JP2013509199A - 藻類での遺伝子発現の増強 - Google Patents
藻類での遺伝子発現の増強 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013509199A JP2013509199A JP2012537176A JP2012537176A JP2013509199A JP 2013509199 A JP2013509199 A JP 2013509199A JP 2012537176 A JP2012537176 A JP 2012537176A JP 2012537176 A JP2012537176 A JP 2012537176A JP 2013509199 A JP2013509199 A JP 2013509199A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- algae
- protein
- gee
- transgene
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 title claims abstract description 75
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 107
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 39
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims abstract description 17
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 claims abstract description 10
- 102100038885 Histone acetyltransferase p300 Human genes 0.000 claims description 71
- 101000882390 Homo sapiens Histone acetyltransferase p300 Proteins 0.000 claims description 71
- 101000978776 Mus musculus Neurogenic locus notch homolog protein 1 Proteins 0.000 claims description 70
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 17
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 17
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 15
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 15
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 11
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 6
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 5
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 241000849798 Nita Species 0.000 claims description 3
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 2
- -1 rbcS Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 41
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 abstract description 12
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 abstract description 12
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 abstract description 11
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 abstract description 11
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 abstract description 9
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 abstract description 4
- 230000000397 acetylating effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 abstract 1
- 108090000246 Histone acetyltransferases Proteins 0.000 description 36
- 102000003893 Histone acetyltransferases Human genes 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 15
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 12
- 241000195620 Euglena Species 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 11
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 8
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 241000545067 Venus Species 0.000 description 6
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 5
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 5
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 101100033183 Acidithiobacillus ferrooxidans cbbS2 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 4
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- 101710155878 Histone acetyltransferase p300 Proteins 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 2
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 241000195614 Volvox carteri Species 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 2
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010001949 Algal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000256182 Anopheles gambiae Species 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108091007065 BIRCs Proteins 0.000 description 1
- 241000206761 Bacillariophyta Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108010040163 CREB-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100021975 CREB-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 241001491932 Camponotus atriceps Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 108010051542 Early Growth Response Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023226 Early growth response protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000664600 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000055031 Inhibitor of Apoptosis Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100389548 Mus musculus Ep300 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241000199919 Phaeophyceae Species 0.000 description 1
- 241000218976 Populus trichocarpa Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 102100038798 Tripartite motif-containing protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 108010083912 bleomycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000006195 histone acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002040 relaxant effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本発明は、藻類での導入遺伝子の発現を増強する系を提供する。導入遺伝子を、それらのプロモーターの近傍に、特定のタンパク質の結合部位、例えばＬｅｘＡ結合部位を含むように改変する。藻類をまた、協調して作用するＤＮＡ結合部位への親和性をもつタンパク質に融合させた、ヌクレオソームを変化させるタンパク質を発現するように改変する。一例としてはＬｅｘＡ−ｐ３００融合タンパク質があり、ここでｐ３００はコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来である。ＬｅｘＡ結合ドメインはｐ３００を結合部位に誘導し、ｐ３００は導入遺伝子の近傍にあるヒストンをアセチル化することによりヌクレオソームの構造を緩ませ、その結果、その部位のクロマチン構造が再構築されて高レベルの発現が生じる。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
Description
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１０年１０月３０日出願の米国仮特許出願第６１／２５６，９２１号、名称「藻類での遺伝子発現の増強（ENHANCED GENE EXPRESSION IN ALGAE）」の優先権を主張し、その全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１０年１０月３０日出願の米国仮特許出願第６１／２５６，９２１号、名称「藻類での遺伝子発現の増強（ENHANCED GENE EXPRESSION IN ALGAE）」の優先権を主張し、その全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。
本発明は分子生物学の分野、具体的には藻類での導入遺伝子の発現に関する。
導入遺伝子は、ゲノム、真核細胞の場合には染色体、に導入された外生のＤＮＡ配列である。これらの遺伝子は通常、宿主のその他の遺伝子と同様に転写される。転写は通常、染色体のＤＮＡを真核生物ではヌクレオソームと呼ばれている緊密な束にまとめる、クロマチン構造によって制御されている。特定の遺伝子の周囲にあるクロマチン構造がゆるむと、細胞の転写機構が、特定の遺伝子のＤＮＡに接近できるようになる。染色実験から、真核生物で活発に転写された遺伝子はヌクレオソーム内でよりルーズになっており、真性染色体となることが分かっている。いくつかの例では、導入遺伝子は宿主の染色体に組み込まれているが、クロマチン構造が適切でないために発現しない。この現象は「遺伝子サイレンシング」と呼ばれている。ヌクレオソームをどの程度密に束ねるかを制御する能力は、宿主細胞での導入遺伝子の発現を補助することができる。哺乳類の細胞では、ヒストン「尾部」に対する高い修飾能力をもつ遺伝子であるｐ３００（ヒストンアセチルトランスフェラーゼ又は「ＨＡＴ」；ＣＲＥＢ結合タンパク質ファミリーの場合は「ＣＢＰ」としても知られる）を一緒に導入して発現させると、そのアセチルトランスフェラーゼ活性によってヒストンとＤＮＡの関係がよりルーズになり、転写因子が遺伝子に接近することができるようになることから、発現レベルが上昇すると提唱されてきた。T.H.J. Kwaks et al., J. Biotechnology, 115:35-46 (2005)。
微小藻類には広い範囲の生物、主に単細胞の水生生物が含まれる。単細胞の真核微小藻類（緑藻類、珪藻、及び褐藻類など）は光合成を行い、かつ、核、ミトコンドリア、及び葉緑体をもつ。藻類のクロマチン構造はその他の真核生物のものとは異なる。藻類のクロマチンが濃く染色されることは、これらのヌクレオソーム構造がより圧縮されていること、及びＤＮＡとヒストンの関係がより緊密であることを示している。特に緑藻類のクロマチン構造におけるこれらの違いは、遺伝子発現のヒストンクロマチン制御機構が異なることを示唆するものである。
真核微小藻類のクロマチン構造に見られるこれらの違いは、クロマチン介在性遺伝子サイレンシングにより、微小藻類の核に導入した遺伝子を安定に及び一過的に発現させることが難しいことの原因であると考えられる。H. Cerutti, A.M.J., N.W. Gillham, J.E. Boynton, Epigenetic silencing of a foreign gene in nuclear transformants of Chlamydomonas, The Plant Cell 9:925-945 (1997)。本発明者らが、哺乳類由来の抗アポトーシス遺伝子と蛍光レポーター遺伝子を藻類に導入した予備実験では、蛍光遺伝子の発現レベルが低いか、その発現は検出されなかった。このことにより、藻類で導入遺伝子を発現させることが難しいことを確認した。
藻類は健康のためにヒトが摂取する栄養源として、かつ、バイオ燃料のバイオマスとしても重要だと考えられている。遺伝子工学によって藻類に導入した遺伝子の発現を（複数世代にわたって）安定させることは有用な培養藻類の新しい展望を切り開き、価値と評価を強く高めるだろう。しかしながら上述したように、安定で十分に高いレベルで遺伝子を発現させることは難しかった。藻類での導入遺伝子の発現を改善させるための方法、及び発現を安定させる方法は非常に有用であると考えられる。そのような方法のためには、緑藻類を含む微小藻類の独特で強固なヒストン介在性遺伝子サイレンシングを明らかにすることが必要であると考えられる。
T.H.J. Kwaks et al., J. Biotechnology, 115:35-46 (2005)
H. Cerutti, A.M.J., N.W. Gillham, J.E. Boynton, Epigenetic silencing of a foreign gene in nuclear transformants of Chlamydomonas, The Plant Cell 9:925-945 (1997)
一実施形態において本発明は、
ＤＮＡ結合タンパク質に機能的に融合させた藻類由来ｐ３００を含み、少なくとも該ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのコード配列の一部分が藻類での発現を改善させるためにコドン最適化してある遺伝子発現増強（ＧＥＥ）融合タンパク質のコード配列の機能的上流に配置した藻類に適した転写プロモーター、
藻類に適した転写プロモーターの機能的下流にに配置した少なくとも１つの導入遺伝子、及び
ＤＮＡ結合タンパク質の結合部位であり、少なくとも１つの前記転写プロモーターの近くに配置した、少なくとも１つのＤＮＡ領域を含む、
藻類での遺伝子発現を高めるための、藻類中にある系を提供する。
ＤＮＡ結合タンパク質に機能的に融合させた藻類由来ｐ３００を含み、少なくとも該ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのコード配列の一部分が藻類での発現を改善させるためにコドン最適化してある遺伝子発現増強（ＧＥＥ）融合タンパク質のコード配列の機能的上流に配置した藻類に適した転写プロモーター、
藻類に適した転写プロモーターの機能的下流にに配置した少なくとも１つの導入遺伝子、及び
ＤＮＡ結合タンパク質の結合部位であり、少なくとも１つの前記転写プロモーターの近くに配置した、少なくとも１つのＤＮＡ領域を含む、
藻類での遺伝子発現を高めるための、藻類中にある系を提供する。
好ましい実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質はＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施形態では、ＧＥＥ融合タンパク質のｐ３００部分はコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来である。より好ましい実施形態では、ＧＥＥ融合タンパク質の一部分は、ｐ３００タンパク質のＨＡＴドメインのみから成る。ｐ３００又はｐ３００のＨＡＴドメインのみは、コナミドリムシに加え、緑藻類を含むその他の微小藻類のホモログ由来であってもよい。
別の実施形態では、藻類での発現を改善するために、導入遺伝子のコドンを変化させる。好ましい実施形態では、導入遺伝子又は目的の遺伝子（ＧＯＩ）は蛍光−Ｂｃｌ−ｘL融合遺伝子である。融合タンパク質は蛍光−Ｂｃｌ−ｘL構築物（例えばＹＦＰ−Ｂｃｌ−ｘL融合体又はＶｅｎｕｓ−Ｂｃｌ−ｘL融合体）を含んでもよい。別の好ましい実施形態では、導入遺伝子がＹＦＰ／Ｖｅｎｕｓ遺伝子であり、融合タンパク質の一部分である必要はない。Ｖｅｎｕｓは広範囲のｐＨで安定で、素早く折りたたまれ、かつ、標準的なＹＦＰの３０倍の強度をもつ、改良された黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。Nagai T., Ibata K., Park E.S., Kubota M., Mikoshiba K. and Miyawaki A. (2002). A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnol, 20, 87-90.
