JP2008526859A

JP2008526859A - トリペプチドおよびテトラペプチドチオエーテル

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Publication number: JP2008526859A
Application number: JP2007550441A
Authority: JP
Inventors: ナタリア・アウレコエチェア; アンドリュー・ビー・ケルソン; ロバート・ダブリュ・マクサタ; ルイーズ・ロビンソン; アンソニー・ジェイ・サンチェズ; ニコラス・エム・サンティアゴ; スティーブン・アール・ショウ; レイナ・ジェイ・サイモン
Original assignee: Telik Inc
Current assignee: Telik Inc
Priority date: 2005-01-06
Filing date: 2006-01-04
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2026-01-04
Also published as: US20060148719A1; CN101080418A; ZA200704488B; EP1833842B1; KR101244609B1; JP2008526880A; WO2006074409A1; ATE410440T1; TWI317739B; JP4903717B2; EA200701398A1; SI1833842T1; CA2587310C; BRPI0606520A2; TWI317738B; ES2314891T3; AU2006204022A1; KR20070104391A; HK1106796A1; US7129215B2

Abstract

トリペプチドおよびテトラペプチドチオエーテル、それを含む医薬組成物、その医薬的使用ならびにその製造。該化合物は、腫瘍細胞における化学療法剤の細胞毒性効果の増強、腫瘍細胞における選択的毒性付与、骨髄細胞におけるGM前駆体産生の亢進、骨髄分化の刺激、化学療法剤の骨髄抑制作用の緩和および骨髄における造血の調節に有用である。

Description

本発明は、トリペプチドおよびテトラペプチドチオエーテル、それを含む医薬組成物、その医薬的使用ならびにその製造に関する。

米国特許No．5599903；5763570；5767086；5786336；および5955432；欧州特許公報No．0 645 397；およびPCT国際公開公報No．WO 95/08563およびWO 96/40205は、式：

［式中、Zは、S、OまたはCである；
nは、1〜3である；
Zが、SまたはOであり、nが、1である場合、Xは、非置換またはハロ、−NO、−NO₂、−NR₂、−ORまたは−SR（ここで、Rは、HまたはC₁₋₄アルキルである）でモノまたはジ置換された1または2個の非隣接O、SまたはNヘテロ原子を必要に応じて含むC₁₋₂₀ヒドロキシカルビルである；
Zが、Sであり、nが、2である場合、一方のXは、上記と同意義であり、他方のXは、C₁₋₄アルキルである；および
Zが、Cであり、nが、3である場合、一方のXは、上記と同意義であり、他の2つのX反応混合物独立して、HまたはC₁₋₄アルキルである；
YCOは、γ−glu、β−asp、glu、asp、γ−glu−gly、β−asp−gly、glu−gly、asp−glyである；および
AA_cは、ペプチド結合を介して分子の残りの部分に結合したアミノ酸である］
で示される化合物およびそのC₁₋₁₀アルキルまたはアルケニルまたはC₇₋₁₂アラルキルエステル、アミドならびに混合エステル/アミド[WO 95/08563]などの還元型グルタチオン(L−γ−グルタミル−L−システイニルグリシン)の類縁体である種々のトリペプチドおよびテトラペプチド化合物を開示する。

該化合物は、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)イソ酵素を特徴付けるのに有用な試薬として、細胞および組織のGST補体を決定するのに有用な試薬として、クロマトグラフィー親和性リガンド、結合試薬および酵素インヒビターとして、および治療的に、腫瘍細胞において化学療法剤の細胞毒性効果を増強するため、腫瘍細胞において選択的毒性を付与するため、骨髄細胞において顆粒球−マクロファージ(GM)前駆体の産生を高めるため、骨髄の分化を刺激するため、化学療法剤の骨髄抑制作用を緩和するため、および骨髄において造血を調節するための使用などの種々の用途を有すると記載されている。

上記の特許および公報においてTER117として特定され、γ−Glu−Cys(Bz)−フェニルGly、γE−C(Bz)−φG、γE−C(Bz)−PG、γE−C(ベンジル)−φGおよびベンジル PGなどの種々の名称を付けられているTLK117は、これらの化合物の1つである。TLK117は、式：

で示される化合物であり、L−γ−グルタミル−S−(フェニルメチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシンと称することもできる。TLK117は、約400 nMのIC₅₀でGST P1−1を阻害する。上記の特許および公報においてTER199として特定されるTLK199は、TLK117のジエチルエステルである。

米国特許No．6627732およびPCT国際港開講方No．WO 99/54346は、式：

［式中、Aは、HまたはC₁₋₂₀アシルである；
R₁は、C₁₋₂₆アルキルまたはC₃₋₂₆アルケニルである；および
R₂は、H、C₁₋₂₆アルキルまたはC₃₋₂₆アルケニルである；
R₁が、C₁₋₁₀アルキルまたはC₃₋₁₀アルケニルであり、R₂が、H、C₁₋₁₀アルキルまたはC₃₋₁₀アルケニルである場合を除く］
で示される化合物のグルタチオン誘導体を開示する。

米国特許出願No.2003/0100511およびPCT国際公開No.WO 00/44366は、式：

［式中、各エステルは、1−25Cである；
YCOは、γ−gluまたはβ−aspである；
G*は、フェニルグリシンである；
Zは、CH₂、OまたはSである；および
Xは、6−8Cアルキル、ベンジルまたはナフチルである］
で示される化合物またはその医薬的に許容しうる塩のジエステルのリポソーム製剤などの脂質製剤；または式：

［式中、R₁およびR₂は独立して、直鎖または分枝鎖アルキル基(1−25C)、シクロアルキル基(6−25C)、置換アルキル基(2−25C)、複素環(6−20C)、エーテルまたはポリエーテル(3−25C)から選ばれるか、またはR₁−R₂(2−20C)は一緒になって、該式とマクロ環を形成する；および
R₃は、6−8Cアルキル、ベンジルまたはナフチルである］
で示される化合物またはその医薬的に許容しうる塩を開示する。

骨髄の3つの主要血液成分（白血球、赤血球および血小板）のうちの1つ以上を不十分なレベルでしか産生しない前白血病の一形態である骨髄異形成症候群(MDS)などの多くの病気が、骨髄の枯渇を特徴とする。血液細胞レベルおよび骨髄における新しい血液細胞の生成の減少である骨髄抑制もまた、多くの標準的化学療法剤の一般的な毒性作用である。

TLK199は、インビトロでHL−60前骨髄球性白血病細胞の分化を誘発すること、インビトロおよびインビボで細胞毒性剤の活性を増強すること、および正常ヒト末梢血中の造血前駆細胞の3つの系統すべてのコロニー形成を刺激することが明らかにされている。前臨床試験において、TLK199は、正常動物ならびにシスプラチンまたはフルオロウラシルを用いる治療によって白血球細胞が枯渇している動物において血液細胞の産生を増加させることが明らかにされている。同様の効果は、MDSを治療する新たなアプローチを提供することができる。TLK199は、現在、MDSの治療について第二相臨床試験において評価されている。2004および2005年度米国血液学会において報告された、この試験の暫定的結果は、TLK199が良好な耐容性を示し、多系列の血液学的改善もたらすことを実証した。これらの結果は、化学療法誘発性血球減少症の治療におけるTLK199の潜在的な役割を示唆する。

腫瘍細胞において化学療法剤の細胞毒性効果を増強するため、腫瘍細胞において選択的毒性を付与するため、骨髄細胞においてGM前駆体の産生を高めるため、骨髄の分化を刺激するため、化学療法剤の骨髄抑制作用を緩和するため、および骨髄において造血を調節するためにヒトにおいて使用するためのGST P1−1の強力なインヒビターを開発することが望まれている。

（発明の開示）
第1の態様において、本発明は、式：

［式中、nは、0または1である；
Wは、L−γ−グルタミルまたはL−γ−グルタミルグリシルである；
Xは、必要に応じて置換されたC₅₋₆シクロアルキル、必要に応じて置換されたC₅₋₆ヘテロシクロアルキル、必要に応じて置換されたフェニルまたは必要に応じて置換されたC₅₋₆ヘテロアリールである；
Yは、＝O、＝N−OHまたは＝N−O(必要に応じて置換されたC₁₋₃アルキル)である；および
Zは、必要に応じて置換されたフェニルまたは必要に応じて置換されたC₅₋₆ヘテロアリールである］
で示される化合物；
およびそのC₁₋₁₀アルキル、(フェニル)−C₁₋₃アルキルまたは(C₅₋₆ヘテロアリール)−C₁₋₃アルキルモノおよびジエステル；
および該化合物の塩ならびにモノおよびジエステルである。

