JP2011046725A - StreptococcusPyogenesについての免疫原組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、単独で使用するか、あるいは、別のGAS抗原、例えば、GAS117、GAS130、GAS277、GAS236、GAS40、GAS389、GAS504、GAS509、GAS366、GAS159、GAS217、GAS309、GAS372、GAS039、GAS042、GAS058、GAS290、GAS511、GAS533、GAS527、GAS294、GAS253、GAS529、GAS045、GAS095、GAS193、GAS137、GAS084、GAS384、GAS202、およびGAS057と組み合わせて使用するのに特に好適なGAS抗原、GAS40を含む。
【選択図】なし
Description
本出願は、米国特許仮出願番号60/491,822(2003年7月31日出願)および米国特許仮出願番号60/541,565(2004年2月3日出願)の全体を参考として援用する。
本発明は免疫学およびワクチン学の分野に属する。特に、本発明は、Streptococcus pyogenes(化膿連鎖球菌)から得られた複数の抗原、および免疫化におけるそれらの使用法に関する。本明細書に引用される文書は全てその全体を参照することによって本明細書に含める。
A群連鎖球菌(「GAS,」S.pyogenes)は、ヒトに高頻度に見られる病原体で、病気の徴候を呈することなく正常なヒトの5−15%に存在すると推定されている。一方、宿主の防御機構が危殆に瀕している場合、または、この微生物が悪性の猛威を発揮することが可能となった場合、または、この微生物が脆弱な組織または宿主に導入された場合、急性の感染症が起こる。関連疾患としては、産褥熱、しょう紅熱、丹毒、咽頭炎、インペチゴ、壊死性筋膜炎、筋炎、および連鎖球菌トキシックショック症候群が挙げられる。
本出願人等は、免疫化に特に適しており、特に組み合わせて使用するのに適している30種の抗原からなるGAS抗原群を発見した。さらに、本出願人等は、単独でも、または、別のGAS抗原と組み合わせて使用しても、免疫原性に特に優れるGAS抗原(GAS40)を特定した。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
(項目1)
GAS抗原の組み合わせを含む免疫原組成物であって、該組み合わせは2種から10種のGAS抗原からなり、該組み合わせは、GAS40を含む、組成物。
(項目2)
上記GAS抗原の組み合わせは、GAS39、GAS57、GAS117、GAS202、GAS294、GAS527、GAS533、およびGAS511からなる群から選択される1種以上のGAS抗原をさらに含む、項目1に記載の組成物。
(項目3)
上記GAS抗原の組み合わせは、GAS117を含む、項目1に記載の組成物。
(項目4)
上記GAS40抗原は、第1のコイルドコイル領域および第2のコイルドコイル領域を含むアミノ酸配列を含む、項目1に記載の組成物。
(項目5)
上記GAS40抗原は、第1のコイルドコイル領域を含むアミノ酸配列を含む、項目1に記載の組成物。
(項目6)
上記第1のコイルドコイル領域は、配列番号12を含むアミノ酸配列を含む、項目5に記載の組成物。
(項目7)
上記GAS40抗原は、第2のコイルドコイル領域を含むアミノ酸配列を含む、項目4に記載の組成物。
(項目8)
上記第2のコイルドコイル領域は、ロイシンジッパー領域を含む、項目7に記載の組成物。
(項目9)
上記第2のコイルドコイル領域は、配列番号13を含むアミノ酸配列を含む、項目7に記載の組成物。
(項目10)
GAS抗原の組み合わせを含む免疫原組成物であって、該組み合わせは、第1の抗原群の2種から31種のGAS抗原からなり、該第1の抗原群は、GAS117、GAS130、GAS277、GAS236、GAS40、GAS389、GAS504、GAS509、GAS366、GAS159、GAS217、GAS309、GAS372、GAS039、GAS042、GAS058、GAS290、GAS511、GAS533、GAS527、GAS294、GAS253、GAS529、GAS045、GAS095、GAS193、GAS137、GAS084、GAS384、GAS202、およびGAS057からなる、免疫原組成物。
(項目11)
上記GAS抗原の組み合わせは、GAS39、GAS40、GAS57、GAS117、GAS202、GAS294、GAS527、GAS533、およびGAS511からなる群から選択される、項目10に記載の免疫原組成物。
(項目12)
上記GAS抗原の組み合わせは、GAS40およびGAS117を含む、項目10に記載の免疫原組成物。
(項目13)
上記組み合わせは、GAS40を含む、項目10に記載の免疫原組成物。
(項目14)
上記GAS40は、(a)第1のコイルドコイル領域、(b)第2のコイルドコイル領域、または、(c)第1のコイルドコイル領域および第2のコイルドコイル領域を含むアミノ酸配列から選択される、項目10に記載の免疫原組成物。
(項目15)
GAS抗原の組み合わせを含む融合構築体であって、該組み合わせは、第1の抗原群の2種から31種のGAS抗原からなり、該第1の抗原群は、GAS117、GAS130、GAS277、GAS236、GAS40、GAS389、GAS504、GAS509、GAS366、GAS159、GAS217、GAS309、GAS372、GAS039、GAS042、GAS058、GAS290、GAS511、GAS533、GAS527、GAS294、GAS253、GAS529、GAS045、GAS095、GAS193、GAS137、GAS084、GAS384、GAS202、およびGAS057からなる、融合構築体。
(項目16)
上記組み合わせは、GAS40を含む、項目15に記載の融合構築体。
(項目17)
上記組み合わせは、GAS40およびGAS117を含む、項目15に記載の融合構築体。
(項目18)
2種以上の抗体の組み合わせを含む組成物であって、該抗体は、GAS40、GAS117、GAS130、GAS277、GAS236、GAS40、GAS389、GAS504、GAS509、GAS366、GAS159、GAS217、GAS309、GAS372、GAS039、GAS042、GAS058、GAS290、GAS511、GAS533、GAS527、GAS294、GAS253、GAS529、GAS045、GAS095、GAS193、GAS137、GAS084、GAS384、GAS202、およびGAS057に対して特異的な抗体を含む抗体に対して特異的な抗体からなる群から選択される、組成物。
(項目19)
上記組み合わせは、GAS40に対して特異的な抗体を含む、項目18に記載の組成物。
(項目20)
上記GAS40特異的抗体は、GAS40の第1のコイルドコイル領域または第2のコイルドコイル領域に対して特異的である、項目19に記載の組成物。
(項目21)
連鎖球菌感染に対して感受性である動物において、Streptococcus pyogenes感染を治療的または予防的に処置するための方法であって、該方法は、治療量または予防量の項目1から20のいずれか1項に記載の免疫原組成物を、該動物に投与する工程を包含する、方法。
(項目22)
項目1から20のいずれか1項に記載の免疫原組成物を製造する方法。
(項目23)
項目1から20のいずれか1項に記載の免疫原組成物を含む第1の成分を含むキット。
(項目24)
GAS40抗原を含む組成物であって、該抗原は、第1のコイルドコイル領域または第2のコイルドコイル領域を含むアミノ酸配列を含む、組成物。
(項目25)
上記GAS40抗原は、配列番号12を含む第1のコイルドコイル領域を含む、項目24に記載の組成物。
(項目26)
上記GAS40抗原は、配列番号13を含む第2のコイルドコイル領域を含む、項目24に記載の組成物。
(項目27)
項目24から26のいずれか1項に記載の組成物に対して特異的な抗体。
上に論じたように、本発明は、GAS抗原の組み合わせを含む組成物を提供する。その組み合わせは、本出願人等が、免疫化に、特に好適であるものとして、特に組み合わせて用いた場合に好適であるものとして特定した抗原群から選択され得る。特に、本発明は、GAS40を含む組成物を含む。
GAS40は、M1 GenBank登録番号GI:13621545およびGI:15674449、M3 GenBank登録番号GI:21909733、M18 GenBank登録番号GI:19745402に一致し、「Spy0269」(M1)、「SpyM3_0197」(M3)、「SpyM18_0256」(M18)、および「prgA」とも呼ばれる。GAS40はまた、推定表面排除タンパクとしても特定されている。M1種のGAS40のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は、下記の配列番号1および2として配列リストに記載される。
