KR102007083B1 - Tschimganidin를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Tschimganidin를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Tschimganidin 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 비만 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

Tschimganidin를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating obesity comprising Tschimganidin as an active ingredient}
본 발명은 Tschimganidin 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
최근 서구화된 식생활과 더불어 열량 섭취와 소비의 불균형으로 인하여 지방 조직이 과다하게 축적된 상태인 비만이 크게 늘고 있다. 비만은 대부분 섭취한 열량 중에서 소모되고 남는 부분이 지방세포(adipocyte)로 전환되어 체내의 피하조직과 복강 내에 축적되는 현상이다. 이러한, 지방세포의 크기에는 한계가 있으므로 과잉 에너지를 섭취할 때 에너지를 빨리 저장하기 위해서는 지방세포 수의 증가가 필요하게 되어 인체에서는 새로운 지방세포를 만든다. 새로운 지방세포는 전구지방세포(pro-adipocyte)로부터 분화되는데, 전구지방세포는 줄기세포(stem cell)로부터 분화되어 형성되고, 줄기세포가 전구지방 세포를 거쳐 지방세포로 분화되는 과정에는 호르몬, 성장요소, 사이토카인 등의 생체조절자(regulator)들이 영향을 미친다.
비만은 단순히 체중이 많이 나가는 것이 아니라 체지방이 과도하게 축적된 상태를 말한다. 겉으로 정상체중으로 보여도 체지방 비율이 높으면 비만이라고 할 수 있다는 의미이다. 보통 비만을 판정하는 방법은 체질량지수 (BMI)를 이용하게 되는데 23~24.9인 경우에 과체중, 25~29.9까지를 경도비만으로 판정하며, 30~34.9는 중등도비만, 35 이상일 경우는 고도비만으로 판정하고 있다. 비만은 한가지 원인보다는 여러 원인이 복합적으로 작용하여 발생하는데, 서구화된 식습관을 포함하여 잘못된 식습관과 활동량 감소, 정서적 요인, 유전적 요인 등을 들 수 있으며 이렇게 발생한 비만은 결국 고지혈증, 당뇨병, 고혈압 등 만성질환의 발생 위험을 높이게 된다.
한편, 피토에스트로겐(phytoestrogen)은 식물에 존재하는 호르몬 유사물질로 내분비장애를 일으키는 물질로 추정되며, 내인성 에스트로겐의 생합성 대사에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 본 발명에 따른 Tschimganidin은 파이토에스트로겐의 일종으로서, 에스트로겐 신호 전달을 ER 서브타입-선택성 식물성 에스트로겐으로 조절할 수 있으며, Era의 작용제(antagonist)로 역할을 한다는 종래 연구가 있었다.
그러나, Tschimganidin의 지방분화 및 비만과의 관련성에 대한 연구는 지금껏 없었다.
본 발명은 Tschimganidin 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 Tschimganidin 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112017086690809-pat00001
.
상기 조성물은 지방합성, 지질축적 또는 지방세포 분화를 억제할 수 있다.
상기 조성물은 FASN(Fatty acid synthase), PPARγ(Peroxisome Proliferator Receptor gamma), C/EBPα(CCAAT-enhancer-binding proteins alpha) 또는 FABP4(fatty acid binding protein 4)의 mRNA 발현을 감소시킬 수 있다.
상기 Tsc의 용량은 0.1㎍/㎖ 내지 100㎍/㎖인 것일 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 하기 화학식 1로 표시되는 Tschimganidin 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112017086690809-pat00002
.
본 발명은 Tschimganidin 또는 이의 염을 유효성분으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 Tschimganidin는 지질 축적 억제 또는 지방세포 분화 억제 활성이 뛰어난바, 비만에 대한 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
도 1은 천연물 유래 화합물들의 지방세포 분화 동안 PPARγ의 발현이 감소하는 물질들을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 2의 세포독성 여부를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 3의 지방세포 분해 효과를 Oil red O 염색하여 확인한 결과이다.
