JP2011006369A

JP2011006369A - Ｐａｉ−１低下剤

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Publication number: JP2011006369A
Application number: JP2009153237A
Authority: JP
Inventors: Tamotsu Gabe; 有我部; Kojiro Hashizume; 浩二郎橋爪; Akihiko Fujii; 明彦藤井
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2009-06-29
Filing date: 2009-06-29
Publication date: 2011-01-13

Abstract

【課題】食経験が豊富で安全性が高く、プラスミノーゲンアクチベータインヒビター１（ＰＡＩ−１）の増加を抑制することができるＰＡＩ−１低下剤の提供。
【解決手段】パプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物からなる群より選ばれる１種以上を有効成分とするＰＡＩ−１低下剤。ＰＡＩ−１の増加を抑制することにより、血栓症、動脈硬化性疾患などの循環器疾患、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病などの予防・改善が可能であると期待される。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規なPAI-１低下剤に関する。

プラスミノーゲンアクチベータインヒビター１（Plasminogen activator inhibitor-1、以下「PAI-1」）は血栓形成の局所において線溶反応を制御する中心的なタンパクである。組織型プラスミノーゲンアクチベータ（t-PA）やウロキナーゼ型PA（u-PA）の作用によるプラスミノーゲンからプラスミンへの活性化を強力に阻害し、血栓の安定化をもたらす。また、炎症時には急性期反応物質としてダイナミックな発現変化をきたし、血栓形成やマトリクス沈着を促進させる作用もある。PAI-1はこうした作用を介して心血管病変をはじめとする様々な病態と関連することが知られている（非特許文献１及び２）。血中PAI-1濃度が高いほど心筋梗塞の発症リスクが高くなることも報告されている（非特許文献３）。

近年の研究により、PAI-1は脂肪細胞で産生、分泌されるアディポカインのひとつであることが明らかとなり、その発現はTGF-βや脂肪細胞からも分泌されるTNF-αなどのサイトカインによって著明に促進される（非特許文献４）。また、内臓肥満やインスリン非依存性糖尿病ではPAI-1の血中濃度が高く、内臓脂肪の量とPAI-1値には正の相関があることも報告されている（非特許文献５）。動物レベルの研究においても、遺伝的肥満・糖尿病マウスでは血中PAI−1抗原量及び脂肪組織におけるPAI-1発現の亢進が認められ、その産生の主体は大型化した脂肪細胞であることも明らかにされた（非特許文献６）。さらに、PAI-1遺伝子をノックアウトした肥満モデルマウスでは、体重の減少、血中グルコースの濃度及び血中インスリン濃度の低下が報告されていることからも（非特許文献７）、PAI-1の発現や作用を抑えることが血栓傾向を改善させるだけでなく、肥満やインスリン抵抗性の進展を抑制できる可能性が指摘されている（非特許文献８）。

近年、ストレスが動脈硬化性疾患の発症リスクを上昇させることが疫学調査より明らかになっている（非特許文献９）。また、ストレスもPAI-1の産生異常を引き起こすことが報告されており、ストレスが引き起こす動脈硬化性疾患にPAI-1が関与している可能性が示唆される。
健康な中年男性69人においては、慢性ストレス（精神疲労）と血中PAI-1に正の相関が認められた（非特許文献１０）。また、拘束ストレスを負荷したマウスでは、血中PAI-1濃度及び腎臓、副腎、脂肪組織におけるPAI-1遺伝子発現量の増加が認められた（非特許文献１１）。この脂肪組織におけるPAI-1遺伝子発現量は、デキサメタゾン（グルココルチコイドの一種）添加により亢進することが報告されており（非特許文献１２）、ストレスによるPAI-1の増加には、ストレス応答のひとつである血中グルココルチコイドの上昇が関与していると考えられる。
以上のことから、PAI-1の増加を抑制することにより、血栓症、動脈硬化性疾患などの循環器疾患、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病などの予防・改善が可能であると期待される。

