JP2013155187A - 不純物を含有する混合物から得た生体分子の精製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】所定条件下の混合物を提供すること、前記所定条件下に前記混合物に可溶であり且つ前記生体分子に可逆的及び選択的に結合可能な1つ以上のポリマーを添加すること、可溶化した前記1つ以上のポリマーを前記混合物全体に混入させること、前記混合物における前記所定条件を変化させることにより、前記1つ以上のポリマー及び結合した生体分子を溶液から析出物として析出させること、前記析出物を洗浄液と接触させて洗浄すると共に上澄み液を第1膜を通して濾過すること、結合した生体分子を前記ポリマーから回収すると共に、外生体分子を第2膜を通して濾過すること、を含む方法。
【選択図】図1
Description
本発明は不純物を含有する混合物から得た生体分子の精製方法に関する。
て通常のプロセス状況下では正電荷(pH値がタンパク質のPI以下)を持つため、第2カラム中で陽イオン交換レジンに結合する。正電荷を持つその他不純物もこのレジンに結合する。次いで関心タンパク質を、タンパク質が溶出し、その間、不純物がレジンに結合し続ける状況下(pH、塩濃度)に第1カラムから溶出させて回収する。陰イオン交換カラムは代表的には、負電荷を持つ不純物がレジンに結合し、その間、正電荷を持つ関心タンパク質がストリーム流れ状態下に回収されるような流通モード下に動作する。このプロセスにより、高度に精製され且つ濃縮されたタンパク溶液が得られる。
あるいは、未浄化細胞培養液に可溶性ポリマー電解質を加え、関心生体分子を捕捉及び凝集物形成させ、この凝集物を沈殿させて残余の溶液から分離させる。凝集物に緩く接着している不純物を代表的には洗浄により除去する。次いで、溶液のイオン強度が増大してポリマー電解質から標的タンパク質が解離され、ポリマー電解質はタンパク質含有溶液中に再溶解する。
より本願明細書の一部とする米国特許出願第12/004,314号では、温度、pH、
塩、光またはそれらの組み合わせ等のある種条件下に溶解するポリマーを用い、当該ポリマーの溶解状態下に不純物を結合させ、条件(pHまたは温度等の)を変化させてポリマーを析出させ、かくして前記結合させた不純物を除去する。次いで、伝統的なクロマトグラフィーまたは膜吸着その他を利用して関心生体分子を取り扱う。
誘導磁性粒子を使用する現場製品回収法はタンパク質精製法の1例であるが、この方法では関心生体分子を未浄化細胞培養液から直接的に精製させ得る。
この方法の欠点は、設計、構造、並びに高勾配磁気分離の検証に相当の設備投資を要することである。しかもこの方法は、今後、バイオプロセス業界でのタンパク質精製の規準になると見込まれる使い捨て性用途には向かない。
、“Purification of Proteins”と題する、Moya, Wilson他の、Attorney Docket No.MCA−1046である部分継続出願には、不溶性粒子や可溶性不純物の一部に実質上不可逆的に結合し得、また未浄化の生物学的材料を含有する流れ内の1つ以上の所望の生体分子と可逆的に結合し得る可溶性ポリマーとしてのポリマーと、それら材料を利用して、事前浄化の必要無しにその流れから1つ以上の所望の生体分子を浄化する方法と、が開示される。詳しくは、前記部分継続出願には、未浄化生体分子材料を含有する流れ中の1つ以上の所望の生体分子に選択的且つ可逆的に結合し得る選択的可溶性ポリマー等の刺激応答性ポリマーと、それらポリマーを利用して、流れを事前浄化する必要無しに、単数または複数の関心生体分子及び、その他タンパク質(宿主タンパク質)、DNA、ウィルス、細胞全体、細胞破片その他の種
々の不純物を含む材料の複雑な混合物から1つ以上の所望の生体分子を精製する方法とが開示される。
然し乍ら、析出物は典型的には大きなスラッジ塊形態であるため、その除去が問題となる。
され、スタンド4が、数本の脚(本実施例では3本であるが、連続する1本の脚、2本または3本以上の脚をも使用できる)6及び支持リム8を含んでいる。図示の如く、脚6はバイオリアクター2を充填し且つスタンド4内に位置付けた場合に脚6が開かないようにする支持部材10をベース部位置又はその付近に随意的に有し得る。
細胞、プローブその他のバイオリアクターの各装置を少なくとも部分的に格納する内側空間を有している。胴部22は頂部16にシール自在に装着される。前記シールは、ラバーガスケット及びクリップ24(図示の如き)等のメカニカルシールまたは、バンドクランプまたはLadishまたはTriCloverクランプ等のクランプ、頂部16及び胴
部22の合致するねじ溝、であり得る。あるいは頂部及び胴部は接着剤により、または頂部16を胴部22に熱シールして、または、回転成型装置内等で相互にワンピース形成してシールし得る。
胴部22は成型プラスチックまたはガラスの単一部品として作製することが好ましい。あるいは胴部22は、熱、接着剤、またはガスケット(図示せず)で相互にシールした2つ以上のプラスチックまたはガラス部品として作製し得る。頂部及び胴部形成用に使用し得る好適なポリマーには、これに限定しないが、ポリカーボネート、ポリエステル、ナイロン、PTFEレジン、及びその他のフルオロポリマー、アクリリック及びメタアクリリ
