−L3);
配列番号285(CDR−L1);配列番号286(CDR−L2);配列番号287(CDR−L3);
配列番号289(CDR−L1);配列番号290(CDR−L2);配列番号291(CDR−L3);
配列番号293(CDR−L1);配列番号294(CDR−L2);配列番号295(CDR−L3);
配列番号297(CDR−L1);配列番号298(CDR−L2);配列番号299(CDR−L3);
配列番号301(CDR−L1);配列番号302(CDR−L2);配列番号303(CDR−L3);
配列番号305(CDR−L1);配列番号306(CDR−L2);配列番号307(CDR−L3);
配列番号309(CDR−L1);配列番号310(CDR−L2);配列番号311(CDR−L3);
配列番号313(CDR−L1);配列番号314(CDR−L2);配列番号315(CDR−L3);
配列番号334の残基31−37番(CDR−H1);配列番号334の残基52−67番(CDR−H2);配列番号334の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号335の残基23−33番(CDR−L1);配列番号335の残基49−55番(CDR−L2);配列番号335の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号336の残基31−37番(CDR−H1);配列番号336の残基52−67番(CDR−H2);配列番号336の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号337の残基23−33番(CDR−L1);配列番号337の残基49−55番(CDR−L2);配列番号337の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号338の残基31−37番(CDR−H1);配列番号338の残基52−67番(CDR−H2);配列番号338の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号339の残基23−33番(CDR−L1);配列番号339の残基49−55番(CDR−L2);配列番号339の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号340の残基31−37番(CDR−H1);配列番号340の残基52−67番(CDR−H2);配列番号340の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号341の残基23−33番(CDR−L1);配列番号341の残基49−55番(CDR−L2);配列番号341の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号342の残基31−37番(CDR−H1);配列番号342の残基52−67番(CDR−H2);配列番号342の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号343の残基23−33番(CDR−L1);配列番号343の残基49−55番(CDR−L2);配列番号343の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号344の残基31−37番(CDR−H1);配列番号344の残基52−67番(CDR−H2);配列番号344の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号345の残基24−34番(CDR−L1);配列番号345の残基50−56番(CDR−L2);配列番号345の残基89−97番(CDR−L3);
配列番号346の残基31−37番(CDR−H1);配列番号346の残基52−67番(CDR−H2);配列番号346の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号347の残基23−33番(CDR−L1);配列番号347の残基49−55番(CDR−L2);配列番号347の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号348の残基31−37番(CDR−H1);配列番号348の残基52−67番(CDR−H2);配列番号348の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号349の残基24−34番(CDR−L1);配列番号349の残基50−56番(CDR−L2);配列番号349の残基89−97番(CDR−L3);
配列番号350の残基31−37番(CDR−H1);配列番号350の残基52−67番(CDR−H2);配列番号350の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号351の残基24−34番(CDR−L1);配列番号351の残基50−56番(CDR−L2);配列番号351の残基89−97番(CDR−L3);
配列番号352の残基31−37番(CDR−H1);配列番号352の残基52−67番(CDR−H2);配列番号352の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号353の残基24−34番(CDR−L1);配列番号353の残基50−56番(CDR−L2);配列番号353の残基89−97番(CDR−L3);
配列番号354の残基31−37番(CDR−H1);配列番号354の残基52−67番(CDR−H2);配列番号354の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号355の残基24−34番(CDR−L1);配列番号355の残基50−56番(CDR−L2);配列番号355の残基89−97番(CDR−L3);
配列番号356の残基31−37番(CDR−H1);配列番号356の残基52−67番(CDR−H2);配列番号356の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号357の残基23−33番(CDR−L1);配列番号357の残基49−55番(CDR−L2);配列番号357の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号358の残基31−37番(CDR−H1);配列番号358の残基52−67番(CDR−H2);配列番号358の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号359の残基23−33番(CDR−L1);配列番号359の残基49−55番(CDR−L2);配列番号359の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号360の残基31−37番(CDR−H1);配列番号360の残基52−67番(CDR−H2);配列番号360の残基100−110番(CDR−H3);
配列番号361の残基23−33番(CDR−L1);配列番号361の残基49−55番(CDR−L2);配列番号361の残基88−96番(CDR−L3)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の結合タンパク質。 - 前記結合タンパク質が少なくとも3つのCDRを含む、請求項2に記載の結合タンパク質。
- 前記少なくとも3つのCDRが、
VH E9 CDR組
CDR−H1:配列番号1の残基31−37番
CDR−H2:配列番号1の残基52−67番
CDR−H3配列番号1の残基100−110番
VL E9 CDR組
CDR−L1:配列番号111の残基23−33番
CDR−L2:配列番号111の残基49−55番
CDR−L3:配列番号111の残基88−96番
VH E9.4 CDR組
CDR−H1:配列番号117
CDR−H2:配列番号118
CDR−H3:配列番号119
VL E9.4 CDR組
CDR−L1:配列番号229
CDR−L2:配列番号230
CDR−L3:配列番号231
VH E9.11 CDR組
CDR−H1:配列番号121
CDR−H2:配列番号122
CDR−H3:配列番号123
VL E9.11 CDR組
CDR−L1:配列番号233
CDR−L2:配列番号234
CDR−L3:配列番号235
VH E9.14 CDR組
CDR−H1:配列番号125
CDR−H2:配列番号126
CDR−H3:配列番号127
VL E9.14 CDR組
CDR−L1:配列番号237
CDR−L2:配列番号238
CDR−L3:配列番号239
VH E9.17 CDR組
CDR−H1:配列番号129
CDR−H2:配列番号130
CDR−H3:配列番号131
VL E9.17 CDR組
CDR−L1:配列番号241
CDR−L2:配列番号242
CDR−L3:配列番号243
VH E9.18 CDR組
CDR−H1:配列番号133
CDR−H2:配列番号134
CDR−H3:配列番号135
VL E9.18 CDR組
CDR−L1:配列番号245
CDR−L2:配列番号246
CDR−L3:配列番号247
VH E9.19 CDR組
CDR−H1:配列番号137
CDR−H2:配列番号138
CDR−H3:配列番号139
VL E9.19 CDR組
CDR−L1:配列番号249
CDR−L2:配列番号250
CDR−L3:配列番号251
VH E9.22 CDR組
CDR−H1:配列番号141
CDR−H2:配列番号142
CDR−H3:配列番号143
VL E9.22 CDR組
CDR−L1:配列番号253
CDR−L2:配列番号254
CDR−L3:配列番号255
VH E9.48 CDR組
CDR−H1:配列番号145
CDR−H2:配列番号146
CDR−H3:配列番号147
VL E9.48 CDR組
CDR−L1:配列番号257
CDR−L2:配列番号258
CDR−L3:配列番号259
VH E9.65 CDR組
CDR−H1:配列番号149
CDR−H2:配列番号150
CDR−H3:配列番号151
VL E9.65 CDR組
CDR−L1:配列番号261
CDR−L2:配列番号262
CDR−L3:配列番号263
VH E9.66 CDR組
CDR−H1:配列番号153
CDR−H2:配列番号154
CDR−H3:配列番号155
VL E9.66 CDR組
CDR−L1:配列番号265
