JPH11505714A - 濾過及び培養の方法並びに装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 試料から微生物を濾過し、微生物を培養する方法及び装置は、フィルタホルダ(10)内に濾過膜(30)を備える。そのホルダ内で、濾過膜は吸収性支持材(26)上に支持され、その吸収性支持材は、濾過膜に対して膨張可能に押圧された状態で保持される。その結果、試料により濾過膜が湿潤性を帯びると、濾過膜の膨張は、気泡を捕獲した支持材から濾過膜の気泡発生を生じさせることがなく、これにより支持材に供給された栄養素の供給が濾過膜上の微生物に到達することを防止する。

Description

【発明の詳細な説明】 濾過及び培養の方法並びに装置 本発明は、試料から微生物を濾過し、濾過で使用されたフィルタ上でイン シ トゥー（in situ）で微生物を培養する方法及び装置に関する。 ＥＰ0150775に議論されているように、多孔性ホルダ上に配置された無菌膜に よって試料を膜濾過することにより、培養のために微生物を捕獲することが知ら れている。濾過の後、膜を除去し、ペトリ皿内に入れられたゼラチン状の培地上 に置く。それから、ペトリ皿を適当な温度で、微生物が十分に成長及び繁殖して 、それらを肉眼で識別し、計数できるようなコロニーを形成するのに必要な時間 インキュベートする。 微生物は膜上に集中するので、多少汚染された試料でさえも評価することがで き、十分な数の微生物を収集するためにかなりの量の試料を濾過することができ る。しかし、この方法で生じる欠点は、寒天培地の局部でコロニーの栄養素が欠 乏し、膜上に多くの細菌が存在する状況では、その欠乏により個々のコロニーの 成長が抑圧されることがあることである。また、濾過膜を培地上に配置する際に 、培地と膜との間に気泡が入り込むことを避けるように注意を払わなければなら ない。気泡が入り込むことは、培地と膜の表面の一部とが接触することを妨げ、 それにより培地の拡散を妨害し、微生物の成長を抑制する。 代替的手法においては、濾過された細菌を含む膜をフィルタの紙芯上に配置し て栄養素の培地を膜へ通じさせることが提案されている。しかし、紙芯に加える 培地の量は、濾過膜が湿りすぎて、個々 のコロニーの成長ではなく集密的成長が観察されることが無いようにするために 注意深く制御しなければならない。 また、これらの手法は一般的に、濾過装置から培養操作への膜の移送を伴い、 この追加のステップは、膜が大気にさらされる時に汚染物を混入させる可能性を 有する。また、これは、試料が試料採取場所から研究室へ移されるまで培養を開 始できないことを意味し、それは数時間の期間を必要とする。 ＥＰ-Ｂ-0150775 に更に記載されるように、相互に入れ子になった循環要素及 び着脱可能なカバーを有する無菌ボックスからなる装置を使用して、これらの不 便さの幾つかを改善することが提案されている。そのボックスはホルダの両端に 配置された入口及び出口を有し、それらの上に吸収性パッド及び濾過膜が循環要 素の一つによりホルダの周囲にクランプされて配置される。濾過の後、一般には 濾過操作と逆に、培地を出口を通じて導入して吸収性パッドに染み込ませる。そ のボックスをインキュベータ内に配置して、収集された微生物の成長を可能とす る。これにより、濾過後培養前のあらゆる移送操作を回避することができ、液体 が収集される場所で試料を直接的に取得することが可能となる。しかし、ＥＰ- Ｂ-0150775 で述べられているように、この方法は依然として重大な欠点を有す る。特に、膜が湿っている時には膜の直径は増加し、周囲において無菌ボックス にクランプされた膜及び吸収性パッドは使用前には乾燥状態に維持されるので、 試料の濾過の際にパッド及び膜の湿潤により膜が吸収性パッドから分離する。