これまでに、PAI-1の増加を抑制する物質の探索が行われ、例えば５員へテロ環誘導体が報告されている（特許文献１）。しかし、医薬品の場合、薬の副作用や併用（飲み合わせ）による弊害が懸念される。そのため、副作用や毒性がなく長期間に渡って摂取できる食品素材であることが望まれている。
食品素材としては、例えばリンゴ由来ポリフェノール（特許文献２）、栗渋皮抽出物（特許文献３）、白桃花抽出物（特許文献４）などが報告されているが、これらの食品素材は、その効果の面で十分満足のいくものではない。

一方、パプリカ色素はトウガラシの果実から得られるカプサンチンを主成分とする油溶性の色素であり、また、ヘマトコッカス色素はヘマトコッカス藻から抽出されるアスタキサンチンの脂肪酸エステルを主成分とする色素である。両色素とも天然色素として食品などに広く利用されている。また、ケーパーは、フウチョウソウ科の半蕾性の低木であり、カプリン酸に由来する独特の風味を持ち、その蕾は料理に広く利用されている。
パプリカ色素は、ＣＯＸ-１，２（シクロオキシゲナーゼ-１，２）阻害作用や抗肥満作用、メタボリックシンドロームの予防又は改善作用等を有することが報告され（特許文献５−７）、また、ヘマトコッカス色素は、肥満やそれから派生する動脈硬化症等の各種生活習慣病、メタボリックシンドロームの予防又は改善作用等を有することが報告されている（特許文献８−１０）。さらに、ケーパー抽出物は、ＣＯＸ-１，２阻害作用や糖類吸収抑制による肥満・糖尿病の改善作用等を有することが報告されている（特許文献５、１１）。
しかしながら、これまでにパプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物がPAI-1に対して与える影響については全く知られていない。

国際公開第2006/095713号パンフレット特開2007-8836号公報国際公開第2007/111242号パンフレット特開2007-45771号公報特表2004-532811号公報特開2007-22917号公報特開2003-95930号公報国際公開第2007-37438号パンフレット特開2007-246504号公報特開2007-153845号公報特開2004-262904号公報

山本晃士血栓止血誌 18, 185-90 (2007) 山本晃士血栓止血誌 19, 55-63 (2008) A. M. Thogersen et al. Circulation 98, 2241-47 (1998) F. Samad et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6902-07 (1999) I. Shimomura et al. Nat. Med. 2, 800-03 (1996) F. Samad et al. Mol. Med. 2, 568-82 (1996) K. Schafer et al. FASEB J. 15, 1840-42 (2001) H. R. Lijnen et al. J. Thromb. Haemost. 3, 1174-79 (2005) H. Iso et al. Circulation 106, 1229-36 (2002) K. Raikkonen et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16, 363-67 (1996) K. Yamamoto et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 890-95 (2002) C. M. Halleux et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 84, 4097-105 (1999)

本発明は、食経験が豊富で安全性が高く、PAI-1の増加を抑制する作用を有するPAI-1低下剤を提供することに関する。

本発明者らは、食経験が豊富で安全性の高い天然物素材の中から有効成分の検索を行ったところ、パプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物がPAI-1増加を有意に抑制することができ、PAI-1低下剤として有用であることを見出した。

前述したように、パプリカ色素等には抗肥満効果等があることが明らかになっているが、その作用は、脂肪細胞への分化抑制、糖類吸収の抑制、脂肪燃焼の亢進等であり、これにより脂肪蓄積を減少させるというものである。従って、上記報告からパプリカ色素等のストレス応答におけるPAI-1増加を抑制する作用は示唆されない。また、動脈硬化性疾患等の循環器疾患の発症や進展には、多数のサイトカインや増殖因子などの生理活性物質が関与していることが知られており、PAI-1が関わるのは一部であることからも、パプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物によって上記の効果が奏されるのは全く予想外のことである。

すなわち、本発明は、パプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物からなる群より選ばれる１種以上を有効成分とするプラスミノーゲンアクチベータインヒビター１低下剤を提供するものである。

本発明のPAI-1低下剤は、食経験が豊富で安全性が高いパプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物を有効成分とするものであり、肥満やストレス等によるPAI-1の増加を抑制するための医薬品、飲食品、化粧品等に有用である。また、継続的な摂取もできる。