ックレジン及びそのコポリマー、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリルスル
ホン、ポリスチレン、ポリエーテルイミド、ナイロン、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリビニルクロリド、クロリネーテッドポリビニルクロリド、ABS及びその合金及び混合物、ポリオレフィン、好ましくは、直鎖状低密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、及び超ポリマー重量ポリエチレン及びそのコポリマー、ポリプロピレン及びそのコポリマー、及び、メタロセン発生ポリオレフィン、が含まれる。好ましいポリマーは、ポリオレフィン、特にはポリエチレン及びそのコポリマー、ポリスチレン、及びポリカーボネート、である。頂部及び胴部は同一ポリマーまたは、所望であれば異なるポリマーから作製し得る。再使用性の実施例では、胴部をガラス、アクリリックあるいはその他の、プロセス上悪影響を及ぼさない材料から作製得る。斯界に既知の如く、胴部22もまた廃棄性のプラスチック製袋であり得る。
ート32(本実施例では、全体合計で7つのポート用の、少なくとも2つの異なる形式のポート32a〜32b)が形成される。頂部16及び胴部22は、バイオリアクター2全体の所望の位置に所望形式の多数のポートの1つを提供する、類似の及びまたは異なる様式の多数のポートを有し得る。これらのポート30、32または少なくともそれらの一部は、頂部16及び胴部22の部分として形成される。各ポートには、閉キャップ、ガスケット内部に貫通穿孔を有するガスケットキャップ等のシール自在のカバー、または、種々のルアーフィッティングと合致するねじ溝を形成し得る。あるいは前記各ポートの1つ以上を、プラスチック製の頂部16及びまたは胴部22を穿孔または焼除して穴を形成し、次いでこの穴を貫いてまたはその周囲にポートを然るべく取り付ける(熱接着または接着剤で)ことで、プラスチック製の頂部16及びまたは胴部22内に作製し得る。異なる数多くのポートスタイル及びサイズが収受され得る。
所望であれば、図1の1つ以上のポート32aまたは32bを用いて胴部内にガスを提供させ得る。POREX(商標名)多孔質材料等のプラスチック製のフリット、微孔質膜またはセラミックストーンまたは燒結金属フィルタを胴部内でポートの内側に装着し、かくして所望サイズ化したガス泡沫を提供させ得る。あるいは、頂部16のポート30aを用いて、胴部内を下方に伸延するガス供給管を保持させ得る。この場合でも、胴部内でポートの内側にフリット、微孔質膜またはセラミックストーンまたは燒結金属フィルタを装着し、所望サイズ化したガス泡沫を提供させ得る。あるいは、攪拌用アセンブリ内の多孔質フィルタ/膜110を通して胴部内にガスを提供させ、このガスをポート32bを通して提供させ得る。
他42から構成される。軸40はポート30cを貫いて伸延し、駆動機構12(図示せず)の軸20に連結する。軸40の動作が、ポート30c内の1つ以上のO−リングにより、胴部22内部のシールの一体性を損なうことなく許容されることが好ましい。あるいは、膜またはフィルタ表面位置に超音波または振動を差し向けることで詰まり防止用の“攪拌”を生じさせ、かくしてフィルタ表面上への固形物集積を防止させ得る。フィルタ/膜
の詰まり防止用のその他方法は、固形物に付着するガス泡沫を誘起させて固形物を液相上部に浮遊せしめるものがある。
またはその他を形成した支持表面101を含んでいる。図示される溝102の同心円的形態は好ましいものであるがこれに限定されるものではない。溝102は孔103と流体連通され、孔103は結局、ポート32bと流体連通してフィルタベース部100から流体
を排出させる。
以上の膜の1つが比較的粗いフィルタまたは膜であることが好ましい。粗いフィルタまたは膜を初期濾過ステップに用いることで、引き続く下流側での、0.2ミクロン殺菌等級膜(以下に詳しく説明される)等の一般にずっと高価な微細膜が保護され且つその使用寿命が延長される。好適な膜には、これに限定しないが、超ポリマー重量ポリエチレンを含むポリエチレン、ポリプロピレン、EVAコポリマー及びアルファオレフィン、メタロセンオレフィニックポリマー、PFA、MFA、PTFE、ポリカーボネート、PVC等のビニルコポリマー、ナイロン等のポリアミド、ポリエステル、セルロース、セルロースアセテート、再生セルロース、セルロース複合物、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリルスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニリデンフロリド(PVDF)、及びそれらの混合物が含まれる。