別の実施形態においてこの系は、抗生物質耐性マーカーのような、少なくとも１つの選択マーカーをさらに含む。好ましい実施形態では１つのベクター中に、ＧＥＥ融合タンパク質、少なくとも１つの導入遺伝子、及び２つのプロモーターを含む両方向性プロモーター領域を配置する。両方のプロモーターの近くにはＤＮＡ結合部位を配置し、ＧＥＥ融合タンパク質と少なくとも１つの導入遺伝子をどちらか一方のプロモーターから発現させるように構成して、このベクターを系に導入する。より好ましい実施形態では、ＧＥＥ融合タンパク質及び導入遺伝子を別個のベクターに入れて系に導入する。各ベクターは選択マーカーを含み、かつ、選択マーカーはそれぞれ異なる。別個のベクターにする場合、ＧＥＥベクターと目的遺伝子（ＧＯＩ）のベクターは選択マーカーを含む。ＧＥＥをＧＯＩのベクターとは別のベクターとして導入する場合、ＧＥＥベクターを、ＧＯＩを発現している２番目のベクターの受容株として役立つ、安定な藻類細胞株を生成するために使用してもよい。この安定なＧＥＥ藻類細胞株は、ＧＯＩを含む２番目のベクターの発現を高める機能をもつと考えられる。
一層さらに別の実施形態では、藻類に適した転写プロモーターはｈｓｐ７０、ｒｂｃＳ、ｎｉｔＡ、ａｃｔｉｎ、ｔｕｂＡ２又はその組み合わせである。
別のさらなる実施形態では、ＧＥＥ融合タンパク質は、そのＨＡＴ領域がコナミドリムシのｐ３００のＨＡＴ領域と少なくとも８０％の同一性をもつ、藻類由来ｐ３００ホモログに機能的に融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む。好ましくはＧＥＥ融合タンパク質は、コナミドリムシ由来のｐ３００のＨＡＴ領域のＨＡＴドメインに機能的に融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む。哺乳動物種由来のｐ３００は、コナミドリムシのｐ３００よりもかなりサイズが大きく、かつ、同一性が５０％未満であることに注意する。
本発明はまた、
ＤＮＡ結合タンパク質に機能的に融合させた藻類由来ｐ３００を含み、少なくとも該ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのコード配列の一部分は藻類での発現を改善させるためにコドン最適化してある遺伝子発現増強（ＧＥＥ）融合タンパク質のコード配列の機能的上流に配置した藻類に適した転写プロモーター、藻類に適した転写プロモーターの機能的下流に配置した少なくとも１つの導入遺伝子、及びＤＮＡ結合タンパク質の結合部位であり、少なくとも１つの前記転写プロモーターの近くに配置した少なくとも１つのＤＮＡ領域を含む、少なくとも１つのベクターで藻類を形質転換する工程、
形質転換された藻類細胞を選抜する工程、及び
前記ＧＥＥ遺伝子及び／又は前記導入遺伝子の藻類での発現を検出する工程を含む、藻類において高レベルで遺伝子を発現させる方法を提供する。
ＤＮＡ結合タンパク質に機能的に融合させた藻類由来ｐ３００を含み、少なくとも該ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのコード配列の一部分は藻類での発現を改善させるためにコドン最適化してある遺伝子発現増強（ＧＥＥ）融合タンパク質のコード配列の機能的上流に配置した藻類に適した転写プロモーター、藻類に適した転写プロモーターの機能的下流に配置した少なくとも１つの導入遺伝子、及びＤＮＡ結合タンパク質の結合部位であり、少なくとも１つの前記転写プロモーターの近くに配置した少なくとも１つのＤＮＡ領域を含む、少なくとも１つのベクターで藻類を形質転換する工程、
形質転換された藻類細胞を選抜する工程、及び
前記ＧＥＥ遺伝子及び／又は前記導入遺伝子の藻類での発現を検出する工程を含む、藻類において高レベルで遺伝子を発現させる方法を提供する。
好ましい実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質はＬｅｘＡ結合ドメインであり、より好ましくは、ｐ３００はコナミドリムシ由来である。より一層好ましくはＧＥＥ融合タンパク質は、コナミドリムシ由来ｐ３００タンパク質のＨＡＴドメインに機能的に融合させたＬｅｘＡ結合ドメインを含む。
別の実施形態では、導入遺伝子はＹＦＰ−Ｂｃｌ−ｘL融合タンパク質又はＶｅｎｕｓ−Ｂｃｌ−ｘL融合タンパク質である。
一層さらに別の実施形態では、まずＧＥＥ融合タンパク質を安定して発現しているベクターを選抜し、次に導入遺伝子を含むベクターを用いて選抜した藻類を形質転換することにより、別個のベクターに入れたＧＥＥ融合タンパク質及び前記導入遺伝子で藻類を形質転換する。
藻類で導入遺伝子を発現させることは困難である。H. Cerutti, A.M.J. et al., The Plant Cell 9:925-945 (1997)。同様に、本発明者らが癌抑制Ｂｃｌ−ｘL遺伝子に融合させた黄色蛍光タンパク質（「ＹＦＰ」）（この転写は、熱ショック転写エンハンサー（ＨＳＰ７０）に依存したｒｕｂｉｓｃｏプロモーター（ｒｃｂＳ２）によって操作した）を用いて微小藻類を形質転換したところ、形質転換した微小藻類は蛍光を生産できなかった。しかしながら、わずかに長く生存した形質転換体は、（Ｂｃｌ−ｘL遺伝子が僅かに発現した結果）形態に影響を受けていたことが観察された。このことにより、藻類での導入遺伝子の発現が低いことは遺伝子サイレンシングによると推測された。
本発明は、藻類、好ましくは緑藻類、より好ましくは微小藻類、での導入遺伝子の発現を高めるために有効な方法を提供する。本発明の好ましい藻類は、単細胞の光合成藻類である。一層さらに好ましい藻類は微小藻類である。本発明を用いて藻類で発現させたＧＯＩ導入遺伝子の発現レベルはより高くなる。発現は、本発明の恩恵を受けることなく改変した、同じ導入遺伝子の藻類での発現と比較して、少なくとも５０％、好ましくは約２から５倍に上昇する。蛍光導入遺伝子に関しては、発現は蛍光シグナルを観察するのに十分な程度上昇する。より好ましくは、クラミドモナス中の蛍光シグナルを観察する。
導入遺伝子を藻類に導入する。本発明のある実施形態に従って、導入遺伝子をベクター上に配置する。ベクターは、ＤＮＡ配列を含むカセットを藻類の染色体に導入するために用いられる核酸構造である。ベクターは宿主藻類細胞の核に導入され、そして導入遺伝子は藻類の中で転写／翻訳される。藻類の形質転換方法は当業者に周知である。例えば、ベクター構築物をエレクトロポレーションを用いて、プラスミド接合により、及びパーティクルボンバードメントによって導入してもよい。形質転換した藻類を固形の栄養培地又は液体培地中で回復させる。Elizabeth H Harris, Chlamydomonas As A Model Organism, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 52:363-406 (2001)及びEMBO Practical Course: Molecular Genetics of Chlamydomonas, Laboratory protocols. Geneva, September 18-28, 2006。
本発明の好ましいベクターは、目的のＤＮＡ配列を藻類の染色体に統合することができるプラスミドである。数多くのベクターが知られており、かつ、特徴付けられている。本発明の好ましいベクターはｐＳＰ１２４である。Lumbreras et al., Efficient foreign gene expression in Chlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous introns, The Plant Journal 14(4):441-447 (1998)。
ベクターの改変方法は当該分野において周知である。ベクター骨格は、宿主細胞がベクターによって形質転換されたことを示す、形質転換マーカーをコードしている遺伝子を含んでいてもよい。形質転換マーカーは、ベクターを含まない細胞と、ベクターを含む細胞を選択するために用いる選択マーカー遺伝子であってもよい。選択マーカーは当業者に周知である。一般的に用いられる選択マーカーには、ブレオマイシンのような、特定の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。ベクターを含む細胞だけが、抗生物質を含む培地上で生育できる。その他のベクター骨格はまた、単にどの細胞が形質転換されたかを示すマーカー遺伝子を含んでいてもよい。そのようなマーカーを用いる場合には、ベクターを含む細胞もベクターを含まない細胞も成長するが、ベクターを含む細胞はベクターによって付与される特定の特徴、例えば色を呈することにより、ベクターを含まない細胞から区別することができる。一般的に用いられる形質転換マーカー遺伝子は黄色又は緑色蛍光遺伝子である。そのような遺伝子を有するベクターを含む細胞は黄色又は緑色の蛍光を発する。その他の一般的な形質転換マーカーには、様々なルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。ルシフェラーゼ遺伝子を含む細胞は発光する。
藻類の核で遺伝子を発現させるために有効な遺伝子発現制御機構の任意の組み合わせをベクター中に組み込むことができる。プラスミドは、異なる型のプロモーター、例えば構成的プロモーター又は誘導プロモーターを含んでいてもよい。本発明に好ましい転写プロモーターには、ｈｓｐ７０（「熱ショックタンパク質」プロモーター）、ｒｂｃＳ（「ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニット」プロモーター）及びｔｕｂＡ２（「アクチン」プロモーター）が挙げられる。ベクターは、通常は５’非翻訳領域又は「５’ＵＴＲ」と呼ばれる、好適な翻訳エンハンサーエレメントを含む。本発明の好ましいエンハンサーはｔｕｂＡ２イントロン１、ＨＳＰ７０エンハンサー、及びｒｃｂＳ２イントロン１である。本発明のベクターはまた、有効な翻訳終結因子である、３’ＵＴＲを含む。好ましい３’ＵＴＲ配列の例としては、ｔｕｂＡ２、ＨＳＰ７０、及びｒｃｂＳ２の３’ＵＴＲが挙げられる。その他の有効なプロモーター、転写エンハンサー及び終結因子は具体的には、十分に高く、かつ、安定は発現を生じる組み合わせであってもよい。
図１及び２に、これらの選択肢のいくつかを示す。例とした図１及び２で選択した特徴としては、コナミドリムシ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ領域、アクチン（チューブリン）をコードしているｔｕｂＡ２、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットをコードしているｒｂｃＳ２、又は硝酸塩レダクターゼをコードしているｎｉｔＡが挙げられる。さらに、ｈｓｐ７０Ａ／ｒｂｃＳ２のタンデムプロモーターが導入遺伝子の発現を誘導するために好ましい。Schroda M., Beck C.F. and Vallon A., Sequence elements within an hsp70 promoter counteract transcriptional transgene silencing in Chlamydomonas. Plant J. 31:445-455 (2002)。このキメラプロモーターは、核と細胞質に局在する７０ｋＤの熱ショックタンパク質遺伝子のエンハンサー領域（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：Ｍ７６７２５；５７２−８３３ｂｐ）及び、核ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニット遺伝子のプロモーター（ＮＢＣＩ ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：Ｘ０４４７２；９３４−１１４２ｂｐ）を含む。加えて、導入遺伝子の発現をより安定にするために、ｒｂｃＳ２遺伝子の１番目のイントロン（１３０７−１４５１ｂｐ）及び３’非翻訳領域（２４０１−２６３２ｂｐ）を含んでいてもよい。
本発明のある実施形態では、目的の遺伝子（「ＧＯＩ」）及び遺伝子サイレンシング阻害剤を含むカセットを、藻類、例えばコナミドリムシの核ＤＮＡに導入するために、１つ以上のベクターを用いる。ＧＯＩは藻類で発現することが望まれる任意の遺伝子であってよい。生存可能な目的の遺伝子には、藻類の代謝経路の制御に関与する遺伝子が含まれる。例えば、本発明の一実施形態では、Ｂｃｌ−ｘL遺伝子を挿入し、藻類の核で発現させることができる。Ｂｃｌ−ｘLはＢ細胞リンパ腫エクストラ−ラージの略語であり、アポトーシス（プログラム細胞死）の阻害剤として知られている。Boise L.H. et al., Bcl-x, a bcl-2-related Gene that Functions as a Dominant Regulator of Apoptotic Cell Death, Cell 74:597-608 (1993)。別の実施形態では、脂質又はイソプレノイドの生産経路に影響を及ぼす遺伝子を導入することが望まれる。アポトーシスを阻害するＢｃｌ−ｘLの能力により、その発現は藻類細胞をより長く生存させることを可能にする。微小藻類の寿命が長くなると、光バイオリアクターのような様々な産業的な応用に微小藻類を利用することが可能になる。
遺伝子サイレンシング阻害剤をもまた藻類に導入する。遺伝子サイレンシング阻害剤は、藻類の核の中にあるヌクレオソームの緩みを誘導するペプチドである。遺伝子サイレンシング阻害剤には、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）及び、ヌクレオソーム上のエレメントを修飾してクロマチン構造を緩ませ、転写因子が目的の遺伝子に近づくことを可能にするその他のペプチドが含まれる。ＨＡＴタンパク質並びにｐ３００及びその他のＨＡＴタンパク質のＨＡＴドメインはヒストンのアセチル化を引き起こすことが知られており、本発明に用いることができる。本発明では、アセチル化活性に関与するドメイン又はタンパク質全体を使用する。Fukuda H, et al., Brief Funct. Genomic Proteomic, 5(3):190-208 (2006); Renthal W. and Nestler E.J., Semin Cell Dev Biol. 20(4):387-94 (Epub 2009); 及びLin Y.Y. et al., Genes Dev., 22(15):2062-74 (2008)を参照のこと。
本発明の好ましい一実施形態では、遺伝子サイレンシング阻害剤として、ｐ３００タンパク質を使用する。より好ましくは、コナミドリムシ由来ｐ３００タンパク質を使用する。一層さらに好ましい実施形態では、コナミドリムシのｐ３００タンパク質は、図３で詳細を示したホモログである。さらにより好ましい実施形態では、コナミドリムシｐ３００遺伝子のＨＡＴドメインのみを用いる。図３及び配列番号４の対応する部分を参照のこと。
図３では、コナミドリムシのｐ３００と、系統発生学的に異なるその他のｐ３００ホモログのアライメントの比較を示す。それぞれの線の灰色の部分はヒストンアセチラーゼ（ＨＡＴ）ドメインを表す。見やすくするためにＨＡＴドメインを整列させた。これらの灰色の部分に含まれる数字は、それぞれのタンパク質のＨＡＴドメインの同一性パーセントを示している。各図のタンパク質中に記載されているパーセンテージは、コナミドリムシ由来のｐ３００タンパク質の、ｐ３００ ＨＡＴドメインと比較した場合の同一性を示す。図３は、ｐ３００タンパク質全体のサイズと、このタンパク質中に含まれるＨＡＴドメインの位置に基づいて書かれている。