CDR−L2:配列番号266
CDR−L3:配列番号267
VH E9.71 CDR組
CDR−H1:配列番号157
CDR−H2:配列番号158
CDR−H3:配列番号159
VL E9.71 CDR組
CDR−L1:配列番号269
CDR−L2:配列番号270
CDR−L3:配列番号271
VH E9.13 CDR組
CDR−H1:配列番号161
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CDR−H3:配列番号163
VL E9.13 CDR組
CDR−L1:配列番号217
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VH E9.16 CDR組
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VL E9.16 CDR組
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VH E9.38 CDR組
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VL E9.38 CDR組
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VH E9.2B CDR組
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VL E9.2B CDR組
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VH E9.1F CDR組
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VL E9.1F CDR組
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VH E9.10H CDR組
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VL E9.10H CDR組
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VH E9.5E CDR組
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VL E9.5E CDR組
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VH E9.10C CDR組
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VL E9.10C CDR組
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VH E9.7E CDR組
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VL E9.7E CDR組
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VH E9.12B CDR組
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VL E9.12B CDR組
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VH E9.10E CDR組
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VL E9.10E CDR組
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VH E9.6A CDR組
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VL E9.6A CDR組
CDR−L1:配列番号305
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VH E9.7A CDR組
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VL E9.7A CDR組
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VH E9.8H CDR組
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VL E9.8H CDR組
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VH E9.1 CDR組
CDR−H1:配列番号334の残基31−37番
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VL E9.1 CDR組
CDR−L1:配列番号335の残基23−33番
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VH E9−SE1 CDR組
CDR−H1:配列番号336の残基31−37番
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CDR−H3:配列番号336の残基100−110番
VL E9−SE1 CDR組
CDR−L1:配列番号337の残基23−33番
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CDR−L3:配列番号337の残基88−96番
VH E9−SE2 CDR組
CDR−H1:配列番号338の残基31−37番
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VL E9−SE2 CDR組
CDR−L1:配列番号339の残基23−33番
CDR−L2:配列番号339の残基49−55番
CDR−L3:配列番号339の残基88−96番
VH E9−SE3 CDR組
CDR−H1:配列番号340の残基31−37番
CDR−H2:配列番号340の残基52−67番
CDR−H3:配列番号340の残基100−110番
VL E9−SE3 CDR組
CDR−L1:配列番号341の残基23−33番
CDR−L2:配列番号341の残基49−55番
CDR−L3:配列番号341の残基88−96番
VH E9−SE4 CDR組
CDR−H1:配列番号342の残基31−37番
CDR−H2:配列番号342の残基52−67番
CDR−H3:配列番号342の残基100−110番
VL E9−SE4 CDR組
CDR−L1:配列番号343の残基23−33番
CDR−L2:配列番号343の残基49−55番
CDR−L3:配列番号343の残基88−96番
VH E9−SE5 CDR組
CDR−H1:配列番号344の残基31−37番
CDR−H2:配列番号344の残基52−67番
CDR−H3:配列番号344の残基100−110番
VL E9−SE5 CDR組
CDR−L1:配列番号345の残基24−34番
CDR−L2:配列番号345の残基50−56番
CDR−L3:配列番号345の残基89−97番
VH E9−SE6 CDR組
CDR−H1:配列番号346の残基31−37番
CDR−H2:配列番号346の残基52−67番
CDR−H3:配列番号346の残基100−110番
VL E9−SE6 CDR組
CDR−L1:配列番号347の残基23−33番
CDR−L2:配列番号347の残基49−55番
CDR−L3:配列番号347の残基88−96番
VH E9−SE7 CDR組
CDR−H1:配列番号348の残基31−37番
CDR−H2:配列番号348の残基52−67番
CDR−H3:配列番号348の残基100−110番
VL E9−SE7 CDR組
CDR−L1:配列番号349の残基24−34番
CDR−L2:配列番号349の残基50−56番
CDR−L3:配列番号349の残基89−97番
VH E9−SE8 CDR組
CDR−H1:配列番号350の残基31−37番
CDR−H2:配列番号350の残基52−67番
CDR−H3:配列番号350の残基100−110番
VL E9−SE8 CDR組
CDR−L1:配列番号351の残基24−34番
CDR−L2:配列番号351の残基50−56番
CDR−L3:配列番号351の残基89−97番
VH E9−FR1 CDR組
CDR−H1:配列番号352の残基31−37番
CDR−H2:配列番号352の残基52−67番
CDR−H3:配列番号352の残基100−110番
VL E9−FR1 CDR組
CDR−L1:配列番号353の残基24−34番
CDR−L2:配列番号353の残基50−56番
CDR−L3:配列番号353の残基89−97番
VH E9−FR2 CDR組
CDR−H1:配列番号354の残基31−37番
CDR−H2:配列番号354の残基52−67番
CDR−H3:配列番号354の残基100−110番
VL E9−FR2 CDR組
CDR−L1:配列番号355の残基24−34番
CDR−L2:配列番号355の残基50−56番
CDR−L3:配列番号355の残基89−97番
VH E9.71 CDR組
CDR−H1:配列番号356の残基31−37番
CDR−H2:配列番号356の残基52−67番
CDR−H3:配列番号356の残基100−110番
VL E9.71 CDR組
CDR−L1:配列番号357の残基23−33番
CDR−L2:配列番号357の残基49−55番
CDR−L3:配列番号357の残基88−96番
VH E9.71(M)CDR組
CDR−H1:配列番号358の残基31−37番
CDR−H2:配列番号358の残基52−67番
CDR−H3:配列番号358の残基100−110番
VL E9.71(M)CDR組
CDR−L1:配列番号359の残基23−33番
CDR−L2:配列番号359の残基49−55番
CDR−L3:配列番号359の残基88−96番
VH E9.71(L)CDR組
CDR−H1:配列番号360の残基31−37番
CDR−H2:配列番号360の残基52−67番
CDR−H3:配列番号360の残基100−110番
VL E9.71(L)CDR組
CDR−L1:配列番号361の残基23−33番
CDR−L2:配列番号361の残基49−55番
CDR−L3:配列番号361の残基88−96番