こ れは、膜と、培地を染み込ませたパッドとの間の接触を妨げ、それによりインキ ュベーション時の微生物の成長を阻害する。 ＥＰ-Ｂ-0150775 はこの問題に対する精巧な解決策を提案し、それは筒状のホ ルダに渡り濾過膜を密閉し、膜がカップ内のゲル化した 栄養素培地の表面に結合する以前に、ホルダを空気により加圧してその膜を外側 へ膨張させることを含む。これは、それに伴う操作中に、システムの汚染の危険 性を再度導入する。栄養素培地と濾過膜との界面におけるあらゆる微生物汚染は 、濾過膜の逆側面上の微生物の成長を妨げる可能性が高い。さらに、ＥＰ-Ｂ-01 50775 に示される装置は過度に精巧であり、製造及び使用が煩雑である。 我々は、ＥＰ-Ｂ-0150775 に概略化された問題が、それに先行する従来技術に 内在する欠点を再度導入することなく、実質的により単純な解決策と成り得るこ とを認識した。 従って、本発明は試料から微生物を濾過し、微生物を培養する方法であって、 微生物を含む試料を、フィルタホルダ内で吸収性支持材上に支持された濾過膜に 通す工程と、次に、培地を吸収性支持材により吸収することにより、フィルタホ ルダ内の濾過膜上の微生物に培地を供給する工程と、を備え、前記吸収性支持材 は、濾過膜に対して、膨張可能な圧縮状態で保持される方法を提供する。 濾過膜に対して吸収性支持材が加圧されることにより、濾過膜の膨張が生じた 場合に、吸収性支持材が膨張し、濾過膜との接触を維持することができることに より、濾過膜が吸収性支持材から膨張して離れようとする傾向を抑制することが できる。 従って、濾過作業後に濾過膜を吸収性支持材から除去する必要が無く、且つ、 濾過膜の面を栄養素培地のゲルに一致させる必要が無い。代わりに、無菌の栄養 素培地をフィルタホルダ内の圧縮された吸収性支持材に直接適用することができ る。 吸収性支持材は、好ましくは網状のフォームとする。ポリエーテル、ポリエス テル、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタンなどの様々なプラスチッ ク材料から作られる適当なポリマーフォームを使用することができる。好ましい ポリマーフォームは、５０ から２００ｐｐｉ（１インチ当りの孔数）（１センチメートル当り２０から８０ の孔と同等）、例えば、１００ｐｐｉ（１センチメートル当り４０個の孔と同等 ）である。 好適には、吸収性支持材は、そのような網状フォームのブロックの形状を有し 、自由な非圧縮状態の厚さが０．５から３ｃｍ、例えば１ｃｍであり、濾過膜が 直接的に、若しくはより好適には、フィルタ紙の如き芯材料の層を濾過膜と吸収 性支持材との間に有して配置されるべき主要な面を提供する。 好ましくは、吸収性支持材は、その自由な非圧縮状態の厚さの７／８から１／ １０の厚さに圧縮される。圧縮の程度は、吸収性支持材の全体領域に渡って均一 であることは必要とされない。例えば、実際に吸収性支持材の端部に圧縮が加え られれば、吸収性支持材の中央部における圧縮はかなり小さくても良い。 好ましくは、濾過膜と網状の吸収性支持材との間に、中間圧縮拡張支持層を設 け、濾過膜のアセンブリの端部、圧縮拡張層及び網状フォームの吸収性支持材に 加えられた圧縮力を伝達し、それにより、アセンブリの中央部をも圧縮状態とす る。そのような膨張拡張層は、フィルタ紙のシートにより便利に設けることがで きる。他の好適な材料を使用することもできる。それらは、好ましくは可撓性及 び多孔性を有する。また、その圧縮拡張材料は好ましくは、培地を吸収性支持材 から引き出し、それを濾過膜に供給する芯として機能することができる。