表１に、ｐ３００タンパク質、特にＨＡＴドメインを高度に保存している生物の例を挙げる。
各カラムの一番上の欄に記載した生物種をそのクレードの代表とし、それを基準としてその他の生物における同一性パーセントを算出した。
実際、植物及び哺乳類のｐ３００ホモログ間の同一性パーセントもまた非常に高く、具体的には少なくとも約８０％である。米国特許公開第２００３／０１４５３４９号を参照のこと。しかしながら、コナミドリムシｐ３００ホモログとその他の生物との相同性はより低い。同様に、コナミドリムシｐ３００の完全長タンパク質はマウスｐ３００タンパク質と１１．５％が同一で、さらに９．９％が類似しており；ショウジョウバエｐ３００タンパク質とは９．１％が同一で、さらに４．７％が類似しており；及びシロイヌナズナｐ３００タンパク質とは２３．６％が同一で、さらに９．９％が類似している。コナミドリムシ由来のタンパク質はより短いＮ末端又はＣ末端領域をもち、かつ、ＨＡＴドメインの位置が、哺乳類又は植物のｐ３００タンパク質のＨＡＴドメインとは異なっている。図３を参照のこと。このことは、タンパク質全体の異なる機能及び系統発生を示唆している。
図１及び本明細書の他の部分で記載した様々なｐ３００ホモログタンパク質は以下の通りである。
コナミドリムシ（C. reinhardtii）ｐ３００／ＨＡＴタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：１５９４６７７０３。
ボルボックス（V. carteri）ｐ３００／ＣＢＰタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：３００２５６２６６。
ソルガム（S. bicolor）推定ｐ３００タンパク質、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ＩＤ：Ｃ５ＸＴＺ４。
ポプラ（P. trichocarpa）Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅデータベースからのＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＰＯＰＴＲ＿００７ｓ１５０９０。
ダイズ（G. max）タンパク質、Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅデータベースＩＤ：ＰＦ０２１３５。
シロイヌナズナ（A. thaliana）、ＨＡＣ１／ｐ３００／ＣＢＰ ＮＣＢＩデータベースによるＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿１０６５５０．３。
イネ（O. sativa）ｐ３００／ＣＢＰタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：１０８７９２６５７。
ショウジョウバエ（D. melanogaster）ＣＢＰ／ＨＡＴ、ＮＣＢＩデータベースによるＧｅｎｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿０７９９０３．２。
ガンビエハマダラカ（A. gambiae）ＨＡＴタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：１５８２８９３９１。
フロリダマミズヨコエビ（C. floridanus）ＣＢＰタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：３０７１７２９９０。
アカゲザル（M. musculus）Ｅ１Ａ／ＢＰ／ｐ３００、ＮＣＢＩデータベースよるＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿１７７８２１．６。
アナウサギ（O. cuniculus）ｐ３００タンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：２９１４１０３３４。
ラット（R. norvegicus）ｐ３００タンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：ＸＰ＿５７６３１２．３。
マウス（M. mulatta）ｐ３００ＨＡＴタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：ＸＰ＿００１１０２８４４．１。
ヒト（H. sapiens）ｐ３００タンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：ＮＰ＿００１４２０．２。
コナミドリムシ（C. reinhardtii）ｐ３００／ＨＡＴタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：１５９４６７７０３。
ボルボックス（V. carteri）ｐ３００／ＣＢＰタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：３００２５６２６６。
ソルガム（S. bicolor）推定ｐ３００タンパク質、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ＩＤ：Ｃ５ＸＴＺ４。
ポプラ（P. trichocarpa）Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅデータベースからのＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＰＯＰＴＲ＿００７ｓ１５０９０。
ダイズ（G. max）タンパク質、Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅデータベースＩＤ：ＰＦ０２１３５。
シロイヌナズナ（A. thaliana）、ＨＡＣ１／ｐ３００／ＣＢＰ ＮＣＢＩデータベースによるＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿１０６５５０．３。
イネ（O. sativa）ｐ３００／ＣＢＰタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：１０８７９２６５７。
ショウジョウバエ（D. melanogaster）ＣＢＰ／ＨＡＴ、ＮＣＢＩデータベースによるＧｅｎｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿０７９９０３．２。
ガンビエハマダラカ（A. gambiae）ＨＡＴタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：１５８２８９３９１。
フロリダマミズヨコエビ（C. floridanus）ＣＢＰタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：３０７１７２９９０。
アカゲザル（M. musculus）Ｅ１Ａ／ＢＰ／ｐ３００、ＮＣＢＩデータベースよるＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿１７７８２１．６。
アナウサギ（O. cuniculus）ｐ３００タンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：２９１４１０３３４。
ラット（R. norvegicus）ｐ３００タンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：ＸＰ＿５７６３１２．３。
マウス（M. mulatta）ｐ３００ＨＡＴタンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：ＸＰ＿００１１０２８４４．１。
ヒト（H. sapiens）ｐ３００タンパク質、ＮＣＢＩデータベースＩＤ：ＮＰ＿００１４２０．２。
本発明の別の好ましい実施形態では、遺伝子サイレンシング阻害剤をＤＮＡ結合タンパク質又はそのドメインに機能的に連結させ、又は好ましくは融合させた（連結した／融合させたタンパク質又はその／それらの遺伝子をこれ以降遺伝子発現増強ユニット、又は「ＧＥＥ」と呼ぶ）。ＤＮＡ結合タンパク質又はドメインは特定のＤＮＡ配列（結合部位又は「ＢＳ」）に結合して遺伝子サイレンシング阻害剤を、ＢＳの近くの標的ヒストンに近づけ、それにより、その遺伝子の位置のヌクレオソームの緩みを誘導する。ヌクレオソームが緩むと、近くにあるＤＮＡ配列が転写因子に曝されてより活性に転写される。
好ましい実施形態では本発明は、特定のＤＮＡ配列に結合する藻類タンパク質の発現を必要とする。この配列は、藻類で発現させるために、任意のＧＯＩの上流を改変したものであってもよい。既知のＤＮＡ結合部位を含むタンパク質である可能性のある、ＤＮＡ結合タンパク質／ドメインを用いることができる。本発明で使用できる、タンパク質を標的とする特定のＤＮＡモチーフの例としては、Ｇａｌ４タンパク質及び初期増殖応答タンパク質１が挙げられる。これらタンパク質のＤＮＡ結合部位モチーフは既知である。同様に、これらの並びにＬｅｘＡタンパク質の結合ドメインが既知であり、かつ、完全長タンパク質の代わりに主に使用される。例えばYoung, K., Biol. Reprod., 58:302-311 (1998) 及び Joung, J. et al., Proc. Natnl. Acad. Sci., 97:7382-7 (2000)を参照のこと。Ｇａｌ４のＤＮＡ結合部位（ＢＳ）は、５’−ＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’である。
ＬｅｘＡは好ましいＤＮＡ結合タンパク質の例である。ＬｅｘＡは細菌由来の遺伝子である。ＬｅｘＡタンパク質又は遺伝子は藻類では見つかっていない。従って、コナミドリムシのゲノムにはＬｅｘＡのＤＮＡ結合配列は含まれていないと考えられる。本発明におけるＬｅｘＡの機能は、特定のＤＮＡ配列（結合部位、「ＢＳ」）に結合することである。ＬｅｘＡ結合部位は多数の部生物の上流プロモーターに見られる。ＬｅｘＡのＢＳに共通の配列はＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＧ、配列番号９である。ＬｅｘＡタンパク質の結合ドメインは既知であり、本発明の目的では、結合ドメインのみを用いることが好ましい。ＮＣＢＩデータベースでのタンパク質ＩＤは２２９３１１８、配列は、ＭＫＡＬＴＡＲＱＱＥＶＦＤＬＩＲＤＨＩＳＱＴＧＭＰＰＴＲＡＥＩＡＱＲＬＧＦＲＳＰＮＡＡＥＥＨＬＫＡＬＡＲＫＧＶＩＥＩＶＳＧＡＳＲＧＩＲＬＬＱＥＥＥＥＧＬＰＬＶＧＲＶＡＡＧＥＰＬＬＡＱＱＨＩＥＧＨＹＱＶＤＰＳＬＦＫＰＮＡＤＦＬＬＲＶＳＧＭＳＭＫＤＩＧＩＭＤＧＤＬＬＡＶＨＫＴＱＤＶＲＮＧＱＶＶＶＡＲＩＤＤＥＶＴＶＫＲＬＫＫＱＧＮＫＶＥＬＬＰＥＮＳＥＦＫＰＩＶＶＤＬＲＱＱＳＦＴＩＥＧＬＡＶＧＶＩＲＮＧＤＷＬＥＦＰＧＩＲＲＰＷＲＰＬＥＳＴＣＳＱＡＮＳＧＲＩＳＹＤＬ、である。
上述したように、ＤＮＡ結合タンパク質又はそのドメイン、好ましくはＬｅｘＡドメインを、ＤＮＡ結合ドメインを構成し、協調してヌクレオソームを緩ませることが可能なタンパク質に翻訳されるように構築する。任意のヌクレオソームを緩ませることができるタンパク質を用いることができる。好ましくは、上述したように、コナミドリムシｐ３００ドメインを用いる。
１つの作用機序に制限されないが、１つのパートナーがＤＮＡに結合し、その他が近傍のヒストンをアセチル化し、それにより、その場にあるＤＮＡとヒストンの結合が緩むと考えられている。そのため、ＤＮＡ結合ドメインとアセチル化ドメインが、互いに空間的に近くなるようにする任意の方法が好ましい。融合タンパク質がより好ましい。融合タンパク質中の２つのユニットの順番（Ｎ末端からの）は重要ではない。しかしながら、ｐ３００−ＬｅｘＡ結合ドメインの例では、ＬｅｘＡ結合ドメインが融合タンパク質のＮ末端になることが好ましい。「機能性」融合タンパク質を設計する。例としては、可撓性や方向性をもつようにする特定のリンカー領域、又はプライマー及び制限酵素部位のような遺伝子工学的特徴に対応する、単に「機能しない」タンパク質配列を戦略的に導入する。
好ましくは、ｐ３００−ＬｅｘＡ結合ドメイン融合タンパク質及びその遺伝子構築物を生成するように、ＧＥＥはｐ３００ペプチドホモログであってもよく、かつ、ＤＮＡ結合ドメインはＬｅｘＡ結合ドメインであってもよい。好ましくは、この融合タンパク質は藻類のｐ３００−ＬｅｘＡ結合ドメイン融合タンパク質である。より好ましくは、融合タンパク質はコナミドリムシのｐ３００−ＬｅｘＡ融合タンパク質である。あるいは、融合タンパク質は、コナミドリムシのｐ３００−ＬｅｘＡタンパク質から選択したドメインを含む。配列番号４を参照のこと。一層さらに好ましくは、融合タンパク質は、藻類で発現させた場合の発現量がより高くなるように、そのコドン使用頻度を核酸レベルで修飾したＬｅｘＡ配列を含む。好ましくは、遺伝子（ｐ３００）の一部分が、配列番号１及び配列番号３に示したように藻類由来の遺伝子である場合でも、ＧＥＥ融合タンパク質遺伝子全体を、藻類での好ましいコドン使用頻度に基づいて設計する。実際に、この系中の導入遺伝子（ＧＯＩ）及びその他の遺伝子は好ましくは、藻類でのコドン使用頻度に基づいて最適化する。
本発明では主に、その他の藻類ｐ３００ホモログ又はそれらのヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインを用いてもよいこと注意すべきである。しかしながら、これらの好ましいホモログは、コナミドリムシのｐ３００と少なくとも約６０％同一、好ましくは少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％又はそれ以上同一でなければならない。ボルボックス（V. carteri、藻類）由来のｐ３００ホモログが近年同定され、このＨＡＴドメインは、コナミドリムシのｐ３００と約８５％同一である。
ＬｅｘＡ−ｐ３００融合ＤＮＡ（配列番号１）は、ＬｅｘＡ結合ドメインと完全長コナミドリムシｐ３００配列を含む融合タンパク質（典型的なＧＥＥ）をコードしているヌクレオチド配列であり、全ての融合体を藻類で好ましいコドン使用頻度を反映して設計した。Ｋａｚｕｓａコドン使用頻度データベース（種ＩＤ：３０５５）から提供されたコナミドリムシの核でのコドン使用頻度の表に基づき、ＤＮＡ２０の遺伝子設計ソフトウェアを使用して変化させた。６９０番目のヌクレオチドまでの配列がＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメインであり、７００番目のヌクレオチドから、コナミドリムシｐ３００の完全長配列が始まる。ＬｅｘＡ結合ドメインとｐ３００は３つのアミノ酸から成るペプチドリンカー（ＧＶＬ）で連結され、この配列はＰｐｕＭＩ（９ｂｐ）のＤＮＡ制限部位を表す。ＮＣＢＩデータベースのタンパク質ＩＤ：２２９３１１８からのアミノ酸配列を使用して、ＬｅｘＡ遺伝子配列をコナミドリムシの核で発現させるためにコドン最適化する。