脂肪細胞におけるパプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物のPAI-1遺伝子発現抑制効果を示す図である。脂肪細胞におけるニンジンカロテン、ブドウ果汁色素及びカキ色素のPAI-1遺伝子発現量に与える影響を示す図である。

本発明で用いるパプリカ色素は、ナス科トウガラシ（Capsicum annuum Linne）の果実から得られる色素であり、カプサンチンを主成分とする。トウガラシは別名パプリカ、甘トウガラシとも称され、また、パプリカ色素は別名トウガラシ色素、カプシカム色素、Paprika oleoresin、カロチノイド、カロチノイド色素、カロテノイド、カロテノイド色素とも称され、それらの名称で市販されている。また、パプリカ色素は食品添加物として、着色料として広く食品に使用されている。

本発明で用いるヘマトコッカス色素は、コナヒゲムシ科ヘマトコッカス（Haematococcus C.A.AGARCH）の藻から得られる色素であり、アスタキサンチンの脂肪酸エステルを主成分とする。ヘマトコッカス色素はヘマトコッカス藻色素とも称される。

パプリカ色素及びヘマトコッカス色素は、それぞれトウガラシの果実、ヘマトコッカスの全藻を、そのまま、あるいは必要に応じて乾燥、切断、粉砕、粉末化等の前処理を行った後抽出して得られる抽出物、その希釈液、その濃縮液、その乾燥末又はペースト状などが包含される。

また、本発明で用いるケーパー抽出物は、フウチョウソウ科の半蕾性の低木であるケーパー（Capparis spinosa）から得られる抽出物である。ケーパーは別名トゲフウチョウボク（棘風蝶木）、セイヨウフウチョウボク（西洋風蝶木）、ケイパー、ケッパー、カープルとも称される。また、ケーパーの蕾をピクルスにしたものを指すこともある。

ケーパー抽出物としては、ケーパーをそのまま、あるいは乾燥した後に適当な大きさに切断したり、粉砕加工したりしたものを抽出して得られる抽出物、その希釈液、その濃縮液、その乾燥末又はペースト状の他、さらに分離精製して得られるより活性の高い画分（成分）が包含される。
ケーパーの使用部位としては、特に制限されず何れの部位も使用することができるが、主として蕾、種子を用いるのが好ましい。

本発明において、抽出方法は、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超臨界抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出等のいずれでもよい。
抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができ、これらを混合して用いることもできる。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類；（超臨界）二酸化炭素；油脂、ワックス、その他菜種油、オリーブ油、大豆油などのオイルなどが挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用でき、溶剤を変えて繰り返し行うことも可能である。このうち、エタノール、アセトン、ヘキサン、（超臨界）二酸化炭素、油脂、オイル等を用いるのが好ましい。

本発明に用いられるパプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物は、食品上・医薬品上許容し得る規格に適合し本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよく、さらに得られた粗精製物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。
本発明においては、パプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物は、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

本発明のパプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物は、後記実施例に示すように、脂肪細胞を用いたin vitro 試験系においてPAI-1遺伝子発現量の増加を有意に抑制した。当該in vitro 試験系は、前述したようなグルココルチコイドのPAI-1への作用を利用した系であり、in vivo系と同様の発現変化が認められる（S. Kralisch et al. Mol. Cell. Endocrinol. 253, 56-62 (2006)）。この系においては、グルココルチコイドの影響下においてもPAI-1遺伝子発現量が低下するかを指標としてPAI-1増加抑制効果を評価できる。
従って、当該パプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物は、PAI-1低下剤や、PAI-1の発現や作用を低下させることに有用性があると考えられる各種疾病、例えば血栓症や、糖尿病、２型糖尿病、インスリン抵抗性症候群、糖尿病合併症、高血糖症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、肥満、心筋梗塞、脳梗塞、メタボリックシンドロームなどの予防・改善剤（以下、「PAI-1低下剤等」）として使用でき、さらにこれらの剤を製造するために使用することができる。