それは 、濾過膜の膨張と適合するために吸収性支持材が膨張することを妨げるべきでは ない。湿潤性を有する時、それは濾過膜と同程度に膨張するように選択される。 濾過されるべき液体試料は、濾過膜上方の試料チャンバ内に入れられ、真空ポ ンプ又は注入器などの適当な手段により濾過膜を通じて吸い出すことができる。 濾過された液体は、フィルタホルダの出 口を通じて引き出される。好ましくは、培地はこの同一の出口を通じて濾過膜の ための吸収性支持材へ供給される。これを容易にするため、本装置はこの段階で 逆さにされる。好ましくは、培地は最初は密閉された容器内に含められ、培地は その容器内で無菌状態で維持され、培地の容器は、培地を吸収性支持材へ解放す るためにシールを破る前にフィルタホルダの出口に連結される。 本発明は、微生物を濾過し、培養する装置であって、濾過されるべき流体の流 路を規定するフィルタホルダと、流路中に配置され、吸収性支持材上に支持され る濾過膜と、吸収性支持材を前記濾過膜に対して圧縮する手段と、を有するフィ ルタ部材と、を備える装置を提供する。 好ましくは、フィルタホルダは着脱可能にはめ込まれる第１及び第２の部分を 有し、前記第１の部分は、濾過された流体の出口に通じる床部と、周囲壁とを有 し、前記濾過膜及び前記吸収性支持材は、前記濾過膜が前記床部から遠い側にな るようにして前記床部上の前記第１の部分内に収容され、前記フィルタホルダの 前記第２の部分は、前記第１の部分内に収容される部分を有し、前記濾過膜及び 前記吸収性支持材を前記床部に対して押圧する。 フィルタホルダの第１の部分の床部の出口は、濾過膜の吸収性支持材の下方に ある多孔性支持面により架橋することができる。 好適には、フィルタホルダの第１の部分の床部の出口は、標準的な注入器取付 具により注入器と連結されるように適合される。 本装置はさらに、上述の装置と、無菌容器と、前記吸収性支持材上に導入され る液体培地とを含む培養キットを含む。 好ましくは、前記培地の容器は、フィルタホルダの第１の部分の出口と一致し 、そこを通じて培地を吸収性支持材へ導入することを可能とする。 好ましくは、フィルタホルダの第１の部分の出口に、培地の容器とフィルタホ ルダとの連結が確立した後に培地の容器のシールと協働して前記シールを破り、 培地を解放する手段を設ける。 添付図面を参照して本発明を更に説明及び図示する。 図１は、本発明による装置の概略的垂直断面図である。 図２は、試料の濾過中に使用する装置の図１と同様の図である。 図３は、培地をその内部の吸収性支持材に導入する際の装置の同様の図である 。 図４は、本発明による第２実施形態を示す斜視図であり、装置の本体及びふた 部が分離されている。 図５は、本体とふた部を直径上で切断した同様の図である。 図１に示すように、本発明による典型的な装置は、第１の部分１２と、それに はめ込まれる第２の部分１４とを有するフィルタホルダ１０を備える。好ましく は両者は、図面の面と交差する円形断面を有する。第１の部分１２はトレーの形 態であり、ベース部の中央に設けられた出口１６、及び直立した周囲壁２２を有 し、その周囲壁２２内にＯ型リングシール１８により密閉されて円筒状の第２の 部分１４を収容する。第２の部分１４にはふた２０が設けられる。 フィルタホルダ内には、プラスチック性スクリム２４の如き支持材の第１層が 配置される。その代わりに、多孔性プラスチックプラグ又はスパイダなどの出口 １６内に配置された支持材により出口１６の首部を架橋することができる。支持 スクリム２４の上には、網状の吸収性フォーム２６があり、それは以下に説明す るように濾過膜の支持材として機能する。網状の吸収性フォーム２６上にはフィ ルタ紙２８の層があり、その上には濾過膜３０自身がある。