JP2011083296A5

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Publication number: JP2011083296A5
Application number: JP2011021710A
Authority: JP
Filing date: 2011-02-03
Publication date: 2012-10-18
Anticipated expiration: 2024-09-29

Claims

ラムノース異化作用を欠失しており、かつ異種ＲＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレームに作用可能に連結したラムノース誘導プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子を有する組換え宿主細胞を、ラムノース、及び、対象のＤＮＡ配列に作用可能に連結した異種ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む発現ベクターに接触させるステップを含む、対象のＤＮＡ配列の発現を宿主細胞中で誘導するインビトロ方法。
対象のＤＮＡ配列に２つの制限酵素部位が隣接しており、隣接制限酵素部位の１つは第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、別の隣接制限酵素部位は第２の制限酵素の部位であり、第２の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ第１の制限酵素によって生成されたオーバーハングとは相補的でない末端を生成する、請求項１に記載の方法。
前記発現ベクターが更に転写ターミネーター配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
前記転写ターミネーター配列がｒｒｎＢのものである、請求項３に記載の方法。
前記発現ベクターがプラスミドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記プラスミドが更に選択マーカー遺伝子を含む、請求項５に記載の方法。
前記プラスミドが更に高コピー数になることを指定する配列を含む、請求項５又は６に記載の方法。
前記プラスミドが更にベクター多量体化を低減する配列を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記宿主細胞が１つ又は複数のラムノース触媒遺伝子を発現しない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記ラムノース誘導プロモーターがｒｈａＢＡＤプロモーターを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記ラムノース誘導プロモーターが遅い誘導プロフィールを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
前記ＲＮＡポリメラーゼがファージＲＮＡポリメラーゼである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
分泌性ドメインを欠失したバルナーゼをコードする核酸断片を含むベクターを、原核細胞で構成的に発現されるプロモーターからバルスターを発現する組換え宿主細胞中に導入するステップを含むインビトロ方法。
分泌性ドメインを欠失したバルナーゼをコードする核酸断片に作用可能に連結した第１のプロモーターを含むベクターを、原核細胞で構成的に発現される第２のプロモーターからバルスターを発現する組換え宿主細胞中に導入するステップを含むインビトロ方法。
前記第１のプロモーターが原核細胞で発現されるプロモーターを含む、請求項１５に記載の方法。
ベクター系を宿主細胞に導入するインビトロ方法であって、
前記ベクター系が第１の選択マーカー遺伝子及び対象のＤＮＡ配列を含む第１のベクターを含み、対象のＤＮＡ配列には、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、隣接制限酵素部位の少なくとも１つは第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、隣接制限酵素部位の少なくとも１つは第２の制限酵素の部位であり、第２の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ、第１の制限酵素によって生成されたオーバーハングとは相補的でない末端を生成し、第１の制限酵素及び第２の制限酵素部位で第１のベクターを消化することによって、第１の選択マーカー遺伝子を欠くが、対象のＤＮＡ配列を含む第１の線状ＤＮＡ断片が生成され、これらの制限酵素部位は、第１の線状ＤＮＡ断片を第２のベクターに直接再連結できるように設計され、
第２のベクターは、第１の選択マーカー遺伝子及び非必須ＤＮＡ配列から識別可能な第２の選択マーカー遺伝子を含み、非必須ＤＮＡ配列は、(i)プロモーター及び分泌性ドメインを欠いたバルナーゼをコードする核酸断片、又は(ii)バルナーゼをコードする核酸断片に作用可能に連結するプロモーター、を含み、バルナーゼＤＮＡ配列には少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、第２のベクター中の隣接制限酵素部位の少なくとも１つは第３の制限酵素の部位であり、第３の制限酵素は、第１の制限酵素によって生成される一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、第２のベクター中の隣接制限部位の少なくとも１つは第４の制限酵素の部位であり、第４の制限酵素は、第１の制限酵素又は第３の制限酵素によって生成される末端には相補的でないが第２の制限酵素によって生成された末端には連結できる末端を生成し、第３の制限酵素及び第４の制限酵素で第２のベクターを消化することによって、非必須ＤＮＡ配列を欠くが第２の選択マーカー遺伝子を含む第２の線状ＤＮＡ断片が生成され、第２のＤＮＡ断片には、第１の線状ＤＮＡ断片が第２の線状ＤＮＡ断片に一方向で結合するのを可能にする末端が隣接する、
ことを特徴とする方法。
前記第２の制限酵素は平滑末端を生成し、かつ、前記第１の線状ＤＮＡ断片には第１の一本鎖ＤＮＡオーバーハング及び平滑末端が隣接する、請求項１７に記載の方法。
前記第１の制限酵素及び第３の制限酵素が同一でない、請求項１７に記載の方法。
前記第２の制限酵素及び第４の制限酵素が同一でない、請求項１７に記載の方法。
前記第２の制限酵素及び第４の制限酵素が平滑末端を生成する、請求項１７に記載の方法。
前記第１の制限酵素がＳｇｆＩである、請求項１７に記載の方法。
前記第２の制限酵素がＰｍｅＩである、請求項２２に記載の方法。
前記第３の制限酵素が３’ＴＡオーバーハングを生成する、請求項１７に記載の方法。
前記第３の制限酵素がＰｖｕＩ又はＰａｃＩである、請求項２４に記載の方法。
連結及び一方向での結合によって、対象のＤＮＡ配列及び第２の線状ＤＮＡ断片の３’末端の５’側にある核酸配列によってコードされているＮ末端融合タンパク質をコードする第３のベクターが産生される、請求項１７に記載の方法。
連結及び一方向での結合によって、対象のＤＮＡ配列及び第２の線状ＤＮＡ断片の５’末端の３’側にある核酸配列によってコードされているＣ末端融合タンパク質をコードする第３のベクターが産生される、請求項１７に記載の方法。
制限酵素の１つがＡａｒＩ、ＡｓｃＩ、ＢｂｒＣＩ，ＣｓｐＩ、ＤｒａＩ、ＦｓｅＩ，ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｐＩ、ＳｄａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｇｆＩ、ＳｐｌＩ、ＳｒｆＩ、ＳｗａＩである、又はＡａｒＩ、ＡｓｃＩ、ＢｂｒＣＩ，ＣｓｐＩ、ＤｒａＩ、ＦｓｅＩ，ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｐＩ、ＳｄａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｇｆＩ、ＳｐｌＩ、ＳｒｆＩ若しくはＳｗａＩと同一の認識部位を有する制限酵素である、請求項１７に記載の方法。
前記第２のベクター中のプロモーターが原核生物のプロモーターを含む、請求項１７に記載の方法。
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項１５又は１７に記載の方法。
前記宿主細胞が第２のプロモーターからバルスターを発現する組換え細胞である、請求項１７に記載の方法。