)。
GAS117は、M1、GenBank登録番号GI:13621679およびGI:15674571、M3、GenBank登録番号GI:21909852、M18、GenBank登録番号GI:19745578に対応し、また、「Spy0448」(M1)、「SpyM3_0316」(M3)、および「SpyM18_0491」(M18)とも呼ばれる。M1株のGAS117のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号35と36に記載される。
GAS130は、M1、GenBank登録番号GI:13621794およびGI:15674677、M3、GenBank登録番号GI:21909954、M18、GenBank登録番号GI:19745704に対応し、また、「Spy0591」(M1)、「SpyM3_0418」(M3)、および「SpyM18_0660」(M18)とも呼ばれる。GAS130は、プロテアーゼと特定される可能性がある。M1株のGAS130のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号39と40に記載される。
GAS277は、M1、GenBank登録番号GI:13622962およびGI:15675742、M3、GenBank登録番号GI:21911206、M18、GenBank登録番号GI:19746852に対応し、また、「Spy1939」(M1)、「SpyM3_1670」(M3)、および「SpyM18_2006」(M18)とも呼ばれる。M1株のGAS277のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号41と42に記載される。
GAS236は、M1、GenBank登録番号GI:13622264およびGI:15675106、M3、GenBank登録番号GI:21910321、M18、GenBank登録番号GI:19746075に対応し、また、「Spy1126」(M1)、「SpyM3_0785」(M3)、および「SpyM18_1087」(M18)とも呼ばれる。M1株のGAS236のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号45と46に記載される。
GAS389は、M1、GenBank登録番号GI:13622996およびGI:15675772、M3、GenBank登録番号GI:21911237、M18、GenBank登録番号GI:19746884に対応し、また、「Spy1981」(M1)、「SpyM3_1701」(M3)、および「SpyM18_2045」(M18)および「relA」とも呼ばれる。GAS389はまた、(p)ppGpp合成酵素と特定されている。M1株のGAS389のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号49と50に記載される。
GAS504は、M1、GenBank登録番号GI:13622806およびGI:15675600、M3、GenBank登録番号GI:21911061、M18、GenBank登録番号GI:19746708に対応し、また、「Spy1751」(M1)、「SpyM3_1525」、「SpyM18_1823」(M18)および「fabK」とも呼ばれる。GAS504はまた、予想トランス−2−エノイル−ACP還元酵素IIと特定されている。M1株のGAS504のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号51と52に記載される。
GAS509は、M1、GenBank登録番号GI:13622692およびGI:15675496、M3、GenBank登録番号GI:21910899、M18、GenBank登録番号GI:19746544に対応し、また、「Spy1618」(M1)、「SpyM3_1363」(M3)、「SpyM18_1627」(M18)および「cysM」とも呼ばれる。GAS509はまた、予想O−アセチルセリンリアーゼと特定されている。M1株のGAS509のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号53と54に記載される。
GAS366は、M1、GenBank登録番号GI:13622612、GI:15675424およびGI:30315979、M3、GenBank登録番号GI:21910712、M18、GenBank登録番号GI:19746474に対応し、また、「Spy1525」(M1)、「SpyM3_1176」(M3)、「SpyM18_1542」(M18)および「murD」とも呼ばれる。GAS366はまた、UDP−N−アセチルムラモイルアラニン−D−グルタメート・リガーゼ、またはDグルタミン酸付加酵素と特定されている。M1株のGAS366のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号57と58に記載される。
GAS159は、M1、GenBank登録番号GI:13622244、およびGI:15675088、M3、GenBank登録番号GI:21910303、M18、GenBank登録番号GI:19746056に対応し、また、「Spy1105」(M1)、「SpyM3_0767」(M3)、「SpyM18_1067」(M18)および「potD」とも呼ばれる。GAS159はまた、予想のスペルイジン/プトレシンABC輸送体(原形質周辺輸送タンパク)と特定されている。M1株のGAS159のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号61と62に記載される。
GAS217は、M1、GenBank登録番号GI:13622089およびGI:15674945、M3、GenBank登録番号GI:21910174、M18、GenBank登録番号GI:19745987に対応し、また、「Spy0925」(M1)、「SpyM3_0638」(M3)、「SpyM18_0982」(M18)とも呼ばれる。GAS217はまた、予想酸化還元酵素と特定されている。M1株のGAS217のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号68と69に記載される。
GAS309は、M1、GenBank登録番号GI:13621426およびGI:15674341、M3、GenBank登録番号GI:21909633、M18、GenBank登録番号GI:19745363に対応し、また、「Spy0124」(M1)、「SpyM3_0097」(M3)、「SpyM18_0205」(M18)、「nra」および「rofA」とも呼ばれる。GAS309はまた、調整タンパクおよび陰性転写制御因子と特定されている。M1株のGAS309のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号70と71に記載される。
GAS372は、M1、GenBank登録番号GI:13622698およびGI:15675501、M3、GenBank登録番号GI:21910905、M18、GenBank登録番号GI:19746500に対応し、また、「Spy1625」(M1)、「SpyM3_1369」(M3)、「SpyM18_1634」(M18)とも呼ばれる。GAS372はまた、予想タンパクキナーゼ、または予想真核細胞型セリン/トレオニンキナーゼと特定されている。M1株のGAS372のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号72と73に記載される。
GAS039は、M1、GenBank登録番号GI:13621542およびGI:15674446、M3、GenBank登録番号GI:21909730、M18、GenBank登録番号GI:19745398に対応し、また、「Spy0266」(M1)、「SpyM3_0194」(M3)、「SpyM18_0250」(M18)とも呼ばれる。M1株のGAS039のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号74と75に記載される。
GAS042は、M1、GenBank登録番号GI:13621559およびGI:15674461、M3、GenBank登録番号GI:21909745、M18、GenBank登録番号GI:19745415に対応し、また、「Spy0287」(M1)、「SpyM3_0209」(M3)、「SpyM18_0275」(M18)とも呼ばれる。M1株のGAS042のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号76と77に記載される。
