JP2009519728A - ローラーボトルでの分娩後取り出し細胞の体外増殖 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 ローラーボトルのような容器などの培養装置での成長速度および細胞収量を最適化する方法を提供する。それらの方法はとりわけ、分娩後取り出しヒト細胞(例えば、臍帯由来細胞)を得るのに適している。
【選択図】 図5
Description
本出願は、出願日2005年12月19日の米国仮特許出願第60/751,550号に対する利益を主張する。この米国仮特許出願明細書の内容は、参照されることによって、その全内容が本明細書に組み入れられる。
本発明は概して、哺乳動物細胞の成長および増殖に関する。本発明はとりわけ、ローラーボトル(roller bottles)のような容器で分娩後取り出し細胞(postpartum-derived cells)の体外成長および体外増殖を行う方法に関する。
市販の細胞治療用産物(cell therapy products)は、閉鎖されている無菌装置で産生されることが好ましい。しかし、市販の細胞治療用産物を得るために使用される多くの細胞系の成長は、足場依存性(anchorage-dependent)である。撹拌槽型反応器、振盪フラスコ、スピナーフラスコ(spinner flasks)、アップリフト反応器(uplift reactors)等は全て、懸濁液中で成長する細胞(例えば、モノクローナル抗体を産生するためのハイブリドーマ(hybridomas)、組み換えDNA技術のために使用される多くの細胞、および、大部分の昆虫細胞の培養株)にとっては有用であるが、足場依存性細胞または足場選択性細胞(anchorage-preferred cells)を成長させかつ増殖させるためのオプション(options)は、より制限されている。
本発明は、その幾つかの態様の1つにおいて、ローラーボトル培養装置での分娩後取り出し細胞の成長パラメータを最大化する諸方法を提供する。本発明によると、ローラーボトル培養装置での分娩後取り出し細胞の培養株の集団倍加数を最大化する諸方法が提供される。それらの方法は、少なくとも約0.85rpmの回転速度を使用することと、850cm2培養ボトルの中で少なくとも約100mLの培地容量を使用することと、約2500細胞/cm2未満の播種密度を使用することと、少なくとも約5.5日間培養することと、を含む。
本発明は、その多くの態様の幾つかにおいて、ローラーボトル培養装置で成長した細胞集団から採取するのに利用できる足場依存性細胞(anchorage-dependent cells)の量、そのような培養株の成長速度、または、そのような培養株の総集団倍加数(total number of doublings)を最大化する別々の方法を提供する。本発明は、前述の諸パラメータの3個全てを同時に最大化する方法をも提供する。前述の諸方法によって産生される細胞および細胞集団もまた、本発明において提供される。
細胞:使用した細胞は、臍帯由来細胞系、ATCC受入番号PTA−6067および/またはPTA−6068、からのものである。
細胞:使用した細胞は、CBAT050604B P6(継代6回目)として分類されている臍帯由来細胞であった。
細胞:特徴付け実験のために使用した細胞は、継代6回目の臍帯由来細胞(050604B P6)であった。
細胞:050604B P7
(1)ローラーボトル培養装置での分娩後取り出し細胞の培養株の集団倍加数を最大化する方法において、
少なくとも約0.85rpmの回転速度を使用することと、
850cm2培養ボトルの中で少なくとも約100mLの培地容量を使用することと、
約2500細胞/cm2未満の播種密度を使用することと、
少なくとも約5.5日間培養することと、
を含む、方法。
(2)実施態様1に記載の方法において、
前記回転速度は、約1rpmであり、前記培地容量は、850cm2培養ボトルの中で約112mLであり、前記培養時間は、約6.2日である、方法。
(3)実施態様1に記載の方法において、
結果的に約3回の集団倍加となる、方法。
(4)実施態様1に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、臍帯由来細胞である、方法。
(5)実施態様4に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、ATCC番号PTA−6067およびPTA−6068である、方法。
(6)ローラーボトル培養装置での分娩後取り出し細胞の培養株の集団倍加速度を最大化する方法において、
少なくとも約0.85rpmの回転速度を使用することと、
850cm2培養ボトルの中で約300mLの成長培地を使用することと、
約2500細胞/cm2未満の播種密度を使用することと、
約6日間よりも短い間培養することと、
を含む、方法。
(7)実施態様6に記載の方法において、
前記回転速度は、約0.93rpmであり、前記培養時間は、約5.5日間よりも短い、方法。
(8)実施態様6に記載の方法において、
前記集団倍加の時間は、約30時間より短い、方法。
(9)実施態様6に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、臍帯由来細胞である、方法。
(10)実施態様9に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、ATCC番号PTA−6067およびPTA−6068である、方法。
約0.5〜1rpmの回転速度を使用することと、
850cm2培養ボトルの中で約300mLの成長培地を使用することと、
約10,000細胞/cm2の播種密度を使用することと、
約5.5〜6.7日間にわたって培養することと、
を含む、方法。
(12)実施態様11に記載の方法において、
前記回転速度は、約0.98rpmであり、前記培養時間は、約6.7日間である、方法。
(13)実施態様11に記載の方法において、
前記細胞密度は、少なくとも約3×104細胞/cm2である、方法。
(14)実施態様11に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、臍帯由来細胞である、方法。