からなる群から選択される可変ドメインCDR組を含む、請求項3に記載の結合タンパク質。 - 少なくとも2つの可変ドメインCDR組を含む、請求項4に記載の結合タンパク質。
- 前記少なくとも2つの可変ドメインCDR組が、
VH E9 CDR組およびVL E9 CDR組、
VH E9.4 CDR組およびVL E9.4 CDR組、
VH E9.11 CDR組およびVL E9.11 CDR組、
VH E9.14 CDR組およびVL E9.14 CDR組、
VH E9.17 CDR組およびVL E9.17 CDR組、
VH E9.18 CDR組およびVL E9.18 CDR組、
VH E9.19 CDR組およびVL E9.19 CDR組、
VH E9.22 CDR組およびVL E9.22 CDR組、
VH E9.48 CDR組およびVL E9.48 CDR組、
VH E9.65 CDR組およびVL E9.65 CDR組、
VH E9.66 CDR組およびVL E9.66 CDR組、
VH E9.71 CDR組およびVL E9.71 CDR組、
VH E9.13 CDR組およびVL E9.13 CDR組、
VH E9.16 CDR組およびVL E9.16 CDR組、
VH E9.38 CDR組およびVL E9.38 CDR組、
VH E9.2B CDR組およびVL E9.2B CDR組、
VH E9.1F CDR組およびVL E9.1F CDR組、
VH E9.10H CDR組およびVL E9.10H CDR組、
VH E9.5E CDR組およびVL E9.5E CDR組、
VH E9.10C CDR組およびVL E9.10C CDR組、
VH E9.7E CDR組およびVL E9.7E CDR組、
VH E9.12B CDR組およびVL E9.12B CDR組、
VH E9.10E CDR組およびVL E9.10E CDR組、
VH E9.6A CDR組およびVL E9.6A CDR組、
VH E9.7A CDR組およびVL E9.7A CDR組、
VH E9.8H CDR組およびVL E9.8H CDR組、
VH E9−SE1 CDR組およびVL E9−SE1 CDR組、
VH E9−SE2 CDR組およびVL E9−SE2 CDR組、
VH E9−SE3 CDR組およびVL E9−SE3 CDR組、
VH E9−SE4 CDR組およびVL E9−SE4 CDR組、
VH E9−SE5 CDR組およびVL E9−SE5 CDR組、
VH E9−SE6 CDR組およびVL E9−SE6 CDR組、
VH E9−SE7 CDR組およびVL E9−SE7 CDR組、
VH E9−SE8 CDR組およびVL E9−SE8 CDR組、
VH E9−FR1 CDR組およびVL E9−FR1 CDR組、
VH E9−FR2 CDR組およびVL E9−FR2 CDR組、
VH E9.71 CDR組およびVL E9.71 CDR組、
VH E9.71(M)DR組およびVL E9.71(M)CDR組、および
VH E9.71(L)CDR組およびVL E9.71(L)CDR組
からなる群から選択される、請求項5に記載の結合タンパク質。 - ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記ヒトアクセプターフレームワークが、
重鎖アクセプターフレームワーク配列、配列番号6から22
重鎖アクセプター配列、配列番号35から62
軽鎖アクセプター配列、配列番号23から34、および
軽鎖アクセプター配列、配列番号63から98
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の結合タンパク質。 - 前記ヒトアクセプターフレームワークが、少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、前記フレームワークのアミノ酸配列が前記ヒトアクセプターフレームワークの配列に少なくとも65%同一であり、前記ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも70アミノ酸残基を含む、請求項7または8に記載の結合タンパク質。
- 前記ヒトアクセプターフレームワークがキーとなる残基に少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、前記キーとなる残基が、
CDRに隣接する残基;
グリコシル化部位残基;
希少残基;
ヒトDLL4と相互作用をすることができる残基;
カノニカル残基;
重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の接触残基;
バーニヤゾーン内の残基;および
コチア定義された可変重鎖CDR1とカバット定義された第一の重鎖フレームワーク間を重複する領域における残基
からなる群から選択される、請求項8に記載の結合タンパク質。 - キーとなる残基が、2H、4H、24H、26H、27H、29H、34H、35H、37H、39H、44H、45H、47H、48H、49H、50H、51H、58H、59H、60H、63H、67H、69H、71H、73H、76H、78H、91H、93H、94H、2L、4L、25L、29L、27bL、33L、34L、36L、38L、43L、44L、46L、47L、48L、49L、55L、58L、62L、64L、71L、87L、89L、90L、91L、94L、95Lからなる群から選択される、請求項10に記載の結合タンパク質。
- 結合タンパク質がコンセンサスヒト可変ドメインである、請求項11に記載の結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が、
配列番号1、111、116、228、120、232、124、236、128、240、132、244、136、248、140、252、144、256、148、260、152、264、156、268、160、216、164、220、168、224、172、272、176、276、180、300、184、292、188、280、192、288、196、296、200、284、204、304、208、308、212、312、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、および361からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの可変ドメインを含む、請求項1に記載の結合タンパク質。 - 前記結合タンパク質が2つの可変ドメインを含み、前記2つの可変ドメインが
配列番号1および111、配列番号116および228、配列番号120および232、配列番号124および236、配列番号128および240、配列番号132および244、配列番号136および248、配列番号140および252、配列番号144および256、配列番号148および260、配列番号152および264、配列番号156および268、配列番号160および216、配列番号164および220、配列番号168および224、配列番号172および272、配列番号176および276、配列番号180および300、配列番号184および292、配列番号188および280、配列番号192および288、配列番号196および296、配列番号200および284、配列番号204および304、配列番号208および308、配列番号212および312、配列番号334および335、配列番号336および337、配列番号338および339、配列番号340および341、配列番号342および343、配列番号344および345、配列番号346および347、配列番号348および349、配列番号350および351、配列番号352および353、配列番号354および355、配列番号356および357、配列番号358および359、配列番号360および361からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項13に記載の結合タンパク質。 - 前記結合タンパク質が、
配列番号1、111、116、228、120、232、124、236、128、240、132、244、136、248、140、252、144、256、148、260、152、264、156、268、160、216、164、220、168、224、172、272、176、276、180、300、184、292、188、280、192、288、196、296、200、284、204、304、208、308、212、312、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、および361からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの可変ドメインを含む、請求項11に記載の結合タンパク質。 - 前記抗原結合ドメインがVHを含む、請求項2に記載の結合タンパク質。
- 前記VHが、
番号1、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、および360からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の結合タンパク質。 - 前記抗原結合ドメインがVLを含む、請求項2に記載の結合タンパク質。
- 前記VLが、
配列番号111、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、216、220、224、272、276、300、292、280、288、296、284、304、308、312、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、および361からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項18に記載の結合タンパク質。 - 前記抗原結合ドメインがVHおよびVLを含む、請求項2に記載の結合タンパク質。
- VHをさらに含み、前記VHが、
配列番号1、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、および360からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の結合タンパク質。 - 前記VLが、