斯かるPAI-1低下剤等は、PAI-1増加抑制作用、抗血栓作用や、PAI-1の発現や作用を低下させることに有用性があると考えられる各種疾病、例えば血栓症や、糖尿病、２型糖尿病、インスリン抵抗性症候群、糖尿病合併症、高血糖症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、肥満、心筋梗塞、脳梗塞、メタボリックシンドロームの予防又は改善等の各効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、食品、機能性食品、化粧品として使用することができる。そして、当該PAI-1低下剤等は、例えばPAI-1の発現や作用を低下させることに有用性があると考えられる各種疾病、例えば血栓症や、糖尿病、２型糖尿病、インスリン抵抗性症候群、糖尿病合併症、高血糖症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、肥満、心筋梗塞、脳梗塞、メタボリックシンドロームの予防又は改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品に応用できる。

本発明のPAI-1低下剤等を、医薬品として使用する場合、任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、経口、経腸、経粘膜、注射等が挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口投与としては、静脈内注射、筋肉注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。

また、斯かる製剤では、本発明のパプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物からなる群より選ばれる１種以上と、薬学的に許容される担体とを組み合わせて使用してもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、香料、被膜剤等が挙げられる。

これらの投与形態のうち、経口投与が好ましく、経口投与用製剤として用いる場合の該製剤中の本発明のパプリカ色素の含有量は、通常、製剤全質量の０．００５〜５質量％であり、０．０１〜１質量％であるのが好ましい。
また、製剤中の本発明のヘマトコッカス色素の含有量は、通常、製剤全質量の０．００５〜５質量％であり、０．０１〜１質量％であるのが好ましい。
また、製剤中のケーパー抽出物の含有量は、通常、製剤全質量の０．００５〜５質量％であり、０．０１〜１質量％であるのが好ましい。
なお、パプリカ色素及びヘマトコッカス色素の含有量は抽出物重量（抽出後、溶媒除去後の重量）として、ケーパー抽出物の含有量は、乾燥重量として算出したものである。

上記製剤の投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当たりの１日の投与量は、通常、パプリカ色素、ヘマトコッカス色素（いずれも抽出物重量）又はケーパー抽出物（乾燥重量）として１〜２０００ｍｇ、１０〜１０００ｍｇ、５０〜５００ｍｇがより好ましい。また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。

本発明のPAI-1低下剤等を、食品として使用する場合、その形態は、固形、半固形または液状であり得る。食品の例としては、パン類、麺類、菓子類、ゼリー類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、でんぷん加工製品、加工肉製品、その他加工食品、飲料、スープ類、調味料、栄養補助食品等、およびそれらの原料が挙げられる。また、上記の経口投与製剤と同様、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。

種々の形態の食品を調製するには、パプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物からなる群より選ばれる１種以上と、他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。

また、食品中におけるパプリカ色素（抽出物重量）の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、０．００１〜２質量％であり、０．００２〜１質量％が好ましい。また、ヘマトコッカス色素の含有量（抽出物重量）は、その使用形態により異なるが、通常０．００１〜２質量％であり、０．００２〜１質量％が好ましい。また、ケーパー抽出物の含有量（乾燥重量）は、その使用形態により異なるが、通常、０．００１〜２質量％であり、０．００２〜１質量％が好ましい。

本発明のPAI-1低下剤等を医薬部外品や化粧料として用いる場合は、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の医薬部外品や化粧料は、本発明のパプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物からなる群より選ばれる１種以上と、医薬部外品、皮膚化粧料及び洗浄料に配合される、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤（例えば、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、ビタミン類、脂肪代謝促進作用又は脱共役蛋白質発現促進作用が知られている薬物或いは天然物）、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。

当該医薬部外品、化粧料中の本発明のパプリカ色素（抽出物重量）の含有量は、一般的に０．００５〜５質量％とするのが好ましく、０．０１〜１質量％とするのがより好ましい。また、ヘマトコッカス色素（抽出物重量）の含有量は、一般的に０．００５〜５質量％とするのが好ましく、０．０１〜１質量％とするのがより好ましい。また、ケーパー抽出物（乾燥重量）の含有量は、一般的に０．００５〜５質量％とするのが好ましく、０．０１〜１質量％とするのがより好ましい。