1 ATGAAGGCTCTGACCGCTCGCCAGCAGGAGGTGTTTGATCTGATTCGGGA
51 CCATATCAGCCAAACGGGCATGCCCCCTACGCGCGCGGAGATCGCGCAAC
101 GGCTGGGCTTCCGCTCCCCGAACGCGGCTGAGGAGCACCTGAAGGCGCTG
151 GCGCGCAAGGGTGTGATTGAGATCGTCTCCGGCGCGTCGCGGGGCATTCG
201 GCTGCTGCAGGAGGAGGAGGAGGGTCTGCCTCTGGTGGGGCGGGTGGCTG
251 CGGGCGAGCCCCTGCTGGCCCAGCAGCACATTGAGGGCCACTACCAAGTG
301 GACCCGTCCCTCTTCAAGCCGAACGCCGATTTCCTGCTGCGCGTCAGCGG
351 TATGAGCATGAAGGACATCGGCATCATGGACGGTGACCTGCTGGCCGTGC
401 ATAAGACGCAGGACGTGCGCAACGGCCAAGTGGTCGTCGCCCGCATCGAT
451 GACGAGGTGACCGTGAAGCGCCTGAAGAAGCAGGGGAACAAGGTCGAGCT
501 GCTGCCCGAGAACAGCGAGTTCAAGCCCATCGTGGTGGATCTGCGCCAGC
551 AATCCTTCACCATCGAGGGCCTGGCGGTGGGCGTGATCCGCAACGGCGAC
601 TGGCTGGAGTTCCCGGGCATCCGCCGCCCGTGGCGCCCTCTGGAGTCCAC
651 GTGCTCGCAGGCCAACTCCGGCCGCATTAGCTACGACCTGGGGGTCCTTA
701 TGGTGCCGATGGGCGCGCCCGCTATGCCCATGGGCAACAACGGCTCGCCC
751 ATGCTGAACGGCATGGGTATGTTCAACGCCCCGCAGCAGACCGTGCCCAA
801 CGGCGGGCCGGGTGGCGTGAACCCCATGGGCCAGGTGCCGGCGATGCCTG
851 CGCCGATCCCCAACGGCGGTCTGCCCGGTATGAACGCTGCCGGCGGTGCC
901 GACGATCCTGCGAAGCAGCGGGAGCAATCGATCCAGAAGCAGCAGCGCTG
951 GCTGCTGTTCCTGCGGCACTGCGCGAAGTGCCGGGCTCCCGGCGAGGACT
1001 GCCAGCTGAAGTCCCAGTGCAAGTTCGGCAAGCAGCTGTGGCAGCACATC
1051 CTGTCGTGCCAAAACCCGGCCTGCGAGTACCCGCGCTGCACCAACTCCAA
1101 GGATCTGCTCAAGCACCACCAGAAGTGCCAGGAGCAGACCTGCCCCGTGT
1151 GCATGCCGGTGAAGGACTACGTGAAGAAGACGCGCCAGGCGACCCAACAG
1201 CAGCAACAAATGCAGCAACAACAGCAAATCCAGCAACAGCAACAACAACA
1251 AATGCAACAGCAACAGATGCAACAGCAGCAGCTCCAGCAGCAGCAGATGC
1301 AACAACAACAGCAGATGCAGCAGCAGCAACAGCCCGGCGTGGGCGCCAAC
1351 TTCATGCCCACCCCGCCCATGATGCCGAACGGCATGTTCCCTCAACAGCA
1401 GCCCCAGCAGGCGATGCGCCTGAACGCCAACGGCCTCGGCGGCCAGAAGC
1451 GCCCCCACGAGATGATGGGTATGTCCAGCGGCGGCATGGACGGTATGAAC
1501 CAGATGGTGCCCGTCGGCGGCGGCGGCATGGGCATGTCGATGCCGATGGG
1551 TATGAACAACCCCATGCAGGGCGGTATGCCCCTGCAGCCTCCGCCCCAGG
1601 TGCAGGCTCCCGGTCAGGGCCCCATGATGAGCGCCCCTCAGCAGCAACAG
1651 CAGCAACCGGCCCCTAAGCGGGCGAAGACCGACGATGTGCTGCGCCAGAA
1701 CACGGGCACCAGCCTCCTGGAGACGTTCGACGCCAAGCAGATCCGCGTGC
1751 ACGTGGACCTGATCCGCGCTGCCGCGGTGACCCAGAAGGCCCAGCAGCCT
1801 CCCCCGGCTAACCCCGACGACGCGTGCAAGGTCTGCGCGCTGACGAAGCT
1851 GTCGTTCGAGCCCCCGGTGATTTACTGCTCGAGCTGCGGCCTGCGCATCA
1901 AGCGCGGCCAGATCTTCTACAGCACGCCTCCGGACCACGGCAACGACCTG
1951 AAGGGTTACTTCTGCCACCAGTGCTTCACCGACCAGAAGGGCGAGCGCAT
2001 CCTGGTGGAGGGCGTCTCGATCAAGAAGAGCGACCTGGTGAAGCGCAAGA
2051 ACGATGAGGAGATCGAGGAGGGGTGGGTGCAGTGCGACCACTGCGAGGGC
2101 TGGGTGCACCAGATTTGCGGCATGTTCAACAAGGGCCGGAACAACACGGA
2151 CGTCCACTACCTGTGCCCTGACTGCCTGGCCGTGGGCTACGAGCGCGGCC
2201 AGCGCCAGAAGACGGAGGTCCGCCCCCAGGCGATGCTCGAGGCGAAGGAT
2251 CTGCCCACGTCCCGGCTGTCCGAGTTTATTACGGAGCGCCTGAACCGCGA
2301 GCTGGAGAAGGAGCACCACAAGCGGGCTGAGCAGCAGGGCAAGCCGCTGC
2351 ACGAGGTGGCGAAGCCCGAGCCCCTGACCGTGCGGATGATCAACTCCGTG
2401 ATGAAGAAGTGCGAGGTCAAGCCGCGCTTCCACGAGACGTTCGGCCCCAC
2451 CGACGGCTACCCCGGGGAGTTCGGCTACCGGCAGAAGGTGCTGCTGCTGT
2501 TCCAAAGCCTGGACGGTGTCGACGTGTGCCTGTTCTGCATGTACGTGCAG
2551 GAGTACGGCAAGGACTGCCCTGCGCCCAACACCAACGTGGTGTACCTGTC
2601 GTATCTGGACTCCGTCAAGTACTTCCGCCCTGAGATTCCCTCGGCCCTGG
2651 GCCCTGCCGTGTCGCTGCGCACCTTCGTGTACCACCAACTCCTGATCGCC
2701 TACGTGGAGTTTACCCGCAACATGGGTTTTGAGCAGATGTACATTTGGGC
2751 GTGCCCGCCGATGCAAGGCGACGACTACATCCTGTACTGCCACCCGACCA
2801 AGCAGAAGACGCCGCGCTCGGACCGCCTGCGCATGTGGTACATTGAGATG
2851 CTGAAGCTGGCGAAGGAGGAGGGTATCGTGAAGCACCTGAGCACGCTGTG
2901 GGATACGTACTTCGAGGGCGGTCGCGACCACCGGATGGAGCGCTGCTCGG
2951 TCACGTACATTCCGTACATGGAGGGCGACTACTGGCCCGGCGAGGCTGAG
3001 AACCAGCTCATGGCCATTAACGACGCGGCCAAGGGCAAGCCTGGGACCAA
3051 GGGTGCGGGCAGCGCCCCGAGCCGCAAGGCCGGTGCCAAGGGCAAGCGCT
3101 ACGGCGGTGGCCCCGCCACGGCTGATGAGCAGCTGATGGCCCGCCTCGGT
3151 GAGATCCTGGGCGGGAACATGCGGGAGGACTTCATTGTGGTCCACATGCA
3201 GGTGCCCTGCACGTTCTGCCGCGCTCACATTCGGGGTCCGAACGTGGTGT
3251 ACCGCTATCGGACGCCGCCTGGCGCGACCCCTCCCAAGGCTGCCCCCGAG
3301 CGCAAGTTCGAGGGCATCAAGCTGGAGGGCGGTGGCCCCAGCGTGCCCGT
3351 GGGCACCGTCTCGAGCCTGACGATCTGCGAGGCGTGCTTTCGCGACGAGG
3401 AGACGCGCACGCTGACCGGCCAACAGCTGCGCCTGCCCGCTGGCGTGTCG
3451 ACCGCTGAGCTCGCGATGGAGAAGCTGGAGGAGATGATCCAGTGGGACCG
3501 CGACCCTGACGGCGACATGGAGAGCGAGTTCTTCGAGACGCGGCAGACCT
3551 TCCTGTCGCTGTGCCAGGGCAACCACTACCAGTTCGACACCCTCCGCCGC
3601 GCTAAGCACTCGTCGATGATGGTGCTCTACCACCTGCACAACCCCCACTC
3651 GCCGGCGTTCGCGTCCTCGTGCAACCAGTGCAACGCCGAGATCGAGCCGG
3701 GCAGCGGCTTTCGCTGCACCGTGTGCCCCGACTTCGACATGTGCGCCAGC
3751 TGCAAGGTCAACCCTCATAAGCGCGCCCTGGACGAGACGCGCCAGCGGCT
3801 GACCGAGGCCGAGCGCCGGGAGCGCAACGAGCAGCTGCAGAAGACCCTCG
3851 CCCTGCTGGTGCACGCCTGCGGCTGCCACAACAGCGCGTGCGGCTCCAAC
3901 AGCTGCCGCAAGGTGAAGCAGCTGTTCCAGCACGCGGTCCACTGCCAGAG
3951 CAAGGTGACCGGGGGCTGCCAGCTGTGCAAGAAGATGTGGTGCCTGCTGA
4001 ACCTGCACGCCAAGTCCTGCACCCGCGCGGACTGCCCGGTGCCGCGCTGC
4051 AAGGAGCTGAAGGAGCTGCGCCGGCGCCAAACGAACCGGCAGGAGGAGAA
4101 GCGCCGGGCGGCCTACGCCGCTATGCTGCGCAACCAGATGGCCGGCAGCC
4151 AGGCTCCGCGCCCCATGTAA SEQ ID NO 1.
1 ATGAAGGCTCTGACCGCTCGCCAGCAGGAGGTGTTTGATCTGATTCGGGA
51 CCATATCAGCCAAACGGGCATGCCCCCTACGCGCGCGGAGATCGCGCAAC
101 GGCTGGGCTTCCGCTCCCCGAACGCGGCTGAGGAGCACCTGAAGGCGCTG
151 GCGCGCAAGGGTGTGATTGAGATCGTCTCCGGCGCGTCGCGGGGCATTCG
201 GCTGCTGCAGGAGGAGGAGGAGGGTCTGCCTCTGGTGGGGCGGGTGGCTG
251 CGGGCGAGCCCCTGCTGGCCCAGCAGCACATTGAGGGCCACTACCAAGTG
301 GACCCGTCCCTCTTCAAGCCGAACGCCGATTTCCTGCTGCGCGTCAGCGG
351 TATGAGCATGAAGGACATCGGCATCATGGACGGTGACCTGCTGGCCGTGC
401 ATAAGACGCAGGACGTGCGCAACGGCCAAGTGGTCGTCGCCCGCATCGAT
451 GACGAGGTGACCGTGAAGCGCCTGAAGAAGCAGGGGAACAAGGTCGAGCT
501 GCTGCCCGAGAACAGCGAGTTCAAGCCCATCGTGGTGGATCTGCGCCAGC
551 AATCCTTCACCATCGAGGGCCTGGCGGTGGGCGTGATCCGCAACGGCGAC
601 TGGCTGGAGTTCCCGGGCATCCGCCGCCCGTGGCGCCCTCTGGAGTCCAC
651 GTGCTCGCAGGCCAACTCCGGCCGCATTAGCTACGACCTGGGGGTCCTTA
701 TGGTGCCGATGGGCGCGCCCGCTATGCCCATGGGCAACAACGGCTCGCCC
751 ATGCTGAACGGCATGGGTATGTTCAACGCCCCGCAGCAGACCGTGCCCAA
801 CGGCGGGCCGGGTGGCGTGAACCCCATGGGCCAGGTGCCGGCGATGCCTG
851 CGCCGATCCCCAACGGCGGTCTGCCCGGTATGAACGCTGCCGGCGGTGCC
901 GACGATCCTGCGAAGCAGCGGGAGCAATCGATCCAGAAGCAGCAGCGCTG
951 GCTGCTGTTCCTGCGGCACTGCGCGAAGTGCCGGGCTCCCGGCGAGGACT
1001 GCCAGCTGAAGTCCCAGTGCAAGTTCGGCAAGCAGCTGTGGCAGCACATC
1051 CTGTCGTGCCAAAACCCGGCCTGCGAGTACCCGCGCTGCACCAACTCCAA
1101 GGATCTGCTCAAGCACCACCAGAAGTGCCAGGAGCAGACCTGCCCCGTGT
1151 GCATGCCGGTGAAGGACTACGTGAAGAAGACGCGCCAGGCGACCCAACAG
1201 CAGCAACAAATGCAGCAACAACAGCAAATCCAGCAACAGCAACAACAACA
1251 AATGCAACAGCAACAGATGCAACAGCAGCAGCTCCAGCAGCAGCAGATGC
1301 AACAACAACAGCAGATGCAGCAGCAGCAACAGCCCGGCGTGGGCGCCAAC
1351 TTCATGCCCACCCCGCCCATGATGCCGAACGGCATGTTCCCTCAACAGCA
1401 GCCCCAGCAGGCGATGCGCCTGAACGCCAACGGCCTCGGCGGCCAGAAGC
1451 GCCCCCACGAGATGATGGGTATGTCCAGCGGCGGCATGGACGGTATGAAC
1501 CAGATGGTGCCCGTCGGCGGCGGCGGCATGGGCATGTCGATGCCGATGGG
1551 TATGAACAACCCCATGCAGGGCGGTATGCCCCTGCAGCCTCCGCCCCAGG
1601 TGCAGGCTCCCGGTCAGGGCCCCATGATGAGCGCCCCTCAGCAGCAACAG