該化合物（特に酸型）は、インビトロにおいて、GST P1−1のインヒビター、典型的には選択的インヒビターである。ジエステル型において、該化合物は、インビトロにおいて、HL−60細胞からのGSTπの免疫沈降に有効であること、インビトロにおいて、HL−60細胞に対して細胞毒性であることも明らかにされている。このことおよびTLK117、TLK199および関連化合物との構造的類似性から、したがって、本発明化合物は、腫瘍細胞において化学療法剤の細胞毒性効果を増強するため、腫瘍細胞において選択的毒性を付与するため、骨髄細胞においてGM前駆体の産生を高めるため、骨髄の分化を刺激するため、化学療法剤の骨髄抑制作用を緩和するため、および骨髄において造血を調節するためにヒトにおいて治療的に作用することが予測される。

第2の態様において、本発明は、本発明の第1の態様の化合物および必要に応じて1つ以上の賦形剤を含む医薬組成物である。

第3の態様において、本発明は、本発明の第1の態様の化合物または本発明の第2の態様の医薬組成物を投与することによる、腫瘍細胞において化学療法剤の細胞毒性効果を増強するため、腫瘍細胞において選択的毒性を付与するため、骨髄細胞においてGM前駆体の産生を高めるため、骨髄の分化を刺激するため、化学療法剤の骨髄抑制作用を緩和するため、および骨髄において造血を調節するため；の1つ以上のための治療方法、特にヒトにおける治療方法、ならびに上述の治療方法の1つ以上のための医薬の製造における本発明の第1の態様の化合物の使用である。
第4の態様において、本発明は、式：

［式中、Wは、N−α−R¹−L−γ−グルタミルまたはN−α−R¹−L−γ−グルタミルグリシルである（ここで、R¹は、アミン保護基である）；および
n、X、YおよびZは、請求項１と同意義である］
で示される化合物；
およびそのC₁₋₁₀アルキル、フェニル−C₁₋₃アルキルまたは(C₅₋₆ヘテロアリール)−C₁₋₃アルキルモノおよびジエステル；
および該化合物の塩ならびにモノおよびジエステルである。これらの化合物は、本発明の第1の態様の化合物の製造における中間体として有用である。

第5の態様において、本発明は、本発明の第1の態様の化合物の製造方法である。

本発明の好ましい実施態様は、本出願の明細書および請求項2−21に記載の特徴、ならびに医薬組成物、方法およびこれらの化合物の用途によって特徴付けられる。

（発明の実施の形態）
定義「アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、1−プロペニル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロペンチル、シクロペンテン−1−イル、シクロプロピルメチル、シクロヘキシルおよびシクロヘキシルメチルなどの炭素原子から1つの水素原子を除去することによって、直鎖、分枝鎖または環式であってよい飽和または不飽和（芳香族的に不飽和ではない）炭化水素から誘導される一価の基を意味する。飽和アルキルおよびC₁−C₆アルキルが、典型的である。本願における「アルキル」が、慣例の定義よりも広く、一般的に「シクロアルキル」、「シクロアルキルアルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」と称する基を含むことに留意すべきである。

「置換C₁₋₃アルキル」(Yの定義において)は、ハロ、ヒドロキシ、メチル、トリフルオロメチル、メトキシおよびアミノから選ばれる1または2個、特に1個の基で置換されたC₁₋₃アルキルを意味する
「置換C₅₋₆シクロアルキル」は、ハロ、ヒドロキシ、メチル、トリフルオロメチルおよびメトキシ、特に、F、Clまたはメチルから選ばれる1または2個、特に1個の基で置換されたシクロペンチルまたはシクロヘキシルを意味する。

「C₅₋₆ヘテロシクロアルキル」は、環メチレン基の1つが、O、S、SO₂、NHまたはN−メチルで置き換えられたシクロペンチルまたはシクロヘキシルを意味し、 2−および3−テトラヒドロフリル、3−および4−テトラヒドロピラニル、4−テトラヒドロチオピラニルならびにそのS,S−ジオキシド、および2−、3−および4−ピペリジニルを含む。「置換C₅₋₆ヘテロシクロアルキル」は、上記C₅₋₆シクロアルキルの記載と同様にして置換されたC₅₋₆ヘテロシクロアルキルを意味する。
「置換フェニル」は、ハロ、−CN、−NO₂、−OH、必要に応じてハロ−置換されたC₁₋₃アルキル(たとえば、エチル、トリフルオロメチルなど)、必要に応じてハロ−置換されたC₁₋₃アルキルオキシ、ホルミル、カルボキシならびにC₁₋₃アルコキシカルボニルから選ばれる3個までの置換基で置換されたフェニルを意味する。

「ハロゲン」または「ハロ」は、F、ClまたはBrを意味する。
「C₅₋₆ヘテロアリール」は、2−または3−フリル、2−または3−チエニルまたは2−、3−または4−ピリジニルを意味する。「置換C₅₋₆ヘテロアリール」は、上記置換フェニルと同様にして置換されたC₅₋₆ヘテロアリールを意味する。
「塩」は、「本発明化合物」と題するセクションに記載する。

「アミン保護基」は、本発明の第1の態様の化合物の残りの部分に影響を及ぼすことなく、本発明化合物の合成中に、該化合物またはそれに至る中間体のグルタミル α−アミン基を保護することができ、続いて、除去しうる基である。一般的なこのような基は、酸分解によって都合よく除去しうるtert−ブトキシカルボニルおよびベンジルオキシカルボニルである。アミン保護基は、有機合成、特にペプチド合成業界において公知である。適当なこのような基およびその除去条件は、Synthesis of Peptides and Peptidomimetics、Workbench edition、M.Goodman編、Georg Thieme Verlag、Stuttgart、Germany、2004ならびにProtective groups in organic synthesis、3版、T.W.GreeneおよびP.G.M.Wuts編、John Wiley & Sons、Inc.、New York、New York、U.S.A.、1999などの書籍に記載されており、当業者には周知である。

「治療有効量」は、本治療方法の1つによる治療を達成するために、哺乳動物、特にヒトに投与された場合に、治療処置の目的である病気の治療を成し遂げるのに十分である量を意味する。哺乳動物における病気を「治療する」または病気の「治療」は、以下の1つ以上を含む：
(1)病気の成長を阻止する、たとえば、その進行を抑止すること；
(2)病気を軽減する、たとえば、病気の退行または治癒を引き起こすこと；
(3)病気の再発を防止すること；および
(4)病気の症状を寛解すること。

本発明化合物およびその製造
本発明の第1の態様の化合物は、式：

［式中、nは、0または1である；
Wは、L−γ−グルタミルまたはL−γ−グルタミルグリシルである；
Xは、必要に応じて置換されたC₅₋₆シクロアルキル、必要に応じて置換されたC₅₋₆ヘテロシクロアルキル、必要に応じて置換されたフェニルまたは必要に応じて置換されたC₅₋₆ヘテロアリールである；
Yは、＝O、＝N−OHまたは＝N−O(必要に応じて置換されたC₁₋₃アルキル)である；および
Zは、必要に応じて置換されたフェニルまたは必要に応じて置換されたC₅₋₆ヘテロアリールである］
で示される化合物；
およびそのC₁₋₁₀アルキル、(フェニル)−C₁₋₃アルキルまたは(C₅₋₆ヘテロアリール)−C₁₋₃アルキルモノおよびジエステル；
およびその塩ならびにモノおよびジエステルである。

好ましい本発明の第1の態様の化合物には、1つ以上の以下の特徴を有する化合物が包含される：
1．Wが、l−γ−グルタミルである；
2．Xが、シクロペンチル、シクロヘキシル、フリル、チエニルまたはピリジニルまたは必要に応じて置換されたフェニル；特に、シクロヘキシルまたは3−チエニル、またはメチル、ヒドロキシまたはメトキシで必要に応じて置換されたフェニル；特に、フェニル、4−クロロフェニルおよび4−ヒドロキシフェニルなどのフェニルが非置換であるか、または4位に1個の置換基を有する場合；
3A．nが、0である；または
3B．nが、1であり、Yが、＝O、＝N−OHまたは＝N−OCH₂CH₂NH₂である；
4．Z−C(＝Y)_n−置換基が、それが結合するフェニル基の2または4位にある；
5．Zが、ピリジルであるか、または、必要に応じて置換されたフェニルである；
6A．化合物が、二酸である；または
6B．化合物が、ジエステル、特には、C₁₋₆アルキルジエステル、さらに特には、C₁₋₃アルキルジエステル、特に、ジエチルエステルである。