配列番号111、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、216、220、224、272、276、300、292、280、288、296、284、304、308、312、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、および361からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項20に記載の結合タンパク質。 - ヒトIgM定常ドメイン;ヒトIgG1定常ドメイン;ヒトIgG2定常ドメイン;ヒトIgG3定常ドメイン;ヒトIgG4定常ドメイン;ヒトIgE定常ドメインおよびヒトIgA定常ドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、請求項2に記載の結合タンパク質。
- 前記重鎖免疫グロブリン定常領域ドメインがヒトIgG1定常ドメインである、請求項23に記載の結合タンパク質。
- 前記ヒトIgG1定常ドメインが、配列番号2および配列番号3からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項24に記載の結合タンパク質。
- ヒトIgκ定常ドメインおよびヒトIgλ定常ドメインからなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、請求項2に記載の結合タンパク質。
- 前記軽鎖免疫グロブリン定常領域ドメインが、アミノ酸配列配列番号4を含むヒトIgκ定常ドメインである、請求項26に記載の結合タンパク質。
- 前記軽鎖免疫グロブリン定常領域ドメインが、アミノ酸配列配列番号5を含むヒトIgλ定常ドメインである、請求項26に記載の結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が、免疫グロブリン分子、scFv、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド連結Fv、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異的抗体、二特異的抗体および二重特異的抗体からなる群から選択される、請求項1に記載の結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質がヒト抗体である、請求項29に記載の結合タンパク質。
- 配列番号2および配列番号3からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg定常重領域;
配列番号4および配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg定常軽領域;
配列番号1、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、および360からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg可変重領域;および
配列番号111、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、216、220、224、272、276、300、292、280、288、296、284、304、308、312、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、および361からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg可変軽領域
を含む、ヒトDLL−4に結合することができる結合タンパク質。 - 前記Ig定常軽領域が配列番号5である、請求項31に記載の結合タンパク質。
- Notch−1、Notch−2、Notch−3、Notch−4およびそれらの組合せからなる群から選択されるNotchタンパク質とのDLL4相互作用をブロックすることができる、請求項1から32のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- Notch−1およびNotch−4とのDLL4相互作用をブロックすることができる、請求項33に記載の結合タンパク質。
- Notch−1とのDLL4相互作用をブロックすることができる、請求項33に記載の結合タンパク質。
- Notch−4とのDLL4相互作用をブロックすることができる、請求項33に記載の結合タンパク質。
- DLL4の生物学的機能を調節することができる、請求項1から32のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- DLL4を中和することができる、請求項1から32のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記DLL4が、ヒトDLL4、マウスDLL4、カニクイザルDLL4およびラットDLL4からなる群から選択される、請求項38に記載の中和結合タンパク質。
- DLL4の受容体結合能力を減少させる、請求項38に記載の中和結合タンパク質。
- 正常な血管新生を減少させることができる、請求項38に記載の中和結合タンパク質。
- 前記中和結合タンパク質が、最大で約10−7M;最大で約10−8M;最大で約10−9M;最大で約10−10M;最大で約10−11M;最大で約10−12M;および最大で約10−13Mからなる群から選択される解離定数(KD)を有する、請求項38に記載の中和結合タンパク質。
- 前記中和結合タンパク質が、少なくとも約102M−1s−1;少なくとも約103M−1s−1;少なくとも約104M−1s−1;少なくとも約105M−1s−1;および少なくとも約106M−1s−1からなる群から選択される結合速度を有する、請求項38に記載の中和結合タンパク質。
- 前記中和結合タンパク質が、最大で約10−3s−1;最大で約10−4s−1;最大で約10−5s−1;および最大で約10−6s−1からなる群から選択される解離速度を有する、請求項38に記載の中和結合タンパク質。
- 請求項1から32のいずれか一項に記載の結合タンパク質を含み、前記結合タンパク質が検出可能な標識にコンジュゲートされている標識結合タンパク質。
- 前記検出可能な標識が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識およびビオチンからなる群から選択される、請求項45に記載の標識結合タンパク質。
- 前記標識が、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Hoおよび153Smからなる群から選択される放射性標識である、請求項46に記載の標識結合タンパク質。
- リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、請求項1から32のいずれか一項に記載の結合タンパク質を含む抗体構築物。
- 免疫グロブリン分子、
モノクローナル抗体、
キメラ抗体、
CDR移植された抗体、
ヒト化抗体、
Fab、
Fab’、
F(ab’)2,
Fv、
ジスルフィド連結Fv、
scFv、
単一ドメイン抗体、
ダイアボディ、
多重特異的抗体、
二重特異的抗体、および
二特異的抗体
からなる群から選択される、請求項48に記載の抗体構築物。 - ヒトIgM定常ドメイン、
ヒトIgG1定常ドメイン、
ヒトIgG2定常ドメイン、
ヒトIgG3定常ドメイン、
ヒトIgG4定常ドメイン、
ヒトIgE定常ドメイン、
ヒトIgA定常ドメイン、
およびFc新生児受容体、Fcガンマ受容体またはClqに対する結合強度を変える1つまたは複数の変異を有するIgG定常ドメインバリアント
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項48に記載の抗体構築物。 - 配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5およびそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項48に記載の抗体構築物。
- 治療薬または細胞傷害性薬にコンジュゲートされている、請求項48に記載される抗体構築物を含む抗体コンジュゲート。
- 前記治療薬または細胞傷害性薬が、抗代謝薬、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生薬、抗有糸分裂薬、アントラサイクリン、毒素およびアポトーシス薬からなる群から選択される、請求項52に記載の抗体コンジュゲート。
- 請求項1に記載されるCDR−H1、CDR−H2もしくはCDR−H3のうちの1つもしくは複数を含む重鎖可変ドメインを含むポリペプチド、請求項1に記載されるCDR−L1、CDR−L2もしくはCDR−L3のうちの1つもしくは複数を含む軽鎖可変ドメインを含むポリペプチド、または両ポリペプチドの組合せからなる群から選択されるポリペプチドをコードする単離された核酸。
- 請求項54に記載の単離された核酸を含むベクター。
- 前記ベクターが、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pHybEおよびpBJからなる群から選択される、請求項55に記載のベクター。
- 請求項55および56のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が原核細胞である、請求項57に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がエシェリキアコリ(Escherichia coli)である、請求項58に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が真核細胞である、請求項59に記載の宿主細胞。
- 前記真核細胞が原生生物細胞、動物細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される、請求項60に記載の宿主細胞。
- 前記真核細胞が哺乳動物細胞、鳥類細胞および昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である、請求項61に記載の宿主細胞。
- 前記哺乳動物細胞がCHO細胞である、請求項62に記載の宿主細胞。
- 前記哺乳動物細胞がCOS細胞である、請求項62に記載の宿主細胞。
- 前記真菌細胞がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項61に記載の宿主細胞。
- 前記昆虫細胞がSf9細胞である、請求項62に記載の宿主細胞。