도 4는 실시예 3의 지방전구세포 내 지질축적 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 지방세포의 분화 동안 지방합성, 지질축적 및 지방세포 분화와 관련된 분자들의 발현 여부를 나타낸 결과이다.
본 발명자들은 천연 유래 화합물 중에서 세포독성이 없으며, 지방세포의 분화 효과가 우수한 Tschimganidin을 선별함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 “Tschimganidin”는 식물 종의 내분비계에 영향을 주며, 에스트로겐 수용체를 통화 효과를 나타내는 식물성 에스트로겐으로서, 하기 화학식 1로 표시되고, IUPAC명은 [(1S,3Z,7Z,9S,10S)-9-하이드록시-3,7-디메틸-10-프로파-2-닐사이클로데카-3,7-디엔-1-일] 4-하이드록시-3-메톡시벤조에이트{[(1S,3Z,7Z,9S,10S)-9-hydroxy-3,7-dimethyl-10-propan-2-ylcyclodeca-3,7-dien-1-yl] 4-hydroxy-3-methoxybenzoate}이다:
[화학식 1]
Figure 112017086690809-pat00003
.
상기 Tschimganidin의 수득방법은 특별히 한정되지 않으며, 상기 Tschimganidin을 함유하고 있는 식물로부터 분리하거나, 공지된 제법을 사용하여 화학적으로 합성하거나 또는 시판되는 것을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 Tschimganidin 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112017086690809-pat00004
.
구체적으로, 상기 Tschimganidin는 지방 합성, 지질축적 또는 지방세포의 분화를 억제하는 각종 인자들, 즉, FASN(Fatty acid synthase), PPARγ(Peroxisome Proliferator Receptor gamma), C/EBPα(CCAAT-enhancer-binding proteins alpha) 또는 FABP4(fatty acid binding protein 4)의 mRNA 또는 단백질 발현을 억제함으로써, 비만을 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 Tschimganidin의 용량은 0.1 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖로 포함될 수 있으며, 5 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, Tschimganidin가 상기 농도 범위 미만인 경우, 중성지방 축적 억제 활성이 저하되어, 비만의 예방 또는 치료 효과를 발휘하기 어려운 문제점이 있고, Tschimganidin가 상기 농도 범위를 초과하는 경우, 세포 독성을 포함한 독성의 우려사항이 있을 수 있다.
본 발명에 따른 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 두류 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
비만 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 Tschimganidin 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112017086690809-pat00005
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상기 Tschimganidin의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 Tschimganidin을 건강기능식품의 첨가물로 사용하는 경우 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
건강기능식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.
상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 TSC은 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 분획물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 비만 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명의 건강기능식품 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 준비예 ]
하기 표 1에 나타낸 각 화합물은 천연물 유래 화합물로서, 시중에서 구매할 수 있는 것으로, 엔조라이프사이언스(Enzo life sience, 미국)에서 구매하여 준비하였다.
CAS No. 이름
24730-10-7 Dihydroergocristine mesylate
518-75-2 Citrinin
142273-20-9 Kenpaullone
304-21-2 Harmaline
14152-28-4 Prostaglandin A1
2068-78-2 Vincristine sulfate
518-69-4 Corydaline
6681-13-6 Hernandezine
59086-90-7 Ingenol 3,20-dibenzoate
17769-16-8 Remerine·HCl
39380-16-0 화학식 1로 표시되는 화합물
[ 실시예 ]
실시예 1. 지방세포 분화 억제 효과를 가지는 천연 추출물 유래 화합물의 선별
상기 준비예에서 준비된 천연물 유래 화합물들 중에서 지방세포 분화를 특이적으로 억제할 수 있는 물질을 선별하기 위해 스크리닝을 수행하였다.
