JP2008530215A - 生物学的に活性な分子をデリバリーするための脂質ナノ粒子系組成物および方法 - Google Patents

生物学的に活性な分子をデリバリーするための脂質ナノ粒子系組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は，新規なカチオン性脂質，トランスフェクション剤，マイクロ粒子，ナノ粒子，および短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。本発明はまた，被験者または生物において遺伝子発現および／または活性の調節に応答する形質，疾病および状態の研究，診断，および治療のために用いられる組成物，および方法を特徴とする。詳細には，本発明は，生物学的に活性な分子，例えば，抗体（例えば，モノクローナル抗体，キメラ抗体，ヒト化抗体など），コレステロール，ホルモン，抗ウイルス剤，ペプチド，蛋白質，化学療法剤，小分子，ビタミン，補因子，ヌクレオシド，ヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アンチセンス核酸，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，２，５−Ａキメラ，ｄｓＲＮＡ，アロザイム，アプタマー，デコイおよびこれらの類似体，および小核酸分子，例えば，短干渉核酸（ｓｉＮＡ），短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を，例えば被験者または生物の関連する細胞および／または組織に有効にトランスフェクションまたはデリバリーするための新規なカチオン性脂質，マイクロ粒子，ナノ粒子およびトランスフェクション剤に関する。そのような新規なカチオン性脂質，マイクロ粒子，ナノ粒子およびトランスフェクション剤は，例えば，細胞，被験者または生物において疾病，状態，または形質を予防，阻害，または治療するために組成物を提供するのに有用である。本明細書に記載される組成物は，一般に処方分子組成物（ＦＭＣ）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と称される。

Description

本出願は，米国特許仮出願６０／６５２，７８７（２００５年２月１４日），米国特許仮出願６０／６７８，５３１（２００５年５月６日出願），米国特許仮出願６０／７０３，９４６（２００５年７月２９日出願），および米国特許仮出願６０／７３７，０２４（２００５年１１月１５日出願）に基づく優先権を主張する。これらの出願は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
発明の分野
本発明は，種々の分子を細胞にデリバリーするのに有用な，新規な粒子形成デリバリー剤，例えば，カチオン性脂質，マイクロ粒子，およびナノ粒子に関する。本発明はまた，被験者または生物において遺伝子発現および／または活性の調節に応答する形質，疾病および状態の研究，診断，および治療において用いるための組成物，および方法を特徴とする。詳細には，本発明は，生物学的に活性な分子，例えば，抗体（例えば，モノクローナル，キメラ，ヒト化等），コレステロール，ホルモン，抗ウイルス剤，ペプチド，蛋白質，化学療法剤，小分子，ビタミン，補因子，ヌクレオシド，ヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アンチセンス核酸，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，２，５−Ａキメラ，アロザイム，アプタマー，デコイおよびこれらの類似体，および小核酸分子，例えば，短干渉核酸（ｓｉＮＡ），短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を，被験者または生物等の関連する細胞および／または組織に効率的にトランスフェクションまたはデリバリーする，新規なカチオン性脂質，マイクロ粒子，ナノ粒子およびトランスフェクション剤に関する。このような新規なカチオン性脂質，マイクロ粒子，ナノ粒子およびトランスフェクション剤は，例えば，細胞，被験者または生物において疾病，状態，または形質を予防，阻害，または治療するための組成物を与えるのに有用である。
発明の背景
本発明は，生物学的に活性な分子の細胞へのデリバリーに関する。詳細には，本発明は，例えば，上皮組織および内皮組織中の細胞膜を越える輸送を容易にすることにより，核酸，ポリヌクレオチド，およびオリゴヌクレオチド，例えば，ＲＮＡ，ＤＮＡおよびこれらの類似体，ペプチド，ポリペプチド，蛋白質，抗体，ホルモンおよび小分子を細胞にデリバリーするための化合物，組成物および方法に関する。本発明の化合物，組成物および方法は，生物学的に活性な分子の細胞，組織，および臓器への効率的な輸送に依存する，治療，研究，および診断用途において有用である。以下の説明は本発明を理解するためにのみ提供される。この概要は，以下に記載される研究のいずれかが本発明に対する従来技術であると認めるものではない。
種々の治療用化合物，例えば，抗ウイルス剤および化学療法剤の細胞デリバリーは，通常は２つの制限により妨げられている。第１は，多くの治療剤の選択性がしばしば低く，このため，正常組織に対する毒性が高いことである。第２は，細胞の複雑な膜システムにより，多くの化合物の生きた細胞内への輸送が高度に制限されていることである。特異的トランスポーターが栄養または制御分子の選択的侵入を可能としているが，ほとんどの外来分子，例えば，核酸および蛋白質は排除される。化合物の細胞内への輸送を改良するために種々の戦略を用いることができ，これには，例えば，脂質担体，生物分解性ポリマー，および種々のコンジュゲート系の使用が含まれる。
外来核酸の細胞内への輸送を改良する最もよく研究されているアプローチは，ウイルスベクターまたはカチオン性脂質および関連するサイトフェクチンの使用を含む。ある種の細胞タイプにはウイルスベクターを用いて遺伝子を効率よく輸送することができるが，これは一般に，化学的に合成された分子の細胞への導入には用いることができない。別のアプローチは，カチオン性脂質を取り込んだデリバリー処方物を用いることであり，これは一方の末端で核酸と相互作用し，もう一方の末端で脂質または膜系と相互作用する（概説として，Ｆｅｌｇｎｅｒ，１９９０，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖａｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５，１６２−１８７；Ｆｅｌｇｎｅｒ １９９３，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．，３，３−１６を参照）。合成核酸ならびにプラスミドは，サイトフェクチンを用いてデリバリーすることができるが，そのような化合物の用途は，細胞タイプ特異性，トランスフェクションの間の低血清の必要性，および毒性のため，しばしば制限される。
生物学的に活性な分子をデリバリーするための別のアプローチは，コンジュゲートの使用を含む。コンジュゲートはしばしば，ある分子が，例えば，レセプター媒介性エンドサイトーシスを介して特定の細胞に選択的に輸送される能力に基づいて選択される。目的とする化合物を細胞膜を横切って能動的に輸送される分子に結合させることにより，その化合物の細胞または特定の細胞オルガネラ内への有効な輸送を実現することができる。あるいは，能動的輸送メカニズムなしで細胞膜に侵入することができる分子，例えば，種々の親油性分子を用いて目的とする化合物をデリバリーすることができる。コンジュゲートとして利用することができる分子の例としては，限定されないが，ペプチド，ホルモン，脂肪酸，ビタミン，フラボノイド，糖，レポーター分子，レポーター酵素，キレーター，ポルフィリン，インターカレーター，および能動的輸送または受動的輸送のいずれかにより細胞膜に侵入しうる他の分子が挙げられる。
特定の細胞タイプ，例えば，癌細胞または特定の組織および臓器に特異的な細胞への化合物のデリバリーは，特定の細胞タイプに関連するレセプターを利用することにより行うことができる。特定のレセプターは，ある種の癌性細胞で過剰発現されており，これには，高親和性葉酸レセプターがある。例えば，高親和性葉酸レセプターは，種々の新生物組織，例えば，乳，卵巣，子宮頚部，結腸直腸，腎臓，および鼻咽頭腫瘍で過剰発現されているが，正常組織では非常に限定された程度で発現されている腫瘍マーカーである。葉酸系のコンジュゲートを用いて外因性化合物を細胞膜を越えて輸送することにより，疾病の治療および診断に対して標的化されたデリバリーのアプローチを提供することができ，治療用化合物の必要な投与量を低減させることができる。さらに，バイオコンジュゲート，例えば葉酸バイオコンジュゲートを用いることにより，治療的生物利用性，薬力学，および薬物動態学的パラメータを調節することができる。Ｇｏｄｗｉｎら（１９７２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４７，２２６６−２２７１）は，生物学的に活性なプテロイルオリゴ−Ｌ−グルタメートの合成を報告する。Ｈａｂｕｓら（１９９８，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，９，２８３−２９１）は，ある種のオリゴヌクレオチド−葉酸コンジュゲートの固相合成の方法を記載する。Ｃｏｏｋ（米国特許６，７２１，２０８）は，特定のコンジュゲート基で修飾されたある種のオリゴヌクレオチドを記載する。ビオチンおよび葉酸コンジュゲートを用いて外因性分子，例えば特定のオリゴヌクレオチドの貫膜輸送を増強することは，Ｌｏｗら（米国特許５，４１６，０１６，５，１０８，９２１，および国際公開ＷＯ９０／１２０９６）により報告されている。Ｍａｎｏｈａｒａｎら（国際公開ＷＯ９９／６６０６３）は，ある種の葉酸コンジュゲート，例えば，コンジュゲートの核酸成分に結合したホスホルアミダイト成分を有する特異的核酸葉酸コンジュゲート，およびこれらの葉酸コンジュゲートを合成する方法を記載する。Ｎｏｍｕｒａら（２０００，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６５，５０１６−５０２１）は，ある種の葉酸−ヌクレオシドコンジュゲートの合成に有用な中間体であるアルファ−［２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル］葉酸の合成を記載する。Ｇｕｚａｅｖら（ＵＳ６，３３５，４３４）は，ある種の葉酸オリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成を記載する。Ｖａｒｇｅｅｓｅら（国際公開ＷＯ０２／０９４１８５および米国特許公開２００３０１３０１８６および２００４０１１０２９６）は，ある種の核酸コンジュゲートを記載する。
別の細胞タイプへの化合物のデリバリーは，ある種の細胞，例えば肝細胞に関連するレセプターを利用することにより行うことができる。例えば，レセプター媒介性エンドサイトーシスを利用する薬剤デリバリー系を用いて，薬剤標的化ならびに薬剤取り込みの増強が達成されている。アシアロ糖蛋白質レセプター（ＡＳＧＰｒ）（例えば，Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２を参照）は肝細胞に独特であり，分子ガラクトース末端糖蛋白質，例えばアシアロオルソムコイドに結合する（ＡＳＯＲ）。このような糖蛋白質または合成グリココンジュゲートのレセプターへの結合は，オリゴ糖鎖の分枝の程度によって大きく異なる親和性をもって，例えば，三触角構造は二触角または一触角鎖より高い親和性をもって生ずる（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｔｅ，１９８０，Ｃｅｌｌ，２２，６１１−６２０；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，９３９−９４５）。Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌｅｅ（１９８７，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．，４，３１７−３２８）は，ガラクトースと比較してレセプターに対して高い親和性を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを炭水化物成分として用いることにより，この高い特異性を得た。この"クラスタリング効果"は，マンノシル末端を有する糖蛋白質またはグリココンジュゲートの結合および取り込みについても記載されている（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２４，１３８８−１３９５）。ガラクトースおよびガラクトサミン系のコンジュゲートを用いて外因性化合物を細胞膜を越えて輸送することは，肝臓病，例えば，ＨＢＶおよびＨＣＶ感染または肝細胞癌の治療に対して標的化デリバリー方法を提供する。バイオコンジュゲートの利用はまた，治療用化合物の治療に必要な投与量を減少させることができる。さらに，バイオコンジュゲートを用いることにより治療的生物利用性，薬力学および薬物動態学的のパラメータを調節することができる。
いくつかの研究グループにより，多数のペプチド系細胞トランスポーターが開発されている。これらのペプチドは，インビトロおよびインビボで高い効率で細胞膜を横切ることができる。そのような融合性ペプチドの例としては，ショウジョウバエの転写因子であるＡＮＴＥＮＮＡＰＥＤＩＡのホメオドメインの１６−アミノ酸フラグメント（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９２，３３１８−３３２２）；ＮＬＳドメインを含むかまたは含まないカポジ線維芽細胞成長因子のシグナル配列の疎水性領域である１７−ｍｅｒフラグメント（Ａｎｔｏｐｏｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１０，５９８−６０６）；クロコダイラスワニのＩｇ（５）軽鎖の１７−ｍｅｒシグナルペプチド配列（Ｃｈａｌｏｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２４３，６０１−６０８）；ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１１４の１７−アミノ酸融合配列（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２５，２７３０−２７３６）；ＨＩＶ−１ Ｔａｔ４９−５７フラグメント（Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５，１５６９−１５７２）；神経ペプチドガラニンおよび膜相互作用ハチ毒ペプチドマストポランのＮ末端フラグメントから構成されるトランスポータンＡ−非キメラ２７−ｍｅｒ（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１１，６１９−６２６）；およびインフルエンザウイルスヘマグルチニンエンベロープ糖蛋白質に由来する２４−ｍｅｒ（Ｂｏｎｇａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，４６８１−４６８８）が挙げられる。これらのペプチドは，脂質なしで細胞培養トランスフェクションを行うためのアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートの一部として首尾よく用いられた。多くの場合，このようなコンジュゲートは，脂質デリバリーを用いてトランスフェクトした親オリゴヌクレオチドより高い細胞培養有効性を示した。さらに，ファージディスプレイ手法の使用により，いくつかの臓器標的化および腫瘍標的化ペプチドがインビボで同定された（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９６，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２，６９７−７１５）。腫瘍を標的とするペプチドのドキソルビシンへのコンジュゲート化により，毒性プロファイルが有意に改良されることが示され，インビボネズミ癌モデルＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌腫においてドキソルビシンの効力が増強されることが示された（Ａｒａｐ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９，３７７−３８０）。
生物学的に活性な分子の細胞内デリバリーの別のアプローチは，カチオン性ポリマーの使用を含む。例えば，Ｒｙｓｅｒら（国際公開ＷＯ７９／００５１５）は，種々の分子の細胞膜を越える輸送を増加させるために高分子量リジンポリマーを使用することを記載する。Ｒｏｔｈｂａｒｄら（国際公開ＷＯ９８／５２６１４）は，薬剤および高分子を生物膜を越えて輸送するためのある種の方法および組成物を記載し，ここで，薬剤または高分子は，６−２５サブユニットから構成される輸送ポリマーに共有結合されており，その少なくとも５０％はグアニジノまたはアミジノ側鎖を含む。輸送ポリマーは，好ましくは全Ｄ−，全Ｌ−またはＤ−アルギニンとＬ−アルギニンとの混合物から構成されるポリアルギニンペプチドである。Ｒｏｔｈｂａｒｄら（米国特許公開２００３００８２３５６）は，上皮組織，例えば，皮膚，胃腸管，肺上皮および血液脳関門を越えて薬剤をデリバリーするためのある種のポリ−リジンおよびポリアルギニン化合物および他の試薬を記載するＷｅｎｄｅｌら（米国特許公開２００３００３２５９３）は，ある種のポリアルギニン化合物を記載する。Ｒｏｔｈｂａｒｄら（米国特許公開２００３００２２８３１）は，薬剤の眼内デリバリー用のある種のポリ−リジンおよびポリアルギニン化合物を記載する。Ｋｏｓａｋ（米国特許公開２００１００３４３３３）は，架橋したカチオン性ポリマー成分を含むある種のシクロデキストランポリマー組成物を記載する。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら（米国特許６，３９５，７１３）；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら（国際公開ＷＯ９９／０４８１９）；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら（国際公開ＷＯ９９／０５０９４）；およびＢｅｉｇｅｌｍａｎら（米国特許公開２００３００７３６４０）は，ある種の脂質系処方物を記載する。
生物学的に活性な分子の細胞内デリバリーの別のアプローチは，リポソームまたは他の粒子形成組成物を使用することを含む。Ｂａｎｇｈａｍ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３，２３８−２５２）により１９６５年にリポソームが最初に記載されて以来，薬学的に活性な化合物をデリバリーするための脂質系担体システムを開発する分野で興味および努力が続けられてきた。リポソームは，その細胞取り込みを改良しながら生物学的分子を分解から保護するため，魅力的な薬剤担体である。ポリアニオン（例えば，ＤＮＡ）をデリバリーするために最も一般的に使用されている種類のリポソーム処方物の１つは，カチオン性脂質を含むものである。カチオン性脂質単独または他の脂質およびホスファチジルエタノールアミン等の両親媒性物質を含むものを用いて，高分子とともに脂質凝集物を形成することができる。脂質処方物の組成ならびにその製造方法の両方が，得られるアニオン性高分子−カチオン性脂質凝集体の構造およびサイズに影響を与えることは当該技術分野においてよく知られている。これらの因子を調節して，インビトロおよびインビボでポリアニオンの特定の細胞タイプへのデリバリーを最適化することができる。生物学的に活性な分子の細胞デリバリーのためにカチオン性脂質を使用することは，いくつかの利点を有する。カチオン性脂質を用いるアニオン性化合物の封入は，静電的相互作用のため本質的に定量的である。さらに，カチオン性脂質は，負に荷電した細胞膜と相互作用し，細胞膜輸送を開始すると考えられている（Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２，１３９；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，５６１６）。
プラスミドＤＮＡを二重層脂質ベシクル中に封入された単一のプラスミドから構成される小さい粒子の中に封入しうることを示す実験がある（Ｗｈｅｅｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６，２７１−２８１）。これらの粒子は，典型的には，融合活性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ），低レベルのカチオン性脂質を含み，ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）コーティングの存在により水性媒体中で安定化することができる。これらの粒子は，静脈内（ｉ．ｖ．）注入後に延長された循環寿命を示し，そのような領域における血管透過性の増加により種々の組織および臓器または腫瘍で優先的に蓄積することができ，エンドソーム膜の破壊によりエンドサイトーシスのリソソーム経路を回避するよう設計することができるため，全身投与用途を有する。これらの特性は，生物学的に活性な分子を実験および治療用途のために種々のタイプの細胞にデリバリーするのに有用でありうる。例えば，核酸技術，例えば，短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），アンチセンス，リボザイム，デコイ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，２−５Ａオリゴヌクレオチド，およびアプタマーのインビトロおよびインビボでの有効な用途には，これらの化合物を細胞膜を越えて効率的にデリバリーすることが有効である。Ｌｅｗｉｓら，米国特許公開２００３０１２５２８１は，ｓｉＲＮＡ，ある種の両性化合物，およびある種のポリカチオンの組み合わせからなるある種の組成物を記載する。ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，米国特許公開２００３００７７８２９は，ある種の脂質系処方物を記載する。ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，国際公開ＷＯ０５／００７１９６は，ある種の脂質で封入した干渉ＲＮＡ処方物を記載する。Ｖａｒｇｅｅｓｅら，国際公開ＷＯ２００５００７８５４は，ポリヌクレオチドの細胞デリバリーのためのある種のポリカチオン性組成物を記載する。ＭｃＳｗｉｇｇｅｎら，国際公開ＷＯ０５／０１９４５３，ＷＯ０３／７０９１８，ＷＯ０３／７４６５４および米国特許公開２００５００２０５２５および２００５００３２７３３は，短干渉核酸分子（ｓｉＮＡ），およびｓｉＮＡ分子および他のポリヌクレオチドをデリバリーするための種々の技術を記載する。
さらに，カチオン性脂質粒子に関する最近の研究は，核酸（または他のポリアニオン性化合物）およびカチオン性脂質を含む２つの構造的に異なる複合体が形成されることを示した（Ｓａｆｉｎｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：７８−８１（１９９８）。１つの構造は，カチオン性脂質二重層の間にサンドウィッチされた核酸単層を有するマルチラメラ構造（"ラメラ構造"）を含む（図７）。第２の構造は，二次元の六角円柱相構造（"逆位六角形構造"）を含み，この構造では核酸分子は六角形構造の形でカチオン性脂質に取り囲まれている（図７）。Ｓａｆｉｎｙａらは，逆位六角形構造はラメラ構造より高い効率で哺乳動物細胞をトランスフェクトすることを示した。さらに，光学顕微鏡による研究は，ラメラ構造を含む複合体はベシクルと融合せずにアニオン性ベシクルに安定に結合するが，逆位六角形構造を含む複合体は不安定であり，急速にアニオン性ベシクルと融合し，融合の際に核酸を放出することを示した。
ラメラ相から逆位六角形相複合体への構造的トランスフォーメーションは，逆位六角形構造をとることを助ける適当なヘルパー脂質を組み込むことにより，または共界面活性剤，例えばヘキサノールを使用することにより達成される。しかし，これらのトランスフォーメーション条件のいずれも，生物学的システムにおけるデリバリーには適していない。さらに，逆位六角形複合体はより高いトランスフェクション効率を示すが，ラメラ複合体と比較して血清安定性が非常に低い。すなわち，血清安定性であり，すなわち循環中で安定であり，例えば生物学的条件下で，ラメラ相から逆位六角形相に構造的トランスフォーメーションを起こすことができるデリバリー剤を設計することが求められている。
本出願は，生物学的に活性な分子の全身および局所デリバリーの効率を有意に改良するための化合物，組成物および方法を提供する。本出願は，特に，循環中で安定であり，かつ適当な生理学的条件（例えば，ｐＨ）下で生物学的に活性な分子のデリバリーの効率を増加させる構造的変化を起こす新規なデリバリー剤を製造し使用するための化合物，組成物および方法を提供する。
発明の概要
本発明は，種々の分子を生物学的システム，例えば，細胞にデリバリーすることを容易にする化合物，組成物，および方法を特徴とする。本発明により提供される化合物，組成物，および方法は，治療用化合物を，細胞膜を越えて，または上皮または内皮組織の１またはそれ以上の層を越えて輸送することにより，治療活性を与えることができる。本発明は，分子，例えば，限定されないが，小分子，脂質，ヌクレオシド，ヌクレオチド，核酸，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，抗体，毒素，負に荷電したポリマーおよび他のポリマー，例えば，蛋白質，ペプチド，ホルモン，炭水化物，またはポリアミンを，細胞膜を越えてデリバリーするための新規な薬剤の設計および合成を包含する。本発明の化合物および方法を用いて細胞膜を越えてデリバリーすることができるポリヌクレオチドの非限定的例としては，短干渉核酸（ｓｉＮＡ）（ｓｉＲＮＡを含む），アンチセンスオリゴヌクレオチド，酵素的核酸分子，２’，５’−オリゴアデニレート，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，アプタマー，およびデコイが挙げられる。一般に，記載されるトランスポーターは，別々にまたは多成分系の一部として，分解性リンカーとともにまたはなしで用いるよう設計される。本発明の化合物（一般に下記の式で示される）は，組成物として処方したときに，血清の存在下または非存在下で，異なる組織に由来する多数の種類の細胞の中への分子のデリバリーを改良すると予測される。
本発明の化合物，組成物，および方法は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ，ｓｉＲＮＡ，核酸，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ペプチド，ポリペプチド，蛋白質，ホルモン，抗体，および小分子）を細胞に，または，例えば，皮膚，粘膜，血管組織，胃腸組織，血液脳関門組織，眼組織，肺組織，肝臓組織，心臓組織，腎臓組織等の上皮および内皮組織を越えてデリバリーするのに有用である。本発明の化合物，組成物，および方法は，投与の特定の部位へのデリバリーまたは全身デリバリーの両方に用いることができる。
本発明の化合物，組成物，および方法は，本発明の化合物，組成物，および方法なしで分子をデリバリーする場合と比較して，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ，ｓｉＲＮＡ，核酸，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ペプチド，ポリペプチド，蛋白質，ホルモン，抗体，および小分子）の細胞または組織へのデリバリーまたは利用性を高めることができる。そのように，本発明の化合物および組成物の存在下では，本発明の化合物および組成物がない場合と比較して，細胞，組織，または生物の内部における生物学的に活性な分子のレベルを高めることができる。
１つの観点においては，本発明は，新規なカチオン性脂質，トランスフェクション剤，マイクロ粒子，ナノ粒子，およびこれらと生物学的に活性な分子との処方物を特徴とする。別の態様においては，本発明は，被験者または生物において遺伝子発現および／または活性の調節に応答する形質，疾病，および状態の研究，診断，および治療において用いるための組成物および方法を特徴とする。別の態様においては，本発明は，小核酸分子，例えば，短干渉核酸（ｓｉＮＡ），短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を，例えば，被験者または生物における関連する細胞および／または組織に効率的にトランスフェクションまたはデリバリーする新規なカチオン性脂質，マイクロ粒子，ナノ粒子トランスフェクション剤，および処方物を特徴とする。このような新規なカチオン性脂質，マイクロ粒子，ナノ粒子，トランスフェクション剤，および処方物は，本明細書に記載されるように，細胞，被験者または生物において疾病，状態または形質を予防，阻害または治療する組成物を提供するのに有用である。
１つの観点においては，本発明は，種々のカチオン性脂質，マイクロ粒子，ナノ粒子，トランスフェクション剤，および，例えば，被験者または生物における細胞，組織において，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的遺伝子の発現または活性を調節する化学的に修飾された合成短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子をデリバリーするための処方物を特徴とする。化学的に修飾されたｓｉＮＡの使用は，インビボでのヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加，細胞取り込みの改良，およびインビボでの薬物動態学的特性の改良により，天然のｓｉＲＮＡ分子の種々の特性を改良する。本発明のカチオン性脂質，マイクロ粒子，ナノ粒子，トランスフェクション剤，処方物，およびｓｉＮＡ分子は，種々の治療，獣医学，診断，標的評価，遺伝的発見，遺伝子工学，およびファーマコゲノミクス用途に有用な試薬および方法を提供する。
１つの観点においては，本発明は，独立してまたは組み合わせて，蛋白質，例えば，疾病，形質，または状態，例えば，肝臓の疾病，形質，または状態の維持および／または発達に関連する蛋白質をコードする標的遺伝子の発現を調節する組成物および方法を特徴とする。これらの遺伝子は本明細書において一般に標的遺伝子と称される。このような標的遺伝子は，当該技術分野において一般に知られており，このような遺伝子の転写産物は一般にＧｅｎｂａｎｋ受託番号により参照される（例えば，国際公開ＷＯ０３／７４６５４，出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８，および米国特許出願１０／９２３，５３６（いずれも本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。例示的標的遺伝子および標的遺伝子転写産物を参照して，本発明の種々の観点および態様について以下に説明する。しかし，種々の観点および態様はまた，他の標的遺伝子，例えば，ある種の標的遺伝子と関連する遺伝子ホモログ，遺伝子転写産物変種，および遺伝子多型（例えば，一塩基多型，（ＳＮＰｓ））にも向けられている。そのように，種々の観点および態様はまた，例えば，疾病，形質，または状態の維持および／または発達に関与するシグナル伝達または遺伝子発現の経路に関与する他の遺伝子にも向けられている。これらの追加の遺伝子は，本明細書において標的遺伝子について記載される方法を用いて標的部位について分析することができる。すなわち，他の遺伝子の調節および他の遺伝子のそのような調節の効果は，本明細書に記載されるようにして，実施し，判定し，測定することができる。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３はＣ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４はコレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（例えば，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２はメチルであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールであり，このような化合物は，本明細書において一般にＣＬｉｎＤＭＡまたは３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパンと称される。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＩＩ：
［式中，
各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカー，でありおよびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４はコレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル）またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２はメチルであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＩＩＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４はコレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。１つの態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，各Ｒ１およびＲ２はメチルであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＩＶ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４はコレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，各Ｒ１およびＲ２はメチルであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＶ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；および各Ｒ３およびＲ４は，独立して，Ｃ１２−Ｃ２４の脂肪族炭化水素であり，これは同じであっても異なっていてもよい］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２はメチルであり，およびＲ３およびＲ４はオレイルであり，この化合物は本明細書において一般にＤＭＯＢＡまたはＮ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンと称される。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＶＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４は，コレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２はメチルであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＶＩＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４はコレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２はメチルであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＶＩＩＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；および各Ｒ３およびＲ４は，独立して，Ｃ１２−Ｃ２４の脂肪族炭化水素であり，これは同じであっても異なっていてもよい］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，各Ｒ１およびＲ２はメチルであり，およびＲ３およびＲ４はリノイルである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＩＸ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４はコレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４はコレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバメートカルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，各Ｒ１およびＲ２はメチルであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４はコレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，各Ｒ１およびＲ２はメチルであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４は，コレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，各Ｒ１およびＲ２はメチルであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＩＩａまたはＣＬＸＩＩｂ：
［式中，Ｒ０および各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４は，コレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，各Ｒ１およびＲ２はメチルであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＩＩＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４は，コレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，各Ｒ１およびＲ２はメチルであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＩＶａおよびＣＬＸＩＶｂ：
［式中，Ｒ０および各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４は，コレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，各Ｒ１およびＲ２はメチルであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＶ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｌはリンカーであり，および各Ｒ３は，独立して，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，コレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，各Ｒ１およびＲ２はメチルであり，Ｒ３はコレステロールであり，およびＬはブチルである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＶＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；各Ｌは，リンカーであり，その構造は他のＬとは独立しており，および各Ｒ３は，独立して，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，コレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，各Ｒ１およびＲ２はメチルであり，Ｒ３はコレステロールであり，およびＬはブチルである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＶＩＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり，およびＲ３はＣ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，各Ｒ１およびＲ２はメチルであり，およびＲ３はリノイルである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＶＩＩＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，各Ｒ１およびＲ２はメチルであり，およびＲ３はリノイルである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＩＸ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，これは同じであっても異なっていてもよい］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ３またはＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＸ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，これは同じであっても異なっていてもよい］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ３またはＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＸＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，これは同じであっても異なっていてもよい］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ３またはＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＸＩＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，これは同じであっても異なっていてもよい］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ３またはＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＸＩＩＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，およびＬはリンカーである］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ３またはＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＸＩＶ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，およびＬはリンカーである］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ３またはＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＸＶ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，およびＬはリンカーである］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ３またはＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＸＶＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，これは同じであっても異なっていてもよい］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ３またはＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＸＶＩＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，およびＬはリンカーである］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ３またはＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＸＶＩＩＩ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，これは同じであっても異なっていてもよい］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ３またはＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である。
１つの態様においては，本発明は，式ＣＬＸＸＩＸ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，これは同じであっても異なっていてもよい］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ３またはＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である。
１つの態様においては，本発明は，式ＮＬＩ：
［式中，Ｒ１は，Ｈ，ＯＨ，またはＣ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素またはアルコールであり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１は，ＯＨ，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルまたはその対応するアルコールである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４はコレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（例えば，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，Ｒ１はＯＨであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＮＬＩＩ：
［式中，Ｒ１は，Ｈ，ＯＨ，またはＣ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素またはアルコールであり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１は，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルまたはその対応するアルコールである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４はコレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル）またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，Ｒ１はＯＨであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＮＬＩＩＩ：
［式中，Ｒ１は，Ｈ，ＯＨ，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素またはアルコールであり；および各Ｒ３およびＲ４は，独立して，Ｃ１２−Ｃ２４の脂肪族炭化水素であり，これは同じであっても異なっていてもよい］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１は，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルまたはその対応するアルコールである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ１はＯＨであり，およびＲ３およびＲ４はオレイルであり，この化合物は本明細書において一般にＤＯＢＡまたはジオレイルオキシベンジルアルコールと称される。
１つの態様においては，本発明は，式ＮＬＩＶ：
［式中，Ｒ１は，Ｈ，ＯＨ，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素またはアルコールであり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１は，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルまたはその対応するアルコールである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４は，コレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，Ｒ１はＯＨであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＮＬＶ：
［式中，Ｒ１は，Ｈ，ＯＨ，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素またはアルコールであり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌはリンカーであり，およびＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１は，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルまたはその対応するアルコールである。１つの態様においては，Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ４は，コレステロールである。１つの態様においては，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，Ｌは，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。１つの態様においては，Ｒ１はＯＨであり，Ｒ３はリノイルであり，Ｌはブチルであり，およびＲ４はコレステロールである。
１つの態様においては，本発明は，式ＮＬＶＩ：
［式中，Ｒ１は，Ｈ，ＯＨ，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素またはアルコールであり；Ｒ３は，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，および各Ｌはリンカーである］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１は，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルまたはその対応するアルコールである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ３またはＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である。１つの態様においては，各Ｌは，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，またはポリエチレングリコールリンカーである。別の態様においては，各Ｌは，独立して，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルリンカーである。
１つの態様においては，本発明は，式ＮＬＶＩＩ：
［式中，Ｒ１は，独立して，Ｈ，ＯＨ，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素またはアルコールであり；Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，Ｃ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，これは同じであっても異なっていてもよい］
を有する化合物を特徴とする。１つの態様においては，Ｒ１は，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，またはブチルまたはその対応するアルコールである。１つの態様においては，Ｒ３およびＲ４は，それぞれ独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである。１つの態様においては，Ｒ３またはＲ４は，コレステロール，コレステロール誘導体，ステロイドホルモン，または胆汁酸である。
１つの態様においては，式ＣＬＩ−ＣＬＸＩＶ，ＣＬＸＶＩＩ−ＣＬＸＸＩＩ，ＣＬＸＸＶＩ，およびＣＬＸＸＶＩＩＩ−ＣＬＸＸＩＸを有するいずれかの化合物の各Ｏ−Ｒ３および／またはＯ−Ｒ４は，さらにリンカーＬを含み（例えば，上で示される−Ｏ−Ｒ３および／または−Ｏ−Ｒ４は−Ｏ−Ｌ−Ｒ３および／または−Ｏ−Ｌ−Ｒ４である），ここで，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，ポリエチレングリコール，アセタール，アミド，スクシニル，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），または当該技術分野において一般に知られる他のリンカーである。
１つの態様においては，本発明の処方物（例えば，本発明の処方分子組成物（ＦＭＣ）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））は，式ＮＬＩ−ＮＬＶＩＩのいずれかを有する中性脂質である。
ステロイドホルモンの例としては，コレステロールを含むもの，エストロゲン，テストステロン，プロゲステロン，グルココルチゾン，アドレナリン，インスリン，グルカゴン，コルチゾル，ビタミンＤ，甲状腺ホルモン，レチノイン酸，および／または成長ホルモンが挙げられる。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，他の核酸分子または本明細書に記載される他の生物学的に活性な分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびポリエチレングリコールコンジュゲート，例えば，ＰＥＧ−ジアシルグリセロール，ＰＥＧ−ジアシルグリカミド，ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートを含む組成物を特徴とする。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。本明細書に記載される組成物は，一般に処方分子組成物（ＦＭＣ）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と称される。本発明のある態様においては，処方分子組成物（ＦＭＣ）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
適当なカチオン性脂質には，選択されたｐＨ，例えば生理学的ｐＨにおいて正味の負電荷を含むカチオン性脂質が含まれる。特に有用なカチオン性脂質としては，比較的小さいヘッドグループ，例えば，三級アミン，四級アミンまたはグアニジンヘッドグループ，および立体的に障害される非対称脂質鎖を有するものが挙げられる。本明細書に記載されるいずれの態様においても，カチオン性脂質は，式ＣＬＩ，ＣＬＩＩ，ＣＬＩＩＩ，ＣＬＩＶ，ＣＬＶ，ＣＬＶＩ，ＣＬＶＩＩ，ＣＬＶＩＩＩ，ＣＬＩＸ，ＣＬＸ，ＣＬＸＩ，ＣＬＸＩＩ，ＣＬＸＩＩＩ，ＣＬＸＩＶ，ＣＬＸＶ，ＣＬＸＶＩ，ＣＬＸＶＩ，ＣＬＸＶＩＩ，ＣＬＸＶＩＩＩ，ＣＬＸＩＸ，ＣＬＸＸ，ＣＬＸＸＩ，ＣＬＸＸＩＩ，ＣＬＸＸＩＩＩ，ＣＬＸＸＩＶ，ＣＬＸＸＶ，ＣＬＸＸＶＩ，ＣＬＸＸＶＩＩ，ＣＬＸＸＶＩＩＩ，ＣＬＸＸＩＸを含むもの；塩化Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＣ），臭化Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ），塩化Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ），塩化Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ），Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ），１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ），１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＣＤＡＰ），１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ），ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−スペルミンカルボキサミド）エチル｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ），ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ），ＤＣ−Ｃｈｏｌ，臭化１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ），３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ），２−［５’−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９’，１２’−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ），Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ），１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ），および／またはこれらの混合物，ならびに同様の特性を有する他のカチオン性脂質から選択される。上述のカチオン性脂質は，当該技術分野において知られるように，種々の異なる塩を含むことができる。これらのカチオン性脂質構造の非限定的例は図１−５および図１９に示される。
ある態様においては，カチオン性脂質のヘッドグループは，切断可能なまたは切断可能でないリンカー，例えば，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られる他のリンカーを介して，脂質鎖に結合させることができる。適当なリンカーの非限定的例としては，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，ポリエチレングリコール，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル（すなわち，モノエステル，ジエステル），またはスクシニルを含むものが挙げられる。
適当な中性脂質としては，安定な複合体を生成しうる種々の中性の荷電していない，両性イオン性またはアニオン性脂質の任意のものが挙げられる。これらは好ましくは中性であるが，あるいは，正または負に荷電していてもよい。本明細書に記載されるいずれの態様においても，適当な中性脂質としては，式ＮＬＩ−ＮＬＶＩＩを有する化合物，ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ），パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ），卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ），ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ），ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ），ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ），ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ），ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ），−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）およびジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ），コレステロール，ならびに以下に記載される他の中性脂質，および／またはこれらの混合物から選択されるものが挙げられる。
適当なポリエチレングリコール−ジアシルグリセロールまたはポリエチレングリコール−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）コンジュゲートとしては，独立して，Ｃ４−約Ｃ４０の長さの，飽和または不飽和の炭素原子を含むアルキル鎖を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものが挙げられる。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は，さらに１またはそれ以上の置換アルキル基を含むことができる。本明細書に記載されるいずれの態様においても，ＰＥＧコンジュゲートはＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６），ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８），ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６），およびＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８），ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール），およびＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）から選択することができる。
１つの態様においては，本発明は，Ｌ０５１，Ｌ０５３，Ｌ０５４，Ｌ０６０，Ｌ０６１，Ｌ０６９，Ｌ０７３，Ｌ０７７，Ｌ０８０，Ｌ０８２，Ｌ０８３，Ｌ０８６，Ｌ０９７，Ｌ０９８，Ｌ０９９，Ｌ１００，Ｌ１０１，Ｌ１０２，Ｌ１０３，および／またはＬ１０４として製剤された生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子）を含む組成物を特徴とする（表ＩＶを参照）。
別の適当なＰＥＧコンジュゲートとしては，ＰＥＧ−コレステロールまたはＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲート（例えば図２４を参照）が挙げられる。１つの態様においては，ＰＥＧコンジュゲートは，飽和または不飽和脂質鎖，例えば，オレイル，リノレイルおよび同様の脂質鎖に結合したＰＥＧを含む。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子），ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−ＤＡＧ（すなわち，ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロールまたはポリエチレングリコール−ジアシルグリカミド），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートを含む組成物を特徴とする。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。別の態様においては，組成物は，本明細書に記載されるＬ０５１，Ｌ０５３，Ｌ０５４，Ｌ０６０，Ｌ０６１，Ｌ０６９，Ｌ０７３，Ｌ０７７，Ｌ０８０，Ｌ０８２，Ｌ０８３，Ｌ０８６，Ｌ０９７，Ｌ０９８，Ｌ０９９，Ｌ１００，Ｌ１０１，Ｌ１０２，Ｌ１０３，および／またはＬ１０４として製剤される（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子），３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）を含むカチオン性脂質，ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含む中性脂質，ＰＥＧ−ｎ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含むＰＥＧ−ＤＡＧ，およびコレステロールを含む組成物を特徴とする。１つの態様においては，ｏｆＣＬｉｎＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比は，それぞれ４８：４０：１０：２であり，この組成物は本明細書において一般に処方物Ｌ０５１と称される。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子），Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）を含むカチオン性脂質，ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含む中性脂質，ＰＥＧ−ｎ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含むＰＥＧ−ＤＡＧ，およびコレステロールを含む組成物を特徴とする。１つの態様においては，ＤＭＯＢＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比はそれぞれ３０：２０：４８：２であり，この組成物は，本明細書において一般に処方物Ｌ０５３と称される。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子），Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）を含むカチオン性脂質，ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含む中性脂質，ＰＥＧ−ｎ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含むＰＥＧ−ＤＡＧ，およびコレステロールを含む組成物を特徴とする。１つの態様においては，ＤＭＯＢＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比はぞれぞれ５０：２０：２８：２であり，この組成物は，本明細書において一般に処方物Ｌ０５４と称される。別の態様においては，組成物はさらに中性脂質，例えば，ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ），パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ），卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ），ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ），コレステロール，および／またはこれらの混合物を含む。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子），３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）を含むカチオン性脂質，Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）を含むカチオン性脂質，ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含む中性脂質，ＰＥＧ−ｎ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含むＰＥＧ−ＤＡＧ，およびコレステロールを含む組成物を特徴とする。１つの態様においては，ＣＬｉｎＤＭＡ：ＤＭＯＢＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比はそれぞれ２５：２５：２０：２８：２であり，この組成物は，本明細書において一般に処方物Ｌ０７３と称される。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子），３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）を含むカチオン性脂質，ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含む中性脂質，ＰＥＧ−コレステロール（ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ）を含むＰＥＧ，およびコレステロールを含む組成物を特徴とする。１つの態様においては，ＣＬｉｎＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−Ｃｈｏｌのモル比はそれぞれ４８：４０：１０：２であり，この組成物は，本明細書において一般に処方物Ｌ０６９と称される。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子），１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）を含むカチオン性脂質，ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含む中性脂質，ＰＥＧ−ｎ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含むＰＥＧ−ＤＡＧ，およびコレステロールを含む組成物を特徴とする。１つの態様においては，ＤＯｃａｒｂＤＡＰ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比はそれぞれ３０：２０：４８：２であり，この組成物は，本明細書において一般に処方物Ｔ０１８．１と称される。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子），Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）を含むカチオン性脂質，ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含む中性脂質，ＰＥＧ−ｎ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含むＰＥＧ−ＤＡＧ，およびコレステロールを含む組成物を特徴とする。１つの態様においては，ＤＯＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比は，それぞれ３０：２０：４８：２であり，この組成物は，本明細書において一般に処方物Ｔ０１９．１と称される。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子），および式ＣＬＩ，ＣＬＩＩ，ＣＬＩＩＩ，ＣＬＩＶ，ＣＬＶ，ＣＬＶＩ，ＣＬＶＩＩ，ＣＬＶＩＩＩ，ＣＬＩＸ，ＣＬＸ，ＣＬＸＩ，ＣＬＸＩＩ，ＣＬＸＩＩＩ，ＣＬＸＩＶ，ＣＬＸＶ，ＣＬＸＶＩ，ＣＬＸＶＩＩ，ＣＬＸＶＩＩＩ，ＣＬＸＩＸ，ＣＬＸＸ，ＣＬＸＸＩ，ＣＬＸＸＩＩ，ＣＬＸＸＩＩＩ，ＣＬＸＸＩＶ，ＣＬＸＸＶ，ＣＬＸＸＶＩ，ＣＬＸＸＶＩＩ，ＣＬＸＸＶＩＩＩ，ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有する化合物を含むカチオン性脂質を含む組成物を特徴とする。別の態様においては，組成物はさらに中性脂質，例えば，ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ），パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ），卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ），ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ），コレステロール，および／またはこれらの混合物を含む。別の態様においては，組成物はさらにＰＥＧコンジュゲートを含む。さらに別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子），および３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）を含むカチオン性脂質を含む組成物を特徴とする。別の態様においては，組成物はさらに中性脂質，例えば，ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ），パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ），卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ），ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ），コレステロール，および／またはこれらの混合物を含む。別の態様においては，組成物はさらに，ＰＥＧコンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢ）を含む。さらに別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子），およびＮ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）を含むカチオン性脂質を含む組成物を特徴とする。別の態様においては，組成物はさらに，中性脂質，例えば，ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ），パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ），卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ），ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ），コレステロール，および／またはこれらの混合物を含む。さらに別の態様においては，組成物はさらにカチオン性脂質ＣＬｉｎＤＭＡを含む。別の態様においては，組成物はさらにＰＥＧコンジュゲートを含む。さらに別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
本明細書において用いる場合，"生物学的に活性な分子"との用語は，ある系において生物学的応答を引き出すかまたは調節しうる化合物または分子を表す。生物学的に活性な分子の非限定的例としては，抗体（例えば，モノクローナル，キメラ，ヒト化等），コレステロール，ホルモン，抗ウイルス，ペプチド，蛋白質，化学療法剤，小分子，ビタミン，補因子，ヌクレオシド，ヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アンチセンス核酸，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，２，５−Ａキメラ，ｓｉＮＡ，ｄｓＲＮＡ，アロザイム，アプタマー，デコイおよびこれらの類似体が挙げられる。本発明の生物学的に活性な分子にはまた，他の生物学的に活性な分子，例えば，脂質およびポリマー，例えば，ポリアミン，ポリアミド，ポリエチレングリコールおよび他のポリエーテルの薬物動態学的および／または薬力学を調節しうる分子も含まれる。ある態様においては，生物学的に活性な分子との用語は，本明細書において"分子"または"目的とする分子"と互換的に用いられる。