膜あるいはその他としてのフィルタは、マサチューセッツ州ビレリカのMillipore社から入手可能DURAPORE(商標名)PVDF膜における如く、その深さ方向全体において孔寸法が対称性を有し得、または、同社より入手可能なMILLIPORE EXPRESS(商標名)及びMILLIPORE EXPRESS(商標名)PLUSまたはSH PES膜における如くその厚さ方向を通して孔寸法が非対称性を有し得る。フィルタは所望であれば、別個の上流側の層としてか、または膜自体の上流側の一体部分としてのプレフィルタ層を含み得る。
バイオリアクターの、円筒管の如き胴部22が、図5に示す如く、フィルタベース部100とシール関係下に配置される。フィルタベース部100から下方に伸延してフィルタ
ベース部100を支持する複数の脚部6’を設け得る。
ス部100とがシール関係下に固着され得るよう、O−リング106’を含むことが好ましい。フィルタベース部100’から下方に伸延してアセンブリを支持する複数の脚部6”を設けることが好ましい。フィルタベース部100’がバイオリアクターアセンブリと一体化され、サンプル処理及び直接精製用のワンピース型反応器アセンブリを構成するの
が好ましいが、ある実施例では、この引き続く精製ステップをバイオリアクターの胴部22から物理的に離間した(随意的には流体連通するが)フィルタを使用して実施し得る。
他の実施例では、胴部22’の出口がフィルタベース部100の出口としてのポート3
2と流体連通されるが、胴部22’にはフィルタまたは膜は格納されない。それらに代え
て、出口としてのポート32’が、図示されない管またはその他導管を介して、関心生体
分子を殺菌濾過するところのMillex(商標名)フィルタまたはOptiscale(商標名)またOpticap(商標名)フィルタ等の内蔵型フィルタ装置(図示せず)と流体連通する。このフィルタ装置の出口は、爾後精製ステップ(例えば、クロマトグラフィープロセストレイン)等の好適使用ポイントに接続される。
作動に際し、スタンド内に殺菌装置を配置し、この装置の適宜の各ポート位置に空気、液体、プローブ、サンプリング、等に使用する種々の連結部を装着する。装置の、頂部16を胴部22に装着する位置よりも幾分下方で且つ、液体/空気界面を形成する所望の高さまで媒体を充填し、この種の装置に一般的なガスのヘッドスペースを残す。ポート32の少なくとも一つは前記界面高さ以下に位置付けられる。
の培養物を効果的に成長させる様式下に液体を旋回または攪拌して空気/ガス及び液体を装置の内外方向に移動させる。
特定のプロセス条件設定下に可溶性となるポリマーを追加し、条件(例えば、温度、塩濃度、光、電界、またはpH)の変化に際して不溶化させて溶液から析出させる。あるいは、関心生体分子または可溶性不純物に結合させるための、生体分子を精製させ得る任意のリガンドまたは機能を持つアフィニティまたは単数または複数のイオン交換ビードを添加し得る。攪拌を継続して固形物の沈降を抑制するが、前記固形物は本実施例では、ポリマー、細胞や細胞破片、宿主細胞タンパク質、DNA等、及び所望の生体分子、等の不純物を含有する析出物が含まれ、液体中のまたはポリマーナイム他はポリマー上に取り込まれた不純物が確実に除去されるよう1回以上(好適なバッファを使用する等により)洗浄され得る。1回または複数回の洗浄ステップは、フィルタベース部100内の1つ以上の膜を通す濾過により実施され得、上澄み液がポート32bを介して送られて廃棄される。
4 スタンド
8 支持リム
10 支持部材
12 駆動機構
14 攪拌用アセンブリ
16 頂部
18 アーム
20 軸
22、22’ 胴部
24 クリップ
26 側壁
30a ポート
30b ポート
30c ポート
32a ポート
32b ポート
40 軸
42 パドル
50 入口
51 配管
100、100’ フィルタベース部
101 支持表面
102 溝
103 孔
106 O−リング
107 支持リング
110 多孔質フィルタ/膜
Claims (4)
- 不純物を含有する混合物から得た生体分子の精製方法であって、
所定条件下の混合物を提供すること、
前記所定条件下に前記混合物に可溶であり且つ前記生体分子に可逆的及び選択的に結合可能な1つ以上のポリマーを添加すること、
可溶化した前記1つ以上のポリマーを前記混合物全体に混入させること、
前記混合物における前記所定条件を変化させることにより、前記1つ以上のポリマー及び結合した生体分子を溶液から析出物として析出させること、
前記析出物を洗浄液と接触させて洗浄すると共に上澄み液を第1膜を通して濾過すること、
結合した生体分子を前記ポリマーから回収すると共に、外生体分子を第2膜を通して濾過すること、
を含む方法。 - 前記上澄み液の濾過及び前記生体分子の濾過が同一装置で実施される請求項1に記載の方法。
- 前記生体分子が、遺伝子組み換え抗体、遺伝子組み換えモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、ヒト化抗体、抗体断片、からなる群から選択した抗体である請求項1に記載の方法。
- 前記生体分子がタンパク質である請求項1に記載の方法。
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