SULFONAS DE TRIPEPTIDOS Y TETRAPEPTIDOS
Campo de la Invención La invención se refiere a sulfonas de tripéptidos y tetrapéptidos, composiciones farmacéuticas que los contienen, su uso farmacéutico y su preparación. Antecedentes de la Invención Las patentes norteamericanas 5599903; 5763570; 5767086; 5786336; y 5955432; la publicación de patente europea No. 0 645 397; y la publicación internacional PCT Nos. WO 95/08563 y WO 96/40205 describen varios compuestos de tripéptidos y tetrapéptidos que son análogos de glutatión reducido (L-?-glutamil-L-cesteinilglicina), incluyendo compuestos de la fórmula [WO 95/08563]:
y sus esteres de alquilo o alquenilo C-,.?0 o aralquilo C7-12l amidas y esteres/amidas mixtas, en las cuales: Z es S, O, o C; n es 1 a 3; cuando Z es S o O y n es 1 , X es a C?_20 hidrocarbilo opcionalmente contiene 1 o 2 heteroátomos no adyacentes de O, S, o N, insustituidos o sustituidos con halo, — NO, -NO2, -NR2, -OR, o -SR,
en donde R es H o C?-4 alquilo ; cuando Z es S y n es 2, una X es como se define y la otra X es C-|.4 alquilo; y cuando Z es C y n es 3, una X es como se define y la otra X es independientemente H o d.4 alquilo; YCO es ?-glu, ß-asp, glu, asp, ?-g lu-g ly , ß-asp-gly, glu-gly, asp-gly ; y AAC es un aminoácido acoplado a través del enlace de péptido al resto del compuesto. Se describe que los compuestos tienen varios usos, incluyendo como reactivos útiles en la caracterización de la isoenzimas S-transferasa de glutatión (GST), al determinar los complementos GTS de células y tejidos, como ligantes de afinidad cromatográfica, agentes ligantes e inhibidores de enzimas; y terapéuticamente para elevar los efectos citotóxicos de agentes quimioterapéuticos en células tumorales, ejercer selectivamente citotoxicidad en células de tumores, elevar la producción de progenitores de macrófagos de granulocitos (GM) en la médula ósea, estimula la diferenciación de médula ósea, mitigar los efectos destructivos de la médula ósea de los gentes quimioterapéuticos, y modular la hematopoyesis en la médula ósea. TLK117, identificada en esas patentes y publicaciones como TER 117 y llamada variadamente como ?-Glu-Cys(Bz)-fen¡IGIy, yE-C(Bz)-fG, ?E-C(Bz)-PG, ?E-C(benc?l)-fG, y bencilo PG, es uno de esos compuestos. TLK117 es el compuesto de la fórmula:
y puede llamarse L-?-glutamil-S-(fenilmetil)-L-cisteinil-D-fenilglic¡na.
TLK117 inhibe GST P1-1 con un IC50 de aproximadamente 400 nM.
TLK199, identificado en esas patentes y publicaciones como TER 199, es el éster de dietilo de TLK117; mientras que TLK261 y
TLKK262 son los esteres de dimetilo y diisopropilo, respectivamente. La solicitud publicada norteamericana no. 2003/0100511 y la publicación internacional PCT no. WO00/44366 describe formulaciones lípidas, incluyendo formulaciones de liposomas, de diésteres de compuestos de la fórmula:
en la cual: cada éster tiene 1-25C; YCO es ?-glu o ß-asp; G* es fenilglicina; Z es CH2, O, o S; y X es 6-8C alquilo, bencilo, o naftilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
o un compuesto de la fórmula:
en la cual: R-i y R2 se seleccionan independientemente de grupos alquilo lineales o ramificadas (1-25C), grupos cicloalquilo (6-25C), grupos alquilo sustituidos (2-25C), heterociclos (6-20C), éteres o poliéteres (3-25C), o en la cual R-?-R2 (2-20C) juntos forman un macrociclo con la fórmula; y R3 es 6-8C alquilo, bencilo, o naftilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Townsend et al., Mol. Cáncer Ther., 1(12), 1089-1095 (2002) describen el compuesto de la fórmula
la "sulfona de vinilo", como uno de los dos productos del rompimiento provocado por GST de la canfosdamida, un agente anticanceroso activado por GST de la fórmula