１つの態様においては，本発明は，ｓｉＮＡ分子，式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質，中性脂質，およびポリエチレングリコール−ジアシルグリセロールまたはポリエチレングリコール−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）コンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢ）を含む組成物を特徴とする。これらの組成物は，本明細書において一般に，処方ｓｉＮＡ組成物と称される。別の態様においては，本発明の処方ｓｉＮＡ組成物はさらに，コレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明の処方ｓｉＮＡ組成物のｓｉＮＡ成分は，哺乳動物細胞，被験者，または生物においてインターフェロン応答を刺激しないように化学的に修飾されている。そのようなｓｉＮＡ分子は，改良された毒性プロファイルを有するといわれ，例えば，免疫刺激特性がないかまたは弱められているか，オフ標的効果がないかまたは弱められているか，または本明細書に記載される他の効果を有する。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）コンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢ）；および（ｄ）標的遺伝子のＲＮＡに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む組成物を特徴とし，ここで，前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は，約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり；前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，標的遺伝子ＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子が標的遺伝子ＲＮＡに対するＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，標的ＲＮＡは，国際公開ＷＯ０３／７４６５４（ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８）および米国特許出願１０／９２３，５３６（いずれも本明細書の一部としてここに引用する）においてＧｅｎｂａｎｋ受託番号で参照されるＲＮＡ配列を含む。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）コンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢ）；および（ｄ）肝炎ウイルスＲＮＡに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む組成物を特徴とし，ここで，前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり；および前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，肝炎ウイルスＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子が肝炎ウイルスＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，肝炎ウイルスＲＮＡはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である。１つの態様においては，肝炎ウイルスＲＮＡはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である。１つの態様においては，ｓｉＮＡは米国特許出願６０／４０１１０４，１０／６６７，２７１，および１０／９４２，５６０（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される配列を含む。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢ）；および（ｄ）蛋白質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）ＲＮＡに対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む組成物を特徴とし，ここで，前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり；前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，ＰＴＰ１Ｂ ＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がＰＴＰ１Ｂ ＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，ｓｉＮＡは，米国特許公開２００４００１９００１および２００５００７０４９７８（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される配列を含む。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢ）；および（ｄ）トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）および／またはトランスフォーミング成長因子ベータレセプター（ＴＧＦ−ｂｅｔａＲ）ＲＮＡに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む組成物を特徴とし，ここで，前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり；前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，ＴＧＦ−ベータおよび／またはＴＧＦ−ｂｅｔａＲ ＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がＴＧＦ−ベータおよび／またはＴＧＦ−ｂｅｔａＲ ＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，ｓｉＮＡは，米国特許出願１１／０５４，０４７（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される配列を含む。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢ）；および（ｄ）コレステリルエステル転移蛋白質（ＣＥＴＰ）ＲＮＡに対して，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む組成物を特徴とし，ここで，前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり；前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，ＣＥＴＰ ＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がＣＥＴＰ ＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，ｓｉＮＡは，米国特許出願１０／９２１，５５４（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される配列を含む。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢ）；および（ｄ）胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）ＲＮＡに対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む組成物を特徴とし，ここで，前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり；前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，ＧＩＰ ＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がＧＩＰ ＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，ｓｉＮＡは，米国特許出願１０／９１６，０３０（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される配列を含む。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢ）；および（ｄ）ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）ＲＮＡに対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む組成物を特徴とし，ここで，前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり；前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，ＳＣＤ ＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がＳＣＤ ＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，ｓｉＮＡは，米国特許出願１０／９２３，４５１（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される配列を含む。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロールコンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，ｏｒＰＥＧ−ＤＭＢ）；および（ｄ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＡＣＢ）ＲＮＡに対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む組成物を特徴とし，ここで，前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり；前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，ＡＣＡＣＢ ＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がＡＣＡＣＢ ＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，ｓｉＮＡは，米国特許出願１０／８８８，２２６（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される配列を含む。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢ）；および（ｄ）アポリポ蛋白質ＲＮＡ（例えば，ａｐｏＡＩ，ａｐｏＡ−ＩＶ，ａｐｏＢ，ａｐｏＣ−ＩＩＩ，および／またはａｐｏＥ ＲＮＡ）に対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む組成物を特徴とし，ここで，前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり；前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，アポリポ蛋白質ＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がアポリポ蛋白質ＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，ｓｉＮＡは，米国特許出願１１／０５４，０４７（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される配列を含む。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢ）；および（ｄ）ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦ−レセプターＲＮＡ（例えば，ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦＲ１，ＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３ ＲＮＡ）に対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む組成物を特徴とし，ここで，前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり；前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦ−レセプターＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦ−レセプターＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，ｓｉＮＡは，米国特許出願１０／９６２，８９８（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される配列を含む。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ＿ＤＭＢ）；および（ｄ）ＩＬ４−レセプターＲＮＡに対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む組成物を特徴とし，ここで，前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり；前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，ＩＬ４−レセプターＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がＩＬ４−レセプターＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，ｓｉＮＡは，米国特許出願１１／００１，３４７（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される配列を含む。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ＿ＤＭＢ）；および（ｄ）ヘアレスＲＮＡに対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む組成物を特徴とし，ここで，前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり；前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，ヘアレスＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がヘアレスＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，ｓｉＮＡは，米国特許出願１０／９１９，９６４（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される配列を含む。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明は，（ａ）式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ＿ＤＭＢ）；および（ｄ）標的ＲＮＡに対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む組成物を特徴とし，ここで，前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり；前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，標的ＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子が標的ＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，標的ＲＮＡは，国際公開ＷＯ０３／７４６５４（ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８）および米国特許出願１０／９２３，５３６（これらの両方とも本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるＧｅｎｂａｎｋ受託番号で参照されるＲＮＡ配列を含む。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明の組成物のカチオン性脂質成分（例えば，式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有する化合物または本明細書に記載される他のもの）は，処方物中に存在する総脂質の約２％−約６０％，約５％−約４５％，約５％−約１５％，または約４０％−約５０％を含む。
１つの態様においては，本発明の組成物の中性脂質成分は，処方物中に存在する総脂質の約５％−約９０％，または約２０％−約８５％を含む。
１つの態様においては，本発明の組成物のＰＥＧコンジュゲート（すなわち，ＰＥＧ＿ＤＡＧ，ＰＥＧ−コレステロール，ＰＥＧ−ＤＭＢ）は，処方物に存在する総脂質の約１％−約２０％，または約４％−約１５％を含む。
１つの態様においては，本発明の組成物のコレステロール成分は，処方物中に存在する総脂質の約１０％−約６０％，または約２０％−約４５％を含む。
１つの態様においては，本発明の処方ｓｉＮＡ組成物は，処方物中に存在する総脂質の約３０−約５０％を含むカチオン性脂質成分，処方物中に存在する総脂質の約３０−約５０％の中性脂質，および処方物中に存在する総脂質の約０−約１０％を含むＰＥＧコンジュゲート（すなわち，ＰＥＧ＿ＤＡＧ，ＰＥＧ−コレステロール，ＰＥＧ−ＤＭＢ）を含む。
１つの態様においては，本発明の処方分子組成物は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子），式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有する化合物，ＤＳＰＣ，およびＰＥＧコンジュゲート（すなわち，ＰＥＧ−ＤＡＧ，ＰＥＧ−コレステロール，ＰＥＧ−ＤＭＢ）を含む。１つの態様においては，ＰＥＧコンジュゲートは，ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６），またはＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）である。別の態様においては，ＰＥＧコンジュゲートは，ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６），またはＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）である。別の態様においては，ＰＥＧコンジュゲートは，ＰＥＧ−コレステロールまたはＰＥＧ−ＤＭＢである。別の態様においては，処方分子組成物はさらに，コレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明の処方分子組成物は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子），式ＣＬＩを有する化合物，ＤＳＰＣ，およびＰＥＧコンジュゲートを含む。１つの態様においては，ＰＥＧコンジュゲートは，ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６），またはＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）である。別の態様においては，ＰＥＧコンジュゲートは，ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６），またはＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）である。別の態様においては，ＰＥＧコンジュゲートはＰＥＧ−コレステロールまたはＰＥＧ−ＤＭＢである。別の態様においては，処方分子組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明の処方分子組成物は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子），式ＣＬＶを有する化合物，ＤＳＰＣ，およびＰＥＧコンジュゲートを含む。１つの態様においては，ＰＥＧコンジュゲートは，ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６），またはＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）である。別の態様においては，ＰＥＧコンジュゲートは，ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６），またはＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）である。別の態様においては，ＰＥＧコンジュゲートはＰＥＧ−コレステロールまたはＰＥＧ−ＤＭＢである。別の態様においては，処方分子組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
１つの態様においては，本発明の組成物（例えば，処方分子組成物）はさらに，組織タイプの特定の細胞に対するターゲティングリガンドを含む。そのようなリガンドの非限定的例としては，糖および炭水化物，例えば，ガラクトース，ガラクトサミン，およびＮ−アセチルガラクトサミン；ホルモン，例えばエストロゲン，テストステロン，プロゲステロン，グルココルチゾン，アドレナリン，インスリン，グルカゴン，コルチゾル，ビタミンＤ，甲状腺ホルモン，レチノイン酸，および成長ホルモン；成長因子，例えば，ＶＥＧＦ，ＥＧＦ，ＮＧＦ，およびＰＤＧＦ；コレステロール；胆汁酸；神経伝達物質，例えば，ＧＡＢＡ，グルタメート，アセチルコリン；ＮＯＧＯ；イノシトール三リン酸；ジアシルグリセロール；エピネフリン；ノルエピネフリン；一酸化窒素，ペプチド，ビタミン，例えば葉酸およびピリドキシン，薬剤，抗体およびインビボまたはインビトロでレセプターと相互作用することができる他の任意の分子が挙げられる。リガンドは，リンカー分子，例えば，アミド，アミド，カルボニル，エステル，ペプチド，ジスルフィド，シラン，ヌクレオシド，無塩基ヌクレオシド，ポリエーテル，ポリアミン，ポリアミド，ペプチド，炭水化物，脂質，ポリ炭化水素，ホスフェートエステル，ホスホルアミデート，チオホスフェート，アルキルホスフェート，または光解離性リンカーを用いて，本発明の処方ｓｉＮＡ組成物の任意の成分（例えば，カチオン性脂質成分，中性脂質成分，ＰＥＧ−ＤＡＧ成分，またはｓｉＮＡ成分等）に結合させることができる。１つの態様においては，リンカーは生物分解性リンカーである。
１つの態様においては，本発明のＰＥＧコンジュゲート，例えば，ＰＥＧ−ＤＡＧ，ＰＥＧ−コレステロール，ＰＥＧ−ＤＭＢは，２００−１０，０００原子のＰＥＧ分子を含む。
１つの態様においては，本発明の組成物，例えば処方分子組成物は，ジアシルグリセロール−ポリエチレングリコールコンジュゲート，すなわち，ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートを含む。"ジアシルグリセロール"との用語は，２つの脂肪酸アシル鎖，すなわちＲ１およびＲ２を有し，この両方とも，独立して，グリセロールの１位および２位にエステル結合により結合した２−３０個の炭素を有する化合物を表す。アシル基は飽和していてもよく，または種々の程度の不飽和を有していてもよい。ジアシルグリセロールは以下の一般式ＶＩＩＩ：
［式中，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，脂質，またはリガンドである］
を有する。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，Ｃ２−Ｃ３０のアルキル基である。１つの態様においては，ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートはジラウリルグリセロール（Ｃ１２）−ＰＥＧコンジュゲート，ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）−ＰＥＧコンジュゲート，ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）−ＰＥＧコンジュゲート，ジステリルグリセロール（Ｃ１８）−ＰＥＧコンジュゲート，ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６），またはＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）である。当業者は，本発明のＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートにおいて他のジアシルグリセロールを用いることができることを容易に理解するであろう。
１つの態様においては，本発明の組成物，例えば処方分子組成物は，ポリエチレングリコール−コレステロールコンジュゲート，すなわちＰＥＧ−ｃｈｏｌコンジュゲートを含む。ＰＥＧ−ｃｈｏｌコンジュゲートは，コレステロールまたはコレステロール誘導体に連結された２００−１０，０００原子のＰＥＧ分子を含むことができる。例示的ＰＥＧ−ｃｈｏｌおよびその合成は図２４に示される。
１つの態様においては，本発明の組成物，例えば処方分子組成物は，ポリエチレングリコール−ＤＭＢコンジュゲートを含む。"ＤＭＢ"との用語は，化合物３，４−ジテトラデコキシルベンジル−β−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテルを表す。ＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートは，ＤＭＢに連結された２００−１０，０００原子のＰＥＧ分子を含むことができる。例示的ＰＥＧ−ＤＭＢおよびその合成は図２４に示される。
"リガンド"との用語は，レセプター等の別の化合物と直接的にまたは間接的に相互作用することができる任意の化合物または分子，例えば，薬剤，ペプチド，ホルモン，または神経伝達物質を表す。リガンドと相互作用するレセプターは，細胞の表面に存在していてもよく，あるいは細胞間レセプターであってもよい。リガンドとレセプターとの相互作用により，生化学的反応が生ずることもあり，またはこれは単に物理学的相互作用または会合でありうる。リガンドの非限定的例としては，糖および炭水化物，例えば，ガラクトース，ガラクトサミン，およびＮ−アセチルガラクトサミン；ホルモン，例えば，エストロゲン，テストステロン，プロゲステロン，グルココルチゾン，アドレナリン，インスリン，グルカゴン，コルチゾル，ビタミンＤ，甲状腺ホルモン，レチノイン酸，および成長ホルモン；成長因子，例えば，ＶＥＧＦ，ＥＧＦ，ＮＧＦ，およびＰＤＧＦ；コレステロール；胆汁酸；神経伝達物質，例えば，ＧＡＢＡ，グルタメート，アセチルコリン；ＮＯＧＯ；イノシトール三リン酸；ジアシルグリセロール；エピネフリン；ノルエピネフリン；一酸化窒素，ペプチド，ビタミン，例えば葉酸およびピリドキシン，薬剤，抗体およびインビボまたはインビトロでレセプターと相互作用することができる他の任意の分子が挙げられる。リガンドは，リンカー分子，例えば，アミド，アミド，カルボニル，エステル，ペプチド，ジスルフィド，シラン，ヌクレオシド，無塩基ヌクレオシド，ポリエーテル，ポリアミン，ポリアミド，ペプチド，炭水化物，脂質，ポリ炭化水素，ホスフェートエステル，ホスホルアミデート，チオホスフェート，アルキルホスフェート，または光解離性リンカーを用いて，本発明の化合物に結合させることができる。１つの態様においては，リンカーは生物分解性リンカーである。
本明細書において用いる場合，"分解性リンカー"との用語は，種々の条件下で切断されることができるリンカー成分を表す。切断に適した条件としては，例えば，限定されないが，ｐＨ，ＵＶ照射，酵素活性，温度，加水分解，脱離，および置換反応，および結合の熱力学的特性が挙げられる。
本明細書において用いる場合，"光解離性リンカー"との用語は，特定のＵＶ波長で選択的に切断されるリンカー成分として当該技術分野において知られるものを表す。光解離性リンカーを含む本発明の化合物は，化合物を目的とする標的細胞または組織にデリバリーし，続いてＵＶ光源の存在下で放出させるために用いることができる。
本明細書において用いる場合，"脂質"との用語は，任意の親油性化合物を表す。脂質化合物の非限定的例としては，脂肪酸およびその誘導体，例えば，直鎖，分枝鎖，飽和および不飽和の脂肪酸，カロチノイド，テルペン，胆汁酸，およびステロイド，例えばコレステロールおよびその誘導体または類似体が挙げられる。
上述の成分に加えて，本発明の組成物はさらに，脂質二重層中に挿入されて正の電荷を付与するよう設計されたカチオン性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質，またはＣＰＬを含むことができる（例えば，Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１１，４３３−４３７を参照）。本発明において用いるのに適した処方物，およびそのような処方物を製造し使用する方法は，例えば，米国特許出願０９／５５３，６３９（２０００年４月２０日出願），および国際出願ＣＡ００／００４５１（２０００年４月２０日出願，２０００年１０月２６日にＷＯ００／６２８１３として公開）（これらのそれぞれの教示は，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に開示されている。
１つの態様においては，本発明の組成物，すなわち，ＰＥＧコンジュゲートを含む処方分子組成物は，多数の異なる方法のいずれかを用いて製造される。１つの態様においては，本発明は，疎水性ポリヌクレオチド−脂質中間体複合体を介して製造される脂質−核酸粒子を提供する。複合体は，好ましくは電荷が中和されたものである。これらの複合体を界面活性剤系または有機溶媒系のシステム中で操作することにより，核酸が保護されている粒子を形成することができる。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子が脂質二重層中に封入されており，分解から保護されている（例えば，組成物はラメラ構造をとっている）血清安定処方分子組成物（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子等の生物学的に活性な分子を含むもの）を提供する。さらに，本発明において形成される処方された粒子は，好ましくは生理学的ｐＨにおいて中性または負に荷電している。１つの態様においては，インビボ用途用には中性粒子が有利であり得るが，インビトロ用途用には，粒子は負に荷電していることができる。このことにより，生物学的に活性な分子をカチオン性脂質中に封入することができる正に荷電したリポソーム処方物上での凝集が減少するというさらなる利点が得られる。
さらに，本発明は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物を提供する。ｐＨ依存的相転移により，ポリヌクレオチド等の生物学的に活性な分子を細胞等の生物学的システムにデリバリーする効率を高める構造的変化が生ずる。構造的変化は，例えば，細胞膜融合および生物学的に活性な分子の生物学的システムへの放出を増加させることにより，デリバリーの効率を高めることができる。すなわち，１つの態様においては，血清安定処方分子組成物は血漿または血清中で（すなわち，循環中で）安定であり，生理学的ｐＨ（すなわち，約ｐＨ７．４）で安定であり，急速なｐＨ依存的相転移を起こして，生物学的に活性な分子の生物学的システムへのデリバリーの効率を高める構造的変化を起こす。１つの態様においては，ｐＨ依存性相転移は約ｐＨ５．５−６．５で生ずる。１つの態様においては，血清安定処方分子組成物は構造的変化を起こして，約ｐＨ５．５−６．５で逆位六角形構造をとる。例えば，血清安定処方分子組成物は，循環中で（すなわち，血漿または血清中で），生理学的ｐＨ（約ｐＨ７．４）でとっている安定なラメラ構造から，初期エンドソームに見いだされるｐＨであるｐＨ５．５−６．５で，逆位六角形構造を有するより安定性が低くより有効なデリバリー組成物に転移することができる。急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物は，生理学的ｐＨにおける循環中での安定性および細胞膜融合を増加させるｐＨ依存性構造変化を生じ，生物学的に活性な分子を細胞等の生物学的システム中に放出する能力のため，生物学的に活性な分子デリバリーの効率の上昇を示す。
急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物は，生物学的に活性な分子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，他の核酸分子または本明細書に記載される他の生物学的に活性な分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびポリエチレンコンジュゲート，例えば，ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール，ポリエチレングリコール−ジアシルグリカミド，ポリエチレングリコール−コレステロールまたはポリエチレン−ＤＭＢコンジュゲートを含む。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。適当なカチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧコンジュゲートの例は本明細書に記載される。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はＣＬｉｎＤＭＡであり，中性脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり，ＰＥＧコンジュゲートはＰＥＧ−ＤＭＧである。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。これは処方物Ｌ０５１として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はＤＭＯＢＡであり，中性脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり，ＰＥＧコンジュゲートはＰＥＧ−ＤＭＧである。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。これは処方物Ｌ０５３またはＬ０５４として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はＣＬｉｎＤＭＡであり，中性脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり，ＰＥＧコンジュゲートは２ＫＰＥＧ−コレステロールである。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。これは処方物Ｌ０６９として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はｐＣＬｉｎＤＭＡまたはＣＬｉｎＤＭＡおよびＤＭＯＢＡであり，中性脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり，ＰＥＧコンジュゲートはＰＥＧ−ＤＭＧである。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。これは処方物Ｌ０７３として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はｅＣＬｉｎＤＭＡであり，中性脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり，ＰＥＧコンジュゲートは２ＫＰＥＧ−コレステロールである。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。これは処方物Ｌ０７７として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はｅＣＬｉｎＤＭＡであり，中性脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり，ＰＥＧコンジュゲートは２ＫＰＥＧ−ＤＭＧである。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。これは処方物Ｌ０８０として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はｐＣＬｉｎＤＭＡであり，中性脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり，ＰＥＧコンジュゲートは２ＫＰＥＧ−ＤＭＧである。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。これは処方物Ｌ０８２として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はｐＣＬｉｎＤＭＡであり，中性脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり，ＰＥＧコンジュゲートは２ＫＰＥＧ−コレステロールである。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。これは処方物Ｌ０８３として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はＣＬｉｎＤＭＡであり，中性脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり，ＰＥＧコンジュゲートは２ＫＰＥＧ−ＤＭＧである。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体およびリノレイルアルコールを含む。これは処方物Ｌ０８６として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はＤＭＬＢＡであり，中性脂質はコレステロールであり，ＰＥＧコンジュゲートは２ＫＰＥＧ−ＤＭＧである。これは処方物Ｌ０６１として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はＤＭＯＢＡであり，中性脂質はコレステロールであり，ＰＥＧコンジュゲートは２ＫＰＥＧ−ＤＭＧであり，処方分子組成物の窒素対リン酸の比率（Ｎ／Ｐ）は５である。これは処方物Ｌ０６０として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はＤＭＬＢＡであり，中性脂質はコレステロールであり，ＰＥＧコンジュゲートは２ＫＰＥＧ−ＤＭＧである。これは処方物Ｌ０９７として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はＤＭＯＢＡであり，中性脂質はコレステロールであり，ＰＥＧコンジュゲートは２ＫＰＥＧ−ＤＭＧであり，処方分子組成物の窒素対リン酸の比率（Ｎ／Ｐ）は３である。これは処方物Ｌ０９８として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はＤＭＯＢＡであり，中性脂質はコレステロールであり，ＰＥＧコンジュゲートは２ＫＰＥＧ−ＤＭＧであり，処方分子組成物の窒素対リン酸の比率（Ｎ／Ｐ）は４である。これは処方物Ｌ０９９として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はＤＭＯＢＡであり，中性脂質はＤＯＢＡであり，ＰＥＧコンジュゲートは２ＫＰＥＧ−ＤＭＧ（３％）であり，処方分子組成物の窒素対リン酸の比率（Ｎ／Ｐ）は３である。これは処方物Ｌ１００として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はＤＭＯＢＡであり，中性脂質はコレステロールであり，ＰＥＧコンジュゲートは２Ｋ−ＰＥＧ−コレステロールである。これは処方物Ｌ１０１として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はＤＭＯＢＡであり，中性脂質はコレステロールであり，ＰＥＧコンジュゲートは２Ｋ−ＰＥＧ−コレステロールであり，処方分子組成物の窒素対リン酸の比率（Ｎ／Ｐ）は５である。これは処方物Ｌ１０２として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はＤＭＬＢＡであり，中性脂質はコレステロールであり，ＰＥＧコンジュゲートは２Ｋ−ＰＥＧ−コレステロールである。これは処方物Ｌ１０３として知られる（表ＩＶを参照）。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子（例えば，ｓｉＮＡ分子），カチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コンジュゲートを含む血清安定処方分子組成物を特徴とし，ここで，カチオン性脂質はＣＬｉｎＤＭＡであり，中性脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり，ＰＥＧコンジュゲートは２ＫＰＥＧ−コレステロールである。別の態様においては，組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体およびリノレイルアルコールを含む。これは処方物Ｌ１０４として知られる（表ＩＶを参照）。
本発明はさらに，処方分子組成物が生物学的に活性な分子を生物学的システム中にデリバリーするのに有効であるか否かを判定する方法を提供する。１つの態様においては，処方分子組成物が生物学的に活性な分子を生物学的システムにデリバリーするのに有効であるか否かを判定する方法は，（１）処方分子組成物の血清安定性を測定し，そして（２）処方分子組成物のｐＨ依存性相転移を測定することを含み，ここで，処方分子組成物が血清中で安定であるとの判定，および処方分子組成物が約ｐＨ４−約７，例えば，５．５−６．５で相転移を起こすとの判定は，処方分子組成物が生物学的に活性な分子を生物学的システムにデリバリーするのに有効であることを示す。別の態様においては，この方法はさらに，細胞中の処方分子組成物のトランスフェクション効率をインビトロで測定することを含む。
処方分子組成物の血清安定性は，処方分子組成物の血清中における安定性を測定する任意のアッセイ，例えば本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られる他のアッセイを用いて測定することができる。血清安定性を測定するために用いることができる１つの例示的アッセイは，組成物の血清中における相対的濁度を経時的に測定するアッセイである。例えば，処方分子組成物の相対的濁度は，分光光度計を用いて，血清の存在下または非存在下で（すなわち，５０％），処方分子組成物の吸収を２４時間のあいだに数回測定することにより決定することができる。吸収により測定した相対的濁度が，経時的に約１．０で一定のままであれば，処方分子組成物は血清中で安定である。
処方分子組成物のｐＨ依存性相転移は，約ｐＨ５．５−６．５で処方分子組成物の相転移を測定する任意のアッセイ，例えば，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られる他のアッセイを用いて測定することができる。ｐＨ依存性相転移を測定するために用いることができる１つの例示的アッセイは，異なるｐＨで組成物の相対的濁度を経時的に測定するアッセイである。例えば，処方分子組成物の相対的濁度は，ある範囲の異なるｐＨ値を有するバッファ中で処方分子組成物の吸収を経時的に測定することにより決定することができる。ｐＨが７．０以下に下がったときに吸収により測定した相対的濁度が減少すれば，処方分子組成物はｐＨ依存性相転移を起こす。さらに，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物のデリバリー剤としての効率は，処方分子組成物のトランスフェクション効率を測定することにより判定することができる。トランスフェクションアッセイを実施する方法は，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られている。
１つの態様においては，本発明の方法により製造される粒子は，約５０−約６００ｎｍのサイズを有する。粒子は，界面活性剤透析法，または有機溶媒を利用して成分を混合する間に単一相を与える逆相法の改変により形成することができる。いかなる特定の形成メカニズムにも拘束されることを意図するものではないが，分子（例えば，ポリヌクレオチド等の生物学的に活性な分子）をカチオン性脂質の界面活性剤溶液と接触させると，コーティングされた分子複合体が形成される。これらのコーティングされた分子は，凝集し沈殿することができる。しかし，界面活性剤の存在は，この凝集を減少させ，コーティングされた分子が過剰の脂質（典型的には，非カチオン性脂質）と反応して，目的とする分子が脂質二重層中に封入されている粒子を形成することを可能とする。以下に記載される有機溶媒を用いて処方分子組成物を形成する方法は同様のスキームにしたがう。
１つの態様においては，粒子は界面活性剤透析を用いて形成する。すなわち，本発明は，ｐＨ依存性相転移を起こすものなどの血清安定処方分子組成物を製造する方法を提供し，この方法は，（ａ）界面活性剤溶液中で分子（例えば，生物学的に活性な分子，例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子）およびカチオン性脂質を混合して，コーティングされた分子−脂質複合体を形成し；（ｂ）非カチオン性脂質をコーティングされた分子−脂質複合体と接触させて，ｓｉＮＡ−脂質複合体および非カチオン性脂質を含む界面活性剤溶液を形成し；そして（ｃ）工程（ｂ）の界面活性剤溶液を透析して血清安定分子−脂質粒子の溶液を得る，の各工程を含み，ここで，分子は，脂質二重層中に封入され，粒子は血清安定性であり，約５０−約６００ｎｍのサイズを有する。
１つの態様においては，コーティングされた分子−脂質（例えば，ポリヌクレオチド−脂質）複合体の最初の溶液は，例えば，界面活性剤溶液中で分子をカチオン性脂質と混合することにより形成する。
これらの態様においては，界面活性剤溶液は，好ましくは１５−３００ｍＭ，より好ましくは２０−５０ｍＭの臨界ミセル濃度を有する中性界面活性剤の水性溶液である。適当な界面活性剤の例としては，例えば，Ｎ，Ｎ’−（（オクタノイルイミノ）−ビス−（トリメチレン））−ビス−（Ｄ−グルコナミド）（ＢＩＧＣＨＡＰ）；ＢＲＩＪ３５；デオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ；ドデシルポリ（エチレングリコール）エーテル；Ｔｗｅｅｎ２０；Ｔｗｅｅｎ４０；Ｔｗｅｅｎ６０；Ｔｗｅｅｎ８０；Ｔｗｅｅｎ８５；Ｍｅｇａ８；Ｍｅｇａ９；Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−０８；Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１０；ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５；ヘキシル−，ヘプチル−，オクチル−およびにニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド；およびヘプチルチオグルコピラノシドが挙げられ，オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドおよびＴｗｅｅｎ−２０が最も好ましい。ｏｆｉｎｔｈｅ界面活性剤溶液中の界面活性剤の濃度は，典型的には約１００ｍＭ−約２Ｍ，好ましくは約２００ｍＭ−約１．５Ｍである。
１つの態様においては，カチオン性脂質および目的とする分子（例えば，生物学的に活性な分子，例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子）は，典型的には，約１：１−約２０：１の荷電比（＋／−），好ましくは約１：１−約１２：１の比，より好ましくは約２：１−約６：１の比が生ずるように混合する。さらに，ｓｉＮＡの溶液中の総濃度は，典型的には，約２５μｇ／ｍＬ−約１ｍｇ／ｍＬ，好ましくは約２５μｇ／ｍＬ−約５００μｇ／ｍＬ，より好ましくは約１００μｇ／ｍＬ−約２５０μｇ／ｍＬである。界面活性剤溶液中の目的とする分子とカチオン性脂質との混合物を，典型的には室温で，コーティングされた複合体が形成するのに十分な時間保持する。あるいは，目的とする分子およびカチオン性脂質を界面活性剤溶液中で混合し，約３７℃の温度まで暖める。温度に特に感受性の分子（例えば，本明細書のある種のポリヌクレオチド）については，コーティングされた複合体は，より低い温度，典型的には約４℃で形成することができる。
１つの態様においては，形成された処方分子組成物中のｓｉＮＡ対脂質の比率（質量／質量比）は，約０．０１−約０．０８の範囲である。精製工程は，典型的には封入されていないｓｉＮＡならびに空のリポソームを除去するため，出発物質の比率もまたこの範囲内である。別の態様においては，処方ｓｉＮＡ組成物調製物は，１０ｍｇの総脂質あたり約４００μｇのｓｉＮＡを使用するか，またはｓｉＮＡ対脂質の比は約０．０１−約０．０８，より好ましくは，約０．０４であり，これは，５０μｇのｓｉＮＡあたり１．２５ｍｇの総脂質に対応する。本発明の処方分子組成物は，特定の臓器，組織，または細胞タイプを標的とするよう開発される。１つの態様においては，本発明の処方分子組成物は，肝臓または肝細胞を標的とするよう開発される。処方分子組成物の種々の成分の比率は，特定の臓器，組織，または細胞タイプを標的とするよう調節される。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物の細胞に生物学的に活性な分子をデリバリーまたは投与する方法を特徴とし，この方法は，処方分子組成物の生物学的に活性な分子成分を被験者または生物の細胞にデリバリーするのに適した条件下で，本発明の処方分子組成物を投与することを含む。１つの態様においては，処方分子組成物を，当該技術分野において一般に知られるように，例えば，投与を容易にする賦形剤を含むかまたは含まない処方分子組成物を非経口投与（例えば，静脈内，筋肉内，皮下投与）することにより，被験者または生物の細胞と接触させることを含む。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物の肝臓または肝臓細胞（例えば，肝細胞）に生物学的に活性な分子をデリバリーまたは投与する方法を特徴とし，この方法は，処方分子組成物の生物学的に活性な分子成分を被験者または生物の肝臓または肝臓細胞（例えば，肝細胞）にデリバリーするのに適した条件下で，本発明の処方分子組成物をを投与することを含む。１つの態様においては，処方分子組成物を，当該技術分野において一般に知られるように，例えば，投与を容易にする賦形剤を含むかまたは含まない処方分子組成物を非経口投与（例えば，静脈内，筋肉内，皮下投与）または局所投与（例えば，直接注射，門脈注射，カテーテル挿入，ステント留置等）することにより，被験者または生物の肝臓または肝臓細胞と接触させる。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子を被験者または生物の腎臓または腎臓細胞にデリバリーまたは投与する方法を特徴とし，この方法は，処方分子組成物の生物学的に活性な分子成分を被験者または生物の腎臓または腎臓細胞にデリバリーするのに適した条件下で，本発明の処方分子組成物を投与することを含む。１つの態様においては，処方分子組成物を，当該技術分野において一般に知られるように，投与を容易にする賦形剤を含むかまたは含まない処方分子組成物を非経口投与（例えば，静脈内，筋肉内，皮下投与）または局所投与（例えば，直接注射，カテーテル挿入，ステント留置等）することにより，被験者または生物の腎臓または腎臓細胞と接触させる。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子を被験者または生物の腫瘍または腫瘍細胞にデリバリーまたは投与する方法を特徴とし，この方法は，処方分子組成物の生物学的に活性な分子成分を被験者または生物の腫瘍または腫瘍細胞にデリバリーするのに適した条件下で，本発明の処方分子組成物を投与することを含む。１つの態様においては，処方分子組成物を，当該技術分野において一般に知られるように，例えば，投与を容易にする賦形剤を含むかまたは含まない処方分子組成物を非経口投与（例えば，静脈内，筋肉内，皮下投与）または局所投与（例えば，直接注射，カテーテル挿入，ステント留置等）することにより，被験者または生物の腫瘍または腫瘍細胞と接触させる。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子を被験者または生物のＣＮＳまたはＣＮＳ細胞（例えば，脳，脊髄）にデリバリーまたは投与する方法を特徴とし，この方法は，処方分子組成物の生物学的に活性な分子成分を被験者または生物のＣＮＳまたはＣＮＳ細胞にデリバリーするのに適した条件下で，本発明の処方分子組成物を投与することを含む。１つの態様においては，処方分子組成物を，当該技術分野において一般に知られるように，例えば，投与を容易にする賦形剤を含むかまたは含まない処方分子組成物を非経口投与（例えば，静脈内，筋肉内，皮下投与）または局所投与（例えば，直接注射，カテーテル挿入，ステント留置等）することにより，被験者または生物のＣＮＳまたはＣＮＳ細胞と接触させる。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子を被験者または生物の肺または肺細胞にデリバリーまたは投与する方法を特徴とし，この方法は，処方分子組成物の生物学的に活性な分子成分を被験者または生物の肺または肺細胞にデリバリーするのに適した条件下で，本発明の処方分子組成物を投与することを含む。１つの態様においては，処方分子組成物を，当該技術分野において一般に知られるように，例えば，投与を容易にする賦形剤を含むかまたは含まない処方分子組成物を非経口投与（例えば，静脈内，筋肉内，皮下投与）または局所投与（例えば，肺組織および細胞への直接肺投与）することにより，被験者または生物の肺または肺細胞と接触させる。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子を被験者または生物の血管または血管細胞にデリバリーまたは投与する方法を特徴とし，この方法は，処方分子組成物の生物学的に活性な分子成分を被験者または生物の血管または血管細胞にデリバリーするのに適した条件下で，本発明の処方分子組成物を投与することを含む。１つの態様においては，処方分子組成物を，当該技術分野において一般に知られるように，例えば，投与を容易にする賦形剤を含むかまたは含まない処方分子組成物を非経口投与（例えば，静脈内，筋肉内，皮下投与）または局所投与（例えば，クランプ設置，カテーテル挿入，ステント留置等）することにより，被験者または生物の血管または血管細胞と接触させる。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子を被験者または生物の皮膚または皮膚細胞（例えば，真皮または真皮細胞，毛包または毛包細胞）にデリバリーまたは投与する方法を特徴とし，この方法は，処方分子組成物の生物学的に活性な分子成分を被験者または生物の皮膚または皮膚細胞にデリバリーするのに適した条件下で，本発明の処方分子組成物を投与することを含む。１つの態様においては，処方分子組成物を，当該技術分野において一般に知られるように，例えば，投与を容易にする賦形剤を含むかまたは含まない処方分子組成物を非経口投与（例えば，静脈内，筋肉内，皮下投与）または局所投与（例えば，直接皮膚適用，イオントフォレシス等）することにより，被験者または生物の皮膚または皮膚細胞と接触させる。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子を被験者または生物の眼または眼細胞（例えば，粘膜，窩，角膜，網膜など）にデリバリーまたは投与する方法を特徴とし，この方法は，処方分子組成物の生物学的に活性な分子成分を被験者または生物の眼または眼細胞にデリバリーするのに適した条件下で，本発明の処方分子組成物を投与することを含む。１つの態様においては，処方分子組成物を，当該技術分野において一般に知られるように，例えば，投与を容易にする賦形剤を含むかまたは含まない処方分子組成物を非経口投与（例えば，静脈内，筋肉内，皮下投与）または局所投与（例えば，直接注射，眼内注射，眼周囲注射，イオントフォレシス，点眼の使用，移植等）することにより，被験者または生物の眼または眼細胞と接触させる。
１つの態様においては，本発明は，生物学的に活性な分子を被験者または生物の耳または耳の細胞（例えば，内耳，中耳，外耳）にデリバリーまたは投与する方法を特徴とし，この方法は，処方分子組成物の生物学的に活性な分子成分を被験者または生物の耳または耳細胞にデリバリーするのに適した条件下で，本発明の処方分子組成物を投与することを含む。１つの態様においては，投与は，米国特許５，４２１，８１８，５，４７６，４４６，５，４７４，５２９，６，０４５，５２８，６，４４０，１０２，６，６８５，６９７，６，１２０，４８４；および５，５７２，５９４；（すべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する）およびＳｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，１９９９，Ｅａｒ Ｎｏｓｅ Ｔｈｒｏａｔ Ｊ．，７８，５９５−８，６００；およびＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，２００２，Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．，３５，６３９−５３の教示に記載され，本発明の組成物の使用に適合させた方法およびデバイスを含む。
１つの態様においては，本発明は，標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，前記ｓｉＮＡ分子は約１５−約２８塩基対を含む。
１つの態様においては，本発明は，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的ＲＮＡの切断を指示する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，二本鎖ｓｉＮＡ分子は，第１の鎖および第２の鎖を含み，ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり，ｓｉＮＡの第１の鎖は，標的ＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉により標的ＲＮＡの切断を指示するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含み，前記ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む。
１つの態様においては，本発明は，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的ＲＮＡの切断を指示する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，二本鎖ｓｉＮＡ分子は，第１の鎖および第２の鎖を含み，ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２３ヌクレオチドの長さであり，ｓｉＮＡ分子の第１の鎖は，標的ＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉により標的ＲＮＡの切断を指示するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含み，前記ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む。
１つの態様においては，本発明は，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的ＲＮＡの切断を指示する化学的に合成された二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２８ヌクレオチドの長さであり；ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，標的ＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉により標的ＲＮＡの切断を指示するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。
つの態様においては，本発明は，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的ＲＮＡの切断を指示する化学的に合成された二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８−約２３ヌクレオチドの長さであり；ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，標的ＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉により標的ＲＮＡの切断を指示するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。
１つの態様においては，本発明は，標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするｓｉＮＡ分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，例えば，標的遺伝子は標的をコードする配列を含む。１つの態様においては，本発明は，標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするｓｉＮＡ分子を特徴とし，例えば，標的遺伝子は標的の非コーディング配列または標的遺伝子発現に関与する調節要素を含む。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡは，標的遺伝子または標的遺伝子ファミリーの発現を阻害するために用いられ，ここで，遺伝子または遺伝子ファミリー配列は，配列ホモロジーを共有する。そのような相同配列は，当該技術分野において知られるようにして，例えば配列アラインメントを用いて同定することができる。ｓｉＮＡ分子は，例えば，完全に相補的な配列を用いることにより，または非標準的な塩基対，例えば，追加の標的配列を提供することができるミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対を取り込むことにより，そのような相同配列を標的とするよう設計することができる。例えば，ミスマッチを同定する場合には，非標準的塩基対（例えば，ミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基）を用いて，２以上の遺伝子配列を標的とするｓｉＮＡ分子を生成することができる。非限定的例においては，非標準的塩基対，例えば，ＵＵおよびＣＣ塩基対を用いて，配列ホモロジーを共有する異なる標的のための配列を標的とすることができるｓｉＮＡ分子を生成する。そのように，本発明のｓｉＮＡを用いる一つの利点は，相同遺伝子間で保存されているヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を含む単一のｓｉＮＡを設計することができることである。この方法においては，２以上のｓｉＮＡ分子を用いて異なる遺伝子を標的とするのではなく，単一のｓｉＮＡを用いて，２以上の遺伝子の発現を阻害することができる。
１つの態様においては，本発明は，標的ＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，ｓｉＮＡ分子は，標的をコードする配列を有する任意のＲＮＡに相補的な配列を含む。本明細書に記載される処方物に適当なｓｉＮＡ分子の例は，国際出願ＵＳ０４／１０６３９０（ＷＯ０５／１９４５３）（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１０６３９０（ＷＯ０５／１９４５３），米国特許出願１０／４４４，８５３（２００３年５月２３日出願），米国特許出願１０／９２３，５３６（２００４年８月２０日出願），米国特許出願１１／２３４，７３０（２００５年９月２３日出願）または米国特許出願１１／２９９，２５４（２００５年１２月８日出願）（すべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるかまたは本明細書に記載される化学修飾を本発明の任意のｓｉＮＡコンストラクトに適用することができる。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用して，このことにより標的遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含み，例えば，ｓｉＮＡは標的遺伝子のクロマチン構造，またはメチル化パターンを調節し，標的遺伝子の転写を妨害する細胞プロセスにより標的遺伝子発現の制御を媒介する。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，疾病または状態（例えば，脱毛症，抜け毛，および／または無毛症）に関連する標的ハプロタイプ多型から生ずる標的蛋白質の発現をダウンレギュレートまたは阻害するために用いられる。標的遺伝子，または標的蛋白質またはＲＮＡレベルの分析を用いて，そのような多型を有する被験者または本明細書に記載される形質，状態または疾病を発症するリスクを有する被験者を同定することができる。これらの被験者は，治療，例えば，標的遺伝子発現に関連する疾病の治療に有用な本発明のｓｉＮＡ分子または他の組成物を用いる治療に適合している。そのように，標的蛋白質またはＲＮＡレベルの分析を用いて，被験者を治療するための治療の種類および治療計画を決定することができる。標的蛋白質またはＲＮＡレベルのモニタリングを用いて，治療の結果を予測し形質，状態または疾病に関連するある種の標的蛋白質のレベルおよび／または活性を調節する化合物および組成物の効力を判定することができる。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的蛋白質をコードするヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。ｓｉＮＡはさらにセンス鎖を含み，前記センス鎖は標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部を含む。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡは，標的蛋白質またはその一部をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含む。ｓｉＮＡ分子はさらにセンス領域を含み，前記センス領域は標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部を含む。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡは，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に，標的遺伝子のヌクレオチド配列または配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡは，標的遺伝子配列またはその一部を含む配列に相補的な領域，例えばｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス領域を含む。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含み，ここで，アンチセンス鎖は標的蛋白質をコードするＲＮＡ配列またはその一部に相補的であり，前記ｓｉＮＡはさらに約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを有するセンス鎖を含み，前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は，各鎖の少なくとも約１５ヌクレオチドが他方の鎖に相補的である別々のヌクレオチド配列を有する。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを有するアンチセンス領域を含み，ここで，アンチセンス領域は，標的蛋白質をコードするＲＮＡ配列に相補的であり，前記ｓｉＮＡはさらに約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを有するセンス領域を含み，前記センス領域および前記アンチセンス領域は，センス領域がアンチセンス領域に相補的な少なくとも約１５ヌクレオチドを含む直鎖状分子から構成される。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子によりコードされるＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を有する。標的遺伝子は互いにある程度の配列ホモロジーを共有することができるため，ｓｉＮＡ分子は，異なる標的の間で共有されている配列を選択することにより一群の標的遺伝子を標的とするよう設計してもよく，あるいは，特定の標的にユニークな配列を選択することにより特定の標的遺伝子（例えば，多型変種）を標的とするよう設計してもよい。したがって，１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子は，１つのｓｉＮＡ分子で一群の標的遺伝子を標的とするように，いくつかの標的遺伝子変種の間でホモロジーを有する標的ＲＮＡ配列の保存領域を標的とするよう設計することができる。したがって，１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，被験者において一方または両方の標的アレルの発現を調節する。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子がＲＮＡｉ活性を媒介するには高度の特異性が必要であるため，ｓｉＮＡ分子は，特定の標的ＲＮＡ配列（例えば，単一の標的アレルまたは標的一塩基多型（ＳＮＰ））にユニークな配列を標的とするよう設計することができる。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は二本鎖である。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子はオリゴヌクレオチド間に約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを含む約１５−約３０塩基対を含むデュープレックス核酸分子からなる。さらに別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，約１−約３（例えば，約１，２，または３）ヌクレオチドのオーバーハングした末端を有するデュープレックス核酸分子，例えば，約１９塩基対および３’末端モノヌクレオチド，ジヌクレオチド，またはトリヌクレオチドオーバーハングを有する約２１−ヌクレオチドデュープレックスを含む。さらに別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，平滑末端を有するデュープレックス核酸分子を含み，ここで，両方の末端が平滑であってもよく，あるいは一方の末端が平滑であってもよい。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的蛋白質を発現する核酸分子，例えば標的蛋白質をコードするＲＮＡに対して特異性を有する。１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，ＲＮＡに基づき（例えば，２’−ＯＨヌクレオチドを含むｓｉＮＡ），１またはそれ以上の化学修飾，例えば本明細書に記載されるようなものを含む。そのような化学修飾の非限定的例としては，限定されないが，ホスホロチオエートヌクレオチド間結合，２’−デオキシリボヌクレオチド，２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド，２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド，"万能塩基"ヌクレオチド，"非環状"ヌクレオチド，５−Ｃ−メチルヌクレオチド，および末端グリセリルおよび／または逆位デオキシ無塩基残基の取り込みが挙げられる。これらの化学修飾は，種々のｓｉＮＡコンストラクト（例えば，ＲＮＡに基づくｓｉＮＡコンストラクト）中で用いたときに，細胞中でＲＮＡｉ活性を維持しながら，同時にこれらの化合物の血清安定性を劇的に増加させる。さらに，Ｐａｒｒｉｓｈら（上掲）に公表されるデータに反して，本発明においては，多数（２以上）のホスホロチオエート置換が充分に許容され，修飾ｓｉＮＡコンストラクトの血清安定性を実質的に増加させることが示される。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら，修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドを用いて，インビトロまたはインビボでの特性，例えば安定性，活性，および／または生物利用性を改良することができる。例えば，本発明のｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数のあるパーセンテージとして修飾ヌクレオチドを含むことができる。すなわち，本発明のｓｉＮＡ分子は，一般に，約５％−１００％の修飾ヌクレオチド（例えば，５％，１０％，１５％，２０％，２５％，３０％，３５％，４０％，４５％，５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％または１００％の修飾ヌクレオチド）を含むことができる。所定のｓｉＮＡ分子中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは，ｓｉＮＡ中に存在するヌクレオチドの総数によって異なるであろう。ｓｉＮＡ分子が一本鎖である場合，修飾のパーセントは一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。同様に，ｓｉＮＡ分子が二本鎖である場合，修飾のパーセントは，センス鎖，アンチセンス鎖，またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。
本発明の１つの観点は，標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とする。１つの態様においては，二本鎖ｓｉＮＡ分子は，１またはそれ以上の化学修飾を含み，二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は約２１ヌクレオチドの長さである。１つの態様においては，二本鎖ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まない。別の態様においては，二本鎖ｓｉＮＡ分子は１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む。１つの態様においては，二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は，独立して，約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを含み，各鎖は他方の鎖のヌクレオチドに相補的な約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを含む。１つの態様においては，二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み，二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は，標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。
別の態様においては，本発明は，アンチセンス領域およびセンス領域を含み，標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，アンチセンス領域は標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域は標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，アンチセンス領域およびセンス領域は，独立して，約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを含み，アンチセンス領域はセンス領域のヌクレオチドに相補的な約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを含む。
別の態様においては，本発明は，標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする，センス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，アンチセンス領域は標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域はアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含む。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，平滑末端，すなわち，オーバーハングしているヌクレオチドを含まない末端を含む。例えば，米国特許出願１０／４４４，８５３（２００３年５月２３日出願），米国特許出願１０／９２３，５３６（２００４年８月２０日出願），または米国特許出願１１／２３４，７３０（２００５年９月２３日出願）（すべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される修飾，またはこれらの任意の組み合わせ，および／または本明細書に記載される任意の長さのｓｉＮＡ分子は，平滑末端またはオーバーハングするヌクレオチドを有しない末端を含むことができる。
１つの態様においては，本発明の任意のｓｉＮＡ分子は，１またはそれ以上の平滑末端（すなわち，平滑末端はオーバーハングするヌクレオチドを有しない）を含むことができる。１つの態様においては，平滑末端のｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子の各鎖に存在するヌクレオチドの数と等しい数の塩基対を有する。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子は１つの平滑末端を含み，例えば，アンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端はオーバーハングするヌクレオチドを有しない。別の例においては，ｓｉＮＡ分子は１つの平滑末端を含み，例えば，アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端とはオーバーハングするヌクレオチドを有しない。別の例においては，ｓｉＮＡ分子は２つの平滑末端を含み，例えば，アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端ならびにアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端は，オーバーハングするヌクレオチドを有しない。平滑末端化ｓｉＮＡ分子は，例えば，約１５−約３０ヌクレオチド（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０ヌクレオチド）を含むことができる。平滑末端化ｓｉＮＡ分子中に存在する他のヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉を媒介する活性を調節するために，例えば，ミスマッチ，バルジ，ループ，またはゆらぎ塩基対を含むことができる。
"平滑末端"とは，対称な末端，またはオーバーハングするヌクレオチドを有しない二本鎖ｓｉＮＡ分子の末端を意味する。二本鎖ｓｉＮＡ分子の２つの鎖は，末端でオーバーハングするヌクレオチドなしに互いに整列する。例えば，平滑末端化ｓｉＮＡコンストラクトは，ｓｉＮＡ分子のセンス領域とアンチセンス領域との間で相補的な末端ヌクレオチドを含む。
１つの態様においては，本発明は，標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，ｓｉＮＡ分子は，２つの別々のオリゴヌクレオチドフラグメントから組み立てられ，ここで，一方のフラグメントはｓｉＮＡ分子のセンス領域を含み，第２のフラグメントはアンチセンス領域を含む。センス領域はアンチセンス領域にリンカー分子，例えばポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーを介して連結することができる。
１つの態様においては，本発明は，標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，ｓｉＮＡ分子は，約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）塩基対を含み，ｓｉＮＡ分子の各鎖は１またはそれ以上の化学修飾を含む。別の態様においては，二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み，二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は，標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部と実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み，二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は，標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子の各鎖は，約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを含み，各鎖は，他方の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを含む。