GAS058は、M1、GenBank登録番号GI:13621663、GI:15674556、M3、GenBank登録番号GI:21909841、M18、GenBank登録番号GI:19745567に対応し、また、「Spy0430」(M1)、「SpyM3_0305」(M3)、および「SpyM18_0477」(M18)とも呼ばれる。M1株のGAS058のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号78と79に記載される。
GAS290は、M1、GenBank登録番号GI:13622978およびGI:15675757、M3、GenBank登録番号GI:21911221、M18、GenBank登録番号GI:19746869に対応し、また、「Spy1959」(M1)、「SpyM3_1685」(M3)、「SpyM18_2026」(M18)とも呼ばれる。M1株のGAS290のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号82と83に記載される。
GAS511は、M1、GenBank登録番号GI:13622798およびGI:15675592、M3、GenBank登録番号GI:21911053、M18、GenBank登録番号GI:19746700に対応し、また、「Spy1743」(M1)、「SpyM3_1517」(M3)、「SpyM18_1815」(M18)および「accA」とも呼ばれる。M1株のGAS511のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号84と85に記載される。
GAS533は、M1、GenBank登録番号GI:13622912およびGI:15675696、M3、GenBank登録番号GI:21911157、M18、GenBank登録番号GI:19746804に対応し、また、「Spy1877」(M1)、「SpyM3_1621」(M3)、「SpyM18_1942」(M18)および「glnA」とも呼ばれる。GAS533はまた、予想グルタミン合成酵素として特定される。M1株のGAS533のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号86と87に記載される。
GAS527は、M1、GenBank登録番号GI:13622332、GI:15675169、およびGI:24211764、M3、GenBank登録番号GI:21910381、M18、GenBank登録番号GI:19746136に対応し、また、「Spy1204」(M1)、「SpyM3_0845」(M3)、「SpyM18_1155」(M18)および「guaA」とも呼ばれる。GAS527はまた、GMP合成酵素(グルタメート加水分解性)(グルタメートアミドトランスフェラーゼ)として特定される。M1株のGAS527のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号88と89に記載される。
GAS294は、M1、GenBank登録番号GI:13622306、GI:15675145、およびGI:26006773、M3、GenBank登録番号GI:21910357、M18、GenBank登録番号GI:19746111に対応し、また、「Spy1173」(M1)、「SpyM3_0821」(M3)、「SpyM18_1125」(M18)および「gid」とも呼ばれる。GAS294はまた、グルコース抑制区画タンパクとして特定される。M1株のGAS294のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号90と91に記載される。
GAS253は、M1、GenBank登録番号GI:13622611、GI:15675423、およびGI:21362716、M3、GenBank登録番号GI:21910711、M18、GenBank登録番号GI:19746473に対応し、また、「Spy1524」(M1)、「SpyM3_1175」(M3)、「SpyM18_1541」(M18)および「murG」とも呼ばれる。GAS253はまた、予想ウンデカプレニル−PP−MurNAc−ペンタペプチド−UDPGlcNAcGlcNAc転移酵素として特定される。M1株のGAS253のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号92と93に記載される。
GAS529は、M1、GenBank登録番号GI:13622403、GI:15675233、およびGI:21759132、M3、GenBank登録番号GI:21910446、M18、GenBank登録番号GI:19746203に対応し、また、「Spy1280」(M1)、「SpyM3_0910」(M3)、「SpyM18_1228」(M18)および「glmS」とも呼ばれる。GAS529はまた、予想L−グルタミン−D−フルクトース−6−リン酸アミノ基転移酵素(グルコサミン−6−リン酸合成酵素)として特定される。M1株のGAS529のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号94と95に記載される。
GAS045は、M3、GenBank登録番号GI:21909751、M18、GenBank登録番号GI:19745421に対応し、また、「SpyM3_0215」(M3)、「SpyM18_oppA」(M18)、および「oppA」とも呼ばれる。GAS045は、オリゴペプチドパーミアーゼとして特定される。M1株のGAS045のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号96と97に記載される。
GAS095は、M1、GenBank登録番号GI:13622787およびGI:15675582、M3、GenBank登録番号GI:21911042、M18、GenBank登録番号GI:19746634に対応し、また、「Spy1733」(M1)、「SpyM3_1506」(M3)、「SpyM18_1741」(M18)とも呼ばれる。GAS095はまた、予測転写調節因子としても特定される。M1株のGAS095のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号100と101に記載される。
GAS193は、M1、GenBank登録番号GI:13623029、およびGI:15675802、M3、GenBank登録番号GI:21911267、M18、GenBank登録番号GI:19746914に対応し、また、「Spy2025」(M1)、「SpyM3_1731」(M3)、「SpyM18_2082」(M18)および「isp」とも呼ばれる。GAS193はまた、免疫原性分泌タンパク前駆物質として特定される。M1株のGAS193のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号104と105に記載される。
GAS137は、M1、GenBank登録番号GI:13621842、GI:15674720、およびGI:30173748、M3、GenBank登録番号GI:21909998、M18、GenBank登録番号GI:19745749に対応し、また、「Spy0652」(M1)、「SpyM3_0462」、「SpyM18_0713」(M18)とも呼ばれる。M1株のGAS137のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号106と107に記載される。
GAS084は、M1、GenBank登録番号GI:13622398およびGI:15675229、M3、GenBank登録番号GI:21910442、M18、GenBank登録番号GI:19746199に対応し、また、「Spy1274」(M1)、「SpyM3_0906」、「SpyM18_1223」(M18)とも呼ばれる。GAS084はまた、予想アミノ酸ABC輸送体/原形質周辺アミノ酸結合タンパクと特定されている。M1株のGAS084のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号108と109に記載される。
GAS384は、M1、GenBank登録番号GI:13622908、およびGI:15675693、M3、GenBank登録番号GI:21911154、M18、GenBank登録番号GI:19746801に対応し、また、「Spy1874」(M1)、「SpyM3_1618」(M3)、「SpyM18_1939」(M18)とも呼ばれる。GAS384はまた、予想糖タンパクエンドペプチダーゼとしても特定される。M1株のGAS384のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号112と113に記載される。