- ヒトDLL4に結合する結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、培地において請求項57から66のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、ヒトDLL4に結合する結合タンパク質を作製する方法。
- 請求項67に記載の方法に従って作製される結合タンパク質。
- 請求項1から32のいずれか一項に記載される結合タンパク質を含み、前記結合タンパク質が結晶として存在する、結晶化された結合タンパク質。
- 前記結晶が無担体医薬徐放結晶である、請求項69に記載の結晶化された結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が、前記結合タンパク質の可溶性相当物よりも大きな半減期をインビボで有する、請求項69に記載の結晶化された結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が、生物学的活性を保持する、請求項69に記載の結晶化された結合タンパク質。
- (a)請求項69から72のいずれか一項に記載の結晶化された結合タンパク質および成分を含む製剤、ならびに
(b)少なくとも1つのポリマー担体
を含む、結合タンパク質を放出するための組成物。 - 前記ポリマー担体が、ポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリル酸)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)またはPLGA、ポリ(b−ヒドロキシブチラート)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、ポリ[(オルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギナート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン(glycaminoglycans)、硫酸ポリサッカライド、これらの混合物およびコポリマーからなる群のうちの1つまたは複数から選択されるポリマーである、請求項73に記載の組成物。
- 前記成分が、アルブミン、ショ糖、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項73に記載の組成物。
- 請求項73に記載の組成物の有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物を治療するための方法。
- 請求項1から32のいずれか一項に記載の結合タンパク質および医薬として許容される担体を含む、医薬組成物。
- DLL4活性が有害である障害を治療するための少なくとも1つの追加の治療剤をさらに含む、請求項77に記載の医薬組成物。
- 前記追加の作用薬が、血管新生阻害剤;キナーゼ阻害剤;共刺激分子遮断剤;接着分子遮断剤;抗サイトカイン抗体またはこの機能的断片;メトトレキサート;コルチコステロイド;シクロスポリン;ラパマイシン;FK506;および非ステロイド系抗炎症薬からなる群から選択される、請求項78に記載の医薬組成物。
- ヒトDLL4活性が減少するようにヒトDLL4を請求項1から32のいずれか一項に記載の結合タンパク質と接触させることを含む、ヒトDLL4活性を減少させるための方法。
- ヒト対象におけるヒトIL−17活性が減少するように請求項1から32のいずれか一項に記載の結合タンパク質をヒト対象に投与することを含む、DLL4活性が有害である障害に罹っているヒト対象においてヒトDLL4活性を減少させるための方法。
- 治療が達成されるように請求項1から32のいずれか一項に記載の結合タンパク質をヒト対象に投与することによりDLL4活性が有害である疾患または障害について対象を治療するための方法。
- 前記障害が、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、尿路癌、女性生殖路癌、男性生殖路癌、内分泌腺癌、皮膚癌、血管腫、悪性黒色腫、肉腫、脳腫瘍、神経癌、眼腫瘍、髄膜癌、造血性悪性病変から生じる固形腫瘍、腫瘍転移、目の血管新生、浮腫、関節リウマチ、多発性硬化症、動脈硬化プラーク、クローン病、炎症性腸疾患、難治性腹水症、乾癬、サルコイドーシス、動脈硬化症、敗血症、消化性潰瘍、火傷、および膵炎、多嚢胞性卵巣疾患(POD)、子宮内膜症、子宮筋腫、良性前立腺肥大症ならびに異常なDLL4活性により特徴付けられる他の血管新生非依存性および依存性疾患からなる群から選択される、請求項82に記載の方法。
- 障害が原発性および転移性癌である、請求項83に記載の方法。
- 尿路癌が、腎臓癌、膀胱癌および尿路上皮癌からなる群から選択される、請求項83に記載の方法。
- 女性生殖路癌が、子宮頚部癌、子宮癌、卵巣癌、絨毛癌および妊娠性絨毛性疾患からなる群から選択される、請求項83に記載の方法。
- 男性生殖路癌が、前立腺癌、精嚢癌、精巣癌および生殖細胞腫瘍からなる群から選択される、請求項83に記載の方法。
- 内分泌腺癌が、甲状腺癌、副腎癌および下垂体癌からなる群から選択される、請求項83に記載の方法。
- 肉腫が、骨肉腫、軟部組織肉腫およびカポジ肉腫からなる群から選択される、請求項83に記載の方法。
- 髄膜癌が、星状膠細胞腫、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン細胞腫および髄膜腫からなる群から選択される、請求項83に記載の方法。
- 造血性悪性病変から生じる固形腫瘍が、白血病、ホジキン白血病、非ホジキン白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫である、請求項83に記載の方法。
- 前記目の血管新生が、糖尿病性失明、網膜症、年齢誘発性黄斑変性症および虹彩血管新生からなる群から選択される、請求項83に記載の方法。
- ヒトVEGFR2に結合することができる抗体またはこの断片;メトトレキサート;ヒトTNFに結合することができる抗体またはこの断片;コルチコステロイド、シクロスポリン;ラパマイシン;FK506;および非ステロイド系抗炎症薬からなる群から選択される第二の作用物質の投与前に、同時にまたは後に、請求項1から32のいずれか一項に記載の結合タンパク質を投与するステップを含む、DLL4が有害である障害に罹っている患者を治療する方法。
- ヒトDLL4に結合することができる抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、
CDR−H1:X1−X2−X3−X4−X5(配列番号105)、
(X1はS、NまたはDであり;
X2はHまたはYであり;
X3はWであり;
X4はMであり;
X5はSまたはHである。);
CDR−H2:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17(配列番号106)、
(X1はI、D、MまたはTであり;
X2はIであり;
X3はSであり;
X4はY、N、S、Q、V、T、HまたはDであり;
X5はDであり;
X6はGであり;
X7はS、R、I、T、G、K、HまたはNであり;
X8はN、Y、S、IまたはTであり;
X9はK、M、N、Q、E、T、R、S、AまたはLであり;
X10はY、DまたはEであり
X11はSまたはYであり;
X12はAであり;
X13はDであり;
X14はSであり;
X15はVであり;
X16はKであり;および
X17はGである。);
CDR−H3:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10(配列番号107)、
(X1はAであり;
X2はG、AまたはRであり;
X3はGであり;
X4はG、SまたはAであり;
X5はNであり;
X6はVまたはMであり;
X7はGであり;
X8はF、L、YまたはMであり;
X9はDであり;および
X10はI、SまたはLである。);
CDR−L1:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11(配列番号108)、
(X1はSであり;
X2はAまたはGであり;
X3はDであり;
X4はK、N、L、Q、M、E、S、T、GまたはDであり;
X5はLであり;
X6はGであり;
X7はT、S、N、A、GまたはEであり;
X8はK、Q、NまたはRであり;
X9はYであり;
X10はVまたはIであり;および
X11はSである。);
CDR−L2:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7(配列番号109)、
(X1はQであり;
X2はDであり;
X3はA、G、W、SまたはDであり;
X4はK、M、Q、N、L、T、IまたはEであり;
X5はRであり;
X6はPであり;および
X7はSである。);
ならびに
CDR−L3:X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9(配列番号110)、
(X1はQであり;
X2はSまたはAであり;
X3はWであり;
X4はDであり;
X5はR、S、Q、P、A、V、WまたはMであり;
X6はS、G、I、N、RまたはTであり;
X7はDまたはGであり;
X8はV、A、PまたはEであり;および
X9はVである。);
からなる群から選択される少なくとも1つまたは複数のCDRを含む、結合タンパク質。 - 前記少なくとも1つのCDRが、