本明細書に記載されるいずれの態様においても，本発明のｓｉＮＡ分子は，リボヌクレオチドを含まないことができる。あるいは，本発明のｓｉＮＡ分子は１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むことができる。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含み，ｓｉＮＡはさらに標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に実質的に類似するヌクレオチド配列を含むセンス領域を含む。別の態様においては，アンチセンス領域およびセンス領域はそれぞれ約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを含み，アンチセンス領域はセンス領域のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを含む。標的遺伝子は，例えば，国際公開ＷＯ０３／７４６５４（ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８）にＧｅｎｂａｎｋ受託番号で参照される配列を含むことができる。別の態様においては，ｓｉＮＡは二本鎖核酸分子であり，ｓｉＮＡ分子の２つの鎖のそれぞれは，独立して，約１５−約４０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，２３，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，または４０）ヌクレオチドを含み，ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，標的遺伝子の核酸配列またはその一部に相補的な少なくとも約１５（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４または２５またはそれ以上）のヌクレオチドを含む。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含み，ここで，アンチセンス領域は標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含み，センス領域は，アンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子は２つの別々のオリゴヌクレオチドフラグメントから組み立てられており，ここで，一方のフラグメントはｓｉＮＡ分子のセンス領域を含み，第２のフラグメントはアンチセンス領域を含む。別の態様においては，センス領域は，リンカー分子を介してアンチセンス領域に連結されている。別の態様においては，センス領域は，リンカー分子，例えば，ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを介してアンチセンス領域に接続されている。標的遺伝子は，例えば，国際公開ＷＯ０３／７４６５４（ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８）または米国特許出願１０／９２３，５３６において参照されるかまたは当該技術分野において知られる他の配列を含むことができる。
１つの態様においては，本発明は，センス領域およびアンチセンス領域を含み，標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，アンチセンス領域は，標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含み，センス領域はアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含み，ｓｉＮＡ分子は１またはそれ以上の修飾ピリミジンおよび／またはプリンヌクレオチドを有する。１つの態様においては，センス領域のピリミジンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドまたは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり，センス領域に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の態様においては，センス領域のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり，センス領域に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。別の態様においては，センス領域のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり，センス領域に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。１つの態様においては，アンチセンス領域のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり，アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルｏｒ２’−デオキシプリンヌクレオチドである。上述したｓｉＮＡ分子のいずれかの別の態様においては，センス鎖の非相補的領域（例えば，オーバーハング領域）に存在する任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの態様においては，本発明は，標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，ｓｉＮＡ分子は，２つの別々のオリゴヌクレオチドフラグメントから組み立てられ，一方のフラグメントはｓｉＮＡ分子のセンス領域を含み，第２のフラグメントはアンチセンス領域を含み，センス領域を含むフラグメントは，フラグメントの５’末端，３’末端，または５’末端および３’末端の両方に末端キャップ成分を含む。１つの態様においては，末端キャップ成分は，逆位デオキシ無塩基成分またはグリセリル成分である。１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子の２つのフラグメントのそれぞれは，独立して，約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを含む。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子の２つのフラグメントのそれぞれは，独立して，約１５−約４０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，２３，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，または４０）ヌクレオチドを含む。非限定的例においては，ｓｉＮＡ分子の２つのフラグメントのそれぞれは約２１ヌクレオチドを含む。
１つの態様においては，本発明は，少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，修飾ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。ｓｉＮＡは，例えば，約１５−約４０ヌクレオチドの長さであることができる。１つの態様においては，ｓｉＮＡに存在する全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。１つの態様においては，ｓｉＮＡ中の修飾ヌクレオチドは，少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンまたは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。別の態様においては，ｓｉＮＡ中の修飾ヌクレオチドは，少なくとも１つの２’−フルオロシチジンおよび少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。１つの態様においては，ｓｉＮＡに存在する全てのウリジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。１つの態様においては，ｓｉＮＡに存在する全てのシチジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。１つの態様においては，ｓｉＮＡに存在する全てのアデノシンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。１つの態様においては，ｓｉＮＡに存在する全てのグアノシンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡはさらに少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合，例えば，ホスホロチオエート結合を含むことができる。１つの態様においては，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドは，ｓｉＮＡ中のリボヌクレアーゼによる切断に感受性の特に選択された位置，例えばピリミジンヌクレオチドを有する位置に存在する。
１つの態様においては，本発明は，リボヌクレアーゼによる切断に対する本発明のｓｉＮＡ分子の安定性を増加させる方法を特徴とし，この方法は，少なくとも１つの修飾ヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入することを含み，ここで，修飾ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。１つの態様においては，ｓｉＮＡに存在する全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。１つの態様においては，ｓｉＮＡ中の修飾ヌクレオチドは少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンまたは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。別の態様においては，ｓｉＮＡ中の修飾ヌクレオチドは少なくとも１つの２’−フルオロシチジンおよび少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。１つの態様においては，ｓｉＮＡに存在する全てのウリジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。１つの態様においては，ｓｉＮＡに存在する全てのシチジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。１つの態様においては，ｓｉＮＡに存在する全てのアデノシンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。１つの態様においては，ｓｉＮＡに存在する全てのグアノシンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡはさらに，少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合，例えばホスホロチオエート結合を含むことができる。１つの態様においては，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドは，ｓｉＮＡ中のリボヌクレアーゼによる切断に感受性の特に選択された位置，例えばピリミジンヌクレオチドを有する位置に存在する。
１つの態様においては，本発明は，センス領域およびアンチセンス領域を含み，標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，アンチセンス領域は標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域はアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含み，アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシ−プリンヌクレオチドを含む。別の態様においては，アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを含む。上述の態様のいずれにおいても，アンチセンス領域は，アンチセンス領域の３’末端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。あるいは，上述の態様のいずれにおいても，アンチセンス領域は，アンチセンス領域の３’末端にグリセリル修飾を含むことができる。上述のいずれかのｓｉＮＡ分子の別の態様においては，アンチセンス鎖の非相補的領域（例えば，オーバーハング領域）に存在する任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は，特定の標的疾病に関連するアレルにユニークな配列，例えば，疾病特異的アレルに関連する一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列を有する標的転写産物の一部に相補的な配列を含む。そのように，本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は，特定のアレルにユニークな配列に相補的な配列を含むことができ，疾病，状態または形質に関連するアレルに対して選択的ＲＮＡｉを媒介する特異性を与えることができる。
１つの態様においては，本発明は，標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ここで，ｓｉＮＡ分子は，２つの別々のオリゴヌクレオチドフラグメントから組み立てられており，一方のフラグメントはｓｉＮＡ分子のセンス領域を含み，第２のフラグメントはアンチセンス領域を含む。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子は二本鎖核酸分子であり，各鎖は約２１ヌクレオチドの長さであり，ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの約１９ヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補的ヌクレオチドと塩基対形成し，ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの少なくとも２つの３’末端ヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントのヌクレオチドと塩基対形成しない。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子は二本鎖核酸分子であり，各鎖は約１９ヌクレオチドの長さであり，ｓｉＮＡ分子の各フラグメントのヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補的ヌクレオチドと塩基対形成して，少なくとも約１５（例えば，１５，１６，１７，１８，または１９）塩基対を形成し，ｓｉＮＡ分子の一方または両方の末端は平滑末端である。１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの２つの３’末端ヌクレオチドのそれぞれは２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチド，例えば２’−デオキシ−チミジンである。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの全てのヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補的ヌクレオチドと塩基対形成する。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子は，センス領域およびアンチセンス領域を有する約１９−約２５塩基対の二本鎖核酸分子であり，アンチセンス領域の約１９ヌクレオチドは，標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部と塩基対形成する。別の態様においては，アンチセンス領域の約２１ヌクレオチドは標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部と塩基対形成する。上述の態様のいずれにおいても，前記アンチセンス領域を含むフラグメントの５’末端任意にリン酸基を含むことができる。
本明細書に記載されるいずれの態様においても，本発明のｓｉＮＡ分子は，表Ｉに示されるかまたはＰＣＴ／ＵＳ２００４／１０６３９０（ＷＯ０５／１９４５３），米国特許出願１０／４４４，８５３（２００３年５月２３日出願），米国特許出願１０／９２３，５３６（２００４年８月２０日出願），米国特許出願１１／２３４，７３０（２００５年９月２３日出願）または米国特許出願１１／２９９，２５４（２００５年１２月８日出願）（すべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される安定化化学の１またはそれ以上を含むことができる。
１つの態様においては，本発明は，標的ＲＮＡ配列（例えば，前記標的ＲＮＡ配列は標的経路に関与する標的遺伝子によりコードされる）の発現を阻害する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まず，二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５−約３０ヌクレオチドである。１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子は２１ヌクレオチドの長さである。非リボヌクレオチド含有ｓｉＮＡコンストラクトの例は，ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１０６３９０（ＷＯ０５／１９４５３），米国特許出願１０／４４４，８５３（２００３年５月２３日出願），米国特許出願１０／９２３，５３６（２００４年８月２０日出願），米国特許出願１１／２３４，７３０（２００５年９月２３日出願）または米国特許出願１１／２９９，２５４（２００５年１２月８日出願）（すべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される安定化化学の組み合わせである。
１つの態様においては，本発明は，ＲＮＡ干渉により標的ＲＮＡの切断を指示する化学的に合成された二本鎖ＲＮＡ分子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を特徴とし，前記ＲＮＡ分子の各鎖は約１５−約３０ヌクレオチドの長さであり；ＲＮＡ分子の一方の鎖は，標的ＲＮＡに対して，ＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉により標的ＲＮＡの切断を指示するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含み；ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は，任意に本明細書に記載される１またはそれ以上の化学的に修飾されたヌクレオチド，例えば，限定されないが，デオキシヌクレオチド，２’−Ｏ−メチルヌクレオチド，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド，２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド等を含む。
１つの態様においては，本発明は，本発明の処方ｓｉＮＡ組成物を薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む組成物を特徴とする。
１つの態様においては，本発明は，標的ＲＮＡ配列の発現を阻害する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，ｓｉＮＡ分子は，リボヌクレオチドを含まず，二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５−約３０ヌクレオチドである。１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子は２１ヌクレオチドの長さである。非リボヌクレオチド含有ｓｉＮＡコンストラクトの例は，表Ｉに示される安定化化学の組み合わせ，またはセンス／アンチセンス化学の任意の組み合わせ，例えば，Ｓｔａｂ７／８，Ｓｔａｂ７／１１，Ｓｔａｂ８／８，Ｓｔａｂ１８／８，Ｓｔａｂ１８／１１，Ｓｔａｂ１２／１３，Ｓｔａｂ７／１３，Ｓｔａｂ１８／１３，Ｓｔａｂ７／１９，Ｓｔａｂ８／１９，Ｓｔａｂ１８／１９，Ｓｔａｂ７／２０，Ｓｔａｂ８／２０，Ｓｔａｂ１８／２０，Ｓｔａｂ７／３２，Ｓｔａｂ８／３２，またはＳｔａｂ１８／３２（例えば，Ｓｔａｂ７，８，１１，１２，１３，１４，１５，１７，１８，１９，２０，または３２を有するセンスまたはアンチセンス鎖またはこれらの任意の組み合わせのｓｉＮＡ）である。ここで，多くのＳｔａｂ化学は，表Ｉに示される２’−フルオロおよび２’−ＯＣＦ３化学の両方を含むことができる。例えば，"Ｓｔａｂ７／８"は，Ｓｔａｂ７／８とＳｔａｂ７Ｆ／８Ｆ等の両方を表す。１つの態様においては，本発明は，ＲＮＡ干渉により標的ＲＮＡの切断を指示する，化学的に合成された二本鎖ＲＮＡ分子を特徴とし，前記ＲＮＡ分子の各鎖は約１５−約３０ヌクレオチドの長さであり；ＲＮＡ分子の一方の鎖は，標的ＲＮＡに対して，ＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉により標的ＲＮＡの切断を指示するのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含み；ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は，任意に本明細書に記載される１またはそれ以上の化学的に修飾されたヌクレオチド，例えば，限定されないが，デオキシヌクレオチド，２’−Ｏ−メチルヌクレオチド，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド，２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド等を含む。
１つの態様においては，本発明は，細胞内でまたは再構成されたインビトロ系でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，化学修飾は，式Ｉ：
［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，任意のヌクレオチド，非ヌクレオチド，またはポリヌクレオチドであり，これは天然に生ずるものであっても，化学的に修飾されたものであってもよく，各ＸおよびＹは，独立して，Ｏ，Ｓ，Ｎ，アルキル，または置換アルキルであり，各ＺおよびＷは，独立して，Ｏ，Ｓ，Ｎ，アルキル，置換アルキル，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，アルカリール，アラルキル，またはアセチルであり，Ｗ，Ｘ，Ｙ，およびＺは，任意に，すべてがＯではない］
を有する主鎖修飾ヌクレオチド間結合を含む１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のヌクレオチドを含む。別の態様においては，本発明の主鎖修飾は，ホスホノアセテートおよび／またはチオホスホノアセテートヌクレオチド間結合を含む（例えば，Ｓｈｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｕｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１，４１０９−４１１８を参照）。
任意のＺ，Ｗ，Ｘ，および／またはＹが，独立して，イオウ原子を含む式Ｉを有する化学的に修飾されたヌクレオチド間結合が，ｓｉＮＡデュープレックスの一方または両方オリゴヌクレオチド鎖，例えば，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に存在していてもよい。本発明のｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に式Ｉを有する１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の化学的に修飾されたヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば，本発明のｓｉＮＡ分子の一例は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の５’末端に式Ｉを有する約１−約５個またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）の化学的に修飾されたヌクレオチド間結合を含むことができる。別の非限定的例においては，本発明のｓｉＮＡ分子の一例は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に式Ｉを有する化学的に修飾されたヌクレオチド間結合を有する１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のピリミジンヌクレオチドを含むことができる。さらに別の非限定的例においては，本発明のｓｉＮＡ分子の一例は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に式Ｉを有する化学的に修飾されたヌクレオチド間結合を有する１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のプリンヌクレオチドを含むことができる。別の態様においては，式Ｉのヌクレオチド間結合を有する本発明のｓｉＮＡ分子はまた，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有する化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。
１つの態様においては，本発明は，細胞内でまたは再構成されたインビトロ系でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，化学修飾は，式ＩＩ：
［式中，各Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ１０，Ｒ１１およびＲ１２は，独立して，Ｈ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリールまたはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ２，Ｏ−アミノアルキル，Ｏ−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，または式ＩまたはＩＩを有する基であり；Ｒ９は，Ｏ，Ｓ，ＣＨ２，Ｓ＝Ｏ，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり，Ｂは，ヌクレオシド性塩基，例えば，アデニン，グアニン，ウラシル，シトシン，チミン，２−アミノアデノシン，５−メチルシトシン，２，６−ジアミノプリン，または標的ＲＮＡに対して相補的であっても相補的でなくてもよい，天然に生じない任意の他の塩基，または，非ヌクレオシド性塩基，例えば，フェニル，ナフチル，３−ニトロピロール，５−ニトロインドール，ネブラリン，ピリドン，ピリジノン，または標的ＲＮＡに対して相補的であっても相補的でなくてもよい他の任意の天然に生じない万能塩基である］
を有する１またはそれ以上の（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。１つの態様においては，Ｒ３および／またはＲ７はコンジュゲート成分およびリンカー（例えば，本明細書に記載されるかまたは他の当該技術分野において知られるヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー）を含む。コンジュゲート成分の非限定的例としては，細胞レセプターのリガンド，例えば天然に生ずる蛋白質リガンドに由来するペプチド；蛋白質局在化配列，例えば，細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他の補因子，例えば葉酸およびＮ−アセチルガラクトサミン；ポリマー，例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド，およびポリアミン，例えば，ＰＥＩ，スペルミンまたはスペルミジンが挙げられる。
式ＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドは，ｓｉＮＡデュープレックスの一方または両方オリゴヌクレオチド鎖に，例えば，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に存在することができる。本発明のｓｉＮＡ分子は，式ＩＩの１またはそれ以上の化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に含むことができる。例えば，本発明のｓｉＮＡ分子の一例は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の５’末端に約１−約５個またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）の式ＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むことができる。別の非限定的例においては，本発明のｓｉＮＡ分子の一例は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端に，約１−約５個またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）の式ＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むことができる。
１つの態様においては，本発明は，細胞内でまたは再構成されたインビトロ系でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる，化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，化学修飾は，式ＩＩＩ：
［式中，各Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ１０，Ｒ１１およびＲ１２は，独立して，Ｈ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリールまたはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ２，Ｏ−アミノアルキル，Ｏ−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，または式ＩまたはＩＩを有する基であり；Ｒ９は，Ｏ，Ｓ，ＣＨ２，Ｓ＝Ｏ，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり，Ｂは，ヌクレオシド性塩基，例えば，アデニン，グアニン，ウラシル，シトシン，チミン，２−アミノアデノシン，５−メチルシトシン，２，６−ジアミノプリン，または標的ＲＮＡに相補的であるようにまたは相補的でないように用いることができる天然に生じない他の任意の塩基，またはヌクレオシド性塩基，例えば，フェニル，ナフチル，３−ニトロピロール，５−ニトロインドール，ネブラリン，ピリドン，ピリジノン，または標的ＲＮＡに相補的であっても相補的でなくてもよい天然に生じない他の任意の万能塩基である］
を有する１またはそれ以上の（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。１つの態様においては，Ｒ３および／またはＲ７はコンジュゲート成分およびリンカー（例えば，本明細書に記載されるかまたは他の当該技術分野において知られるヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー）を含む。コンジュゲート成分の非限定的例としては，細胞レセプターのリガンド，例えば天然に生ずる蛋白質リガンドに由来するペプチド；蛋白質局在化配列，例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他の補因子，例えば葉酸およびＮ−アセチルガラクトサミン；ポリマー，例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド，およびポリアミン，例えばＰＥＩ，スペルミンまたはスペルミジンが挙げられる。
式ＩＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドは，ｓｉＮＡデュープレックスの一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に，例えば，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に存在することができる。本発明のｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に，式ＩＩＩの１またはそれ以上の化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むことができる。例えば，本発明のｓｉＮＡ分子の一例は，約１−約５個またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）の，式ＩＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の５’末端に含むことができる。別の非限定的例においては，本発明のｓｉＮＡ分子の一例は，約１−約５個またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）の，式ＩＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端に含むことができる。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，式ＩＩまたはＩＩＩを有するヌクレオチドを含み，式ＩＩまたはＩＩＩを有するヌクレオチドは，逆位コンフィギュレーションである。例えば，式ＩＩまたはＩＩＩを有するヌクレオチドは，ｓｉＮＡコンストラクトに３’−３’，３’−２’，２’−３’，または５’−５’コンフィギュレーションで，例えば，一方または両方のｓｉＮＡ鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に連結されている。
１つの態様においては，本発明は，細胞内でまたは再構成されたインビトロ系でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，化学修飾は式ＩＶ：
［式中，各ＸおよびＹは，独立して，Ｏ，Ｓ，Ｎ，アルキル，置換アルキル，またはアルキルハロであり；各ＺおよびＷは，独立して，Ｏ，Ｓ，Ｎ，アルキル，置換アルキル，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，アルカリール，アラルキル，アルキルハロ，またはアセチルであり；Ｗ，Ｘ，ＹおよびＺのすべてがＯではない］
を有する５’末端ホスフェート基を含む。
１つの態様においては，本発明は，標的相補鎖，例えば標的ＲＮＡに相補的な鎖に式ＩＶを有する５’末端ホスフェート基を有するｓｉＮＡ分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子は全ＲＮＡｓｉＮＡ分子を含む。別の態様においては，本発明は，標的相補鎖に式ＩＶを有する５’末端ホスフェート基を有するｓｉＮＡ分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子はまた，一方または両方の鎖の３’末端に約１−約４個（例えば，約１，２，３，または４個）のデオキシリボヌクレオチドを有する約１−約３個（例えば，約１，２，または３個）のヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む。別の態様においては，式ＩＶを有する５’末端ホスフェート基は，本発明のｓｉＮＡ分子，例えば式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有する化学修飾を有するｓｉＮＡ分子の標的相補鎖に存在する。
１つの態様においては，本発明は，細胞内でまたは再構成されたインビトロ系でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる，化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，化学修飾は１またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。例えば，非限定的例においては，本発明は，一方のｓｉＮＡ鎖に約１，２，３，４，５，６，７，８個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する，化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。さらに別の態様においては，本発明は，両方のｓｉＮＡ鎖に独立して，約１，２，３，４，５，６，７，８個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する，化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は，ｓｉＮＡデュープレックスの一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に，例えば，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に存在することができる。本発明のｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に１またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば，本発明のｓｉＮＡ分子の一例は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の５’末端に，約１−約５個またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個，またはそれ以上）の連続するホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。別の非限定的例においては，本発明のｓｉＮＡ分子の一例は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に，１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のピリミジンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。さらに別の非限定的例においては，本発明のｓｉＮＡ分子の一例は，センス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖に，１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のプリンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。
１つの態様においては，本発明は，センス鎖が，１またはそれ以上の，例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上ホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシおよび／または約１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含み；アンチセンス鎖が，約１−約１０個またはそれ以上，特に約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ，４’−チオおよび／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にアンチセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の態様においては，センスおよび／またはアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１またはそれ以上の，例えば約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ，４’−チオおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾されており，さらに，同じまたは異なる鎖に存在する，１またはそれ以上の，例えば約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および／または３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を有していても有していなくてもよい。
別の態様においては，本発明は，センス鎖が，約１−約５個，特に約１，２，３，４，または５個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ，４’−チオおよび／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にセンス鎖の３末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含み；アンチセンス鎖が，約１−約５個またはそれ以上，特に約１，２，３，４，５個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ，４’−チオおよび／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にアンチセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の態様においては，センスおよび／またはアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１またはそれ以上の，例えば約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ，４’−チオおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾されており，さらに，同じまたは異なる鎖に存在する，約１−約５個またはそれ以上，例えば約１，２，３，４，５個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および／または３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を有していても有していなくてもよい。
１つの態様においては，本発明は，アンチセンス鎖が，１またはそれ以上，例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または約１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ，４’−チオおよび／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含み；アンチセンス鎖が，約１−約１０個またはそれ以上，特に約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ，４’−チオおよび／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にアンチセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の態様においては，センスおよび／またはアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１またはそれ以上，例えば約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ，４’−チオおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾されており，さらに，同じまたは異なる鎖に存在する，１またはそれ以上，例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および／または３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を有していても有していなくてもよい。
別の態様においては，本発明は，アンチセンス鎖が，約１−約５個またはそれ以上，特に約１，２，３，４，５個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ，４’−チオおよび／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含み；アンチセンス鎖は，約１−約５個またはそれ以上，特に約１，２，３，４，５個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，および／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ，４’−チオおよび／または１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み，任意にアンチセンス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の態様においては，センスおよび／またはアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１またはそれ以上の，例えば約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ，４’−チオおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾されており，さらに，同じまたは異なる鎖に存在する，約１−約５個，例えば約１，２，３，４，５個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および／または３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を有していても有していなくてもよい。
１つの態様においては，本発明は，ｓｉＮＡ分子の各鎖に，約１−約５個またはそれ以上（特に，約１，２，３，４，５個またはそれ以上）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，２’−５’ヌクレオチド間結合を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。２’−５’ヌクレオチド間結合は，一方または両方のｓｉＮＡ配列鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方にあってもよい。さらに，２’−５’ヌクレオチド間結合は，一方または両方のｓｉＮＡ配列鎖中の他の種々の位置に存在していてもよく，例えば，ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖のピリミジンヌクレオチドの約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上，例えばすべてのヌクレオチド間結合は２’−５’ヌクレオチド間結合を含んでいてもよく，またはｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖のプリンヌクレオチドの約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上，例えばすべてのヌクレオチド間結合は２’−５’ヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。
別の態様においては，本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子は，２つの鎖を有するデュープレックスを含み，その一方または両方は化学的に修飾することができ，ここで各鎖は，独立して，約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドの長さであり，デュープレックスは約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）塩基対を有し，化学修飾は，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有する構造を含む。例えば，本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子の一例は，２つの鎖を有するデュープレックスを含み，その一方または両方は化学的に修飾することができ，化学修飾は式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはこれらの任意の組み合わせを有し，各鎖は約２１ヌクレオチドからなり，それぞれ２−ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有し，デュープレックスは約１９塩基対を有する。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，一本鎖ヘアピン構造を含み，ｓｉＮＡは約３６−約７０（例えば，約３６，４０，４５，５０，５５，６０，６５，または７０）ヌクレオチドの長さであり，約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）塩基対を有し，ｓｉＮＡは式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはこれらの任意の組み合わせを有する構造を含む化学修飾を含むことができる。例えば，本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子の一例は，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはこれらの任意の組み合わせを有する化学修飾で化学的に修飾された，約４２−約５０（例えば，約４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，または５０）ヌクレオチドを有する直鎖状オリゴヌクレオチドを含み，直鎖状オリゴヌクレオチドは約１９−約２１（例えば，１９，２０，または２１）塩基対および２−ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有するヘアピン構造を形成する。別の態様においては，本発明の直鎖状ヘアピンｓｉＮＡ分子は，ステムループモチーフを含み，ｓｉＮＡ分子のループ部分は生物分解性である。例えば，本発明の直鎖状ヘアピンｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子のループ部分のインビボでの分解により，３’末端オーバーハング，例えば，約２ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生ずるように設計される。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子はヘアピン構造を含み，ｓｉＮＡは約２５−約５０（例えば，約２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，または５０）ヌクレオチドの長さであり，約３−約２５（例えば，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）塩基対を有し，ｓｉＮＡは式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはこれらの任意の組み合わせを有する構造を含む１またはそれ以上の化学修飾を含むことができる。例えば，本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子の一例は，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはこれらの任意の組み合わせを有する１またはそれ以上の化学修飾で化学的に修飾された約２５−約３５（例えば，約２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，または３５）ヌクレオチドを有する直鎖状オリゴヌクレオチドを含み，直鎖状オリゴヌクレオチドは，約３−約２５（例えば，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）塩基対および本明細書に記載されるように化学的に修飾されていてもよい５’末端ホスフェート基（例えば，式ＩＶを有する５’末端ホスフェート基）を有するヘアピン構造を形成する。別の態様においては，本発明の直鎖状ヘアピンｓｉＮＡ分子は，ステムループモチーフを含み，ｓｉＮＡ分子のループ部分は生物分解性である。１つの態様においては，本発明の直鎖状ヘアピンｓｉＮＡ分子は非ヌクレオチドリンカーを含むループ部分を含む。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，非対称ヘアピン構造を含み，ｓｉＮＡは約２５−約５０（例えば，約２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，または５０）ヌクレオチドの長さであり，約３−約２５（例えば，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）塩基対を有し，ｓｉＮＡは，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはこれらの任意の組み合わせを有する構造を含む１またはそれ以上の化学修飾を含むことができる。例えば，本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子の一例は，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはこれらの任意の組み合わせを有する１またはそれ以上の化学修飾で化学的に修飾された約２５−約３５（例えば，約２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，または３５）ヌクレオチドを有する直鎖状オリゴヌクレオチドを含み，直鎖状オリゴヌクレオチドは，約３−約２５（例えば，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）塩基対および本明細書に記載されるように化学的に修飾することができる５’末端ホスフェート基（例えば，式ＩＶを有する５’末端ホスフェート基）を有する非対称ヘアピン構造を形成する。１つの態様においては，本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は，ステムループモチーフを含み，ｓｉＮＡ分子のループ部分は生物分解性である。別の態様においては，本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は非ヌクレオチドリンカーを含むループ部分を含む。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，センス領域およびアンチセンス領域を含む別々のポリヌクレオチド鎖を有する非対称二本鎖構造を含み，アンチセンス領域は約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドの長さであり，センス領域は約３−約２５（例えば，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）ヌクレオチドの長さであり，センス領域およびアンチセンス領域は少なくとも３つの相補的ヌクレオチドを有し，ｓｉＮＡは式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはこれらの任意の組み合わせを有する構造を含む１またはそれ以上の化学修飾を含むことができる。例えば，本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子の一例は，センス領域およびアンチセンス領域を含む別々のポリヌクレオチド鎖を有する非対称二本鎖構造を含み，アンチセンス領域は約１８−約２３（例えば，約１８，１９，２０，２１，２２，または２３）ヌクレオチドの長さであり，センス領域は約３−約１５（例えば，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，または１５）ヌクレオチドの長さであり，センス領域およびアンチセンス領域は少なくとも３つの相補的ヌクレオチドを有し，ｓｉＮＡは式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはこれらの任意の組み合わせを有する構造を含む１またはそれ以上の化学修飾を含むことができる。別の態様においては，非対称二本鎖ｓｉＮＡ分子はまた，本明細書に記載されるように化学的に修飾することができる５’末端ホスフェート基（例えば式ＩＶを有する５’末端ホスフェート基）を有することができる。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，環状核酸分子を含み，ｓｉＮＡは約３８−約７０（例えば，約３８，４０，４５，５０，５５，６０，６５，または７０）ヌクレオチドの長さであり，約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）塩基対を有し，ｓｉＮＡは式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはこれらの任意の組み合わせを有する構造を含む化学修飾を含むことができる。例えば，本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子の一例は，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかまたはこれらの任意の組み合わせを有する化学修飾で化学的に修飾された約４２−約５０（例えば，約４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，または５０）ヌクレオチドを有する環状オリゴヌクレオチドを含み，環状オリゴヌクレオチドは，約１９塩基対および２つのループを有するダンベル形状の構造を形成する。
別の態様においては，本発明の環状ｓｉＮＡ分子は，２つのループモチーフを含み，ｓｉＮＡ分子の一方または両方のループ部分は生物分解性である。例えば，本発明の環状ｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子のループ部分のインビボにおける分解により３’末端オーバーハング，例えば約２ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生ずることができるように設計されている。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は少なくとも１つ（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の無塩基成分，例えば，式Ｖ：
［式中，各Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，およびＲ１３は，独立して，Ｈ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリールまたはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ２，Ｏ−アミノアルキル，Ｏ−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，または式ＩまたはＩＩを有する基であり；Ｒ９は，Ｏ，Ｓ，ＣＨ２，Ｓ＝Ｏ，ＣＨＦ，またはＣＦ２である］
を有する化合物を含む。１つの態様においては，Ｒ３および／またはＲ７は，コンジュゲート成分およびリンカー（例えば，本明細書に記載されるかまたは他の当該技術分野において知られるヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー）を含む。コンジュゲート成分の非限定的例としては，細胞レセプターのリガンド，例えば天然に生ずる蛋白質リガンドに由来するペプチド；蛋白質局在化配列，例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他の補因子，例えば葉酸およびＮ−アセチルガラクトサミン；ポリマー，例えば，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド，およびポリアミン，例えば，ＰＥＩ，スペルミンまたはスペルミジンが挙げられる。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，少なくとも１つ（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の逆位無塩基成分，例えば，式ＶＩ：
［式中，各Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，およびＲ１３は，独立して，Ｈ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリールまたはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ２，Ｏ−アミノアルキル，Ｏ−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，または式ＩまたはＩＩを有する基であり；Ｒ９は，Ｏ，Ｓ，ＣＨ２，Ｓ＝Ｏ，ＣＨＦ，またはＣＦ２であり，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ８またはＲ１３のいずれかは本発明のｓｉＮＡ分子への結合点として働く］
を有する化合物を含む。１つの態様においては，Ｒ３および／またはＲ７は，コンジュゲート成分およびリンカー（例えば，本明細書に記載されるかまたは他の当該技術分野において知られるヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー）を含む。コンジュゲート成分の非限定的例としては，細胞レセプターのリガンド，例えば天然に生ずる蛋白質リガンドに由来するペプチド；蛋白質局在化配列，例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他の補因子，例えば葉酸およびＮ−アセチルガラクトサミン；ポリマー，例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド，およびポリアミン，例えばＰＥＩ，スペルミンまたはスペルミジンが挙げられる。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，少なくとも１つ（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の置換ポリアルキル成分，例えば，式ＶＩＩ：
［式中，各ｎは，独立して，１−１２の整数であり，各Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は，独立して，Ｈ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリールまたはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ２，Ｏ−アミノアルキル，Ｏ−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，または式Ｉを有する基であり，Ｒ１，Ｒ２またはＲ３は，本発明のｓｉＮＡ分子への結合点として働く］
を有する化合物を含む。１つの態様においては，Ｒ３および／またはＲ１は，コンジュゲート成分およびリンカー（例えば，本明細書に記載されるかまたは他の当該技術分野において知られるヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー）を含む。コンジュゲート成分の非限定的例としては，細胞レセプターのリガンド，例えば天然に生ずる蛋白質リガンドに由来するペプチド；蛋白質局在化配列，例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他の補因子，例えば葉酸およびＮ−アセチルガラクトサミン；ポリマー，例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド，およびポリアミン，例えばＰＥＩ，スペルミンまたはスペルミジンが挙げられる。
"ＺＩＰコード"配列とは，細胞局所（ｔｏｐｏｇｅｎｉｃ）シグナリング媒介性輸送（例えば，Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６（１５０１）：１５０５を参照）に関与する任意のペプチドまたは蛋白質配列を意味する。
別の態様においては，本発明は，式ＶＩＩを有する化合物を特徴とし，ここで，Ｒ１およびＲ２はヒドロキシル（ＯＨ）基であり，ｎは１であり，Ｒ３はＯを含み，これは本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方への，または本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子への結合点である。この修飾は本明細書において"グリセリル"と称される。
別の態様においては，本発明の化学的に修飾されたヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例えば，式Ｖ，ＶＩまたはＶＩＩのいずれかを有する成分）は，本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に存在する。例えば，化学的に修飾されたヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例えば，式Ｖ，ＶＩまたはＶＩＩを有する成分）は，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖，センス鎖，またはアンチセンス鎖およびセンス鎖の両方の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に存在することができる。１つの態様においては，化学的に修飾されたヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例えば，式Ｖ，ＶＩまたはＶＩＩを有する成分）は，本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端および３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に存在する。１つの態様においては，化学的に修飾されたヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例えば，式Ｖ，ＶＩまたはＶＩＩを有する成分）は，本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端および３’末端の末端位置，およびアンチセンス鎖の３’末端に存在する。１つの態様においては，化学的に修飾されたヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例えば，式Ｖ，ＶＩまたはＶＩＩを有する成分）は，本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端および３’末端の２つの末端位置およびアンチセンス鎖の３’末端に存在する。１つの態様においては，化学的に修飾されたヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例えば，式Ｖ，ＶＩまたはＶＩＩを有する成分）は，本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端から２番目の位置および３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に存在する。さらに，式ＶＩＩを有する成分が本明細書に記載されるヘアピンｓｉＮＡ分子の３’末端または５’末端に存在していてもよい。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，式ＶまたはＶＩを有する無塩基残基を含み，式ＶＩまたはＶＩを有する無塩基残基は，ｓｉＮＡコンストラクトに，３’−３’，３’−２’，２’−３’，または５’−５’コンフィギュレーションで，一方または両方のｓｉＮＡ鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方などに連結されている。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを，例えば，ｓｉＮＡ分子の５’末端，３’末端，５’末端および３’末端の両方，またはこれらの任意の組み合わせに含む。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の４’−チオヌクレオチドを，例えば，ｓｉＮＡ分子の５’末端，３’末端，５’末端および３’末端の両方，またはこれらの任意の組み合わせに含む。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）の非環状ヌクレオチドを，例えば，ｓｉＮＡ分子の５’末端，３’末端，５’末端および３’末端の両方，またはこれらの任意の組み合わせに含む。
１つの態様においては，本発明は，センス領域を含む本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，センス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）ピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば，全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである），センス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）プリンヌクレオチドは，２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
１つの態様においては，本発明は，センス領域を含む本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，センス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）ピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば，全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである），センス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）プリンヌクレオチドは，２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである），前記センス領域に存在する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの態様においては，本発明は，センス領域を含む本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，センス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）ピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば，全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである），センス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）プリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。
１つの態様においては，本発明は，センス領域を含む本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，センス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）ピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば，全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである），センス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）プリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである），前記センス領域に存在する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの態様においては，本発明は，アンチセンス領域を含む本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，アンチセンス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）ピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば，全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである），アンチセンス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）プリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。
１つの態様においては，本発明は，アンチセンス領域を含む本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，アンチセンス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）ピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば，全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである），アンチセンス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）プリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである），前記アンチセンス領域に存在する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの態様においては，本発明は，アンチセンス領域を含む本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，アンチセンス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）ピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば，全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである），アンチセンス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
１つの態様においては，本発明は，アンチセンス領域を含む本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，アンチセンス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）ピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば，全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである），およびアンチセンス領域に存在する任意の（例えば，１またはそれ以上のまたは全ての）プリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。
１つの態様においては，本発明は，細胞内でまたは再構成されたインビトロ系でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる本発明の化学的に修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，これは，センス領域を含み，ここで，センス領域に存在する１またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば，全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである），センス領域に存在する１またはそれ以上のプリンヌクレオチドは，２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである），およびアンチセンス領域を含み，ここで，アンチセンス領域に存在する１またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば，全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである），アンチセンス領域に存在する１またはそれ以上のプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。センス領域および／またはアンチセンス領域は末端キャップ修飾を有することができ，これは任意にセンスおよび／またはアンチセンス配列の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に存在していてもよい。センスおよび／またはアンチセンス領域はさらに任意に約１−約４個（例えば，約１，２，３，または４個）の２’−デオキシヌクレオチドを有する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有していてもよい。オーバーハングヌクレオチドはさらに１またはそれ以上の（例えば，約１，２，３，４個またはそれ以上）のホスホロチオエート，ホスホノアセテート，および／またはチオホスホノアセテートヌクレオチド間結合を含むことができる。上述の態様のいずれかにおいて，あるいは，センス領域に存在するプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである），およびアンチセンス領域に存在する１またはそれ以上のプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。また，これらの態様のいずれかにおいて，あるいは，センス領域に存在する１またはそれ以上のプリンヌクレオチドは，プリンリボヌクレオチドであり（例えば，全てのプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドである），アンチセンス領域に存在する任意のプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。さらに，これらの態様のいずれかにおいて，センス領域に存在するか，および／またはアンチセンス領域に存在する１またはそれ以上のプリンヌクレオチドは，あるいは，２’−デオキシヌクレオチド，ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド，２’−メトキシエチルヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択される（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチド，ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド，２’−メトキシエチルヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択されるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが，２’−デオキシヌクレオチド，ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド，２’−メトキシエチルヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択される）。