GAS202は、M1、GenBank登録番号GI:13622431、およびGI:15675258、M3、GenBank登録番号GI:21910527、M18、GenBank登録番号GI:19746290に対応し、また、「Spy13094」(M1)、「SpyM3_0991」(M3)、「SpyM18_1321」(M18)および「dltD」とも呼ばれる。GAS202はまた、予想の膜外タンパクとしても特定される。M1株のGAS202のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号114と115に記載される。
GAS057は、M1、GenBank登録番号GI:13621655およびGI:15674549、M3、GenBank登録番号GI:21909834、M18、GenBank登録番号GI:19745560に対応し、また、「Spy0416」(M1)、「SpyM3_0298」(M3)、「SpyM18_0464」(M18)および「prtS」とも呼ばれる。GAS057はまた、予想細胞エンベローププロテイナーゼと特定されている。M1株のGAS057のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号116と117に記載される。
Mタンパクは、コロニー形成と食作用に対する耐性と関連するGAS毒性因子である。Mタンパクについては、抗原特異性に基づいて、100を超える様々なタイプの変種が特定されており、Mタンパクは、GASにおける抗原性シフトおよび抗原性ドリフトの主要原因であると考えられている。Mタンパクも血清のフィブリノーゲンに結合し、補体の、内部のペプチドグリカンに対する結合を阻止する。この活動は、食作用を抑制することによって哺乳類宿主の内部におけるGAS生存率を高めると考えられている。
以上により、本発明の組成物はさらに、GAS M表面タンパク、または、その断片または誘導体を含んでもよい。1種以上のGAS M表面タンパク断片が、一つの融合タンパクの中で結合している可能性がある。別に、1種以上のGAS M表面タンパク断片が、第1の抗原群のGAS抗原、またはその断片と組み合わせられる。GAS Mタンパクの一つの例が、配列番号123として配列リストに記載される。
GASフィブロネクチン結合性タンパク(「SfbI」)は、細菌の、宿主細胞に対する付着を仲介し、細菌の細胞への取り込みを促進し、ヒトIgGのFc断片に結合してFc受容体介在食作用および抗体依存性細胞傷害性を妨げる、多機能細菌タンパクである。マウスのSfbIおよび「H12断片」(SfbI遺伝子の位置1240−1854によってコードされる)による免疫化がSchulze et al.,Vaccine(2003)21:1958−1964;Schulze et al.,Infection and Immunity(2001)69(1):622−625、および Guzman et al., Journal of Infectious Diseases(1999)179:901−906に論じられている。GAS SfbIのアミノ酸配列の一例が、配列番号124として配列リストに示される。
GAS連鎖球菌ヘム関連タンパク(「Shp」)は、GAS細胞表面タンパクと特定されていた。これは、グラム陰性細菌におけるイオン摂取に関与するABC輸送体の相同体をコードする遺伝子と共に転写されると考えられている。Shpタンパクは、さらに精しく、Lei et al.,「Identification and Characterization of a Novel Heme−Associated Cell Surface Protein Made by Streptococcus pyogenes,」Infection and Immunity(2002)70(8):4494−4500に記載されている。Shpタンパクの一つの例が、配列番号125として配列リストに示される。
ストレプトリシンS(SLS)、別名「SagA」は、ほとんど全てのGASコロニーで生産されると考えられている。この細胞溶解性毒素は、血液寒天の上で培養したGASのコロニーを取り巻くベータ溶血の原因となり、毒性に関連すると考えられている。完全長SagAペプチドは、免疫原性が明らかになっていないが、アミノ酸10−30の断片(SagA10−30)は、中和化抗体を生産するのに使用されている。Dale et
al.,「Antibodies against a Synthetic Peptide of SagA Neutralize the Cytolytic Activity of Streptolysin S from Group A Streptococci,」Infection and Immunicty(2002)70(4):2166−2170を参照されたい。SagA10−30のアミノ酸配列を、配列番号126として配列リストに示す。
本発明で使用されるGAS抗原は、組成物において、個別のポリペプチドとして存在してもよいが、それらの抗原の内の少なくとも2種類(すなわち、2、3、4、5、6,7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20)が、単一ポリペプチド鎖(「ハイブリッド」ポリペプチド)として発現される。ハイブリッドポリペプチドによって大きな二つの利点が得られる。先ず、それ自体では、不安定だったり、十分発現しないポリペプチドは、問題を克服する適当なパートナーハイブリッドを加えることによって支援される。第二に、共に抗原的に有効な二つのポリペプチドを生産するのに、ただ1回の発現・精製工程が要求されるだけなので、商業的な製造が簡単化される。
本発明の好ましいポリペプチドは、GASのM1、M3、またはM18株に見られるアミノ酸配列を含む。M1 GAS株のゲノム配列は、Ferretti et al,PNAS(2001)98(8):4658−4663に報告されている。M3 GAS株のゲノム配列は、Berres et al,PNAS(2002)99(15):10078−10083に報告されている。M18 GAS株のゲノム配列は、Smooet
et al,PNAS(2002)99(7):4668−4673に報告されている。
本発明のGAS抗原は、Streptococcus pyogenesから単離されてもよいし、例えば、異種宿主において組み換え技術によって生産されてもよい。GAS抗原は、異種宿主を用いて調製されるのが好ましい。異種宿主は、前核性(例えば、細菌)または真核性であってもよい。E.coliが好ましいが、他の好適な宿主としては、Bacillus subtilis、Vibrio cholerae、Salmonella typhi、Salmonella typhimurium、Neisseria lactamica、Neisseria cinerea、Mycobacteria(例えば、M.tuberculosis)、酵母等が挙げられる。
本発明の組成物は免疫原組成物であることが好ましく、ワクチン組成物であることがより好ましい。組成物のpHは、6と8の間、約7であることが好ましい。pHは、バッファーを用いて維持してもよい。組成物は、滅菌性、および/または、発熱物質フリーであってもよい。組成物は、ヒトに対して等張的であってもよい。
本発明の組成物は、典型的には、前述の成分の他に、1種以上の「製薬学的に受容可能な担体」を含む。この担体は、それが、組成物を受け取る個体に対して有害な抗体の産生を誘発するものでない限り、どのような担体であってもよい。好適な担体は、通常、大きく、代謝されにくい巨大分子、例えば、タンパク、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体(例えば、油滴またはリポソーム)である。このような担体は当業者にはよく知られている。ワクチンはまた希釈剤、例えば、水、生食液、グリセロール等を含んでよい。さらに、補助物質、例えば、潤滑または乳化剤、pH緩衝剤等が存在してもよい。製薬学的に受容可能な賦形剤に関する詳細な説明がGennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th ed.,ISBN:0683306472において得られる。