網状フォーム２６、 フィルタ紙芯２８及び濾過膜３０のアセンブリは、フィルタホルダ１０の第２の 部分１４の底端部により圧縮される。網 状フォームパッドは、例えば１ｃｍの非圧縮時の厚さを有し、アセンブリの端部 において例えば３ｍｍまで圧縮される。圧縮は、主として濾過膜により、またフ ィルタ紙層２８により網状フォームパッドの中央まで広がり、それにより中央部 では圧縮は典型的にはその端部より幾らか少なく、例えば５ｍｍまでである。加 えられる圧縮量は一般的には重大ではない。幾らかの圧縮が存在すれば、使用中 に濾過膜の膨張があると、フォームパッド２６は膨張してそれを収容し、フィル タ紙２８と濾過膜３０の間の接触を維持することができる。 完全性のため、図１はまた、概略的に３６で示す適当なコネクタにより出口１ ６に取り付けられた液体培地３４のバルブの形態の容器３２の存在を示す。しか し、使用時には、通常この段階ではバルブ３２はフィルタホルダ１０には取り付 けされない。培地を含む可撓性バルブの代わりに、密閉されたアンプル又は閉鎖 された注入器を適当に使用することができる。しかし、好ましくは、どのような 形態を使用しても、容器はシール３８により密閉され、そのシール３８は容器が 密閉状態で出口１６に連結された後は破れやすいものとする。容器３２が可撓性 バルブである場合、シールは、バルブに外部圧力を加えることにより簡単に破裂 するように適合される。その代わりに、出口１６とコネクタ３６との間の連結は 、連結が完全に行われると機械的手段がシール３８に穴を開けるように設計する ことができる。このために、例えば差込タイプのロックを容器３２と出口１６と の間に設け、その２つが係合した後に容器をフィルタホルダ１０へ向けて押し、 コネクタ内に配置されたピンその他の穴あけ部材によりシール３８を破裂させる ような位置まで容器を回転することができるようにする。 図１の装置の使用が図２及び３に示される。第１段階において、 液体試料４０をフィルタホルダ１０内に導入し、ふた２０を付けて大気中の汚染 物を防止する。注入器４２を使用して、液体試料をフィルタアセンブリ２６、２ ８、３０を通過するように吸い込み、液体試料中の微生物を濾過膜３０の上面に 堆積させる。それから、図３に示すように装置を逆さにし、培地の容器３２を配 置し、そのシール３８を破裂させて培地３４を吸収剤フォーム２６上に解放し、 その吸収剤フォーム２６から紙層２８のウィッキング（wicking）作用（毛管作 用）により培地を濾過膜３０へ供給する。 それから、微生物を成長させる適当な温度で本装置をインキュベートする。 上述の装置は単純な構成であり、野外で使用することができる。例えば、河川 、貯水池、貯蔵タンクその他のソースから採取された水の試料をフィルタホルダ １０内に直接入れ、試料採取の際に濾過することができる。培地を直ぐに加える ことができ、培養プロセスを開始することができる。試料のその後の作業を行う 研究室に試料を戻すのには数時間がかかるが、その輸送時間は無駄にはならない 。むしろ、その時間は微生物の培養のために使用される。 図４及び５に示す代替的実施形態（明瞭のため幾つかの点は省略）は、形態上 は異なるが機能上は同様である。それは、ふた部１１４と本体部１１２を有する フィルタホルダ１００を備える。本体部１１２は円形基板５０を有する樹脂一体 モールドであり、その基板５０からはウェルを規定する略円形の壁部５２が直立 している。略円形のフランジ５４がウェルの頂部から半径方向外側へ延び、そこ から直立する円筒状壁部５６を保持する。フランジ５４の上面の半径方向内側の 部分はフィルタアセンブリ（図示せず）の端部を収容する棚部５８を形成し、基 板５０から直立する壁部６０は、中央部によるフィルタアセンブリのより多くの 支持を提供するが、それらの 端部６３間に中央チャンネル６１を残す。