実施例１
［試験方法］
（１）細胞培養
3T3-L1細胞（マウス前駆脂肪細胞；ATCC社）を、75cm²フラスコ（Becton Dickinson社）に播き、37℃、５％ CO₂存在下で培養した。培養液は、DMEM（10％ウシ胎児血清含有、高グルコース；Invitrogen社）を用いた。

（２）脂肪細胞への分化誘導法
24穴プレートに7.5 x 10³ cells/wellの濃度で細胞を播き４日間培養した。細胞がconfluentになったことを確認し、10％ウシ胎児血清、0.5 mM IBMX（isobutyl-methylxanthine；Wako社）、0.1μM DEX（デキサメタゾン；Wako社）、1μM インスリン（SIGMA社）を含むDMEMで3T3-L1細胞を培養した。３日後、10％ウシ胎児血清、1μM インスリンを含むDMEMに交換し培養を続けた。４日後、10％ウシ胎児血清のみを含むDMEMに培養液を交換した。３〜４日後、培養液を、ウシ胎児血清を含まないDMEMに交換し、６時間培養後、DEX（10〜100 nM）と検体（10〜100μg/ml）を添加した（Ｎ=３）。16時間後、培養液を除き、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、total RNAの抽出を行った。
なお、検体としては、パプリカ色素（「パプリカベース150」三栄源エフエフアイ（パプリカ色素として２０％含有））、ヘマトコッカス色素（「アスタリールオイル50Ｆ」富士化学工業（アスタキサンチンフリー体として５％含有））、ニンジンカロテン（「キャロットオイル」三共ライフティック）、ブドウ果汁色素（「サンレッドGR」三栄源エフエフアイ）、カキ色素（「キリヤスブラウンKBS」キリヤ化学）を用いた。添加量は商品量あたりで換算した。
ケーパー抽出物は、ケーパー果実の塩水漬け（ヤスマ株式会社より入手）10ｇに50％エタノール水溶液100mlを加え、室温、静置条件下で７日間抽出を行い、その後、ろ過を行うことにより抽出液を得た。抽出液の固形分濃度は1.27％（w/v）であった。

（３）PAI-1遺伝子量の定量
抽出したtotal RNAサンプルを用い、Oligo (dT)_12-18 Primer（Invitrogen社）とM-MLV Reverse Transcriptase（Invitrogen社）で逆転写反応を行い、cDNAサンプルを作製した。作製したcDNAはTaqMan（登録商標）アッセイにより各遺伝子の発現を定量した。解析には7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems社）を用いた。得られた解析結果は内部標準としてGAPDHの発現量を用い補正し、相対的mRNA発現量として表した。TaqManプローブおよびプライマーはPAI-1用としてTaqMan Gene Expression Assays（Applied Biosystems社、AssayID;Mm00435860_m1）、GAPDH用として4352339E（Applied Biosystems社）を用いた。得られた解析結果は、全て平均値（Mean）±標準誤差（SE）を用いてグラフにし、Dunnettにより有意差検定を行った。

（４）結果
グルココルチコイド受容体アゴニストであるデキサメタゾンを添加したコントロール群では、デキサメタゾン非添加群に比べてPAI-1遺伝子発現量は亢進した。これに対し、パプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物を添加した群では、コントロール群に比べPAI-1遺伝子発現量は有意に低下した（図１）。また、濃度依存的なPAI-1遺伝子発現抑制効果も認められた。
しかし、パプリカ色素の主成分であるカプサンチン及びヘマトコッカス色素の主成分であるアスタキサンチンと同じカロテノイド類に属するβ-カロテンを主成分とするニンジンカロテンを添加した群や、フラボノイド類を主成分とするブドウ果汁色素及びカキ色素を添加した群では、100μg/mlの用量で添加しても全くPAI-1遺伝子発現抑制効果は認められなかった(図２)。
この結果から、本発明のPAI-1低下剤は、PAI-1の増加を抑制させることができることが確認された。

Claims

パプリカ色素、ヘマトコッカス色素及びケーパー抽出物からなる群より選ばれる１種以上を有効成分とするプラスミノーゲンアクチベータインヒビター１低下剤。