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適なミネラル含有組成物は、ミネラルの塩、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩を含む。本発明は、ミネラル塩を、例えば、ヒドロキシド(例えば、オキシヒドロキシド)、リン酸塩(例えば、ヒドロキシフォスフェート、オルトフォスフェート)、硫酸塩等(例えば、chapters 8&9 of Vaccine design:the subunit and adjuvant approach(1995)Powell & Newman.ISBN0−306−44867−Xを参照)、または、異なるミネラル化合物の混合物であって、化合物は任意の適当な形(例えば、ゲル、結晶、非晶質等)で、好んで吸着される混合物を含む。ミネラル含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方されてもよい。WO00/23105を参照されたい。
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適なオイル乳剤として、スクアレン水乳剤、例えばMF59(5%スクアレン、0.5%Tween80、および0.5%Span85を、微小流体器を用いてサブミクロンの粒子にしたもの)が挙げられる。WO90/14837を参照されたい。また、Podda,「The adjuvanted influenza vaccines with novel adjuvants:experience with the MF59−adjuvanted vaccine,」Vaccine(2001)19:2673−2680;Frey et al.,「Comparison of the safety,tolerability,and immunogenicity of a MF59−adjuvanted influenza vaccine and a non−adjuvanted influenza vaccine in non−elderly adults,」Vaccine(2003)21:4234−4237を参照されたい。MF59は、FLUAD(商標)インフルエンザウィルス3価サブユニットワクチンのアジュバントとして用いられた。
サポニン処方も、本発明においてアジュバントとして使用してもよい。サポニンは、広範な植物種の木の皮、葉、幹、根、および場合によって花にも認められるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドから成る異種同士の群である。Quillaia saponaria Molina樹木の皮から得られるサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンはまた、Smilax ornata(sarsaprilla)、Gypsophilla paniculata(brides veil)、およびSaponaria officialis(ソープ根)から工業的に採取されている。サポニンアジュバント処方は、精製処方、例えば、QS21を始め、脂質処方、例えば、ISCOMを含む。サポニン組成物は、高速薄層クロマトグラフィー(HP−LC)、および逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)を用いて精製する。これらの技術を用いて特異的な精製分画が特定された。そのような分画としては、QS7、QS17、QS18、QS21、QH−A、QH−B,および、QH−Cが挙げられる。サポニンはQS21であることが好ましい。QS21の製法は米国特許第5,057,540号に開示されている。サポニン処方も、ステロール、例えば、コレステロールを含んでもよい(WO96/33739を参照)。
Drug Delivery Reviews(1998)32:247−271に見出される。さらにSjolander, et al.,Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32:321−338を参照されたい。
ウィロソームおよびウィルス様粒子(VLP)も本発明のアジュバントとして使用が可能である。これらの構造体は、一般に、ウィルスから得られた1種以上のタンパクで、要すれば任意にリン脂質と組み合わされた、または処方されたタンパクを含む。この構造体は、一般に、非病原的で、非複製的で、一般に、天然のウィルスゲノムを全く含まない。ウィルスタンパクは、組み換え的に生産されるか、または、全体ウィルスから単離される。ウィロソームまたはVLPに用いるのに好適なウィルスタンパクは、インフルエンザウィルス(例えば、HAまたはNA)、B型肝炎ウィルス(例えば、コアまたはカプシドタンパク)、E型肝炎ウィルス、麻疹ウィルス、シンドビスウィルス、ロタウィルス、口蹄疫ウィルス、レトロウィルス、ノーウォークウィルス、ヒトパピローマウィルス、HIV、RNA−ファージ、Qβ−ファージ(例えば、コートタンパク)、GA−ファージ、fr−ファージ、AP205ファージ、およびTy(例えば、レトロトランスポゾンTyタンパクp1)から得られるタンパクである。VLPは、WO03/024480、WO03/024481、および、Niikura et al.,Virology(2002)293:273−280;Lenz et al.,Journal of Immunology(2001)5246−5355;Pinto et al.,Journal of Infectious Diseases(2003)188:327−338;Gerber et al., Journal of Virology(2001)75(10):4752−4760にさらに詳細に記載される。ウィロソームについては、さらに、例えば、Gluck et al.,Vaccine(2002)20:B10−B16に論じられている。
本発明において使用するのに好適なアジュバントは、細菌性、または微生物性誘導体、例えば、下記を含む。
このような誘導体としては、モノフォスフォリル脂質A(MPL)および3−O−デアシル化MPL(3dMPL)が挙げられる。3dMPLは、4、5、または6本のアシル化鎖を持つ3De−O−アシル化モノフォスフォリル脂質Aの混合物である。3De−O−アシル化モノフォスフォリル脂質Aの好ましい「小型粒子」が、EP0689454に開示されている。このような「小型粒子」の3dMPLは、十分に小型で、0.22ミクロン膜でろ過して滅菌可能である(EP0689454参照)。その他の、非毒性LPS誘導体としては、モノフォスフォリル脂質A模擬体、例えば、アミノアルキルグルコサミドリン酸誘導体、例えば、RC−529が挙げられる。Johnson et al.(1999)Bioorg Med Chem Lett9:2273−2278を参照されたい。
脂質A誘導体は、大腸菌から得られた脂質Aの誘導体、例えば、OM−174を含む。OM−174は、例えば、Meraldi et al.,Vaccine(2003)21:2485−2491およびPajak, et al.,Vaccine(2003)21:836−842に記載されている。
本発明のアジュバントして好適に使用される免疫刺激性オリゴヌクレオチドとしては、CpGモチーフ(グアノシンが後ろに続く非メチル化シトシンを含み、リン酸結合で結ばれる配列)を含む核酸配列が挙げられる。パリンドロームまたはポリ(dG)配列を含む、細菌の2本鎖RNAまたはオリゴヌクレオチドも免疫刺激性であることが判明している。
細菌のADP−リボシル化毒素、およびその無毒化誘導体を、本発明においてアジュバントとして用いてもよい。タンパクは、大腸菌由来のもの(すなわち、大腸菌の熱に弱い腸内毒素「LT」)、コレラ菌(「CT」)、または、百日咳菌(「PT」)から得られたものであることが好ましい。無毒化されたADP−リボシル化毒素を粘膜性アジュバントとして用いることが、WO95/17211に記載され、非経口アジュバントとして用いることがWO98/42375に記載されている。アジュバントは無毒化LT突然変異、例えば、LT−K63であることが好ましい。
本発明においてアジュバントとして使用が好適なヒト免疫修飾因子としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12等)、インターフェロン(例えば、インターフェロン−γ)、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。
生体接着剤および粘膜接着剤も、本発明のアジュバントとして使用することが可能である。適当な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸微小球(Singh et al.(2001)J.Cont.Rele.70:267−276)、粘膜接着剤、例えば、ポリ(アクリル酸)の架橋誘導体、ポリビニールアルコール、ポリビニールピロリドン、ポリサッカリド、およびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。キトサンとその誘導体も、本発明におけるアジュバントとして使用が可能である。例えば、WO99/27960。