壁部６０及びフランジ５４の棚部５８ の上面は、フィルタアセンブリが収容される床部を形成する。 差込み取付け突起６２が、フランジ５４の端部から半径方向外側へ間隔を配し て突出する。 ふた部１１４は、樹脂一体モールドであり、円形天板６４を有し、そこから円 筒壁部６６が下方へ延びて半径方向に延びる円形フランジ６８で終わり、そのフ ランジ６８はさらなる円筒状壁部７０を保持する。円筒状壁部６６内には、そこ から環状ギャップ７４により離隔した小径の円筒状壁部７２があり、そのギャッ プ７４は本体部１１２の壁部５６を収容するように適合されている。差込み突起 ６２と協働する突起が壁部７０の内側に設けられる。貫通穴７６が壁部６６及び ７２の両方を貫通する。下方へ延びる遮蔽壁部７８がフランジ６８の下側に、ほ ぼ穴７６と対向して設けられる。 断面が円形のボア８０がフランジ５４の下側で且つそれと平行に本体部１１２ の壁部５２を貫通し、同様のボア８２が直正面にも設けられる。 使用時には、図１乃至３との関連で記述された、スクリム２４、網状フォーム ２６、フィルタ紙２８及び濾過膜３０を有するフィルタアセンブリを、培地を含 むバイアルがチャンネル６１内に配置された後、壁部５６内の棚部５８上に配置 する。 ふた部１１４がはめ込まれると、図１乃至３との関連で説明したように、壁部 ７２の底部がフィルタアセンブリの端部を押圧する。 差込み突起６２は、ふた部を本体部に固定するが、相対的にある程度のねじり 運動を可能とし、それにより穴７６を壁部５６の同様の穴７７と一致し又はそれ からずれるように移動させ、且つ、遮蔽壁部７８をボア８２に対するブロック位 置へ、またブロック位置か ら外れるように移動させる。 最後に、のみ部材（図示せず）をボア８０内に挿入し、培地のバイアルに当接 させる。のみ部材は、円筒状本体と、バイアルに当接する尖った端部とを有する 。鋭利な端部はあらゆる所望の形状とすることができる。円筒状部分をボア８０ 内に押し込みはめ込み、又はネジ山によりボアと結合させることができる。 研究すべき試料を穴７６、７７を通じて、例えば注入器から導入し、フィルタ アセンブリを通過させてボア８２から排出する。その後、フタ部及び本体部を回 転させて穴７６を閉じ、壁部７８をブロック位置に移動させてボア８２を閉じる 。それから、のみを深く押し込み（例えば、ネジ山があればそれを回転させて） 、培地のバイアルを破る。培地がフィルタアセンブリのフォームに染み込み、捕 獲された微生物の培養が始まる。培養中は本装置を逆さにする。培養後は、ふた 部を通して微生物を観察することができ、希望すれば、装置を分解して培養され た微生物をさらに研究することができる。 ふた部の回転により入口及び出口のボア７６、７７及び８２を閉じることがで きる能力は、ある程度の通気を可能としつつ培養中に汚染を排除する便利な方法 を提供する。また、本装置は、事前に良好に準備され、使用前の保管のために無 菌状態で完全に組み立て、包装することに適している。 本装置の使用を、以下の例により示す。例１ 大腸菌を加えた１００ｍｌの水を、図１乃至３に関連して上述したユニットを により濾過した。こうして、そのようなユニットを複数用意した。各ユニットを 逆さにし、様々の量及び強度の栄養培養基を各ユニットのフォームベースに浸し た。ユニットを摂氏３７度で一晩インキュベートし、以下の数の微生物が捕獲さ れた。 例２ 脱塩素化した水道水で希釈した１００ｍｌの河川水を、夫々上述の複数のユニ ットで濾過した。様々の量及び強度の膜ラウリル培養基（酸化物）を、逆さにし たユニットに加え、各ユニットのフォーム支持材に浸した。