別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子に存在する任意の修飾ヌクレオチドは，好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖に存在するが，任意にセンスおよび／またはアンチセンス鎖とセンス鎖との両方に存在していてもよく，これは天然に生ずるリボヌクレオチドと類似する特性または特徴を有する修飾ヌクレオチドを含む。例えば，本発明は，ノザンコンフォメーション（例えば，ノザン偽回転サイクル，例えば，Ｓａｅｎｇｅｒ，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇｅｄ．，１９８４を参照）を有する修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。このように，本発明の化学的に修飾されたヌクレオチドｓｉＮＡに存在する分子は，好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖，または任意にセンスおよび／またはアンチセンス鎖およびセンス鎖の両方に存在し，これはヌクレアーゼ分解に対して耐性であり，同時にＲＮＡｉを媒介する能力を保持している。ノザンコンフィギュレーションを有するヌクレオチドの非限定的例としては，ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば，２´−Ｏ，４´−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチル，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド，２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド，２’−アジドヌクレオチド，２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド，４’−チオヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。
１つの態様においては，本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は，センス鎖の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に，末端キャップ成分，例えば，逆位デオキシ無塩基成分を含む。
１つの態様においては，本発明は，細胞内でまたは再構成されたインビトロ系でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる化学的に修飾された短干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）を特徴とし，ここで，化学修飾は，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子に共有結合されたコンジュゲートを含む。本発明により企図されるコンジュゲートの非限定的例としては，Ｖａｒｇｅｅｓｅら，米国特許出願１０／４２７，１６０（２００３年４月３０日出願）（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるコンジュゲートおよびリガンドが挙げられる。別の態様においては，コンジュゲートは，生物分解性リンカーを介して化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子に共有結合されている。１つの態様においては，コンジュゲート分子は，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端に結合している。別の態様においては，コンジュゲート分子は，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の５’末端に結合している。さらに別の態様においては，コンジュゲート分子は，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖，アンチセンス鎖，または両方の鎖の３’末端および５’末端の両方またはこれらの任意の組み合わせに結合している。１つの態様においては，本発明のコンジュゲート分子は，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子の生物学的システム，例えば細胞へのデリバリーを容易にする分子を含む。別の態様においては，化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子に結合したコンジュゲート分子は，細胞レセプターのリガンド，例えば，天然に生ずる蛋白質リガンドに由来するペプチド；蛋白質局在化配列，例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他の補因子，例えば葉酸およびＮ−アセチルガラクトサミン；ポリマー，例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド，およびポリアミン，例えば，ＰＥＩ，スペルミンまたはスペルミジンである。化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子に結合することができる，本発明により企図される特異的コンジュゲート分子の例は，Ｖａｒｇｅｅｓｅら，米国特許出願１０／２０１，３９４（２００２年７月２２日出願）（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。使用されるコンジュゲートのタイプおよび本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲートの程度は，同時にｓｉＮＡがＲＮＡｉ活性を媒介する能力を維持しながら，ｓｉＮＡコンストラクトの改良された薬物動態学的プロファイル，生物利用性，および／または安定性について評価することができる。そのように，当業者は，種々のコンジュゲートで修飾されたｓｉＮＡコンストラクトをスクリーニングして，例えば，当該技術分野において一般に知られるように動物モデルにおいて，ｓｉＮＡコンジュゲート複合体がＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら，改良された特性を有するか否かを判定することができる。
１つの態様においては，本発明は，本発明の短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，ｓｉＮＡはさらに，ｓｉＮＡのセンス領域をｓｉＮＡのアンチセンス領域と連結するヌクレオチド，非ヌクレオチド，または混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを含む。１つの態様においては，ヌクレオチド，非ヌクレオチド，または混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーは，例えば，コンジュゲート成分をｓｉＮＡに結合させるために用いる。１つの態様においては，本発明のヌクレオチドリンカーは，２ヌクレオチド以上の長さ，例えば，約３，４，５，６，７，８，９，または１０ヌクレオチドの長さのリンカーでありうる。別の態様においては，ヌクレオチドリンカーは核酸アプタマーでありうる。
さらに別の態様においては，本発明の非ヌクレオチドリンカーは，無塩基ヌクレオチド，ポリエーテル，ポリアミン，ポリアミド，ペプチド，炭水化物，脂質，ポリ炭化水素，または他のポリマー性化合物（例えば，ポリエチレングリコール，例えば，２−１００個のエチレングリコールユニットを有するポリエチレングリコール）を含む。特定の例としては，Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９８７，１５：３１１３；Ｃｌｏａｄａ ｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：６３２４；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：５１０９；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９９３，２１：２５８５およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３，３２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３；ＭｃＣｕｒｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９１，１０：２８７；Ｊｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９３，３４：３０１；Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１，３０：９９１４；Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ８９／０２４３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／０６７３１；Ｄｕｄｙｃｚ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／１１９１０およびＦｅｒｅｎｔｚ ａｎｄ Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：４０００（全て本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるものが含まれる。"非ヌクレオチド"はさらに，１またはそれ以上のヌクレオチドユニット，例えば糖および／またはホスフェート置換の代わりに核酸鎖中に取り込ませ留ことができ，残りの塩基がその酵素活性を示すことができる任意の基または化合物を意味する。基または化合物は，一般に認識されているヌクレオチド塩基，例えば，アデノシン，グアニン，シトシン，ウラシルまたはチミンを，例えば糖のＣ１位に含まないという点において，無塩基であってもよい。
１つの態様においては，本発明は，細胞または再構成されたインビトロ系でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし，ここで，２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てられたｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖は，リボヌクレオチドを含まない。例えば，ｓｉＮＡ分子は，単一のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ，ここで，ｓｉＮＡのセンス領域およびアンチセンス領域はオリゴヌクレオチド中にリボヌクレオチド（例えば，２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まない別々のオリゴヌクレオチドを含む。別の例においては，ｓｉＮＡ分子は単一のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ，ここで，ｓｉＮＡのセンス領域およびアンチセンス領域は本明細書に記載されるヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーにより連結されているかまたは環状化されており，オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド中にリボヌクレオチド（例えば，２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まない。本出願人は，ｓｉＮＡ分子中にリボヌクレオチド（例えば，２’−ヒドロキシル基を有するヌクレオチド）が存在することはＲＮＡｉ活性を支持するのに必要ではないかまたは必須ではないことを見いだした。そのように，１つの態様においては，ｓｉＮＡ中の全ての位置は，細胞内においてｓｉＮＡ分子がＲＮＡｉ活性を支持する能力が維持される程度に，化学的に修飾されたヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチド，例えば，式Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ，またはＶＩＩを有するヌクレオチドおよびまたは非ヌクレオチドまたはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的核酸配列に対する相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含む，細胞または再構成されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖ｓｉＮＡ分子である。別の態様においては，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は，５’末端ホスフェート基を含む。別の態様においては，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は，５’末端ホスフェート基および３’末端ホスフェート基（例えば，２’，３’−環状ホスフェート）を含む。別の態様においては，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は，約１５−約３０個（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０個）のヌクレオチドを含む。さらに別の態様においては，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は，本明細書に記載される１またはそれ以上の化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。例えば，ｓｉＮＡ分子中の全ての位置は，ｓｉＮＡ分子が細胞内でＲＮＡｉ活性を指示する能力が維持される程度に，化学的に修飾されたヌクレオチド，例えば，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド，またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，細胞または再構成されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖ｓｉＮＡ分子であり，これは，標的核酸配列に相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み，ここで，ｓｉＮＡ中に存在する１またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば，全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである），かつ，アンチセンス領域に存在する任意のプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである），そして，アンチセンス配列の３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に存在していてもよい末端キャップ修飾を含む。ｓｉＮＡはさらに，約１−約４個またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４個またはそれ以上）の末端２’−デオキシヌクレオチドをｓｉＮＡ分子の３’末端に含んでいてもよく，ここで，末端ヌクレオチドはさらに１またはそれ以上の（例えば，１，２，３，４個またはそれ以上の）ホスホロチオエート，ホスホノアセテート，および／またはチオホスホノアセテートヌクレオチド間結合を含んでいてもよく，ｓｉＮＡはさらに末端ホスフェート基，例えば，５’末端ホスフェート基を含んでいてもよい。これらの態様のいずれにおいても，アンチセンス領域に存在する任意のプリンヌクレオチドは，あるいは，２’−デオキシプリンヌクレオチドであってもよい（例えば，全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。また，これらの態様のいずれにおいても，ｓｉＮＡ中に存在する任意のプリンヌクレオチド（すなわち，センスおよび／またはアンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチド）は，あるいは，ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドであってもよい（例えば，すべてのプリンヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドである）。また，これらの態様のいずれにおいても，ｓｉＮＡ中に存在する任意のプリンヌクレオチドは，あるいは，２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドであり（例えば，すべてのプリンヌクレオチドが２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドであるか，または１つおきの複数のプリンヌクレオチドが２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドである）。別の態様においては，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在する任意の修飾ヌクレオチドは，天然に生ずるリボヌクレオチドと類似した特性または特徴を有する修飾ヌクレオチドを含む。例えば，本発明は，ノザンコンフォメーション（例えば，ノザン偽回転（ｐｓｅｕｄｏｒｏｔａｔｉｏｎ）サイクル（例えば，Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｅｄ．，１９８４を参照）を有する修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。このように，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在する化学的に修飾されたヌクレオチドは，好ましくはヌクレアーゼ分解に対して耐性であるが，同時にＲＮＡｉを媒介する能力を維持する。
１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド（例えば，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有するもの，例えば，２’−デオキシ，２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド）を，ｓｉＮＡ分子の１またはそれ以上の鎖または領域中の交互の位置に含む。例えば，そのような化学修飾は，ｓｉＮＡの３’末端または５’末端から１番目または２番目のヌクレオチドのいずれかから出発して，ＲＮＡ系ｓｉＮＡ分子の１つおきの位置に導入することができる。非限定的例においては，ｓｉＮＡの各鎖が２１ヌクレオチドの長さである本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は，各鎖の１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９および２１位が化学的に修飾されていることを特徴とする（例えば，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有する化合物，例えば，２’−デオキシ，２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで）。別の非限定的例においては，ｓｉＮＡの各鎖が２１ヌクレオチドの長さである本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は，各鎖の２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，および２０位が化学的に修飾されていることを特徴とする（例えば，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有する化合物，例えば，２’−デオキシ，２’−デオキシ−２’−フルオロ，４’−チオ，２’−Ｏ−トリフルオロメチル，２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ，２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで）。そのようなｓｉＮＡ分子は，さらに本明細書に記載される末端キャップ成分および／または主鎖修飾を含むことができる。
１つの態様においては，本発明は，本発明の生物学的に活性な分子，例えば，ポリヌクレオチド分子（例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子）を被験者または生物の細胞にデリバリーまたは投与する方法を特徴とし，この方法は，本発明の処方分子組成物を，処方分子組成物のポリヌクレオチド成分のデリバリーに適した条件下で，被験者または生物の細胞に投与することを含む。別の態様においては，細胞は，例えば，肺細胞，肝臓細胞，ＣＮＳ細胞，ＰＮＳ細胞，腫瘍細胞，腎臓細胞，血管細胞，皮膚細胞，眼細胞，または耳の細胞である。
１つの態様においては，本発明は，本発明の生物学的に活性な分子，例えば，ポリヌクレオチド分子（例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子）を被験者または生物の肝臓または肝臓細胞（例えば，肝細胞）にデリバリーまたは投与する方法を特徴とし，この方法は，本発明の処方分子組成物を，処方分子組成物のポリヌクレオチド成分のデリバリーに適した条件下で，被験者または生物の肝臓または肝臓細胞（例えば，肝細胞）に投与することを含む。
１つの態様においては，本発明は，細胞中で標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，この方法は，本発明の処方分子組成物を，細胞における標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で細胞中に導入することを含む。１つの態様においては，細胞は肝臓細胞（例えば，肝細胞）である。別の態様においては，細胞は，例えば，肺細胞，ＣＮＳ細胞，ＰＮＳ細胞，腫瘍細胞，腎臓細胞，血管細胞，皮膚細胞，眼細胞，または耳の細胞である。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。
別の態様においては，本発明は，細胞中で２以上の標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし，この方法は，細胞における標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，本発明の処方分子組成物を細胞に導入することを含む。１つの態様においては，細胞は肝臓細胞（例えば，肝細胞）である。別の態様においては，細胞は，例えば，肺細胞，ＣＮＳ細胞，ＰＮＳ細胞，腫瘍細胞，腎臓細胞，血管細胞，皮膚細胞，眼細胞，または耳の細胞である。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において遺伝子発現に関連する疾病，疾患，形質または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含む。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，遺伝子発現の低下，したがってそれぞれの蛋白質／ＲＮＡのレベルの低下は，疾病，疾患，形質または状態の症状をある程度軽減する。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において癌を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含み，このことにより癌の治療または予防を達成することができる。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，癌性細胞および組織に局所投与することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，被験者または生物において癌の維持または発達に関与する組織または細胞に全身投与（例えば，処方分子組成物の静脈内または皮下投与により）することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。本発明の処方分子組成物は，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるようにして処方またはコンジュゲートして，被験者または生物の適当な組織または細胞を標的とすることができる。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において，増殖性疾病または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含み，このことにより，増殖性疾病または状態の治療または予防を達成することができる。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，増殖性疾病に関与する細胞および組織に局所投与することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，被験者または生物において増殖性疾病または状態の維持または発達に関与する組織または細胞に全身投与（例えば，処方分子組成物の静脈内または皮下投与により）することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。本発明の処方分子組成物は，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるようにして処方またはコンジュゲートして，被験者または生物の適当な組織または細胞を標的とすることができる。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において移植および／または組織拒絶（同種移植片拒絶）を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含み，このことにより，移植および／または組織拒絶（同種移植片拒絶）の治療または予防を達成することができる。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，移植および／または組織拒絶（同種移植片拒絶）に関与する細胞および組織に局所投与することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，被験者または生物において移植および／または組織拒絶（同種移植片拒絶）の維持または発達に関与する組織または細胞に全身投与（例えば，処方分子組成物の静脈内または皮下投与により）することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。本発明の処方分子組成物は，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるようにして処方またはコンジュゲートして，被験者または生物の適当な組織または細胞を標的とすることができる。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において自己免疫疾病，疾患，形質または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含み，このことにより，自己免疫疾病，疾患，形質または状態の治療または予防を達成することができる。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，自己免疫疾病，疾患，形質または状態に関与する細胞および組織に局所投与することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，被験者または生物において自己免疫疾病，疾患，形質または状態の維持または発達に関与する組織または細胞に全身投与（例えば，処方分子組成物の静脈内または皮下投与により）することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。本発明の処方分子組成物は，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるようにして処方またはコンジュゲートして，被験者または生物の適当な組織または細胞を標的とすることができる。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において感染性疾病，疾患，形質または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含み，このことにより，感染性疾病，疾患，形質または状態の治療または予防を達成することができる。１つの態様においては，処方分子組成物はポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，感染性疾病，疾患，形質または状態に関与する細胞および組織に局所投与することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，被験者または生物において感染性疾病，疾患，形質または状態の維持または発達に関与する組織または細胞に全身投与（例えば，処方分子組成物の静脈内または皮下投与により）することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。本発明の処方分子組成物は，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるようにして処方またはコンジュゲートして，被験者または生物の適当な組織または細胞を標的とすることができる。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において加齢関連疾病，疾患，形質または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含み，このことにより，加齢関連疾病，疾患，形質または状態の治療または予防を達成することができる。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，加齢関連疾病，疾患，形質または状態に関与する細胞および組織に局所投与することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，被験者または生物において加齢関連疾病，疾患，形質または状態の維持または発達に関与する組織または細胞に全身投与（例えば，処方分子組成物の静脈内または皮下投与により）することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。本発明の処方分子組成物は，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるようにして処方またはコンジュゲートして，被験者または生物の適当な組織または細胞を標的とすることができる。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において神経学的または神経変性性疾病，疾患，形質または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含み，このことにより，神経学的または神経変性性疾病，疾患，形質または状態の治療または予防を達成することができる。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，神経学的または神経変性性疾病，疾患，形質または状態に関与する細胞および組織に局所投与することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，被験者または生物において神経学的または神経変性性疾病，疾患，形質または状態の維持または発達に関与する組織または細胞に全身投与（例えば，処方分子組成物のカテーテル挿入，浸透圧ポンプ投与（例えば，髄腔内または心室内），静脈内または皮下投与）することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。本発明の処方分子組成物は，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるようにして処方またはコンジュゲートして，被験者または生物の標的適当な組織または細胞を標的とすることができる。１つの態様においては，神経疾患はハンチントン病である。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において代謝性疾病，疾患，形質または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含み，このことにより，代謝性疾病，疾患，形質または状態の治療または予防を達成することができる。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，代謝性疾病，疾患，形質または状態に関与する細胞および組織に局所投与することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，被験者または生物において代謝性疾病，疾患，形質または状態の維持または発達に関与する組織または細胞に全身投与（例えば，処方分子組成物の静脈内または皮下投与）することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。本発明の処方分子組成物は，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるようにして，処方またはコンジュゲートして，被験者または生物の適当な組織または細胞を標的とすることができる。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において心臓血管疾病，疾患，形質または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含み，このことにより心臓血管疾病，疾患，形質または状態の治療または予防を達成することができる。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，心臓血管疾病，疾患，形質または状態に関与する細胞および組織に局所投与することにより被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，被験者または生物において心臓血管疾病，疾患，形質または状態の維持または発達に関与する組織または細胞に全身投与（例えば，処方分子組成物の静脈内または皮下投与により）することにより被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。本発明の処方分子組成物は，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるようにして処方またはコンジュゲートして，被験者または生物の適当な組織または細胞を標的とすることができる。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において，呼吸器疾病，疾患，形質または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含み，このことにより，呼吸器疾病，疾患，形質または状態の治療または予防を達成することができる。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，呼吸器疾病，疾患，形質または状態に関与する細胞および組織に局所投与することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，被験者または生物において呼吸器疾病，疾患，形質または状態の維持または発達に関与する組織または細胞に全身投与（例えば，処方分子組成物の静脈内または皮下投与により）することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。本発明の処方分子組成物は，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるようにして処方またはコンジュゲートして，被験者または生物の適当な組織または細胞を標的とすることができる。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において眼科疾病，疾患，形質または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含み，このことにより，眼科疾病，疾患，形質または状態の治療または予防を達成することができる。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，眼科疾病，疾患，形質または状態に関与する細胞および組織に局所投与することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，被験者または生物において，眼科疾病，疾患，形質または状態の維持または発達に関与する組織または細胞に全身投与（例えば，処方分子組成物の静脈内または皮下投与により）することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。本発明の処方分子組成物は，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるようにして処方またはコンジュゲートして，被験者または生物の適当な組織または細胞を標的とすることができる。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において皮膚疾病，疾患，形質または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含み，このことにより，皮膚疾病，疾患，形質または状態の治療または予防を達成することができる。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，皮膚疾病，疾患，形質または状態に関与する細胞および組織に局所投与することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，被験者または生物において皮膚疾病，疾患，形質または状態の維持または発達に関与する組織または細胞に全身投与（例えば，処方分子組成物の静脈内または皮下投与により）することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。本発明の処方分子組成物は，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるようにして処方またはコンジュゲートして，被験者または生物の適当な組織または細胞を標的とすることができる。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において肝臓疾病，疾患，形質または状態（例えば，肝炎，ＨＣＶ，ＨＢＶ，糖尿病，肝硬変，肝細胞癌等）を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させ留ことを含み，このことにより肝臓疾病，疾患，形質または状態の治療または予防を達成することができる。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，肝臓細胞および肝臓疾病，疾患，形質または状態に関与する組織への局所投与により，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。１つの態様においては，本発明は，被験者または生物の関連する組織または細胞，例えば，肝臓疾病，疾患，形質または状態の維持または発達に関与する組織または細胞への全身投与により（例えば，処方分子組成物の静脈内または投与により），被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。本発明の処方分子組成物は，被験者または生物の適当な組織または細胞を標的とするように，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるように処方またはコンジュゲート化することができる。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において腎臓／腎性疾病，疾患，形質または状態（例えば，多発性嚢胞腎疾病等）を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させ，このことにより腎臓／腎性疾病，疾患，形質または状態の治療または予防を達成しうることを含む。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，腎臓／腎性細胞および腎臓／腎性疾病，疾患，形質または状態に関与する組織への局所投与により，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，被験者または生物において腎臓／腎性疾病，疾患，形質または状態の維持または発達に関与する組織または細胞に全身投与（例えば，処方分子組成物の静脈内または皮下投与）することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含む。本発明の処方分子組成物は，被験者または生物の適当な組織または細胞を標的とするように，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるように処方またはコンジュゲート化することができる。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において，聴覚疾病，疾患，形質または状態（例えば，聴力損失，難聴等）を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを含み，このことにより聴覚疾病，疾患，形質または状態の治療または予防を達成することができる。１つの態様においては，処方分子組成物は，ポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を含む。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，聴覚疾病，疾患，形質または状態に関与する耳，頭髪内（ｉｎｎｅｒｈｅａｒ）または中耳の細胞および組織に局所投与することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。１つの態様においては，本発明は，関連する組織または細胞，例えば，被験者または生物において聴覚疾病，疾患，形質または状態の維持または発達に関与する組織または細胞に全身投与（例えば，処方分子組成物の静脈内または皮下投与により）することにより，被験者または生物を本発明の処方分子組成物と接触させることを特徴とする。本発明の処方分子組成物は，被験者または生物の適当な組織または細胞を標的とするように，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるように処方またはコンジュゲート化することができる。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において本明細書に記載される疾病または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者または生物に本発明の処方分子組成物を投与することを含み；ここで，処方分子組成物は，被験者において，処方分子組成物で治療していない被験者と比較して標的遺伝子発現のレベルを低下させるかまたは阻害するのに適した条件下で投与される。１つの態様においては，処方分子組成物は，脂質ナノ粒子および本発明のｓｉＮＡ分子を含む。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において，本明細書に記載される疾病または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者に本発明の処方分子組成物を投与することを含み；ここで，（ａ）処方分子組成物はセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸分子を含み；（ｂ）二本鎖核酸分子の各鎖は１５−２８ヌクレオチドの長さであり；（ｃ）センス鎖の少なくとも１５ヌクレオチドはアンチセンス鎖に相補的であり（ｄ）二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖は標的ＲＮＡに相補性を有しており；処方分子組成物は，被験者において，処方分子組成物で治療していない被験者と比較して標的ＲＮＡを低下させるかまたは阻害するのに適した条件下で投与される。１つの態様においては，処方分子組成物は脂質ナノ粒子および本発明のｓｉＮＡ分子を含む。
１つの態様においては，本発明は，被験者または生物において本明細書に記載される疾病または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者に本発明の処方分子組成物を投与することを含み；ここで，（ａ）処方分子組成物はセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸分子を含み；（ｂ）二本鎖核酸分子の各鎖は１５−２８ヌクレオチドの長さであり；（ｃ）センス鎖の少なくとも１５ヌクレオチドはアンチセンス鎖に相補的であり（ｄ）二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖は標的ＲＮＡに相補性を有しており；（ｅ）二本鎖核酸分子の各鎖の内部ヌクレオチドの少なくとも２０％は，化学修飾を有する修飾ヌクレオシドであり；かつ（ｆ）化学修飾の少なくとも２つは互いに異なっており，そして，処方分子組成物は，処方分子組成物で治療していない被験者と比較して被験者における標的ＲＮＡのレベルを低下させるかまたは阻害するのに適した条件下で投与される。１つの態様においては，処方分子組成物は，脂質ナノ粒子および本発明のｓｉＮＡ分子を含む。
本発明の治療方法のいずれにおいても，処方分子組成物は，例えば，種々の時間間隔で，例えば，治療過程の間に１日に１回，治療過程の間に２日に１回，治療過程の間に３日に１回，治療過程の間に４日に１回，治療過程の間に５日に１回，治療過程の間に６日に１回，治療過程の間に１週間に１回，治療過程の間に１週おきに，治療過程の間に１ヶ月に１回などの治療過程として，被験者に投与することができる。１つの態様においては，治療過程は，１，２，３，４，５，６，７，８，９，または１０週ごとに１回である。１つの態様においては，治療過程は，約１−約５２週間またはそれ以上（例えば，永久に）である。１つの態様においては，治療過程は約１−約４８か月またはそれ以上（例えば，永久に）である。
１つの態様においては，治療過程は，最初の治療過程，例えば，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０週またはそれ以上の週ごとに１回を固定された期間（例えば，１ｘ，２ｘ，３ｘ，４ｘ，５ｘ，６ｘ，７ｘ，８ｘ，９ｘ，１０ｘまたはそれ以上），次に維持治療過程，例えば，４，６，８，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，またはそれ以上の週にごとに１回をさらに別の固定された期間（例えば，１ｘ，２ｘ，３ｘ，４ｘ，５ｘ，６ｘ，７ｘ，８ｘ，９ｘ，１０ｘまたはそれ以上）の治療を含む。
本発明の治療方法のいずれにおいても，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られる他の方法により，処方分子組成物を被験者に全身投与することができる。全身投与は，当該技術分野において一般に知られるように，例えば，静脈内，皮下，筋肉内，カテーテル挿入，鼻咽頭，経皮，または胃腸投与を含むことができる。
１つの態様においては，本発明の治療または予防のいずれの方法においても，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるようにして，処方分子組成物を被験者に局所的にまたは局所組織に投与することができる。局所投与には，例えば，関連する組織へのカテーテル投与，移植，浸透圧ポンプ，直接注入，皮膚／経皮適用，ステント，点耳薬／点眼薬，または門脈投与，または当該技術分野において一般に知られる他の任意の局所投与手法，方法または手順が含まれる。
１つの態様においては，本発明は，薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に本発明の処方分子組成物を含む組成物を特徴とする。別の態様においては，本発明は，１またはそれ以上の遺伝子を標的とする本発明の処方分子組成物を薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む医薬組成物を特徴とする。別の態様においては，本発明は，被験者において疾病または状態を診断する方法を特徴とし，この方法は，被験者における疾病または状態の診断に適した条件下で被験者に本発明の処方分子組成物を投与することを含む。別の態様においては，本発明は，被験者において疾病，形質，または状態を治療または予防する方法を特徴とし，この方法は，被験者において疾病，形質または状態を治療または予防するのに適した条件下で，本発明の処方分子組成物を，単独で，または１またはそれ以上の他の治療用化合物と組み合わせて，被験者に投与することを含む。
１つの態様においては，本発明のポリヌクレオチド分子，例えば，限定されないが，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子を合成する方法は，Ｓｃａｒｉｎｇｅら，米国特許５，８８９，１３６；６，００８，４００；および６，１１１，０８６（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）の教示を含む。
別の態様においては，本発明は，ヌクレアーゼ耐性が増加した処方ポリヌクレオチド（例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子）組成物を生成する方法を特徴とし，この方法は，（ａ）本発明の処方分子組成物のポリヌクレオチド成分に修飾ヌクレオチドを導入し，そして（ｂ）ヌクレアーゼ耐性が増加した処方ポリヌクレオチド組成物を単離するのに適した条件下で工程（ａ）の処方分子組成物をアッセイする，ことを含む。
別の態様においては，本発明は，毒性プロファイルが改良された（例えば，免疫刺激特性が弱められているかこれを有しない）ポリヌクレオチド（例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子）分子を生成する方法を特徴とし，この方法は，（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド（例えば，表Ｉに示されるｓｉＮＡモチーフ）またはこれらの任意の組み合わせをポリヌクレオチド分子に導入し，そして（ｂ）毒性プロファイルが改良されたｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で工程（ａ）のポリヌクレオチド分子をアッセイする，ことを含む。
別の態様においては，本発明は，毒性プロファイルが改良された（例えば，免疫刺激特性が弱められているかこれを有しない）処方ｓｉＮＡ組成物を生成する方法を特徴とし，この方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子および本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるデリバリーベヒクルまたはデリバリー粒子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を生成し，そして（ｂ）毒性プロファイルが改良された処方ｓｉＮＡ組成物を単離するのに適した条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ処方物をアッセイする，ことを含む。
別の態様においては，本発明は，細胞，被験者，または生物においてインターフェロン応答を刺激しない（例えば，インターフェロン応答がないかまたはインターフェロン応答が弱められている）ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし，この方法は，（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド（例えば，表Ｉに示されるｓｉＮＡモチーフ）またはこれらの任意の組み合わせをｓｉＮＡ分子に導入し，そして（ｂ）インターフェロン応答を刺激しないｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。
別の態様においては，本発明は，細胞，被験者，または生物において，インターフェロン応答を刺激しない（例えば，インターフェロン応答がないかまたはインターフェロン応答が弱められている）処方ｓｉＮＡ組成物を生成する方法を特徴とし，この方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子および本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるデリバリーベヒクルまたはデリバリー粒子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を生成し，そして（ｂ）インターフェロン応答を刺激しない処方ｓｉＮＡ組成物を単離するのに適した条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ処方物をアッセイする，ことを含む。１つの態様においては，インターフェロンはインターフェロンアルファを含む。
別の態様においては，本発明は，細胞，被験者，または生物において，炎症性またはプロ炎症性サイトカイン応答を刺激しない（例えば，サイトカイン応答がないかまたはサイトカイン応答が弱められている），ｓｉＮＡ分子を生成することを特徴とし，この方法は，（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド（例えば，表Ｉに示されるｓｉＮＡモチーフ）またはこれらの任意の組み合わせをｓｉＮＡ分子に導入し，そして（ｂ）サイトカイン応答を刺激しないｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。１つの態様においては，サイトカインは，インターロイキン，例えばインターロイキン−６（ＩＬ−６）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）を含む。
別の態様においては，本発明は，細胞，被験者，または生物において，炎症性またはプロ炎症性サイトカイン応答を刺激しない（例えば，サイトカイン応答がないかまたはサイトカイン応答が弱められている）処方ｓｉＮＡ組成物を生成する方法を特徴とし，この方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子および本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるデリバリーベヒクルまたはデリバリー粒子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を生成し，そして（ｂ）サイトカイン応答を刺激しない処方ｓｉＮＡ組成物を単離するのに適した条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ処方物をアッセイする，ことを含む。１つの態様においては，サイトカインは，インターロイキン，例えば，インターロイキン−６（ＩＬ−６）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）を含む。
別の態様においては，本発明は，細胞，被験者，または生物において，Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）応答を刺激しない（例えば，ＴＬＲ応答がないかまたはＴＬＲ応答が弱められている）ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし，この方法は，（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド（例えば，表Ｉに示されるｓｉＮＡモチーフ）またはこれらの任意の組み合わせをｓｉＮＡ分子中に導入し，そして（ｂ）ＴＬＲ応答を刺激しないｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，ことを含む。１つの態様においては，ＴＬＲは，ＴＬＲ３，ＴＬＲ７，ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９を含む。
別の態様においては，本発明は，細胞，被験者，または生物においてＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）応答を刺激しない（例えば，ＴＬＲ応答がないかまたはＴＬＲ応答が弱められている）処方ｓｉＮＡ組成物を生成する方法を特徴とし，この方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子および本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られるデリバリーベヒクルまたはデリバリー粒子を含む処方ｓｉＮＡ組成物を生成し，そして（ｂ）ＴＬＲ応答を刺激しない処方ｓｉＮＡ組成物を単離するのに適した条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ処方物をアッセイすることを含む。１つの態様においては，ＴＬＲは，ＴＬＲ３，ＴＬＲ７，ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９を含む。
"改良された毒性プロファイル"とは，ポリヌクレオチド，処方分子組成物，ｓｉＮＡまたは処方ｓｉＮＡ組成物が，細胞，被験者，または生物において，より少ない修飾または改良された毒性学を付与する効果がより低い修飾を有する非修飾ポリヌクレオチド，処方分子組成物，ｓｉＮＡまたは処方ｓｉＮＡ組成物，またはｓｉＮＡ分子と比較して，低下した毒性を示すことを意味する。非限定的例においては，毒性プロファイルが改良されているポリヌクレオチド，処方分子組成物，ｓｉＮＡｓまたは処方ｓｉＮＡ組成物は，細胞，被験者，または生物において，より少ない修飾または改良された毒性学を付与する効果がより低い修飾を有する非修飾ポリヌクレオチド，処方分子組成物，ｓｉＮＡまたは処方ｓｉＮＡ組成物，またはポリヌクレオチド（例えば，ｓｉＮＡ）分子と比較して，免疫刺激特性の低下，例えば，免疫刺激性応答の低下，減少または減弱化と関連する。そのような改良された毒性プロファイルは，無効のまたは低下した免疫刺激，例えば，インターフェロン（例えば，インターフェロンアルファ），炎症性サイトカイン（例えば，インターロイキン，例えばＩＬ−６，および／またはＴＮＦ−アルファ），および／またはｔｏｌｌ様レセプター（例えば，ＴＬＲ−３，ＴＬＲ−７，ＴＬＲ−８，および／またはＴＬＲ−９）の誘導が低下するかまたは無効であることを特徴とする。１つの態様においては，毒性学的プロファイルが改良されているポリヌクレオチド，処方分子組成物，ｓｉＮＡまたは処方ｓｉＮＡ組成物は，リボヌクレオチドを含まない。１つの態様においては，毒性学的プロファイルが改良されているポリヌクレオチド，処方分子組成物，ｓｉＮＡまたは処方ｓｉＮＡ組成物は，５個未満のリボヌクレオチド（例えば，１，２，３，または４個のリボヌクレオチド）を含む。１つの態様においては，毒性学的プロファイルが改良されているｓｉＮＡまたは処方ｓｉＮＡ組成物は，Ｓｔａｂ７，Ｓｔａｂ８，Ｓｔａｂ１１，Ｓｔａｂ１２，Ｓｔａｂ１３，Ｓｔａｂ１６，Ｓｔａｂ１７，Ｓｔａｂ１８，Ｓｔａｂ１９，Ｓｔａｂ２０，Ｓｔａｂ２３，Ｓｔａｂ２４，Ｓｔａｂ２５，Ｓｔａｂ２６，Ｓｔａｂ２７，Ｓｔａｂ２８，Ｓｔａｂ２９，Ｓｔａｂ３０，Ｓｔａｂ３１，Ｓｔａｂ３２，Ｓｔａｂ３３，Ｓｔａｂ３４またはこれらの任意の組み合わせを含む（表Ｉを参照）。本明細書では，数字付きのＳｔａｂ化学は，表ＩＶに示される化学の２’−フルオロおよび２’−ＯＣＦ３版の両方を含む。例えば，"Ｓｔａｂ７／８"は，Ｓｔａｂ７／８およびＳｔａｂ７Ｆ／８Ｆの両方を表す。１つの態様においては，毒性学的プロファイルが改良されているｓｉＮＡまたは処方ｓｉＮＡ組成物は，米国特許公開２００３００７７８２９（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるｓｉＮＡ分子を含む。
１つの態様においては，所定のポリヌクレオチド，処方分子組成物，ｓｉＮＡ分子または処方ｓｉＮＡ組成物と関連する免疫刺激性応答のレベルは，本明細書に記載されるようにして，または当該技術分野において知られるようにして，例えば，特定のポリヌクレオチド分子の免疫刺激性応答を定量するアッセイにおいて，ＰＫＲ／インターフェロン応答，増殖，Ｂ−細胞活性化，および／またはサイトカイン産生のレベルを測定することにより，測定することができる（例えば，Ｌｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２６，３１３−９；および米国特許５，９６８，９０９（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。１つの態様においては，低下した免疫刺激性応答は，修飾されていないかまたは最小限に修飾されているｓｉＲＮＡ分子と比較して，約１０％−約１００％の範囲であり，例えば，約１０％，２０％，３０％，４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％または１００％低下した免疫刺激性応答である。１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子に関連する免疫刺激性応答は，化学修飾の程度により調節することができる。例えば，ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド位置の約１０％−約１００％，例えば，約１０％，２０％，３０％，４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％または１００％が修飾されている，本明細書に記載される対応する程度の免疫刺激特性を有するｓｉＮＡ分子を選択することができる。
１つの態様においては，低下した免疫刺激性応答の程度は，ＲＮＡｉ活性を最適化するよう選択することができる。例えば，ウイルス感染を治療するためにはある程度の免疫刺激を保持することが好ましく，最大抗ウイルス活性のためには免疫刺激の１００％未満の低下が好ましいであろうが（例えば，免疫刺激の約１０％，２０％，３０％，４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，または９０％の低下），一方，外因性遺伝子標的の発現の阻害は，非特異的毒性またはオフ標的効果を防止するために，最少の免疫刺激特性（例えば，免疫刺激の約９０％−約１００％の低下）を有するｓｉＮＡ分子を用いることが好ましいであろう。
１つの態様においては，本発明の処方ｓｉＮＡ組成物は，組成物が処方ｓｉＮＡ組成物のｓｉＮＡ成分により媒介されるＲＮＡｉの効力を妨害しないか，または細胞に毒性とならないように，組成物が細胞に対して毒性ではないかまたは最少の毒性プロファイルを有するように設計される。
本明細書において用いる場合，"処方分子組成物"または"脂質ナノ粒子"，または"脂質ナノ粒子組成物"または"ＬＮＰ"との用語は，１またはそれ以上の生物学的に活性な分子を，独立してまたはカチオン性脂質，中性脂質，および／またはポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（すなわち，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢ）コンジュゲートと組み合わせて含む組成物を表す。処方分子組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含むことができる（図５を参照）。本発明のカチオン性脂質は，式ＣＬＩ，ＣＬＩＩ，ＣＬＩＩＩ，ＣＬＩＶ，ＣＬＶ，ＣＬＶＩ，ＣＬＶＩＩ，ＣＬＶＩＩＩ，ＣＬＩＸ，ＣＬＸ，ＣＬＸＩ，ＣＬＸＩＩ，ＣＬＸＩＩＩ，ＣＬＸＩＶ，ＣＬＸＶ，ＣＬＸＶＩ，ＣＬＸＶＩＩ，ＣＬＸＶＩＩＩ，ＣＬＸＩＸ，ＣＬＸＸ，ＣＬＸＸＩ，ＣＬＸＸＩＩ，ＣＬＸＸＩＩＩ，ＣＬＸＸＩＶ，ＣＬＸＸＶ，ＣＬＸＸＶＩ，ＣＬＸＸＶＩＩ，ＣＬＸＸＶＩＩＩ，ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有する化合物，塩化Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＣ），臭化Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ），塩化Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ），塩化Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ），Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ），１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ），１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＣＤＡＰ），１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ），３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ），２−［５’−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９’，１２’−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ），Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）および／またはこれらの混合物を含むことができる。中性脂質は，ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ），パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ），卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ），ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ），コレステロール，および／またはこれらの混合物を含むことができる。ＰＥＧコンジュゲートは，ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６），ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８），ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６），ＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢを含むことができる。カチオン性脂質成分は，処方物中に存在する総脂質の約２％−約６０％，約５％−約４５％，約５％−約１５％，または約４０％−約５０％を含むことができる。中性脂質成分は，処方物中に存在する総脂質の約５％−約９０％，または約２０％−約８５％を含むことができる。ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲート（例えば，ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ），ＰＥＧ−コレステロール，ｏｒＰＥＧ−ＤＭＢ）は，処方物中に存在する総脂質の約１％−約２０％，または約４％−約１５％を含むことができる。コレステロール成分は，処方物中に存在する総脂質の約１０％−約６０％，または約２０％−約４５％を含むことができる。１つの態様においては，本発明の処方分子組成物は，処方物中に存在する総脂質の約７．５％を含むカチオン性脂質成分，処方物中に存在する総脂質約８２．５％を含む中性脂質，および処方物中に存在する総脂質の約１０％を含むＰＥＧコンジュゲートを含むことができる。１つの態様においては，本発明の処方分子組成物は，生物学的に活性な分子，ＤＯＤＭＡ，ＤＳＰＣ，およびＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートを含むことができる。１つの態様においては，ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートは，ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６），またはＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）である。別の態様においては，処方分子組成物はまた，コレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。１つの態様においては，処方分子組成物は表ＩＶに示される脂質ナノ粒子処方物を含む。
本明細書において用いる場合，"処方ｓｉＮＡ組成物"との用語は，１またはそれ以上のｓｉＮＡ分子または１またはそれ以上のｓｉＮＡ分子をコードするベクターを，独立してまたはカチオン性脂質，中性脂質，および／またはポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）またはＰＥＧ−コレステロール（ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ）コンジュゲートとの組み合わせで含む組成物を表す。処方ｓｉＮＡ組成物はさらにコレステロールまたはコレステロール誘導体を含むことができる。本発明のカチオン性脂質は，式ＣＬＩ，ＣＬＩＩ，ＣＬＩＩＩ，ＣＬＩＶ，ＣＬＶ，ＣＬＶＩ，ＣＬＶＩＩ，ＣＬＶＩＩＩ，ＣＬＩＸ，ＣＬＸ，ＣＬＸＩ，ＣＬＸＩＩ，ＣＬＸＩＩＩ，ＣＬＸＩＶ，ＣＬＸＶ，ＣＬＸＶＩ，ＣＬＸＶＩＩ，ＣＬＸＶＩＩＩ，ＣＬＸＩＸ，ＣＬＸＸ，ＣＬＸＸＩ，ＣＬＸＸＩＩ，ＣＬＸＸＩＩＩ，ＣＬＸＸＩＶ，ＣＬＸＸＶ，ＣＬＸＸＶＩ，ＣＬＸＸＶＩＩ，ＣＬＸＸＶＩＩＩ，ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有する化合物，塩化Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＣ），臭化Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ），塩化Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ），塩化Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ），Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ），１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ），１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＣＤＡＰ），１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ），３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ），２−［５’−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９’，１２’−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ），Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）および／またはこれらの混合物を含むことができる。中性脂質は，式ＮＬＩ−ＮＬＶＩＩのいずれかを有する化合物，ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ），パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ），卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ），ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ），コレステロール，および／またはこれらの混合物を含むことができる。ＰＥＧコンジュゲートは，ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６），ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８），ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６），ＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８），ＰＥＧ−コレステロール，またはＰＥＧ−ＤＭＢを含むことができる。カチオン性脂質成分は，処方物中に存在する総脂質の約２％−約６０％，約５％−約４５％，約５％−約１５％，または約４０％−約５０％を含むことができる。中性脂質成分は，処方物中に存在する総脂質の約５％−約９０％，または約２０％−約８５％を含むことができる。ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートは，処方物中に存在する総脂質の約１％−約２０％，または約４％−約１５％を含むことができる。コレステロール成分は，処方物中に存在する総脂質の約１０％−約６０％，または約２０％−約４５％を含むことができる。１つの態様においては，本発明の処方ｓｉＮＡ組成物は，処方物中に存在する総脂質の約７．５％を含むカチオン性脂質成分，処方物中に存在する総脂質の約８２．５％を含む中性脂質，および処方物中に存在する総脂質の約１０％を含むＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートを含むことができる。１つの態様においては，本発明の処方ｓｉＮＡ組成物は，ｓｉＮＡ分子，ＤＯＤＭＡ，ＤＳＰＣ，およびＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートを含む。１つの態様においては，ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートは，ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６），またはＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）である。別の態様においては，処方ｓｉＮＡ組成物はまたコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。
本明細書において用いる場合，"カチオン性脂質"とは，カチオン性電荷を有する任意の親油性化合物，例えば，式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有する化合物を意味する。
本明細書において用いる場合，"中性脂質"とは，カチオン性ではない電荷（例えば，アニオン性または中性の電荷）を有する任意の親油性化合物を意味する。
"ＰＥＧ"とは，任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルまたは同等のポリマーを意味する。
"ナノ粒子"とは，そのサイズがナノメーターのオーダーで測定される微細な粒子を意味する。本発明のナノ粒子は，典型的には直径約１−約９９９ｎｍの範囲であり，カプセル化または封入された生物学的に活性な分子を含むことができる。
"マイクロ粒子"とはそのサイズがマイクロメーターのオーダーでで測定される微細な粒子を意味する。本発明のマイクロ粒子は，典型的には直径約１−約１００マイクロメーターの範囲であり，カプセル化または封入された生物学的に活性な分子を含むことができる。