먼저, 지방전구세포(3T3-L1, 한국세포주은행, cat. 10092.1)를 48-웰 플레이트(48-well plate)에 5×104 cell/well로 분주하여 48시간 동안 5% CO2, 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다. 이후, 세포 밀도가 100%에 도달하면, 배양액을 제거하고, 지방세포 분화배지(Insulin, Dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine이 포함된 DMEM)를 이용하여 분화를 3일 동안 유도하였다. 3일 후, 배양액을 제거하고, insulin이 5 ㎍/㎖ 포함된 배지에 표 1에 기재된 다양한 천연물 유래 화합물을 각각 25㎍/㎖ 농도로 처리하였으며, 천연물 유래 화합물을 처리하지 않은 군 및 DMSO 만 처리한 군을 대조군으로 하였다. 이후, 2일 마다 지속적으로 insulin 5 ㎍/㎖과 천연물 유래 화합물을 각각 25㎍/㎖가 포함된 배지를 분주하여 6일 동안 분화를 진행하였다.
그 결과, 지방세포의 분화를 억제하는 효과를 가지는 Corydaline, Hernandezine, Ingenol 3,20-dibenzoate, Remerine·HCl 및 화학식 1로 표시되는 화합물을 1차로 선별하였으며, 최종적으로 지방세포의 분화효과가 가장 우수한 화학식 1로 표시되는 화합물을 선별하였다.
실시예 2. 세포 독성 확인( MTT assay)
상기 실시예 1에서 최종으로 선별한 화학식 1로 표시되는 화합물의 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다.
구체적으로, HEK293 세포를 10% fetal bovine serum (Gibco-BRL, USA)과 1% Penicillin-Streptomycin (+5,000 Units/ml Penicillin, +5,000 ㎍/㎕ Streptomycin, Gibco-BRL, USA)을 넣은 DMEM 배양액으로 5% CO2가 공급되는 배양기에서 37℃ 조건으로 배양하였다. 이후, 상기 HEK293 세포를 5×104 cells/㎖로 96-well plates (SPL, Korea)에 100 ㎕씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, 화학식 1로 표시되는 화합물을 0, 0.1, 0.5, 1, 5, 25, 50 및 100㎍/㎖의 농도로 제조하여 HEK293 세포에 처리하였다. 이후, LPS를 200 ng/mL의 농도로 처리하고 24시간 동안 배양한 후, 각 well에 PBS 완충액에 녹인 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, 5 mg/ml) 용액을 20 ㎕씩 첨가하여 다시 4시간 동안 배양시켰다. Formazan 형성을 확인한 후, 배지를 완전히 제거하고, well 바닥에 형성된 formazan을 녹이기 위해 100 ㎕의 DMSO를 첨가한 후, ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 화학식 1로 표시되는 화합물은 0.1 내지 50㎍/㎖의 농도에서 HEK293 세포에 대하여 세포 독성을 나타내지 않았음을 확인할 수 있다.
실시예 3. 지방전구세포에서 지방세포로의 분화 정도 및 지방축적 억제 확인
상기 실시예 1에서 최종으로 선별한 화학식 1로 표시되는 화합물의 처리 농도(0.1, 0.5, 1, 5, 25, 50㎍/㎖)에 따른 지방전구세포에서 지방세포로의 분화 정도를 확인하기 위하여, Oil red O 염색을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 분화가 진행된 지방전구세포의 배양액을 제거하고 인산완충식염수(PBS; phosphate buffered saline)로 세척하였다. 이후, 웰에 10 % 포름알데하이드(formaldehyde)를 200 ㎕씩 첨가하고 상온에서 1시간 동안 고정시킨 다음, 포름알데하이드를 제거하고 3차 증류수로 씻어내고 60% 이소프로판올로 씻어낸 후 건조하였다. 이후 플레이트(plate)가 다 마르면 오일 레드 오(Oil red O) 염색약을 200 ㎕씩 넣고 상온에서 1 시간 염색한 후 3차 증류수로 3번 세척하였다. 염색이 된 세포는 현미경으로 관찰하여 지방전구세포에서 지방세포로의 분화정도를 확인하였다. 상기 오일 레드 오 염색약은 Oil Red O 염색약 350 ㎎을 이소프로판올(isopropanol) 100 ㎖에 녹인 용액을 증류수와 6:4의 비율로 섞은 후 0.22 ㎛ 필터(filter)로 여과한 용액이다.