一般に、より多くの数のこれらの特徴を有する化合物が、より少ない数のこれらの特徴を有する化合物よりも好ましい；特に、すべての特徴よりも少ない特徴を有する化合物に対して、これらの特徴の1つを追加すると、一般に、その特徴を含まない化合物よりも好ましい化合物がもたらされる。

本発明化合物の適当な塩（非排他的リストとして、BergeらのJ．Pharm．Sci.、66:1(1971)を参照）は、無機塩基(たとえば、水酸化ナトリウム、カリウムおよびカルシウム)または有機塩基(たとえば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、トロメタミン、N−メチルグルカミン)がカルボキシル基と反応して形成されるもの、および無機酸（たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸およびクロロスルホン酸)または有機酸(たとえば、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、フマル酸または酒石酸およびメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、クロロベンゼンスルホン酸といったような置換ベンゼンスルホン酸、およびトルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸および置換ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸および置換ナフタレンジスルホン酸ならびにカンファースルホン酸)が反応して本発明化合物のアミン基の酸付加塩を形成するように反応する場合に形成されるものである。これらの塩が、医薬的に許容しうる酸および塩基と形成されるのが好ましい。本発明化合物のための適当な塩は、酸付加塩、特に、塩酸塩などの無機酸との塩である。

本発明方法による本発明の第1の態様の化合物の製造は、ステップ(a1)〜(a4)：
(a1)式：

で示されるトリペプチドまたはテトラペプチドまたはそのモノまたはジエステル（典型的には、R¹保護グルタミルアミン基を有する）のシステインイオウ原子を、式：

［式中、Lは、塩素、臭素、またはメタン−、トリフルオロメタン−、ベンゼン−、4−トルエン−、4−ニトロベンゼン−、4−クロロベンゼン−または4−ブロモベンゼンスルホネートなどの必要に応じて置換されたC₁₋₆アルカンまたはベンゼンスルホネート、特に臭素などの脱離基である］
で示される置換ベンジル基でアルキル化する；
；または
(a2)式：

［式中、nが1ならば、Yは＝Oである］
で示される必要に応じて保護されたジペプチドまたはトリペプチドまたはグルタミルカルボキシレートにおけるそのモノエステル（典型的には、R¹保護グルタミルアミン基を有する）を、式：

で示されるアミノ酸またはそのモノエステルとカップリングさせる；または
(a3)式：

［式中、nが1ならば、Yは＝Oである］
で示されるジペプチドまたはそのモノエステルを、グルタミル α−カルボキシレートにおいて必要に応じてエステル化された、必要に応じて保護されたL−γ−グルタミン酸またはL−γ−グルタミルグリシンとカップリングさせる；または
(a4)式：

で示されるトリペプチドまたはテトラペプチドまたはそのモノまたはジエステルを、Z−ボロン酸とカップリングさせて、式：

［式中、nは0である］
で示される化合物またはそのモノまたはジエステルを得る；
の1つ以上を含み；
必要に応じて、ステップ(b)〜(e)：
(b)ステップ(a)で製造された化合物において、Wが、N−α−R¹−L−γ−グルタミルまたはN−α−R¹−L−γ−グルタミルグリシルならば、本発明の第4の態様の化合物を脱保護して、本発明の第1の態様の化合物を得る；
(c)nが1ならば、Yが＝Oである化合物を、ヒドロキシルアミンまたはO−(必要に応じて置換されたC₁₋₃アルキル)ヒドロキシルアミンと反応させて、＝N−OHまたは＝N−O(必要に応じて置換されたC₁₋₃アルキル)である化合物を形成する；
(d1)ステップ(a)またはステップ(b)において製造された本発明の第1の態様の化合物が二酸である場合、該化合物のモノまたはジエステルを形成する；または
(d2)ステップ(a)またはステップ(b)において製造された化合物がモノまたはジエステルである場合、該化合物を脱エステル化して、該化合物の二酸を製造する；および
(e)ステップ(a)〜(e)のいずれかで製造した化合物の塩を形成する；
の1つ以上を含む。

ステップ(a1)の工程の出発物質は、脱保護されたシステインイオウを有する、グルタミルアミンにおいて必要に応じて保護された、必要に応じてモノまたはジエステル化されたトリペプチドおよびテトラペプチドである。これらのグルタチオン類縁体は、当業者に公知の慣例のペプチド合成方法によって、都合よく製造される。
トリフェニルメチルなどの多くの標準的S−保護基の1つを用いてペプチド合成を行うことができ、次いで、たとえば、酸分解によって、得られるS−保護ペプチドを脱保護する。典型的には、必要に応じてスカベンジャーの存在下、酸分解的に除去可能なイオウ保護基を除去するのには十分強いが、アミン保護基を除去するのには不十分な強さの酸にS−保護ペプチドを溶解する。適当な酸として、必要に応じてジクロロメタンなどの共溶媒の存在下で、トリフルオロ酢酸およびトリフルオロメタンスルホン酸などの他の強酸が挙げられる；適当なスカベンジャーとして、アニソールまたはチオアニソールなどの芳香族エーテルおよび硫化物、クレゾールなどのフェノール、および最も効率的には、トリエチルシランおよびトリイソプロピルシランなどのトリアルキルシランおよびポリ(メチルヒドロシロキサン)などのシランポリマーといったようなシランが挙げられる；および特に適当な脱保護試薬は、ポリ(メチルヒドロシロキサン)の存在下でのトリフルオロ酢酸である。炭化水素またはエーテルなどの非プロトン性非極性溶媒などのアンチソルベントの添加によって、反応混合物からS−脱保護ペプチドを単離することができる

容易に入手可能な出発物質であるN−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミン酸 α−ベンジルエステル、S−トリフェニルメチル−L−システインおよびD−フェニルグリシンを用いる、多くの本発明化合物のための出発ペプチドであるN−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミル−L−システイニル−D−フェニルグリシンの都合のよい製造を以下に示す。N−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミン酸α−ベンジルエステルを、無水1,4−ジオキサン中のN−ヒドロキシスクシンイミドおよびジシクロヘキシルカルボジイミドとの反応によって、N−ヒドロキシスクシンイミドエステルとして活性化させる。The N−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミン酸α−ベンジルエステル γ−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、無水テトラヒドロフランに熔解し、S−(トリフェニルメチル)−L−システインおよびトリエチルアミンの水溶液に加えて、O−α−ベンジル−N−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミル−S−(トリフェニルメチル)−L−システイン。を得る。これをN−ヒドロキシスクシンイミドエステルとして活性化させ、γ−グルタミンとシステインとの化合物と同様にしてD−フェニルグリシンとカップリングさせて、O−α−ベンジル−N−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミル−S−(トリフェニルメチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシンを得る。

異なる活性化基またはカップリングのためのグルタミン酸のγ−カルボキシル基および／またはシステインカルボキシル基の活性化方法を用いる以外は同様の方法を用いることもできる；システイン−フェニルグリシンカップリングを最初に行い、次いで、得られるS−(トリフェニルメチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシンとN−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミン酸 α−ベンジルエステルとのカップリングを行うなどである。N−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミル−S−(トリフェニルメチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシン分子の残りをそのままの状態にしておいてα−カルボキシル基を最終的に脱保護することができるという条件で、N−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミン酸のα−カルボキシル基の他の保護を用いることもできる。O−α−ベンジル−N−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミル−S−(トリフェニルメチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシンを、低級アルコール（たとえば、メタノールなど）に溶解し、水性塩基(たとえば、1 M NaOHなど)を用いる加水分解によってベンジルエステルを除去し、次いで、酸性化して、N−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミル−S−(トリフェニルメチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシンを酸付加塩として単離する。次いで、トルエン中のトリフルオロ酢酸とポリ(メチルヒドロシロキサン)との反応によって、N−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミル−S−(トリフェニルメチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシンのシステインイオウを脱保護し、ヘプタン/メチル tert−ブチルエーテルによりN−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミル−L−システイニル−D−フェニルグリシンを沈澱させることができる。