que se describe en la patente norteamericana no. 5556942 y publicación internacional PCT no. WO95/09866, en donde se le llama TER 286. Muchas condiciones se caracterizan por una médula ósea agotada, incluyendo síndrome de mielodisplástico (MDS), una forma de pre-leucemia en la cual la médula ósea produce niveles insuficientes de uno o más de los tres elementos principales de la sangre (glóbulos blancos, glóbulos rojos y plaquetas). La mielosupresión, una reducción en los niveles de glóbulos rojos y en la generación de nuevos glóbulos rojos en la médula ósea, es también un efecto tóxico común de muchos fármacos quimioterapéuticos estándar. Se ha mostrado que TLK199 induce la diferenciación de las células de leucemia promiolocíticas HL-60 in vitro, para potenciar la actividad de los agentes citotóxicos tanto in vitro como in vivo, y estimular la formación de colonias de los tres linajes de células progenitoras hematopoyéticas en la sangre periférica humana normal En las pruebas preclínicas de ha mostrado que TLK199
aumenta la producción de glóbulos blancos en los animales normales así como en animales en los cuales los glóbulos blancos se agotaron por medio del tratamiento con cisplatino o fluorouracilo. Efectos similares puede proporcionar un nuevo método de tratamiento MDS Actualmente se evalúa TLK199 en una prueba clínica fase II para el tratamiento de MDS. Los resultados parciales de esta prueba reportaron en las asambleas de la American Society of Hematology de 2004 y 2005, demostraron que TLK199 es bien tolerado y da como resultado en mejoras hematológica de múltiples linajes. Esos resultados también sugieren un papel potencial de TLK199 en el tratamiento de citopenias inducidas por la quimioterapia. Sería deseable desarrollar potentes inhibidores de GST P1-1 para usarse en humanos para potenciar los efectos citotóxicos de los agentes quimioterapéuticos en las células tumorales, ejercer selectivamente la citotoxicidad en las células tumorales, elevar la producción de progenitores GM en la médula ósea, estimular la diferenciación de la medula ósea, estimula la diferenciación de la médula ósea, mitigar los efectos mielosupresivos de los agentes quimioterapéuticos y modular la hematopoyesis en la medula ósea. Breve Descripción de la Invención En un primer aspecto esta invención se refiere a compuestos de la fórmula
en la cual X es L-?-glutam?lo o L-?-glutam?lgl?c?lo, Y es H, alquilo opcionalmente sustituido, heteroalquilo opcionalmente sustituido, a rilo opcionalmente sustituido, aralquilo opcionalmente sustituido, heteroaplo opcionalmente sustituido, o heteroaralquilo opcionalmente sustituido, y Z es C5_9 alquilo, aplo opcionalmente sustituido, aralquilo opcionalmente sustituido, heteroaplo opcionalmente sustituido, o heteroaralquilo opcionalmente sustituido, y sus mono- y di-esteres de C-t-io alquilo, fen?l-d-3 alquilo o (C5 6 heteroar?l)-C-?-3 alquilo, y sales de los compuestos y sus mono- y di-ésteres Los compuestos (especialmente en forma de ácido) son inhibidores, típicamente inhibidores selectivos de GST P1-1 in vitro En la forma de diéster, también han mostrado ser efectivos en la inmunoprecipitación de GSTp de las células HL-60 in vitro, y que son citotóxico para las células HL-60 m vitro También son activos en la mejora de la diferenciación de las células HL-50 m vitro, y se ha mostrado que mejora la formación de colonias de granulocitos/monocitos de las células de médula ósea de murma ex vivo Por esto y por la similaridad estructural da TLK117, TLJK199, y compuestos relacionados, de los compuestos de esta invención por lo tanto se espera que actúen de forma terapéutica en los humanos para potenciar los efectos citotóxicos de los agentes quimioterapéuticos de células tumorales, ejercer selectivamente citotoxicidad en las células tumorales, elevar la producción de
progenitores GM en la médula osea, estimular la diferenciación de las células de médula ósea mitigar los efectos mielosupresores de los agentes quimioterapeuticos, y modular la hematopoyesis en la médula ósea En un segundo aspecto la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contiene un compuesto del primer aspecto de esta invención y opcionalmente uno o más excipientes En un tercer aspecto la invención se refiere a métodos terapéuticos particularmente en humanos para uno o más de potenciar los efectos citotoxicos de agentes quimioterapéuticos en células tumorales, ejercer selectivamente la toxicidad en células tumorales, elevar la