配列番号112の残基31−35番(CDR−H1);配列番号112の残基50−66番(CDR−H2);配列番号112の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号113の残基23−33番(CDR−L1);配列番号113の残基49−55番(CDR−L2);配列番号113の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号316の残基31−35番(CDR−H1);配列番号316の残基50−66番(CDR−H2);配列番号316の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号317の残基31−35番(CDR−H1);配列番号317の残基50−66番(CDR−H2);配列番号317の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号318の残基31−35番(CDR−H1);配列番号318の残基50−66番(CDR−H2);配列番号318の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号319の残基31−35番(CDR−H1);配列番号319の残基50−66番(CDR−H2);配列番号319の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号320の残基31−35番(CDR−H1);配列番号320の残基50−66番(CDR−H2);配列番号320の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号321の残基31−35番(CDR−H1);配列番号321の残基50−66番(CDR−H2);配列番号321の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号322の残基31−35番(CDR−H1);配列番号322の残基50−66番(CDR−H2);配列番号322の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号323の残基31−35番(CDR−H1);配列番号323の残基50−66番(CDR−H2);配列番号323の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号324の残基31−35番(CDR−H1);配列番号324の残基50−66番(CDR−H2);配列番号324の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号325の残基31−35番(CDR−H1);配列番号325の残基50−66番(CDR−H2);配列番号325の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号326の残基31−35番(CDR−H1);配列番号326の残基50−66番(CDR−H2);配列番号326の残基99−108番(CDR−H3);
配列番号327の残基23−33番(CDR−L1);配列番号327の残基49−55番(CDR−L2);配列番号327の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号328の残基23−33番(CDR−L1);配列番号328の残基49−55番(CDR−L2);配列番号328の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号329の残基23−33番(CDR−L1);配列番号329の残基49−55番(CDR−L2);配列番号329の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号330の残基23−33番(CDR−L1);配列番号330の残基49−55番(CDR−L2);配列番号330の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号331の残基23−33番(CDR−L1);配列番号331の残基49−55番(CDR−L2);配列番号331の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号332の残基23−33番(CDR−L1);配列番号332の残基49−55番(CDR−L2);配列番号332の残基88−96番(CDR−L3);
配列番号333の残基23−33番(CDR−L1);配列番号333の残基49−55番(CDR−L2);配列番号333の残基88−96番(CDR−L3)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項94に記載の結合タンパク質。 - 前記結合タンパク質が少なくとも3つのCDRを含む、請求項95に記載の結合タンパク質。
- 前記少なくとも3つのCDRが、
VH A10 CDR組
CDR−H1:配列番号112の残基31−35番
CDR−H2:配列番号112の残基50−66番
CDR−H3:配列番号112の残基99−108番
VL A10 CDR組
CDR−L1:配列番号113の残基23−33番
CDR−L2:配列番号113の残基49−55番
CDR−L3:配列番号113の残基88−96番
VH A10.3 CDR組
CDR−H1:配列番号316の残基31−35番
CDR−H2:配列番号316の残基50−66番
CDR−H3:配列番号316の残基99−108番
VL A10.3 CDR組
CDR−L1:配列番号327の残基23−33番
CDR−L2:配列番号327の残基49−55番
CDR−L3:配列番号327の残基88−96番
VH A10.K30 CDR組
CDR−H1:配列番号317の残基31−35番
CDR−H2:配列番号317の残基50−66番
CDR−H3:配列番号317の残基99−108番
VH A10.K42 CDR組
CDR−H1:配列番号318の残基31−35番
CDR−H2:配列番号318の残基50−66番
CDR−H3:配列番号318の残基99−108番
VH A10.9A CDR組
CDR−H1:配列番号319の残基31−35番
CDR−H2:配列番号319の残基50−66番
CDR−H3:配列番号319の残基99−108番
VH A10.8A CDR組
CDR−H1:配列番号320の残基31−35番
CDR−H2:配列番号320の残基50−66番
CDR−H3:配列番号320の残基99−108番
VH A10.1A CDR組
CDR−H1:配列番号321の残基31−35番
CDR−H2:配列番号321の残基50−66番
CDR−H3:配列番号321の残基99−108番
VH A10.5D CDR組
CDR−H1:配列番号322の残基31−35番
CDR−H2:配列番号322の残基50−66番
CDR−H3:配列番号322の残基99−108番
VH A10.3A CDR組
CDR−H1:配列番号323の残基31−35番
CDR−H2:配列番号323の残基50−66番
CDR−H3:配列番号323の残基99−108番
VL A10.3A CDR組
CDR−L1:配列番号330の残基23−33番
CDR−L2:配列番号330の残基49−55番
CDR−L3:配列番号330の残基88−96番
VH A10.6B CDR組
CDR−H1:配列番号324の残基31−35番
CDR−H2:配列番号324の残基50−66番
CDR−H3:配列番号324の残基99−108番
VL A10.6B CDR組
CDR−L1:配列番号331の残基23−33番
CDR−L2:配列番号331の残基49−55番
CDR−L3:配列番号331の残基88−96番
VH A10.3D CDR組
CDR−H1:配列番号325の残基31−35番
CDR−H2:配列番号325の残基50−66番
CDR−H3:配列番号325の残基99−108番
VL A10.3D CDR組
CDR−L1:配列番号332の残基23−33番
CDR−L2:配列番号332の残基49−55番
CDR−L3:配列番号332の残基88−96番
VH A10.4C CDR組
CDR−H1:配列番号326の残基31−35番
CDR−H2:配列番号326の残基50−66番
CDR−H3:配列番号326の残基99−108番
VL A10.4C CDR組
CDR−L1:配列番号333の残基23−33番
CDR−L2:配列番号333の残基49−55番
CDR−L3:配列番号333の残基88−96番
VL A10.L45 CDR組
CDR−L1:配列番号328の残基23−33番
CDR−L2:配列番号328の残基49−55番
CDR−L3:配列番号328の残基88−96番
VL A10.L73 CDR組
CDR−L1:配列番号329の残基23−33番
CDR−L2:配列番号329の残基49−55番
CDR−L3:配列番号329の残基88−96番からなる群から選択される可変ドメインCDR組を含む、請求項96に記載の結合タンパク質。 - 少なくとも2つの可変ドメインCDR組を含む、請求項97に記載の結合タンパク質。
- 前記少なくとも2つの可変ドメインCDR組が、
VH A10 CDR組およびVL A10 CDR組;
VH A10.3 CDR組およびVL A10.3 CDR組:
VH A10.3A CDR組およびVL A10.3A組;
VH A10.6B CDR組およびVL A10.6B組;
VH A10.3D CDR組およびVL A10.3D CDR組;
VH A10.4C CDR組およびVL A10.4C CDR組;
VH A10.K30 CDR組およびVL A10.3 CDR組;
VH A10.K42 CDR組およびVL A10.3 CDR組;
VH A10.3 CDR組およびVL A10.L45 CDR組;
VH A10.3 CDR組およびVL A10.L73 CDR組;
VH A10.9A CDR組およびVL A10.3 CDR組;
VH A10.8A CDR組およびVL A10.3 CDR組;
VH A10.1A CDR組およびVL A10.3 CDR組;および
VH A10.5D CDR組およびVL A10.3 CDR組からなる群から選択される、請求項98に記載の結合タンパク質。 - ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項94から99のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記ヒトアクセプターフレームワークが、
重鎖アクセプターフレームワーク配列、配列番号6から22
重鎖アクセプター配列、配列番号35から62
軽鎖アクセプター配列、配列番号23から34、および
軽鎖アクセプター配列、配列番号63から98
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項100に記載の結合タンパク質。 - 前記ヒトアクセプターフレームワークが少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、前記フレームワークのアミノ酸配列が前記ヒトアクセプターフレームワークの配列に少なくとも65%同一であり、前記ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも70アミノ酸残基を含む、請求項100または101に記載の結合タンパク質。