アミノ酸または入手可能であればジペプチドから出発して、同様の方法によって他のペプチドを容易に製造することができる。D−フェニルグリシン、D−(4−クロロフェニル)グリシン、D−(4−ヒドロキシフェニル)グリシン、D−(3−チエニル)グリシン、D−シクロヘキシルグリシンなどの式：

で示される多くのアミノ酸が、分割された形態で市販されており、いくつかの場合、エステルとして市販されている。他には、ラセミ形態で入手可能なものもあるが、アミノ酸分割のための公知の方法のいずれかによって分割することができる。

次いで、ステップ(a1)において、S−脱保護ペプチドのチオレートアニオンを、式：

［式中、Lは、塩素、臭素またはメタン−、トリフルオロメタン−、ベンゼン−、4−トルエン−、4−ニトロベンゼン−、4−クロロベンゼン−もしくは4−ブロモベンゼンスルホネートなどの必要に応じて置換されたC₁₋₆アルカンまたはベンゼンスルホネート、特に臭素などの脱離基である］
で示される置換ベンジル基でアルキル化して、適当なS−アルキル化ペプチドを製造する。これは、グルタミルアミンを保護して副反応を最小化する場合に都合よく行われるが、アミンが非保護の場合でも行うことが可能である。

典型的には、適当な溶媒(たとえば、C₁₋₆アルカノール、1,2−エタンジオールまたは1,3−プロパンジオールなどのジオール、2−メトキシエタノール、1,2−ジメトキシエタンまたはテトラヒドロフランなどのエーテルなど)中の強塩基[たとえば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩またはアルコキシドまたは水酸化アンモニウム；またはテトラメチルグアニジン、DBU(1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク−7−エン)などの有機アミン塩基など]の溶液に、S−脱保護ペプチドを溶解して、チオレートアニオンを形成し、置換ベンジル基を（典型的には過剰で）加え、完了まで反応混合物を適切な温度および時間にて保持する。都合のよい反応条件は、20%テトラヒドロフラン水溶液および約10倍過剰の重炭酸ナトリウムの使用である。

ペプチドを、出発アミノ酸の状態に応じて、二酸(これは、グルタミルα−カルボキシならびにアミンの中間体保護を含むが)またはモノもしくはジエステルとして製造してもよい。ペプチドを二酸として製造する場合、モノまたはジエステル化(典型的には、アミン保護しながら)した後に、システインイオウ原子をアルキル化、エステル化条件は、典型的には、本発明の第1の態様の化合物のエステル化のために用いた方法と同様である。

ステップ(a2)および(a3)において、必要に応じてアミン保護したシステインのチオレートアニオンを、最初に、式：

で示される置換ベンジル基でアルキル化して、本発明の第1の態様のトリペプチドまたはテトラペプチドの中心アミノ酸を形成する；次いで、該ペプチドを慣例のペプチド合成方法によって組み立てる。

上記トリペプチドまたはテトラペプチドのアルキル化のために用いた方法と同様の方法によって、システインのアルキル化を行うことができる；本発明の第1または第4の態様の化合物である得られるペプチドを得るための種々のアミノ酸のカップリングは、上記と同様の方法によって行うこともできる。

ステップ(a4)において、S−[(ハロフェニル)メチル]−システイン−含有トリペプチドまたはテトラペプチド[たとえば、ステップ(a1)で記載した方法でのS−非保護ペプチドのアルキル化によるか、または上記ステップ(a2)および(a3)で記載した方法でのペプチドを形成するためのシステインのアルキル化およびカップリングによるなどの都合のよい方法によって合成されている]を、スズキカップリングにて式：Z−B(OH)₂のボロン酸とカップリングさせる。

任意のステップ(b)において、分子の残りの部分に影響を及ぼさないアミン保護基の除去に適したいずれかの方法、必要に応じてジクロロメタンの存在下で典型的にはトリフルオロ酢酸などの強酸を用いる酸分解によって、本発明の第4の態様の化合物のR¹−保護アミン基を脱保護して、本発明の第1の態様の化合物を製造する。

任意のステップ(c)において、(c)nが1であり、Yが＝Oである本発明の第1の態様の化合物を、ヒドロキシルアミンまたはO−(必要に応じて置換されたC₁₋₃アルキル)ヒドロキシルアミンと反応させて、＝N−OHまたは＝N−O(必要に応じて置換されたC₁₋₃アルキル)である化合物を形成する。反応は、典型的には、塩基の存在下、水溶液（必要に応じて、テトラヒドロフランなどの水混和性有機溶媒も含む）中でのヒドロキシルアミンとの反応によって行う。

任意のステップ(d1)および(d2)において、本発明の第1の態様の化合物を、エステル化するか（エステルが望ましい場合）、または脱エステル化する（二酸が望ましい場合）。これらのエステル化または脱エステル化は、慣例法であり、当業者に公知のいずれかの方法によって行うことができる；特に、都合のよいエステル化技術は、室温とアルコールの沸騰温度の間の温度にて、クロロトリメチルシランなどのハロシランの存在下、溶媒としてアルコールを用いる、本発明の第1の態様の二酸化合物と所望のエステルを生成するアルコールとの反応を含む。

任意のステップ(e)において、本発明の第1の態様の化合物の塩を形成する。これは、典型的には、酸付加塩である（上記「塩」の定義を参照）。これは、本発明の第1の態様の化合物が形成された後すぐに都合よく行われ、たとえば、炭化水素またはジクロロメタンといったようなハロゲン化炭化水素などの非プロトン性溶媒などの塩のためのアンチソルベントになる溶媒を添加し、次いで、特に、無水酸単独の形態または非プロトン性溶媒中の塩化水素ガスなどの、塩を形成するために選ばれた酸を添加することによって達成される。たとえばジエチルエーテル、メチル tert−ブチルエーテルおよびテトラヒドロフラン、特に、メチル tert−ブチルエーテルといったようなエーテルなどの塩のためのさらなるアンチソルベントを要すれば、または望ましければ加えてもよい。

当業者であれば、その技術および本明細書の記載（実施例を含む）を考慮して、困難なく本発明の第4および第1の態様の化合物を製造することができる。

化合物および方法の使用
本発明の第1の態様の化合物(特に、酸型)は、GST P1−1の非常に強力なインヒビター、典型的には選択的インヒビターである。それらは、インビトロにおいてHL−60細胞の分化の増強においても活性があり、そのうちの1つは、エクスビボにおいてマウス骨髄細胞からの顆粒球／単球コロニー形成を増強することが明らかにされている。したがって、該化合物は、腫瘍細胞において化学療法剤の細胞毒性効果を増強するため(多くの腫瘍組織において高くなるGST、特に、GST P1−1は、化学療法剤に対する腫瘍細胞の耐性に関与するので、GSTインヒビターは、化学療法剤に耐える腫瘍の能力を低下させる)、腫瘍細胞において選択的毒性を付与するため(これもGSTイソ酵素阻害という理由から)、骨髄細胞においてGM前駆体の産生を高めるため、骨髄の分化を刺激するため、化学療法剤の骨髄抑制作用を緩和するため、および骨髄において造血を調節するためにヒトにおいて治療的に作用することが予測される。

本発明の第4の態様の化合物および本発明の第5の態様の方法は、本発明の第1の態様の化合物の製造に有用である。
本発明の第2の態様は、本発明の第1の態様の化合物および必要に応じて医薬的に許容しうる賦形剤などの賦形剤を含む医薬組成物である。
本発明の第3の態様は、典型的には治療有効量で本発明の第1の態様の化合物または本発明の第2の態様の医薬組成物を投与することを含む治療方法、および化学療法剤の細胞毒性効果を増強するため、腫瘍細胞において選択的毒性を付与するため、骨髄細胞においてGM前駆体の産生を高めるため、骨髄の分化を刺激するため、化学療法剤の骨髄抑制作用を緩和するため、および骨髄において造血を調節するため；の1つ以上のためのこれらの化合物の使用である。