(15)実施態様14に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、ATCC番号PTA−6067およびPTA−6068である、方法。
(16)ローラーボトル培養装置での分娩後取り出し細胞の集団倍加速度と採取密度と総集団倍加数とを同時に最大化する方法において、
約0.65〜0.9rpmの回転速度を使用することと、
850cm2培養ボトルの中で少なくとも約300mLの成長培地を使用することと、
約2,500細胞/cm2未満の播種密度を使用することと、
約5.5〜6.5日間にわたって培養することと、
を含む、方法。
(17)実施態様16に記載の方法において、
前記回転速度は、約0.7rpmであり、前記培養時間は、約6〜6.3日間である、方法。
(18)実施態様16に記載の方法において、
前記回転速度は、約0.85rpmであり、前記培養時間は、約6〜6.3日間である、方法。
(19)実施態様16に記載の方法において、
集団倍加時間は、約39時間よりも短く、前記集団は、少なくとも約3回倍加(about 3 doublings)し、採取時の前記細胞密度は、少なくとも約1.8×104細胞/cm2である、方法。
(20)実施態様16に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、臍帯由来細胞である、方法。
(21)実施態様20に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、ATCC番号PTA−6067およびPTA−6068である、方法。
Claims (21)
- ローラーボトル培養装置での分娩後取り出し細胞の培養株の集団倍加数を最大化する方法において、
少なくとも約0.85rpmの回転速度を使用することと、
850cm2培養ボトルの中で少なくとも約100mLの培地容量を使用することと、
約2500細胞/cm2未満の播種密度を使用することと、
少なくとも約5.5日間培養することと、
を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記回転速度は、約1rpmであり、前記培地容量は、850cm2培養ボトルの中で約112mLであり、前記培養時間は、約6.2日である、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
結果的に約3回の集団倍加となる、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、臍帯由来細胞である、方法。 - 請求項4に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、ATCC番号PTA−6067およびPTA−6068である、方法。 - ローラーボトル培養装置での分娩後取り出し細胞の培養株の集団倍加速度を最大化する方法において、
少なくとも約0.85rpmの回転速度を使用することと、
850cm2培養ボトルの中で約300mLの成長培地を使用することと、
約2500細胞/cm2未満の播種密度を使用することと、
約6日間よりも短い間培養することと、
を含む、方法。 - 請求項6に記載の方法において、
前記回転速度は、約0.93rpmであり、前記培養時間は、約5.5日間よりも短い、方法。 - 請求項6に記載の方法において、
前記集団倍加の時間は、約30時間より短い、方法。 - 請求項6に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、臍帯由来細胞である、方法。 - 請求項9に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、ATCC番号PTA−6067およびPTA−6068である、方法。 - ローラーボトル培養装置で分娩後取り出し細胞を採取する時の細胞密度を最大化する方法において、
約0.5〜1rpmの回転速度を使用することと、
850cm2培養ボトルの中で約300mLの成長培地を使用することと、
約10,000細胞/cm2の播種密度を使用することと、
約5.5〜6.7日間にわたって培養することと、
を含む、方法。 - 請求項11に記載の方法において、
前記回転速度は、約0.98rpmであり、前記培養時間は、約6.7日間である、方法。 - 請求項11に記載の方法において、
前記細胞密度は、少なくとも約3×104細胞/cm2である、方法。 - 請求項11に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、臍帯由来細胞である、方法。 - 請求項14に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、ATCC番号PTA−6067およびPTA−6068である、方法。 - ローラーボトル培養装置での分娩後取り出し細胞の集団倍加速度と採取密度と総集団倍加数とを同時に最大化する方法において、
約0.65〜0.9rpmの回転速度を使用することと、
850cm2培養ボトルの中で少なくとも約300mLの成長培地を使用することと、
約2,500細胞/cm2未満の播種密度を使用することと、
約5.5〜6.5日間にわたって培養することと、
を含む、方法。 - 請求項16に記載の方法において、
前記回転速度は、約0.7rpmであり、前記培養時間は、約6〜6.3日間である、方法。 - 請求項16に記載の方法において、
前記回転速度は、約0.85rpmであり、前記培養時間は、約6〜6.3日間である、方法。 - 請求項16に記載の方法において、
集団倍加時間は、約39時間よりも短く、前記集団は、少なくとも約3回倍加し、採取時の前記細胞密度は、少なくとも約1.8×104細胞/cm2である、方法。 - 請求項16に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、臍帯由来細胞である、方法。 - 請求項20に記載の方法において、
前記分娩後取り出し細胞は、ATCC番号PTA−6067およびPTA−6068である、方法。
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