producción de los progenitores GM en la médula ósea, estimular la diferenciación de las células de médula ósea, mitigar los efectos mielosupresores de los agentes quimioterapéuticos, y modular la hematopoyesis en la médula ósea, por medio de la administración de compuestos del primer aspecto de la invención o una composición farmacéutica del segundo aspecto de esta invención, y el uso de los compuestos de los primeros aspectos de esta invención en la manufactura de un medicamento para uno o más de potenciar los efectos citotóxicos de agentes quimioterapéuticos en células tumorales, ejercer selectivamente la toxicidad en células tumorales, elevar la producción de los progenitores GM en la médula osea, estimular la diferenciación de las células de médula osea, mitigar los efectos mielosupresores de los agentes quimioterapeuticos, y modular la hematopoyesis en la
médula ósea. En un cuarto aspecto, esta invención se refiera a método para preparar compuesto del primer aspecto de la invención. En un quinto aspecto, la invención se refiere a compuestos de la fórmula
en la cual: X es N-a-R1-L-?-glutamilo o ?-a-R1-L-?-glutamilglicilo, en la cual R1 es un grupo de protección de amina; y Y y Z son como se definen para los compuestos del primer aspecto de esta invención y sus y sus mono- y di-ésteres de C^o alquilo, fenil-C?-3 alquilo o (C5-6 heteroaril)-C-,.3 alquilo; y sales de los compuestos y sus mono- y diésteres. Estos compuestos son útiles como intermedios en la preparación de los compuestos del primer aspecto de esta invención.
Las modalidades preferidas de esta invención se caracterizan por la especificación y por las características de las reivindicaciones 2-20 de esta aplicación tal como se presento, y las composiciones farmacéuticas, composiciones, métodos y usos de esos compuestos. Descripción Detallada de la Invención Definiciones
"Alquilo" significa un grupo monovalente derivado de hidrocarburos d 10 preferentemente d 6 saturados o insaturados (pero no insaturados aromáticamente) que pueden ser lineal, ramificado o cíclico por medio del retiro de un átomo de hidrógeno de un átomo de carbono, tal como metilo, etilo, propilo, 1-propen?lo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, tert-butilo, pentilo, hexilo, ciclopentilo, c?clopenten-1 -lio, ciclopropilmetilo, ciclohexilo, y ciclohexilmetilo Alquilos y d-C6 alquilos saturados son ejemplares Notar que la definición de "alquilo en esta solicitud es más amplia que la definición convencional e incluye grupos más comúnmente referidos como "cicloalquilo", "cicloalquiloalquilo", "alquenilo", y "alqumilo" Un "alquilo sustituido" es un alquilo sustituido con hasta tres átomos de halógeno y/o un sustituyente seleccionado de -CN, -NO2, -OR, y -NR2 (en la cual cada R es independientemente H o d 3 alquil) Así, por ejemplo, grupos alquilo sustituidos incluyen aquellos grupos como tpfluorometilo y 3-cloroprop?lo Los grupos C5.6 cicloalquilo sustituidos son ciclopentilo y ciclohexilo, sustituidos con 1 o 2, especialmente 1, grupo seleccionado de halo, hidroxi, metilo, tpfluorometilo, y metoxi, especialmente flúor, cloro, o metilo "Heteroalquilo" significa "alquilo" (como se define antes) en el cual 1 o 2 de los grupos metileno están reemplazados por O, S, S02, o NR (en donde R es H o d 3 alquilo), incluyendo grupos lineales tales como 3-oxapent?lo, anillos monociclicos que contienen 5 o 6 átomos tales como 2-tetrah?drofuran?lo, 2-p?rrol?d?n?lo, 3-p?per?d?n?lo,
2-p?peraz?n?lo, 4-d?h idropí ran lio, y 3-morfol?n?lo, y grupos tales tetrah?drofuran-2-?lmet?lo y p?per?d?n-3-?loet?lo Los grupos C56 cicloheteroalquilo preferidos son ciclopentilo o ciclohexilo en los cuales 1 de los grupos de metileno del anillo está reemplazado por O, S, S02, NH, o N-metilo, e incluyen 2- y 3-tetrah?drofuran?lo, 3- y 4-tetrah?drop?ran?lo, 4-tetrah?drot?op?ran?lo y sus S, S-dióxidos, y 2-, 3-, y 4-p?per?d?n?lo Un "heteroalquilo sustituido" es un heteroalquilo sustituido de la manera descrita antes para el alquilo sustituido "Aplo" significa un grupo monovalente derivado de un hidrocarburo aromático que contiene