1651 CAGCAACCGGCCCCTAAGCGGGCGAAGACCGACGATGTGCTGCGCCAGAA
1701 CACGGGCACCAGCCTCCTGGAGACGTTCGACGCCAAGCAGATCCGCGTGC
1751 ACGTGGACCTGATCCGCGCTGCCGCGGTGACCCAGAAGGCCCAGCAGCCT
1801 CCCCCGGCTAACCCCGACGACGCGTGCAAGGTCTGCGCGCTGACGAAGCT
1851 GTCGTTCGAGCCCCCGGTGATTTACTGCTCGAGCTGCGGCCTGCGCATCA
1901 AGCGCGGCCAGATCTTCTACAGCACGCCTCCGGACCACGGCAACGACCTG
1951 AAGGGTTACTTCTGCCACCAGTGCTTCACCGACCAGAAGGGCGAGCGCAT
2001 CCTGGTGGAGGGCGTCTCGATCAAGAAGAGCGACCTGGTGAAGCGCAAGA
2051 ACGATGAGGAGATCGAGGAGGGGTGGGTGCAGTGCGACCACTGCGAGGGC
2101 TGGGTGCACCAGATTTGCGGCATGTTCAACAAGGGCCGGAACAACACGGA
2151 CGTCCACTACCTGTGCCCTGACTGCCTGGCCGTGGGCTACGAGCGCGGCC
2201 AGCGCCAGAAGACGGAGGTCCGCCCCCAGGCGATGCTCGAGGCGAAGGAT
2251 CTGCCCACGTCCCGGCTGTCCGAGTTTATTACGGAGCGCCTGAACCGCGA
2301 GCTGGAGAAGGAGCACCACAAGCGGGCTGAGCAGCAGGGCAAGCCGCTGC
2351 ACGAGGTGGCGAAGCCCGAGCCCCTGACCGTGCGGATGATCAACTCCGTG
2401 ATGAAGAAGTGCGAGGTCAAGCCGCGCTTCCACGAGACGTTCGGCCCCAC
2451 CGACGGCTACCCCGGGGAGTTCGGCTACCGGCAGAAGGTGCTGCTGCTGT
2501 TCCAAAGCCTGGACGGTGTCGACGTGTGCCTGTTCTGCATGTACGTGCAG
2551 GAGTACGGCAAGGACTGCCCTGCGCCCAACACCAACGTGGTGTACCTGTC
2601 GTATCTGGACTCCGTCAAGTACTTCCGCCCTGAGATTCCCTCGGCCCTGG
2651 GCCCTGCCGTGTCGCTGCGCACCTTCGTGTACCACCAACTCCTGATCGCC
2701 TACGTGGAGTTTACCCGCAACATGGGTTTTGAGCAGATGTACATTTGGGC
2751 GTGCCCGCCGATGCAAGGCGACGACTACATCCTGTACTGCCACCCGACCA
2801 AGCAGAAGACGCCGCGCTCGGACCGCCTGCGCATGTGGTACATTGAGATG
2851 CTGAAGCTGGCGAAGGAGGAGGGTATCGTGAAGCACCTGAGCACGCTGTG
2901 GGATACGTACTTCGAGGGCGGTCGCGACCACCGGATGGAGCGCTGCTCGG
2951 TCACGTACATTCCGTACATGGAGGGCGACTACTGGCCCGGCGAGGCTGAG
3001 AACCAGCTCATGGCCATTAACGACGCGGCCAAGGGCAAGCCTGGGACCAA
3051 GGGTGCGGGCAGCGCCCCGAGCCGCAAGGCCGGTGCCAAGGGCAAGCGCT
3101 ACGGCGGTGGCCCCGCCACGGCTGATGAGCAGCTGATGGCCCGCCTCGGT
3151 GAGATCCTGGGCGGGAACATGCGGGAGGACTTCATTGTGGTCCACATGCA
3201 GGTGCCCTGCACGTTCTGCCGCGCTCACATTCGGGGTCCGAACGTGGTGT
3251 ACCGCTATCGGACGCCGCCTGGCGCGACCCCTCCCAAGGCTGCCCCCGAG
3301 CGCAAGTTCGAGGGCATCAAGCTGGAGGGCGGTGGCCCCAGCGTGCCCGT
3351 GGGCACCGTCTCGAGCCTGACGATCTGCGAGGCGTGCTTTCGCGACGAGG
3401 AGACGCGCACGCTGACCGGCCAACAGCTGCGCCTGCCCGCTGGCGTGTCG
3451 ACCGCTGAGCTCGCGATGGAGAAGCTGGAGGAGATGATCCAGTGGGACCG
3501 CGACCCTGACGGCGACATGGAGAGCGAGTTCTTCGAGACGCGGCAGACCT
3551 TCCTGTCGCTGTGCCAGGGCAACCACTACCAGTTCGACACCCTCCGCCGC
3601 GCTAAGCACTCGTCGATGATGGTGCTCTACCACCTGCACAACCCCCACTC
3651 GCCGGCGTTCGCGTCCTCGTGCAACCAGTGCAACGCCGAGATCGAGCCGG
3701 GCAGCGGCTTTCGCTGCACCGTGTGCCCCGACTTCGACATGTGCGCCAGC
3751 TGCAAGGTCAACCCTCATAAGCGCGCCCTGGACGAGACGCGCCAGCGGCT
3801 GACCGAGGCCGAGCGCCGGGAGCGCAACGAGCAGCTGCAGAAGACCCTCG
3851 CCCTGCTGGTGCACGCCTGCGGCTGCCACAACAGCGCGTGCGGCTCCAAC
3901 AGCTGCCGCAAGGTGAAGCAGCTGTTCCAGCACGCGGTCCACTGCCAGAG
3951 CAAGGTGACCGGGGGCTGCCAGCTGTGCAAGAAGATGTGGTGCCTGCTGA
4001 ACCTGCACGCCAAGTCCTGCACCCGCGCGGACTGCCCGGTGCCGCGCTGC
4051 AAGGAGCTGAAGGAGCTGCGCCGGCGCCAAACGAACCGGCAGGAGGAGAA
4101 GCGCCGGGCGGCCTACGCCGCTATGCTGCGCAACCAGATGGCCGGCAGCC
4151 AGGCTCCGCGCCCCATGTAA SEQ ID NO 1.
ＬｅｘＡ−ｐ３００融合タンパク質（配列番号２）は、配列番号１によってコードされる核酸配列に対応するタンパク質の配列である。２３０個のアミノ酸を含み、２３０番目のアミノ酸までの配列がＬｅｘＡ結合ドメインである。完全長ｐ３００ＨＡＴドメイン配列は２３４番目のアミノ酸から始まる。ＬｅｘＡ結合ドメインとｐ３００は３つのアミノ酸から成るペプチドリンカー（ＧＶＬ）で連結され、この配列はＰｐｕＭＩ（９ｂｐ）のＤＮＡ制限部位を表す。
1 MKALTARQQEVFDLIRDHISQTGMPPTRAEIAQRLGFRSPNAAEEHLKAL
51 ARKGVIEIVSGASRGIRLLQEEEEGLPLVGRVAAGEPLLAQQHIEGHYQV
101 DPSLFKPNADFLLRVSGMSMKDIGIMDGDLLAVHKTQDVRNGQVVVARID
151 DEVTVKRLKKQGNKVELLPENSEFKPIVVDLRQQSFTIEGLAVGVIRNGD
201 WLEFPGIRRPWRPLESTCSQANSGRISYDLGVLMVPMGAPAMPMGNNGSP
251 MLNGMGMFNAPQQTVPNGGPGGVNPMGQVPAMPAPIPNGGLPGMNAAGGA
301 DDPAKQREQSIQKQQRWLLFLRHCAKCRAPGEDCQLKSQCKFGKQLWQHI
351 LSCQNPACEYPRCTNSKDLLKHHQKCQEQTCPVCMPVKDYVKKTRQATQQ
401 QQQMQQQQQIQQQQQQQMQQQQMQQQQLQQQQMQQQQQMQQQQQPGVGAN
451 FMPTPPMMPNGMFPQQQPQQAMRLNANGLGGQKRPHEMMGMSSGGMDGMN
501 QMVPVGGGGMGMSMPMGMNNPMQGGMPLQPPPQVQAPGQGPMMSAPQQQQ
551 QQPAPKRAKTDDVLRQNTGTSLLETFDAKQIRVHVDLIRAAAVTQKAQQP
601 PPANPDDACKVCALTKLSFEPPVIYCSSCGLRIKRGQIFYSTPPDHGNDL
651 KGYFCHQCFTDQKGERILVEGVSIKKSDLVKRKNDEEIEEGWVQCDHCEG
701 WVHQICGMFNKGRNNTDVHYLCPDCLAVGYERGQRQKTEVRPQAMLEAKD
751 LPTSRLSEFITERLNRELEKEHHKRAEQQGKPLHEVAKPEPLTVRMINSV
801 MKKCEVKPRFHETFGPTDGYPGEFGYRQKVLLLFQSLDGVDVCLFCMYVQ
851 EYGKDCPAPNTNVVYLSYLDSVKYFRPEIPSALGPAVSLRTFVYHQLLIA
901 YVEFTRNMGFEQMYIWACPPMQGDDYILYCHPTKQKTPRSDRLRMWYIEM
951 LKLAKEEGIVKHLSTLWDTYFEGGRDHRMERCSVTYIPYMEGDYWPGEAE
1001 NQLMAINDAAKGKPGTKGAGSAPSRKAGAKGKRYGGGPATADEQLMARLG
1051 EILGGNMREDFIVVHMQVPCTFCRAHIRGPNVVYRYRTPPGATPPKAAPE
1101 RKFEGIKLEGGGPSVPVGTVSSLTICEACFRDEETRTLTGQQLRLPAGVS
1151 TAELAMEKLEEMIQWDRDPDGDMESEFFETRQTFLSLCQGNHYQFDTLRR
1201 AKHSSMMVLYHLHNPHSPAFASSCNQCNAEIEPGSGFRCTVCPDFDMCAS
1251 CKVNPHKRALDETRQRLTEAERRERNEQLQKTLALLVHACGCHNSACGSN
1301 SCRKVKQLFQHAVHCQSKVTGGCQLCKKMWCLLNLHAKSCTRADCPVPRC
1351 KELKELRRRQTNRQEEKRRAAYAAMLRNQMAGSQAPRPM* SEQ ID NO 2.
1 MKALTARQQEVFDLIRDHISQTGMPPTRAEIAQRLGFRSPNAAEEHLKAL
51 ARKGVIEIVSGASRGIRLLQEEEEGLPLVGRVAAGEPLLAQQHIEGHYQV
101 DPSLFKPNADFLLRVSGMSMKDIGIMDGDLLAVHKTQDVRNGQVVVARID
151 DEVTVKRLKKQGNKVELLPENSEFKPIVVDLRQQSFTIEGLAVGVIRNGD
201 WLEFPGIRRPWRPLESTCSQANSGRISYDLGVLMVPMGAPAMPMGNNGSP
251 MLNGMGMFNAPQQTVPNGGPGGVNPMGQVPAMPAPIPNGGLPGMNAAGGA
301 DDPAKQREQSIQKQQRWLLFLRHCAKCRAPGEDCQLKSQCKFGKQLWQHI
351 LSCQNPACEYPRCTNSKDLLKHHQKCQEQTCPVCMPVKDYVKKTRQATQQ
401 QQQMQQQQQIQQQQQQQMQQQQMQQQQLQQQQMQQQQQMQQQQQPGVGAN
451 FMPTPPMMPNGMFPQQQPQQAMRLNANGLGGQKRPHEMMGMSSGGMDGMN
501 QMVPVGGGGMGMSMPMGMNNPMQGGMPLQPPPQVQAPGQGPMMSAPQQQQ
551 QQPAPKRAKTDDVLRQNTGTSLLETFDAKQIRVHVDLIRAAAVTQKAQQP
601 PPANPDDACKVCALTKLSFEPPVIYCSSCGLRIKRGQIFYSTPPDHGNDL
651 KGYFCHQCFTDQKGERILVEGVSIKKSDLVKRKNDEEIEEGWVQCDHCEG
701 WVHQICGMFNKGRNNTDVHYLCPDCLAVGYERGQRQKTEVRPQAMLEAKD
751 LPTSRLSEFITERLNRELEKEHHKRAEQQGKPLHEVAKPEPLTVRMINSV
801 MKKCEVKPRFHETFGPTDGYPGEFGYRQKVLLLFQSLDGVDVCLFCMYVQ
851 EYGKDCPAPNTNVVYLSYLDSVKYFRPEIPSALGPAVSLRTFVYHQLLIA
901 YVEFTRNMGFEQMYIWACPPMQGDDYILYCHPTKQKTPRSDRLRMWYIEM
951 LKLAKEEGIVKHLSTLWDTYFEGGRDHRMERCSVTYIPYMEGDYWPGEAE
1001 NQLMAINDAAKGKPGTKGAGSAPSRKAGAKGKRYGGGPATADEQLMARLG
1051 EILGGNMREDFIVVHMQVPCTFCRAHIRGPNVVYRYRTPPGATPPKAAPE
1101 RKFEGIKLEGGGPSVPVGTVSSLTICEACFRDEETRTLTGQQLRLPAGVS
1151 TAELAMEKLEEMIQWDRDPDGDMESEFFETRQTFLSLCQGNHYQFDTLRR
1201 AKHSSMMVLYHLHNPHSPAFASSCNQCNAEIEPGSGFRCTVCPDFDMCAS
1251 CKVNPHKRALDETRQRLTEAERRERNEQLQKTLALLVHACGCHNSACGSN
1301 SCRKVKQLFQHAVHCQSKVTGGCQLCKKMWCLLNLHAKSCTRADCPVPRC
1351 KELKELRRRQTNRQEEKRRAAYAAMLRNQMAGSQAPRPM* SEQ ID NO 2.
ＬｅｘＡ−ｐ３００ＨＡＴドメインＤＮＡ（配列番号３）は、コナミドリムシｐ３００タンパク質のＬｅｘＡ結合ドメイン−アセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインをコードしている遺伝子に対応する核酸配列である。同様に、ＬｅｘＡ結合ドメインは６９０個のヌクレオチドを含む６９０番目のヌクレオチドまでの配列であり、ｐ３００ＨＡＴドメイン配列は７００番目のヌクレオチドから始まる。ＬｅｘＡ結合ドメインとｐ３００は３つのアミノ酸から成るペプチドリンカー（ＧＶＬ）で連結され、この配列はＰｐｕＭＩ（９ｂｐ）のＤＮＡ制限部位を表す。