이후, 지방세포내 지질 축적 정도를 확인하기 위해 웰당 300 ㎕의 이소프로판올로 지방세포 내 염색된 염색약을 추출하여 ELISA reader로 500 ㎚에서 광학밀도값(OD값; optical density)을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 화학식 1로 표시되는 화합물의 농도 의존적으로 지방전구세포의 지방세포로의 분화가 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 50 내지 50㎍/㎖을 처리한 경우, 지방세포 분화가 현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 화학식 1로 표시되는 화합물을 5㎍/㎖ 이상 처리한 경우, 지방세포 내 지질 축적이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히, 25 내지 50㎍/㎖을 처리한 경우, 지질 축적이 현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 항비만 관여 인자의 발현 양상 확인
4-1. RNA 분리 및 RT- PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)
지방전구세포 1×106 cells 당 Trizol 용액 334 ㎕을 첨가하여 갈아준 후, 4℃, 12,000 × g에서 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 chloroform 67 ㎕을 첨가하고, vortex하였다. 다시 상층액을 새 튜브로 옮기고 상층액과 isopropanol의 비율이 1:1이 되도록 isopropanol을 첨가하였다. 10회 세게 흔든 다음 실온에서 15분 동안 방치하고, 12,000 × g, 4℃에서 10분간 원심분리 시킨 후 상층액을 제거하고, 남은 침전물에 70% ethanol 1 ml을 가한 후 7,500 × g, 4℃에서 5분 동안 원심분리 하였다. 에탄올을 제거한 후 RNA 침전물이 담긴 튜브를 실온에서 15분 동안 건조시키고, nuclease free water를 사용하여 RNA pellet을 용해시켰다. UV/VIS spectrophotometer(Beckman coulter, DU730)를 이용하여 260 nm 및 280 nm 파장에서 추출된 RNA 시료의 농도를 측정하고, agarose gel electrophoresis를 실시하여 RNA 시료의 integrity를 확인하였다.
지방전구세포에서 추출된 RNA시료를 대상으로 oligo dT primer와 superscript reverse transcriptase (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 이용하여 reverse transcription을 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. Reverse transcription을 통해 얻은 cDNA를 template로 하고 증폭하고자 하는 유전자 cDNA의 5‘과 3’ flanking sequence를 primer로 사용하여 PCR을 수행하였으며, 이때 사용된 primer sequence는 하기 표 2에 제시된 바와 같다. 증폭된 PCR 산물 1 ㎕를 1% agarose gel에 전기 영동하여 DNA band를 확인하였다.
Gene description Primers Sequences (5’→3') Annealing
temperature
(℃)		 PCR
product
(bp)
FASN F tgggttctagccagcagagt 60.5 158
R accaccagagaccgttatgc
FABP4 F catcagcgtaaatggggatt 56.4 182
R tcgactttccatcccacttc
PPARγ F Agggcgatcttgacaggaaa 59 164
R cgaaactggcacccttgaaa
C/EBPα F gtgactttgactacccggga 59 183
R ggggctcttgtttgatcacc
4-2. Western blotting
지방세포에서 western blotting을 수행하기 위해 media를 제거한 각 well에 500 μL의 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, 5 mM EDTA, 50 mM sodium pyrophosphate, 50 mM NaF, 100 mM orthovanadate, 1% Triton X-100, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride, 2 μg/mL aprotinin, 1 μg/mL pepstatin A, and 1 μg/mL leupeptin을 포함하는 lysis buffer를 넣고 harvest한 후 1,300 × g, 4℃에서 20분간 원심분리한 후 가운데 층을 취하고 Bradford 법에 따라 단백질을 정량 하였다(Bio-Rad). 단백질 40 ㎍을 SDS polyacrylamide gel에 전기영동시킨 후 nitrocellulose membranes (Amersham, Buckinghamshire, UK)으로 이동시켰다. Membrane을 tris-buffered saline과 tween 20 용액(TBS-T)을 이용하여 10분 동안 3회 반복하여 세척한 후 10% skim milk를 이용하여 60분간 차단하였다. Membrane을 1:1,000의 비율로 희석한 1차 항체에 넣어 4℃에서 부드럽게 흔들어 12시간 동안 배양한 후 TBS-T를 이용하여 세척하였고, membrane을 다시 1:2,000의 비율로 희석한 2차 항체와 함께 60분 동안 배양하고 세척하였다. 이 때, 1차 항체는 FASN, FABP4, PPARγ 및 C/EBP4를 사용하였다. 최종적으로 단백질을 X-ray 필름에 ECL Western blot detection kit (RPN2106, Amersham, Arlington Heights, IL, USA)를 사용하여 시각화하였다. X-ray 필름에 시각화된 밴드를 스캔 후 Quantity One analysis software (Bio-Rad)를 이용하여 정량화하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 화학식 1로 표시되는 화합물의 농도 의존적으로 FASN, FABP4, PPARγ 및 C/EBPα의 단백질 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히, 20 내지 40㎍/㎖을 처리한 경우, 상기 단백질의 발현량이 현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