化合物は、治療される患者および患者の病気の性質に適当な経路のいずれかによって投与することができる。投与経路として、静脈内、腹腔内、筋肉内および皮下注射などの注射による投与、局所適用を介する経粘膜または経皮デリバリーによる投与、点鼻スプレー、座薬などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、あるいは経口投与してもよい。これらの化合物を含む医薬組成物は、必要に応じて、リポソーム製剤、乳剤、粘膜を通して薬剤を投与するように設計された製剤または経皮製剤であってもよい。これらの投与方法のそれぞれのための適当な製剤は、たとえば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、20 ed.、A．Gennaroら、Lippincott Williams & Wilkins、Philadelphia、Pennsylvania、U.S.A.、2003に見出すことができる。典型的な組成物は、経口剤または静脈内注入のための液剤のいずれかであり、該化合物を含み、典型的には1つ以上の医薬的に許容しうる賦形剤も含む。典型的な投与剤形は、錠剤、静脈内注入のための液剤および静脈内注入のための溶液に戻して用いる凍結乾燥粉末である。

本発明の第1の態様の化合物の治療有効量は、約10〜2000 mg/m²体表面積、特に50〜1000 mg/m²である。投与は、1〜35日間隔；たとえば、1〜5週間隔、特に1、2、3または4週間隔、あるいは数日間(たとえば、5または7日)の1日に1回などのより多い頻度で、2、3または4週間毎に投与を繰り返して、もしくは6〜72時間の持続注入で、2、3または4週間毎に投与を繰り返して、約250〜1000 mg/m²の投与を行うことができる。典型的な処方は、3週間毎に5日間の1日1回投与を含む。

製造例および実施例
次の実施例は、本発明方法による有用な中間体の製造および本発明化合物の合成および治療剤としての本発明の第1の態様の化合物の有用性を明らかにする。

製造例1および2は、システインまたはトリペプチドおよびテトラペプチド（スルフィド化合物）のシステインのS−アルキル化のための試薬の製造を記載する。便宜上、この試薬をベンジルブロミドの誘導体（α−ブロモトルエン）と命名する。

製造例1：4−(2−ピリジル)ベンジルブロミドの製造
4−(2−ピリジル)トルエン、2 mL(1.98 g、11.7 mmol)、N−ブロモスクシンイミド−NBS)2.5 g(14.0 mmol)およびα,α'−アゾビス(イソブチロニトリル)(AIBN)23 mg(0.14 mmol)を35 mLのテトラクロロメタンに懸濁し、24時間還流する。生成物を濾過し、回転蒸発によっって濾液から溶媒を除去する。
等量のクロロホルムおよび水を加え、生成物を抽出する。クロロホルム層を分離し、乾燥し、溶媒を除去する。4−(2−ピリジル)ベンジルブロミド2 gを粘着性の黄色固体で得る。

この方法によって、4'−メチル−4−ビフェニルカルボン酸から4'−(4−カルボキシフェニル)ベンジルブロミドを製造し、メチル 4'−メチル−4−ビフェニルカルボキシレート(メタノールとクロロトリメチルシランとのエステル化によってカルボン酸から得る)から4'−(4−(メトキシカルボニル)ベンジルブロミドを製造し、4−メチルベンゾフェノンから4−(ベンゾイル)ベンジルブロミドを製造する。

製造例2：4−(2−メトキシフェニル)ベンジルブロミドの製造
4−ブロモトルエン171 mg(1 mmol)、2−メトキシフェニルボロン酸152 mg(1 mmol)、二酢酸パラジウム1 mg(4 μmol)、N−ブチルアンモニウムブロミド322 mg(1 mmol)および2 M水性Na₂CO₃1.9 mL(3.8 mmol)を、電子レンジ可能な圧力バイアルに入れ、150℃にて5分間加熱する。室温に冷却した後、生成物を分液ロートに注ぎ入れ、それぞれ30 mLの水およびジエチルエーテルを加える。抽出後、層を分離し、水性層を別の30 mLのジエチルエーテルで洗浄する。エーテル抽出物を合わせ、乾燥(硫酸マグネシウム)し、溶媒を減圧下で回転蒸発により除去する。2−メトキシ−4'−メチルビフェニル160 mg(81%収率)を固体生成物で得る、NMRによる純度95%。

2−メトキシ−4'−メチルビフェニル160 mg(0.81 mmol)、NBS158 mg(0.91 mmol)およびAIBN1 mg(0.006 mmol)を7 mLのテトラクロロメタンに懸濁し、24時間還流する。生成物を濾過し、回転蒸発により濾液から溶媒を除去する。等量のジエチルエーテルおよび水を加え、生成物を抽出する。エーテル層を分離し、乾燥(硫酸マグネシウム)し、濾過し、溶媒を除去する。4−(2−メトキシフェニル)ベンジルブロミド128 mgを油状物で得る。
この方法により、4−シアノフェニルボロン酸から4'−(4−シアノフェニル)ベンジルブロミドを製造し、3−(トリフルオロメチル)フェニルボロン酸から4'−[3−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンジルブロミドを製造する。
これらの製造例の方法により、必要に応じて置換されたフェニルまたは必要に応じて置換されたC₅₋₆ヘテロアリール、必要に応じて置換されたベンゾイルまたは（必要に応じて置換されたC₅₋₆ヘテロアリール）カルボニルで置換されたその他のベンジルブロミドを容易に製造することができる。
製造例3は、S−アルキル化システインの製造を記載する。

製造例3：N−α−(tert−ブトキシカルボニル)−S−(4−ビフェニルイルメチル)−L−システインの製造
アルゴンを通気することによって脱気した9 mLのテトラヒドロフランおよび9 mLの1 M水性NaOHの混合物に、N−α−(tert−ブトキシカルボニル)−L−システイン1.0 g(4.52 mmol)を溶解する。5 mLのテトラヒドロフラン(THF)中の4−(ブロモメチル)ビフェニル1,12 g(4.53 mmol)の溶液を加え、アルゴン通気下、溶液を室温にて8時間撹拌する。減圧下、回転蒸発によりTHFを除去し、残渣を水に溶解し、ジエチルエーテルで洗浄する。6 M水性HClで水性相をpH 3まで酸性化し、酢酸エチルで3回抽出する。合わせた有機抽出物を水、飽和水性NaHCO₃、水および食塩水で洗浄し、次いで、乾燥し、濃縮して、1−44 g N−α−(tert−ブトキシカルボニル)−S−(4−ビフェニルイルメチル)−L−システイン(82%収率)を白色固体で得る。
この製造例の方法により、その他の(必要に応じて保護された)S−アルキル化システインを容易に製造することができる。

合成例1：L−γ−グルタミル−S−[(4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシンの合成[ステップ(a1)、(b)および(e)の説明]
アセトニトリル/水にアミン保護ペプチドを溶解し、10倍過剰の重炭酸ナトリウムを加え、次いで、わずかに過剰の4−(ブロモメチル)ビフェニルを加え、次いで、完了まで窒素下に反応物を維持することによって、330 mgのN−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミル−L−システイニル−D−フェニルグリシンから、L−γ−グルタミル−S−[(4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシン、1Aを塩酸塩として製造する。反応混合物を水で希釈し、ジエチルエーテルで洗浄し、水性相を分離し、塩酸でpH2−3まで酸性化し、次いで、酢酸エチルで抽出する。有機相を乾燥(硫酸マグネシウム)し、濾過し、体積を減少させて、N−α−(ベンジルオキシカルボニル)−L−γ−グルタミル−S−[(4−ビフェニルイル)メチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシンを得る。アミン保護スルフィド約300 mgを2 mLの95：5 トリフルオロ酢酸(TFA)：ジクロロメタンおよび一滴の水に溶解し、45℃にて一夜撹拌し、プレパラティブHPLCにより精製して、L−γ−グルタミル−S−[(4−ビフェニルイル)メチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシンを得る。L−γ−グルタミル−S−[(4−ビフェニルイル)メチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシンを塩酸塩として単離する。

同様の方法により、L−γ−グルタミル−S−{[4−(2−ピリジル)フェニル]メチル}−L−システイニル−D−フェニルグリシン、化合物8AおよびL−γ−グルタミル−S−[(4−ベンゾイルフェニル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシン、化合物9Aなどの化合物を製造する。
同様の方法により、モノおよびジエステルである化合物などの本発明の第1の態様の他のトリペプチドおよびテトラペプチドを容易に製造することができる。

合成例2：L−γ−グルタミル−S−[(4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシンジエチルエステルの合成[ステップ(d1)および(e)の説明]
エタノールとクロロトリメチルシランとのエステル化によって、L−γ−グルタミル−S−[(4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシン、30 mgから、L−γ−グルタミル−S−[(4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシンジエチルエステル、1Bを塩酸塩として製造し、L−γ−グルタミル−S−[(4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシンジエチルエステルを得る、正確な質量605、MS(m/z) 606(M＋H)。L−γ−グルタミル−S−[(4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシンジエチルエステルを塩酸塩として単離する。