- 前記ヒトアクセプターフレームワークがキーとなる残基に少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、前記キーとなる残基が、
CDRに隣接する残基;
グリコシル化部位残基;
希少残基;
ヒトDLL4と相互作用をすることができる残基;
カノニカル残基;
重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の接触残基;
バーニヤゾーン内の残基;および
コチア定義された可変重鎖CDR1とカバット定義された第一の重鎖フレームワーク間を重複する領域における残基
からなる群から選択される、請求項101に記載の結合タンパク質。 - キーとなる残基が2H、4H、24H、26H、27H、29H、34H、35H、37H、39H、44H、45H、47H、48H、49H、50H、51H、58H、59H、60H、63H、67H、69H、71H、73H、76H、78H、91H、93H、94H、2L、4L、25L、29L、27bL、33L、34L、36L、38L、43L、44L、46L、47L、48L、49L、55L、58L、62L、64L、71L、87L、89L、90L、91L、94L、95Lからなる群から選択される、請求項103に記載の結合タンパク質。
- 結合タンパク質がコンセンサスヒト可変ドメインである、請求項104に記載の結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が
配列番号112、113、316、327、317、318、319、320、321、322、323、330、324、331、325、332、326、333、328および329
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの可変ドメインを含む、請求項94に記載の結合タンパク質。 - 前記結合タンパク質が2つの可変ドメインを含み、前記2つの可変ドメインが
配列番号112および113、配列番号316および327、配列番号323および330、配列番号324および331、配列番号325および332、および配列番号326および333
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項106に記載の結合タンパク質。 - 前記結合タンパク質が、
配列番号112、113、316、327、317、318、319、320、321、322、323、330、324、331、325、332、326、333、328および329
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの可変ドメインを含む、請求項104に記載の結合タンパク質。 - 前記抗原結合ドメインがVHを含む、請求項95に記載の結合タンパク質。
- 前記VHが、
配列番号112、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325および326
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項109に記載の結合タンパク質。 - 前記抗原結合ドメインがVLを含む、請求項95に記載の結合タンパク質。
- 前記VLが、
配列番号113、327、328、329、330、331、332および333
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項111に記載の結合タンパク質。 - 前記抗原結合ドメインがVHおよびVLを含む、請求項95に記載の結合タンパク質。
- VHをさらに含み、前記VHが、
配列番号112、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325および326
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項112に記載の結合タンパク質。 - 前記VLが、
配列番号113、327、328、329、330、331、332および333
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項20に記載の結合タンパク質。 - ヒトIgM定常ドメイン;ヒトIgG1定常ドメイン;ヒトIgG2定常ドメイン;ヒトIgG3定常ドメイン;ヒトIgG4定常ドメイン;ヒトIgE定常ドメインおよびヒトIgA定常ドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、請求項95に記載の結合タンパク質。
- 前記重鎖免疫グロブリン定常領域ドメインがヒトIgG1定常ドメインである、請求項117に記載の結合タンパク質。
- 前記ヒトIgG1定常ドメインが、配列番号2および配列番号3からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項117に記載の結合タンパク質。
- ヒトIgκ定常ドメインおよびヒトIgλ定常ドメインからなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、請求項95に記載の結合タンパク質。
- 前記軽鎖免疫グロブリン定常領域ドメインが、アミノ酸配列配列番号4を含むヒトIgκ定常ドメインである、請求項119に記載の結合タンパク質。
- 前記軽鎖免疫グロブリン定常領域ドメインが、アミノ酸配列配列番号5を含むヒトIgλ定常ドメインである、請求項119に記載の結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が、免疫グロブリン分子、scFv、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2;Fv、ジスルフィド連結Fv、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異的抗体、二特異的抗体および二重特異的抗体からなる群から選択される、請求項94に記載の結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質がヒト抗体である、請求項122に記載の結合タンパク質。
- 配列番号2および配列番号3からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg定常重領域;
配列番号4および配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg定常軽領域;
配列番号112、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325および326からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg可変重領域;および
配列番号113、327、328、329、330、331、332および333からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するIg可変軽領域
を含む、ヒトDLL−4に結合することができる結合タンパク質。 - Ig定常軽領域が配列番号5である、請求項124に記載の結合タンパク質。
- Notch−1、Notch−2、Notch−3、Notch−4およびこれらの組合せからなる群から選択されるNotchタンパク質とのDLL4相互作用をブロックすることができる、請求項94から125のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- Notch−1およびNotch−4とのDLL4相互作用をブロックすることができる、請求項126に記載の結合タンパク質。
- Notch−1とのDLL4相互作用をブロックすることができる、請求項126に記載の結合タンパク質。
- Notch−4とのDLL4相互作用をブロックすることができる、請求項126に記載の結合タンパク質。
- DLL4の生物学的機能を調節することができる、請求項94から125のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- DLL4を中和することができる、請求項94から125のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記DLL4が、ヒトDLL4、マウスDLL4、カニクイザルDLL4およびラットDLL4からなる群から選択される、請求項131に記載の中和結合タンパク質。
- 前記中和結合タンパク質が、DLL4のこの受容体に結合する能力を減少させる、請求項131に記載の中和結合タンパク質。
- 正常な血管新生を減少させることができる、請求項131に記載の中和結合タンパク質。
- 前記中和結合タンパク質が、最大で約10−7M;最大で約10−8M;最大で約10−9M;最大で約10−10M;最大で約10−11M;最大で約10−12M;および最大で約10−13Mからなる群から選択される解離定数(KD)を有する、請求項131に記載の中和結合タンパク質。
- 前記中和結合タンパク質が、少なくとも約102M−1s−1;少なくとも約103M−1s−1;少なくとも約104M−1s−1;少なくとも約105M−1s−1;および少なくとも約106M−1s−1からなる群から選択される結合速度を有する、請求項131に記載の中和結合タンパク質。
- 前記中和結合タンパク質が、最大で約10−3s−1;最大で約10−4s−1;最大で約10−5s−1;および最大で約10−6s−1からなる群から選択される解離速度を有する、請求項131に記載の中和結合タンパク質。
- 請求項94から137のいずれか一項に記載の結合タンパク質を含み、前記結合タンパク質が検出可能な標識にコンジュゲートされている標識結合タンパク質。
- 前記検出可能な標識が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識およびビオチンからなる群から選択される、請求項138に記載の標識結合タンパク質。
- 前記標識が、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Hoおよび153Smからなる群から選択される放射性標識である、請求項139に記載の標識結合タンパク質。
- リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、請求項94から137のいずれかに記載の結合タンパク質を含む抗体構築物。