摂氏３７度で一晩イ ンキュベートし、予定腸内細菌として黄色のコロニーが記録された。一つのユニ ットからの濾過膜を移動し、対照として凝固した培地上に配置した。微生物の数 は以下の通りである。 例３ 大腸菌を加えた１００ｍｌの水の試料を上述した種類のユニットで濾過した。 各ユニットを逆さにし、色原体ＢＣＩＧを含む１．３Ｘの強度の膜ラウリル硫酸 塩培養基２ｍｌをフォームに加えた。培 養基はＳartory及びＨowardに従って作成したが、２０ｍｇ／１００ｍｌではな く、３９ｍｇのＢＣＩＧ／１００ｍｌを使用した。ＭＬＧＡへの濾過の後、対照 膜を移動した（Ｓartory et al）。摂氏３０度で４時間、摂氏３７度で１４時間 インキュベートし、緑及び黄色のコロニーは以下のように計数された。 要約すると、寒天平板又はフォームパッド上に回復された微生物の数に統計上 重大な相違は無いことが結論付けられた。より多くの合成成長培地、即ち原体を 含むものがシステムで使用される場合でさえ、フォームパッドシステムが寒天平 板に匹敵することが証明された。 本発明を図示した特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の視野内にお いて様々の変形及び変更が可能である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料から微生物を濾過し、微生物を培養する方法において、 微生物を含む試料を、フィルタホルダ(10)内で吸収性支持材(26)上に支持され た濾過膜(30)に通す工程と、 次に、培地を吸収性支持材により吸収することにより、フィルタホルダ内の濾 過膜上の微生物に培地を供給する工程と、を備え、 前記吸収性支持材は、膨張可能な圧縮状態で濾過膜に対して保持される方法。 ２．前記吸収性支持材は、網状のフォームである請求項１に記載の方法。 ３．前記吸収性支持材は、その自由な非圧縮状態の厚さの７／８から１／１０の 厚さに圧縮される請求項１又は２に記載の方法。 ４．前記培地は、最初は密閉された容器(32)内に含められ、前記容器は、前記密 閉を破壊して前記培地を前記吸収性支持材上に解放する以前に、前記吸収性支持 材と通じるように前記フィルタホルダと連結される請求項１乃至３のいずれかに 記載の方法。 ５．微生物を濾過し、培養する装置において、 濾過されるべき流体の流路を規定するフィルタホルダ(10)と、 前記流路中に配置され、吸収性支持材(26)上に支持される濾過膜(30)と、前記 吸収性支持材を前記濾過膜に対して加圧する手段(14)と、を有するフィルタ部材 と、を備える装置。 ６．前記フィルタホルダは着脱可能にはめ込まれる第１及び第２の部分(12，14) を有し、 前記第１の部分は、濾過された流体の出口に通じる床部と、周囲壁(22)とを有 し、 前記濾過膜(30)及び前記吸収性支持材(20)は、前記濾過膜が前記床部から遠い 側になるようにして前記床部上の前記第１の部分内に収容され、 前記フィルタホルダの前記第２の部分は、前記第１の部分内に収容される部分 を有し、前記濾過膜及び前記吸収性支持材を前記床部に対して加圧する請求項５ に記載の装置。 ７．請求項５又は６に記載の装置と、無菌容器と、前記吸収性支持材に導入され る液体培地とを含む培養キット。 ８．前記装置は請求項６に記載された装置であり、前記培地の容器は、前記フィ ルタホルダの第１の部分の前記出口と一致するように適合され、そこを通じて前 記培地を前記吸収性支持材に導入可能とする請求項７に記載の培養キット。 ９．前記培地は前記装置内の閉鎖容器内に含められ、前記装置は、前記装置の外 部から操作可能であり、前記容器を破って前記培地を解放する手段を備える請求 項７に記載の培養キット。