微粒子も、本発明におけるアジュバントとして使用してよい。微粒子(すなわち、直径約100nmから約150μm、より好ましくは約200nmから約30μm、もっとも好ましくは約500nmから約10μm)で、生体分解性で無毒な材料(例えば、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシルブチル酸、ポリオルソエステル、ポリアンヒドリド、ポロカプロラクトン等)から形成されるが、ポリ(ラクチド−co−グリコリド)によるものが好ましく、要すれば任意に、陰性荷電された表面を持つように(例えば、SDSにより)、または、陽性荷電された表面を持つように(例えば、陽イオン性界面活性剤、例えば、CTABにより)処理される。
アジュバントとして使用するのに好適なリポソーム処方の例が、米国特許第6,090,406号、米国特許第5,916,588号、およびEP0626169に記載される。
本発明に使用するのに好適なアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテル、およびポリオキシエチレンエステルが挙げられる。WO99/52549。この処方はさらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(WO01/21207)を始め、少なくとも一つ追加の、非イオン性界面活性剤、例えば、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル、またはエステル界面活性剤(WO01/21152)を含む。
PCPP処方については、Andrianov et al.,「Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions,」Biomaterials(1998)19(1−3):109−115、およびPayne et al.,「Protein Release from Polyphosphazene Matrices,」Adv.Drug Delivery Review(1998)31(3):185−196に記載される。
本発明におけるアジュバントとして好適に使用されるムラミルペプチドの例としては、N−アセチル−ムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(nor−MDP)、およびN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシフォスフォリルオキシ)−エチルアミンMTP−PE)が挙げられる。
本発明においてアジュバントとして好適に使用されるイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモッドおよびその相同体が挙げられる。これらについては、Stanley,「Imiquimod and imidazoquinolones:mechanism of action and therapeutic potential」Clin Exp Dermatol(2002)27(7):571−577、およびJones,「Resiquimod 3M,」Curr Opin Investig Drugs(2003)4(2):214−218にさらに詳細に記載される。
(1)サポニン、および、水中油滴乳剤(WO99/11241)
(2)サポニン(例えばQS21)+無毒LPS誘導体(例えば3dMPL)(WO94/00153参照);
(3)サポニン(例えばQS21)+無毒LPS誘導体(例えば3dMPL)+コレステロール;
(4)サポニン(例えばQS21)+3dMPL+IL−12(任意に+ステロール)(WO98/57659);
(5)3dMPLと、例えば、QS21および/または水中油滴乳剤(欧州特許出願0835318、0735898、および0761231);
(6)SAFで、10%スクアレン、0.4%Tween80、5%プルロニックブロックポリマーL121、およびthr−MDPを含み、これらを微小流体処理してサブミクロン乳剤にしたもの、または、渦流攪拌して比較的大きな粒子径の乳剤にしたもの;
(7)Ribi(商標)アジュバントシステム(RAS)(Ribi Immunochem)で、2%スクアレン、0.2%Tween80、および、モノフォスフォリルリピドA(MPL)、トレハロースジミコレート(TDM)、および、細胞壁骨格(CWS)、MPL+CWS(Detox(商標))から成る群から選ばれる、1種以上の細胞壁成分を含むアジュバントシステム;
(8)1種以上のミネラル塩(例えば、アルミニウム塩)+LPSの無毒誘導体(例えば、3dPML);
(9)1種以上のミネラル塩(例えば、アルミニウム塩)+免疫刺激性オリゴヌクレオチド(例えば、CpGモチーフを含むヌクレオチド配列)。
本発明の組成物はさらに、1種以上の、追加の非GAS抗原であって、追加の細菌性、ウィルス性、または、寄生生物性抗原を含む抗原を含んでもよい。
「含む」という用語は、「包含する」を始め、「から成る」を意味し、例えば、Xを「含む」組成物とは、Xだけを含んでもよいし、その他の何か、例えば、X+Yを含んでもよい。
Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482−489に開示されている。同様の配列同一性法を用いて、二つのポリヌクレオチド配列の間の相同性を定めることが可能である。
第1の抗原群の2種以上のGAS抗原に対応する組み換えGASタンパクは下記のように発現される。
選択されたGAS抗原は、異なる2種類の組み換えタンパクが得られるようにクローンされた。すなわち、(1)カルボキシ末端に6ヒスチジンタグを持つタンパク(Gas−His)、(2)カルボキシ末端に6ヒスチジンタグ、アミノ末端にGstを持つタンパク(Gst−Gas−His)である。(1)型タンパクは、pET21b+ベクター(Novagenから入手)にクローンすることによって獲得した。(2)型タンパクは、pGEX−NNHベクターにクローンすることによって獲得した。このクローニング戦略によって、GASゲノムDNAを用いて、選択された遺伝子をPCRによって増幅し、こもPCR産物の単一酵素消化を実行し、次に、消化産物を両ベクターにおいて同時にクローンすることが可能となった。
DNA合成器ABI394(Perkin Elmer)とCruachem(Glasgow,Scotland)から入手した試薬を用いて2カップルの相補的オリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。等モルのオリゴペア(各オリゴにつき50ng)を、T4DNAリガーゼバッファー(New England Biolabs)中で、最終容量50μlとして10分アニールさせ、放置してゆっくりと室温に冷却させた。後述の処理工程によって下記のDNAリンカーが得られる。
GAS SF370を、OD600が0.6−0.8となるまでTHY培養液にて増殖させ、次に、細菌を遠心し、ライソザイム(10mg/ml)およびムタノリシン(10U/μl)を含むTESバッファーに懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。細菌懸濁液をRNアーゼ、プロテイナーゼKおよび10%サルコシル/EDTAで処理した後、飽和フェノールおよびフェノール/クロロフォルムによるタンパク抽出を行う。得られた上清を、酢酸ナトリウム/エタノールで沈殿させ、抽出DNAを遠心にてペレット状とし、Trisバッファーに懸濁し、−20℃に保存する。
Streptococcus pyogenesSF370 M1株の配列を用いて各GAS抗原のコード配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。予測されたリーダー配列の直ぐ下流において5’末端増幅プライマー配列を導出することによって、予測されたシグナルペプチドは全て除去した。多くのGAS抗原において、プライマーの5’尾部は(下記の表1参照)、唯一つの制限酵素認識部位(遺伝子自身の制限パターンに応じてNdeI、またはNheI、またはSpeI)しか含んでいない。3’プライマー尾部(表1参照)は、XhoI、またはNotI、またはHindIII制限部位を含む。
プライマーは、制限酵素認識部位を含むだけでなく、増幅される配列にハイブリダイズするヌクレオチドも含んでいる。ハイブリダイズするヌクレオチドの数は、従来記載されている通りに確定することが可能なプライマーの融解温度に依存する(Breslauer et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.83,3746−50(1986))。選択されたオリゴの平均融解温度は、ハイブリダイズ領域のみでは50−55℃で、全体オリゴでは65−75℃である。オリゴは、MWG−Biotech S.p.A.(フィレンツェ、イタリー)から購入した。