本明細書において用いる場合，"短干渉核酸"，"ｓｉＮＡ"，"短干渉ＲＮＡ"，"ｓｉＲＮＡ"，"短干渉核酸分子"，"短干渉オリゴヌクレオチド分子"，および"化学的に修飾された短干渉核酸分子"との用語は，配列特異的様式でＲＮＡ干渉"ＲＮＡｉ"または遺伝子サイレンシングを媒介することにより遺伝子発現またはウイルス複製を阻害またはダウンレギュレートすることができる任意の核酸分子を表す（ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１０６３９０（ＷＯ０５／１９４５３），米国特許出願１０／４４４，８５３（２００３年５月２３日出願），米国特許出願１０／９２３，５３６（２００４年８月２０日出願），米国特許出願１１／２３４，７３０（２００５年９月２３日出願）または米国特許出願１１／２９９，２５（２００５年１２月８日出願）（すべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。例えば，ｓｉＮＡは，自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖核酸分子であることができ，ここで，アンチセンス領域は標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは，２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てられていてもよく，ここで，一方の鎖はセンス鎖であり，他方の鎖はアンチセンス鎖であり，アンチセンス鎖およびセンス鎖は自己相補的である（すなわち，各鎖は他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む；例えば，アンチセンス鎖およびセンス鎖は，デュープレックスまたは二本鎖構造を形成し，ここで，例えば，二本鎖領域は約１５−約３０，例えば約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９または３０塩基対である；アンチセンス鎖は，標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む（例えば，ｓｉＮＡ分子の約１５−約２５またはそれ以上のヌクレオチドが標的核酸またはその一部に相補的である）。あるいは，ｓｉＮＡは単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられていてもよく，ここで，ｓｉＮＡの自己相補的センス領域およびアンチセンス領域は，核酸系または非核酸系のリンカーにより連結されている。ｓｉＮＡは自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を有するデュープレックス，非対称デュープレックス，ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造のポリヌクレオチドであることができ，ここで，アンチセンス領域は，別個の標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域は，標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは，２またはそれ以上のループ構造および自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく，ここで，アンチセンス領域は標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域は，標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し，環状ポリヌクレオチドは，インビボまたはインビトロでプロセシングされて，ＲＮＡｉを媒介しうる活性なｓｉＮＡ分子を生ずることができる。ｓｉＮＡはまた，標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含んでいてもよく（例えば，そのようなｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子中に標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列が存在することを必要としない），一本鎖ポリヌクレオチドはさらに，末端リン酸基，例えば，５’−リン酸（例えば，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３−５７４およびＳｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１０，５３７−５６８を参照），または５’，３’−ジホスフェートを含むことができる。ある態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，別々のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含み，ここで，センス領域およびアンチセンス領域は，当該技術分野において知られるようにヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子により共有結合で連結されていてもよく，あるいは，イオン性相互作用，水素結合，ファンデルワールス相互作用，疎水性相互作用，および／またはスタッキング相互作用により非共有結合で連結されていてもよい。ある態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子の発現の阻害を引き起こすような様式で，標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書において用いる場合，ｓｉＮＡ分子は，ＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はなく，さらに化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを包含する。ある態様においては，本発明の短干渉核酸分子は，２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを有しない。本出願人は，ある態様において，ＲＮＡｉを媒介するために２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要としない短干渉核酸を記載し，したがって，本発明の短干渉核酸分子は，任意に，リボヌクレオチド（例えば，２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まなくてもよい。しかし，ＲＮＡｉを支持するためにｓｉＮＡ分子中にリボヌクレオチドの存在を必要としないそのようなｓｉＮＡ分子は，２’−ＯＨ基を有する１またはそれ以上のヌクレオチドを含む結合したリンカーまたは他の結合したまたは会合した基，成分，または鎖を有していてもよい。任意に，ｓｉＮＡ分子は，ヌクレオチド位置の約５，１０，２０，３０，４０，または５０％にリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の修飾短干渉核酸分子は，短干渉修飾オリゴヌクレオチド"ｓｉＭＯＮ"と称することもできる。本明細書において用いる場合，ｓｉＮＡとの用語は，配列特異的ＲＮＡｉを媒介しうる核酸分子を記述するために用いられる他の用語，例えば，短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ），短干渉オリゴヌクレオチド，短干渉核酸，短干渉修飾オリゴヌクレオチド，化学修飾ｓｉＲＮＡ，転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）および他のものと同等であることを意味する。本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的例は，米国特許出願１１／２３４，７３０（２００５年９月２３日出願）（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に示される。そのようなｓｉＮＡ分子は，当該技術分野において知られる遺伝子発現の阻害を媒介する他の核酸技術，例えば，リボザイム，アンチセンス，トリプレックス形成，アプタマー，２，５−Ａキメラ，またはデコイオリゴヌクレオチドと区別される。
"ＲＮＡ干渉"または"ＲＮＡｉ"とは，当該技術分野において一般に知られているように細胞において遺伝子発現を阻害するかまたはダウンレギュレートし，短干渉核酸分子により媒介される生物学的過程を意味する（例えば，Ｚａｍｏｒｅ ａｎｄ Ｈａｌｅｙ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５１９−１５２４；Ｖａｕｇｈｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２５−１５２６；Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；およびＫｒｅｕｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ００／４４８９５；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ０１／３６６４６；Ｆｉｒｅ，国際公開ＷＯ９９／３２６１９；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ００／０１８４６；Ｍｅｌｌｏ ａｎｄ Ｆｉｒｅ，国際公開ＷＯ０１／２９０５８；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，国際公開ＷＯ９９／０７４０９；およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ００／４４９１４；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；およびＲｅｉｎｈａｒｔ＆Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１を参照）。さらに，本明細書において用いる場合，ＲＮＡｉとの用語は，配列特異的ＲＮＡ干渉，例えば，転写後遺伝子サイレンシング，翻訳阻害，転写阻害，またはエピジェネティックスを記述するために用いられる他の用語と同等であることを意味する。例えば，本発明のｓｉＮＡ分子を用いて，後成的遺伝学的に転写後のレベルまたは転写前のレベルの両方で遺伝子をサイレンシングすることができる。非限定的例においては，本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の後成的遺伝学的調節は，クロマチン構造またはメチル化パターンのｓｉＮＡ媒介性修飾により遺伝子発現が変化した結果として生じうる（例えば，Ｖｅｒｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６７２−６７６；Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６６９−６７２；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照）。別の非限定的例においては，本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の調節は，ＲＩＳＣによるＲＮＡ（コーディングＲＮＡまたは非コーディングＲＮＡのいずれか）のｓｉＮＡ媒介性切断の結果として，あるいは，当該技術分野において知られるように翻訳阻害の結果として生じうる。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の調節は，転写阻害の結果として生じうる（例えば，Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，２１６−２２２を参照）。
本明細書において用いる場合，"非対称ヘアピン"とは，アンチセンス領域，ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むことができるループ部分，およびセンス領域がアンチセンス領域と塩基対形成してループを有するデュープレックスを形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する程度にアンチセンス領域より少ないヌクレオチドを含むセンス領域を含む直鎖状ｓｉＮＡ分子を意味する。例えば，本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は，細胞またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例えば，約１５−約３０，または約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域，約４−約１２（例えば，約４，５，６，７，８，９，１０，１１，または１２）ヌクレオチドを含むループ領域，およびアンチセンス領域に相補的な約３−約２５（例えば，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）ヌクレオチドを有するセンス領域を含むことができる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子はまた，化学的に修飾されていてもよい５’末端リン酸基を含むことができる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は，本明細書に記載されるヌクレオチド，非ヌクレオチド，リンカー分子，またはコンジュゲート分子を含むことができる。
本明細書において用いる場合，"非対称デュープレックス"とは，センス領域およびアンチセンス領域を含む２つの別々の鎖を有するｓｉＮＡ分子を意味し，ここで，センス領域は，センス領域が，アンチセンス領域と塩基対形成してデュープレックスを形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを含む程度に，アンチセンス領域より少ないヌクレオチドを含む。例えば，本発明の非対称デュープレックスｓｉＮＡ分子は，細胞またはインビトロ系においてＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例えば，約１５−約３０，または約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域，およびアンチセンス領域に相補的な約３−約２５（例えば，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）ヌクレオチドを有するセンス領域を含むことができる。
本明細書において用いる場合，"ポリヌクレオチド"または"核酸分子"との用語は，ヌクレオチドを有する分子を表す。核酸は，一本鎖，二本鎖または多数の鎖であることができ，修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドまたは非ヌクレオチド，またはこれらの種々の混合物および組み合わせを含むことができる。
本明細書において用いる場合，"酵素的核酸分子"との用語は，基質結合領域において特定の遺伝子標的と相補性を有し，かつ標的ＲＮＡを特異的に切断する作用をする酵素活性を有する核酸分子を表す。すなわち，酵素的核酸分子は，ＲＮＡを分子内切断して，このことにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができる。これらの相補的領域は，酵素的核酸分子が標的ＲＮＡに十分にハイブリダイズすることを可能とし，したがって，切断を可能とする。１００パーセントの相補性が好ましいが，５０−７５％程度の低い双方性も本発明において有用である（例えば，Ｗｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，２０９２−２０９６；Ｈａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，９，２５−３１を参照）。核酸は，塩基，糖，および／またはリン酸基で修飾することができる。酵素的核酸との用語は，リボザイム，触媒的ＲＮＡ，酵素的ＲＮＡ，触媒的ＤＮＡ，アプタザイムまたはアプタマー結合リボザイム，制御可能リボザイム，触媒的オリゴヌクレオチド，ヌクレオザイム，ＤＮＡｚｙｍｅ，ＲＮＡ酵素，エンドリボヌクレアーゼ，エンドヌクレアーゼ，ミニザイム，リードザイム，オリゴザイムまたはＤＮＡ酵素等の用語と互換的に用いられる。これらの用語はすべて，酵素活性を有する核酸分子を記述する。本明細書に記載される特異的酵素的核酸分子は，本発明を限定するものではなく，当業者は，本発明の酵素的核酸分子において重要なことは，これが標的核酸領域の１またはそれ以上に相補的な特異的基質結合部位を有し，かつこの基質結合部位の中または周囲に分子に核酸切断および／またはライゲーション活性を付与するヌクレオチド配列を有することのみであることを理解するであろう（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，９８７，０７１；Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８，２６０ ＪＡＭＡ ３０３０）。本発明のリボザイムおよび酵素的核酸分子は，当該技術分野において一般に知られるように，または本明細書に記載されるようにして化学的に修飾することができる。
本明細書において用いる場合，"アンチセンス核酸"との用語は，ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（蛋白質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６５，５６６）相互作用により標的ＲＮＡに結合し，標的ＲＮＡの活性を変化させる非酵素的核酸分子を表す（概説として，Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ，１９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１００４およびＷｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８４９，９０２を参照）。典型的には，アンチセンス分子は，アンチセンス分子の単一の連続する配列に沿って標的配列に相補的である。しかし，ある態様においては，アンチセンス分子は，基質分子がループを形成するように基質に結合することができ，および／または，アンチセンス分子は，アンチセンス分子がループを形成するように結合することができる。すなわち，アンチセンス分子は２つ（またはそれ以上）の非連続基質配列に相補的であってもよく，またはアンチセンス分子の２つ（またはそれ以上）の非連続配列部分が標的配列に相補的であってもよく，その両方であってもよい。現在のアンチセンス戦略の概要については，Ｓｃｈｍａｊｕｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２１７８３−２１７８９，Ｄｅｌｉｈａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ，１５，７５１−７５３，Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎ．Ａ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，７，１５１，Ｃｒｏｏｋｅ，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１３，３−４５；Ｃｒｏｏｋｅ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．，１５，１２１−１５７，Ｃｒｏｏｋｅ，１９９７，Ａｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０，１−４９を参照。さらに，アンチセンスＤＮＡＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によりＲＮＡを標的とするように使用してもよく，このことによりＲＮａｓｅＨを活性化し，次にこれはデュープレックス中の標的ＲＮＡを切断する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅＨ切断を活性化しうる１またはそれ以上のＲＮＡｓｅＨ活性化領域を含むことができる。アンチセンスＤＮＡは，化学的に合成してもよく，または一本鎖ＤＮＡ発現ベクターまたはその同等物を用いて発現させてもよい。本発明のアンチセンス分子は，当該技術分野において一般に知られるように，または本明細書に記載されるようにして化学的に修飾することができる。
本明細書において用いる場合，"ＲＮａｓｅＨ活性化領域"との用語は，標的ＲＮＡに結合して細胞のＲＮａｓｅＨ酵素により認識される非共有複合体を形成委することができる核酸分子の領域（一般に，４−２５ヌクレオチドの長さまたはそれ以上，好ましくは５−１１ヌクレオチドの長さ）を表す（例えば，Ａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ５，８４９，９０２；Ａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ５，９８９，９１２を参照）。ＲＮａｓｅＨ酵素は，核酸分子−標的ＲＮＡ複合体に結合して，標的ＲＮＡ配列を切断する。ＲＮａｓｅＨ活性化領域は，例えば，ホスホジエステル，ホスホロチオエート（好ましくは少なくともヌクレオチドの少なくとも４つがホスホロチオエート置換であり；より詳細には，ヌクレオチドの４−１１個がホスホロチオエート置換である）；ホスホロジチオエート，５’−チオホスフェート，またはメチルホスホネート主鎖化学またはこれらの組み合わせを含む。上述の１またはそれ以上の主鎖化学に加えて，ＲＮａｓｅＨ活性化領域はまた，種々の糖化学を含むことができる。例えば，ＲＮａｓｅＨ活性化領域は，デオキシリボース，アラビノ，フルオロアラビノまたはこれらの組み合わせのヌクレオチド糖化学を含むことができる。当業者は，上述のものが非限定的例であり，ＲＮａｓｅＨ酵素の活性を支持する核酸のリン酸，糖および塩基化学の任意の組み合わせがＲＮａｓｅＨ活性化領域の定義の範囲内であり，本発明の範囲内であることを理解するであろう。
本明細書において用いる場合，"２−５Ａアンチセンスキメラ"との用語は，５’−リン酸化２’−５’−結合アデニレート残基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを表す。これらのキメラは，配列特異的様式で標的ＲＮＡに結合し，細胞の２−５Ａ依存的リボヌクレアーゼを活性化し，これは次に，標的ＲＮＡを切断する（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，１３００；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１３，５２２−５３３；Ｐｌａｙｅｒ ａｎｄ Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，１９９８，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，７８，５５−１１３）。本発明の２−５Ａアンチセンスキメラ分子は，当該技術分野において一般に知られるように，または本明細書に記載されるようにして化学的に修飾することができる。
本明細書において用いる場合，"トリプレックス形成オリゴヌクレオチド"との用語は，配列特異的様式で二本鎖ＤＮＡに結合して，三本鎖ヘリックスを形成することができるオリゴヌクレオチドを表す。そのようなトリプルヘリックス構造は，標的遺伝子の転写を阻害することが示されている（Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，５０４；Ｆｏｘ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，７，１７−３７；Ｐｒａｓｅｕｔｈ ｅｔ．ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８９，１８１−２０６）。本発明のトリプレックス形成オリゴヌクレオチド分子は，当該技術分野において一般に知られるように，または本明細書に記載されるようにして化学的に修飾することができる。
本明細書において用いる場合，"デコイＲＮＡ"との用語は，予め決定されたリガンドに優先的に結合するよう設計されたＲＮＡ分子またはアプタマーを表す。そのような結合により，標的分子が阻害または活性化されることができる。デコイＲＮＡまたはアプタマーは，特定のリガンドへの結合について天然に生ずる結合標的と競合することができる。例えば，ＨＩＶトランス活性化応答（ＴＡＲ）ＲＮＡの過剰発現は"デコイ"として作用してＨＩＶｔａｔ蛋白質に有効に結合することができ，このことによりＨＩＶＲＮＡによりコードされるＴＡＲ配列に結合することを妨害しうることが示されている（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ，６３，６０１−６０８）。しかし，これは特定の例であり，当業者は，当該技術分野において一般に知られる手法を用いて他の態様を容易に生成することができることを理解するであろう。例えば，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，５；Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２，１００；Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０；およびＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８を参照。同様に，デコイＲＮＡは，レセプターに結合してエフェクター分子の結合をブロックするように設計することができ，またはデコイＲＮＡは，目的とするレセプターに結合してレセプターとの相互作用を妨害するように設計することができる。本発明のデコイ分子は，当該技術分野において一般に知られているように，または本明細書に記載されるようにして化学的に修飾することができる。
本明細書において用いる場合，"一本鎖ＲＮＡ"（ｓｓＲＮＡ）との用語は，直鎖状一本鎖を含む天然に生ずるかまたは合成のリボ核酸分子を表し，例えば，ｓｓＲＮＡは，遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ），転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ），リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）等でありうる。
本明細書において用いる場合，"一本鎖ＤＮＡ"（ｓｓＤＮＡ）との用語は，直鎖状一本鎖を含む天然に生ずるかまたは合成のデオキシリボ核酸分子を表し，例えば，ｓｓＤＮＡは，センスまたはアンチセンス遺伝子配列またはＥＳＴ（発現配列タグ）でありうる。
本明細書において用いる場合，"二本鎖ＲＮＡ"または"ｄｓＲＮＡ"との用語は，ＲＮＡ干渉を行いうる二本鎖ＲＮＡ分子，例えば短干渉ＲＮＡ（ｓｉＮＡ）を表す。
本明細書において用いる場合，"アロザイム"との用語は，アロステリック酵素的核酸分子を表す（例えば，Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８３４，１８６および５，７４１，６７９，Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，５８９，３３２，Ｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８７１，９１４，Ｎａｔｈａｎ ａｎｄ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，国際公開ＷＯ００／２４９３１，Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ００／２６２２６および９８／２７１０４，およびＳｕｌｌｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９９／２９８４２を参照）。
本明細書において用いる場合，"アプタマー"または"核酸アプタマー"とは，標的分子に特異的に結合するポリヌクレオチドを意味し，ここで，核酸分子は，自然の状態で標的分子により認識される配列とは別の配列を有する。あるいは，アプタマーは，標的分子に結合する核酸分子であってもよく，ここで，標的分子は，自然には核酸に結合しない。標的分子は，興味ある任意の分子でありうる。例えば，アプタマーを用いて蛋白質のリガンド結合ドメインに結合させ，このことにより天然に生ずるリガンドと蛋白質との相互作用を妨害することができる。これは非限定的例であり，当業者は当該技術分野において一般に知られる手法を用いて他の態様を容易にしうることを理解するであろう。例えば，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，５；Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２，１００；Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０；およびＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８を参照。本発明のアプタマー分子は，当該技術分野において一般に知られているように，または本明細書に記載されるようにして化学的に修飾することができる。
"調節する"とは，遺伝子の発現，または１またはそれ以上の蛋白質または蛋白質サブユニットをコードするＲＮＡ分子または同等のＲＮＡ分子のレベル，または１またはそれ以上の蛋白質または蛋白質サブユニットの活性が，発現，レベルまたは活性が調節剤の非存在下で観察されるより高いかまたは低いように，アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされることを意味する。例えば，"調節する"との用語は，"阻害する"ことを意味することができるが，"調節する"との用語の使用はこの定義に限定されない。
"阻害する"，"ダウンレギュレートする"，または"低下させる"とは，遺伝子の発現，または１またはそれ以上の蛋白質または蛋白質サブユニットをコードするＲＮＡ分子または同等のＲＮＡ分子のレベル，または１またはそれ以上の蛋白質または蛋白質サブユニットの活性が，本発明の核酸分子（例えば，ｓｉＮＡ）の非存在下において観察されるものより低いことを意味する。１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子による阻害，ダウンレギュレーションまたは低下は，不活性または減弱化分子の存在下で観察されるレベルより低い。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子による阻害，ダウンレギュレーション，または低下は，例えば，スクランブル化配列またはミスマッチを有するｓｉＮＡ分子の存在下で観察されるレベルよりも低い。別の態様においては，本発明の核酸分子による遺伝子発現の阻害，ダウンレギュレーション，または低下は，核酸分子の存在下において，存在しない場合よりも大きい。１つの態様においては，遺伝子発現の阻害，ダウンレギュレーションまたは低下は，転写後サイレンシング，例えば，標的核酸分子（例えば，ＲＮＡ）のＲＮＡｉ媒介性切断または翻訳の阻害に関連する。１つの態様においては，遺伝子発現の阻害，ダウンレギュレーション，または低下は，転写前サイレンシングに関連する。
"アップレギュレートする"，または"促進する"とは，遺伝子の発現，または１またはそれ以上の蛋白質または蛋白質サブユニットをコードするＲＮＡ分子または同等のＲＮＡ分子のレベル，または１またはそれ以上の蛋白質または蛋白質サブユニットの活性が，本発明の核酸分子（例えば，ｓｉＮＡ）の非存在下において観察されるものより高いことを意味する。１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のアップレギュレーションまたは促進は，不活性または減弱化分子の存在下で観察されるレベルより高い。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のアップレギュレーションまたは促進は，例えば，スクランブル化配列またはミスマッチを有するｓｉＮＡ分子の存在下で観察されるレベルよりも高い。別の態様においては，本発明の核酸分子による遺伝子発現のアップレギュレーションまたは促進は，核酸分子の存在下において，存在しない場合よりも大きい。１つの態様においては，遺伝子発現のアップレギュレーションまたは促進は，ＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシング，例えば，アップレギュレートされるべき目的とする遺伝子の発現をダウンレギュレート，阻害またはサイレンシングする，コーディングまたは非コーディングＲＮＡ標的のＲＮＡｉ媒介性切断またはサイレンシングの阻害に伴う。遺伝子発現のダウンレギュレーションは，例えば，コーディングＲＮＡまたはそれによりコードされる蛋白質により，例えば，負のフィードバックまたはアンタゴニスト効果を介して誘発することができる。遺伝子発現のダウンレギュレーションは，例えば，目的とする遺伝子の調節制御を有する非コーディングＲＮＡにより，例えば，翻訳阻害，クロマチン構造，メチル化，ＲＩＳＣ媒介性ＲＮＡ切断，または翻訳阻害により遺伝子の発現をサイレンシングすることにより，誘発されうる。そのように，目的とする遺伝子をダウンレギュレート，抑制またはサイレンシングする標的の阻害またはダウンレギュレーションを用いて，治療用途に向けて，目的とする遺伝子の発現をアップレギュレートまたは促進することができる。
"遺伝子"または"標的遺伝子"とは，ＲＮＡをコードする核酸，例えば，限定されないが，ポリペプチドをコードする構造遺伝子などの核酸配列を意味する。遺伝子または標的遺伝子はまた，機能的ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）または非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ），例えば，小一過性ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ），マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），小各ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ），短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），小核小体ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ），リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ），転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびこれらの前駆体ＲＮＡをコードすることができる。このような非コーディングＲＮＡは，機能的または制御的細胞プロセスに関与するｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性の調節において，ｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡ干渉の標的核酸分子として働くことができる。したがって，疾病につながる異常なｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ活性は，本発明のｓｉＮＡ分子により調節される。ｆＲＮＡおよびｎｃＲＮＡを標的とするｓｉＮＡ分子はまた，細胞プロセス，例えば遺伝的インプリンティング，転写，翻訳，または核酸プロセシング（例えば，アミノ転移，メチル化等）を妨害することにより，被験者，生物または細胞の遺伝子型または表現型を操作または変更するために用いることができる。標的遺伝子は，細胞，内在性遺伝子，トランスジン，または外来遺伝子，例えば，感染後に細胞中に存在するウイルス等の病原体の遺伝子に由来する遺伝子でありうる。標的遺伝子を含む細胞は，任意の生物，例えば，植物，動物，原生動物，ウイルス，細菌または真菌に由来するものであるかまたはその中に含まれることができる。植物の非限定的例には，単子葉植物，双子葉植物，または裸子植物が含まれる。動物の非限定的例には脊椎動物または無脊椎動物が含まれる。真菌の非限定的例には，かびまたは酵母が含まれる。概説として，例えば，Ｓｎｙｄｅｒ ａｎｄ Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００，２５８−２６０を参照。
本明細書において用いる場合，"標的"とは，標的遺伝子によりコードされる任意の標的蛋白質，ペプチド，またはポリペプチドを意味する。"標的"との用語はまた，標的ＲＮＡによりコードされる標的活性を有する任意の標的蛋白質，ペプチド，またはポリペプチドをコードする核酸配列を表す。"標的"との用語はまた，他の標的をコードする配列，例えば，他の標的アイソフォーム，変異体標的遺伝子，標的遺伝子のスプライシング変種，および標的遺伝子多型を含むことを意味する。"標的核酸"とは，その発現または活性を調節すべき任意の核酸配列を意味する。標的核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
"非標準塩基対"とは，任意の非ワトソン・クリック塩基対，例えば，ミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対，例えば，フリップ付きミスマッチ，一水素結合ミスマッチ，トランスタイプミスマッチ，三塩基相互作用，および四重塩基相互作用などを意味する。そのような非標準塩基対の非限定的例としては，限定されないが，ＡＣ逆位フーグスティーン，ＡＣゆらぎ，ＡＵ逆位フーグスティーン，ＧＵゆらぎ，ＡＡＮ７アミノ，ＣＣ２−カルボニル−アミノ（Ｈ１）−Ｎ３−アミノ（Ｈ２），ＧＡ共有，ＵＣ４−カルボニル−アミノ，ＵＵイミノ−カルボニル，ＡＣ逆位ゆらぎ，ＡＵフーグスティーン，ＡＵ逆位ワトソン・クリック，ＣＧ逆位ワトソン・クリック，ＧＣＮ３−アミノ−アミノＮ３，ＡＡＮ１−アミノ対称，ＡＡＮ７−アミノ対称，ＧＡＮ７−Ｎ１アミノ−カルボニル，ＧＡ＋カルボニル−アミノＮ７−Ｎ１，ＧＧＮ１−カルボニル対称，ＧＧＮ３−アミノ対称，ＣＣカルボニル−アミノ対称，ＣＣＮ３−アミノ対称，ＵＵ２−カルボニル−イミノ対称，ＵＵ４−カルボニル−イミノ対称，ＡＡアミノ−Ｎ３，ＡＡＮ１−アミノ，ＡＣアミノ２−カルボニル，ＡＣＮ３−アミノ，ＡＣＮ７−アミノ，ＡＵアミノ−４−カルボニル，ＡＵＮ１−イミノ，ＡＵＮ３−イミノ，ＡＵＮ７−イミノ，ＣＣカルボニル−アミノ，ＧＡアミノ−Ｎ１，ＧＡアミノ−Ｎ７，ＧＡカルボニル−アミノ，ＧＡＮ３−アミノ，ＧＣアミノ−Ｎ３，ＧＣカルボニル−アミノ，ＧＣＮ３−アミノ，ＧＣＮ７−アミノ，ＧＧアミノ−Ｎ７，ＧＧカルボニル−イミノ，ＧＧＮ７−アミノ，ＧＵアミノ−２−カルボニル，ＧＵカルボニル−イミノ，ＧＵイミノ−２−カルボニル，ＧＵＮ７−イミノ，ｐｓｉＵイミノ−２−カルボニル，ＵＣ４−カルボニル−アミノ，ＵＣイミノ−カルボニル，ＵＵイミノ−４−カルボニル，ＡＣＣ２−Ｈ−Ｎ３，ＧＡカルボニル−Ｃ２−Ｈ，ＵＵイミノ−４−カルボニル２カルボニル−Ｃ５−Ｈ，ＡＣアミノ（Ａ）Ｎ３（Ｃ）−カルボニル，ＧＣイミノアミノ−カルボニル，Ｇｐｓｉイミノ−２−カルボニルアミノ−２−カルボニル，およびＧＵイミノアミノ−２−カルボニル塩基対などが挙げられる。
本明細書において用いる場合，"標的"とは，任意の標的蛋白質，ペプチド，またはポリペプチド，例えば，米国特許出願１０／９２３，５３６および米国特許出願１０／９２３５３６（いずれも本明細書の一部としてここに引用する）に示されるＧｅｎｂａｎｋ受託番号によりコードされるものを意味する。"標的"との用語はまた，標的蛋白質，ペプチド，またはポリペプチド，例えば，米国特許出願１０／９２３，５３６および米国特許出願１０／９２３５３６に示されるＧｅｎｂａｎｋ受託番号を有する配列によりコードされる蛋白質，ペプチド，またはポリペプチドをコードする核酸配列または標的ポリヌクレオチド配列を表す。目的とする標的は，標的ポリヌクレオチド配列，例えば，標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを含むことができる。"標的"との用語はまた，他の配列，例えば，異なるアイソフォーム，変異体標的遺伝子，標的ポリヌクレオチドのスプライシング変種，標的多型，および非コーディング（例えば，ｎｃＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ，ｓＲＮＡ），または本明細書に記載される他の制御ポリヌクレオチド配列を含むことを意味する。したがって，本発明の種々の態様においては，標的ＲＮＡに相補性を有する本発明の二本鎖核酸分子（例えば，ｓｉＮＡ）を用いて，ｍｉＲＮＡまたは他のｎｃＲＮＡ活性を阻害するかまたはダウンレギュレートすることができる。１つの態様においては，ｍｉＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ活性の阻害を用いて，遺伝子発現（例えば，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られる他の遺伝子標的），またはｍｉＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ活性に依存するウイルス複製（例えば，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られる他のウイルス標的）をダウンレギュレートまたは阻害することができる。別の態様においては，ｍｉＲＮＡまたはｎｃＲＮＡに相補性を有する本発明の二本鎖核酸分子（例えば，ｓｉＮＡ）によるｍｉＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ活性の阻害を用いて，ｍｉＲＮＡまたはｎｃＲＮＡによって遺伝子の発現がダウンレギュレート，抑制またはサイレンシングされるような標的遺伝子の発現（例えば，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られる他の遺伝子標的）をアップレギュレートまたは促進することができる。そのような遺伝子発現のアップレギュレーションを用いて，当該技術分野において一般に知られる機能の喪失またはハプロ不全に伴う疾病および状態（例えば，筋ジストロフィー，嚢胞性線維症，または神経疾患および本明細書に記載される状態，例えば，新生児期の重症ミオクローヌスてんかんまたはドレーブ（Ｄｒａｖｅｔ）症候群）等のてんかんを治療することができる。
"相同配列"とは，１またはそれ以上のポリヌクレオチド配列，例えば，遺伝子，遺伝子転写産物および／または非コーディングポリヌクレオチドにより共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば，相同配列は，２またはそれ以上の遺伝子，例えば遺伝子ファミリーの異なるメンバー，異なる蛋白質エピトープ，異なる蛋白質アイソフォーム等の関連するが異なる蛋白質，または例えばサイトカインおよびその対応するレセプター等の完全に相違する遺伝子により共有されているヌクレオチド配列でありうる。相同配列は，２またはそれ以上の非コーディングポリヌクレオチド，例えば，非コーディングＤＮＡまたはＲＮＡ，制御配列，イントロン，および転写調節または制御の部位により共有されているヌクレオチド配列でありうる。相同配列は，２以上のポリヌクレオチド配列により共有されている保存配列領域を含むことができる。ホモロジーは，完全なホモロジー（例えば，１００％）ではなくてもよく，部分的に相同な配列もまた本発明により企図される（例えば，９９％，９８％，９７％，９６％，９５％，９４％，９３％，９２％，９１％，９０％，８９％，８８％，８７％，８６％，８５％，８４％，８３％，８２％，８１％，８０％等）。
"保存配列領域"とは，ポリヌクレオチド中の１またはそれ以上の領域のヌクレオチド配列が，１つの世代と他の世代とで，または１つの生物学的システム，被験者，または生物と，他の生物学的システム，被験者，または生物とで有意に相違しないことを意味する。ポリヌクレオチドは，コーディングおよび非コーディングＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むことができる。
"センス領域"とは，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対して相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに，ｓｉＮＡ分子のセンス領域は，標的核酸配列とホモロジーを有する核酸配列を含むことができる。１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子のセンス領域はセンス鎖または乗客鎖と称される。
"アンチセンス領域"とは，標的核酸配列に対して相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は，ｓｉＮＡ分子のセンス領域に対する相補性を有する核酸配列を任意に含むことができる。１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域はアンチセンス鎖またはガイド鎖と称される。
"標的核酸"または"標的ポリヌクレオチド"とは，その発現または活性を調節すべき任意の核酸配列を意味する。標的核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。１つの態様においては，本発明の標的核酸は標的ＲＮＡまたはＤＮＡである。
"相補性"とは，核酸が他方の核酸配列と，伝統的なワトソン・クリックまたは本明細書に記載される他の非伝統的なタイプのいずれかにより水素結合を形成しうることを意味する。１つの態様においては，各鎖が１５−３０ヌクレオチドの長さである本発明の二本鎖核酸分子，例えばｓｉＮＡ分子は，二本鎖核酸分子の２つの鎖の間に約１０％−約１００％（例えば，約１０％，２０％，３０％，４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，または１００％）の相補性を含む。別の態様においては，一方の鎖がセンス鎖であり他方の鎖がアンチセンス鎖であり，各鎖が１５−３０ヌクレオチドの長さである本発明の二本鎖核酸分子，例えばｓｉＮＡ分子は，二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列とその対応する標的核酸分子，例えば標的ＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡのヌクレオチド配列との間に少なくとも約１０％−約１００％（例えば，少なくとも約１０％，２０％，３０％，４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，または１００％）の相補性を含む。１つの態様においては，一方の鎖がセンス領域と称されるヌクレオチド配列を含み，他方の鎖がアンチセンス領域と称されるヌクレオチド配列を含み，各鎖が１５−３０ヌクレオチドの長さである本発明の二本鎖核酸分子，例えばｓｉＮＡ分子は，二本鎖核酸分子のセンス領域とアンチセンス領域との間に，約１０％−約１００％（例えば，約１０％，２０％，３０％，４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，または１００％）の相補性を有する。本発明の核酸分子に関して，核酸分子とその相補的配列との結合自由エネルギーは核酸の重要な機能，例えばＲＮＡｉ活性を進行させるのに十分なものである。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は当該技術分野においてよく知られている（例えば，Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照）。パーセント相補性とは，第２の核酸配列と水素結合（例えば，ワトソン・クリック塩基対形成）を形成することができる，核酸分子中の連続する残基のパーセンテージを示す（例えば，第１のオリゴヌクレオチド中の全部で１０ヌクレオチドのうちの５，６，７，８，９，または１０ヌクレオチドが１０ヌクレオチドを有する第２の核酸配列と塩基対形成することは，それぞれ５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，および１００％の相補性を表す）。１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間に完全な相補性を有する。１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，対応する標的核酸分子に完全に相補的である。"完全に相補的"とは，核酸配列のすべての連続する残基が第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合するであろうことを意味する。１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，１またはそれ以上の標的核酸分子またはその一部に相補的な約１５−約３０またはそれ以上（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０またはそれ以上）のヌクレオチドを含む。１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間に，またはｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間に，部分的な相補性（すなわち，１００％未満の相補性）を有する。例えば，部分的な相補性は，ｓｉＮＡ構造中に種々のミスマッチまたは非塩基対形成ヌクレオチド（例えば，１，２，３，４，５またはそれ以上のミスマッチまたは非塩基対形成ヌクレオチド）を含むことができ，このことにより，ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間に，またはｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間にバルジ，ループ，またはオーバーハングが生ずる。
１つの態様においては，本発明の二本鎖核酸分子，例えば，ｓｉＮＡ分子は，核酸分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間に完全な相補性を有する。１つの態様においては，本発明の二本鎖核酸分子，例えばｓｉＮＡ分子は，対応する標的核酸分子に完全に相補的である。
１つの態様においては，本発明の二本鎖核酸分子，例えばｓｉＮＡ分子は，二本鎖核酸分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間に，または核酸分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間に，部分的な相補性（すなわち，１００％より低い相補性）を有する。例えば，部分的な相補性は，二本鎖核酸分子中に種々のミスマッチまたは非塩基対形成ヌクレオチド（例えば，１，２，３，４，５またはそれ以上のミスマッチまたは非塩基対形成ヌクレオチド，例えばヌクレオチドバルジ）を含むことができ，この構造により，二本鎖核酸分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間に，または二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間にバルジ，ループまたはオーバーハングが生ずる。
１つの態様においては，本発明の二本鎖核酸分子は，マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。"マイクロＲＮＡ"または"ｍｉＲＮＡ"とは，ｍＲＮＡ切断，翻訳の抑制／阻害またはヘテロクロマチンサイレンシングのいずれかにより標的メッセンジャーＲＮＡの発現を制御する小さい二本鎖ＲＮＡを意味する（例えば，Ａｍｂｒｏｓ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３１，３５０−３５５；Ｂａｒｔｅｌ，２００４，Ｃｅｌｌ，１１６，２８１−２９７；Ｃｕｌｌｅｎ，２００４，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，１０２，３−９；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，５，５２２−５３１；およびＹｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｇｅｎｅ，３４２，２５−２８を参照）。１つの態様においては，本発明のマイクロＲＮＡは，ｍｉＲＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間に，またはｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間に部分的な相補性（すなわち，１００％未満の相補性）を有する。例えば，部分的な相補性は，二本鎖核酸分子中に種々のミスマッチまたは非塩基対形成ヌクレオチド（例えば，１，２，３，４，５またはそれ以上のミスマッチまたは非塩基対形成ヌクレオチド，例えば，ヌクレオチドバルジ）を含むことができ，この構造により，ｍｉＲＮＡのセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間に，またはｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間にバルジ，ループ，またはオーバーハングが生ずる。
１つの態様においては，本発明の組成物，例えば処方分子組成物および標的遺伝子発現をダウンレギュレートするかまたは低下させる本発明の処方ｓｉＮＡ組成物は，被験者または生物において本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られる疾病，疾患，状態，または形質を予防または治療するために用いられる。
本明細書において用いる場合，"増殖性疾病"または"癌"とは，当該技術分野において知られるように，制御されない細胞成長または複製を特徴とする任意の疾病，状態，形質，遺伝子型または表現型を意味し，例えば，白血病，例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ），慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ），急性リンパ性白血病（ＡＬＬ），および慢性リンパ性白血病，ＡＩＤＳ関連癌，例えばカポジ肉腫；乳癌；骨癌，例えば骨肉腫，軟骨肉腫，ユーイング肉腫，線維肉腫，巨細胞癌，アダマンチノーム，および脊索腫；脳癌，例えば髄膜腫，神経膠芽細胞腫，低等級星状細胞腫，稀突起神経膠細胞腫，下垂体腫瘍，神経鞘腫，および転移性脳癌；頭頚部の癌，例えば種々のリンパ腫，例えば外套細胞リンパ腫，非ホジキンリンパ腫，腺腫，扁平上皮癌，喉頭癌腫，胆嚢および胆管癌，網膜の癌，例えば網膜芽細胞腫，食道の癌，胃癌，多発性骨髄腫，卵巣癌，子宮癌，甲状腺癌，精巣癌，子宮内膜癌，黒色腫，結腸直腸癌，肺癌，膀胱癌，前立腺癌，肺癌（非小細胞肺癌を含む），膵臓癌，肉腫，ウイルムス腫瘍，子宮頸癌，頭頚部癌，皮膚癌，鼻咽頭癌腫，脂肪肉腫，上皮癌，腎細胞癌，胆嚢腺癌，耳下腺腺癌，子宮内膜肉腫，多剤耐性癌；および増殖性疾病および状態，例えば，腫瘍血管新生に伴う新生血管形成，黄斑変性（例えば，湿潤／乾燥ＡＭＤ），角膜新生血管形成，糖尿病性網膜症，新生血管緑内障，近視性変性および他の増殖性疾病および状態，例えば，再狭窄および多発性嚢胞腎疾病，および細胞または組織において，単独でまたは他の療法との組み合わせで疾病関連遺伝子発現の調節に応答しうる他の任意の癌または増殖性疾病，状態，形質，遺伝子型または表現型が挙げられる。
本明細書において用いる場合，"炎症性疾病"または"炎症性状態"とは，当該技術分野において知られるように，炎症性またはアレルギー性のプロセスを特徴とする任意の疾病，状態，形質，遺伝子型または表現型を意味し，例えば，炎症，急性炎症，慢性炎症，呼吸器疾病，アテローム性動脈硬化症，乾癬，皮膚炎，再狭窄，ぜん息，アレルギー性鼻炎，アトピー性皮膚炎，敗血症性ショック，慢性関節リウマチ，炎症性腸疾病，炎症性骨盤疾病，痛み，眼性炎症性疾病，セリアック病，リー症候群，グリセロールキナーゼ欠乏症，家族性好酸球増加症（ＦＥ），常染色体劣性痙性失調症，喉頭部炎症性疾病；結核，慢性胆嚢炎，気管支拡張症，珪肺症および他の塵肺症，および細胞または組織において，単独でまたは他の療法との組み合わせで疾病関連遺伝子発現の調節に応答しうる他の任意の炎症性疾病，状態，形質，遺伝子型または表現型が挙げられる。
本明細書において用いる場合，"自己免疫疾病"または"自己免疫状態"とは，当該技術分野において知られるように，自己免疫を特徴とする任意の疾病，状態，形質，遺伝子型または表現型を意味し，例えば，多発性硬化症，糖尿病，狼瘡，セリアック病，クローン病，潰瘍性大腸炎，ギヤン−バレー症候群，強皮症，グッドパスチャー症候群，ヴェーゲナー肉芽腫症，自己免疫てんかん，ラスムッセン脳炎，原発性硬化性胆管炎，硬化性胆管炎，自己免疫肝炎，アディソン病，橋本甲状腺炎，線維筋痛，メニエール症候群；移植拒絶（例えば，同種移植片拒絶の予防），悪性貧血，慢性関節リウマチ，全身性エリテマトーデス，皮膚筋炎，シェーグレン症候群，エリテマトーデス，多発性硬化症，重症筋無力症，ライター症候群，グラーベ病，および細胞または組織において，単独でまたは他の療法との組み合わせで疾病関連遺伝子発現の調節に応答しうる他の任意の自己免疫疾病，状態，形質，遺伝子型または表現型が挙げられる。
"感染性疾病"とは，感染性因子，例えば，ウイルス，細菌，真菌，プリオン，または寄生虫と関連する任意の疾病，状態，形質，遺伝子型または表現型を意味する。本発明のｓｉＮＡ分子を用いて標的とすることができる種々のウイルス遺伝子の非限定的例としては，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ，例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｄ１１１６８，Ｄ５０４８３．１，Ｌ３８３１８およびＳ８２２２７），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１００３０８．１），１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ５１１８８），２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６０６６７），西ナイル熱ウイルス（ＷＮＶ，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１５６３），サイトメガロウイルス（ＣＭＶ，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１３４７），呼吸器シンチニウムウイルス（ＲＳＶ，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号
），インフルエンザウイルス（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０３７４１２，ライノウイルス（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｄ００２３９，Ｘ０２３１６，Ｘ０１０８７，Ｌ２４９１７，Ｍ１６２４８，Ｋ０２１２１，Ｘ０１０８７），パピローマウイルス（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号
），ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ，例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号
），および他のウイルス，例えばＨＴＬＶ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号
）が挙げられる。多くのウイルスゲノムは配列の変動性が高いため，広い治療用途のためのｓｉＮＡ分子の選択には，ウイルスゲノムの保存領域が関与するであろう。ウイルスゲノムの保存領域の非限定的例としては，限定されないが，５’−非コーディング領域（ＮＣＲ），３’−非コーディング領域（ＮＣＲ）および／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が挙げられる。種々のウイルスゲノムの保存領域に対して設計されたｓｉＮＡ分子は，多様な患者集団においてウイルス複製の有効な阻害を可能とし，ウイルスゲノムの非保存領域中の変異により進化するウイルス偽種に対するｓｉＮＡ分子の有効性を確実にすることができる。細菌感染の非限定的例としては，放線菌症，炭疽，アスペルギルス症，菌血症，細菌感染および真菌症，バルトネラ感染，ボツリスム，ブルセラ症，セパシア菌感染，キャンピロバクター感染，カンジダ症，ネコ引っ掻き病，クラミジア感染，コレラ，クロストリジウム感染，コクシジオイデス真菌症，交差感染，クリプトコックス症，皮膚真菌症，ジフテリア，エールリヒア症，大腸菌感染，筋膜炎，壊死性，フゾバクテリウム感染，ガス壊疽，グラム陰性細菌感染，グラム陽性細菌感染，ヒストプラスマ症，膿痂疹，クレブシエラ感染，レジオネラ症，らい病，レプトスピラ症，リステリア感染，ライム病，マズラミコーシス，類鼻疽，ミコバクテリウム感染，マイコプラスマ感染，真菌症，ノカルジア感染，爪甲真菌症，オルニトーシス，ペスト，肺炎球菌感染，シュードモナス感染，Ｑ熱，鼡咬熱，回帰熱，リウマチ熱，リケッチア感染，ロッキー山紅斑熱，サルモネラ感染，猩紅熱，ツツガムシ病，敗血症，細菌性性感染病，細菌性皮膚疾病，ブドウ球菌感染，連鎖球菌感染，破傷風，ダニ媒介病，結核，ツラレミア，腸チフス，発疹チフス，流行性シラミ媒介性疾病，ビブリオ感染，フランベジア，エルジニア感染，人獣共通伝染病，および接合真菌症が挙げられる。真菌感染の非限定的例としては，アスペルギルス症，ブラストミセス症，コクシジオイデス真菌症，クリプトコックス症，爪および足指爪の真菌感染，真菌性静脈洞炎，ヒストプラスマ症，ムコール菌症，爪真菌感染，パラコクシジオイドミコーシス，スポロトリクス症，渓谷熱（コクシジオイデス真菌症），およびカビアレルギーが挙げられる。
"神経疾患"または"神経学的疾病"とは，中枢神経系または末梢神経系に影響を与える任意の疾病，疾患，または状態を意味し，例えば，ＡＤＨＤ，ＡＩＤＳの神経学的合併症，透明中隔の欠失，後天性てんかん様失語症，急性播種性脳脊髄炎，副腎脳白質ジストロフィー，脳梁の無発育，失認，エカルディ症候群，アレグザンダー病，アルパーズ病，交代性片麻痺，アルツハイマー病，筋萎縮性側方硬化症，無脳症，動脈瘤，エンジェルマン症候群，血管腫症，無酸素症，失語症，失行症，クモ膜嚢胞，クモ膜炎，アルノルト−キアーリ奇形，動静脈奇形，アスパルテーム，アスペルガー症候群，毛細血管拡張性運動失調，運動失調，注意欠陥過活動性障害，自閉症，自律神経機能障害，背痛，バルト症候群，バッテン病，ベーチェット病，ベル麻痺，良性本態性眼瞼痙攣，良性限局性筋萎縮症，良性頭蓋内高血圧症，ベルンハルト−ロート症候群，ビンスヴァンガー病，眼瞼痙攣，ブロッホ−サルズバーガー症候群，腕神経叢分娩外傷，腕神経叢外傷，ブラドバリー−エグルストン症候群，脳動脈瘤，脳外傷，脳および脊髄腫瘍，ブラウン−セカール症候群，延髄脊髄筋萎縮，キャナヴァン病，手根管症候群，カウザルギー，カベルノーマ，海綿状血管腫，空洞性奇形，中心頸髄症候群，脊髄中心症候群，中心性疼痛症候群，頭疾患，小脳退化，小脳性発育不全，脳性動脈瘤，脳性動脈硬化症，脳萎縮症，脳性脚気，脳性巨人症，脳低酸素症，脳性小児麻痺，脳−眼−顔面−骨格症候群，シャルコー−マリー−ツース病，キアリ奇形，舞踏病，舞踏病有棘赤血球増加症，慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ），慢性起立不耐症，慢性疼痛，ＩＩ型コケーン症候群，コフィン−ローリー症候，昏睡，例えば持続性植物状態，複雑体局所痛み症候群，先天性両側顔面神経麻痺，先天性筋無力症，先天性ミオパシー，先天性血管空洞奇形，大脳皮質基底核変性症，頭蓋動脈炎，頭蓋骨癒合症，クロイツフェルト−ヤーコプ病，蓄積外傷疾患，クッシング症候群，サイトメガロ封入体病（ＣＩＢＤ），サイトメガロウイルス感染，跳躍性眼−跳躍性足症候群，ダンディ−ウォーカー症候群，ドーソン病，ド・モルシェ症候群，ドゥジュリーヌ−クルンプケ麻痺，多発脳梗塞性痴呆，皮質下痴呆，レーヴィ小体を伴う痴呆，皮膚筋炎，発達性結合運動障害，ドヴィック症候群，糖尿病性ニューロパシー，散在性硬化症，ドラバー症候群，自律神経障害，書字障害，失読症，えん下困難，結合運動障害，失調症，初期乳児期てんかん性脳障害，トルコ鞍空虚症候群，嗜眠性脳炎，脳炎および髄膜炎，脳ヘルニア，脳障害，脳三叉神経領域血管腫症，てんかん，エルブ麻痺，エルブデュシェンヌおよびドゥジュリーヌ−クルンプケ麻痺，ファブリー病，ファール症候群，失神，家族性自律神経障害，家族性血管腫，家族性特発性大脳基底核石灰化症，家族性けいれん性麻痺，熱性痙攣（例えば，ＧＥＦＳおよびＧＥＦＳプラス），フィッシャー症候群，フロッピー乳児症候群，フリートライヒ運動失調，ゴシェ疾病，ゲルストマン症候群，ゲルストマン−シュトロイスラシェ印加ー疾病，巨大細胞動脈炎，巨大細胞封入病，球様細胞白質萎縮症，舌咽神経痛，ギヤン−バレー症候群，ＨＴＬＶ−１関連ミエロパシー，ハレルフォルデン・スパッツ病，頭部外傷，頭痛，稽留性片頭痛，片側顔面痙縮，交代性片麻痺，遺伝性ニューロパシー，遺伝性痙性対麻痺，遺伝性多発神経炎性失調，耳帯状疱疹，帯状疱疹，ヒラヤマ症候群，全前脳症，ハンチントン病，水無脳症，正常圧水頭症，水頭症，水脊髄症，副腎皮質機能亢進症，睡眠過剰，高張，低張，低酸素症，免疫媒介性脳脊髄炎，封入体筋炎，色素失調症，乳児期低張，乳児期フタル酸蓄積症，乳児期レフサム病，乳児期痙攣，炎症性ミオパシー，腸性脂肪異栄養症，頭蓋内嚢腫，頭蓋内高血圧症，アイザック症候群，ジュベール症候群，キーンズ・セイアー症候群，ケネディ病，キンスボーン症候群，クライネ−レヴィン症候群，クリペル−フェーユ症候群，クリペル−トルノネー症候群（ＫＴＳ），クリューヴァー−ビューシー症候群，コルサコフ健忘症候群，クラッベ疾病，クーゲルベルク−ヴェランデル病，クールー，ランバート−イートン筋無力症症候群，ランドー−クレッフナー症候群，側方大腿皮膚神経エントラップメント，側方骨髄症候群，学習障害，リー病，レノックス−ガストー症候群，レッシュ−ナイハン症候群，白質萎縮症，レヴァイン−クリチリー症候群，レーヴィ小体痴呆，脳回欠損，閉込め症候群，ルー・ゲーリグ病，ループス−神経学的続発症，ライム病−神経学的合併症，マチャド−ジョセフ病，大脳髄症，巨大脳髄症，メルカーソン・ローゼンタール症候群，髄膜炎，メンケス病，知覚異常性大腿神経痛，異染性白質萎縮症，小頭蓋症，片頭痛，ミラーフィッシャー症候群，症発作，ミトコンドリアミオパシー，メービウス症候群，単肢筋萎縮症，運動ニューロン疾患，モヤモヤ病，ムコリピドーシス，ムコ多糖体症，多発脳梗塞性痴呆，多病巣性運動ニューロパシー，多発性硬化症，起立性低血圧症を伴う多発性全身萎縮症，多発性全身萎縮症，筋ジストロフィー，先天性筋無力症，重症筋無力症，ミエリン破壊性散在性硬化症，乳児のミオクローヌス脳障害，ミオクローヌス，先天性ミオパシー，甲状腺中毒性ミオパシー，ミオパシー，先天性ミオトニー，ミオトニー，ナルコレプシー，神経有棘赤血球増加症，脳鉄蓄積を有する神経変性，神経線維腫症，神経弛緩薬性悪性症候群，ＡＩＤＳの神経学的合併症，ポーンプ病の神経学的発現，視神経脊髄炎，神経ミオトニー，神経セロイド脂褐素沈着症，神経移動疾患，ニューロパシー−遺伝性，神経サルコイドーシス，神経毒性，海綿状母斑，ニーマン−ピック病，オサリバン−マクラウド症候群，後頭神経痛，不顕性脊椎管癒合異常配列，オータハラ症候群，オリーブ橋小脳萎縮，眼球クローヌスミオクローヌス，起立性低血圧症，過用症候群，慢性痛み，新生物随伴症候群，感覚異常症，パーキンソン病，先天性パラミオトニア，発作性舞踏病アテトーシス，発作性片頭痛，パリー−ロンバーグ，ペリツェーウス−メルツバッヒャー病，ペナショーカーＩＩ症候群，神経周囲嚢，周期性麻痺，末梢ニューロパシー，室周白軟化症，持続性植物状態，広汎発達障害，フィタン酸蓄積症，ピック病，梨状症候群，下垂体腫瘍，多発性筋炎，ポーンプ病，脳空洞症，ポリオ後症候群，ヘルペス後神経痛，感染後脳脊髄炎，体位性低血圧症，体位性起立性頻拍症症候群，体位性頻拍症候群，原発性側方硬化症，プリオン病，進行性片側萎縮症，進行性歩行性運動失調症，進行性多病巣性白質脳症，進行性硬化性ポリオジストロフィー，進行性核上麻痺，偽腫瘍大脳，ピリドキシン依存およびピリドキシン応答性シーズー疾患，Ｉ型ラムジー・ハント症候群，ＩＩ型ラムジー・ハント症候群，ラスムッセン脳炎および他の自己免疫てんかん，反射性交感神経性ジストロフィー症候群，レフサム病−乳児，レフサム病，反復運動疾患，反復ストレス障害，不穏下肢症候群，レトロウイルス関連ミエロパシー，レット症候群，レイ症候群，リリーデイ症候群，ＳＵＮＣＴ頭痛，仙骨神経根嚢胞，舞踏病，唾液腺疾病，ザントホフ病，シルダー病，脳裂，痙攣疾患，中隔−視覚異形成症，新生児期の重症ミオクローヌスてんかん（ＳＭＥＩ），揺さぶられっ子症候群，帯状ヘルペス，シャイ−ドレーガー症候群，シェーグレン症候群，睡眠時無呼吸，睡眠病，ソト症候群，痙性，二分脊椎，脊髄梗塞，脊髄外傷，脊髄腫瘍，棘筋萎縮症，脊髄小脳性萎縮症，スティール−リチャードソン−オルスゼフスキー症候群，スティッフパーソン症候群，線条体黒質変性，発作，スタージ−ウェーバー症候群，亜急性硬化性汎脳炎，皮質下動脈硬化性脳障害，えん下疾患，シドナム舞踏病，失神，梅毒性棘硬化症，空洞水脊髄症，脊髄空洞症，全身性エリテマトーデス，脊髄ろう，遅発性ジスキネジー，眼板嚢胞，テイ−サックス病，一過性動脈炎，繋留脊髄症候群，トムセン病，胸郭出口症候群，甲状腺中毒性ミオパシー，疼痛性チック，トッド麻痺，ツーレット症候群，一過性虚血性発作，伝染性海綿状脳障害，横断脊髄炎，外傷性脳障害，振せん，三叉神経痛，熱帯性痙性不全対麻痺，結節硬化症，血管勃起腫瘍，脈管炎，例えば，一過性動脈炎，フォン・エコーノモ病，フォン・ヒッペル−リンダウ病（ＶＨＬ），フォン・レックリングハウゼン病，ヴァレンベルク症候群，ヴェルドニッヒ−ホフマン病，ヴェルニッケ−コルサコフ症候群，ウエスト症候群，ホウィップル病，ウィリアムズ症候群，ウィルソン病，Ｘ連鎖脊髄および延髄筋萎縮，およびツェルヴェーガー症候群が含まれる。
"呼吸器疾病"とは，呼吸管に影響を与える任意の疾病または状態を意味し，例えば，ぜん息，慢性閉塞性肺疾患または"ＣＯＰＤ"，アレルギー性鼻炎，静脈洞炎，肺血管収縮，炎症，アレルギー，呼吸阻止，呼吸窮迫症候群，嚢胞性線維症，肺高血圧症，肺血管収縮，気腫，および細胞または組織において，単独でまたは他の療法との組み合わせで疾病関連遺伝子発現の調節に応答しうる他の任意の呼吸器疾病，状態，形質，遺伝子型または表現型が含まれる。
"心臓血管疾病"とは，心臓および血管系に影響を与える疾病または状態を意味し，例えば，限定されないが，冠状動脈心臓疾患疾病（ＣＨＤ），脳血管疾患（ＣＶＤ），大動脈狭窄，末梢血管疾病，アテローム性動脈硬化症，動脈硬化症，心筋梗塞（心臓発作），脳血管疾患（発作），一過性虚血性発作（ＴＩＡ），アンギナ（安定性および不安定性），心房性細動，不整脈，弁膜性疾患，うっ血性心不全，高コレステロール血症，Ｉ型高リポ蛋白血症，ＩＩ型高リポ蛋白血症，ＩＩＩ型高リポ蛋白血症，ＩＶ型高リポ蛋白血症，Ｖ型高リポ蛋白血症，続発性高トリグリセリド血症，および家族性レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損が含まれる。
本明細書において用いる場合，"眼科疾病"とは，当該技術分野において知られるように，眼および関連する構造の任意の疾病，状態，形質，遺伝子型または表現型を意味し，例えば，類嚢胞黄斑水腫，星芒状硝子体症，病的近視および後極ブドウ膜腫，トキソカラ症（眼幼虫移行症），網膜血管閉塞，後部硝子体剥離，着色性網膜断裂，網膜上膜，糖尿病性網膜症，格子変性，網膜血管閉塞，網膜動脈閉塞，黄斑変性（例えば，加齢性黄斑変性，例えば湿潤ＡＭＤまたは乾燥ＡＭＤ），トキソプラスマ症，脈絡膜黒色腫，後天性網膜分離，ホレンホースト斑，特発性中央漿液網脈絡膜症，黄斑円孔，推定眼ヒストプラスマ症症候群，網膜マクロ動脈瘤，色素性網膜炎，網膜剥離，高血圧性網膜症，網膜色素上皮（ＲＰＥ）剥離，パピロ静脈炎，眼性虚血性症候群，コーツ病，レーベル粟粒動脈瘤，結膜新生物，アレルギー性結膜炎，春季結膜炎，急性細菌性結膜炎，アレルギー性結膜炎および春季カタル，ウイルス性結膜炎，細菌性結膜炎，クラミジアおよび淋菌性結膜炎，結膜裂傷，上強膜炎，強膜炎，瞼裂斑炎，翼状片，上輪部角結膜炎（テオドールのＳＬＫ），毒性結膜炎，偽膜を有する結膜炎，巨大乳頭状結膜炎，テリエン辺縁変性，アカントアメーバ角膜炎，真菌性角膜炎，糸状角膜炎，細菌性角膜炎，乾性角結膜炎／ドライアイ症候群，細菌性角膜炎，ヘルペス単純角膜炎，無菌性角膜浸潤，フリクテン症，角膜擦過傷および再発性角膜びらん，角膜異物，薬品熱傷，上皮基底膜ジストロフィー（ＥＢＭＤ），サイジェソン表在性点状角膜炎，角膜裂傷，ザルツマン結節状角膜変性，フックス内皮ジストロフィー，水晶体亜脱臼，毛様体ブロック緑内障，原発性開放隅角緑内障，色素分散症候群および色素性緑内障，偽性剥脱症候群および偽剥脱性緑内障，前部ブドウ膜炎，原発性開放隅角緑内障，ブドウ膜緑内障および緑内障毛様体炎発症，色素分散症候群および色素性緑内障，急性閉塞隅角緑内障，前部ブドウ膜炎，前房出血，隅角後退緑内障，水晶体誘発性緑内障，偽性剥脱症候群および偽性剥脱性緑内障，アクセンフェルト−リーガー症候群，新生血管緑内障，扁平部炎，脈絡膜破裂，デュエーン退縮症候群，毒性／栄養性視神経ニューロパシー，第３脳神経の異常な再生，頭蓋内腫瘤病変，頸動脈海綿静脈洞瘻，虚血性前視神経ニューロパシー，視神経円浮腫および乳頭水腫，第３脳神経麻痺，第４脳神経麻痺，第６脳神経麻痺，第７脳神経（顔面神経）麻痺，ホルナー症候群，核間眼筋麻痺，視神経頭形成不全，視窩，緊張性瞳孔，視神経乳頭結晶腔，脱髄視神経ニューロパシー（視神経炎，球後視神経炎），一過性黒内障および一過性虚血性発作，偽脳腫瘍，下垂体腺腫，伝染性軟属腫，小管炎，ゆうぜいおよび乳頭腫，シラミ寄生症およびシラミ症，眼瞼炎，麦粒腫，前中隔蜂巣炎，霰粒腫，基底細胞癌腫，眼部帯状疱疹，シラミ寄生症およびシラミ症，眼窩下壁骨折，慢性流涙症，涙嚢炎，ヘルペス眼瞼炎，眼窩蜂巣炎，老人性内反，および扁平上皮癌が含まれる。
"代謝性疾病"とは，当該技術分野において知られるように，代謝性経路に影響を与える任意の疾病または状態を意味する。代謝性疾病は，遺伝的酵素異常（先天性代謝異常）による先天性のものか，または内分泌臓器の疾病または肝臓等の代謝的に重要な臓器の障害による後天性のもののために，異常な代謝性プロセスを引き起こしうる。１つの態様においては，代謝性疾病には，肥満，インスリン耐性，および糖尿病（例えば，Ｉ型および／またはＩＩ型糖尿病）が含まれる。
"皮膚疾病"とは，皮膚，真皮またはその中の任意の下部構造，例えば，髪，毛包等の任意の疾病または状態を意味する。皮膚疾病，疾患，状態および形質には，乾癬，異所性皮膚炎，皮膚癌，例えば黒色腫および基底細胞癌腫，抜け毛，脱毛，色の変化，および皮膚，真皮またはその中の構造に伴う他の任意音疾病，状態または形質が含まれる。
"聴覚疾病"とは，耳等の聴覚系，例えば内耳，中耳，外耳，蝸牛神経，およびその中の任意の下部構造の任意の疾病または状態を意味する。聴覚疾病，疾患，状態および形質には，聴力損失，難聴，耳鳴，メニエール病，めまい，バランスおよび運動疾患，および耳，またはその中の構造に伴う他の任意の疾病，状態または形質が含まれる。
本発明の１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子の各配列は，独立して，約１５−約３０ヌクレオチドの長さであり，特定の態様においては，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０ヌクレオチドの長さである。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡデュープレックスは，独立して，約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）塩基対を含む。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子の１またはそれ以上の鎖は，独立して，標的核酸分子に相補的な約１５−約３０（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０）ヌクレオチドを含む。さらに別の態様においては，ヘアピンまたは環状構造を含む本発明のｓｉＮＡ分子は，約３５−約５５（例えば，約３５，４０，４５，５０または５５）ヌクレオチドの長さであるか，または約３８−約４４（例えば，約３８，３９，４０，４１，４２，４３，または４４）ヌクレオチドの長さであり，約１５−約２５（例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）塩基対を含む。
本明細書において用いる場合，"細胞"は，その通常の生物学的意味で用いられ，多細胞生物全体を指さず，特にヒトを指さない。細胞は生物中で，例えば，鳥類，植物および哺乳動物，例えばヒト，ウシ，ヤギ，無尾サル，有尾サル，ブタ，イヌおよびネコ中で存在することができる。細胞は，原核生物（例えば細菌細胞）または真核生物（例えば哺乳動物または植物細胞）であってもよい。細胞は体細胞起源でも生殖細胞系起源でもよく，全能細胞でも多能性細胞でもよく，分裂していても分裂していなくてもよい。細胞はまた，配偶子または胚，幹細胞，または完全に分化した細胞に由来するか，またはこれらを含むものであってもよい。
１つの態様においては，本発明の処方分子組成物または処方ｓｉＮＡ組成物は，エクスビボで，または直接注射，カテーテル挿入，またはステント留置（例えば，門脈カテーテル挿入／ステント留置）によりインビボで，関連する組織に局所投与することができる。
１つの態様においては，本発明の処方分子組成物または処方ｓｉＮＡ組成物は，当該技術分野において知られる非経口投与により，例えば，静脈内，筋肉内，または皮下注射により，被験者または生物に全身デリバリーすることができる。
別の観点においては，本発明は，本発明の１またはそれ以上の処方分子組成物または処方ｓｉＮＡ組成物を含む哺乳動物細胞を提供する。１またはそれ以上の処方分子組成物または処方ｓｉＮＡ組成物は，独立して，同じまたは異なる部位を標的とすることができる。
"ＲＮＡ"とは，少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。"リボヌクレオチド"とは，β−Ｄ−リボフラノース成分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は，二本鎖ＲＮＡ，一本鎖ＲＮＡ，単離されたＲＮＡ，例えば部分的に精製されたＲＮＡ，本質的に純粋なＲＮＡ，合成ＲＮＡ，組換え的に製造されたＲＮＡ，ならびに１またはそれ以上のヌクレオチドの付加，欠失，置換および／または変更により天然に生ずるＲＮＡと異なるように変更されたＲＮＡを含む。そのような変更は，非ヌクレオチド物質の付加，例えば，ｓｉＮＡの末端または内部（例えばＲＮＡの少なくとも１またはそれ以上のヌクレオチド）への付加を含むことができる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた，標準的ではないヌクレオチド，例えば，天然に生じないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含むことができる。これらの変更されたＲＮＡは，類似体または天然に生ずるＲＮＡの類似体と称することができる。
"被験者"とは，外植された細胞のドナーまたはレシピエントである生物または細胞それ自体を意味する。"被験者"とはまた，本発明の核酸分子を投与することができる生物を表す。１つの態様においては，被験者は哺乳動物または哺乳動物細胞，例えば，ヒトまたはヒト細胞である。
本明細書において用いる場合，"ホスホロチオエート"との用語は，式Ｉ（式中，Ｚおよび／またはＷはイオウ原子を含む）を有するヌクレオチド間結合を表す。したがって，ホスホロチオエートとの用語は，ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートヌクレオチド間結合の両方を表す。
本明細書において用いる場合，"ホスホノアセテート"との用語は，式Ｉ（式中，Ｚおよび／またはＷはアセチル基または保護アセチル基を含む）を有するヌクレオチド間結合を表す。
本明細書において用いる場合，"チオホスホノアセテート"との用語は，式Ｉ（式中，Ｚはアセチル基または保護アセチル基を含み，Ｗはイオウ原子を含むか，あるいは，Ｗはアセチル基または保護アセチル基を含み，Ｚはイオウ原子を含む）を有するヌクレオチド間結合を表す。
本明細書において用いる場合，"万能塩基"との用語は，天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれと，これらをほとんど区別せずに塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体を表す。万能塩基の非限定的例としては，当該技術分野において知られるように，Ｃ−フェニル，Ｃ−ナフチル，および他の芳香族誘導体，イノシン，アゾールカルボキサミド，およびニトロアゾール誘導体，例えば，３−ニトロピロール，４−ニトロインドール，５−ニトロインドール，および６−ニトロインドールが挙げられる（例えば，Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７を参照）。
本明細書において用いる場合，"非環状ヌクレオチド"との用語は，非環状リボース糖を有する任意のヌクレオチド，例えば，リボース炭素（Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４，またはＣ５）にいずれかが，独立してまたは組み合わせてヌクレオチド中に存在しないヌクレオチドを表す。
さらに別の態様においては，処方分子組成物および処方ｓｉＮＡ組成物は，被験者または生物において，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られる疾病，形質，および状態を阻害，軽減または予防するために，他の既知の治療剤と組み合わせて用いられる。例えば，本明細書に記載される分子は，被験者または生物において，本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において知られる疾病，形質，および状態を阻害，軽減または予防するために，１またはそれ以上の既知の化合物，治療剤または方法と組み合わせて用いることができる。非限定的例においては，ＨＣＶ感染およびＨＢＶ感染に伴う合併症を治療するために用いられる処方分子組成物および処方ｓｉＮＡ組成物は，他のＨＣＶ治療剤，例えば，ＨＣＶワクチン；抗ＨＣＶ抗体，例えばＨｅｐｅＸ−ＣおよびＣｉｖａｃｉｒ；プロテアーゼ阻害剤，例えばＶＸ−９５０；ペギル化インターフェロン，例えばＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ，および／または他の抗ウイルス剤，例えばリバビリンおよび／またはバロピシタビンと組み合わせて用いられる。