1 ATGAAGGCTCTCACCGCTCGCCAACAGGAGGTCTTTGATCTGATTCGCGA
51 CCACATCTCGCAGACCGGCATGCCGCCGACCCGGGCGGAGATTGCTCAGC
101 GGCTGGGCTTCCGGAGCCCCAACGCGGCCGAGGAGCACCTGAAGGCCCTC
151 GCGCGCAAGGGGGTGATCGAGATTGTCTCCGGCGCTAGCCGCGGCATCCG
201 CCTGCTGCAGGAGGAGGAGGAGGGCCTGCCGCTGGTCGGGCGGGTCGCGG
251 CCGGGGAGCCTCTGCTGGCCCAGCAGCACATCGAGGGCCACTACCAAGTG
301 GACCCCTCGCTGTTTAAGCCCAACGCGGACTTCCTGCTCCGGGTGTCGGG
351 CATGAGCATGAAGGACATCGGCATCATGGACGGCGACCTCCTGGCGGTGC
401 ACAAGACCCAGGACGTGCGCAACGGCCAGGTGGTCGTCGCGCGGATTGAC
451 GACGAGGTGACCGTGAAGCGGCTGAAGAAGCAGGGCAACAAGGTCGAGCT
501 GCTGCCCGAGAACTCGGAGTTCAAGCCTATCGTGGTCGACCTGCGCCAGC
551 AGTCCTTCACCATCGAGGGCCTGGCCGTGGGGGTCATCCGCAACGGTGAC
601 TGGCTGGAGTTCCCCGGCATCCGGCGCCCGTGGCGGCCGCTGGAGTCCAC
651 CTGCAGCCAGGCGAACTCCGGCCGCATCTCCTACGATCTGGGGGTCCTTG
701 AGGTGGCCAAGCCGGAGCCGCTGACCGTGCGGATGATCAACAGCGTGATG
751 AAGAAGTGCGAGGTCAAGCCCCGCTTCCACGAGACGTTCGGTCCGACCGA
801 CGGTTACCCCGGGGAGTTCGGCTACCGGCAGAAGGTGCTCCTCCTGTTCC
851 AGTCCCTCGACGGCGTCGACGTGTGCCTGTTCTGCATGTACGTGCAGGAG
901 TACGGGAAGGACTGCCCGGCGCCCAACACGAACGTGGTGTACCTGAGCTA
951 CCTGGACTCCGTCAAGTATTTCCGCCCCGAGATTCCCAGCGCCCTGGGCC
1001 CTGCGGTGAGCCTGCGGACCTTCGTGTACCACCAGCTCCTGATTGCGTAC
1051 GTGGAGTTCACGCGCAACATGGGCTTCGAGCAGATGTACATTTGGGCGTG
1101 CCCCCCCATGCAGGGGGACGACTATATCCTGTATTGCCATCCCACGAAGC
1151 AGAAGACCCCGCGCTCGGACCGCCTGCGCATGTGGTACATCGAGATGCTG
1201 AAGCTGGCTAAGGAGGAGGGCATCGTGAAGCACCTGTCGACGCTGTGGGA
1251 CACCTACTTCGAGGGCGGTCGCGACCACCGGATGGAGCGCTGCAGCGTGA
1301 CCTACATCCCCTACATGGAGGGCGACTACTGGCCTGGCGAGGCCGAGTAA SEQ ID NO 3.
1 ATGAAGGCTCTCACCGCTCGCCAACAGGAGGTCTTTGATCTGATTCGCGA
51 CCACATCTCGCAGACCGGCATGCCGCCGACCCGGGCGGAGATTGCTCAGC
101 GGCTGGGCTTCCGGAGCCCCAACGCGGCCGAGGAGCACCTGAAGGCCCTC
151 GCGCGCAAGGGGGTGATCGAGATTGTCTCCGGCGCTAGCCGCGGCATCCG
201 CCTGCTGCAGGAGGAGGAGGAGGGCCTGCCGCTGGTCGGGCGGGTCGCGG
251 CCGGGGAGCCTCTGCTGGCCCAGCAGCACATCGAGGGCCACTACCAAGTG
301 GACCCCTCGCTGTTTAAGCCCAACGCGGACTTCCTGCTCCGGGTGTCGGG
351 CATGAGCATGAAGGACATCGGCATCATGGACGGCGACCTCCTGGCGGTGC
401 ACAAGACCCAGGACGTGCGCAACGGCCAGGTGGTCGTCGCGCGGATTGAC
451 GACGAGGTGACCGTGAAGCGGCTGAAGAAGCAGGGCAACAAGGTCGAGCT
501 GCTGCCCGAGAACTCGGAGTTCAAGCCTATCGTGGTCGACCTGCGCCAGC
551 AGTCCTTCACCATCGAGGGCCTGGCCGTGGGGGTCATCCGCAACGGTGAC
601 TGGCTGGAGTTCCCCGGCATCCGGCGCCCGTGGCGGCCGCTGGAGTCCAC
651 CTGCAGCCAGGCGAACTCCGGCCGCATCTCCTACGATCTGGGGGTCCTTG
701 AGGTGGCCAAGCCGGAGCCGCTGACCGTGCGGATGATCAACAGCGTGATG
751 AAGAAGTGCGAGGTCAAGCCCCGCTTCCACGAGACGTTCGGTCCGACCGA
801 CGGTTACCCCGGGGAGTTCGGCTACCGGCAGAAGGTGCTCCTCCTGTTCC
851 AGTCCCTCGACGGCGTCGACGTGTGCCTGTTCTGCATGTACGTGCAGGAG
901 TACGGGAAGGACTGCCCGGCGCCCAACACGAACGTGGTGTACCTGAGCTA
951 CCTGGACTCCGTCAAGTATTTCCGCCCCGAGATTCCCAGCGCCCTGGGCC
1001 CTGCGGTGAGCCTGCGGACCTTCGTGTACCACCAGCTCCTGATTGCGTAC
1051 GTGGAGTTCACGCGCAACATGGGCTTCGAGCAGATGTACATTTGGGCGTG
1101 CCCCCCCATGCAGGGGGACGACTATATCCTGTATTGCCATCCCACGAAGC
1151 AGAAGACCCCGCGCTCGGACCGCCTGCGCATGTGGTACATCGAGATGCTG
1201 AAGCTGGCTAAGGAGGAGGGCATCGTGAAGCACCTGTCGACGCTGTGGGA
1251 CACCTACTTCGAGGGCGGTCGCGACCACCGGATGGAGCGCTGCAGCGTGA
1301 CCTACATCCCCTACATGGAGGGCGACTACTGGCCTGGCGAGGCCGAGTAA SEQ ID NO 3.
ＬｅｘＡ−ｐ３００ＨＡＴドメインＡＡ（配列番号４）は、ＬｅｘＡ結合ドメイン−コナミドリムシｐ３００タンパク質の典型的なＧＥＥタンパク質配列であり、ここでは、コナミドリムシｐ３００はコナミドリムシｐ３００酵素のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインに限定されている。２３０個のアミノ酸を含む２３０番目のアミノ酸までの配列がＬｅｘＡ結合ドメインである。ｐ３００ＨＡＴドメイン配列は２３４番目のアミノ酸から始まる。ＬｅｘＡ結合ドメインとｐ３００は３つのアミノ酸から成るペプチドリンカー（ＧＶＬ）で連結している。
1 MKALTARQQEVFDLIRDHISQTGMPPTRAEIAQRLGFRSPNAAEEHLKAL
51 ARKGVIEIVSGASRGIRLLQEEEEGLPLVGRVAAGEPLLAQQHIEGHYQV
101 DPSLFKPNADFLLRVSGMSMKDIGIMDGDLLAVHKTQDVRNGQVVVARID
151 DEVTVKRLKKQGNKVELLPENSEFKPIVVDLRQQSFTIEGLAVGVIRNGD
201 WLEFPGIRRPWRPLESTCSQANSGRISYDLGVLEVAKPEPLTVRMINSVM
251 KKCEVKPRFHETFGPTDGYPGEFGYRQKVLLLFQSLDGVDVCLFCMYVQE
301 YGKDCPAPNTNVVYLSYLDSVKYFRPEIPSALGPAVSLRTFVYHQLLIAY
351 VEFTRNMGFEQMYIWACPPMQGDDYILYCHPTKQKTPRSDRLRMWYIEML
401 KLAKEEGIVKHLSTLWDTYFEGGRDHRMERCSVTYIPYMEGDYWPGEAE* SEQ ID NO 4.
1 MKALTARQQEVFDLIRDHISQTGMPPTRAEIAQRLGFRSPNAAEEHLKAL
51 ARKGVIEIVSGASRGIRLLQEEEEGLPLVGRVAAGEPLLAQQHIEGHYQV
101 DPSLFKPNADFLLRVSGMSMKDIGIMDGDLLAVHKTQDVRNGQVVVARID
151 DEVTVKRLKKQGNKVELLPENSEFKPIVVDLRQQSFTIEGLAVGVIRNGD
201 WLEFPGIRRPWRPLESTCSQANSGRISYDLGVLEVAKPEPLTVRMINSVM
251 KKCEVKPRFHETFGPTDGYPGEFGYRQKVLLLFQSLDGVDVCLFCMYVQE
301 YGKDCPAPNTNVVYLSYLDSVKYFRPEIPSALGPAVSLRTFVYHQLLIAY
351 VEFTRNMGFEQMYIWACPPMQGDDYILYCHPTKQKTPRSDRLRMWYIEML
401 KLAKEEGIVKHLSTLWDTYFEGGRDHRMERCSVTYIPYMEGDYWPGEAE* SEQ ID NO 4.
コドン最適化したＶｅｎｕｓ遺伝子配列が好ましい実施形態である。
1 ATGGTGTCGAAGGGTGAGGAGCTGTTTACCGGTGTCGTGCCTATTCTGGT
51 GGAGCTCGACGGCGACGTCAACGGGCACAAGTTTTCGGTGTCCGGCGAGG
101 GTGAGGGGGACGCGACGTACGGCAAGCTCACGCTGAAGCTGATCTGCACC
151 ACCGGCAAGCTGCCCGTCCCCTGGCCGACGCTGGTGACCACCCTGGGCTA
201 CGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCGGACCACATGAAGCAGCACGACT
251 TCTTCAAGTCGGCCATGCCCGAGGGGTACGTGCAGGAGCGCACGATCTTC
301 TTTAAGGACGATGGCAACTACAAGACCCGCGCTGAGGTGAAGTTCGAGGG
351 CGATACGCTGGTGAACCGCATCGAGCTCAAGGGCATCGACTTCAAGGAGG
401 ACGGCAACATCCTGGGTCACAAGCTGGAGTACAACTACAACTCCCACAAC
451 GTGTACATCACGGCGGATAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTTAA
501 GATTCGCCATAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACC
551 AGCAGAACACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGATAACCAC
601 TACCTCAGCTACCAGTCGGCCCTGTCCAAGGATCCCAACGAGAAGCGCGA
651 TCACATGGTCCTCCTGGAGTTCGTGACCGCCGCTGGCATCACCCTGGGCA
701 TGGACGAGCTGTACAAGTAA SEQ ID NO 5.
1 ATGGTGTCGAAGGGTGAGGAGCTGTTTACCGGTGTCGTGCCTATTCTGGT
51 GGAGCTCGACGGCGACGTCAACGGGCACAAGTTTTCGGTGTCCGGCGAGG
101 GTGAGGGGGACGCGACGTACGGCAAGCTCACGCTGAAGCTGATCTGCACC
151 ACCGGCAAGCTGCCCGTCCCCTGGCCGACGCTGGTGACCACCCTGGGCTA
201 CGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCGGACCACATGAAGCAGCACGACT
251 TCTTCAAGTCGGCCATGCCCGAGGGGTACGTGCAGGAGCGCACGATCTTC
301 TTTAAGGACGATGGCAACTACAAGACCCGCGCTGAGGTGAAGTTCGAGGG
351 CGATACGCTGGTGAACCGCATCGAGCTCAAGGGCATCGACTTCAAGGAGG
401 ACGGCAACATCCTGGGTCACAAGCTGGAGTACAACTACAACTCCCACAAC
451 GTGTACATCACGGCGGATAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTTAA
501 GATTCGCCATAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACC
551 AGCAGAACACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGATAACCAC
601 TACCTCAGCTACCAGTCGGCCCTGTCCAAGGATCCCAACGAGAAGCGCGA
651 TCACATGGTCCTCCTGGAGTTCGTGACCGCCGCTGGCATCACCCTGGGCA
701 TGGACGAGCTGTACAAGTAA SEQ ID NO 5.
配列番号６は、配列番号５の核酸によってコードされているタンパク質である。Ｖｅｎｕｓのアミノ酸配列。
1 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKLICT
51 TGKLPVPWPTLVTTLGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIF
101 FKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHN
151 VYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNH
201 YLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK* SEQ ID NO 6.
1 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKLICT
51 TGKLPVPWPTLVTTLGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIF
101 FKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHN
151 VYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNH
201 YLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK* SEQ ID NO 6.
配列番号７は、本発明のＶｅｎｕｓ−Ｂｃｌ−ｘL融合体をコードしている核酸である。これは藻類での好ましいコドン使用頻度に基づいて設計した。７１７番目のヌクレオチド配列がＶｅｎｕｓを表す。ＶｅｎｕｓとＢｃｌ−ｘLは３つのアミノ酸から成るペプチドリンカー（ＧＶＬ）で連結し、この配列はＰｐｕＭＩのＤＮＡ制限部位（９ｂｐ）を表す。Ｂｃｌ−ｘLは７２６番目のヌクレオチドから始まる。