標準的PCRプロトコールは下記の通り。50ngのゲノムDNAを鋳型として用い、各プライマー0.2μM、各dNTP200μM、1.5mM MgCl2、1xPCRバッファーマイナスMg(Gibco−BRL)、および、2単位のTaqDNAポリメラーゼ(Platinum Taq,Gibco−BRL)と混ぜ最終容量を100μlとする。各サンプルには2ステップ増幅を行う。最初の5サイクルは、制限酵素尾部を除いたオリゴのハイブリダイゼーション温度で行い、次の25サイクルは、プライマー全長のハイブリダイゼーション温度に従って行う。標準サイクルは下記の通り。
1サイクル
変性:94℃、2分
5サイクル
変性:94℃、30秒
ハイブリダイゼーション:51℃、50秒
伸長:72℃、1分または2分および40秒
25サイクル
変性:94℃、30秒
ハイブリダイゼーション:70℃、50秒
伸長:72℃、1分または2分および40秒
72℃、7分
4℃。
精製PCR産物1〜2μgを、37℃で一晩適当な制限酵素(各酵素60単位)で、100μlの最終容量において適当な制限バッファーを用いて二重消化した。制限酵素および消化バッファーは、New England Bufferから入手した。消化したDNAの精製(PCR精製キット、Qiagen)と30μl TEによる溶出後、1μlをアガロース電気泳動し、産物を同時泳動の分子量標準(DNAマーカーIIIまたはIX,Roche)と比較して評価した。
10μgのプラスミドを、適当なバッファーの存在下に400μlの反応液において各制限酵素100単位によって37℃で一晩インキュベートすることによって、二重消化した。1%アガロースで電気泳動後、消化されたベクターに対応するバンドを、QiagenのQiaexIIゲル抽出キットを用いて精製し、DNAを50μlのTEで溶出した。DNA濃度を、サンプルのOD260を測定することによって評価した。
75ngの適当に消化され精製されたベクターと、選択された各GAS抗原に対応する消化され精製された断片とが、断片/ベクターのモル比1:1を含む最終容量10−20μlにおいて、400単位のT4DNAリガーゼ(New England Biolabs)を用い、メーカーの支給するバッファーの存在下にライゲートされた。反応は16℃にて一晩インキュベートした。
PCR陽性クローンを、3mlLB 100μg/mlアンピシリンに接種し、37℃で一晩増殖させた。この一晩培養体の70μlを、2mlのLB/Ampに接種し、pETクローンのOD600が0.4−0.8値になるまで、または、pGEXクローンのOD600が0.8−1値になるまで、37℃で増殖させた。次に、タンパクの発現を、このミニ培養体に1mM IPTG(イソプロピルβ−Dチオ−ガラクト−ピラノシド)を加えることによって誘発する。37℃で3時間インキュベートした後、最終OD600をチェックし、培養物を氷上にて冷却する。0.5mlの培養体の遠心後、細胞ペレットを、50μlのタンパク負荷サンプルバッファー(60mM TRIS−HCl、pH6.8、5%w/vSDS、10%v/vグリセリン、0.1%w/vブロモフェノールブルー、100mM DTT)に懸濁し、100℃で5分インキュベートする。0.1OD600培養体に対応する煮沸サンプルの一容量をSDS−PAGEで分析し、クーマッシーブルー染色によって、誘発されたタンパクバンドの存在を確認した。
単一コロニーを、25mlLB 100μg/mlアンピシリンに接種し、37℃で一晩増殖させた。この一晩培養体のを、500mlのLB/Ampに接種し、OD600が0.4−0.7値になるまで、振盪しながら25℃で増殖させた。次に、タンパクの発現を、この培養体に1mM IPTGを加えることによって誘発する。25℃で3.5時間インキュベートした後、最終OD600をチェックし、培養物を氷上にて冷却する。6000rpmの遠心後(JA10ローター、Beckman)、細胞ペレットを精製のために処理するか、または−20℃で凍結した。
(1)ペレットを−20℃から氷浴に移し、10mlの、50mMNaHPO4バッファー、300mM NaCl、pH8.0にて再構成し、40−50mlの遠心チューブに移し、下記の概説の通りに細胞を破壊する
(2)細胞を、直列洗浄下3回通過させながらフレンチプレスにて破壊する
(3)約30−40000gにて15−20分遠心。ローターJA25.50(21000rpm、15分)またはJA−20(18000rpm、15分)を使用
(4)ポリプレップカラムを、50mMリン酸バッファー、300mM NaCl,pH8.0を含む1mlの高速キレートセファロース樹脂で平衡させる
(5)遠心ペレットを−20℃で保存し、上清をカラムに負荷する
(6)流出物を収集する
(7)カラムを、10ml(2ml+2ml+4ml)の50mMリン酸バッファー、300mM NaCl、pH8.0で洗浄する
(8)再び、10mlの20mMイミダゾールバッファー、50mMリン酸、300mM NaCl、pH8.0で洗浄する
(9)カラムに結合したタンパクを、4.5ml(1.5ml+1.5ml+1.5ml)の250mMイミダゾールバッファー、50mMリン酸、300mM NaCl、pH8.0で溶出し、それぞれ約1.5mlの3種の対応分画を収集する。各チューブに、15μlのDTT200mM(最終濃度2mM)を加える
(10)最初の2分画のタンパク濃度をブラッドフォード法にて測定し、各サンプルから10μg分液を採取し、SDS−PAGEにて分析する(注意:サンプルを希釈しすぎた場合、21μl+7μlの負荷バッファーを負荷する)
(11)SDS−PAGE分析の結果を待ちながら、収集分画を+4℃で保存する
(12)免疫化のために、それぞれ100μgを0.5mlの40%グリセロールに溶解させた4−5分液を調製する。希釈バッファーは、前述の溶出バッファー、プラス2mM DDTである。分液を免疫化まで−20℃で保存する。
精製は事実上下記のプロトコールに従って行った:
(1)500ml培養体から、細菌を遠心にて収集する。要すれば、細菌ペレットは−20℃で保存する。抽出後、各細菌ペレットを10mlの50mM TRIS−HCl、pH8.5バッファーに氷浴にて再懸濁する
(2)再懸濁細菌を、フレンチプレスにて2回通過を行わせながら破壊する
(3)35000xgで15分遠心し、ペレットを収集する。BeckmanローターJA25.50(21000rpm、15分)またはJA−20(18000rpm、15分)を使用する
(4)遠心ペレットを50mM TRIS−HCl、1mM TCEP(Tris(2−カルボキシエチル)−フォスフィン塩酸、Pierce)、6M塩化グアニジン、pH8.5に溶解する。マグネットバーにて約10分攪拌する
(5)前述のように遠心し、上清を収集する
(6)ニッチェルで飽和させた高速キレートセファロース(Pharmacia)1mlを含む、十分な数のポリプレップ(Bio−Rad)カラムを、メーカーの指示に従って調製する。カラムを、5mlのH2Oで2度洗浄し、50mM TRIS−HCl、1mM TCEP、6M塩化グアニジン、pH8.5で平衡させる
(7)工程(5)の上清をカラムに負荷し、5mlの50mM TRIS−HCl、1mM TCEP、6M尿素、pH8.5で洗浄する
(8)カラムを、10mlの20mMイミダゾール、50mM TRIS−HCl、6M尿素、1mM TCEP、pH8.5で洗浄し、最初の5mlを場合によってコントロールとして使用するために脇にどけておく
(9)カラムに結合したタンパクを、4.5mlの250mMイミダゾール、50mM
TRIS−HCl、6M尿素、1mM TCEP、pH8.5で溶出する。3個の1.5ml分液に溶出バッファーを加え、3種の対応分画を収集する。各分画に、15μlのDTT200mM(最終濃度2mM)を加える
(10)溶出されたタンパク濃度をブラッドフォード法にて測定し、約10μgのタンパク分液をSDS−PAGEにて分析する
(11)タンパクを、40%(v/v)グリセロール、50mM TRIS−HCl、2M尿素、0.5Mアルギニン、2mM DTT、0.3mM TCEP,83.3mMイミダゾール、pH8.5に溶解させて−20℃で保存する。
(1)細菌ペレットを−20℃から氷浴に移し、7.5mlのPBS、pH7.4に懸濁し、そこに、プロテアーゼ阻害剤の混合物(COMPLETE(商標)−Boehringer Mannheim,バッファー25ml毎に1錠)を加える
(2)40−50mlの遠心管に移し、下記の工程に従って超音波処理する
a.プローブを、チューブの底から約0.5cmの所に配置する
b.チューブをクランプで塞ぐ
c.チューブを氷浴に浸す
d.超音波装置を下記のようにセットする。タイマー−>保持、仕事サイクル−>55、出力コントロール−>6