１つの態様においては，本発明の処方ｓｉＮＡ組成物は，本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド分子（例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子）をコードする核酸配列をｓｉＮＡ分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクターを含む。例えば，ベクターは，デュープレックスを含むｓｉＮＡ分子の両方の鎖をコードする配列を含むことができる。ベクターはまた，自己相補的でありしたがってｓｉＮＡ分子を形成する単一の核酸分子をコードする配列を含むことができる。そのような発現ベクターの非限定的例は，Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００；およびＮｏｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５に記載されている。１つの態様においては，本発明の発現ベクターは，２またはそれ以上のｓｉＮＡ分子（同じであっても異なっていてもよい）をコードする核酸配列を含む。
本発明の別の観点においては，標的ＲＮＡ分子と相互作用して標的ＲＮＡ分子（例えば，本明細書においてＧｅｎｂａｎｋ受託番号で表される標的ＲＮＡ分子）をコードする遺伝子をダウンレギュレートする本発明のポリヌクレオチド，例えば，ｓｉＮＡ分子は，ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。組換えベクターはＤＮＡプラスミドであってもウイルスベクターであってもよい。ポリヌクレオチドを発現するウイルスベクターは，例えば，限定されないが，アデノ関連ウイルス，レトロウイルス，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築することができる。ポリヌクレオチド分子を発現しうる組換えベクターは，本明細書に記載されるようにしてデリバリーし，標的細胞中に残留させることができる。あるいは，ポリヌクレオチド分子の一過性発現を与えるウイルスベクターを用いることができる。そのようなベクターは，必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，ｓｉＮＡ分子は結合してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子機能または発現をダウンレギュレートする。処方分子組成物を発現するベクターのデリバリーは，全身的（例えば，静脈内または筋肉内投与により），被験者から外植された標的細胞に投与した後，被験者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれかの手段により行うことができる。
ｓｉＮＡを発現するベクター"ベクター"とは，所望の核酸をデリバリーするために使用される，任意の核酸−および／またはウイルス系手法を意味する。
本発明の他の特徴および利点は，以下の本発明の好ましい態様の説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
図面の簡単な説明
図１は，本発明のカチオン性脂質化合物の非限定的例を示す。
図２は，本発明のアセタール結合カチオン性脂質化合物の非限定的例を示す。
図３は，本発明のスクシニル／アシル結合カチオン性脂質化合物の非限定的例を示す。
図４は，本発明の芳香族カチオン性脂質化合物の非限定的例を示す。
図５は，本発明の別のカチオン性脂質化合物の非限定的例を示す。
図６は，処方分子組成物の成分の概略を示す。
図７は，処方分子組成物がとりうるラメラ構造および逆位六角形構造の概略図を示す。
図８は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物であるＬ０５１の成分を示す。
図９は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物であるＬ０７３の成分を示す。
図１０は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物であるＬ０６９の成分を示す。
図１１は，５００ｎｍの吸収により測定した，５０％血清における処方分子組成物の相対的濁度により測定した，処方分子組成物Ｌ０６５，Ｆ２，Ｌ０５１，およびＬ０７３の血清安定性を示すグラフである。処方分子組成物Ｌ０６５，Ｌ０５１，およびＬ０７３は血清中で安定である。
図１２は，３５０ｎｍの吸収により測定した処方分子組成物のｐＨ３．５−ｐＨ９．０の範囲のバッファ溶液における相対的濁度により測定した，処方分子組成物Ｌ０６５，Ｆ２，Ｌ０５１，およびＬ０７３のｐＨ依存的相転移を示すグラフである。処方分子組成物Ｌ０５１およびＬ０７３はそれぞれ，ｐＨ５．５−ｐＨ６．５で急速なｐＨ依存的相転移を起こした。
図１３は，３５０ｎｍの吸収により測定した処方分子組成物のｐＨ３．５−ｐＨ９．０の範囲のバッファ溶液における相対的濁度により測定した，処方分子組成物Ｌ０６９のｐＨ依存的相転移を示すグラフである。処方分子組成物Ｌ０６９はｐＨ５．５−ｐＨ６．５で急速なｐＨ依存的相転移を起こした。
図１４は，本発明のｓｉＮＡ分子の化学修飾の非限定的例を示す。
図１５は，ｓｉＮＡナノ粒子がＨｅｐＧ２細胞においてＨＢｓＡｇレベルを低下させるインビトロ効力の非限定的例を示す。活性な化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子を，ＨＢＶ部位２６３ＲＮＡを標的とするよう設計した（ｓｉＮＡ配列は図１４に示される）。図面は，処方された活性なｓｉＮＡＬ０５１ナノ粒子（表ＩＶを参照）で処置した細胞におけるＨＢｓＡｇのレベルを，未処置または負対照処置細胞と比較して示す。活性なｓｉＮＡで処置した細胞では，ＨＢｓＡｇレベルの用量依存的減少が観察されたが，負対照処置細胞では減少は認められなかった。
図１６は，ｓｉＮＡナノ粒子がＨｅｐＧ２細胞においてＨＢｓＡｇレベルを低下させるインビトロ効力の非限定的例を示す。活性な化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子を，ＨＢＶ部位２６３ＲＮＡを標的とするよう設計した（ｓｉＮＡ配列は図１４に示される）．図面は，処方された活性なｓｉＮＡＬ０５３およびＬ０５４ナノ粒子（表ＩＶを参照）で処置した細胞におけるＨＢｓＡｇのレベルを未処置または負対照処置細胞と比較して示す。活性なｓｉＮＡで処置した細胞では，ＨＢｓＡｇレベルの用量依存的減少が観察されたが，負対照処置細胞では減少は認められなかった。
図１７は，ｓｉＮＡナノ粒子がＨｅｐＧ２細胞においてＨＢｓＡｇレベルを低下させるインビトロ効力の非限定的例を示す。活性な化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子を，ＨＢＶ部位２６３ＲＮＡを標的とするよう設計した（ｓｉＮＡ配列は図１４に示される）。図面は，活性なｓｉＮＡ（表ＩＶを参照）を含む処方分子組成物Ｌ０６９で処置した細胞におけるＨＢｓＡｇのレベルを，未処置または負対照処置細胞と比較して示す。活性なｓｉＮＡで処置した細胞ではＨＢｓＡｇレベルの用量依存的減少が観察されたが，負対照処置細胞では減少は認められなかった。
図１８は，ＨＢＶマウスモデルにおける，全身投与されたｓｉＮＡＬ０５１（表ＩＶ）ナノ粒子の活性の非限定的例を示す。０．３μｇのｐＷＴＤＨＢＶベクターを含む尾静脈水圧注入を行った。活性なｓｉＮＡ分子を封入したナノ粒子を，ＨＤＩの６日後から初めて３日間，標準的なＩＶ注入で３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで投与した。動物の群（Ｎ＝５）を最後の投与の３および７日後に犠牲死させ，血清ＨＢＶＤＮＡのレベルを測定した。ＨＢＶＤＮＡタイターは定量的リアルタイムＰＣＲにより測定し，平均ｌｏｇ１０コピー／ｍｌ（±ＳＥＭ）で表した。
図１９は，ＨＢＶマウスモデルにおける，全身投与されたｓｉＮＡＬ０５１（表ＩＶ）ナノ粒子の活性の非限定的例を示す。０．３μｇのｐＷＴＤＨＢＶベクターを含む尾静脈水圧注入を行った。活性なｓｉＮＡ分子を封入したナノ粒子を，ＨＤＩの６日後から初めて３日間，標準的なＩＶ注入で３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで投与した。動物の群（Ｎ＝５）を最後の投与の３および７日後に犠牲死させ，血清ＨＢｓＡｇのレベルを測定した。血清ＨＢｓＡｇレベルはＥＬＩＳＡによりアッセイし，平均ｌｏｇ１０ｐｇ／ｍｌ（±ＳＥＭ）で表した。
図２０は，Ｈｕｈ７ＨＣＶレプリコン系において用量依存的な，ウイルス複製を標的とする処方ｓｉＮＡＬ０５１（表ＩＶ）ナノ粒子コンストラクトの非限定的例を示す。活性なｓｉＮＡ処方物を，１，５，１０，および２５ｎＭで，未処置細胞（"ｕｎｔｒｅａｔｅｄ"），および同じ濃度の処方された不活性なｓｉＮＡスクランブル化対照コンストラクトと比較して評価した。
図２１は，Ｈｕｈ７ＨＣＶレプリコン系において用量依存的な，ウイルス複製を標的とする処方ｓｉＮＡＬ０５３およびＬ０５４（表ＩＶ）ナノ粒子コンストラクトの非限定的例を示す。活性なｓｉＮＡ処方物を，１，５，１０，および２５ｎＭで，未処置細胞（"ｕｎｔｒｅａｔｅｄ"），および同じ濃度の処方された不活性なｓｉＮＡスクランブル化対照コンストラクトと比較して評価した。
図２２は，非処方ｓｉＮＡ，コレステロール−コンジュゲート化ｓｉＮＡ，および処方ｓｉＮＡ（処方分子組成物１８．１および１９．１）を気管内投与した後の，マウスの肺組織におけるｓｉＮＡの分布を示す。示されるように，分子組成物Ｔ０１８．１またはＴ０１９．１で処方したｓｉＮＡを用いたときに，肺組織における暴露の最大半減期が観察された。
図２３は，３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）の合成に用いられる合成スキームの非限定的例を示す。
図２４は，１−［８’−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−コレステロール）および３，４−ジテトラデコキシイルベンジル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル（ＰＥＧ−ＤＭＢ）の合成に用いられる合成スキームの非限定的例を示す。
図２５は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物であるＬ０８３の成分を示す。
図２６は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物であるＬ０７７の成分を示す。
図２７は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物であるＬ０８０の成分を示す。
図２８は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物であるＬ０８２の成分を示す。
図２９は，ＨＢＶマウスモデルにおける，全身投与されたｓｉＮＡＬ０７７，Ｌ０６９，Ｌ０８０，Ｌ０８２，Ｌ０８３，Ｌ０６０，Ｌ０６１，およびＬ０５１（表ＩＶ）ナノ粒子の活性の非限定的例を示す。０．３μｇのｐＷＴＤＨＢＶベクターを含む尾静脈水圧注入を行った。ナノ粒子に封入された活性なｓｉＮＡ分子を，３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで標準的なＩＶ注入でＨＤＩの６日後から初めて３日間投与した。最後の投与の３および７日後に動物の群（Ｎ＝５）を犠牲死させて，血清ＨＢＶＤＮＡのレベルを測定した。ＨＢＶＤＮＡタイターは定量的リアルタイムＰＣＲにより測定し，平均ｌｏｇ１０コピー／ｍｌ（±ＳＥＭ）で表した。
図３０は，ＨＢＶマウスモデルにおける，全身投与されたｓｉＮＡＬ０８３およびＬ０８４（表ＩＶ）ナノ粒子の用量応答活性の非限定的例を示す。０．３μｇのｐＷＴＤＨＢＶベクターを含む尾静脈水圧注入を行った。活性なｓｉＮＡ分子を封入したナノ粒子を，ＨＤＩの６日後から初めて３日間，標準的なＩＶ注入で３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで投与した。動物の群（Ｎ＝５）を最後の投与の３および７日後に犠牲死させ，血清ＨＢｓＡｇのレベルを測定した。血清ＨＢｓＡｇレベルはＥＬＩＳＡによりアッセイし，平均ｌｏｇ１０ｐｇ／ｍｌ（±ＳＥＭ）で表した。
図３１は，ＨＢＶマウスモデルにおける，全身投与されたｓｉＮＡＬ０７７（表ＩＶ）ナノ粒子の用量応答活性の非限定的例を示す。０．３μｇのｐＷＴＤＨＢＶベクターを含む尾静脈水圧注入を行った。活性なｓｉＮＡ分子を封入したナノ粒子を，ＨＤＩの６日後から初めて３日間，標準的なＩＶ注入で３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで投与した。動物の群（Ｎ＝５）を最後の投与の３および７日後に犠牲死させ，血清ＨＢｓＡｇのレベルを測定した。血清ＨＢｓＡｇレベルはＥＬＩＳＡによりアッセイし，平均ｌｏｇ１０ｐｇ／ｍｌ（±ＳＥＭ）で表した。
図３２は，ＨＢＶマウスモデルにおける，全身投与されたｓｉＮＡＬ０８０（表ＩＶ）ナノ粒子の用量応答活性の非限定的例を示す。０．３μｇのｐＷＴＤＨＢＶベクターを含む尾静脈水圧注入を行った。活性なｓｉＮＡ分子を封入したナノ粒子を，ＨＤＩの６日後から初めて３日間，標準的なＩＶ注入で３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで投与した。動物の群（Ｎ＝５）を最後の投与の３および７日後に犠牲死させ，血清ＨＢｓＡｇのレベルを測定した。血清ＨＢｓＡｇレベルはＥＬＩＳＡによりアッセイし，平均ｌｏｇ１０ｐｇ／ｍｌ（±ＳＥＭ）で表した。
図３３は，ｓｉＮＡＬ０７７，Ｌ０８０，Ｌ０８２，およびＬ０８３（表ＩＶ）ナノ粒子処方物の血清安定性の非限定的例を示す。
図３４は，３５０ｎｍの吸収により測定した処方分子組成物のｐＨ３．５−ｐＨ９．０の範囲のバッファ溶液における相対的濁度により測定した，ｓｉＮＡＬ０７７，Ｌ０８０，Ｌ０８２，およびＬ０８３（表ＩＶ）ナノ粒子処方物のｐＨ依存的相転移を示すグラフである。処方分子組成物Ｌ０６９はｐＨ５．５−ｐＨ６．５で急速なｐＨ依存的相転移を起こした。
図３５は，ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞における，ＭａｐＫ１４部位１０３３を標的とするＬＮＰ５８およびＬＮＰ９８処方物の効力のデータをＬＦＫ２０００および処方された無関係ｓｉＮＡ対照を比較して示す。
図３６は，ＭＭ１４．Ｌｕ正常マウス肺細胞における，ＭａｐＫ１４部位１０３３を標的とするＬＮＰ９８処方物の効力のデータをＬＦＫ２０００および処方された無関係ｓｉＮＡ対照を比較して示す。
図３７は，６．１２Ｂリンパ球における，ＭａｐＫ１４部位１０３３を標的とするＬＮＰ５４，ＬＮＰ９７，およびＬＮＰ９８処方物の効力のデータをＬＦＫ２０００および処方された無関係ｓｉＮＡ対照と比較して示す。
図３８は，ＮＩＨ３Ｔ３細胞における，ＭａｐＫ１４部位１０３３を標的とするＬＮＰ９８処方物の効力のデータをＬＦＫ２０００および処方された無関係ｓｉＮＡ対照を比較して示す。
図３９は，ＲＡＷ２６４．７細胞における，ＭａｐＫ１４ＬＮＰ５４およびＬＮＰ９８処方ｓｉＮＡによるＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存的減少を示す。
図４０は，ＭＭ１４．Ｌｕ細胞における，ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９８処方ｓｉＮＡによるＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存的減少を示す。
図４１は，６．１２Ｂ細胞における，ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９７およびＬＮＰ９８処方ｓｉＮＡによるＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存的減少を示す。
図４２は，ＮＩＨ３Ｔ３細胞における，ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９８処方ｓｉＮＡによるＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存的減少を示す。
図４３は，ＯＶＡチャレンジ媒介気道過敏性のマウスモデルにおける，ＩＬ−４Ｒを標的とするＬＮＰ−５１処方ｓｉＮＡを用いる治療による気道過敏性の低下の非限定的例を示す。活性な処方ｓｉＮＡを０．０１，０．１，および１．０ｍｇ／ｋｇで試験し，ＬＮＰベヒクル単独および未処置（ナイーブ）動物と比較した。
図４４は，ＬＮＰ処方ｓｉＮＡにより媒介されるインビボでのハンチントン（ｈｔｔ）遺伝子発現の阻害の非限定的例を示す。Ａｌｚｅｔ浸透圧ポンプを用いて，ＬＮＰ中に封入したｓｉＮＡを０．１−１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でマウス側方心室または線条体にそれぞれ７または１４日間注入した（総投与量は８．４−８４μｇの範囲である）。ＬＮＰ−０９８またはＬＮＰ−０６１で処方した活性なｓｉＮＡで処置した動物を，ＬＮＰ−０６１で処方したミスマッチ対照ｓｉＮＡおよび未処置動物対照と比較した。ハンチントン（ｈｔｔ）遺伝子発現レベルはＱＰＣＲにより測定した。
発明の詳細な説明
本発明の核酸分子の作用のメカニズム
アプタマー：核酸アプタマーは，目的とする特定のリガンドに特異的に結合するよう選択することができる（例えば，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，５６７，５８８および米国特許５，４７５，０９６，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，２０００，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，５；Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２，１００；Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０；およびＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８を参照）。例えば，インビトロ選択を適用してＣｙｌＡに対する結合特異性を有する核酸アプタマーを進化させることができる。核酸アプタマーは，本明細書に記載される化学的修飾およびリンカーを含むことができる。本発明の核酸アプタマーは，二本鎖であっても一本鎖であってもよく，１つの区別しうる核酸配列を含んでいてもよく，互いに複合体化された２以上の核酸配列を含んでいてもよい。ＣｙｌＡに結合する本発明のアプタマー分子はＣｙｌＡのプロテアーゼ活性を調節し，続いてサイトリシンを活性化することができ，したがって，腸球菌感染に伴う急性毒性を調節することができる。
アンチセンス：アンチセンス分子は，修飾されたまたは修飾されていないＲＮＡ，ＤＮＡ，または混合ポリマーのオリゴヌクレオチドであることができ，主として，マッチする配列に特異的に結合することにより機能し，ペプチド合成を調節する（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，Ｎｏｖ １９９４，Ｂｉｏ Ｐｈａｒｍ，２０−３３）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，標的ＲＮＡにワトソンクリック塩基対形成により結合し，立体的障害により結合した配列のリボソーム翻訳を防止することによりまたはＲＮａｓｅＨ酵素を活性化することにより遺伝子発現を妨害する。アンチセンス分子はまた，ＲＮＡのプロセシングまたは核から細胞質への輸送を妨害することにより蛋白質合成を変化させることができる（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ＆Ｒｏｔｈ，１９９６，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ７，１５１−１９０）。
さらに，一本鎖ＤＮＡのＲＮＡへの結合により，ヘテロデュープレックスがヌクレアーゼ分解される（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，（上掲），Ｃｒｏｏｋｅ，（上掲））。これまでのところ，ＲＮａｓｅＨの基質として作用する，主鎖を化学的に修飾したＤＮＡは，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエートおよびボロントリフルオリデートのみである。最近，２’−アラビノおよび２’−フルオロアラビノ含有オリゴもまたＲＮａｓｅＨ活性を活性化することが報告された。
化学的に修飾されたヌクレオチドの新規なコンフィギュレーション，二次構造，および／またはＲＮａｓｅＨ基質ドメインを利用する多数のアンチセンス分子が記載されている（Ｗｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ；米国特許５，９８９，９１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願６０／０８２，４０４，１９９８年４月２０日出願；Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願６０／１０１，１７４，１９９８年９月２１日出願）（これらはその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。
アンチセンスＤＮＡを用いて，ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によりＲＮＡを標的化して，このことによりＲＮａｓｅＨを活性化すｍデュープレックス中の標的ＲＮＡを消化することができる。アンチセンスＤＮＡは，化学的に合成することができ，または一本鎖ＤＮＡの細胞内発現ベクターまたはその同等物を用いて発現させることができる。
トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）：配列特異的様式でゲノムＤＮＡに結合するように一本鎖オリゴヌクレオチドを設計することができる。ＴＦＯは，フーグスティーン塩基対形成を介してＤＮＡらせんに結合するピリミジンリッチオリゴヌクレオチドから構成される（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，（上掲））。さらに，ＴＦＯは，化学的に修飾して，標的ＤＮＡ配列に対する結合親和性を高めることができる。得られるＤＮＡセンス，ＤＮＡアンチセンス，およびＴＦＯからなる三重らせんは，ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成を破壊する。結合が不可逆的であるため，ＴＦＯメカニズムにより遺伝子発現または細胞死が生じうる（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ＆Ｒｏｔｈ，（上掲））。
２’−５’オリゴアデニレート：２−５Ａシステムは，高等脊椎動物に見いだされるＲＮＡ分解のインターフェロン媒介性メカニズムである（Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ；１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３，６７８０−６７８５）。ＲＮＡ切断には，２種類の酵素，すなわち，２−５ＡシンセターゼおよびＲＮａｓｅＬが必要である。２−５Ａシンセターゼは，２’−５’オリゴアデニレート（２−５Ａ）を形成するのに二本鎖ＲＮＡを必要とする。次に，２−５Ａは，一本鎖ＲＮＡを切断する能力を有するＲＮａｓｅＬを利用するためのアロステリックエフェクターとして作用する。二本鎖ＲＮＡとともに２−５Ａ構造を形成する能力のため，このシステムはウイルス複製の阻害に特に有用である。
（２’−５’）オリゴアデニレート構造は，アンチセンス分子に共有結合で結合して，ＲＮＡ切断が可能なキメラオリゴヌクレオチドを形成することができる（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，（上掲））。これらの分子は，おそらくは，２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに結合してこれを活性化し，次にオリゴヌクレオチド／酵素複合体が標的ＲＮＡ分子に結合し，これは次にＲＮａｓｅ酵素により切断されることができる。２’−５’オリゴアデニレート構造の共有結合は，アンチセンス用途に限定されず，本発明の核酸分子への結合を含むようにさらに作り上げることができる。
酵素的核酸：現在，天然に生ずる酵素的ＲＮＡのいくつかの変種が知られている（Ｄｏｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ，２００１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３０，４５７−４７５；Ｓｙｍｏｎｓ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，４，３２２−３０）。さらに，いくつかのインビトロ選択（進化）戦略（Ｏｒｇｅｌ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ２０５，４３５）を用いて，ホスホジエステル結合の切断およびライゲーションを触媒しうる新たな核酸触媒が発展してきた（Ｊｏｙｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３−８７；Ｂｅａｕｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙｃｅ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６７，９０−９７；Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＴＩＢＴＥＣＨ １２，２６８；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ １７，８９−９３；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４，４２６２；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＲＮＡ ３，９１４；Ｎａｋａｍａｙｅ＆Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９４，（上掲）；Ｌｏｎｇ＆Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９４，（上掲）；Ｉｓｈｉｚａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，（上掲）；Ｖａｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ ３６，６４９５。それぞれは，生理学的条件下で，ホスホジエステル結合をトランスで加水分解することを含む一連の反応を触媒することができる（したがって，他のＲＮＡ分子を切断しうる）。
酵素的核酸の酵素的性質は，治療を行うのに必要な核酸の濃度が低いなどの重要な利点を有する。この利点は，酵素的核酸分子が酵素的に作用する能力を反映している。すなわち，１つの酵素的核酸分子が多くの標的ＲＮＡ分子を切断することができる。さらに，酵素的核酸分子は，高度に特異的な調節剤であり，その調節の特異性は，標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成メカニズムのみならず，標的ＲＮＡ切断のメカニズムにも依存する。切断の部位の近くにおける１つのミスマッチまたは塩基置換を選択して，酵素的核酸分子の触媒活性を完全に排除することができる。
エンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸分子は，ヌクレオチド塩基配列に特異的な様式で他の別のＲＮＡ分子を繰り返し切断することができる。適切な設計および構造を有するそのような酵素的核酸分子は，事実上すべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができ，インビトロで有効な切断を達成することができる（Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，３２４，Ｎａｔｕｒｅ ４２９ １９８６；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８７ Ｎａｔｕｒｅ ３２８，５９６；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，８４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７８８，１９８７；Ｄｒｅｙｆｕｓ，１９８８，Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，６，９２；Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，３３４ Ｎａｔｕｒｅ ５８５，１９８８；Ｃｅｃｈ，２６０ ＪＡＭＡ ３０３０，１９８８；Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３７１，１９８９；Ｃｈａｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３，４０９２；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７（上掲））ＰＮＡＳ ９４，４２６２）。
その配列特異性のため，トランス切断酵素的核酸分子は，ヒトの疾患の治療剤として有望である（Ｕｓｍａｎ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５ Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｍａｒｒ，１９９５ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３７）。酵素的核酸分子は，細胞性ＲＮＡのバックグラウンド中で特定のＲＮＡ標的を切断するよう設計することができる。そのような切断事象は，ＲＮＡを非機能性にし，そのＲＮＡからの蛋白質発現を排除する。このようにして，疾患状態に関連する蛋白質の合成を選択的に調節することができる（Ｗａｒａｓｈｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｈｅｎａｉｓｔｔｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６，２３７−２５０）。
本発明はまた，本発明の核酸デコイおよび／またはアプタマーを含むセンサードメインを有する核酸センサー分子またはアロザイムを特徴とする。核酸センサー分子のセンサードメインと分子標的との相互作用は，標的シグナリング分子の存在下で核酸センサー分子の活性が調節されるように，核酸センサー分子の酵素的核酸ドメインを活性化または不活性化することができる。核酸センサー分子は，標的分子の存在下で活性であるように設計してもよく，あるいは，分子標的の存在下で不活性であるように設計してもよい。例えば，核酸センサー分子は，リガンドに対して結合特異性を有するアプタマーを含むセンサードメインを有するように設計する。非限定的例においては，リガンドと核酸センサー分子のセンサードメインとの相互作用により，センサー分子が反応，例えば，リガンドをコードするＲＮＡの切断を触媒するように，核酸センサー分子の酵素的核酸ドメインが活性化される。この例においては，核酸センサー分子は，リガンドの存在下で活性化され，リガンドに関連する疾病または状態を治療する治療剤として用いることができる。あるいは，反応は，標識された核酸レポーター分子の切断またはライゲーションを含むことができ，ある系におけるリガンドの存在を検出する有用な診断試薬が得られる。
ＲＮＡ干渉：以下の議論は，現在知られている短干渉ＲＮＡにより媒介されるＲＮＡ干渉の提唱されるメカニズムを記載するが，限定を意味するものではなく，先行技術であると認めるものではない。本出願人は，本明細書において，化学的に修飾された短干渉核酸がｓｉＲＮＡ分子と類似のまたは改良されたＲＮＡｉ媒介能力を有し，インビボで改良された安定性および活性を有すると予測されることを示す。したがって，この議論は，ｓｉＲＮＡのみに限定されることを意味するものではなく，ｓｉＮＡ全体に適用することができる。"ＲＮＡｉを媒介する改良された能力"または"改良されたＲＮＡｉ活性"とは，インビトロおよび／またはインビボで測定されたＲＮＡｉ活性を含むことを意味し，ここで，ＲＮＡｉ活性はｓｉＮＡがＲＮＡｉを媒介する能力と本発明のｓｉＮＡの安定性との両方を反映する。本発明においては，これらの活性の積を，全ＲＮＡ ｓｉＲＮＡまたは複数のリボヌクレオチドを含むｓｉＮＡと比較して，インビトロおよび／またはインビボで増加させることができる。場合によっては，ｓｉＮＡ分子の活性または安定性は低下するかもしれないが（すなわち，１０分の１以下），ｓｉＮＡ分子の全体的活性はインビトロおよび／またはインビボで増強される。
ＲＮＡ干渉とは，動物において短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを表す（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）。植物における対応するプロセスは一般に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと称され，真菌においてはクエリングとも称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは，外来遺伝子の発現を防止するために用いられる進化的に保存された細胞防御メカニズムであると考えられており，異なる叢および門が共通して有している（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８）。そのような外来遺伝子発現からの防御は，ウイルス感染または宿主ゲノム中へのトランスポゾン要素のランダムインテグレーションから生ずる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応答して，相同的一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答により進化してきたのであろう。細胞におけるｄｓＲＮＡの存在は，まだ完全には特性決定されていないメカニズムにより，ＲＮＡｉ応答を引き起こす。このメカニズムは，蛋白質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニレートシンセターゼのｄｓＲＮＡ媒介性活性化の結果，リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断が生ずるインターフェロン応答とは異なるようである。
細胞中に長いｄｓＲＮＡが存在すると，ダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは，ｄｓＲＮＡをプロセシングして短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られる短い断片のｄｓＲＮＡとすることに関与している（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。ダイサー活性から生ずる短干渉ＲＮＡは，典型的には約２１−２３ヌクレオチドの長さであり，約１９塩基対のデュープレックスを含む。ダイサーはまた，翻訳制御における関与が示唆されている保存された構造の前駆体ＲＮＡから２１および２２ヌクレオチドの小さな一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）を切り出すことに関与することが示唆されている（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答はまた，一般にＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称される，ｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし，これはｓｉＲＮＡと相同な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は，ｓｉＲＮＡデュープレックスのガイド配列に相補的な領域の中央部で生ずる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８）。さらに，ＲＮＡ干渉には，小さいＲＮＡ（例えば，マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）に媒介される遺伝子サイレンシングが関与する場合もある。これはおそらくは，クロマチン構造を制御する細胞性メカニズムによるものであり，このことにより標的遺伝子配列の転写が妨害される（例えば，Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照）。このように，本発明のｓｉＮＡ分子は，ＲＮＡ転写産物との相互作用を介して，あるいは特定の遺伝子配列との相互作用により，遺伝子サイレンシングを媒介するために用いることができ，そのような相互作用により転写レベルまたは転写後レベルのいずれかで遺伝子サイレンシングが生ずる。
ＲＮＡｉは種々の系で研究されてきた。Ｆｉｒｅら（１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）は，Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓにおいて最初にＲＮＡｉを観察した。ＷｉａｎｎｙおよびＧｏｅｔｚ（１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２，７０）は，マウス胚においてｄｓＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉを記載する。Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）は２，ｄｓＲＮＡでトランスフェクトしたショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉを記載する。Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４）は，培養哺乳動物細胞，例えばヒト胚性腎臓細胞およびＨｅＬａ細胞において，合成の２１ヌクレオチドＲＮＡのデュープレックスを導入することにより誘導されるＲＮＡｉを記載する。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究は，効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するために必須であるｓｉＲＮＡの長さ，構造，化学組成，および配列についてのある種の要件を明らかにした。これらの研究は，２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡデュープレックスは２つの２ヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む場合に最も活性であることを示した。さらに，一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖を２’−デオキシまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が破壊されるが，３’末端ｓｉＲＮＡヌクレオチドをデオキシヌクレオチドで置換することは許容されることが示された。ｓｉＲＮＡデュープレックスの中心におけるミスマッチ配列もまたＲＮＡｉ活性を破壊することが示された。さらに，これらの研究はまた，標的ＲＮＡにおける切断部位の位置はｓｉＲＮＡガイド配列の３’末端ではなくガイド配列の５’末端により規定されることを示した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７）。他の研究は，ｓｉＲＮＡデュープレックスの標的相補鎖の５’−リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であり，ｓｉＲＮＡの５’−リン酸成分を維持するためにＡＴＰが用いられることを示した（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）。しかし，５’−リン酸を欠失したｓｉＲＮＡ分子は，外的に導入したときに活性であり，このことは，インビボでｓｉＲＮＡコンストラクトの５’−リン酸化が生じているかもしれないことを示唆する。
核酸分子の合成
１００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は，自動化方法を用いては困難であり，そのような分子の治療コストは非常に高くなる。本発明においては，好ましくは，小さい核酸モチーフ（"小さい"とは，１００ヌクレオチド以下の長さ，好ましくは８０ヌクレオチド以下の長さ，最も好ましくは５０ヌクレオチド以下の長さの核酸モチーフ，例えば，別々のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド配列またはタンデムで合成されたｓｉＮＡ配列を表す）が外的デリバリーに用いられる。これらの分子は構造が簡単であるため，核酸が蛋白質および／またはＲＮＡ構造の標的領域に進入する能力が高い。本発明の例示的分子は化学的に合成するが，他の分子も同様に合成することができる。
オリゴヌクレオチド（例えば，ある種の修飾オリゴヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを欠失しているオリゴヌクレオチドの一部）は，例えば，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開９９／５４４５９，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９，Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５，およびＢｒｅｎｎａｎ，米国特許６，００１，３１１に記載されるような，当該技術分野において知られるプロトコルを用いて合成する（これらの文献はすべて本明細書の一部としてここに引用する）。オリゴヌクレオチドの合成は，一般の核酸保護基およびカップリング基，例えば５’末端にジメトキシトリチル，および３’末端にホスホルアミダイトを用いて行う。非限定的例においては，３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で，０．２μｍｏｌスケールのプロトコルで，２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程，および２’−デオキシヌクレオチドまたは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドについては４５秒間のカップリング工程で，小スケールの合成を行う。表ＩＩは，合成サイクルで用いる試薬の量および接触時間の概要を示す。あるいは，０．２μｍｏｌスケールでの合成は，９６ウエルプレート合成機，例えば，Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造される装置で，サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいては，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトおよび１０５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いることができる。デオキシ残基の各カップリングサイクルにおいては，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して２２倍過剰（４０μＬの０．１１Ｍ＝４．４μｍｏｌ）のデオキシホスホルアミダイトおよび７０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（４０μＬの０．２５Ｍ＝１０μｍｏｌ）を用いることができる。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定して，典型的には９７．５−９９％である。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ(ＡＢＩ）であり；キャッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は，ＴＨＦ中１６．９ｍＭ Ｉ２，４９ｍＭピリジン，９％水（Ｐｅｒ Ｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは試薬瓶から直接用いる。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成する。あるいは，ホスホロチオエート結合の導入のためには，ボーケージ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド，アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
ＤＮＡ系オリゴヌクレオチドの脱保護は以下のように行う：ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中で６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後，上清をポリマー支持体から取り出す。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を得る。
本発明のある種のｓｉＮＡ分子を含むＲＮＡについて用いられる合成方法は，Ｕｓｍａｎら（１９８７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５），Ｓｃａｒｉｎｇｅら（１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３）およびＷｉｎｃｏｔｔら（１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４），Ｗｉｎｃｏｔｔら（１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９）に記載の方法にしたがい，慣用の核酸保護基およびカップリング基，例えば，５’末端にジメトキシトリチル，および３’末端にホスホルアミダイトを用いて行う。非限定的例においては，小スケールの合成は，３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機で，改変した０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを用いて，アルキルシリル保護ヌクレオチドについては７．５分間のカップリング工程を，２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程を行う。表ＩＩは，合成サイクルにおいて用いる試薬の量および接触時間の概要を示す。あるいは，０．２μｍｏｌスケールでの合成は，９６ウエルプレート合成機，例えば，Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造される装置で，サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいては，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトおよび７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いることができる。リボ残基の各カップリングサイクルにおいては，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して６６倍過剰（１２０μＬの０．１１Ｍ＝１３．２μｕｍｏｌ）のアルキルシリル（リボ）保護ホスホルアミダイトおよび１５０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（１２０μＬの０．２５Ｍ＝３０μｍｏｌ）を用いることができる。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定して，典型的には９７．５−９９％である。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ(ＡＢＩ）であり；キャッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は，ＴＨＦ中１６．９ｍＭ Ｉ２，４９ｍＭピリジン，９％水（Ｐｅｒ Ｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは試薬瓶から直接用いる。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成する。あるいは，ホスホロチオエート結合の導入のためには，ボーケージ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド，アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
ＲＮＡの脱保護は，２ポットプロトコルまたは１ポットプロトコルのいずれかを用いて行う。２ポットプロトコルについては，ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中で６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後，上清をポリマー支持体から取り出す。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を得る。塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（１．５ｍＬ Ｎ−メチルピロリジノン，７５０μＬ ＴＥＡおよび１．０ｍＬ ＴＥＡ・３ＨＦの溶液３００μＬ，ＨＦ濃度１．４Ｍ）に再懸濁し，６５℃に加熱する。１．５時間後，オリゴマーを１．５Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３で反応を停止させる。
あるいは，１ポットプロトコルのためには，ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，３３％エタノール性メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ）の溶液中で，６５℃で１５分間懸濁する。バイアルを室温にする。ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）を加え，バイアルを６５℃で１５分間加熱する。試料を−２０℃に冷却し，次に１．５Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３で反応を停止させる。
トリチルオンオリゴマーの精製のためには，停止したＮＨ４ＨＣＯ３溶液を，アセトニトリル，続いて５０ｍＭ ＴＥＡＡで予備洗浄したＣ−１８含有カートリッジに負荷する。負荷したカートリッジを水で洗浄した後，ＲＮＡを０．５％ＴＦＡで１３分間脱トリチル化する。次にカートリッジを水で再び洗浄し，１Ｍ ＮａＣｌで塩交換し，再び水で洗浄する。次に，３０％アセトニトリルでオリゴヌクレオチドを溶出する。
平均段階カップリング収率は，典型的には＞９８％である（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）。当業者は，合成のスケールは，上述の例より大きくまたは小さく，例えば，限定されないが，９６ウエルのフォーマットに適合させることができること認識するであろう。
あるいは，本発明の核酸分子は，別々に合成して，合成後に例えばライゲーションにより（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．国際公開ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８，２０４），または合成および／または脱保護の後にハイブリダイゼーションにより，一緒につなげてもよい。
本発明のｓｉＮＡ分子はまた，本明細書の実施例１に記載されるようにタンデム合成法により合成することができる。この方法では，両方のｓｉＮＡ鎖を，切断可能なリンカーにより分離された単一の連続するオリゴヌクレオチドフラグメントまたは鎖として合成し，次にこれを切断して別々のｓｉＮＡフラグメントまたは鎖を生成し，これはハイブリダイズしてｓｉＮＡデュープレックスの精製を可能とする。リンカーはポリヌクレオチドリンカーであっても非ヌクレオチドリンカーであってもよい。本明細書に記載されるｓｉＮＡのタンデム合成は，マルチウエル／マルチプレート合成プラットフォーム，例えば９６ウエルまたは同様のより大きなマルチウエルプラットフォームのいずれにも容易に適合させることができる。本明細書に記載されるｓｉＮＡのタンデム合成はまた，バッチリアクター，合成カラムなどを用いる大規模合成プラットフォームにも容易に適合させることができる。
ｓｉＮＡ分子はまた，一方のフラグメントがＲＮＡ分子のセンス領域を含み，第２のフラグメントがアンチセンス領域を含む２つの別々の核酸鎖またはフラグメントから組み立ててもよい。
本発明の核酸分子は，広範囲に修飾して，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｈによる修飾により安定性を高めることができる（概説として，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ １７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３を参照）。ｓｉＮＡコンストラクトは，一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）により精製し，水に再懸濁する。
本発明の別の観点においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。組換えベクターは，ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターでありうる。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは，限定されないが，アデノ随伴ウイルス，レトロウイルス，アデノウイルスまたはアルファウイルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ分子を発現しうる組換えベクターを本明細書に記載されるようにデリバリーし，標的細胞中に残留させることができる。あるいは，ｓｉＮＡ分子の過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いてもよい。
処方分子組成物の製造
核酸処方物を製造する方法は，米国特許５，９７６，５６７，米国特許５，９８１，５０１および国際公開ＷＯ９６／４０９６４（これらの教示はすべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に開示されている。本発明において有用なカチオン性脂質は，選択されたｐＨ，例えば生理学的ｐＨで正味正電荷をもつ多数の脂質種のいずれであってもよい。適当なカチオン性脂質としては，例えば，限定されないが，式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸのいずれかを有する化合物，ＤＯＤＡＣ，ＤＯＴＭＡ，ＤＤＡＢ，ＤＯＴＡＰ，ＤＯＤＡＰ，ＤＯＣＤＡＰ，ＤＬＩＮＤＡＰ，ＤＯＳＰＡ，ＤＯＧＳ，ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＭＲＩＥ，ならびに本明細書に記載される他のカチオン性脂質，またはこれらの組み合わせが挙げられる。多数のこれらのカチオン性脂質および関連する類似体もまた本発明において有用であり，これらは米国特許出願０８／３１６，３９９；米国特許５，２０８，０３６，５，２６４，６１８，５，２７９，８３３および５，２８３，１８５（その開示を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。さらに，多数の市販のカチオン性脂質の調製物が入手可能であり，本発明において用いることができる。これらには，例えば，ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む市販のカチオン性リポソーム，ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む市販のカチオン性リポソーム，ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）；およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（ＤＯＧＳを含む市販のカチオン性リポソーム，ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）が含まれる。
本発明において用いられる非カチオン性脂質は，安定な複合体を生成しうる種々の中性の荷電していない，両性イオン性またはアニオン性脂質のいずれでもよい。これらは，好ましくは中性であるが，あるいは正または負に荷電していてもよい。本発明において有用な非カチオン性脂質の例としては，リン脂質関連物質，例えば，レシチン，ホスファチジルエタノールアミン，リソレシチン，リソホスファチジルエタノールアミン，ホスファチジルセリン，ホスファチジルイノシトール，スフィンゴミエリン，セファリン，カルジオリピン，ホスファチジン酸，セレブロシド，ジセチルホスフェート，ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ），ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ），ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ），ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ），ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ），ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ），パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ），パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）およびジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）が挙げられる。非カチオン性脂質またはステロール類，例えばコレステロールが存在していてもよい。別の非リン含有脂質は，例えば，ステアリルアミン，ドデシルアミン，ヘキサデシルアミン，パルミチン酸アセチル，リシノール酸グリセロール，ステアリン酸ヘキサデシル，ミリスチン酸イソプロピル，両性アクリル酸ポリマー，トリエタノールアミン−ラウリル硫酸，アルキル−アリール硫酸ポリエチルオキシ化脂肪酸アミド，臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム等，ジアシルホスファチジルコリン，ジアシルホスファチジルエタノールアミン，セラミド，スフィンゴミエリン，セファリン，およびセレブロシドである。他の脂質，例えば，リソホスファチジルコリンおよびリソホスファチジルエタノールアミンが存在していてもよい。また，非カチオン性脂質には，ポリエチレングリコール系ポリマー，例えば，ＰＥＧ２０００，ＰＥＧ５０００，および係属中の米国特許出願０８／３１６，４２９（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるようなリン脂質またはセラミドにコンジュゲートさせたポリエチレングリコール（ＰＥＧ−Ｃｅｒと称される）が含まれる。
１つの態様においては，非カチオン性脂質は，ジアシルホスファチジルコリン（例えば，ジステアロイルホスファチジルコリン，ジオレオイルホスファチジルコリン，ジパルミトイルホスファチジルコリンまたはジリノレオイルホスファチジルコリン），ジアシルホスファチジルエタノールアミン（例えば，ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびパルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン），セラミドまたはスフィンゴミエリンである。これらの脂質中のアシル基は，好ましくは，約Ｃ１０−約Ｃ２４の炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。１つの態様においては，アシル基は，ラウロイル，ミリストイル，パルミトイル，ステアロイルまたはオレオイルである。別の態様においては，非カチオン性脂質は，コレステロール，１，２−ｓｎ−ジオレオイルホスファチジルエタノール−アミン，または卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）を含む。
本発明の処方分子組成物は，カチオン性および中性脂質に加えて，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲートを含む。ＰＥＧコンジュゲートは，ジアシルグリセロール−ポリエチレングリコールコンジュゲート，すなわち，ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートを含むことができる。"ジアシルグリセロール"との用語は，２つの脂肪アシル鎖，すなわちＲ１およびＲ２を有する化合物を表し，これらは両方とも，独立して，グリセロールの１位および２位にエステル結合により結合している２−３０個の炭素を有する。アシル基は，飽和していてもよく，種々の程度の不飽和を含んでいてもよい。ジアシルグリセロールは，下記の一般式ＶＩＩＩ：
［式中，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，脂質，またはリガンドである］
を有する。１つの態様においては，Ｒ１およびＲ２は，それぞれ独立して，Ｃ２−Ｃ３０のアルキル基である。
１つの態様においては，ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートは，ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）−ＰＥＧコンジュゲート，ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）−ＰＥＧコンジュゲート，ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）−ＰＥＧコンジュゲート，ジステリルグリセロール（Ｃ１８）−ＰＥＧコンジュゲート，ＰＥＧ−ジラウリルグリカミドコンジュゲート（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミドコンジュゲート（Ｃ１４），ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミドコンジュゲート（Ｃ１６），またはＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）である。当業者は，本発明のＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートにおいて他のジアシルグリセロールを使用しうることを容易に理解するであろう。
あるいは，ＰＥＧコンジュゲートは，ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲート以外のコンジュゲート，例えばＰＥＧ−コレステロールコンジュゲートまたはＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートを含むことができる。
本発明の処方分子組成物は，上述の成分に加えて，さらに脂質二重層中に挿入して正電荷を付与するよう設計されているカチオン性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質，またはＣＰＬを含むことができる（例えば，Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１１，４３３−４３７を参照）。本発明において使用するのに適した処方物，およびそのような処方物を製造および使用する方法は，例えば，米国特許出願０９／５５３，６３９（２０００年４月２０日出願），および国際出願ＣＡ００／００４５１（２０００年４月２０日出願，２０００年１０月２６日にＷＯ００／６２８１３として公開）（これらのそれぞれの教示はその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に開示されている。
本発明の処方分子組成物，すなわち，ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートを含む処方分子組成物は，多数の種々の方法のいずれを用いても製造することができる。例えば，脂質−核酸粒子は，疎水性ｓｉＮＡ−脂質中間体複合体から製造することができる。複合体は，好ましくは電化が中和されているものである。これらの複合体を界面活性剤系または有機溶媒系で取り扱うことにより，その中に核酸が保護されている粒子を形成することができる。
本発明は，生物学的に活性な分子が脂質二重層中に封入されており，分解から保護されている血清安定処方分子組成物，例えば，ｐＨ依存的相転移を起こす処方物を製造する方法を提供する。さらに，本発明において形成される処方粒子は，好ましくは生理学的ｐＨで中性であるかまたは負に荷電している。インビボ用途のためには，中性粒子が有利であるが，インビトロ用途のためには，粒子はより好ましくは負に荷電している。このことにより，生物学的に活性な分子をカチオン性脂質中に封入することができる正に荷電したリポソーム処方物上での凝集を低下させるというさらなる利点が得られる。
本発明の方法により製造される処方粒子は，約５０−約６００ｎｍまたはそれ以上のサイズを有し，粒子のあるものは約６５−８５ｎｍである。粒子は，有機溶媒を用いて成分の混合の間に単一の相を与える界面活性剤透析法または改変逆相法により形成することができる。いかなる特定の形成メカニズムにも束縛されることを意図するものではないが，生物学的に活性な分子をカチオン性脂質の界面活性剤溶液と接触させて，コーティングされた分子複合体を形成する。これらのコーティングされた分子は凝集して沈殿することができる。しかし，界面活性剤の存在により，この凝集が低下し，コーティングされた分子が過剰の脂質（典型的には，非カチオン性脂質）と反応して，生物学的に活性な分子が脂質二重層中に封入されている粒子を形成することが可能となる。以下に記載される，有機溶媒を用いて処方分子組成物を形成するための方法は同様のスキームに従う。
ある態様においては，粒子は界面活性剤透析を用いて形成される。すなわち，本発明は，血清安定処方分子組成物（ｐＨ依存的相転移を起こす処方物を含む）を製造する方法を提供し，この方法は，（ａ）界面活性剤溶液中で目的とする分子とカチオン性脂質とを混合して，コーティングされた分子−脂質複合体を形成し；（ｂ）非カチオン性脂質をコーティングされた分子−脂質複合体と接触させて，分子−脂質複合体および非カチオン性脂質を含む界面活性剤溶液を形成し；そして（ｃ）工程（ｂ）の界面活性剤溶液を透析して血清安定分子−脂質粒子の溶液を得ることを含み，ここで，目的とする分子は脂質二重層中に封入され，粒子は約５０−約６００ｎｍのサイズを有する。１つの態様においては，粒子は約５０−約１５０ｎｍのサイズを有する。
コーティングされた分子−脂質複合体の最初の溶液は，例えば，目的とする分子を界面活性剤溶液中でカチオン性脂質と混合することにより形成する。
これらの態様においては，好ましくは，界面活性剤溶液は，１５−３００ｍＭ，より，好ましくは２０−５０ｍＭの臨界ミセル濃度を有する中性界面活性剤の水性溶液である。適当な界面活性剤の例としては，例えば，Ｎ，Ｎ’−（（オクタノイルイミノ）−ビス−（ｔｒｉメチレン））−ビス−（Ｄ−グルコンアミド）（ＢＩＧＣＨＡＰ）；ＢＲＩＪ３５；デオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ；ドデシルポリ（エチレングリコール）エーテル；Ｔｗｅｅｎ２０；Ｔｗｅｅｎ４０；Ｔｗｅｅｎ６０；Ｔｗｅｅｎ８０；Ｔｗｅｅｎ８５；Ｍｅｇａ８；Ｍｅｇａ９；Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−０８；Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１０；ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５；ヘキシル−，ヘプチル−，オクチル−およびにニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド；およびヘプチルチオグルコピラノシドが挙げられる。１つの態様においては，界面活性剤はオクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドまたはＴｗｅｅｎ−２０である。界面活性剤溶液中の界面活性剤の濃度は，典型的には約１００ｍＭ−約２Ｍ，好ましくは約２００ｍＭ−約１．５Ｍである。
封入されるべきカチオン性脂質および分子は，典型的には，約１：１−約２０：１の荷電比（＋／−），好ましくは約１：１−約１２：１の比，より好ましくは約２：１−約６：１の比となるように混合する。さらに，溶液中の目的とする分子の合計の濃度は，典型的には，約２５μｇ／ｍＬ−約１ｍｇ／ｍＬ，好ましくは約２５μｇ／ｍＬ−約５００μｇ／ｍＬ，より好ましくは約１００μｇ／ｍＬ−約２５０μｇ／ｍＬである。界面活性剤溶液中の分子とカチオン性脂質の組み合わせを，典型的には室温で，コーティングされた複合体が形成させるのに十分な時間保持する。あるいは，分子およびカチオン性脂質を界面活性剤溶液中で混合し，約３７℃までの温度に暖める。温度に特に感受性の分子については，コーティングした複合体をより低い温度，典型的には約４℃程度の低温で形成することができる。
１つの態様においては，形成された処方分子組成物中の分子と脂質の比率（質量／質量比）は，約０．０１−約０．０８の範囲である。精製工程は典型的には封入されていない分子ならびに空リポソームを除くため，出発物質の比率もこの範囲内に入る。別の態様においては，処方分子組成物の調製物は，１０ｍｇの総脂質あたり約４００μｇのｓｉＮＡを使用し，または，分子対脂質の比率は，約０．０１−約０．０８，より好ましくは，約０．０４であり，これは５０μｇのｓｉＮＡあたり１．２５ｍｇの総脂質に相当する。
次に，コーティングされた分子−脂質複合体の界面活性剤溶液を中性脂質と接触させて，分子−脂質複合体および中性脂質の界面活性剤溶液を得る。この工程において有用な中性脂質としては，例えば，ジアシルホスファチジルコリン，ジアシルホスファチジルエタノールアミン，セラミド，スフィンゴミエリン，セファリン，カルジオリピン，およびセレブロシドが挙げられる。好ましい態様においては，中性脂質は，ジアシルホスファチジルコリン，ジアシルホスファチジルエタノールアミン，セラミドまたはスフィンゴミエリンである。これらの脂質のアシル基は，好ましくは，Ｃ１０−Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。より好ましくは，アシル基は，ラウロイル，ミリストイル，パルミトイル，ステアロイルまたはオレオイルである。好ましい態様においては，中性脂質は，１，２−ｓｎ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ），パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ），卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ），ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ），コレステロール，またはこれらの混合物である。最も好ましい態様においては，ｓｉＮＡ−脂質粒子は，インビボで増強された特性を有する融合性粒子であり，中性脂質はＤＳＰＣまたはＤＯＰＥである。上述したように，本発明のｓｉＮＡ−脂質粒子はさらにＰＥＧコンジュゲート，例えば，ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲート，ＰＥＧ−コレステロールコンジュゲート，およびＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートを含むことができる。さらに，本発明のｓｉＮＡ−脂質粒子は，さらにコレステロールを含むことができる。
本発明の方法において用いられる中性脂質の量は，典型的には，目的とする分子５０μｇあたり約０．５−約１０ｍｇの総脂質である。好ましくは総脂質の量は，目的とする分子５０μｇあたり約１−約５ｍｇである。
分子−脂質複合体と中性脂質の界面活性剤溶液を形成した後，界面活性剤を好ましくは透析により除去する。界面活性剤を除去することにより，脂質二重層が形成され，これは目的とする分子を囲んで，約５０ｎｍ−約１５０ｎｍまたは５０ｎｍ−約６００ｎｍのサイズを有する血清安定分子−脂質粒子を与える。このようにして形成された粒子は，凝集せず，任意のサイズに定寸して均一な粒子サイズとすることができる。
血清安定分子−脂質粒子は，当該技術分野において知られるリポソームを定寸するのに利用可能な任意の方法を用いて定寸することができる。定寸は，所望のサイズ範囲および比較的狭い粒子サイズ分布を得るために行うことができる。
粒子を所望のサイズとする定寸のためには，いくつかの手法が利用可能である。リポソームについて用いられ本発明の粒子にも同様に適用しうる１つの定寸方法は，米国特許４，７３７，３２３（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。浴またはプローブ超音波処理のいずれかにより粒子懸濁液を超音波処理すると，約５０ｎｍより小さいサイズの粒子まで漸次サイズを小さくすることができる。均一化はより大きい粒子をより小さい粒子にフラグメント化するために剪断エネルギーを利用する別法である。典型的な均一化工程においては，粒子は，選択された粒子サイズ，典型的には約６０−８０ｎｍが観察されるまで，標準的なエマルジョンホモジナイザーを通して再循環させる。いずれの方法においても，粒子サイズ分布は，慣用のレーザービーム粒子サイズ識別器またはＱＥＬＳによりモニタリングすることができる。
小孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通して粒子を押し出すことも，粒子サイズを比較的よく規定されたサイズ分布に低下させるための有効な方法である。典型的には，所望の粒子サイズ分布が得られるまで，懸濁液を１回またはそれ以上の回数繰り返して膜を通す。より小さい孔の膜を順番に用いて粒子を押し出して，サイズを徐々に低下させることができる。
別の群の態様においては，本発明は処方分子組成物を製造する方法を提供し，この方法は，（ａ）有機溶媒中にカチオン性脂質および非カチオン性脂質を含む混合物を調製し；（ｂ）目的とする分子の水性溶液を工程（ａ）の混合物と接触させて，透明な（ｃｌｅａｒ）一相とし；そして（ｃ）有機溶媒を除去して分子−脂質粒子の懸濁液を得ることを含み，ここで，目的とする分子は脂質二重層中に封入され，粒子は血清中で安定であり，約５０−約１５０ｎｍあるは５０−約６００ｎｍのサイズを有する。
この群の態様において有用な，目的とする分子，カチオン性脂質および非カチオン性脂質は，上述の界面活性剤透析方法において記載したとおりである。
有機溶媒の選択は，典型的には，溶媒極性および粒子形成の後の段階で溶媒を除去することができる容易さを考慮することを含む。溶解剤としても用いられる有機溶媒は，生物学的に活性な分子と脂質との透明な一相混合物を与えるのに十分な量で用いる。適当な溶媒としては，限定されないが，クロロホルム，ジクロロメタン，ジエチルエーテル，シクロヘキサン，シクロペンタン，ベンゼン，トルエン，メタノール，または他の脂肪族アルコール，例えば，プロパノール，イソプロパノール，ブタノール，ｔｅｒｔ−ブタノール，イソブタノール，ペンタノールおよびヘキサノールが挙げられる。２またはそれ以上の溶媒の組み合わせも本発明において用いることができる。
目的とする分子とカチオン性の中性脂質の有機溶液との接触は，目的とする分子の第１の溶液（典型的には水性溶液），と脂質の第２の有機溶液とを一緒に混合することにより行う。当業者は，この混合は多くの方法のいずれかにより，例えばボルテックスミキサーを用いるなどの機械的手段により，行うことができることを理解するであろう。
目的とする分子を脂質の有機溶液と接触させた後，有機溶媒を除去し，このことにより血清安定分子−脂質粒子の水性懸濁液が形成される。有機溶媒を除去するために用いられる方法は，減圧下で蒸発させるかまたは混合物に不活性ガス（例えば，窒素またはアルゴン）を吹き込むことを含む。
このようにして形成される処方分子組成物は，典型的には約５０ｎｍ−１５０ｎｍあるいは約５０ｎｍ−６００ｎｍに定寸される。さらに粒子のサイズを減少させるかまたはサイズを均一化するためには，上述したように定寸を行うことができる。
別の態様においては，本発明の方法はさらに，非脂質ポリカチオンを加えることを含み，これは本発明の組成物を用いて細胞をトランスフォームするのに有用である。適当な非脂質ポリカチオンの例としては，限定されないが，臭化ヘキサジメトリン（商品名ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（登録商標）として市販（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ））またはヘキサジメトリンの他の塩が挙げられる。他の適当なポリカチオンとしては，例えば，ポリ−Ｌ−オルニチン，ポリ−Ｌ−アルギニン，ポリ−Ｌ−リジン，ポリ−Ｄ−リジン，ポリアリルアミンおよびポリエチレンイミンの塩が挙げられる。
ある態様においては，処方分子組成物の形成は，一相系（例えば，ブライとダイヤー（ＢｌｉｇｈａｎｄＤｙｅｒ）の一相または水性溶媒と有機溶媒との同様の混合物）または二相系で，適切に混合しながら行うことができる。
複合体の形成を一相系で行う場合，カチオン性脂質および目的とする分子をそれぞれある量の一相混合物中に溶解する。２つの溶液を組み合わせると，単一の混合物が得られ，その中で複合体が形成される。あるいは，複合体は，は，カチオン性脂質が分子に結合しており（これは水性相に存在する），これを有機相中に「引っ張る」二相混合物中で形成させることができる。
別の態様においては，本発明は，処方分子組成物を製造する方法を提供し，この方法は，（ａ）目的とする分子を非カチオン性脂質および界面活性剤を含む溶液と接触させて分子−脂質混合物を形成し；（ｂ）カチオン性脂質を分子−脂質混合物と接触させて，目的とする分子の負電荷の一部を中和して，分子および脂質の荷電中和混合物を形成し；そして（ｃ）界面活性剤を荷電中和混合物から除去して処方分子組成物を得る，ことを含む。
一群の態様においては，中性脂質および界面活性剤の溶液は水性溶液である。目的とする分子と中性脂質および界面活性剤の溶液との接触は，典型的には目的とする分子の第１の溶液と脂質および界面活性剤の第２の溶液とを一緒に混合することにより行う。当業者は，この混合は多数の方法のいずれを用いて行ってもよく，例えば，機械的手段，例えばボルテックスミキサーを使用することにより行うことができることを理解するであろう。好ましくは，分子溶液はまた界面活性剤溶液である。本発明の方法において用いられる中性脂質の量は，典型的には，用いられるカチオン性脂質の量に基づいて決定され，典型的には，カチオン性脂質の量の約０．２−５倍，好ましくは用いられるカチオン性脂質の量の約０．５−約２倍である。