1 ATGGTGTCGAAGGGTGAGGAGCTGTTTACCGGTGTCGTGCCTATTCTGGT
51 GGAGCTCGACGGCGACGTCAACGGGCACAAGTTTTCGGTGTCCGGCGAGG
101 GTGAGGGGGACGCGACGTACGGCAAGCTCACGCTGAAGCTGATCTGCACC
151 ACCGGCAAGCTGCCCGTCCCCTGGCCGACGCTGGTGACCACCCTGGGCTA
201 CGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCGGACCACATGAAGCAGCACGACT
251 TCTTCAAGTCGGCCATGCCCGAGGGGTACGTGCAGGAGCGCACGATCTTC
301 TTTAAGGACGATGGCAACTACAAGACCCGCGCTGAGGTGAAGTTCGAGGG
351 CGATACGCTGGTGAACCGCATCGAGCTCAAGGGCATCGACTTCAAGGAGG
401 ACGGCAACATCCTGGGTCACAAGCTGGAGTACAACTACAACTCCCACAAC
451 GTGTACATCACGGCGGATAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTTAA
501 GATTCGCCATAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACC
551 AGCAGAACACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGATAACCAC
601 TACCTCAGCTACCAGTCGGCCCTGTCCAAGGATCCCAACGAGAAGCGCGA
651 TCACATGGTCCTCCTGGAGTTCGTGACCGCCGCTGGCATCACCCTGGGCA
701 TGGACGAGCTGTACAAGGGGGTCCTTATGAGCCAGAGCAACCGGGAGCTG
751 GTGGTGGACTTCCTGAGCTACAAGCTGAGCCAAAAGGGCTATAGCTGGTC
801 GCAGTTCTCCGACGTCGAGGAGAACCGGACCGAGGCCCCCGAGGGGACCG
851 AGTCCGAGATGGAGACGCCGAGCGCGATTAACGGCAACCCGAGCTGGCAC
901 CTGGCGGACTCCCCTGCCGTGAACGGCGCGACCGGCCACAGCTCCAGCCT
951 GGACGCGCGCGAGGTCATCCCGATGGCGGCCGTGAAGCAGGCCCTCCGCG
1001 AGGCCGGCGACGAGTTCGAGCTGCGCTATCGCCGCGCTTTCTCGGACCTG
1051 ACCAGCCAGCTGCACATCACCCCCGGCACGGCTTACCAAAGCTTCGAGCA
1101 GGTGGTGAACGAGCTGTTCCGCGACGGCGTGAACTGGGGTCGCATCGTGG
1151 CGTTCTTCAGCTTCGGCGGTGCGCTGTGCGTGGAGAGCGTCGACAAGGAG
1201 ATGCAGGTGCTGGTGTCGCGCATTGCGGCTTGGATGGCCACCTACCTGAA
1251 CGACCACCTGGAGCCCTGGATTCAGGAGAACGGCGGCTGGGACACCTTCG
1301 TCGAGCTGTACGGCAACAACGCTGCGGCGGAGAGCCGCAAGGGCCAAGAG
1351 CGGTTCAACCGCTGGTTCCTCACGGGGATGACCGTGGCGGGCGTCGTCCT
1401 GCTGGGCAGCCTGTTCTCGCGGAAGTAA SEQ ID NO 7.
1 ATGGTGTCGAAGGGTGAGGAGCTGTTTACCGGTGTCGTGCCTATTCTGGT
51 GGAGCTCGACGGCGACGTCAACGGGCACAAGTTTTCGGTGTCCGGCGAGG
101 GTGAGGGGGACGCGACGTACGGCAAGCTCACGCTGAAGCTGATCTGCACC
151 ACCGGCAAGCTGCCCGTCCCCTGGCCGACGCTGGTGACCACCCTGGGCTA
201 CGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCGGACCACATGAAGCAGCACGACT
251 TCTTCAAGTCGGCCATGCCCGAGGGGTACGTGCAGGAGCGCACGATCTTC
301 TTTAAGGACGATGGCAACTACAAGACCCGCGCTGAGGTGAAGTTCGAGGG
351 CGATACGCTGGTGAACCGCATCGAGCTCAAGGGCATCGACTTCAAGGAGG
401 ACGGCAACATCCTGGGTCACAAGCTGGAGTACAACTACAACTCCCACAAC
451 GTGTACATCACGGCGGATAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTTAA
501 GATTCGCCATAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACC
551 AGCAGAACACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGATAACCAC
601 TACCTCAGCTACCAGTCGGCCCTGTCCAAGGATCCCAACGAGAAGCGCGA
651 TCACATGGTCCTCCTGGAGTTCGTGACCGCCGCTGGCATCACCCTGGGCA
701 TGGACGAGCTGTACAAGGGGGTCCTTATGAGCCAGAGCAACCGGGAGCTG
751 GTGGTGGACTTCCTGAGCTACAAGCTGAGCCAAAAGGGCTATAGCTGGTC
801 GCAGTTCTCCGACGTCGAGGAGAACCGGACCGAGGCCCCCGAGGGGACCG
851 AGTCCGAGATGGAGACGCCGAGCGCGATTAACGGCAACCCGAGCTGGCAC
901 CTGGCGGACTCCCCTGCCGTGAACGGCGCGACCGGCCACAGCTCCAGCCT
951 GGACGCGCGCGAGGTCATCCCGATGGCGGCCGTGAAGCAGGCCCTCCGCG
1001 AGGCCGGCGACGAGTTCGAGCTGCGCTATCGCCGCGCTTTCTCGGACCTG
1051 ACCAGCCAGCTGCACATCACCCCCGGCACGGCTTACCAAAGCTTCGAGCA
1101 GGTGGTGAACGAGCTGTTCCGCGACGGCGTGAACTGGGGTCGCATCGTGG
1151 CGTTCTTCAGCTTCGGCGGTGCGCTGTGCGTGGAGAGCGTCGACAAGGAG
1201 ATGCAGGTGCTGGTGTCGCGCATTGCGGCTTGGATGGCCACCTACCTGAA
1251 CGACCACCTGGAGCCCTGGATTCAGGAGAACGGCGGCTGGGACACCTTCG
1301 TCGAGCTGTACGGCAACAACGCTGCGGCGGAGAGCCGCAAGGGCCAAGAG
1351 CGGTTCAACCGCTGGTTCCTCACGGGGATGACCGTGGCGGGCGTCGTCCT
1401 GCTGGGCAGCCTGTTCTCGCGGAAGTAA SEQ ID NO 7.
Ｖｅｎｕｓ−Ｂｃｌ−ｘLタンパク質（配列番号８）は、配列番号７の核酸によってコードされされている融合タンパク質である。後半のＢｃｌ−ｘLタンパク質配列（２３３ＡＡ）は、ＮＣＢＩデータベースからのＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：２０３３６３３４のＤＮＡ配列によってコードされている。
1 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKLICT
51 TGKLPVPWPTLVTTLGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIF
101 FKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHN
151 VYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNH
201 YLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGVLMSQSNREL
251 VVDFLSYKLSQKGYSWSQFSDVEENRTEAPEGTESEMETPSAINGNPSWH
301 LADSPAVNGATGHSSSLDAREVIPMAAVKQALREAGDEFELRYRRAFSDL
351 TSQLHITPGTAYQSFEQVVNELFRDGVNWGRIVAFFSFGGALCVESVDKE
401 MQVLVSRIAAWMATYLNDHLEPWIQENGGWDTFVELYGNNAAAESRKGQE
451 RFNRWFLTGMTVAGVVLLGSLFSRK* SEQ ID NO 8.
1 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKLICT
51 TGKLPVPWPTLVTTLGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIF
101 FKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHN
151 VYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNH
201 YLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGVLMSQSNREL
251 VVDFLSYKLSQKGYSWSQFSDVEENRTEAPEGTESEMETPSAINGNPSWH
301 LADSPAVNGATGHSSSLDAREVIPMAAVKQALREAGDEFELRYRRAFSDL
351 TSQLHITPGTAYQSFEQVVNELFRDGVNWGRIVAFFSFGGALCVESVDKE
401 MQVLVSRIAAWMATYLNDHLEPWIQENGGWDTFVELYGNNAAAESRKGQE
451 RFNRWFLTGMTVAGVVLLGSLFSRK* SEQ ID NO 8.
実施例１
本発明の代表的なベクター
本発明の代表的なベクター
本発明の構築物を図１に示す。基にしたベクターはｐＳＰ１２４である。V. Lumbreras, D.R.S. and S. Purton, Plant J., 14(4):441-447 (1998)を参照のこと。ベクターの特徴を図１にあげた。すなわち、図１に示した２つの領域は、ｐＳＰ１２４のベクター骨格の一部である。
周知の技術により、それぞれの合成ＤＮＡ断片を制限酵素部位を介して連結し、非ｐＳＰ１２４配列を好ましく改変する。別の方法、及び方法を組み合わせて用いることも可能である。例えば、いくつかの特徴をＰＣＲ産物として、又はその他に使用可能な構築物からの「切り貼り」で導入してもよい。通常、得られたベクターを確認するために、配列決定及び／又はその他のアッセイ（例えばサイズ解析、ハイブリダイゼーション）を行う。
一例として、ＢａｍＨＩを含み、ＥｃｏＲＩで終わる領域を合成することより、挿入断片の一部分を作出する（「合成＿１」）。この領域には、転写エンハンサー領域、２つのＬｅｘＡ結合モチーフ、ｒｕｂｉｓｃｏ転写プロモーター（ｒｂｃＳ２の最初のイントロンを含む）、ＹＦＰ−Ｂｃｌ−ｘL融合タンパク質、及びｒｕｂｉｓｃｏの３’ＵＴＲが含まれる。この例では、ＹＦＰ及びＢｃｌ−ｘLのコード領域を藻類で好ましいコドン使用頻度に基づいて設計した。
組み込む別の領域を高忠実度ＰＣＲで準備し、ｐ３００（ＨＡＴ）遺伝子（「ゲノムＰＣＲ」）を効果的に提供する。ゲノムＰＣＲ断片に隣接した２ｔの領域を、合成ＤＮＡによりさらに準備する（「合成＿２」）。ｐ３００遺伝子の上流の転写領域には、転写プロモーターとその下流にＬｅｘＡ結合ドメインコード配列、及び２つのＬｅｘＡ結合部位が含まれる。合成＿２領域には３’ＵＴＲが含まれる。合成＿２とゲノム領域は合わせて、ＬｅｘＡ−ｐ３００融合タンパク質（ＧＥＥ）をコードしている転写ユニットの全長を生成する。
図１及びこれらの説明は効果的に、本発明の構築物の特徴の例を提供し、かつ、藻類に適したプラスミド中に特徴を加える方法を説明する。２つの転写単位は反対の方向に転写されるように配置され、それぞれは２つのＬｅｘＡ結合部位を有し、これによってＬｅｘＡ−ｐ３００が４つの部位のいずれかに結合する機会を作り出し、転写ユニットのいずれかの転写レベルに影響を及ぼす。３番目の転写ユニットは選択マーカーであるブレオマイシン耐性を提供する。
このベクターの作出の根底にある概念、すなわち、ＤＮＡ−ＢＳの近傍に配置した遺伝子の発現レベルをＢＳを認識／結合するＧＥＥの存在下で効果的に上昇させること、を変化させることなく、ベクター中に発現のためのさらなる又は異なる遺伝子、遺伝子発現を制御するための異なる特徴、及びその他の制限部位を組み込むこと、並びにＬｅｘＡ−ＢＳの数を変えることなどの、その他の設計法が利用可能であることが当業者には明かだろう。
実施例２
別の代表的なベクター
別の代表的なベクター
大部分は同一だが、ＧＥＥユニットの有無が異なる２つのベクターを構築する。これらのベクターは互いに他の点では同じであり、かつ、図２Ａのベクターと同様である。これらのベクターを同時に使用することにより、他の点は同一の遺伝的バックグラウンドでの、ｐ３００の活性及びＬｅｘＡの役割を試験することができる。２つのベクターを使用することで、例えばその他の遺伝子の付加、さらに複数コピーのＧＥＥの付加などのさらなる改変によるＧＥＥ活性の変化を試験することもまた可能である。
特に、「ＬｅｘＡ ＢＳ」には結合部位の数になんの制限もない。１つのＢＳから多くのＢＳにしても指定した位置に配置することができる。経験的には、過剰な部位による効果は期待できないことから、約８ＢＳより多いＢＳの使用は好ましくない。好ましくは、約２−６のＢＳを領域に又は発現することが期待される遺伝子の５’末端に配置し、より好ましくは２−４ＢＳである。
実施例３
両方向性プロモーターを用いたＧＥＥの効果の特徴付け
両方向性プロモーターを用いたＧＥＥの効果の特徴付け
実験１。ＧＯＩの位置にＹＦＰレポーターをもつ両方向性構築物、及び２つの内の１つのＧＥＥ構築物の変異体（１）ＬｅｘＡ−ｐ３００キメラ遺伝子は反対の方向に転写される（図１）又は（２）ＬｅｘＡのみが反対の方向に転写され対照となる、を使用する。
２つの構築物で藻類を形質転換し、適切な抗生物質を含む選択培地（例えばブレオマイシンを含む培地）上で選抜した。選抜した後、各構築物による形質転換体から１００個のコロニーを選択し、ｒｔＰＣＲによるｍＲＮＡ発現、ウェスタンブロットによるタンパク質の発現、並びにフローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡による単一の細胞での蛍光を試験することにより、ＹＦＰ導入遺伝子の発現を解析する。クローン集団を２、４、６及び１０世代継代する。高レベルでＹＦＰを発現しているクローンの頻度を、ＬｅｘＡ−ｐ３００及びＬｅｘＡのみで比較する。ＬｅｘＡ−ｐ３００ＧＥＥでは、核に導入した遺伝子の発現が上昇し、時間が経過しても高レベルの発現が維持される。
実施例４
別個のプラスミドを用いたＧＥＥの効果の特徴付け
別個のプラスミドを用いたＧＥＥの効果の特徴付け
２セットの安定なクローンを作出する。１セット目は、ＬｅｘＡ−ｐ３００融合体（図２Ａ）をコードしている導入遺伝子を組み込んだ安定な細胞株で、これを次にＹＦＰベクター（図２Ｂ）を発現しているプラスミドで形質転換する。２セット目はＬｅｘＡのみ（ｐ３００融合パートナー以外は図２Ａと同様）をコードしている導入遺伝子を組み込んだ安定な細胞株で、これを次にＹＦＰベクター（図２Ｂ）を発現しているプラスミドで形質転換する。
安定な細胞株を選択し、時間経過に伴うＹＦＰの発現を、ｒｔＰＣＲによるｍＲＮＡの発現試験、ウェスタンブロットによるタンパク質発現の決定、並びにフローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡による単一の細胞内の蛍光を試験することによって特徴付ける。クローン集団を２、４、６及び１０世代継代する。同様に、高レベルでＹＦＰを発現しているクローンの頻度をＬｅｘＡ−ｐ３００及びＬｅｘＡのみで比較する。ＬｅｘＡ−ｐ３００ＧＥＥでは、核に導入した遺伝子の発現が上昇し、時間が経過しても高レベルの発現が維持される。
上に記載した本発明は、添付の請求項及び図面と合わせて読まれるべきである。実施形態及び実施例の詳細により、本発明の様々な実施を行うことができる。実施形態及び実施例は本発明を好ましい実施形態に制限することを意図しないが、本発明の特定の例として役立つ。開示した概念及び特定の実施形態を、変更を行うための、又は本発明と同じ目的をもつその他の方法及び系を設計するための基礎として容易に用いることができることを当業者は理解するだろう。
本明細書で引用した、出版物、特許出願、特許及びウェブサイトに含まれる内容を含む全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照により組み込まれること個別に及び特定して示すものと同様に、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる。
本明細書において言及したウェブサイトは、２０１０年１０月３０日時点のものである。
本明細書においては、別段の指定のない限り又はその文脈で明かに矛盾がない限り、本明細書で記載した文脈で使用される「１つ（ａ）」及び「１種（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」及び同様の用語は、単数及び複数の両方を包含すると解釈される。
本明細書における値の範囲の記載は、本明細書では単に、その範囲に中にある個々の値をそれぞれ個別に記載することの簡略法として役立ち、そして別段の指定のない限り本明細書においては、それぞれ個別の値は、本明細書で個々に記載されたかのうように、明細書中に組み込まれる。数値に伴って使用される場合、用語「約」は、述べられた数値の１０％の偏差を含み、１０％の偏差までの数値を示していると解釈される。任意の及び全ての実施例、又は例を示す言葉（「例えば」又は「など」）の使用は本明細書では、単に本発明の理解をより容易にするためだけに用いられ、請求項に記載の内限り、本発明の範囲を制限するものではない。明細書中のいずれの言葉も、請求項に記載されていない任意の要素が本発明の実施に必須であることを示しているとは解釈されない。
Claims (20)
- 藻類での遺伝子発現を増強する系であって、
ＤＮＡ結合タンパク質に機能的に融合させた藻類由来ｐ３００を含み、少なくとも該ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのコード配列の一部分は藻類での発現を改善させるためにコドン最適化してある遺伝子発現増強（ＧＥＥ）融合タンパク質のコード配列の機能的上流に配置した藻類に適した転写プロモーター、