同様の方法により、L−γ−グルタミル−S−{[4−(2−ピリジル)フェニル]メチル}−L−システイニル−D−フェニルグリシンジエチルエステル、化合物8BおよびL−γ−グルタミル−S−[(4−ベンゾイルフェニル)メチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシンジエチルエステル、化合物9Bなどの化合物を製造する。
同様の方法により、本発明の第1の態様の化合物の他のエステル、特に、ジエステルを容易に製造することができる。

合成例3：L−γ−グルタミル−S−[(4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−シクロヘキシルグリシンの合成[ステップ(a3)、(b)および(e)の説明]
15 mLのエタノールに酸を懸濁し、クロロトリメチルシラン、2.02 mL(5当量)を加え、混合物を50℃にて18時間加熱することによって、D−シクロヘキシルグリシン500 mg(3.1 mmol)から、D−シクロヘキシルグリシンエチルエステルを製造する。揮発成分を減圧除去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、水性NaHCO₃および食塩水2回で洗浄し、乾燥(硫酸マグネシウム)し、濾過し、蒸発して、401 mgのD−シクロヘキシルグリシンエチルエステルを油状固体で得る。

N−α−(tert−ブトキシカルボニル)−S−(4−ビフェニルイルメチル)−L−システイン588 mg(1.9 mmol)を、5 mLのジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、O−ベンゾトリアゾール−N,N,N',N'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)860 mg(1.2当量)およびジ(イソプロピル)エチルアミン990 μL(3当量)を加える。3分後、4 mLのDMFに溶解したD−シクロヘキシルグリシンエチルエステル360 mg(1当量)を加え、混合物を室温にて2時間撹拌し、次いで、粗N−α−(tert−ブトキシカルボニル)−S−(4−ビフェニルイルメチル)−L−システイニル−D−シクロヘキシルグリシンエチルエステルを単離する。ジペプチドを10 mLの20% TFA/ジクロロメタンに溶解し、室温にて2時間撹拌し、次いで、揮発物を減圧除去して粗生成物を単離する。粗S−(4−ビフェニルイルメチル)−L−システイニル−D−シクロヘキシルグリシントリフルオロアセテートを次のステップに直接用いるか、またはさらに処理してもよい。

N−α−( tert−ブトキシカルボニル)−O−α−tert−ブチル−L−γ−グルタミンを2 mLのDMFに溶解し、HBTU174 mg(1.2当量)およびジ(イソプロピル)エチルアミン330 μL(5当量)を加える。5分後、2 mLのDMFに溶解した粗S−(4−ビフェニルイルメチル)−L−システイニル−D−シクロヘキシルグリシントリフルオロアセテート200 mg(0.38 mmolを加え、混合物を室温にて2時間撹拌する。混合物に0.1 N水性クエン酸を注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出する。有機層を食塩水で4回洗浄し、乾燥(硫酸マグネシウム)し、揮発物を蒸発して、N−α−( tert−ブトキシカルボニル)−O−α−tert−ブチル−L−γ−グルタミル−S−(4−ビフェニルイルメチル)−L−システイニル−D−シクロヘキシルグリシンを褐色油状物で得る。これを10 mLの20% TFA/ジクロロメタンに溶解し、室温にて24時間撹拌する。揮発物を減圧除去し、逆相HPLCにより生成物を精製し、次いで、47 mgのL−γ−グルタミル−S−(4−ビフェニルイルメチル)−L−システイニル−D−シクロヘキシルグリシン、化合物12Aを塩酸塩として単離する。
同様の方法により、L−γ−グルタミル−S−(4−ビフェニルイルメチル)−L−システイニル−D−(4−クロロフェニル)グリシン、化合物11Aを塩酸塩として製造する。

合成例4：L−γ−グルタミル−S−({4−[(2−アミノエトキシイミノ)(フェニル)メチル]フェニル}メチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシンの合成[ステップ(c)の説明]
5 mLの水、5 mLのTHFおよび10 mLの0.5 Mリン酸ナトリウム（pH 4.5）中、L−γ−グルタミル−S−[(4−ベンゾイルフェニル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシン108 mg(0.18 mmol)をO−(2−アミノエチル)ヒドロキシルアミンジヒドロクロリド26 mg(0.18 mmol)で処理することによって、L−γ−グルタミル−S−({4−[(2−アミノエトキシイミノ)(フェニル)メチル]フェニル}メチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシン、化合物10Aを製造する。混合物を50℃にて一夜加熱し、塩酸緩衝液を用いるHPLCにより生成物を精製し、それぞれ約45 mgのL−γ−グルタミル−S−({4−[(2−アミノエトキシイミノ)(フェニル)メチル]フェニル}メチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシンの2つの異性体（オキシム窒素にて）を塩酸塩として単離する。

同じ方法により、L−γ−グルタミル−S−[(4−ベンゾイルフェニル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシンジエチルエステルから出発して、L−γ−グルタミル−S−({4−[(2−アミノエトキシイミノ)(フェニル)メチル]フェニル}メチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシンジエチルエステル、化合物10Bを製造し、同様に2つの異性体を得る。

代表的本発明の第1の態様の化合物を下記第1表に示す：
第1表：本発明の第1の態様の二酸化合物

＃は、化合物の残りの部分のシステインイオウへのAの結合点を意味する。

化合物9Bを製造しないこと以外は、前述の方法の１つによって、化合物1A−12Aのジエチルエステル1B−12Bを製造し、質量分析によって分析し、各化合物についてその質量に対応する質量ピーク(M/z)を得る。典型的には、M+H：プラスのイオン化またはM−H：マイナスのイオン化である。
化合物10Aおよびそのジエチルエステル10は、二塩酸塩として単離され、オキシム窒素における2つの異性体として存在する。異性体は分離される。
当業者の技術および本明細書の開示にしたがって、当業者に公知の方法を用いて、本発明のその他の化合物を同様に製造することができる。

インビトロアッセイ実施例
これらの実施例は、予測的インビトロアッセイにおいて、本発明化合物（ならびに比較化合物TLK117およびTLK199ならびにTLK137の一方または他方）の効果を説明する。
EMD Biosciences、Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア、U.S.A.から、組換えヒトGST P1−1、A1−1およびM1−1イソ酵素ならびにウサギポリクローナル抗ヒトGSTπ抗体を入手した。Dakoctyomation、Inc.、カーピンテリア、カリフォルニア、U.S.A.から、マウス抗ヒトGSTπ抗体を入手した。Rockland Immunochemicals、Inc.、ギルバートビル、ペンシルバニア、U.S.A.から、IRDye800複合,親和性精製ヤギ抗ウサギIgG抗体を入手した。National Cancer Institute、ベセスダ、メリーランド、U.S.A.から、ヒトガン細胞系HL−60(前骨髄骨髄性白血病)を入手した。Invitrogen、Inc.、カールスバッド、カリフォルニア、U.S.A.から、RPMI 1−40 培地およびイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)を入手した。Promega Corporation、マディソン、ウィスコンシン、U.S.A.から、CellTiter−Glo(登録商標)アッセイキットを入手し、使用説明書にしたがって用いた。BD Biosciences、Inc.、サンホセ、カリフォルニア、U.S.A.から、フィコエリトリン複合抗CD11b抗体およびフィコエリトリン複合イソタイプコントロール抗体を入手した。StemCell Technologies、Inc.、バンクーバー、カナダから、MethoCult(登録商標)M3234メチルセルロース培地(ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン、rh インスリン、h トランスフェリン、2−メルカプトエタノールおよびL−グルタミンを補足した、メチルセルロースの2.5%IMDM溶液)を入手し、使用説明書にしたがって希釈した（1%メチルセルロース濃度まで）。

インビトロ実施例1：グルタチオンS−トランスフェラーゼイソ酵素の阻害
この実施例は、インビトロにおけるグルタチオンS−トランスフェラーゼイソ酵素GST P1−1、A1−1およびM1−1のインヒビターとしての本発明化合物の効果を説明する。TLK199(これらのアッセイで試験されたTLK117のジエチルエステル)が、ヒトにおける骨髄刺激活性および動物モデルにおける化学増強活性を示しているので、GST P1−1の阻害は、本発明の第3の態様の治療方法における効力の予測であるとみなされる。