e.1分間10パルス5サイクルを実行(すなわち、1サイクル=10パルス+約45’’保持;b.10パルス+約45’’保持;c.10パルス+約45’’保持;d.10パルス+約45’’保持;e.10パルス+約45’’保持)
(3)30−40000xgで15−20分遠心する。例えば、BeckmanローターJA25.50を21000rpm、15分使用する
(4)遠心ペレットを−20℃で保存し、上清を下記のようにクロマトグラフィーカラムに負荷する
(5)ポリプレップ(Bio−Rad)カラムを、0.5ml(約1ml懸濁液)のグルタチオン−セファロース4B樹脂で平衡させ、2ml(1+1)H2Oで洗浄し、次に、10ml(2+4+4)PBS、pH7.4で洗浄する
(6)上清をカラムに負荷し、流出液は廃棄する
(7)カラムを10ml(2+4+4)PBS、pH7.4で洗浄する
(8)カラムに結合したタンパクを、4.5mlの50mM TRISバッファー、10mM還元グルタチオン、pH8.0にて溶出し、1.5ml+1.5ml+1.5mlを加え、それぞれ約1.5mlの3種の分画を収集する
(9)最初の2分画のタンパク濃度をブラッドフォード法にて測定し、各サンプルから10μgタンパク分液を採取し、SDS−PAGEにて分析する(注意:サンプルを希釈しすぎた場合、21μl+7μlの負荷バッファーを負荷する)
(10)SDS−PAGE分析の結果を待ちながら、収集分画を+4℃で保存する
(11)免疫化のために使用が予定されている各タンパクについて、それぞれ100μgを0.5mlの40%グリセロールに溶解させた4−5分液を調製する。希釈バッファーは、50mM TRIS HCl、2mM DDT、pH8.0である。分液を免疫化まで−20℃で保存する。
((a)免疫化プロトコール)
6から7週齢の10匹のCD1雌マウスから成る群を、2種類以上の、本発明のGAS抗原で免疫化する(適当な溶液100μl中に懸濁させた、各組み換えGAS抗原20μg)。各群に対して0、21、および45日目に3回投与する。免疫化は、第1回目投与では、タンパクを、等量のフロイントの完全アジュバント(CFA)と共に、続く2回の投与では、等量のフロイントの不完全アジュバント(IFA)と共に腹腔内注入することによって行った。各免疫化スキームにおいて、陰性および陽性コントロール群を使用する。
((a)GAS全体タンパク抽出物の調製)
全体タンパク抽出物は、細菌培養体を、OD6000.4−0.5となるまで、Tris50mM、pH6.8/ムタノリシン(20単位/ml)中に37℃で2時間培養し、次いで、0.24N NaOHおよび0.96%β−メルカプトエタノールにおいて氷上で10分インキュベートする。抽出されたタンパクは、トリクロロ酢酸の添加によって沈殿させ、氷冷アセトンで洗浄し、タンパク負荷バッファーに懸濁する。
SDS負荷バッファー(1x:60mM TRIS−HCl、pH6.8、5%w/vSDS、10%v/vグリセリン、0.1%ブロモフェノールブルー、100mM DDT)と混合し、95℃で5分煮沸した全体タンパク抽出物の分液を、12.5%SDS−PAGEプレカストゲル(Biorad)に負荷した。ゲルを、250mM TRIS、2.5mMグリシン、および0.1%SDSを含むSDS−PAGE操作バッファーを用いて移動させる。ゲルを、200mAで60分ニトロセルロース膜に電気ブロットする。膜を、PBS/0.05%Tween−20(Sigma)、10%スクムミルク粉末で60分でブロックし、PBS/0.05%Tween−20、1%スクムミルク粉末と、血清の適当な希釈液と共に、4℃でインキュベートする。PBS/0.05%Tweenで2回洗浄した後、膜を、1:4000に希釈したペルオキシダーゼ接合抗マウス二次抗体(Amersham)と2時間インキュベートする。このニトロセルロースを、PBS/0.05%Tweenで10分間で3回洗浄し、PBSで1回洗浄し、その後、Opti−4CN基質キット(Biorad)によって現像する。
OD6000.4−0.5となるまで増殖させた細菌培養体をPBSで1回洗浄し、PBS/0.05%パラフォルムアルデヒド中で4倍に濃縮する。振とうしながら37℃で1時間インキュベーションした後、処理培養体を4℃で一晩置き、次に、細菌の完全な不活性化を、分液をTHY血液寒天プレートに撒くことによってコントロールする。
約105個のパラフォルムアルデヒド不活性化細菌を、96ウェルU型底プレートにおいて200μlのPBSにて洗浄し、4℃で10分3000gで遠心する。上清は捨て、細菌を20μlのPBS−0.1%BSAに懸濁する。PBS−0.1%BSAで希釈した、免疫前、または免疫血清のどちらか80μlを、最終希釈度が1:100、1:250、または1:500のいずれかとなるように細菌懸濁液に加え、氷上で30分インキュベートする。細菌を、100μlのPBS−0.1%BSAを加えることによって1回洗浄し、4℃で10分3000gで遠心し、200μlのPBS−0.1%BSAに懸濁し、再び遠心し、10μlのヤギ抗マウスIgGのPBS−0.1%BSA溶液に最終的に1:100に希釈されるように懸濁する。この抗体は、F(ab’)2断片、特異的−R−フィコエリスリン−接合(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.,カタログ番号115−116−072)である。この懸濁液を暗所にて氷上で30分インキュベートする。細菌を180μlのPBS−0.1%BSAを加えて1回洗浄し、4℃で10分3000gで遠心する。上清は捨て、細菌は、200μlのPBSに懸濁する。細菌懸濁液を、FACS Calibur(Becton Dikinson,Mountain View,カリフォルニア州、米国)の細胞計測チェンバー中を通過させて、10,000件のデータを得る。データは、Cell Quest Software(Becton Dikinson、Mountain View、カリフォルニア州、米国)を用い、細菌シグナルに対して形態的ドットプロットを引くことによって(前方および側方散乱パラメータを用いて)分析する。次に、ヒストグラムプロットを、細菌の形態領域を想起しながら、蛍光の対数スケールのFL2強度について作成する。
下記の例は、野生型GAS株とGAS40欠失突然変異の間の毒性の比較を示す。GAS40の大部分が除去されたGAS突然変異株を標準的方法で調製した。1群当たり10匹のマウスから成る、いくつかの免疫化群に対し、野生GAS株か、突然変異GAS株かのいずれかを注入した。下記に示すように、ある濃度範囲の野生型分離株の注入は、マウスの致死をもたらすが、GAS△40突然変異株の注入は致死的ではない。
下記の例は、細菌オプソニン食作用アッセイを用いてGAS40の表面露出を証明する。下記のGAS構築体をアッセイに用いた。なお、それぞれについては上に詳細に記述してある。すなわち、40a−CH、40a−RR−NH、40a−RR、GST−40、40a、40aと40a−NHである。(図7において「40a」について2度の言及があるが、これらは、異なる日に調製された血清を指す)。
GAS細菌をTHY培養液において、中央対数期(OD6000.4)に達するまで37℃で増殖させる。細菌を、寒冷生食液にて2回洗浄し、HBSS培養液に懸濁する。その際、各株について、使用する細菌の量に応じて容量を調節する。細菌細胞は、使用するまで氷上に維持する。
PMNは、健康な志願者のヘパリン添加血液のバフィーコートから調製する。バフィーコートを、デキストラン、NaClおよびヘパリン(1:1比)を含む溶液に30分インキュベートする。インキュベーション後、白血球の豊富な上清を取り出し、清潔なチューブに移し、700gで20分遠心する。水による短い洗浄を行い赤血球を破壊し、次にNaCl溶液を加え、適当な塩濃度を回復する。この工程後、細胞を遠心し、適当な濃度でMEMに懸濁する。
GAS株(前述のように調製)を、表示のGAS抗原(または、コントロールの場合免疫前のもの)による免疫化から得られた、熱不活性化免疫マウス血清、ヒトPMN、および仔ウサギ補体とインキュベートする。37℃で1時間のインキュベーション。インキュベーション直前・直後に採取したサンプルをTHY血液寒天プレートに接種する。食作用は、免疫前血清および免疫血清について、二つの時点におけるコロニー数の差を比較することによって評価する。データは、t=0時における成長コロニー数の対数−t=60時における成長コロニー数の対数で表す。
GAS40抗原を用いて行った、多数のげっ歯類マウスモデル実験から得られた生存率結果の見本を下記に掲げる。注記は、組み換えGAS40抗原を発現するのに用いられた構築体において、発現を促進するためにどこを修飾したかを示す。
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