- 免疫グロブリン分子、
モノクローナル抗体、
キメラ抗体、
CDR移植された抗体、
ヒト化抗体、
Fab、
Fab’、
F(ab’)2,
Fv、
ジスルフィド連結Fv、
scFv、
単一ドメイン抗体、
ダイアボディ、
多重特異的抗体、
二重特異的抗体、および
二特異的抗体
からなる群から選択される、請求項141に記載の抗体構築物。 - ヒトIgM定常ドメイン、
ヒトIgG1定常ドメイン、
ヒトIgG2定常ドメイン、
ヒトIgG3定常ドメイン、
ヒトIgG4定常ドメイン、
ヒトIgE定常ドメイン、
ヒトIgA定常ドメイン、
およびFc新生児受容体、Fcガンマ受容体またはClqに対する結合強度を変える1つまたは複数の変異を有するIgG定常ドメインバリアント
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項141に記載の抗体構築物。 - 配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項141に記載の抗体構築物。
- 請求項141に記載される抗体構築物を含み、前記抗体構築物が治療薬または細胞傷害性薬にコンジュゲートされている、抗体コンジュゲート。
- 前記治療剤または細胞毒性剤が、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、血管新生阻害剤、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、毒素およびアポトーシス剤からなる群から選択される、請求項145に記載の抗体コンジュゲート。
- 請求項94に記載されるCDR−H1、CDR−H2もしくはCDR−H3のうちの1つもしくは複数を含む重鎖可変ドメインを含むポリペプチド、請求項94に記載されるCDR−L1、CDR−L2もしくはCDR−L3のうちの1つもしくは複数を含む軽鎖可変ドメインを含むポリペプチド、または両ポリペプチドの組合せからなる群から選択される、ポリペプチドをコードする単離された核酸。
- 請求項147に記載の単離された核酸を含むベクター。
- 前記ベクターが、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、PhybEおよびpBJからなる群から選択される、請求項148に記載のベクター。
- 請求項148または149のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が原核細胞である、請求項150に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がエシェリキアコリである、請求項151に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が真核細胞である、請求項152に記載の宿主細胞。
- 前記真核細胞が、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される、請求項153に記載の宿主細胞。
- 前記真核細胞が、哺乳動物細胞、鳥類細胞および昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である、請求項154に記載の宿主細胞。
- 前記哺乳動物細胞がCHO細胞である、請求項155に記載の宿主細胞。
- 前記哺乳動物細胞がCOS細胞である、請求項155に記載の宿主細胞。
- 前記真菌細胞がサッカロミセス・セレビシエである、請求項154に記載の宿主細胞。
- 前記昆虫細胞がSf9細胞である、請求項155に記載の宿主細胞。
- ヒトDLL4に結合する結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、培地において請求項150から159のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、ヒトDLL4に結合する結合タンパク質を作製する方法。
- 請求項160に記載の方法に従って作製される結合タンパク質。
- 請求項94から137のいずれか一項に記載の結合タンパク質を含み、前記結合タンパク質が結晶として存在する、結晶化された結合タンパク質。
- 前記結晶が無担体医薬徐放結晶である、請求項162に記載の結晶化された結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が、前記結合タンパク質の可溶性相当物よりもインビボにおいて大きな半減期を有する、請求項162に記載の結晶化された結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が生物学的活性を保持している、請求項162に記載の結晶化された結合タンパク質。
- (a)請求項162から165のいずれか一項に記載の結晶化された結合タンパク質および成分を含む製剤、ならびに
(b)少なくとも1つのポリマー担体
を含む、結合タンパク質を放出するための組成物。 - 前記ポリマー担体が、ポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリル酸)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)またはPLGA、ポリ(b−ヒドロキシブチラート)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、ポリ[(オルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギナート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫酸ポリサッカライド、これらの混合物およびコポリマーからなる群のうちの1つまたは複数から選択されるポリマーである、請求項166に記載の組成物。
- 前記成分が、アルブミン、ショ糖、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項166に記載の組成物。
- 請求項166に記載の組成物の有効量を哺乳動物に投与する工程を含む哺乳動物を治療するための方法。
- 請求項94から137のいずれか一項に記載の結合タンパク質および医薬として許容される担体を含む、医薬組成物。
- DLL4活性が有害である障害を治療するための少なくとも1つの追加の治療剤をさらに含む、請求項170に記載の医薬組成物。
- 前記追加の成分が、血管新生阻害剤;キナーゼ阻害剤;同時刺激分子遮断剤;接着分子遮断剤;抗サイトカイン抗体またはその機能的断片;メトトレキサート;コルチコステロイド;シクロスポリン;ラパマイシン;FK506および非ステロイド抗炎症剤からなる群から選択される、請求項172に記載の医薬組成物。
- ヒトDLL4活性が減少するようにヒトDLL4を請求項94から137のいずれか一項に記載の結合タンパク質と接触させることを含む、ヒトDLL4活性を減少させるための方法。
- ヒト対象におけるヒトIL−17活性が減少するように請求項94から137のいずれか一項に記載の結合タンパク質をヒト対象に投与することを含む、DLL4活性が有害である障害に罹っているヒト対象においてヒトDLL4活性を減少させるための方法。
- 治療が達成されるように請求項94から137のいずれか一項に記載の結合タンパク質を対象に投与することによりDLL4活性が有害である疾患または障害について対象を治療するための方法。
- 前記障害が、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、尿路癌、女性生殖路癌、男性生殖路癌、内分泌腺癌、皮膚癌、血管腫、悪性黒色腫、肉腫、脳腫瘍、神経癌、眼腫瘍、髄膜癌、造血性悪性病変から生じる固形腫瘍、腫瘍転移、目の血管新生、浮腫、関節リウマチ、多発性硬化症、動脈硬化プラーク、クローン病、炎症性腸疾患、難治性腹水症、乾癬、サルコイドーシス、動脈硬化症、敗血症、消化性潰瘍、火傷、および膵炎、多嚢胞性卵巣疾患(POD)、子宮内膜症、子宮筋腫、良性前立腺肥大症ならびに異常なDLL4活性により特徴付けられる他の血管新生非依存性および依存性疾患からなる群から選択される、請求項176に記載の方法。
- 障害が原発性および転移性癌である、請求項177に記載の方法。
- 尿路癌が、腎臓癌、膀胱癌および尿路上皮癌からなる群から選択される、請求項177に記載の方法。
- 女性生殖路癌が、子宮頚部癌、子宮癌、卵巣癌、絨毛癌および妊娠性絨毛性疾患からなる群から選択される、請求項177に記載の方法。
- 男性生殖路癌が、前立腺癌、精嚢癌、精巣癌および生殖細胞腫瘍からなる群から選択される、請求項177に記載の方法。
- 内分泌腺癌が、甲状腺癌、副腎癌および下垂体癌からなる群から選択される、請求項177に記載の方法。
- 肉腫が、骨肉腫、軟部組織肉腫およびカポジ肉腫からなる群から選択される、請求項177に記載の方法。
- 髄膜癌が、星状膠細胞腫、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン細胞腫および髄膜腫からなる群から選択される、請求項177に記載の方法。
- 造血性悪性病変から生じる固形腫瘍が、白血病、ホジキン白血病、非ホジキン白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫である、請求項177に記載の方法。
- 目の血管新生が、糖尿病性失明、網膜症、年齢誘発性黄斑変性症および虹彩血管新生からなる群から選択される、請求項177に記載の方法。
- ヒトVEGFR2に結合することができる抗体またはこの断片;メトトレキサート;ヒトTNFに結合することができる抗体またはこの断片;コルチコステロイド、シクロスポリン;ラパマイシン;FK506;および非ステロイド系抗炎症薬からなる群から選択される第二の作用物質の投与前に、同時にまたは後に、請求項94から137のいずれか一項に記載の結合タンパク質を投与するステップを含む、DLL4が有害である障害に罹っている患者を治療する方法。
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CELL STEM CELL, vol. Vol.5,p.168-177, JPN6014046371, 7 August 2009 (2009-08-07), ISSN: 0003265566 * |
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