アッセイ緩衝液(水溶液中、100 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄、0.1 mM EDTA、pH 6.5)中、それぞれ最終濃度0.02、0.011および0.0083ユニット/mLで組換えヒトGST P1−1、A1−1およびM1−1イソ酵素を用いた[1ユニットは、20℃およびpH 6.5にて、1分間に1 μmolの1−クロロ−2,4−ジニトロベンゼン(CDNB)を還元型グルタチオン(GSH)に結合させる酵素の量である]。100 mMの貯蔵水溶液としてGSHを製造し、100 mMの貯蔵エタノール溶液としてCDNPを製造し、両方をアッセイ緩衝液で希釈して、適切な濃度(最終濃度が評価する酵素の2×Kmになること)にした。試験化合物（二酸、化合物1A−12AおよびTLK117）をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、DMSOで希釈して、アッセイに適した濃度（予測されるIC₅₀に近い中間点を含む範囲にわたる8種類の濃度）にした。各アッセイのために、試験化合物およびGSHをイソ酵素に加えた。イソ酵素／化合物／GSH溶液にCDNB溶液を添加した後ただちに、SpectraMaxプレートリーダー(Molecular Devices、Inc.、サニーベール、カリフォルニア、U.S.A.)により340 nmにおける吸光度を5分間継続して記録した。試験化合物の種々の濃度における吸光度／時間曲線の勾配から、各化合物のGST阻害活性を計算した。アッセイは、二複製ウエルおよびDMSOコントロールにおいて、2%に維持した最終DMSO濃度で行った。これらのアッセイの結果を後記第2表に示す。

インビトロ実施例2：HL−60細胞における細胞毒性
この実施例は、インビトロにおけるHL−60ヒト白血病細胞系に対する本発明化合物の細胞毒性を説明する。
96ウエルプレートに、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%L−グルタミンを補足したRPMI 1−40培地150 μL中の1500細胞/ウエルにて、対数期細胞を播種し、空気/5% CO₂下、37℃にて4−5時間インキュベートした。試験化合物(ジエチルエステル、化合物1B−12BおよびTLK199)をDMSOに溶解し、連続的に希釈した（予測されるCC₅₀に近い中間点を含む範囲にわたる8種類の濃度）。補足したRPMI 1−40培地中でさらに1：50希釈を行った後、50 μLの希釈化合物を加えて、最終DMSO濃度0.5%を達成した。次いで、細胞を72時間(倍加時間のおよそ3倍)インキュベートした。次いで、遠心分離(1200 rpm、20℃にて5分間)により細胞を集め、100 μLの培養上清を除去し、同量の CellTiter−Glo試薬と交換した。一定の撹拌をしながら室温にて10分間インキュベートした後、プレートから、照度計により、観察された発光に比例する生存細胞の数を読み取った。すべてのアッセイを三複製ウエルおよびDMSOコントロールで行った。発光／濃度曲線から、CC₅₀(成長を50%阻害する濃度)を計算した。このアッセイの結果を後記第2表に示す。

インビトロ実施例3：GSTπ免疫沈降アッセイ
この実施例は、GSTπ免疫沈降を引き起こすことにおける本発明化合物の有利な効果を説明する。TLK199(これらのアッセイで試験されたTLK117のジエチルエステル)が、ヒトにおける骨髄刺激活性および動物モデルにおける化学増強活性を示しているので、これらの結果は、本発明の第3の態様の治療方法における効力の予測であるとみなされる。
T75フラスコに、10%ウシ胎児血清、1 mM グルタミンおよび20 μMゲンタマイシンを補足したRPMI−1−40培地20 mL中の6 × 10⁵細胞/mLにて、HL−60細胞を播種し、5% CO₂雰囲気中、37℃にて一夜培養した。0.1% DMSOを含む培養培地中、0.1% DMSOまたは20 μMの試験化合物(ジエチルエステル、化合物1B−12BおよびTLK199)で2時間細胞を処理した。処理に続いて、遠心分離により細胞を集め、リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄した。細胞ペレットを1 mLの溶解緩衝液(50 mM Tris、pH 8.0、120 mM NaCl、0.5% NP−40界面活性剤、100 mM NaF；使用前にプロテアーゼおよびホスファターゼインヒビター(Roche Diagnostics、インディアナポリス、インディアナ、U.S.A.)を加えたもの)に再懸濁し、緩やかに撹拌しながら4℃にて30分間インキュベートした。13,000 rpmで10分間遠心分離することによって細胞溶解液を清澄化して、細胞残骸を除去した。免疫沈降のために、1 mg/mLの総タンパク質を含む細胞溶解液500 μLに、2.1 μgのマウスモノクローナル抗ヒトGSTπ抗体を加えた。4℃にて一夜インキュベートした後、混合物に30 μLのプロテインA/Gアガロースビーズ(Pierce、ロックフォード、IL)を加え、4℃にて1時間インキュベートした。次いで、遠心分離によりビーズを集め、細胞溶解液中で3回洗浄し、10 μLの非還元ドデシル硫酸リチウムサンプル緩衝液(Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア、U.S.A.)に再懸濁した。懸濁したサンプルを95℃にて5分間加熱し、4−12%ゲルSDS−PAGE、次いで、ウサギポリクローナル抗ヒトGSTπ抗体およびIRDye 800複合,親和性精製ヤギ抗ウサギIgG抗体を用いるウエスタンブロット分析に付した。GSTπタンパク質のバンドを視覚化し、バンド強度をOdyssey赤外線走査装置(Li−Cor、リンカーン、ネブラスカ、U.S.A.)で定量した。化合物処理サンプルからのバンド強度をその対応するDMSOコントロールと比較し、阻害パーセントで表した。結果を後記第2表に示す。

第2表：本発明二酸化合物によるGSTイソ酵素阻害およびHL−60細胞毒性および本発明ジエチルエステル化合物のGSTπ免疫沈降
（＊ビフェニルカルボキシレートにおけるエステル化を含む、化合物６についてのトリエチルエステル）

NM−測定値なし；ブランク−化合物作成せず

本発明の二酸化合物は、GST P1−1の非常に強力なインヒビターであり(IC₅₀＜20 nM、数種についてはIC₅₀＜10 nM)、一般に、２つの他の人GSTイソ酵素であるGST A1−1およびGST M1−1よりもGST P1−1に対して選択的である。すべてのジエチルエステルが、HL−60細胞において良好な細胞毒性を示し、免疫沈降アッセイで測定されたように、多くが、GSTπの有意な阻害を示す。

いくつかの本発明のジエチルエステル化合物は、そのHL−60の細胞の分化を増強する能力についても試験した。これは、インビトロにおけるHL−60ヒト白血病細胞系の分化を刺激する本発明化合物の有利な効果を説明する。このアッセイにおいて分化を増強するTLK199が、ヒトにおける骨髄刺激活性を示しているので、これらの結果は、ヒトにおける骨髄刺激の効力の予測であるとみなされる。空気/5% CO₂下、インビトロ実施例2で用いた補足RPMI 1−40培地2 mLおよび最終DMSO濃度0.1%でDMSOに溶解した試験化合物中、対数期細胞(1×10⁵細胞/mL)を37℃にて24時間インキュベートした。遠心分離(1250 rpm、20℃にて5分間)により細胞を集め、氷冷した2%FBS含有リン酸緩衝生理食塩水(PBS)2 mLで洗浄し、次いで、10 μLのフィコエリトリン複合抗CD11b抗体または10 μLのフィコエリトリン複合イソタイプコントロール抗体で染色した。30分間氷上で静置した後、細胞を氷冷した2%FBS含有PBS2 mLに再懸濁した。遠心分離(1250 rpm、20℃にて5分間)により細胞を集め、0.4 mLの2%FBS含有PBSに再懸濁した。FACSCaliburアナライザー(BD Biosciences)を用いるフローサイトメトリーによって、顆粒球および単球のマーカーであるCD11bの特異的細胞表面発現を検出した。アッセイは三複製およびDMSOコントロールにて行った。分化の程度は、DMSOコントロールからの多様なシグナルとして表した。いくつかの試験化合物が、HL−60細胞の分化を増強した。