하기에 본 발명의 추출물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1: 산제의 제조
Tschimganidin 20 ㎎
유당수화물 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 2: 정제의 제조
Tschimganidin 10 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당수화물 100 ㎎
스테아르산마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예 3: 캅셀제의 제조
Tschimganidin 10 ㎎
미결정셀룰로오스 3 ㎎
유당수화물 14.8 ㎎
스테아르산마그네슘 0.2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캅셀제의 제조방법에 다라서 젤라틴캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조하였다.
제제예 4: 주사제의 제조
Tschimganidin 10 ㎎
만니톨 180 ㎎
주사용 멸균 증류수 2974 ㎎
인산일수소나트퓸 26 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1앰플당(2mL) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
제제예 5: 액제의 제조
Tsc 10 ㎎
이성화당 10 ㎎
만니톨 5 ㎎
정제수 적량
레몬향 적량
상기의 성분을 통상의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100mL로 조절한 후 멸균시켜 갈색병에 충진하여 액제를 제조한다.
제제예 6: 건강기능식품의 제조
Tschimganidin 10 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이드 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 30 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7: 건강음료의 제조
Tschimganidin 10 mg
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3 g
정제수 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Composition for preventing or treating obesity comprising Tschimganidin as an active ingredient <130> 1062682 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of FASN <400> 1 tgggttctag ccagcagagt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of FASN <400> 2 accaccagag accgttatgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of FABP4 <400> 3 catcagcgta aatggggatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of FABP4 <400> 4 tcgactttcc atcccacttc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of PPAR gamma <400> 5 agggcgatct tgacaggaaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of PPAR gamma <400> 6 cgaaactggc acccttgaaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of C/EBP alpha <400> 7 gtgactttga ctacccggga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of C/EBP alpha <400> 8 ggggctcttg tttgatcacc 20

Claims (5)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 Tschimganidin 또는 이의 염을 유효성분으로 25㎍/㎖ 내지 50㎍/㎖ 농도로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112019059396534-pat00006
    .
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 지방합성, 지질축적 또는 지방세포 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는
    비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 FASN(Fatty acid synthase), PPARγ(Peroxisome Proliferator Receptor gamma), C/EBPα(CCAAT-enhancer-binding proteins alpha) 또는 FABP4(fatty acid binding protein 4)의 mRNA 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는
    비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 하기 화학식 1로 표시되는 Tschimganidin 또는 이의 염을 유효성분으로 25㎍/㎖ 내지 50㎍/㎖ 농도로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112019059396534-pat00007
    .
KR1020170114076A 2017-09-06 2017-09-06 Tschimganidin를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 KR102007083B1 (ko)

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