このようにして形成される分子−脂質混合物をカチオン性脂質と接触させて，存在する目的とする分子（または他のポリアニオン性物質）に伴う負電荷の一部を中和する。用いられるカチオン性脂質の量は，典型的には，目的とする分子の負電荷の少なくとも５０％を中和するのに十分な量である。好ましくは，負電荷は，少なくとも７０％中和され，より好ましくは少なくとも９０％中和される。本発明において有用なカチオン性脂質としては，例えば，式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸ，ＤＯＤＡＣ，ＤＯＴＭＡ，ＤＤＡＢ，ＤＯＴＡＰ，ＤＣ−Ｃｈｏｌ，ＤＭＯＢＡ，ＣＬｉｎＤＭＡ，およびＤＭＲＩＥのいずれかを有する化合物が挙げられる。これらの脂質および関連する類似体は，米国特許出願０８／３１６，３９９；米国特許５，２０８，０３６，５，２６４，６１８，５，２７９，８３３および５，２８３，１８５（これらの開示はその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。さらに，多数の市販のカチオン性脂質の調製物が利用可能であり，本発明において用いることができる。これらには，例えば，ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む市販のカチオン性リポソーム（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ））；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む市販のカチオン性リポソーム（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ））；およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（エタノール中にＤＯＧＳを含む市販のカチオン性脂質（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ））が含まれる。
カチオン性脂質と分子−脂質混合物との接触は，多くの手法のいずれによって行ってもよく，好ましくはカチオン性脂質の溶液と分子−脂質混合物を含む溶液を一緒に混合する。２つの溶液を混合すると（または他のいずれかの方法により接触させると），目的とする分子に伴う負電荷の一部が中和される。
カチオン性脂質を分子−脂質混合物と接触させた後，界面活性剤（または界面活性剤と有機溶媒との組み合わせ）を除去し，このことにより処方分子組成物を形成する。界面活性剤を除去するために用いられる方法は，典型的には透析を含む。有機溶媒が存在する場合には，除去は，典型的には，減圧下で蒸発させるかまたは混合物に活性ガス（例えば，窒素またはアルゴン）を吹き込むことにより行う。
このようにして形成された処方分子組成物粒子は，典型的には，約５０ｎｍから数ミクロンのサイズである。粒子のさらなるサイズ減少またはサイズの均一化を行うためには，処方分子組成物粒子を超音波処理するか，濾過するか，またはリポソーム処方物において用いられ当業者に知られる他の定寸（ｓｉｚｉｎｇ）手法に供することができる。
別の態様においては，本発明の方法はさらに，非脂質ポリカチオンを含み，これは本発明の組成物を用いて細胞をリポフェクションするのに有用である。適当な非脂質ポリカチオンの例としては，臭化ヘキサジメトリン（商品名ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（登録商標）として販売されている（Ａｌｄｒｉｃｈ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ））または他のヘキサジメトリンの塩が挙げられる。他の適当なポリカチオンとしては，例えば，ポリ−Ｌ−オルニチン，ポリ−Ｌ−アルギニン，ポリ−Ｌ−リジン，ポリ−Ｄ−リジン，ポリアリルアミンおよびポリエチレンイミンの塩が挙げられる。これらの塩の付加は，好ましくは，粒子が形成された後に行う。
別の観点においては，本発明は，処方ｓｉＮＡ組成物を製造する方法を提供し，この方法は，（ａ）溶液中である量のカチオン性脂質をｓｉＮＡと接触させて疎水性脂質−ｓｉＮＡ複合体を与え，ここで溶液は，約１５−３５％の水および約６５−８５％の有機溶媒を含み，カチオン性脂質の量は約０．８５−約２．０の＋／−荷電比を得るのに十分な量であり；（ｂ）溶液中の疎水性，脂質−ｓｉＮＡ複合体を中性脂質と接触させて，ｓｉＮＡ−脂質混合物を与え；そして（ｃ）脂質−ｓｉＮＡ混合物から有機溶媒を除去して処方ｓｉＮＡ組成物粒子を得る，ことを含む。
本発明のこの観点において有用なｓｉＮＡ，中性脂質，カチオン性脂質および有機溶媒は，界面活性剤を用いる方法について上述したものと同じである。ある群の態様においては，工程（ａ）の溶液は一相である。別の群の態様においては，工程（ａ）の溶液は二相である。
１つの態様においては，本発明の処方物において用いられるカチオン性脂質は，式ＣＬＩ，ＣＬＩＩ，ＣＬＩＩＩ，ＣＬＩＶ，ＣＬＶ，ＣＬＶＩ，ＣＬＶＩＩ，ＣＬＶＩＩＩ，ＣＬＩＸ，ＣＬＸ，ＣＬＸＩ，ＣＬＸＩＩ，ＣＬＸＩＩＩ，ＣＬＸＩＶ，ＣＬＸＶ，ＣＬＸＶＩ，ＣＬＸＶＩＩ，ＣＬＸＶＩＩＩ，ＣＬＸＩＸ，ＣＬＸＸ，ＣＬＸＸＩ，ＣＬＸＸＩＩ，ＣＬＸＸＩＩＩ，ＣＬＸＸＩＶ，ＣＬＸＸＶ，ＣＬＸＸＶＩ，ＣＬＸＸＶＩＩ，ＣＬＸＸＶＩＩＩ，ＣＬＸＸＩＸ，およびＤＯＤＡＣ，ＤＤＡＢ，ＤＯＴＭＡ，ＤＯＤＡＰ，ＤＯＣＤＡＰ，ＤＬＩＮＤＡＰ，ＤＯＳＰＡ，ＤＭＲＩＥ，ＤＯＧＳ，ＤＭＯＢＡ，ＣＬｉｎＤＭＡ，およびこれらの組み合わせを有する化合物から選択される。１つの態様においては，非カチオン性脂質は，ＥＳＭ，ＤＯＰＥ，ＤＯＰＣ，ＤＳＰＣ，ポリエチレングリコール系ポリマー（例えば，ＰＥＧ２０００，ＰＥＧ５０００またはＰＥＧ−修飾ジアシルグリセロール），ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ），コレステロール，およびこれらの組み合わせから選択される。１つの態様においては，有機溶媒は，メタノール，クロロホルム，塩化メチレン，エタノール，ジエチルエーテルおよびこれらの組み合わせから選択される。
１つの態様においては，カチオン性脂質は，式ＣＬＩ，ＣＬＩＩ，ＣＬＩＩＩ，ＣＬＩＶ，ＣＬＶ，ＣＬＶＩ，ＣＬＶＩＩ，ＣＬＶＩＩＩ，ＣＬＩＸ，ＣＬＸ，ＣＬＸＩ，ＣＬＸＩＩ，ＣＬＸＩＩＩ，ＣＬＸＩＶ，ＣＬＸＶ，ＣＬＸＶＩ，ＣＬＸＶＩＩ，ＣＬＸＶＩＩＩ，ＣＬＸＶＩＩ，ＣＬＸＶＩＩＩ，ＣＬＸＩＸ，ＣＬＸＸ，ＣＬＸＸＩ，ＣＬＸＸＩＩ，ＣＬＸＸＩＩＩ，ＣＬＸＸＩＶ，ＣＬＸＸＶ，ＣＬＸＸＶＩ，ＣＬＸＸＶＩＩ，ＣＬＸＸＶＩＩＩ，ＣＬＸＸＩＸｏｒＤＯＤＡＣ，ＤＯＴＡＰ，ＤＯＤＡＰ，ＤＯＣＤＡＰ，ＤＬＩＮＤＡＰ，ＤＤＡＢ，ＤＯＴＭＡ，ＤＯＳＰＡ，ＤＭＲＩＥ，ＤＯＧＳまたはこれらの組み合わせを有する化合物であり；非カチオン性脂質はＥＳＭ，ＤＯＰＥ，ＤＡＧ−ＰＥＧ，ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ），コレステロール，またはこれらの組み合わせ（例えば，ＤＳＰＣおよびＤＡＧ−ＰＥＧ）であり；有機溶媒は，メタノール，クロロホルム，塩化メチレン，エタノール，ジエチルエーテルまたはこれらの組み合わせである。
上述したように，ｓｉＮＡとカチオン性脂質との接触は，典型的には，ｓｉＮＡの第１の溶液と脂質の第２の溶液を，好ましくは機械的手段，例えばボルテックスミキサーを用いて一緒に混合することにより行う。得られる混合物は上述の複合体を含む。次に，中性脂質を加え，有機溶媒を除去することにより，これらの複合体を粒子に変換する。中性脂質の添加は，典型的には単に中性脂質の溶液を複合体を含む混合物に加えることにより行う。また，逆付加を用いてもよい。続く有機溶媒の除去は，当業者に知られ，本明細書にも記載される方法により行うことができる。
本発明のこの観点において用いられる中性脂質の量は，典型的には，カチオン性脂質の量の約０．２−約１５倍（モル基準）の量であり，これを用いて，電荷中和脂質−核酸複合体を得る。好ましくは，この量は，用いられるカチオン性脂質の量の約０．５−約９倍である。
さらに別の観点においては，本発明は，上述の方法により製造される処方ｓｉＮＡ組成物を提供する。これらの態様においては，処方ｓｉＮＡ組成物は正味電荷が中性であるか，またはより高いリポフェクション活性を有する処方ｓｉＮＡ組成物を与える総電荷を有する。１つの態様においては，非カチオン性脂質は卵スフィンゴミエリンであり，カチオン性脂質はＤＯＤＡＣである。１つの態様においては，非カチオン性脂質はＤＳＰＣおよびコレステロールの混合物であり，カチオン性脂質はＤＯＴＭＡである。別の態様においては，非カチオン性脂質はさらにコレステロールを含むことができる。
処方ｓｉＮＡ組成物−ＣＰＬ（ＣＰＬ含有処方ｓｉＮＡ組成物）を製造する種々の一般的方法を以下に説明する。２つの一般的な手法には，"挿入後（ｐｏｓｔ−ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）"手法，すなわち，予め形成した処方ｓｉＮＡ組成物中にＣＰＬを挿入する方法と，"標準的な"手法，すなわち，処方ｓｉＮＡ組成物形成工程等の間にＣＰＬを脂質混合物中に含ませる方法がある。挿入後手法によれば，主として処方ｓｉＮＡ組成物二重層膜の外側面にＣＰＬを有する処方ｓｉＮＡ組成物が得られ，一方，標準的な手法では，内側面および外側面の両方にＣＰＬを有する処方ｓｉＮＡ組成物が得られる。
特に，"挿入後"は，処方ｓｉＮＡ組成物を調製し（任意の方法により），予め形成された処方ｓｉＮＡ組成物をＣＰＬの存在下で適当な条件下で（好ましくは６０℃で２−３時間）インキュベートすることを含む。６０−８０％のＣＰＬをレシピエントベシクルの外側のリーフレット中に挿入することができ，約５−１０ｍｏｌ％（総脂質に対して）までの最終濃度が得られる。この方法は，リン脂質（これはコレステロールを含むことができる）から製造されるベシクル，およびＰＥＧ−脂質（例えばＰＥＧ−ＤＡＧｓ）を含むベシクルについて特に有用である。
"標準的な"手法の一例においては，本発明のＣＰＬ−処方ｓｉＮＡ組成物は，押し出しにより形成することができる。この態様においては，ＣＰＬを含むすべての脂質をクロロホルムに共溶解し，次にこれを窒素下で次に高真空下で除去する。脂質混合物を適当なバッファで水和し，孔サイズ１００ｎｍの２つのポリカーボネートフィルターを通して押し出す。得られる処方ｓｉＮＡ組成物は，内側および外側の表面の両方にＣＰＬを含む。さらに別の標準的な手法においては，ＣＰＬ−処方ｓｉＮＡ組成物の形成は，界面活性剤透析法またはエタノール透析法を用いて，例えば，米国特許５，９７６，５６７および５，９８１，５０１（いずれもその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるようにして行うことができる。
本発明の処方ｓｉＮＡ組成物は，単独で，または投与の経路および標準的な薬理学的習慣にしたがって選択される生理学的に許容しうる担体（例えば生理学的食塩水またはリン酸バッファ）との混合物中で，投与することができる。一般に，通常の食塩水を薬学的に許容しうる担体として用いる。他の適当な担体としては，例えば，水，緩衝液，０．４％食塩水，０．３％グリシン等が挙げられ，安定性の向上のために，アルブミン，リポ蛋白質，グロブリンなどの糖蛋白質を含んでいてもよい。
薬理学的担体は，一般に，処方ｓｉＮＡ組成物を形成した後に加える。すなわち，処方ｓｉＮＡ組成物を形成した後，処方ｓｉＮＡ組成物を薬学的に許容しうる担体，例えば通常の食塩水中で希釈することができる。
薬理学的処方物中の処方ｓｉＮＡ組成物の濃度は様々であることができ，例えば，約０．０５％以下から，通常は少なくとも約２−５％から１０−３０重量％程度であり，選択された特定の投与モードにしたがって，主として液体容量，粘度等により選択される。例えば，濃度を増加させて治療に伴う液体の負荷量を減少させることができる。これはアテローム性動脈硬化症に伴ううっ血性心不全または重症の高血圧症をを有する患者には特に望ましい。あるいは，刺激性の脂質から構成される処方ｓｉＮＡ組成物を低濃度に希釈して，投与部位における炎症を少なくすることができる。
上述したように，本発明の処方ｓｉＮＡ組成物は，ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートを含む。ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートと同様の様式で作用し，粒子凝集を防止し，循環寿命を増加させ，処方ｓｉＮＡ組成物の標的組織へのデリバリーを増加させる他の成分を含めることがしばしば望ましい。そのような成分としては，限定されないが，粒子へのＰＥＧ−脂質コンジュゲート，例えば，ＰＥＧ−セラミドまたはＰＥＧ−リン脂質（例えばＰＥＧ−ＰＥ），ガングリオシドＧＭ１−修飾脂質またはＡＴＴＡ−脂質が挙げられる。典型的には，粒子中の成分の濃度は，約１−２０％，より好ましくは約３−１０％である。
本発明の医薬組成物は，慣用のよく知られる滅菌手法により滅菌することができる。水性溶液は使用のために包装するか，無菌条件下で濾過して凍結乾燥し，凍結乾燥した調製物を投与前に滅菌水性溶液と混合することができる。組成物は，生理学的条件を模倣する必要に応じて，薬学的に許容しうる助剤，例えばｐＨ調節および緩衝剤，等張調節剤等，例えば，酢酸ナトリウム，乳酸ナトリウム，塩化ナトリウム，塩化カリウムおよび塩化カルシウムを含むことができる。さらに，粒子懸濁液は，保存中に脂質をフリーラジカルおよび脂質過酸化性障害から保護する脂質保護剤を含むことができる。親油性フリーラジカルクエンチャー，例えば，アルファトコフェロールおよび水溶性鉄特異的キレーター，例えば，フェリオキサミンが適当である。
その用途の別の例においては，処方分子組成物は，広範な範囲の局所投与形，例えば，限定されないが，ゲル，オイル，乳剤等の中に取り込ませることができる。例えば，処方分子組成物を含有する懸濁液は，局所クリーム，ペースト，軟膏，ゲル，ローション等として製剤し投与することができる。
本発明の処方分子組成物は，一旦形成されると，生物学的に活性な分子を細胞内に導入するのに有用である。したがって，本発明はまた，生物学的に活性な分子を細胞内に導入する方法を提供する。この方法は，まず上述するように処方分子組成物を形成し，次に処方分子組成物をトランスフェクションが生ずるのに十分な時間細胞と接触させることにより，インビトロまたはインビボで行うことができる。
本発明の処方分子組成物は，これと混合または接触したほぼすべての細胞タイプにより吸着されることができる。一旦吸着されると，処方物は，細胞の一部によりエンドサイトーシスを受けるか，細胞膜と脂質を交換するか，または細胞と融合することができる。処方物の生物学的に活性な分子の部分の移動または取り込みは，これらの経路のいずれかにより生ずることができる。特に，融合が生ずる場合，粒子膜は細胞膜中に一体化され，粒子の内容物，すなわち生物学的に活性な分子は，細胞内液体，例えばサイトプラズムと混合される。ｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物は，初期エンドソームのｐＨ（すなわち，約ｐＨ５．５−６．５）で細胞融合の増加を示し，このことにより粒子の内容物，すなわち生物学的に活性な分子の細胞への効率的なデリバリーが可能となる。
本発明のエンドソーム放出パラメータ（Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ：ＥＲＰ）アッセイを用いて，処方分子組成物または他の脂質系担体システムのトランスフェクション効率を最適化することができる。より詳細には，ＥＲＰアッセイの目的は，結合／取り込みまたはエンドソーム膜との融合／エンドソーム膜の不安定化に及ぼすこれらの相対的効果に基づいて，処方分子組成物の種々のカチオン性脂質およびヘルパー脂質成分の効果を区別することである。このアッセイにより，処方分子組成物または他の脂質系担体システムの各成分がどのようにしてトランスフェクション効率に影響を及ぼし，このことにより処方分子組成物または他の脂質系担体システムを最適化するかを定量的に決定することができる。本明細書に説明されるように，エンドソーム放出パラメータ（Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ，ＥＲＰ）は，以下のように定義される：レポーター遺伝子発現／細胞を処方分子組成物取り込み／細胞で割る。
当業者には，任意のレポーター遺伝子（例えば，ルシフェラーゼ，ベータ−ガラクトシダーゼ，グリーン蛍光蛋白質等）をアッセイにおいて用いることができることが明らかであろう。さらに，脂質成分（あるいは処方分子組成物の任意の成分）は，細胞への取り込みを阻害または妨害しないかぎり，任意の検出可能な標識で標識することができる。本発明のＥＲＰアッセイを用いて，当業者は，細胞への取り込みおよびトランスフェクション効率に及ぼす種々の脂質成分（例えば，カチオン性脂質，中性脂質，ＰＥＧ−脂質誘導体，ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲート，ＡＴＴＡ−脂質誘導体，カルシウム，ＣＰＬ，コレステロール等）の影響を評価することができ，このことにより，処方ｓｉＮＡ組成物を最適化することができる。種々の処方分子組成物のそれぞれについてＥＲＰを比較することにより，最適化されたシステム，例えば最大の細胞取り込みと最大のトランスフェクション効率を合わせもつ処方分子組成物を容易に決定することができる。
本発明のＥＲＰアッセイを実施するのに適した標識としては，限定されないが，分光標識，例えば，蛍光染料（例えば，フルオレセインおよび誘導体，例えば，フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ９；ローダミンおよび誘導体，例えば，テキサスレッド，テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等，ジゴキシゲニン，ビオチン，フィコエリスリン，ＡＭＣＡ，ＣｙＤｙｅｓ等；放射性標識，例えば，３Ｈ，１２５Ｉ，３５Ｓ，１４Ｃ，３２Ｐ，３３Ｐ等；酵素，例えば，西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ等．；分光比色分析標識，例えば金コロイドまたは着色ガラスまたはプラスチックビーズ，例えば，ポリスチレン，ポリプロピレン，ラテックス等が挙げられる。標識は，当該技術分野においてよく知られる方法を用いて，処方分子組成物の成分に直接的にまたは間接的に結合させることができる。上述したように，広範な種類の標識を用いることができ，必要とされる感度，処方ｓｉＮＡ組成物とのコンジュゲートの容易性，安定性の要件，および利用可能な装置および廃棄規定などにしたがって標識を選択することができる。
さらに，処方分子組成物または他の脂質系担体システムのトランスフェクション効率は，血清中における組成物の安定性を測定するか，および／または処方分子組成物のｐＨ依存性相転移を測定することにより判定することができ，ここで，処方分子組成物が血清中で安定であると判定されること，および処方分子組成物が約ｐＨ５．５−６．５で相転移を起こすと判定されることは，処方分子組成物のトランスフェクション効率が高いであろうことを示す。処方分子組成物の血清安定性は，例えば，組成物の血清における相対的濁度を測定するアッセイを用いて測定することができ，血清中における組成物の濁度が経時的に一定のままであるか否かを判定する。処方分子組成物のｐＨ依存性相転移は，異なるｐＨで組成物の相対的濁度の経時変化を測定して，ｐＨが生理学的ｐＨと異なる場合に濁度が変化するか否かを判定するアッセイを用いて測定することができる。
本発明の核酸分子の活性の最適化
修飾（塩基，糖および／またはリン酸）を有する化学的に合成した核酸分子（例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子）は，血清リボヌクレアーゼによる分解を防止することができ，このことによりその抗力を高めることができる（例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１；Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ６，３００，０７４およびＢｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照（これらはすべて本明細書の一部としてここに引用する）。上述の参考文献はすべて，本明細書に記載される核酸分子の塩基，リン酸および／または糖成分になしうる種々の化学修飾を記載する。細胞中におけるその抗力を増強するよう修飾し，およびオリゴヌクレオチドの合成時間を短縮し化学物質の必要性を減少するために核酸分子から塩基を除去することが望ましい。
当該技術分野には，そのヌクレアーゼ安定性および効力を有意に増強することができる，核酸分子中に導入することができる糖，塩基およびリン酸修飾を記述するいくつかの例がある。例えば，オリゴヌクレオチドは，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２'−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−アリル，２'−Ｈ等のヌクレオチド塩基修飾で修飾することにより，安定性を高め，および／または生物学的活性を増強するために修飾される（総説については，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ ＴＩＴＢＳ １７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ ３５，１４０９０を参照）。核酸分子の糖修飾は，当該技術分野において広く記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９７／２６２７０；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，７１６，８２４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６２７，０５３；Ｗｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９８／１３５２６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願６０／０８２，４０４（１９９８年４月２０日出願）；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１；Ｅａｒｎｓｈａｗ ａｎｄ Ｇａｉｔ，１９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９−５５；Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９−１３４；およびＢｕｒｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１９９９−２０１０を参照，これらの参考文献はすべて，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）。これらの刊行物は，触媒活性を変更することなく，糖，塩基および／またはリン酸修飾等を核酸分子中に組み込む位置を決定する一般的方法および戦略を記載しており，本明細書の一部としてここに引用する。このような教示の観点から，ｓｉＮＡが細胞においてＲＮＡｉを促進する能力が有意に阻害されない限り，本明細書に記載されるように，同様の修飾を用いて本発明のｓｉＮＡ核酸分子を修飾することができる。
ホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，および／または５’−メチルホスホネート結合によるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の化学修飾は安定性を改良するが，過剰な修飾はある種の毒性または活性の低下を引き起こしうる。したがって，核酸分子を設計する場合，これらのヌクレオチド間結合の量は最小にすべきである。これらの結合の濃度を減少させると，毒性が低下し，これらの分子の効力が増加し特異性が高くなるはずである。
活性を維持または増強する化学的修飾を有するポリヌクレオチド（例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子）が提供される。そのような核酸はまた，一般に非修飾核酸よりヌクレアーゼに対する耐性が高い。したがって，インビトロおよび／またはインビボで活性は顕著に低下しないはずである。調節が目的である場合には，外的にデリバリーされる治療用核酸分子は，最適には，望ましくない蛋白質のレベルが低下するのに充分長い時間標的ＲＮＡの翻訳が調節されるまで細胞内で安定であるべきである。この時間は，疾病の状態により数時間から数日まで様々である。ＲＮＡおよびＤＮＡの化学合成における進歩（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｌａｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９（本明細書の一部としてここに引用する））により，上述のようにヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を高めることにより，核酸分子を改変する可能性が拡大した。
１つの態様においては，本発明の核酸分子は，１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のＧクランプヌクレオチドを含む。Ｇクランプヌクレオチドは，修飾シトシン類似体であり，ここで，修飾は，デュープレックス中の相補的グアニンのワトソン・クリックおよびフーグスティーン面の両方の水素結合の能力を与える。例えば，Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，８５３１−８５３２を参照。オリゴヌクレオチド中の単一のＧクランプ類似体置換により，相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたときのらせん熱安定性およびミスマッチ識別性を実質的に増強することができる。そのようなヌクレオチドを本発明の核酸分子中に取り込ませることにより，核酸標的の相補的配列またはテンプレート鎖に対する親和性および特異性の両方が増強される。別の態様においては，本発明の核酸分子は１またはそれ以上（例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上）のＬＮＡ"ロック核酸"ヌクレオチド，例えば，２’，４’−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドを含む（例えば，Ｗｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ００／６６６０４およびＷＯ９９／１４２２６を参照）。
別の態様においては，本発明は，本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲートおよび／または複合体を特徴とする。そのようなコンジュゲートおよび／または複合体は，生物学的システム，例えば細胞へのｓｉＮＡ分子のデリバリーを容易にするために用いることができる。本発明により提供されるコンジュゲートおよび複合体は，治療用化合物を細胞膜を超えて輸送し，薬物動態学を変更し，および／または本発明の核酸分子の局在化を調節することにより，治療的活性を付与することができる。本発明は，分子，例えば，限定されないが，小分子，脂質，コレステロール,リン脂質，ヌクレオシド，ヌクレオチド，核酸，抗体，トキシン，負に荷電したポリマーおよび他のポリマー，例えば，蛋白質，ペプチド，ホルモン，炭水化物，ポリエチレングリコール，またはポリアミンを，細胞膜を横切ってデリバリーするための，新規コンジュゲートおよび複合体の設計および合成を包含する。一般に，記載されるトランスポーターは，個々にまたは多成分系の一部として，分解性リンカー付きでまたはなしで用いるよう設計される。これらの化合物は，血清の存在下または非存在下で，本発明の核酸分子を異なる組織に由来する多数の細胞タイプにデリバリーおよび／または局在化することを改良すると予測される（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ ａｎｄ Ｃｅｃｈ，米国特許５，８５４，０３８を参照）。本明細書に記載される分子のコンジュゲートは，生物分解性のリンカー，例えば生物分解性核酸リンカー分子を介して，生物学的に活性な分子に結合させることができる。
本明細書において用いる場合，"生物分解性リンカー"との用語は，１つの分子を別の分子に，例えば，生物学的に活性な分子を本発明のｓｉＮＡ分子に，または本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖とを接続するための生物分解性リンカーとして設計される核酸または非核酸リンカー分子を表す。生物分解性リンカーは，特定の目的，例えば特定の組織または細胞タイプへのデリバリーのためにその安定性を調節することができるように設計する。核酸に基づく生物分解性リンカー分子の安定性は，リボヌクレオチド，デオキシリボヌクレオチド，および化学的に修飾されたヌクレオチド，例えば，２’−Ｏ−メチル，２’−フルオロ，２’−アミノ，２’−Ｏ−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２’−Ｏ−アリル，および他の２’−修飾または塩基修飾ヌクレオチドの種々の組み合わせを用いることにより調節することができる。生物分解性核酸リンカー分子は，ダイマー，トリマー，テトラマー，またはより長い核酸分子，例えば，約２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，または２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであることができ，またはリン酸に基づく結合，例えば，ホスホルアミデートまたはホスホジエステル結合を有する単一のヌクレオチドを含むことができる。生物分解性核酸リンカー分子はまた，核酸骨格，核酸糖，または核酸塩基修飾を含むことができる。
本明細書において用いる場合，"生物分解性"との用語は，生物学的システムにおける分解，例えば酵素的分解または化学的分解を表す。
本明細書において用いる場合，"リン脂質"との用語は，少なくとも１つのリン酸基を含む疎水性分子を表す。例えば，リン脂質は，リン酸含有基および飽和または不飽和アルキル基を含むことができ，これは，ＯＨ，ＣＯＯＨ，オキソ，アミン，または置換もしくは未置換アリール基で任意に置換されていてもよい。
外的にデリバリーされた治療用核酸分子（例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子）は，最適には，ＲＮＡ転写産物のレベルが低下するのに充分長い時間ＲＮＡの逆転写が調節されるまで細胞内で安定であるべきである。核酸分子は，有効な細胞内治療用薬剤として機能するためには，ヌクレアーゼに耐性である。本明細書におよび当該技術分野において記載される核酸分子の化学合成の改良により，上述したように，ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を増強させることにより，核酸分子を修飾する可能性が拡大した。
さらに別の態様においては，ＲＮＡｉに関与する蛋白質の酵素活性を維持するかまたは増強させる化学的修飾を有するｓｉＮＡ分子が提供される。そのような核酸はまた，一般に非修飾核酸よりヌクレアーゼに対してより耐性が高い。したがって，インビトロおよび／またはインビボで，活性は顕著に低下しないであろう。
本発明の核酸系分子の使用は，組み合わせ療法の可能性を提供することにより，疾病の進行のよりよい治療につながるであろう（例えば，異なる遺伝子を標的とする多数のｓｉＮＡ分子，既知の小分子阻害剤とカップリングさせた核酸分子，または分子（異なる酵素的核酸分子モチーフを含む）および／または他の化学的または生物学的分子の組み合わせによる間欠的治療）。
別の観点においては本発明のポリヌクレオチド分子（例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子）は，１またはそれ以上の５’および／または３’−キャップ構造を，例えばセンスｓｉＮＡ鎖のみに，アンチセンスｓｉＮＡ鎖のみに，または両方のｓｉＮＡ鎖に含む。
"キャップ構造"とは，オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれている化学的修飾を意味する（例えば，Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，９９８，２０３（本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。これらの末端修飾は，核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し，デリバリーおよび／または細胞中の局在化を助けるであろう。キャップは５’末端（５’−キャップ）に存在してもよく，または３’末端（３’−キャップ）に存在してもよく，両方の末端に存在してもよい。非限定的例においては，５’−キャップは，グリセリル，反転デオキシ無塩基残基（成分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；非環状３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環状３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，３’−３’−反転ヌクレオチド成分；３’−３’−反転無塩基成分；３’−２’−反転ヌクレオチド成分；３’−２’−反転無塩基成分；１，４−ブタンジオールリン酸；３’−ホスホルアミデート；ヘキシルリン酸；アミノヘキシルリン酸；３’−リン酸；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋または非架橋メチルホスホネート成分からなる群より選択される。
３’−キャップの非限定的例としては，限定されないが,例えば，グリセリル，反転デオキシ無塩基残基（成分），４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸；３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５’−５’−反転ヌクレオチド成分；５’−５’−反転無塩基成分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミデート，ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート，架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト成分が挙げられる（より詳細には，Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９，１９２５（本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。
"非ヌクレオチド"との用語は，１またはそれ以上のヌクレオチドユニットの代わりに核酸鎖中に導入することができ，糖および／またはリン酸置換のいずれかを含み，残りの塩基がその酵素的活性を発揮することを可能とする任意の基または化合物を意味する。基または化合物は，一般に認識されているヌクレオチド塩基，例えば，アデノシン，グアニン，シトシン，ウラシルまたはチミンを含まず，したがって１’位に塩基を欠失している場合，無塩基である。
"アルキル"基とは，飽和脂肪族炭化水素を表し，直鎖，分枝鎖，および環状アルキル基が含まれる。好ましくは，アルキル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１−７個の炭素，より好ましくは１−４個の炭素を有する低級アルキルである。アルキルは置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ２またはＮ（ＣＨ３）２，アミノ，またはＳＨである。この用語は，また，少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む不飽和炭化水素基であるアルケニル基を含み，直鎖，分枝鎖，および環状基を含む。好ましくは，アルケニル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１−７個の炭素原子，より好ましくは１−４個の炭素原子の低級アルケニルである。アルケニル基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ２，ハロゲン，Ｎ（ＣＨ３）２，アミノ，またはＳＨから選択される。"アルキル"との用語はまた，少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む不飽和の炭化水素基を有するアルキニル基を含み，直鎖，分枝鎖，および環状基を含む。好ましくは，アルキニル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１−７個の炭素，より好ましくは１−４個の炭素を有する低級アルキニルである。アルキニル基は，置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ２またはＮ（ＣＨ３）２，アミノまたはＳＨである。
そのようなアルキル基はまた，アリール，アルキルアリール，炭素環式アリール，複素環アリール，アミドおよびエステル基を含むことができる。"アリール"基とは，共役したパイ電子系を有する少なくとも１つの環を有する芳香族基を表し，炭素環式アリール，複素環アリールおよび二アリール基が含まれる。これらはすべて任意に置換されていてもよい。アリール基の好ましい置換基は，ハロゲン，トリハロメチル，ヒドロキシル，ＳＨ，ＯＨ，シアノ，アルコキシ，アルキル，アルケニル，アルキニル，およびアミノ基である。"アルキルアリール"基は，アリール基（上述）に共有結合したアルキル基（上述）を表す。炭素環式アリール基は，芳香族環の環原子がすべて炭素原子である基である。炭素原子は任意に置換されていてもよい。複素環アリール基は，芳香族環中の環原子として１−３個の複素原子を有し，環原子の残りが炭素原子である基である。適当な複素原子には，酸素，イオウ，および窒素が含まれ，例えば，フラニル，チエニル，ピリジル，ピロリル，Ｎ−低級アルキルピロロ，ピリミジル，ピラジニル，イミダゾリル等が挙げられる。これらはすべて任意に置換されていてもよい。"アミド"とは，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ（式中，Ｒはアルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素のいずれかである）を表す。"エステル"とは，−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’（式中，Ｒはアルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素のいずれかである）を表す。
本明細書において用いる場合，"ヌクレオチド"は，当該技術分野においては，天然塩基（標準的），および当該技術分野においてよく知られる修飾塩基を含むと認識されている。そのような塩基は，一般にヌクレオチド糖成分の１’位に位置する。ヌクレオチドは一般に，塩基，糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは，糖，リン酸および／または塩基成分において修飾されていてもされていなくてもよい（互換的に，ヌクレオチド類似体，修飾ヌクレオチド，非天然ヌクレオチド，非標準的ヌクレオチド等とも称される。例えば，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ（上掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲）（すべて本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。当該技術分野において知られる修飾核酸塩基のいくつかの例があり，Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３にまとめられている。核酸中に導入することができる塩基修飾のいくつかの非限定的例としては，例えば，イノシン，プリン，ピリジン−４−オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメトキシベンゼン，３−メチルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミノフェニル，５−アルキルシチジン（例えば５−メチルシチジン），５−アルキルウリジン（例えばリボチミジン），５−ハロウリジン（例えば５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば６−メチルウリジン），プロピンおよびその他のものが挙げられる（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，上掲）。この観点において，"修飾塩基"とは，１’位におけるアデニン，グアニン，シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基またはそれらの同等物を意味する。
１つの態様においては，本発明はリン酸骨格修飾を有する修飾されたポリヌクレオチド分子（例えば，ｓｉＮＡ，アンチセンス，アプタマー，デコイ，リボザイム，２−５Ａ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，または他の核酸分子）を特徴とし，これは１またはそれ以上のホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，メチルホスホネート，ホスホトリエステル，モルホリノ，アミデート，カルバメート，カルボキシメチル，アセトアミデート，ポリアミド，スルホネート，スルホンアミド，スルファメート，ホルムアセタール，チオホルムアセタール，および／またはアルキルシリル置換を含む。オリゴヌクレオチド骨格修飾の概説については，Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｍａｎｎ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７，およびＭｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照されたい。
"無塩基"とは，１’位において塩基を欠失しているか，または塩基の代わりに他の化学基を有する糖成分を意味する（例えば，Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，９９８，２０３を参照）。
"非修飾ヌクレオシド"とは，β−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合した塩基，アデニン，シトシン，グアニン，チミンまたはウラシルのいずれかの塩基を意味する。
"修飾ヌクレオシド"とは，非修飾ヌクレオチドの塩基，糖および／またはリン酸の化学構造中に修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を意味する。修飾ヌクレオチドの非限定的例は式Ｉ−ＶＩＩに示されるか，および／または本明細書に記載される他の修飾である。
本発明において記載される２’−修飾ヌクレオチドに関して，"アミノ"とは，２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２を意味し，これは修飾されていてもされていなくてもよい。そのような修飾基は，例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６７２，６９５およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，米国特許６，２４８，８７８（いずれもその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
核酸ｓｉＮＡ構造に対する種々の修飾を作成して，これらの分子の有用性を高めることができる。例えば，このような修飾は，製品寿命，インビトロの半減期，安定性，およびそのようなオリゴヌクレオチドを標的部位に導入する容易さを高め，例えば，細胞膜の透過性を高め，標的とする細胞を認識し結合する能力を付与するであろう。
"コレステロール誘導体"とは，コレステロール構造から本質的になる任意の化合物を意味し，これらの付加，置換および／または欠失も含まれる。本明細書において，コレステロール誘導体との用語はまた，当該技術分野において一般に認識されているように，ステロイドホルモンおよび胆汁酸を含む。
処方ｓｉＮＡ組成物の投与
本発明の処方分子組成物は，単独でまたは他の療法との組み合わせで，細胞または組織において標的遺伝子発現のレベルに関連するかまたはこれに応答する任意の形質，疾病または状態を予防，阻害，または軽減するのに使用するために適合させることができる。
１つの態様においては，処方分子組成物は，当業者に知られる種々の方法により細胞に投与することができ，これは，例えば，限定されないが，注射，イオントフォレシス，または他のベヒクル，例えば，生物分解性ポリマー，ハイドロゲル，シクロデキストリンへの組み込み（例えば，Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ０３／４７５１８およびＷＯ０３／４６１８５を参照）によるものが含まれる。１つの態様においては，本発明の処方分子組成物を，膜破壊剤，例えば，米国特許公開２００１０００７６６６（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるものと複合体化する。別の態様においては，膜破壊剤および生物学的に活性な分子はまた，カチオン性脂質またはヘルパー脂質分子，例えば，米国特許６，２３５，３１０（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される脂質と複合体する。
１つの態様においては，本発明のデリバリーシステムには，例えば，水性および非水性ゲル，クリーム，マルチエマルジョン，マイクロエマルジョン，軟膏，水性および非水性溶液，ローション，エアロゾル，炭化水素基材および粉体が含まれ，可溶化剤，透過促進剤（例えば，脂肪酸，脂肪酸エステル，脂肪酸アルコールおよびアミノ酸），および親水性ポリマー（例えば，ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）等の賦形剤を含むことができる。１つの態様においては，薬学的に許容しうる担体は経皮吸収促進剤である。
１つの態様においては，本発明のデリバリーシステムには，パッチ，錠剤，座薬，ペッサリー，ゲルおよびクリームが含まれ，可溶化剤および促進剤（例えば，プロピレングリコール，胆汁酸およびアミノ酸）等の賦形剤，および他のベヒクル（例えば，ポリエチレングリコール，脂肪酸エステルおよび誘導体，および親水性ポリマー，例えば，ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸）を含むことができる。
１つの態様においては，本発明は，本発明の１またはそれ以上の処方ｓｉＮＡ組成物を許容しうる担体，例えば，安定化剤，バッファ等の中に含む医薬組成物を特徴とする。本発明の処方分子組成物は，安定化剤，バッファ等とともにまたはなしで医薬組成物を形成して，任意の標準的な手段で被験者に投与し導入することができる。本発明の組成物はまた，クリーム，ゲル，スプレー，オイル，および当該技術分野において知られる局所，皮膚，または経皮投与用の他の適当な組成物として処方し使用することができる。
１つの態様においては，本発明はまた，記載される化合物の薬学的に許容しうる処方物を含む。これらの処方物には，上述の化合物の塩，例えば，酸付加塩（例えば，塩酸，シュウ酸，酢酸およびベンゼンスルホン酸の塩）が含まれる。
医薬組成物または処方物は，細胞または被験者（例えばヒト）への投与（例えば全身投与）に適当な形態の組成物または処方物を表す。適当な形態は，部分的には，使用する投与経路（例えば経口，経皮，または注射）に依存する。そのような形態は，組成物または処方物が標的細胞（すなわち，負に荷電した核酸がデリバリーされることが望まれる細胞）に到達することを妨害してはならない。例えば，血流中に注入される医薬組成物は可溶性でなければならない。他の因子は当該技術分野において知られており，例えば，毒性，および組成物または処方物がその効果を発揮することを妨害する形態等を考慮することが含まれる。
１つの態様においては，本発明の処方分子組成物は，薬学的に許容しうる組成物 または処方物中で全身投与により被験者に投与される。"全身投与"とは，インビボでの全身吸収，または血流中における薬剤の蓄積の後に全身に分配されることを意味する。全身的吸収をもたらす投与経路には，限定されないが，静脈内，皮下，腹腔内，吸入，経口，肺内および筋肉内が含まれる。これらの投与経路のそれぞれは，本発明のｓｉＮＡ分子をアクセス可能な疾患組織に暴露する。薬剤が循環中に入る速度は，分子量またはサイズの関数であることが示されている。
"薬学的に許容しうる処方物"または"薬学的に許容しうる組成物"とは，本発明の処方分子組成物をその所望の活性に最も適した物理学的な位置に有効に分布させることができる組成物または処方物を意味する。本発明の処方分子組成物とともに処方するのに適した薬剤の非限定的例としては，Ｐ−糖蛋白質阻害剤（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃＰ８５）；生物分解性ポリマー，例えば徐放デリバリー用のポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）微小球（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８）；および負荷されたナノ粒子，例えばポリブチルシアノアクリレートから作成されるもの等が挙げられる。本発明の核酸分子のデリバリー戦略の他の非限定的例には，Ｂｏａｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７，１３０８−１３１５；Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２１，２８０−２８４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９２，５５９２−５５９６；Ｂｏａｄｏ，１９９５，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，１５，７３−１０７；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６，４９１０−４９１６；およびＴｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９６，７０５３−７０５８に記載される物質が含まれる。
本発明はまた，薬学的に有効量の所望の化合物を薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む，保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用いるための許容しうる担体または希釈剤は，医薬の技術分野においてよく知られており，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。例えば，保存剤，安定剤，染料，および風味剤を用いることができる。これらには，安息香酸ナトリウム，ソルビン酸，およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに，抗酸化剤および懸濁剤を用いてもよい。
薬学的に有効な用量とは，疾患状態の予防，発症の阻害，または治療（症状をある程度緩和し，好ましくはすべての症状を緩和する）に必要な用量である。薬学的に有効な用量は，疾患の種類，用いる組成物，投与の経路，治療する哺乳動物の種類，考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性，同時に投与される薬剤，および医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に，処方ｓｉＮＡ組成物の効力に依存して，０．１ｍｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の活性成分を投与する。
本発明の処方分子組成物は，慣用的な無毒性の薬学的に許容しうる担体，アジュバントおよびベヒクルを含む用量単位処方物中で，経口的に，局所的に，非経口的に，吸入またはスプレーにより，または直腸に投与することができる。本明細書において用いる場合，非経口的との用語には，経皮，皮下，血管内（例えば，静脈内），筋肉内，または髄腔内注射または注入の手法等が含まれる。さらに，本発明の処方分子組成物および薬学的に許容しうる担体を含む医薬処方物が提供される。１またはそれ以上の本発明の処方分子組成物は，１またはそれ以上の無毒性の薬学的に許容しうる担体および／または希釈剤，および／またはアジュバント，および所望の場合には他の活性成分とともに存在することができる。本発明の処方分子組成物を含有する医薬組成物は，経口使用に適した形，例えば，錠剤，トローチ剤，菱形剤，水性または油性懸濁液，分散可能な粉体または顆粒，乳剤，硬カプセルまたは軟カプセル，またはシロップまたはエリキシル剤の形であることができる。
経口で使用することが意図される組成物は，医薬組成物の製造について当該技術分野において知られる任意の方法にしたがって製造することができ，そのような組成物は，薬学的に洗練された口に合う製品を提供するために，１またはそれ以上のそのような甘味剤，芳香剤，着色剤または保存剤を含んでいてもよい。錠剤は，錠剤の製造に適した無毒性の薬学的に許容しうる賦形剤との混合物として活性成分を含む。これらの賦形剤は，例えば，不活性希釈剤，例えば，炭酸カルシウム，炭酸ナトリウム，ラクトース，リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；顆粒化剤および崩壊剤，例えば，コーンスターチ，またはアルギン酸；結合剤，例えば，デンプン，ゼラチンまたはアラビアゴム，および潤滑剤，例えば，ステアリン酸マグネシウム，ステアリン酸またはタルクでありうる。錠剤は被覆しなくてもよく，既知の手法により被覆してもよい。場合によっては，既知の手法によりそのような被覆を調製して，胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ，このことによりより長い期間の持続的な作用を与えることができる。例えば，遅延用材料，例えばグリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートを用いることができる。
経口使用のための処方物は，活性成分が不活性固体希釈剤，例えば，炭酸カルシウム，リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセル，または活性成分が水または油状媒体，例えば，ピーナッツ油，液体パラフィンまたはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルであってもよい。
水性懸濁液は，水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に活性物質を含む。そのような賦形剤は，懸濁剤，例えば，カルボキシメチルセルロースナトリウム，メチルセルロース，ヒドロプロピル−メチルセルロース，アルギン酸ナトリウム，ポリビニルピロリドン，トララガントガムおよびアラビアゴムである。分散剤または湿潤剤は，天然に生ずるホフファチド，例えば，レシチン，またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物，例えば，ステアリン酸ポリオキシエチレン，またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物，例えば，ヘプタデカエチレンオキシセタノール，またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物，例えば，ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート，またはエチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物，例えば，ポリエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。水性懸濁液はまた，１またはそれ以上の保存剤，例えば，エチル−，またはｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート，１またはそれ以上の着色剤，１またはそれ以上の芳香剤，および１またはそれ以上の甘味剤，例えばショ糖またはサッカリンを含んでいてもよい。
油性懸濁液は，活性成分を植物油，例えば，アラキス油，オリーブ油，ゴマ油またはココナッツ油，または無機油，例えば液体パラフィン中に懸濁させることにより処方することができる。油性懸濁液は，増粘剤，例えば，密ロウ，硬パラフィンまたはセチルアルコールを含むことができる。甘味剤および芳香剤を加えて，口に合う経口製品を得ることができる。これらの組成物は，抗酸化剤，例えばアスコルビン酸を加えることにより保存することができる。
水を加えることにより水性懸濁液を製造するのに適した分散可能な粉体および顆粒は，活性成分を，分散剤または湿潤剤，懸濁剤および１またはそれ以上の保存剤との混合物中で与える。適当な分散剤または湿潤剤または懸濁剤は，上で例示したとおりである。さらに別の賦形剤，例えば，甘味剤，芳香剤および着色剤が存在していてもよい。
本発明の医薬組成物はまた，水中油エマルジョンの形であってもよい。油相は，植物油またはミネラルオイルまたはこれらの混合物であってもよい。適当な乳化剤としては，天然に生ずるガム，例えば，アラビアゴムまたはトラガガントゴム，天然に生ずるホスファチド類，例えば，大豆，レクチン，および脂肪酸とヘキシトールから誘導されるエステルまたは部分エステル，無水物，例えば，ソルビタンモノオレエート，および前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物，例えば，ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。エマルジョンは，甘味料および芳香剤を含んでいてもよい。
シロップおよびエリキシルは，甘味剤，例えば，グリセロール，プロピレングリコール，ソルビトール，グルコースまたはショ糖を用いて処方することができる。このような処方物はまた，粘滑剤，保存剤および甘味料および着色料を含んでいてもよい。医薬組成物は，滅菌した注射可能な水性または油性の懸濁液の形であってもよい。この懸濁液は，上述した適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて，当該技術分野において知られるように処方することができる。滅菌した注射可能な製品はまた，無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌した注射可能な溶液または懸濁液，例えば，１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いることのできる許容可能なベヒクルおよび溶媒の例は，水，リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに，滅菌し固定した油を溶媒または懸濁媒体として便利に用いることができる。この目的のためには，任意の非刺激性の固定した油，例えば，合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを用いることができる。さらに，脂肪酸，例えば，オレイン酸を注射可能な薬剤の製造において用いることができる。
本発明の処方分子組成物はまた，例えば，薬剤の直腸投与用に，座剤の形で投与することができる。これらの組成物は，薬剤を，通常の温度では固体であるが直腸温度では液体であり，したがって直腸中で溶融して薬剤を放出する適当な非刺激性賦形剤と混合することにより製造することができる。そのような材料としては，カカオバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
本発明の処方分子組成物は，滅菌媒体中で非経口的に投与することができる。薬剤は，使用するベヒクルおよび濃度に応じて，ベヒクル中に懸濁されていてもよく，溶解されていてもよい。アジュバント，例えば局所麻酔剤，保存剤および緩衝剤をベヒクル中に溶解することも有利である。
上述した健康状態の治療には，体重１キログラムあたり１日あたり約０．１ｍｇ−約１４０ｍｇのオーダーの投与量レベルが有用である（被験者あたり１日あたり約０．５ｍｇ−約７ｇ）。担体物質と組み合わせて１回投与量形を生成することができる活性成分の量は，治療される宿主および投与の特定のモードに依存して様々である。投与量単位形は，一般に，約１ｍｇ−約５００ｍｇの活性成分を含む。
特定の被験者についての特定の投与量レベルは，種々の因子，例えば，用いる特定の化合物の活性，年齢，体重，一般的健康状態，性別，食事，投与時間，投与経路，および排出速度，薬剤の組み合わせ，および治療をしている特定の疾病の重篤性に依存することが理解されるであろう。
ヒト以外の動物に投与するためには，組成物を動物飼料または飲料水に加えてもよい。動物が治療上適当な量の組成物を飼料とともに接種できるよう，動物飼料および飲用水組成物を処方することが便利であろう。飼料または飲料水に加えるように組成物をプレミックスとして製造することも便利であろう。
本発明の処方分子組成物はまた，他の治療用化合物と組み合わせて被験者に投与して，全体的治療効果を高めることができる。ある適応症の治療に複数の化合物を用いることにより，副作用の存在を低下させながら有益な効果を高めることができる。
以下は，本発明の核酸の選択，単離，合成および活性を示す非限定的例である。
実施例１：任意のＲＮＡ配列中の潜在的ｓｉＮＡ標的部位の同定
目的とするＲＮＡ標的，例えばウイルスまたはヒトｍＲＮＡ転写産物の配列を，例えばコンピュータフォールディングアルゴリズムを用いることにより，標的部位についてスクリーニングする。非限定的例においては，Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースから得られる遺伝子またはＲＮＡ遺伝子転写産物の配列を用いて，標的に対して相補性を有するｓｉＮＡ標的を生成する。そのような配列は，データベースから得ることができるか，または当該技術分野において知られるように実験的に決定することができる。既知の標的部位，例えば，リボザイムまたはアンチセンス等の他の核酸分子を用いた研究に基づいて有効な標的部位であると決定されている標的部位，または疾病または健康状態と関連していることが知られている標的，例えば変異または欠失を含む部位を用いて，これらの部位を標的とするｓｉＮＡ分子を設計することができる。種々のパラメータを用いて，標的ＲＮＡ配列中でいずれの部位が最も適当な標的部位であるかを判定することができる。これらのパラメータには，限定されないが，二次または三次ＲＮＡ構造，標的配列のヌクレオチド塩基組成，標的配列の種々の領域間のホモロジーの程度，またはＲＮＡ転写産物中の標的配列の相対的位置が含まれる。これらの判定に基づいて，ＲＮＡ転写産物中の任意の数の標的部位を選択して，例えば，インビトロＲＮＡ切断アッセイ，培養細胞，または動物モデルを用いることにより，効力についてｓｉＮＡ分子をスクリーニングすることができる。非限定的例においては，用いるべきｓｉＮＡコンストラクトのサイズに基づいて，転写産物中のいずれかの位置の１−１０００個の標的部位を選択する。当該技術分野において知られる方法，例えば標的遺伝子発現の有効な減少を判定するマルチウエルまたはマルチプレートアッセイを用いて，ｓｉＮＡ分子をスクリーニングするためのハイスループットスクリーニングアッセイを開発することができる。これらの方法はまた，例えば，本発明のアンチセンス，リボザイム，２−５−Ａ，トリプレックス，およびデコイ核酸分子の標的部位を決定するためにも用いることができる。
実施例２：ＲＮＡ中のｓｉＮＡ分子標的部位の選択
以下の非限定的工程を用いて，所定の遺伝子配列または転写産物を標的とするｓｉＮＡの選択を行うことができる。
１．標的配列をインシリコで解析して，標的配列中に含まれる特定の長さのすべてのフラグメントまたはサブ配列，例えば２３ヌクレオチドフラグメントのリストを作成する。この工程は，典型的にはあつらえのＰｅｒｌスクリプトを用いて行うが，市販の配列分析プログラム，例えば，Ｏｌｉｇｏ，ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，またはｔｈｅ ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅも同様に用いることができる。
２．場合によっては，ｓｉＮＡは２以上の標的配列に対応する。これは，例えば，同じ遺伝子の異なる転写産物を標的とする場合，２以上の遺伝子の異なる転写産物を標的とする場合，またはヒト遺伝子と動物ホモログとの両方を標的とする場合に生じうる。この場合には，それぞれの標的について特定の長さのサブ配列のリストを生成し，次にリストを比較して，各リスト中でマッチング配列を見いだす。次に，サブ配列を，所定のサブ配列を含む標的配列の数にしたがってランク付けする。この目的は，標的配列のほとんどまたはすべてに存在するサブ配列を見いだすことである。あるいは，ランク付けにより，標的配列にユニークなサブ配列，例えば変異体標的配列を同定することができる。このような方法により，変異体配列を特異的に標的とし，正常な配列の発現に影響を及ぼさないｓｉＮＡの使用が可能となるであろう。
３．場合によっては，ｓｉＮＡのサブ配列は，１またはそれ以上の配列中には存在しないが，所望の標的配列中に存在する。これは，ｓｉＮＡが標的とされないままでいるべきパラロガスファミリーのメンバーを有する遺伝子を標的とする場合に生じうる。上述のケース２におけるように，それぞれの標的について特定の長さのサブ配列のリストを生成し，次にリストを比較して，標的遺伝子中に存在するが標的ではないパラログ中には存在しない配列を見いだす。
４．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して，ＧＣ含量にしたがってランク付けすることができる。３０−７０％のＧＣを含有する部位が好ましく，４０−６０％のＧＣを含有する部位がさらに好ましい。
５．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して，自己フォールディングおよび内部ヘアピンにしたがってランク付けすることができる。内部フォールディングがより弱いことが好ましい。強いヘアピン構造は回避すべきである。
６．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して，配列中にＧＧＧまたはＣＣＣの連続を有するか否かにしたがってランク付けすることができる。いずれかの鎖にＧＧＧ（またはさらに多いＧ）が存在すると，オリゴヌクレオチド合成に問題が生じることがあり，ＲＮＡｉ活性を妨害する可能性がある。したがって，よりよい配列が利用可能である限り，これは回避する。ＣＣＣはアンチセンス鎖にＧＧＧを配置するため，標的鎖中で検索する。
７．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して，配列の３’末端にジヌクレオチドＵＵ（ウリジンジヌクレオチド）を，および／または配列の５’末端にＡＡ（アンチセンス配列に３’ＵＵを生ずる）を有するか否かにしたがってランク付けする。これらの配列により，末端ＴＴチミジンジヌクレオチドを有するｓｉＮＡ分子を設計することが可能となる。
８．上述のようにランク付けされたサブ配列のリストから４個または５個の標的部位を選択する。次に，例えば，２３ヌクレオチドを有するサブ配列において，それぞれの選択された２３−ｍｅｒサブ配列の右側２１ヌクレオチドをｓｉＮＡデュープレックスの上側（センス）鎖用に設計し合成し，一方，それぞれの選択された２３−ｍｅｒサブ配列の左側２１ヌクレオチドの逆相補鎖をｓｉＮＡデュープレックスの下側（アンチセンス）鎖用に設計し合成する（表ＩＩおよびＩＩＩを参照）。末端ＴＴ残基が配列にとって望ましい場合には（パラグラフ７に記載されるように），オリゴを合成する前にセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の２つの３’末端ヌクレオチドをＴＴで置き換える。
９．ｓｉＮＡ分子をインビトロ，培養細胞または動物モデル系においてスクリーニングして，最も活性なｓｉＮＡ分子，または標的ＲＮＡ配列中の最も好ましい標的部位を同定する。
１０．標的核酸配列の選択に際しては，他の設計上の検討事項を用いることができる。例えば，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，１ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ９３６およびＵｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｈ２４７を参照。
実施例３：ｓｉＮＡの設計
標的ＲＮＡの標的配列を分析し，任意に，フォールディングに基づいて標的部位の優先順位をつけることにより（所定の配列の構造を分析してｓｉＮＡの標的に対するアクセス可能性を判定する），ｓｉＮＡ分子のライブラリを用いることにより，あるいは本明細書に記載されるようにしてインビトロｓｉＮＡシステムを用いることにより，ｓｉＮＡ標的部位を選択した。ｓｉＮＡ分子は，各標的に結合することができるように設計し，任意にコンピュータフォールディングにより個々に分析して，ｓｉＮＡ分子が標的配列と相互作用しうるか否かを評価した。種々の長さのｓｉＮＡ分子を選択して活性を最適化することができる。一般に，標的ＲＮＡに結合するかさもなくばこれと相互作用するのに十分な数の相補的ヌクレオチド塩基が選択されるが，相補性の程度または種々の長さまたは塩基組成はｓｉＮＡデュープレックスと適合するよう改変することができる。このような方法論を用いることにより，任意の既知のＲＮＡ配列，例えば，任意の遺伝子転写産物に対応するＲＮＡ配列中の部位を標的とするようｓｉＮＡ分子を設計することができる。
化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトは，ＲＮＡｉ活性を媒介する能力を保持しながらインビボでの全身投与におけるヌクレアーゼ安定性および／または改良された薬物動態学，局在化およびデリバリー特性を与えるよう設計する。本明細書に記載される化学修飾は，本明細書に記載されるか当該技術分野において一般に知られる合成方法を用いて合成的に導入する。次に，合成ｓｉＮＡコンストラクトを，血清および／または細胞／組織抽出物（例えば，肝臓抽出物）中におけるヌクレアーゼ安定性についてアッセイする。合成ｓｉＮＡコンストラクトは，平行して，適当なアッセイ，例えば本明細書に記載されるルシフェラーゼレポーターアッセイまたはＲＮＡｉ活性を定量することができる別の適当なアッセイを用いてＲＮＡｉ活性についても試験する。ヌクレアーゼ安定性とＲＮＡｉ活性との両方を有する合成ｓｉＮＡコンストラクトをさらに改変して，安定性および活性アッセイについて再評価することができる。次に，安定化された活性なｓｉＮＡコンストラクトの化学修飾を任意の選択されたＲＮＡを標的とする任意のｓｉＮＡ配列に適用し，例えば標的スクリーニングアッセイにおいて用いて，治療薬開発のためのリードｓｉＮＡ化合物を選定することができる。
実施例４：ｓｉＮＡの化学合成および精製
ｓｉＮＡ分子は，ＲＮＡメッセージ中の種々の部位，例えば，本明細書に記載されるＲＮＡ配列中の標的配列と相互作用するよう設計することができる。ｓｉＮＡ分子の一方の鎖の配列は，上述した標的部位配列に相補的である。ｓｉＮＡ分子は，本明細書に記載される方法を用いて化学的に合成することができる。対照配列として用いられる不活性ｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子の配列を標的配列に相補的ではないようにスクランブル化することにより，合成することができる。一般に，ｓｉＮＡコンストラクトは，本明細書に記載されるように，固相オリゴヌクレオチド合成方法を用いて合成することができる（例えば，Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８０４，６８３；５，８３１，０７１；５，９９８，２０３；６，１１７，６５７；６，３５３，０９８；６，３６２，３２３；６，４３７，１１７；６，４６９，１５８；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許６，１１１，０８６；６，００８，４００；６，１１１，０８６を参照（いずれもその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。
非限定的例においては，ＲＮＡオリゴヌクレオチドは，当該技術分野において知られるように，ホスホルアミダイト化学を用いて段階的様式で合成する。標準的なホスホルアミダイト化学においては，５’−Ｏ−ジメトキシトリチル，２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル，３’−Ｏ−２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト基，および環外アミン保護基（例えば，Ｎ６−ベンゾイルアデノシン，Ｎ４−アセチルシチジン，およびＮ２−イソブチリルグアノシン）のいずれかを含むヌクレオシドを使用する。あるいは，Ｓｃａｒｉｎｇｅ（上掲）により記載されるように，ＲＮＡの合成において２’−Ｏ−シリルエーテルを酸不安定性２’−Ｏ−オルトエステル保護基と組み合わせて用いてもよい。異なる２’化学は異なる保護基を必要とし，例えば，Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６３１，３６０（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるように，２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオシドにはＮ−フタロイル保護を用いることができる。
固相合成の間に，各ヌクレオチドを順番に（３’−から５’−方向に）固体支持体結合オリゴヌクレオチドに付加する。鎖の３’末端の最初のヌクレオシドを種々のリンカーを用いて固体支持体（例えば，調整多孔ガラスまたはポリスチレン）に共有結合させる。ヌクレオチド前駆体，リボヌクレオシドホスホルアミダイト，および活性化剤を混合して，第１のヌクレオシドの５’末端上に第２のヌクレオシドホスホルアミダイトをカップリングさせる。次に支持体を洗浄し，未反応５’−ヒドロキシル基を無水酢酸等のキャッピング試薬を用いてキャッピングして，不活性な５’−アセチル成分を得る。次に３価リン結合を酸化してより安定なリン酸結合とする。ヌクレオチド付加サイクルの最後に，適当な条件下で（例えば，トリチル系の基については酸性条件，シリル系の基についてはフッ化物を用いて），５’−Ｏ−保護基を切断する。それぞれの次のヌクレオチドについてこのサイクルを繰り返す。
合成条件を改変して，例えば，合成すべきｓｉＮＡの特定の化学組成に応じて，異なるカップリング時間，異なる試薬／ホスホルアミダイト濃度，異なる接触時間，異なる固体支持体および固体支持体リンカー化学を用いることにより，カップリング効率を最適化することができる。ｓｉＮＡの脱保護および精製は，一般に記載されているようにして行うことができる（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８３１，０７１，米国特許６，３５３，０９８，米国特許６，４３７，１１７，およびＢｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許６，０５４，５７６，米国特許６，１６２，９０９，米国特許６，３０３，７７３およびＳｃａｒｉｎｇｅ（上掲）（これらはすべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。
さらに，脱保護条件を改変して，可能な限り最高の収量および純度のｓｉＮＡコンストラクトを得る。例えば，本出願人は，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは不適切な脱保護条件下で分解しうることを見いだした。そのようなオリゴヌクレオチドは，水性メチルアミンを用いて約３５℃で３０分間脱保護する。２’−デオキシ−２’−フルオロ含有オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドをも含む場合には，水性メチルアミンで約３５℃で３０分間脱保護した後，ＴＥＡ−ＨＦを加え，反応液をさらに１５分間約６５℃に維持する。次に脱保護し，精製し，および／またはアニールさせたｓｉＮＡ分子を，本明細書に記載されるようにして処方する。
実施例５：ｓｉＮＡ活性を評価するためのＲＮＡｉインビトロアッセイ
ＲＮＡｉを無細胞システムにおいて再現するインビトロアッセイを用いて，ＲＮＡ標的を標的とするｓｉＮＡコンストラクトを評価する。アッセイは，Ｔｕｓｃｈｌら（１９９９，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７）およびＺａｍｏｒｅら（２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３）に記載され，標的ＲＮＡ用に適合させた系を含む。シンシチウム胚盤葉に由来するショウジョウバエ抽出物を用いてインビトロでＲＮＡｉ活性を再構築する。標的ＲＮＡは，ヘアレスを発現する適当なプラスミドからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写することにより，または本明細書に記載されるように化学合成により作製する。センスおよびアンチセンスｓｉＮＡ鎖（例えば各２０μＭ）は，緩衝液（例えば，１００ｍＭ酢酸カリウム，３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．４，２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で９０℃で１分間，次に３７℃で１時間インキュベートすることによりアニーリングさせ，次に溶解緩衝液（例えば１００ｍＭ酢酸カリウム，３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４），２ｍＭ酢酸マグネシウム）で希釈する。アニーリングは，アガロースゲルを用いてＴＢＥ緩衝液でゲル電気泳動し，臭化エチジウムで染色することによりモニターすることができる。ショウジョウバエの溶解物は，ＯｒｅｇｏｎＲハエからの０−２時間齢の胚を用いて調製し，酵母糖蜜寒天上に回収し，絨毛膜を除去し溶解する。溶解物を遠心分離し，上清を単離する。アッセイは，５０％溶解物［ｖｏｌ／ｖｏｌ］，ＲＮＡ（１０−５０ｐＭの最終濃度），およびｓｉＮＡ（１０ｎＭの最終濃度）を含む１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解緩衝液を含有する反応混合物を含む。反応混合物はまた，１０ｍＭのクレアチンリン酸，１０μｇ／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼ，１００μＭのＧＴＰ，１００μＭのＵＴＰ，１００μＭのＣＴＰ，５００μＭのＡＴＰ，５ｍＭのＤＴＴ，０．１Ｕ／μＬのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ），および１００μＭの各アミノ酸を含む。酢酸カリウムの最終濃度は１００ｍＭに調節する。反応は氷上で予め組立て，２５℃で１０分間プレインキュベートした後にＲＮＡを加え，２５℃でさらに６０分間インキュベートする。４倍容量の１．２５ｘ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で反応を停止させる。標的ＲＮＡの切断は，ＲＴ−ＰＣＲ分析または当該技術分野において知られる他の方法によりアッセイし，反応からｓｉＮＡが省略されている対照反応と比較する。