これらの結果およびこれらの化合物のTLK199との構造的類似性から、化合物、特にジエステルは、腫瘍細胞において化学療法剤の細胞毒性効果を増強するため、腫瘍細胞において選択的毒性を付与するため(これもGSTイソ酵素阻害という理由から)、骨髄細胞においてGM前駆体の産生を高めるため、骨髄の分化を刺激するため、化学療法剤の骨髄抑制作用を緩和するため、および骨髄において造血を調節するためにヒトにおいて治療的に作用することが予測される。

製剤例
この実施例は、本発明化合物、特にジエステルに適した製剤を説明する。
以下を合わせ、混合物を打錠して錠剤を形成するか、または硬ゼラチンカプセルに充填して、250 mgの化合物4Aを含む経口投与用固形製剤を製造する：
化合物4A 25.0% w/w
ステアリン酸マグネシムウム 0.5% w/w
デンプン 2.0% w/w
ヒドロキシプロピルメチルセルロース 1.0% w/w
微結晶セルロース 71.5% w/w
錠剤は、要すれば、フィルム形成剤(たとえば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、色素(たとえば、二酸化チタン)および可塑剤(たとえば、ジエチルフタレート)の懸濁液を適用し、溶媒を蒸発させてフィルムを乾燥することによってコーティングしてもよい。

化合物をたとえば、医薬的に許容しうる塩として濃度1% w/vのリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、溶液を滅菌濾過し、次いで、滅菌容器に封入することによって、たとえば、250 mgの本発明化合物を含む静脈内投与用製剤を製造する。
あるいは、化合物を医薬的に許容しうる塩として、たとえば、上記リン酸緩衝生理食塩水のリン酸緩衝液などの適当な緩衝液に溶解し、この溶液を滅菌し、適当な滅菌バイアルに分配し、溶液を凍結乾燥して水を除去し、バイアルを密封することによって、凍結乾燥製剤を製造することができる。凍結乾燥製剤を、滅菌水を加えることによって戻し、戻した溶液を0.9%塩化ナトリウム静脈内注入液または5%デキストロース静脈内注入液などの溶液で、投与用にさらに希釈することができる。

あるいは、米国特許出願No.2003/0100511(たとえば、実施例4および5)の方法によって、該公報の化合物9の代わりに本発明化合物を用いて、リポソーム製剤を製造し、該公報に記載のように凍結乾燥することができる。

治療例
この実施例は、本発明化合物に適した治療方法を説明する。
前記製剤例に記載した静脈内製剤中の化合物は、初期用量50 mg/m²で骨髄異形成症候群を患う患者に30分間かけて静脈内投与し、この用量を100 mg/m²、200 mg/m²、400 mg/m²および600 mg/m²に増加させる。化合物は、3週間毎に5日間1日1回投与する。

本発明は、特定の態様および実施例とともに記載されているが、当業者には、専門技術および本発明の開示から、特別に開示された物質および方法の等価物もまた、本発明に適用することができること；およびこのような等価物が特許請求の範囲に包含されることが意図されることは明らかである。

Claims

式：

［式中、nは、0または1である；
Wは、L−γ−グルタミルまたはL−γ−グルタミルグリシルである；
Xは、必要に応じて置換されたC₅₋₆シクロアルキル、必要に応じて置換されたC₅₋₆ヘテロシクロアルキル、必要に応じて置換されたフェニルまたは必要に応じて置換されたC₅₋₆ヘテロアリールである；
Yは、＝O、＝N−OHまたは＝N−O(必要に応じて置換されたC₁₋₃アルキル)である；および
Zは、必要に応じて置換されたフェニルまたは必要に応じて置換されたC₅₋₆ヘテロアリールである］
で示される化合物；
およびそのC₁₋₁₀アルキル、(フェニル)−C₁₋₃アルキルまたは(C₅₋₆ヘテロアリール)−C₁₋₃アルキルモノおよびジエステル；
および該化合物の塩ならびにモノおよびジエステル。
nが、0である請求項１に記載の化合物。
nが、1である請求項１に記載の化合物。
Yが、＝Oである請求項３に記載の化合物。
Wが、L−γ−グルタミルである請求項１〜４のいずれか１つに記載の化合物。
Xが、シクロペンチル、シクロヘキシル、チエニル、フリル、ピリジニルまたは必要に応じて置換されたフェニルである請求項１〜５のいずれか１つに記載の化合物。
Xが、シクロヘキシルである請求項６に記載の化合物。
Xが、1または2個のフルオロ、クロロ、メチル、ヒドロキシ、メトキシまたはトリフルオロメチル基で必要に応じて置換されたフェニルである請求項６に記載の化合物。
フェニルが、非置換である請求項８に記載の化合物。
フェニルが置換され、置換基の1つが4位にある請求項８に記載の化合物。
ただ1つの置換基がある請求項１０に記載の化合物。
−C(＝Y)_n−Z置換が、フェニル基の2または4位にある請求項１〜１１のいずれか１つに記載の化合物。
−C(＝Y)_n−Z置換が、フェニル基の2位にある請求項１２に記載の化合物。
−C(＝Y)_n−Z置換が、フェニル基の4位にある請求項１２に記載の化合物。
Zが、フルオロ、クロロ、シアノ、メチル、ヒドロキシ、メトキシまたはトリフルオロメチル基で必要に応じて置換されたフェニルである請求項１４に記載の化合物。
二酸またはその塩である請求項１〜１５のいずれか１つに記載の化合物。
ジエステルまたはその塩である請求項１〜１５のいずれか１つに記載の化合物。
C₁₋₆アルキルまたはベンジルジエステルまたはその塩である請求項１７に記載の化合物。
C₁₋₆アルキルジエステルまたはその塩である請求項１８に記載の化合物。
ジエチルエステルまたはその塩である請求項１９に記載の化合物。
L−γ−グルタミル−S−[(4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシン；
L−γ−グルタミル−S−[(2−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシン；
L−γ−グルタミル−S−[(2'−シアノ−4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシン；
L−γ−グルタミル−S−[(2'−メトキシ−4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシン；
L−γ−グルタミル−S−[(3'−(トリフルオロメチル)−4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシン；
L−γ−グルタミル−S−[(4'−カルボキシ−4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシン；
L−γ−グルタミル−S−[(4'−シアノ−4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシン；
L−γ−グルタミル−S−{[4−(2−ピリジル)フェニル]メチル}−L−システイニル−D−フェニルグリシン；
L−γ−グルタミル−S−[(4−ベンゾイルフェニル)メチル]−L−システイニル−D−フェニルグリシン；
L−γ−グルタミル−S−({4−[(2−アミノエトキシイミノ)(フェニル)メチル]フェニル}メチル)−L−システイニル−D−フェニルグリシン；
L−γ−グルタミル−S−[(4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−(4−クロロフェニル)グリシン；および
L−γ−グルタミル−S−[(4−ビフェニルイル)メチル]−L−システイニル−D−シクロヘキシルグリシン；
から選ばれる請求項１に記載の化合物およびそのジエチルエステル；
およびその塩およびそのジエチルエステル。
請求項１〜２１のいずれか１つに記載の化合物を含む医薬組成物。
さらに賦形剤を含む請求項２２に記載の医薬組成物。
腫瘍細胞において化学療法剤の細胞毒性効果を増強するため、腫瘍細胞において選択的毒性を付与するため、骨髄細胞においてGM前駆体の産生を高めるため、骨髄の分化を刺激するため、化学療法剤の骨髄抑制作用を緩和するため、および骨髄において造血を調節するため；の1つ以上のための医薬の製造における請求項１〜２１のいずれか１つに記載の化合物の使用。
請求項１〜２１のいずれか１つに記載の化合物または請求項２２または２３のいずれか1つに記載の医薬組成物を投与することによる、腫瘍細胞において化学療法剤の細胞毒性効果を増強するため、腫瘍細胞において選択的毒性を付与するため、骨髄細胞においてGM前駆体の産生を高めるため、骨髄の分化を刺激するため、化学療法剤の骨髄抑制作用を緩和するため、および骨髄において造血を調節するため；の1つ以上のための治療方法。
式：

［式中、Wは、N−α−R¹−L−γ−グルタミルまたはN−α−R¹−L−γ−グルタミルグリシルである（ここで、R¹は、アミン保護基である）；および
n、X、YおよびZは、請求項１と同意義である］
で示される化合物；
またはそのC₁₋₁₀アルキル、フェニル−C₁₋₃アルキルまたは(C₅₋₆ヘテロアリール)−C₁₋₃アルキルモノまたはジエステル；
または該化合物の塩またはモノまたはジエステル。