藻類に適した転写プロモーターの機能的下流に配置した少なくとも１つの導入遺伝子、及び
ＤＮＡ結合タンパク質の結合部位であり、少なくとも１つの前記転写プロモーターの近くに配置した、少なくとも１つのＤＮＡ領域を含む、
藻類での遺伝子発現を高めるための、藻類中にある、前記系。 - ＤＮＡ結合タンパク質がＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインである、請求項１に記載の系。
- ＧＥＥ融合タンパク質のｐ３００部分がコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来である、請求項１に記載の系。
- ｐ３００タンパク質のＨＡＴドメインのみがＧＥＥ融合タンパク質の一部分である、請求項１に記載の系。
- 導入遺伝子の藻類での発現が改善されるようにコドンを変化させた、請求項１に記載の系。
- 導入遺伝子が、蛍光−Ｂｃｌ−ｘL融合遺伝子である、請求項５に記載の系。
- 蛍光−Ｂｃｌ−ｘL融合遺伝子がＹＦＰ−Ｂｃｌ−ｘL融合体である、請求項６に記載の系。
- 蛍光−Ｂｃｌ−ｘL融合遺伝子がＶｅｎｕｓ−Ｂｃｌ−ｘL融合体である、請求項６に記載の系。
- 少なくとも１つの選択マーカーをさらに含む、請求項１に記載の系。
- ＧＥＥ融合タンパク質と少なくとも１つの導入遺伝子を、２つのプロモーターの近傍に配置したＤＮＡ結合部位を含む１つの両方向性プロモーター領域から発現されるような構造で配置した１つのベクターを用いて導入する、請求項９に記載の系。
- ＧＥＥ融合タンパク質と導入遺伝子を、それぞれが選択マーカーを含み、それぞれの選択マーカーが同じではない別個のベクターを用いて導入する、請求項９に記載の系。
- 藻類に適した転写プロモーターがｈｓｐ７０、ｒｂｃＳ、ｎｉｔＡ、ｔｕｂＡ２又はその組み合わせである、請求項１に記載の系。
- ＧＥＥ融合タンパク質が、ＨＡＴ領域がコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来のｐ３００のＨＡＴ領域と少なくとも８０％の同一性を有する藻類由来ｐ３００ホモログに機能的に融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項１に記載の系。
- ＧＥＥ融合タンパク質が、ＨＡＴ領域がコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来のｐ３００のＨＡＴ領域と少なくとも８０％の同一性を有する藻類由来のｐ３００ホモログのＨＡＴドメインに機能的に融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項１３に記載の系。
- 藻類において高レベルで遺伝子を発現させる方法であって、
ＤＮＡ結合タンパク質に機能的に融合させた藻類由来ｐ３００を含み、少なくとも該ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのコード配列の一部分は藻類での発現を改善させるためにコドン最適化してある遺伝子発現増強（ＧＥＥ）融合タンパク質のコード配列の機能的上流に配置した藻類に適した転写プロモーター、藻類に適した転写プロモーターの機能的下流に配置した少なくとも１つの導入遺伝子、及びＤＮＡ結合タンパク質の結合部位であり、少なくとも１つの前記転写プロモーターの近くに配置した少なくとも１つのＤＮＡ領域を含む、少なくとも１つのベクターで藻類を形質転換する工程、形質転換された藻類細胞を選抜する工程、及び
前記ＧＥＥ遺伝子又は前記導入遺伝子の藻類での発現を検出する工程を含む、前記方法。 - 前記ＤＮＡ結合タンパク質がＬｅｘＡ結合ドメインである、請求項１５に記載の方法。
- ｐ３００がコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来である、請求項１５に記載の方法。
- ＧＥＥ融合タンパク質が、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来ｐ３００タンパク質のＨＡＴドメインに機能的に融合させたＬｅｘＡ結合ドメインを含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記導入遺伝子がＹＦＰ−Ｂｃｌ−ｘL融合タンパク質又はＶｅｎｕｓ−Ｂｃｌ−ｘL融合タンパク質である、請求項に１７記載の方法。
- まずＧＥＥ融合タンパク質を安定して発現しているベクターを選抜し、次に導入遺伝子を含むベクターを用いて選抜した藻類を形質転換する、別個のベクターにのせた前記ＧＥＥ融合タンパク質及び前記導入遺伝子を用いて藻類を形質転換する、請求項１５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US25692109P | 2009-10-30 | 2009-10-30 | |
| US61/256,921 | 2009-10-30 | ||
| PCT/US2010/055012 WO2011053935A2 (en) | 2009-10-30 | 2010-11-01 | Enhanced gene expression in algae |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2013509199A true JP2013509199A (ja) | 2013-03-14 |
Family
ID=43923055
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012537176A Withdrawn JP2013509199A (ja) | 2009-10-30 | 2010-11-01 | 藻類での遺伝子発現の増強 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8476019B2 (ja) |
| EP (1) | EP2494054A4 (ja) |
| JP (1) | JP2013509199A (ja) |
| KR (1) | KR20120092647A (ja) |
| CA (1) | CA2779273A1 (ja) |
| WO (1) | WO2011053935A2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120092647A (ko) * | 2009-10-30 | 2012-08-21 | 시냅틱 리서치, 엘엘씨 | 조류에서 향상된 유전자 발현 |
| US10570378B2 (en) * | 2012-02-28 | 2020-02-25 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Targeted histone acetylation |
| EP3997221A4 (en) * | 2019-07-08 | 2023-07-05 | Inscripta, Inc. | INCREASED NUCLEIC ACID-DRIVEN CELL EDIT VIA A LEXA-RAD51 FUSION PROTEIN |
| KR102242665B1 (ko) * | 2019-11-28 | 2021-04-21 | 부경대학교 산학협력단 | 클로렐라 불가리스 hsp70 유래의 열 유도성 프로모터 및 이의 용도 |
| CN114574515B (zh) * | 2022-02-28 | 2023-12-08 | 修实生物医药(南通)有限公司 | 一种抗逆性强的莱茵衣藻表达蛋白的方法 |
| WO2023198774A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Institute Of Agricultural Resources And Regional Planning Of The Chinese Academy Of Agricultural Sciences | Modified microalgae for enhanced phosphate uptade involving overexpression of psr1 and optionally underexpression of ptc1 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030145349A1 (en) | 1997-06-12 | 2003-07-31 | Odell Joan Tellefsen | Plant transcription coactivators with histone acetyl transferase activity |
| US20030186424A1 (en) | 2001-08-29 | 2003-10-02 | Roninson Igor B. | Reagents and methods for identifying and modulating expression of genes regulated by CDK inhibitors |
| EP1572994B1 (en) * | 2002-12-20 | 2007-02-21 | Chromagenics B.V. | Means and methods for producing a protein through chromatin openers that are capable of rendering chromatin more accessible to transcription factors |
| KR20120092647A (ko) * | 2009-10-30 | 2012-08-21 | 시냅틱 리서치, 엘엘씨 | 조류에서 향상된 유전자 발현 |
-
2010
- 2010-11-01 KR KR1020127014091A patent/KR20120092647A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-11-01 CA CA2779273A patent/CA2779273A1/en not_active Abandoned
- 2010-11-01 US US13/504,741 patent/US8476019B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-11-01 WO PCT/US2010/055012 patent/WO2011053935A2/en active Application Filing
- 2010-11-01 JP JP2012537176A patent/JP2013509199A/ja not_active Withdrawn
- 2010-11-01 EP EP10827622.1A patent/EP2494054A4/en not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-06-25 US US13/925,921 patent/US8815568B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2494054A4 (en) | 2013-04-24 |
| US20130273638A1 (en) | 2013-10-17 |
| WO2011053935A2 (en) | 2011-05-05 |
| CA2779273A1 (en) | 2011-05-05 |
| US8476019B2 (en) | 2013-07-02 |
| US20120208201A1 (en) | 2012-08-16 |
| KR20120092647A (ko) | 2012-08-21 |
| WO2011053935A3 (en) | 2011-09-15 |
| EP2494054A2 (en) | 2012-09-05 |
| US8815568B2 (en) | 2014-08-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vom Endt et al. | Identification of a bipartite jasmonate-responsive promoter element in the Catharanthus roseus ORCA3 transcription factor gene that interacts specifically with AT-Hook DNA-binding proteins | |
| Okushima et al. | ARF7 and ARF19 regulate lateral root formation via direct activation of LBD/ASL genes in Arabidopsis | |
| Antony et al. | Rice xa13 recessive resistance to bacterial blight is defeated by induction of the disease susceptibility gene Os-11N3 | |
| Wang et al. | TRICHOMELESS1 regulates trichome patterning by suppressing GLABRA1 in Arabidopsis | |
| Moreau et al. | The Myb-domain protein ULTRAPETALA1 INTERACTING FACTOR 1 controls floral meristem activities in Arabidopsis | |
| Schunmann et al. | Promoter analysis of the barley Pht1; 1 phosphate transporter gene identifies regions controlling root expression and responsiveness to phosphate deprivation | |
| Koshino-Kimura et al. | Regulation of CAPRICE transcription by MYB proteins for root epidermis differentiation in Arabidopsis | |
| JP5758376B2 (ja) | イネのジンクフィンガータンパク質転写因子ｄｓｔならびに渇水および塩の耐性を調節するためのその使用 | |
| Dixit et al. | A novel stress-associated protein ‘AtSAP10’from Arabidopsis thaliana confers tolerance to nickel, manganese, zinc, and high temperature stress | |
| Wang et al. | Methyl-CpG-binding domain protein MBD7 is required for active DNA demethylation in Arabidopsis | |
| Chen et al. | Identification, cloning and characterization of R2R3-MYB gene family in canola (Brassica napus L.) identify a novel member modulating ROS accumulation and hypersensitive-like cell death | |
| Qiao et al. | ZmMADS47 regulates zein gene transcription through interaction with Opaque2 | |
| Zhou et al. | Genome-wide mining of wheat DUF966 gene family provides new insights into salt stress responses | |
| Zhang et al. | TcMYC2a, a basic helix–loop–helix transcription factor, transduces JA-signals and regulates taxol biosynthesis in Taxus chinensis | |
| Zhao et al. | REPRESSOR OF SILENCING5 encodes a member of the small heat shock protein family and is required for DNA demethylation in Arabidopsis | |
| US8815568B2 (en) | Enhanced gene expression in algae | |
| Xing et al. | Arabidopsis PCFS4, a homologue of yeast polyadenylation factor Pcf11p, regulates FCA alternative processing and promotes flowering time | |
| Pattanaik et al. | The interaction domains of the plant Myc-like bHLH transcription factors can regulate the transactivation strength | |
| Xiong et al. | Multiplex and optimization of dCas9‐TV‐mediated gene activation in plants | |
| Li et al. | HbMADS4, a MADS-box transcription factor from Hevea brasiliensis, negatively regulates HbSRPP | |
| CN110041416B (zh) | GmABCA9基因在提高大豆蛋白含量和粒重中的应用 | |
| Mishra et al. | Intergenic sequence between Arabidopsis caseinolytic protease B-cytoplasmic/heat shock protein100 and choline kinase genes functions as a heat-inducible bidirectional promoter | |
| CN112010955B (zh) | 小麦抗赤霉病相关蛋白TaRBL及其编码基因与应用 | |
| Seo et al. | Identification of a novel jasmonate-responsive element in the AtJMT promoter and its binding protein for AtJMT repression | |
| Zhao et al. | Using hybrid transcription factors to study gene function in rice |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20140107 |