あるいは，アッセイ用の内部標識した標的ＲＮＡを［アルファ−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写により調製し，スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通し，さらに精製することなく標的ＲＮＡとして用いる。任意に，標的ＲＮＡはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて５’−３２Ｐ末端標識してもよい。アッセイは上述のようにして行い，標的ＲＮＡおよびＲＮＡｉにより生成する特異的ＲＮＡ切断産物をゲルのオートラジオグラフィーで可視化する。切断のパーセントは，無傷の対照ＲＮＡまたはｓｉＮＡなしの対照反応からのＲＮＡ，およびアッセイにより生成する切断産物を表すバンドをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（登録商標）（オートラジオグラフィー）で定量することにより決定する。
１つの態様においては，このアッセイを用いてｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡｉ切断のＲＮＡ標的の標的部位を決定する。ここでは，複数のｓｉＮＡコンストラクトを，例えば，標識した標的ＲＮＡの電気泳動により，またはノザンブロッティング，ならびに当該技術分野においてよく知られる他の方法論により，アッセイ反応を分析することにより，ＲＮＡ標的のＲＮＡｉ媒介性切断についてスクリーニングする。
実施例６：標的ＲＮＡの核酸阻害
ヒト標的ＲＮＡを標的とするｓｉＮＡ分子を上述したように設計し合成する。これらの核酸分子は，例えば以下の方法を用いて，インビボでの切断活性について試験することができる。
２つのフォーマットを用いて標的にターゲティングするｓｉＮＡの効力を試験した。最初に，培養細胞で試薬を試験して，ＲＮＡおよび蛋白質阻害の程度を測定する。本明細書に記載される標的に対するｓｉＮＡ試薬を選択する。は，適当なトランスフェクション剤によりこれらの試薬を細胞にデリバリーした後にＲＮＡ阻害を測定する。増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリングにより（例えば，ＡＢＩ７７００ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）），標的ＲＮＡの相対量をアクチンに対して測定する。無関係標的に対して作製したオリゴヌクレオチド配列の混合物または同じ全体長および化学を有するが各位置においてランダムに置換されているランダム化ｓｉＮＡ対照と比較する。標的に対して第１および第２のリード試薬を選択し，最適化を行う。最適トランスフェクション試薬濃度を選択した後，リードｓｉＮＡ分子を用いてＲＮＡの阻害の経時変化を調べる。さらに，細胞播種フォーマットを用いてＲＮＡ阻害を測定することができる。
ｓｉＮＡの細胞へのデリバリー
トランスフェクションの前日に，細胞を，６ウエルディッシュにＥＧＭ−２（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中で例えば１ｘ１０５細胞／ウエルで播種する。ポリスチレンチューブ中で処方ｓｉＮＡ組成物をＥＧＭ基本培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中で３７℃で３０分間複合体する。ボルテックスした後，複合体化した処方ｓｉＮＡ組成物を各ウエルに加え，示される時間インキュベートする。最初の最適化実験のためには，細胞を例えば１ｘ１０３で９６ウエルプレートに播種し，ｓｉＮＡ複合体を示されるように加える。ｓｉＮＡの細胞へのデリバリーの効率は脂質とした複合体化蛍光ｓｉＮＡを用いて決定する。６ウエルディッシュ中の細胞をｓｉＮＡとともに２４時間インキュベートし，ＰＢＳですすぎ，２％パラホルムアルデヒド中で室温で１５分間固定する。ｓｉＮＡの取り込みは，蛍光顕微鏡で可視化する。
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標） （増幅のリアルタイムＰＣＲ モニタリング ） および光サイクラーによる ｍＲＮＡの定量
ｓｉＮＡのデリバリーの後，例えば，６ウエル用にはＱｉａｇｅｎＲＮＡ精製キットを，または９６ウエルアッセイ用にはＲｎｅａｓｙ抽出キットを用いて，細胞から総ＲＮＡを調製する。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）のためには，５’末端に共有結合させたレポーター染料（ＦＡＭまたはＪＯＥ）および３’末端にコンジュゲート化したクエンチャー染料ＴＡＭＲＡを有する二重標識プローブを合成する。１段階ＲＴ−ＰＣＲ増幅は，例えば，ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒで，１０μｌの総ＲＮＡ，１００ｎＭのフォワードプライマー，９００ｎＭのリバースプライマー，１００ｎＭのプローブ，１ＸＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応緩衝液（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，３００μＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，およびｄＴＴＰ，１０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ），１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ＵのＭ−ＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から構成される５０μｌの反応液を用いて行う。熱サイクリング条件は，４８℃で３０分間，９５℃で１０分間，次に９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクルからなるものでありうる。ｍＲＮＡレベルの定量は，段階的に希釈した総細胞ＲＮＡ（３００，１００，３３，１１ｎｇ／ｒｘｎ）から生成した標準に対して行い，平行してＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）で測定したβ−アクチンまたはＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して標準化する。目的とする各遺伝子について，上側プライマーおよび下側プライマー，および蛍光標識したプローブを設計する。特定のＰＣＲ産物中へのＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ染料のリアルタイム取り込みは，ガラスキャピラリー管で光サイクラーを用いて測定することができる。対照ｃＲＮＡを用いて，各プライマー対について標準曲線を作成する。値は，各サンプルにおいてＧＡＰＤＨに対する相対的発現として表す。
ウエスタンブロッティング
核抽出物は，標準的なマイクロ調製手法（例えば，Ａｎｄｒｅｗｓ ａｎｄ Ｆａｌｌｅｒ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，２４９９を参照）を用いて調製することができる。例えばＴＣＡ沈殿を用いて，上清からの蛋白質抽出物を調製する。等量の２０％ＴＣＡを細胞上清に加え，氷上で１時間インキュベートし，５分間の遠心分離によりペレット化する。ペレットをアセトンで洗浄し，乾燥し，水に再懸濁する。細胞蛋白質抽出物を１０％ビス−Ｔｒｉｓ ＮｕＰａｇｅ（核抽出物）または４−１２％Ｔｒｉｓ−グリシン（上清抽出物）ポリアクリルアミドゲルに流し，ニトロセルロース膜に移す。非特異的結合は，例えば，５％無脂乳とともに１時間インキュベートすることによりブロッキングすることができ，次に一次抗体で４℃で１６時間反応させる。洗浄した後，二次抗体，例えば（１：１０，０００希釈）を室温で１時間適用し，ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）でシグナルを検出する。
実施例７：処方ｓｉＮＡ組成物の血清安定性の評価
本明細書において説明されているように，処方脂質組成物のトランスフェクションまたはデリバリー効率を判定する１つの方法は，処方組成物の血清における安定性をインビトロで測定することである。相対的濁度測定を用いて，処方ｓｉＮＡ組成物のインビトロ血清安定性を判定することができる。
濁度測定を用いて，脂質粒子処方物Ｌ０６５，Ｆ２，Ｌ０５１，およびＬ０７３の血清安定性をモニタリングした（脂質処方物Ｌ０５１およびＬ０７３については図８および９を参照）。Ｌ０６５の脂質処方物は，カチオン性脂質ＣｐＬｉｎＤＭＡ，中性脂質ＤＳＰＣ，コレステロール，および２ｋＰＥＧ−ＤＭＧを含む。脂質処方物Ｆ２はＤＯＤＡＰを含む。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ３８４マイクロプレート分光光度計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））を用いて，５０％血清の存在下および非存在下における処方ｓｉＮＡ組成物（０．１ｍｇ／ｍｌ）の吸収を，対応する量の血清単独を参照として用いて，５００ｎｍで測定した。処方物を３７℃でインキュベートし，２分，５分，１０分，２０分，３０分，１時間，２時間，３時間，４時間，５時間，７時間および２４時間に分析した。相対的濁度は，サンプル濁度を処方ｓｉＮＡ組成物を５０％血清中で２分間インキュベートしたときの濁度で割ることにより測定した。相対的濁度が経時的に１．０付近で一定のままであれば，処方分子組成物は血清中で安定である。図１１に示されるように，処方ｓｉＮＡ組成物Ｌ０６５，Ｌ０５１，およびＬ０７３は，血清安定脂質ナノ粒子組成物である。図３３に示されるように，処方ｓｉＮＡ組成物Ｌ０７７，Ｌ０８０，Ｌ０８２およびＬ０８３，は血清安定脂質ナノ粒子組成物である。
実施例８： 処方ｓｉＮＡ組成物のｐＨ依存的相転移の評価
さらに，処方脂質組成物のトランスフェクションまたはデリバリー効率は，処方組成物のインビトロでのｐＨ依存的相転移を測定することにより判定することができる。相対的濁度測定を用いて，処方ｓｉＮＡ組成物のインビトロでのｐＨ依存的相転移を測定することができる。
濁度測定を用いて，処方ｓｉＮＡ組成物Ｌ０６５，Ｌ０５１，Ｆ２，Ｌ０７３，およびＬ０６９の相転移をモニタリングした。ｐＨ３．５，４．０，４．５，５．０，５．５，６．０，６．５，７．０，７．５，８．０，８．５および９．０を有する０．１Ｍホスフェートバッファ中における脂質粒子処方物（０．１ｍｇ／ｍｌ）の吸収を，ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ３８４マイクロプレート分光光度計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））を用いて，対応する量のバッファ単独を参照として用いて３５０ｎｍで測定した。このアッセイは，種々のｐＨにおける処方物の相対的光散乱を測定する。比較的大きい粒子サイズを有するラメラ構造（すなわち，血清安定構造）は，対応する逆位六角形構造より多くの光を散乱させると予測される。サンプルを３７℃でインキュベートし，２分，５分，１０分，３０分，および２時間に分析した。相対的濁度は，サンプル濁度を処方ｓｉＮＡ組成物をリン酸バッファ（ｐＨ７．５）中で２分間インキュベートしたときの濁度で割ることにより決定した。ｐＨ７．５−ｐＨ５．０の間で測定したときに相対的濁度の変化があれば，処方分子組成物はｐＨ依存的相転移を起こしている。図１２に示されるように，処方ｓｉＮＡ組成物Ｌ０５１およびＬ０７３は，ｐＨ６．５−ｐＨ５．０でｐＨ依存的相転移を起こした。図１３に示されるように，処方ｓｉＮＡ組成物Ｌ０６９は，ｐＨ６．５−ｐＨ５．０でｐＨ依存的相転移を起こした。図３４に示されるように，処方ｓｉＮＡ組成物Ｌ０７７，Ｌ０８０，Ｌ０８２，およびＬ０８３は，ｐＨ６．５−ｐＨ５．０でｐＨ依存的相転移を起こした。
実施例９：慢性ＨＢＶ感染のモデルにおける処方ｓｉＮＡ組成物の評価
ｓｉＮＡナノ粒子活性のインビトロ分析
ＨｅｐＧ２細胞を，非必須アミノ酸，ピルビン酸ナトリウム（９０％），および１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅＣａｔ＃ＳＨ３００７０．０３）を含むＥＭＥＭ（ＣｅｌｌｇｒｏＣａｔ＃１０−０１０−ＣＶ）で成長させた。ｐｓＨＢＶ−１ベクターからＨＢＶゲノム配列を切り出し再ライゲーションさせることにより複製可能なｃＤＮＡを生成した。ＨｅｐＧ２細胞を９６ウエルマイクロタイタープレートに播種（３ｘ１０４細胞／ウエル）し，一晩インキュベートした。成長培地中にカチオン性脂質（１１−１５μｇ／ｍＬ）および再ライゲーションｐｓＨＢＶ−１（４．５μｇ／ｍＬ）を含む（最終濃度）カチオン性脂質／ＤＮＡ複合体を形成した。３７℃で１５分間インキュベートした後，２０μＬの複合体を抗生物質を含まない８０μＬの成長培地中に播種したＨｅｐＧ２細胞に加えた。３７℃で７．５時間後，培地を除去し，細胞を培地で１回すすぎ，１００μＬの新鮮な培地を各ウエルに加えた。５０μＬのｓｉＮＡナノ粒子処方物（処方物の詳細については実施例９を参照）（培地中に３Ｘ濃度で希釈）を各ウエルに加え，１つの濃度につき３つのレプリカウエルを用意した。細胞を４日間インキュベートし，培地を除去し，ＨＢｓＡｇレベルについてアッセイした。図１５は，処方された（処方物Ｌ０５１，表ＩＶ）活性なｓｉＮＡで処置した細胞からのＨＢｓＡｇのレベルを，未処置または負対照処置細胞と比較して示す。図１６は，処方された（処方物Ｌ０５３およびＬ０５４，表ＩＶ）活性なｓｉＮＡで処置した細胞からのＨＢｓＡｇのレベルを未処置または負対照処置細胞と比較して示す。図１７は，処方された（処方物Ｌ０５１，表ＩＶ）活性なｓｉＮＡで処置した細胞からのＨＢｓＡｇのレベルを未処置または負対照処置細胞と比較して示す。図３０は，処方された（処方物Ｌ０８３ａｎｄＬ０８４，表ＩＶ）活性なｓｉＮＡで処置した細胞からのＨＢｓＡｇのレベルを未処置または負対照処置細胞と比較して示す。図３１は，処方された（処方物Ｌ０７７，表ＩＶ）活性なｓｉＮＡで処置した細胞からのＨＢｓＡｇのレベルを未処置または負対照処置細胞と比較して示す。図３２は，処方された（処方物Ｌ０８０，表ＩＶ）活性なｓｉＮＡで処置した細胞からのＨＢｓＡｇのレベルを未処置または負対照処置細胞と比較して示す。これらの実験においては，ナノ粒子処方物Ｌ０５１，Ｌ０５３，およびＬ０５４を用いて活性な処方ｓｉＮＡで処置した細胞ではＨＢｓＡｇレベルの用量依存的低下が認められたが，負対照処置細胞では低下が認められなかった。この結果は，処方ｓｉＮＡ組成物が細胞に入ることができ，細胞性ＲＮＡｉ装置を有効に作用させてウイルス遺伝子発現を阻害しうることを示す。
ＨＢＶ複製のマウスモデルにおける処方ｓｉＲＮＡの活性の分析
化学的に安定化させたｓｉＮＡナノ粒子（処方物の詳細については実施例９を参照）組成物のＨＢＶに対する活性を評価するために，マウスＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ）株に，ＨＢＶベクターを水圧注入（ＨＤＩ）した後に処方ｓｉＮＡ組成物（処方物Ｌ０５１，表ＩＶ）を全身投与した。実験時，雌マウスは５−６週齢であり，約２０グラムであった。用いたＨＢＶベクターｐＷＴＤは，完全ＨＢＶゲノムの頭−尾ダイマーである。２０グラムのマウスに対して，ｐＷＴＤを食塩水中に含む合計１．６ｍｌを尾静脈に５秒間で注入した。マウス１匹あたり合計０．３μｇのＨＢＶベクターを注入した。肝臓をＨＤＩによる破壊から回復させるために，処方ｓｉＮＡ組成物の投与はＨＤＩの６日後に始めた。封入された活性および負対照ｓｉＲＮＡを，標準的なＩＶ注入により３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで３日間投与した。各群（Ｎ＝５）の動物を最終投与の３および７日後に犠牲死させ，血清ＨＢＶＤＮＡおよびＨＢｓＡｇのレベルを測定した。ＨＢＶＤＮＡタイターは，定量的リアルタイムＰＣＲにより測定し，平均ｌｏｇ１０コピー／ｍｌ（±ＳＥＭ）で表した。血清ＨＢｓＡｇレベルは，ＥＬＩＳＡによりアッセイし，平均ｌｏｇ１０ｐｇ／ｍｌ（±ＳＥＭ）で表した。活性な処方ｓｉＮＡ組成物で処置した群では，ＰＢＳ群および負対照群の両方と比較して，３日および７日の時点の両方で血清ＨＢＶＤＮＡ（図１８および２９）およびＨＢｓＡｇ（図１９，３０，３１，および３２））の有意な低下が認められた。
材料および方法
オリゴヌクレオチド合成および特性決定
すべてのＲＮＡは，本明細書に記載されるようにして合成した。相補鎖をＰＢＳ中でアニーリングし，脱塩し，凍結乾燥した。２６３ＨＢＶｓｉＮＡの活性部位の配列を図１４に示す。インビボで用いた修飾ｓｉＮＡは，ＨＢＶ２６３ＭおよびＨＢＶ１５８３Ｍと称し，修飾されていないリボヌクレオチドおよび逆位無塩基末端キャップを含むものはＨＢＶ２６３ＲおよびＨＢＶ１５８３Ｒと称する。２つの別の部位を標的とするｓｉＮＡ，ＨＢＶ１５８０ＭおよびＨＢＶ１５８０Ｒを用いてある種の薬物動態学的研究を行った。
ＨＣＶ無関係対照のｓｉＮＡ配列は下記のとおりである：
センス鎖:
アンチセンス鎖:
（小文字＝２’−デオキシ−２’−フルオロ；大文字イタリック＝２’−デオキシ；大文字下線＝２’−Ｏ−メチル；大文字太字＝リボヌクレオチド；Ｔ＝チミジン；Ｂ＝逆位デオキシ無塩基；ｓ＝ホスホロチオエート）
逆位対照配列は５’−３’の逆位である。
ＨＢｓＡｇＥ ＬＩＳＡアッセイ
ＨＢｓＡｇのレベルは，ＧｅｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ／Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡキットを用いて，製造元の指針にしたがって測定した。ＨＢＶベクターでトランスフェクションしていない細胞の吸収をアッセイのバックグラウンドとして用い，実験サンプルの値から差し引いた。
ＨＢＶ ＤＮＡ分析
５０μＬのマウス血清からＱＩＡｍｐ９６ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造元の指針にしたがってウイルスＤＮＡを抽出した。ＡＢＩＰｒｉｓｍ７０００配列検出器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用いてＨＢＶＤＮＡレベルを分析した。以下のプライマーおよびプローブ配列を用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行った：
フォラードプライマー
リバースプライマー
およびプローブ
全長ＨＢＶゲノムを含むｐｓＨＢＶ−１ベクターを標準曲線として用いて，血清１ｍＬあたりのＨＢＶコピー数を計算した。
実施例１０：ＨＣＶ感染のインビトロＨＣＶレプリコンモデルにおける処方ｓｉＮＡ組成物の評価
ＨＣＶレプリコン系を用いて，ＨＣＶＲＮＡを標的とするｓｉＮＡの有効性を調べた。試薬を，Ｈｕｈ７細胞（例えば，Ｒａｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１００，２３５−２４０を参照）を用いて培養細胞中で試験してＲＮＡ阻害の程度を決定した。ｓｉＮＡは，本明細書に記載されるように，ＨＣＶ標的に対して選択した。ＨＣＶ部位３０４用の活性なｓｉＮＡ配列は以下のとおりである：センス鎖：（配列番号１）；アンチセンス鎖：（配列番号２）（これらは上述の実施例８において不活性配列として用いた）．この実験で用いたｓｉＮＡ不活性対照配列は，ＨＢＶ部位２６３を標的とし，以下のとおりである：センス鎖：（配列番号６）；アンチセンス鎖：（配列番号７），（これらは上述の実施例８において活性な配列として用いた）。活性および不活性ｓｉＮＡｓを上述の実施例９に記載されるようにして処方物Ｌ０５１，Ｌ０５３，またはＬ０５４として処方した。安定にトランスフェクトされたＣｌｏｎｅＡＨＣＶサブゲノムレプリコン（Ａｐａｔｈ，ＬＬＣ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＨｕｈ７細胞を５ｍｌの１００Ｘ（１０ｍＭ）非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃１１１４０−０５０），５ｕＬの２００ｍＭグルタミン（Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ＃２５−００５−Ｃ１），５０ｕＬの熱不活性化ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃２６１４０−０７９）および１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃１１８１１−０２３）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃１１９６５−１１８）で成長させた。ｓｉＮＡ処方物でトランスフェクションするためには，細胞を９，８００細胞／ウエルで９６ウエルＣｏＳｔａｒ組織培養プレートでＮＥＡＡおよび１０％ＦＢＳ，（抗生物質なし）を含むＤＭＥＭに播種した。２０−２４時間後，細胞を最終濃度１−２５ｎＭの処方ｓｉＮＡでトランスフェクションした。３日間インキュベートした後，細胞を溶解し，ＲＮ水性−９６キット（ＡｍｂｉｏｎＣａｔ＃１９２０）を用いて製造元の指針にしたがってＲＮＡを抽出した。図２０は，処方された活性なｓｉＮＡ（処方物Ｌ０５１，表ＩＶ）で処置した細胞からのＨＣＶＲＮＡのレベルを，未処置または負対照処置細胞と比較して示す。図２１は，処方された活性なｓｉＮＡ（処方物Ｌ０５３およびＬ０５４，表ＩＶ）で処置した細胞からのＨＣＶＲＮＡのレベルを，未処置または負対照処置細胞と比較して示す。これらの実験においては，処方物Ｌ０５１，Ｌ０５３，およびＬ０５４を用いて活性な処方ｓｉＮＡで処置した細胞では，ＨＣＶＲＮＡレベルの用量依存性減少が観察されたが，負対照処置細胞では減少は認められなかった。この結果は，処方ｓｉＮＡ組成物が細胞中に入り，有効にウイルス遺伝子発現を阻害しうることを示す。
実施例１１：未処方および処方ｓｉＮＡの気管内投与後の肺分布
ｓｉＮＡ分子の肺へのデリバリーの効率を測定するため，未処方ｓｉＲＮＡ（裸），コレステロールコンジュゲート化ｓｉＮＡ，または処方分子組成物（Ｔ０１８．１およびＴ０１９．１）中のｓｉＲＮＡを気管を通してマウスの肺に投与した。非処方ｓｉＮＡは裸の核酸を含む。コレステロールコンジュゲート化ｓｉＮＡはコレステロールと結合させたｓｉＮＡを含む。処方分子組成物Ｔ０１８．１およびＴ０１９．１は，それぞれ，ＤＯｃａｒｂＤＡＰ，ＤＳＰＣ，コレステロール，ＰＥＧ−ＤＭＧ，およびＤＯＤＭＡ，ＤＳＰＣ，コレステロール，ＰＥＧ−ＤＭＧで処方したｓｉＮＡを含む。３匹の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群をケタミンおよびキシラジンを用いる麻酔下に置いた。投与用溶液を濾過し，１．０ｍｇ／ｋｇのデュープレックス化ｓｉＲＮＡをＰｅｎｎｃｅｎｔｕｒｙモデル＃１Ａ−１ＣマイクロスプレーヤーおよびＰｅｎｎｃｅｎｔｕｒｙモデル＃ＦＭＪ２５０シリンジを用いてｓｉＲＮＡ（ＴＧＦβ部位１２６４，安定化化学７／８）をエアロゾル化し，気管を通して肺に直接投与した。動物には，非処方ｓｉＮＡ，コレステロール−コンジュゲート化ｓｉＮＡまたは処方分子組成物中のｓｉＮＡを投与した。投与の１，２４または７２時間後に，動物を安楽死させ，放血させ，滅菌獣医学等級食塩水で心臓から潅流した。肺を取り出し，予め秤量したホモ時ネーションチューブに入れ，ドライアイスで凍結した。チューブと肺とを秤量した後に差し引くことにより，肺重量を決定した。肺組織におけるｓｉＮＡのレベルをハイブリダイゼーションアッセイを用いて測定した。図２２は，（ｉ）非処方ｓｉＮＡ，（ｉｉ）コレステロールコンジュゲート化ｓｉＮＡまたは（ｉｉｉ）処方分子組成物Ｔ０１８．１またはＴ０１９．１中のｓｉＮＡを直接投与した後の，肺組織におけるｓｉＮＡのレベルを示す。肺組織中の暴露の半減期は，非処方ｓｉＮＡでは３−４時間，コレステロールコンジュゲート化ｓｉＮＡでは９時間，処方分子組成物Ｔ０１８．１またはＴ０１９．１中のｓｉＮＡでは３７−３９時間であった。
実施例１２：本発明のｓｉＮＡＬＮＰ処方物を用いる種々の細胞株の効率的なトランスフェクション
本発明のＬＮＰ処方物のトランスフェクション効率を種々の細胞株，例えば，６．１２脾臓，Ｒａｗ２６４．７腫瘍，ＭＭ１４Ｌｕ，ＮＩＨ３Ｔ３，Ｄ１０．Ｇ４．１Ｔｈ２ヘルパー，および肺初代マクロファージ細胞において，内因性ＭＡＰキナーゼ１４（ｐ３８）遺伝子発現を標的とすることにより測定した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＬＦ２Ｋ）をデリバリー剤として用いるインビトロスクリーニングにより，ＭａｐＫ１４（ｐ３８ａ）に対する強力なリードｓｉＮＡを選択した。このｓｉＮＡのセンス鎖配列は，
からなり，およびアンチセンス鎖配列は
からなり，式中，小文字＝２’−デオキシ−２’−フルオロ；大文字イタリック＝２’−デオキシ；大文字下線＝２’−Ｏ−メチル；大文字太字＝リボヌクレオチド；Ｔ＝チミジン；Ｂ＝逆位デオキシ無塩基；およびｓ＝ホスホロチオエートである。
ＭａｐＫ１４を標的とする独自のＬＮＰをスクリーニングし，培養細胞でＬＦ２Ｋおよび不活性なｓｉＮＡを含有するＬＮＰ対照と比較した。さらに，リードＬＮＰを用量応答法で試験してＩＣ５０値を決定した。結果を表Ｖにまとめる。図３５は，ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞における，ＭａｐＫ１４部位１０３３を標的とするＬＮＰ５８およびＬＮＰ９８処方物の効力のデータを示す。図３６は，ＭＭ１４．Ｌｕ正常マウス肺細胞における，ＭａｐＫ１４部位１０３３を標的とするＬＮＰ９８処方物の効力のデータを示す。図３７は，６．１２Ｂリンパ球における，ＭａｐＫ１４部位１０３３を標的とするＬＮＰ５４，ＬＮＰ９７，およびＬＮＰ９８処方物の効力のデータを示す。図３８は，ＮＩＨ３Ｔ３細胞における，ＭａｐＫ１４部位１０３３を標的とするＬＮＰ９８処方物の効力データを示す。図３９は，ＲＡＷ２６４．７細胞における，ＭａｐＫ１４ＬＮＰ５４およびＬＮＰ９８処方ｓｉＮＡによるＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存的減少を示す。図４０は，ＭＭ１４．Ｌｕ細胞における，ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９８処方ｓｉＮＡによるＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存的減少を示す。図４１は，６．１２Ｂ細胞における，ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９７およびＬＮＰ９８処方ｓｉＮＡによるＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存的減少を示す。図４２は，ＮＩＨ３Ｔ３細胞における，ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９８処方ｓｉＮＡによるＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存的減少を示す。
ＬＦ２Ｋトランスフェクション方法：
ＬＦ２Ｋトランスフェクション用には以下の方法を用いた。２０−２４時間後，０．２５または０．３５μＬ／ウエルのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００および０．１５または０．２５μＬ／ウエルの２５ｎＭのｓｉＮＡの複合体を用いて細胞をトランスフェクションした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００をＯｐｔｉＭＥＭと混合し，少なくとも５分間静置した。０．２５μＬのトランスフェクション用には，各複合体について１μＬのＬＦ２Ｋを９９μＬのＯｐｔｉＭＥＭと混合した。０．３５μＬのトランスフェクション用には，各複合体について１．４μＬのＬＦ２Ｋを９８．６μＬのＯｐｔｉＭＥＭと混合した。０．１５μＬのトランスフェクション用には，各複合体について０．６０μＬのＳｉｌｅｎｔＦｅｃｔを９９．４μＬのＯｐｔｉＭＥＭと混合した。０．３０μＬのトランスフェクション用には，各複合体について１．２μＬのＳｉｌｅｎｔＦｅｃｔを９８．２μＬのＯｐｔｉＭＥＭと混合した。ｓｉＮＡをマイクロタイターチューブ（ＢｉｏＲａｄ＃２２３−９３９５）に加え，次にＯｐｔｉＭＥＭを加えて合計１００μＬの容量として，４つのウエルで用いた。１００μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００／ＯｐｔｉＭＥＭ混合物を加え，チューブを中速で１０秒間ボルテックスし，室温で２０分間静置した。チューブを速やかにボルテックスし，１００μＬの培地を含むウエルあたり５０μＬを加えた。２４，４８，７２，９６時間に処置した細胞からＲＮＡを単離した。
ＬＮＰトランスフェクション方法：
以下の方法を用いて，ＬＦ２Ｋトランスフェクションを行った。細胞を１００ｕＬの完全成長培地中で９６ウエルプレートに，５，０００−３０，０００細胞／ウエルの範囲の所望の濃度で播種した。２４時間後，５Ｘ濃度のＬＮＰを完全成長培地中で希釈し，細胞に加えることにより細胞をトランスフェクションした（２５ｕＬの５Ｘから１Ｘの最終濃度が得られる）。２４，４８，７２，および９６時間に処置した細胞からＲＮＡを単離した。
実施例１３：ぜん息のマウスモデルにおける気道過敏性の低下
ＯＶＡ誘発性気道過敏性モデルを用いて，インターロイキン４Ｒ（ＩＬ−４Ｒアルファ）を標的とするＬＮＰ処方ｓｉＮＡ分子が気道過敏性を低下させる効力を評価した。この実験で用いたＩＬ−４Ｒアルファを標的とする活性なｓｉＮＡのセンス鎖配列は，
からなり，アンチセンス鎖配列は
からなる（小文字＝２’−デオキシ−２’−フルオロ；大文字イタリック＝２’−デオキシ；大文字下線＝２’−Ｏ−メチル；大文字太字＝リボヌクレオチド；Ｔ＝チミジン；Ｂ＝逆位デオキシ無塩基；およびｓ＝ホスホロチオエート）。第０日および第７日に，０．４ｍｇ／ｍＬＯＶＡ／食塩水溶液を等量のＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍと混合して０．２ｍｇ／ｍＬ（１００ｕＬ／マウス）の最終注射溶液としたものを動物に腹腔内注射することにより免疫した。ＰＢＳ（Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋なし）中で調製したＬＮＰ−５１処方ＩＬ−４Ｒ−アルファ部位１１１１ｓｉＮＡ（米国特許出願１１／００１，３４７（本明細書の一部としてここに引用する）を参照）または無関係対照を，気管内投与により毎日（１日に１回），第１７日から始めて第２６日に終了するまで合計１０回デリバリーした。第２４，２５および２６日に，ＰａｒｉＬＣエアロゾルネブライザを用いてマウスをＯＶＡ（１．５％ｉｎ食塩水）で３０分間エアロゾルチャレンジした。動物を２４時間休息させた後，気道機能分析を行った。第２８日に，ＢｕｘｃｏＷｈｏｌｅＢｏｄｙＰｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈを用いてエアロゾル化したメタコリンでチャレンジした後に，気道応答性を評価した。メタコリンチャレンジの後，動物を安楽死させた。気管切開を行い，肺を０．５ｍＬの食塩水で２回洗浄した。動物の胸をマッサージしながら肺洗浄を行い，すべての洗浄液を回収し，氷上に置いた。サイトスピンを調製して，ＢＡＬ液体から細胞を回収し，差異細胞係数を行った。結果を図４３に示す。ＬＮＰベヒクル単独および未処置（ナイーブ）動物と比較して処方ｓｉＮＡの用量応答的な（０．０１，０．１，および１ｍｇ／ｋｇ）活性が明確に示されている。
実施例１４：ＬＮＰ処方ｓｉＮＡを用いるインビボでのヒトハンチントン（ｈｔｔ）遺伝子発現の有効な低下
ハンチントン病（ＨＤ）は，ハンチントン（ｈｔｔ）蛋白質のポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）トラクトの拡大により引き起こされる主要な神経変性性疾患である。ｈｔｔにおけるＰｏｌｙＱ拡大は，皮質および線条体神経細胞の減少および脳細胞中におけるｈｔｔ含有凝集物の形成を誘導する。ＨＤ患者は，進行する精神病理学的，認識および運動機能障害および早期死亡を有する。マウスモデルにおける初期の研究は，疾病表現型の発症後の変異体蛋白質の減少が運動機能障害を改善させ，ｈｔｔ凝集物負荷を低減させうることを示している。すなわち，患者脳における変異体ｈｔｔの減少は，疾病を改善するであろう。
最近の研究は，ＨＤのマウスモデルにおいて短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現するウイルスベクターを用いて変異体ｈｔｔを減少させると，動物が疾病の挙動および神経病理学的特徴の発症から保護されることを示す（Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１０２：５８２０−５を参照）。この研究を利用して，非ウイルス方法により合成ｓｉＮＡを脳へ直接デリバリーすることが同様に有効であるか否かを判定することができる。この方法は，投与計画を改変することが可能であるなどの多くの利点を有する。この実験では，脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）処方物ＬＮＰ−０６１，ＬＮＰ−０９８，およびＬＮＰ−１０１（表ＩＶを参照）中に封入された化学的に修飾されたｓｉＮＡ，すなわち，配列
を有するセンス鎖およびアンチセンス鎖
を用いた。これらの配列において，小文字は２’−デオキシ−２’−フルオロを表し，大文字はリボヌクレオチドを表し，下線大文字は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを表し，Ｔはチミジンであり，ｓはホスホロチオエートであり，Ｂは逆位デオキシ無塩基である。種々のＬＮＰ処方物中に封入されたｓｉＮＡデュープレックスを，全長ｈｔｔをインビトロでサイレンシングする能力についてスクリーニングし，次にインビボで試験した。Ａｌｚｅｔ浸透圧ポンプを用いて，ＬＮＰを中に封入したｓｉＮＡを，０．１−１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で（総投与量は８．４−８４μｇの範囲）側方心室または線条体にそれぞれ７または１４日間注入した。ＬＮＰ−０６１およびＬＮＰ−０９８処方ｓｉＮＡで処置した動物では，ＱＰＣＲで測定して，スクランブル化対照配列，または自然脳と比較して，印象的なｈｔｔｍＲＮＡレベルの８０％の低下が認められた。結果は図４４に示される。
実施例１４：本発明のカチオン性脂質の製造（カチオン性脂質および中間体については表ＩＩＩを，合成スキームについては図２３Ａを参照）
コレスト−５−エン−３β−トシレート（２）
コレステロール（１，２５．０ｇ，６４．７ｍｍｏｌ）を秤量して撹拌棒を備えた１Ｌ丸底フラスコに入れた。フラスコにピリジン（２５０ｍＬ）を加え，隔膜で密封し，アルゴンでフラッシングした。塩化トルエンスルホニル（２５．０ｇ，１３１ｍｍｏｌ）を秤量して１００ｍＬ丸底フラスコに入れ，次にこれを密封し，ピリジンを加えた。次に塩化トルエンスルホニル溶液をシリンジを通して撹拌コレステロール溶液に加え，これを一晩撹拌した。大部分のピリジンを真空下で除去し，得られた固体をメタノール（３００ｍＬ）に懸濁し，固体が分割されて均一な懸濁液となるまで３時間撹拌した。得られた懸濁液を濾過し，固体をアセトニトリルで洗浄し，高真空下で乾燥して，３１．８ｇ（９１％）の白色粉体を得た（例えば，Ｄａｖｉｓ，Ｓ．Ｃ．；Ｓｚｏｋａ，Ｆ．Ｃ．，Ｊｒ．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１９９８，９，７８３を参照）。
コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−オール（３ａ）
コレスト−５−エン−３β−トシレート（２０．０ｇ，３７．０ｍｍｏｌ）を秤量して撹拌棒を備えた５００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにジオキサン（３００ｍＬ）および１，４−ブタンジオール（６５．７ｍＬ，２０当量）を加えた。フラスコに還流冷却器を取り付け，混合物を一晩還流した。反応液を冷却し，真空下で濃縮した。反応混合物を水（４００ｍＬ）に懸濁した。溶液を塩化メチレン（３ｘ２００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ，水（２ｘ２００）で洗浄し，硫酸マグネシウムで乾燥し，濾過し，溶媒を除去した。得られた油状物／ワックスをカラムクロマトグラフィー（１５％アセトン／ヘキサン）でさらに精製して，１３．４１ｇ（７９％）の無色ワックスを得た。
コレスト−５−エン−３β−オキシペント−３−オキサ−アン−５−オール（３ｂ）
この化合物は，コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−オールと同様にして製造した。コレスト−５−エン−３β−トシレート（５．０ｇ，９．２ｍｍｏｌ）を秤量して撹拌棒を備えた５００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにジオキサン（１５０ｍＬ）およびジエチレングリコール（２２ｍＬ，２５当量）を加えた。フラスコに還流冷却器を取り付け，混合物を一晩還流した。反応液を冷却し，濃縮した。反応混合物を水（５００ｍＬ）に懸濁した。溶液を塩化メチレン（３ｘ２００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ，水（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄し，硫酸マグネシウムで乾燥し，濾過し，溶媒を除去した。得られた油状物／ワックスをカラムクロマトグラフィー（２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）でさらに精製して，３．６０ｇ（８２％）の無色油状物を得た（例えば，Ｄａｖｉｓ，Ｓ．Ｃ．；Ｓｚｏｋａ，Ｆ．Ｃ．，Ｊｒ．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１９９８，９，７８３を参照）。
コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−メシレート（４ａ）
コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−オール（１２．４５ｇ，２７．１４ｍｍｏｌ）を秤量し，撹拌棒を備えた５００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコを密封し，アルゴンでフラッシングし，塩化メチレン（１００ｍＬ）およびトリエチルアミン（５．６７ｍＬ，１．５当量）を加え，０℃に冷却した。塩化メタンスルホニル（３．１５ｍＬ，１．５当量）をＰＰシリンジで計り，撹拌反応混合物にゆっくり加えた。反応液を０℃で１時間撹拌し，このときＴＬＣ分析（７．５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）は反応の完了を示した。反応混合物を塩化メチレン（１００ｍＬ）で希釈し，飽和重炭酸塩溶液（２ｘ２００ｍＬ）およびブライン（１ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し，濾過し，濃縮して，１４．４５ｇ（９９％）の無色ワックスを得，これをさらに精製することなく用いた。
コレスト−５−エン−３β−オキシペント−３−オキサ−アン−５−メシレート（４ｂ）
この化合物は，コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−メシレートと同様にして製造した。コレスト−５−エン−３β−オキシペント−３−オキサ−アン−５−オール（３．６０ｇ，７．５８ｍｍｏｌ）を秤量し撹拌棒を備えた５００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコを密封し，アルゴンでフラッシングし，塩化メチレン（３０ｍＬ）およびトリエチルアミン（１．６０ｍＬ，１．５当量）を加え，０℃に冷却した。塩化メタンスルホニル（０．８９ｍＬ，１．５当量）をＰＰシリンジで計り，撹拌反応混合物にゆっくり加えた。反応液を０℃で１時間撹拌し，このとき，ＴＬＣ分析（１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）は反応の完了を示した。反応混合物を塩化メチレン（１５０ｍＬ）で希釈し，飽和重炭酸塩溶液（２ｘ１００ｍＬ）およびブライン（１ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し，濾過し，濃縮して，４．１５ｇ（９９％）の無色ワックスを得，これをさらに精製することなく用いた。
１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−３−ジメチルアミノ−２−プロパノール（５）
３−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオール（６．０ｇ，５０ｍｍｏｌ）を秤量し撹拌棒を備えた１Ｌ丸底フラスコに入れた。フラスコを密封し，アルゴンでフラッシングし，ピリジンを加え，０℃に冷却した。塩化４，４’−ジメトキシトリチル（１７．９ｇ，１．０５当量）を秤量して１００ｍＬ丸底フラスコに入れ，密封し，次にピリジン（８０ｍＬ）に溶解した。塩化４，４’−ジメトキシトリチル溶液を撹拌した反応混合物にゆっくり加え，追加の新たなピリジン（２０ｍＬ）を用いて残存の塩化４，４’−ジメトキシトリチルを移した。一晩撹拌しながら反応液を室温にした。反応液を真空下で濃縮し，ジクロロメタン（３００ｍＬ）に再溶解した。有機相を飽和重炭酸塩（２ｘ２００ｍＬ）およびブライン（１ｘ２００ｍＬ）で洗浄し，ＭｇＳＯ４で乾燥し，濾過し，濃縮し，高真空下で乾燥して，２２．１９ｇの黄色ガムを得，これをさらに精製することなく用いた。
３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−プロパノール（６ａ）
１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−３−ジメチルアミノ−２−プロパノール（７．５０ｇ，１７．８ｍｍｏｌ）を秤量して２００ｍＬ丸底フラスコに入れ，無水トルエン（２ｘ５０ｍＬ）と共蒸発させた。撹拌棒をフラスコに入れ，これを隔膜で密封し，アルゴンでフラッシングし，トルエン（６０ｍＬ）を加えた。水素化ナトリウム（１．７１ｇ，４当量）を一度に加え，混合物を室温で２０分間撹拌した。コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−メシレートを無水トルエン（２０ｍＬ）に溶解し，反応混合物にシリンジを通して加えた。フラスコに還流冷却器を取り付け，アルゴンを連続して流し，反応液を一晩加熱還流した。反応混合物を水浴中で室温に冷却し，ガス発生が止まるまでエタノールを滴加した。反応混合物を酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し，水性１０％炭酸ナトリウム（２ｘ３００ｍＬ）で洗浄した。水性相を合わせ，酢酸エチル（２ｘ１００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ，ＭｇＳＯ４で乾燥し，濾過し，濃縮して，５００ｍＬ丸底フラスコ中に油状物を得た。
フラスコに撹拌棒を入れ，密封し，アルゴンでパージし，ジクロロ酢酸溶液（３％，ＤＣＭ中，２００ｍＬ）を加えた。トリエチルシラン（１４．２ｍＬ，８９ｍｍｏｌ）を混合物に加え，反応液を一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し，飽和重炭酸塩溶液（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄した。水性相を合わせ，ＤＣＭ（２ｘ１００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ，ＭｇＳＯ４で乾燥し，濾過し，濃縮して，油状物を得，これをエタノール（１５０ｍＬ）に再溶解した。フッ化カリウム（１０．３ｇ，１７８ｍｍｏｌ）を溶液に加え，次にこれを１時間還流した。混合物を冷却し，真空下で濃縮し，ＤＣＭ（２００ｍＬ）に再溶解し，濾過し，濃縮して，油状物／結晶混合物を得た。混合物を最少量のＤＣＭに再溶解し，予め平衡化したシリカゲルカラムに負荷し，３％ＴＥＡを含む２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出して，４．８９ｇ（４９％）の無色ワックスを得た。
３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３β−オキシペント−３−オキサ−アン−５−オキシ）−１−プロパノール（６ｂ）
この化合物は，３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−プロパノールと同様にして製造した。１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−３−ジメチルアミノ−２−プロパノール（２．６５ｇ，６．３１ｍｍｏｌ）を秤量して２００ｍＬ丸底フラスコに入れ，無水トルエン（２ｘ２０ｍＬ）と共蒸発させた。撹拌棒をフラスコに入れ，これを隔膜で密封し，アルゴンでフラッシングし，トルエン（５０ｍＬ）を加えた。水素化ナトリウム（０．６１ｇ，４当量）を一度に加え，混合物を室温で２０分間撹拌した。コレスト−５−エン−３β−オキシペント−３−オキサ−アン−５−メシレート（４．１５ｇ，７．６ｍｍｏｌ）を無水トルエン（１０ｍＬ）に溶解し，反応混合物にシリンジを通して加えた。フラスコに還流冷却器を取り付け，アルゴンを連続して流し，反応液を一晩加熱還流した。反応混合物を水浴中で室温に冷却し，ガス発生が止まるまでエタノールを滴加した。反応混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し，水性１０％炭酸ナトリウム（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄した。水性相を合わせ，酢酸エチル（２ｘ１００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ，ＭｇＳＯ４で乾燥し，濾過し，濃縮して，５００ｍＬ丸底フラスコ中に油状物を得た。
フラスコに撹拌棒を入れ，密封し，アルゴンでパージし，ジクロロ酢酸溶液（３％，ＤＣＭ中，１５０ｍＬ）を加えた。トリエチルシラン（４．０３ｍＬ，２５．２ｍｍｏｌ）を混合物に加え，反応液を４時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し，飽和重炭酸塩溶液（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄した。水性相を合わせ，ＤＣＭ（２ｘ１００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ，ＭｇＳＯ４で乾燥し，濾過し，濃縮して油状物を得，これをエタノール（１００ｍＬ）に再溶解した。フッ化カリウム（３．６ｇ，６３ｍｍｏｌ）を溶液に加え，次にこれを１時間還流した。混合物を冷却し，真空下で濃縮し，ＤＣＭ（２００ｍＬ）に再溶解し，濾過し，濃縮して，油状物／結晶混合物を得た。混合物を最少量のＤＣＭに溶解し，予め平衡化したシリカゲルカラムに負荷し，３％ＴＥＡを含む２５％アセトン／ヘキサンで溶出して，２．７０ｇ（７４％）の無色ワックスを得た。
リノレイルメシレート（７）
リノレイルアルコール（１０．０ｇ，３７．５ｍｍｏｌ）を秤量して撹拌棒を備えた５００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコを密封し，アルゴンでフラッシングし，ＤＣＭ（１００ｍＬ）およびトリエチルアミン（７．８４ｍＬ，１．５当量）を加え，０℃に冷却した。塩化メタンスルホニル（４．３５ｍＬ），１．５当量）をＰＰシリンジで計り，撹拌反応混合物にゆっくり加えた。ＴＬＣ分析（７．５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）は反応が１時間以内に完了したことを示した。反応液をＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し，飽和重炭酸塩溶液（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し，濾過し，濃縮して，１２．５３ｇ（９７％）の無色油状物を得，これをさらに精製することなく用いた。
３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（８ａ）
３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−プロパノール（２．６ｇ，４．６ｍｍｏｌ）を秤量して２００ｍＬ丸底フラスコに入れ，無水トルエン（２ｘ２０ｍＬ）と共蒸発させた。撹拌棒をフラスコに入れ，次にこれを密封し，アルゴンでフラッシングし，無水トルエン（１００ｍＬ）を加えた。水素化ナトリウム（０．７ｇ，６当量）を一度に加え，混合物をアルゴン下で２０分間撹拌した。リノレイルメシレート（４．６ｇ，２．３当量）をＰＰシリンジで計り，反応混合物にゆっくり加えた。フラスコに還流冷却器を取り付け，装置をアルゴンでフラッシングした。反応混合物を油浴中で加熱し，一晩撹拌還流した。次に反応混合物を水浴中で室温に冷却し，ガス発生が止まるまでエタノールを滴加した。反応混合物を酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し，水性１０％炭酸ナトリウム（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄した。水性相を合わせ，酢酸エチル（２ｘ１００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ，ＭｇＳＯ４で乾燥し，濾過し，濃縮した。得られた油状物をカラムクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，３％ＴＥＡ）で精製して，３．０ｇ（８１％）の無色油状物を得た。
３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３β−オキシペント−３−オキサ−アン−５−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）（８ｂ）
この化合物は，３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパンと同様にして製造した。３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３β−オキシペント−３−オキサ−アン−５−オキシ）−１−プロパノール（０．７３ｇ，１．３ｍｍｏｌ）を秤量して１００ｍＬ丸底フラスコに入れ，無水トルエンと共蒸発させた。撹拌棒をフラスコに入れ，次にこれを密封し，アルゴンでフラッシングし，無水トルエンを加えた。水素化ナトリウム（１２１ｍｇ，４当量）を一度に加え，混合物をアルゴン下で２０分間撹拌した。リノレイルメシレート（０．８７３ｇ，２当量）をＰＰシリンジで計り，反応混合物にゆっくり加えた。フラスコに還流冷却器を取り付け，装置をアルゴンでフラッシングした。反応混合物を油浴中で加熱し，一晩撹拌還流した。次に反応混合物を水浴中で室温に冷却し，ガス発生が止まるまでエタノールを滴加した。反応混合物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で希釈し，水性１０％炭酸ナトリウム（２ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。水性相を合わせ，酢酸エチル（２ｘ５０ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ，Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し，濾過し，濃縮した。得られた油状物をカラムクロマトグラフィー（１５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，３％ＴＥＡ）で精製して，０．７０ｇ（６７％）の無色油状物を得た。
実施例１５：本発明の芳香族脂質の製造（図２３Ｂを参照）
ジオレイルオキシベンズアルデヒド，３ａ
３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（２．７６ｇ，２０．０ｍｍｏｌ）を秤量して撹拌棒を備えた２００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにジグリム（１００ｍＬ）を加え，隔膜で密封し，アルゴンでフラッシングした。炭酸セシウム（１９．５ｇ，６０．０ｍｍｏｌ）を溶液にゆっくり少しずつ加えた。オレイルメシレート（１５．２ｇ，４４．０ｍｍｏｌ）をシリンジを通して加えた。反応混合物をアルゴンの弱加圧下で１００℃で加熱した。反応混合物を室温に冷却し，濾過した。固体を１，２−ジクロロエタンで洗浄した。合わせた濾液および洗浄液を濃縮し，次に高真空下で６５℃で乾燥して残留ジグリムを除去した。得られた黄色油状物をフラッシュクロマトグラフィー（５％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，１１．４ｇ（８９％）の黄色油状物を得，これは室温に放置することにより黄色ワックスになった。
ジリノレイルベンズアルデヒド，３ｂ
３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（２．７６ｇ，２０．０ｍｍｏｌ）を秤量して撹拌棒を備えた２００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコにジグリム（１００ｍＬ）を加え，隔膜密封し，アルゴンでフラッシングした。炭酸セシウム（１９．５ｇ，６０．０ｍｍｏｌ）を溶液に少しずつゆっくり加えた。リノレイルメシレート（１５．２ｇ，４４．０ｍｍｏｌ）をシリンジを通して加えた。反応混合物をアルゴンの弱加圧下で１００℃に加熱した。反応混合物を室温に冷却し，濾過した。固体を１，２−ジクロロエタンで洗浄した。合わせた濾液および洗浄液を濃縮し，次に高真空下で６５℃で乾燥して，残存するジグリムを除去した。得られた黄色油状物をフラッシュクロマトグラフィー（５％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，１１．９ｇ（９４％）の褐色油状物を得た。
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン，４ａ
エタノール（２０ｍＬ）中のトリエチルアミンアミン（２．０ｍＬ，１４ｍｍｏｌ）の溶液に，ジメチルアミン塩酸塩（１．６３ｇ，２０ｍｍｏｌ），チタンテトライソプロポキシド（５．９６ｍＬ，２０ｍｍｏｌ）および３，４−ジオレイルオキシベンズアルデヒド（６．３９ｇ，１０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をアルゴン下で室温で１０時間撹拌した。水素化ホウ素ナトリウム（０．５７ｇ，１５ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え，次に室温で一晩撹拌した。濃水性アンモニア（４ｍＬ）を反応混合物にゆっくり加えた。反応混合物を濾過し，固体をジクロロメタンで洗浄した。濾液をＫ２ＣＯ３で乾燥し，濾過し，濃縮した。得られた油状物をフラッシュクロマトグラフィー（２−１０％アセトン，ジクロロメタン中，０．５％ＴＥＡ勾配）で精製して，５．８１ｇ（８７−＋％）の黄色油状物を得た。
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジリノレイルオキシベンジルアミン，４ｂ
エタノール（２０ｍＬ）中のトリエチルアミンアミン（２．０ｍＬ，１４ｍｍｏｌ）の溶液に，ジメチルアミン塩酸塩（１．６３ｇ，２０ｍｍｏｌ），チタンテトライソプロポキシド（５．９６ｍＬ，２０ｍｍｏｌ）および３，４−ジリノレイルオキシベンズアルデヒド（６．３５ｇ，１０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をアルゴン下で室温で１０時間撹拌した。水素化ホウ素ナトリウム（０．５７ｇ，１５ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え，次にこれを室温で一晩撹拌した。６Ｎ水性アンモニア（３０ｍＬ）を反応混合物にゆっくり加え，次にジクロロメタンを加えた。反応混合物を濾過した。濾液をＫ２ＣＯ３で乾燥し，濾過し，濃縮した。得られた油状物をフラッシュクロマトグラフィー（２−１０％アセトン，ジクロロメタン中，０．５％ＴＥＡ勾配）で精製して，４．９４ｇ（７４％）の黄色油状物を得た。
実施例１６：本発明のＰＥＧ−コンジュゲートの製造（図２４を参照）
１−［８’−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−コレステロール）
２０ｍＬの無水ＴＨＦ中の２．０ｇ（０．８９ｍｍｏｌ）の１−［８’−アミノ−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール），２２ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリジン，および０．９３ｍＬ（５．３ｍｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミンの溶液を入れた２００−ｍＬ丸底フラスコに，撹拌しながら２０ｍＬの無水ＴＨＦ中の１．２０ｇ（２．６７ｍｍｏｌ）のコレステロールクロロギ酸の溶液を加えた。得られた反応混合物を一晩穏やかに加熱還流した。冷却した後，溶媒を回転蒸発により除去し，得られた残渣をシリカゲルカラムに適用して精製した（メタノール／ジクロロメタン５：９５−１０：９０）。クロマトグラフィーにより，２．４３ｇ（９１％）の白色固体生成物を得た。
３，４−ジテトラデコキシルベンジル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル（ＰＥＧ−ＤＭＢ）
２０ｍＬの１，４−ジオキサン中の２．６７ｇ（５．００ｍｍｏｌ）のジテトラデコキシルベンジルアルコールの溶液を入れた１００−ｍＬ丸底フラスコに，２０ｍＬの１，４−ジオキサン中４．０ＭＨＣｌ溶液を加えた。次にフラスコに還流冷却器を取り付け，ナトリウム重炭酸塩溶液と接触させて，発生する塩化水素ガスを吸着させた。反応混合物を８０℃で６時間加熱した後，薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；ジクロロメタン）は反応の完了を示した。回転蒸発により溶媒および過剰の試薬を真空下で完全に除去して，２．６９ｇ（９７％）の塩化３，４−ジテトラデコキシルベンジルを灰色固体として得た。この粗物質をさらに精製することなく次の工程の反応に直接用いた。
ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（２．００ｇ，１．００ｍｍｏｌ）を，トルエン（２ｘ２０ｍＬ）とともに真空下で共蒸発させることにより乾燥した。３０ｍＬの無水トルエン中の乾燥ポリ（エチレングリコール）の溶液に，撹拌しながら，０．１７ｇ（７．２ｍｍｏｌ）の水素化ナトリウムを少しずつ加えた。ただちにガスが発生した。得られた混合物を６０℃で２時間撹拌を続けて，オキシドの完全な形成を確実にした。次に，１０ｍＬの無水トルエン中の０．６６８ｇ（１．２０ｍｍｏｌ）の塩化３，４−ジテトラデコキシルベンジルの溶液を上述の混合物に滴加した。反応混合物を８０℃で一晩撹拌した。冷却した後，１０ｍＬの飽和塩化アンモニウム溶液を加えることにより反応をクエンチした。次に，得られた混合物を３００ｍＬのジクロロメタン中に取り出し，飽和塩化アンモニウム（３ｘ１００ｍＬ）で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，蒸発乾固させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン２：９８−５：９５）により精製して，１．２４ｇ（４９％）の所望の生成物を灰色固体として得た。
実施例１７：ナノ粒子封入ｓｉＮＡ処方物の製造
ｓｉＮＡナノ粒子溶液は，ｓｉＮＡを２５ｍＭクエン酸バッファ（ｐＨ４．０）に０．９ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解することにより調製した。脂質溶液は，カチオン性脂質（例えば，ＣＬｉｎＤＭＡまたはＤＯＢＭＡ，処方物の構造および比率については表ＩＶを参照），ＤＳＰＣ，コレステロール，およびＰＥＧ−ＤＭＧ（比率は表ＩＶに示される）の混合物を約１５ｍｇ／ｍＬの濃度で無水エタノールに溶解することにより調製した。窒素対リン酸の比率は約３：１であった。
２つのＦＰＬＣポンプを同じ流速で用いて，等容量のｓｉＮＡ溶液および脂質溶液を混合Ｔコネクターに移した。背圧バルブを用いて所望の粒子サイズを調節した。得られた乳状混合物を無菌ガラス瓶中に回収した。次にこの混合物を等量のクエン酸バッファでゆっくり希釈し，イオン交換膜を通して濾過して，混合物中の遊離ｓｉＲＮＡを除去した。クエン酸バッファ（ｐＨ４．０）に対する限外濾過を行ってエタノールを除去し（ＡＬＣＯｓｃｒｅｅｎからの試験スティック），ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファ交換を行った。所望の容量まで濃縮し，０．２μｍフィルターで滅菌濾過することにより，最終的なリポソームを得た。
得られたリポソームを，粒子サイズ，ゼータ電位，アルコール含量，総脂質含量，封入された核酸，および総核酸濃度について特性決定した。
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示す。本明細書において引用されるすべての参考文献は，それぞれの参考文献が個々にその全体が本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，本明細書の一部として引用される。
当業者は，本発明が，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならびに本明細書に固有のものを得るためによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載される方法および組成物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，特許請求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用途をなすであろう。
当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して種々の置換および改変をなすことが可能であることを容易に理解するであろう。すなわち，そのような追加の態様は，本発明および特許請求の範囲の範囲内である。本発明は，ＲＮＡｉ活性を媒介する改良された活性を有する核酸コンストラクトを得るために本明細書に記載される化学的修飾の種々の組み合わせおよび／または置換を試験することを当業者に教示する。そのような改良された活性は，改良された安定性，改良された生物利用性，および／またはＲＮＡｉを媒介する細胞応答の改良された活性化を含むことができる。したがって，本明細書に記載される特定の態様は限定ではなく，当業者は，改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を同定するために，過度の実験なしに本明細書に記載される修飾の特定の組み合わせを試験しうることを容易に理解することができる。
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。本明細書において用いられる用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
さらに，発明の特徴および観点がマーカッシュグループまたは他の代替グループの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループまたは他のグループの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
図１は，本発明のカチオン性脂質化合物の非限定的例を示す。 図２は，本発明のアセタール結合カチオン性脂質化合物の非限定的例を示す。 図３は，本発明のスクシニル／アシル結合カチオン性脂質化合物の非限定的例を示す。 図４は，本発明の芳香族カチオン性脂質化合物の非限定的例を示す。 図５は，本発明の別のカチオン性脂質化合物の非限定的例を示す。 図６は，処方分子組成物の成分の概略を示す。 図７は，処方分子組成物がとりうるラメラ構造および逆位六角形構造の概略図を示す。 図８は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物であるＬ０５１の成分を示す。 図９は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物であるＬ０７３の成分を示す。 図１０は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物であるＬ０６９の成分を示す。 図１１は，本発明の処方分子組成物の血清安定性を示すグラフである。 図１２は，本発明の処方分子組成物のｐＨ依存的相転移を示すグラフである。 図１３は，本発明の処方分子組成物のｐＨ依存的相転移を示すグラフである。 図１４は，本発明のｓｉＮＡ分子の化学修飾の非限定的例を示す。 図１５は，ｓｉＮＡナノ粒子がＨｅｐＧ２細胞においてＨＢｓＡｇレベルを低下させるインビトロ効力の非限定的例を示す。 図１６は，ｓｉＮＡナノ粒子がＨｅｐＧ２細胞においてＨＢｓＡｇレベルを低下させるインビトロ効力の非限定的例を示す。 図１７は，ｓｉＮＡナノ粒子がＨｅｐＧ２細胞においてＨＢｓＡｇレベルを低下させるインビトロ効力の非限定的例を示す。 図１８は，ＨＢＶマウスモデルにおける，全身投与されたｓｉＮＡＬ０５１（表ＩＶ）ナノ粒子の活性の非限定的例を示す。 図１９は，ＨＢＶマウスモデルにおける，全身投与されたｓｉＮＡＬ０５１（表ＩＶ）ナノ粒子の活性の非限定的例を示す。 図２０は，Ｈｕｈ７ＨＣＶレプリコン系において用量依存的な，ウイルス複製を標的とする処方ｓｉＮＡＬ０５１ナノ粒子コンストラクトの非限定的例を示す。 図２１は，Ｈｕｈ７ＨＣＶレプリコン系において用量依存的な，ウイルス複製を標的とする処方ｓｉＮＡＬ０５３およびＬ０５４ナノ粒子コンストラクトの非限定的例を示す。 図２２は，非処方ｓｉＮＡ，コレステロール−コンジュゲート化ｓｉＮＡ，および処方ｓｉＮＡを気管内投与した後の，マウスの肺組織におけるｓｉＮＡの分布を示す。 図２３ａは，３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）の合成に用いられる合成スキームの非限定的例を示す。 図２３ｂは，３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）の合成に用いられる合成スキームの非限定的例を示す。 図２４は，１−［８’−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−コレステロール）および３，４−ジテトラデコキシイルベンジル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル（ＰＥＧ−ＤＭＢ）の合成に用いられる合成スキームの非限定的例を示す。 図２５は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物であるＬ０８３の成分を示す。 図２６は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物であるＬ０７７の成分を示す。 図２７は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物であるＬ０８０の成分を示す。 図２８は，急速なｐＨ依存的相転移を起こす血清安定処方分子組成物であるＬ０８２の成分を示す。 図２９は，ＨＢＶマウスモデルにおける，全身投与されたｓｉＮＡナノ粒子の活性の非限定的例を示す。 図３０は，ＨＢＶマウスモデルにおける，全身投与されたｓｉＮＡナノ粒子の用量応答活性の非限定的例を示す。 図３１は，ＨＢＶマウスモデルにおける，全身投与されたｓｉＮＡナノ粒子の用量応答活性の非限定的例を示す。 図３２は，ＨＢＶマウスモデルにおける，全身投与されたｓｉＮＡナノ粒子の用量応答活性の非限定的例を示す。 図３３は，ｓｉＮＡナノ粒子処方物の血清安定性の非限定的例を示す。 図３４は，ｓｉＮＡナノ粒子処方物のｐＨ依存的相転移を示すグラフである。 図３５は，ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞における，ＭａｐＫ１４部位１０３３を標的とするＬＮＰ５８およびＬＮＰ９８処方物の効力のデータを示す。 図３６は，ＭＭ１４．Ｌｕ正常マウス肺細胞における，ＭａｐＫ１４部位１０３３を標的とするＬＮＰ９８処方物の効力のデータを示す。 図３７は，６．１２Ｂリンパ球における，ＭａｐＫ１４部位１０３３を標的とするＬＮＰ５４，ＬＮＰ９７，およびＬＮＰ９８処方物の効力のデータを示す。 図３８は，ＮＩＨ３Ｔ３細胞における，ＭａｐＫ１４部位１０３３を標的とするＬＮＰ９８処方物の効力のデータを示す。 図３９は，ＲＡＷ２６４．７細胞における，ＭａｐＫ１４ＬＮＰ５４およびＬＮＰ９８処方ｓｉＮＡによるＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存的減少を示す。 図４０は，ＭＭ１４．Ｌｕ細胞における，ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９８処方ｓｉＮＡによるＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存的減少を示す。 図４１は，６．１２Ｂ細胞における，ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９７およびＬＮＰ９８処方ｓｉＮＡによるＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存的減少を示す。 図４２は，ＮＩＨ３Ｔ３細胞における，ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９８処方ｓｉＮＡによるＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存的減少を示す。 図４３は，ＯＶＡチャレンジ媒介気道過敏性のマウスモデルにおける，ＩＬ−４Ｒを標的とするＬＮＰ−５１処方ｓｉＮＡを用いる治療による気道過敏性の低下の非限定的例を示す。 図４４は，ＬＮＰ処方ｓｉＮＡにより媒介されるインビボでのハンチントン（ｈｔｔ）遺伝子発現の阻害の非限定的例を示す。

Claims (20)

  1. 式ＣＬＩ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３はＣ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，ポリエチレングリコール，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル，またはスクシニルリンカーを含み，およびＲ４はコレステロールを含む］
    を有する化合物。
  2. 式ＣＬＩＩ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３はＣ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，ポリエチレングリコール，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル，またはスクシニルリンカーを含み，およびＲ４はコレステロールを含む］
    を有する化合物。
  3. 式ＣＬＩＩＩ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３はＣ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，ポリエチレングリコール，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル，またはスクシニルリンカーを含み，およびＲ４はコレステロールを含む］
    を有する化合物。
  4. 式ＣＬＩＶ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３はＣ９−Ｃ２４の脂肪族飽和または不飽和炭化水素であり，Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，ポリエチレングリコール，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル，またはスクシニルリンカーを含み，およびＲ４はコレステロールを含む］
    を有する化合物。
  5. 式ＣＬＶ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；および各Ｒ３およびＲ４は，独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである］
    を有する化合物。
  6. 式ＣＬＶＩ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルであり；Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，ポリエチレングリコール，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル，またはスクシニルリンカーを含み，およびＲ４はコレステロールである］
    を有する化合物。
  7. 式ＣＬＶＩＩ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルであり；Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，ポリエチレングリコール，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル，またはスクシニルリンカーを含み，およびＲ４はコレステロールである］
    を有する化合物。
  8. 式ＣＬＶＩＩＩ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；および各Ｒ３およびＲ４は，独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルである］
    を有する化合物。
  9. 式ＣＬＩＸ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルであり；Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，ポリエチレングリコール，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル，またはスクシニルリンカーを含み，およびＲ４はコレステロールである］
    を有する化合物。
  10. 式ＣＬＸ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；Ｒ３は，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，またはラウロイルであり；Ｌは，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，ポリエチレングリコール，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル，またはスクシニルリンカーを含み，およびＲ４はコレステロールである］
    を有する化合物。
  11. 式ＣＬＸＩＸ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；および各Ｒ３およびＲ４は，独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，ラウロイル，またはコレステロールである］
    を有する化合物。
  12. 式ＣＬＸＸ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；および各Ｒ３およびＲ４は，独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，ラウロイル，またはコレステロールである］
    を有する化合物。
  13. 式ＣＬＸＸＩＩＩ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；各Ｒ３およびＲ４は，独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，ラウロイル，またはコレステロールであり，および各Ｌは，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，ポリエチレングリコール，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル，またはスクシニルリンカーである］
    を有する化合物。
  14. 式ＣＬＸＸＩＶ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；各Ｒ３およびＲ４は，独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，ラウロイル，またはコレステロールであり，および各Ｌは，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，ポリエチレングリコール，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル，またはスクシニルリンカーである］
    を有する化合物。
  15. 式ＣＬＸＸＶ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；各Ｒ３およびＲ４は，独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，ラウロイル，またはコレステロールであり，および各Ｌは，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，ポリエチレングリコール，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル，またはスクシニルリンカーである］
    を有する化合物。
  16. 式ＣＬＸＸＶＩ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；各Ｒ３およびＲ４は，独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，ラウロイル，またはコレステロールである］
    を有する化合物。
  17. 式ＣＬＸＸＶＩＩ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；各Ｒ３およびＲ４は，独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，ラウロイル，またはコレステロールであり，および各Ｌは，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキルエーテル，ポリエーテル，ポリエチレングリコール，アセタール，アミド，カルボニル，カルバミド，カルバメート，カーボネート，エステル，またはスクシニルリンカーである］
    を有する化合物。
  18. 式ＣＬＸＸＶＩＩＩ：
    ［式中，各Ｒ１およびＲ２は，独立して，Ｃ１−Ｃ１０のアルキル，アルキニル，またはアリール炭化水素であり；各Ｒ３およびＲ４は，独立して，リノイル，イソステアリル，オレイル，エライジル，ペトロセリニル，リノレニル，エレオステアリル，アラキジル，ミリストイル，パルミトイル，ラウロイル，またはコレステロールである］
    を有する化合物。
  19. 短干渉核酸（ｓｉＮＡ），請求項１−１８のいずれかに記載の構造を有するカチオン性脂質，中性脂質，およびＰＥＧ−コレステロールを含む組成物。
  20. さらにコレステロールを含む請求項１９記載の組成物。


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