de 6-14 átomos de carbono de carbono por medio del retiro de un átomo de hidrógeno de un átomo de carbono y puede ser monociclico (tal como fenil), policiclico condensado (tal como naftil), o policíciico enlazado (tal como bifenilil) "Aplo sustituido" significa aplo sustituido con hasta 3 sustituyentes seleccionados de halo, -CN, -NO2, -OH, Ci 3 alquilo opcionalmente sustituido con halo (por ejemplo etilo, tpfluorometil), CT 3 alquiloxi opcionalmente sustituido con halo, fenoxi, (C5.6 heteroar?l)ox?, formilo, carboxi, 3 alcoxicarbonilo, y -NR2 (en la cual cada R es independientemente H o C, 3 alquil) "Aralquilo" significa alquilo sustituido con a rilo, tal como bencilo y fenetilo "aralquilo sustituido" significa aralquilo en el cual uno o ambos de entre a rilo y alquilo están sustituidos descritos de la manera descrita antes para el a rilo y alquilo sustituidos "Halógeno" o "halo" significa F, Cl, o Br
"Heteroaplo" significa un grupo monovalente derivado de un hidrocarburo aromático que contiene 5-14 átomos de carbono por medio el retiro de un átomo de hidrogeno de un átomo de carbono, en el cual 1-4 átomos de carbono del anillo se reemplazan por O, S, N, o NR (en la cual R es H o d 3 alquil), y puede ser monociclico conteniendo 5 o 6 átomos de anillo (tal como fuplo, tienilo, pirro lo, oxazolilo, imidazolilo, pipdimlo, pirazmilo, pipdazmilo, y pirimidmil), bicíclico condensado tal como (benzimidazolilo, benzotpazolilo y quinohl), o bicíc co enlazado especialmente (C56 heteroapl) -fenil tal como 4-(2-p?r?d?l)fen?l Los gurpos C5.6 heteroaplo preferidos son 2-y 3-fur?lo, 2- y 3-t?en?lo, y 2-, 3-, y 4-p?pd?nilo "Heteroaplo sustituido" significa heteroaplo sustitudí de la manera antes descrita para a rilo sustituido "Heteroaralquilo" significa alquilo sustituido con heteroaplo, tal como 2-p?rrol?lmet?lo "heteroaralquilo sustituido" significa heteroaralquilo de la manera descrita antes para alquilo sustituido Las "sales" se describen en la sección titulada "Compuestos de la invención" Un "grupo de protección de amina" es un grupo capaz de proteger el grupo glutamil a-amina de un compuesto del primer aspecto de esta invención o un intermedio durante la síntesis de ese compuesto y subsecuentemente retirable sin afectar al resto del compuesto del primer aspecto de esta invención Grupos de ese tipo comunes incluyen tert-butoxicarbonilo y benciloxicarbonilo, retirables convenientemente por acidolisis, con benciloxicarbonilo que también
puede ser retirable convenientemente por medio de hidrogenación catalítica Los grupos de protección de amina son bien conocidos en el campo de la síntesis orgánica y particularmente la síntesis de péptidos Grupos adecuados y condiciones para su retiro se describen en libros tales como Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, Workbench edition, M Goodman, ed , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 2004, y Protective groups m organic synthesis, 3 ed , T W Greene y IP G M Wuts, eds , John Wiley & Sons, Ine , New York, New York, U S A , 1999, y serán conocidos para los expertos en la técnica Una "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad que cuando se administra a un mamífero especialmente un humano para tratar una condición es suficiente para efectuar el tratamiento del condición "tratar" o "tratamiento" de una condición en un mamífero incluyen uno o mas de los siguientes (1) inhibir el desarrollo de la condición, esto es detener su desarrollo
(2) curar la condición, esto es provocar el retroceso de la condición,
(3) prevenir la recurrencia de la condición, y (4) aliviar los síntomas de la condición Los compuestos de la invención y su preparación Los compuestos del primer aspecto de esta invención son compuestos de la formula
en la cual X es L-?-glutam?lo o L-?-glutam?lgl?c?lo, Y es H, alquilo opcionalmente sustituido, heteroalquilo opcionalmente sustituido, aplo opcionalmente sustituido, aralquilo opcionalmente sustituido, heteroaplo opcionalmente sustituido, o heteroaralquilo opcionalmente sustituido, y Z es C5_9 alquilo, aplo opcionalmente sustituido, aralquilo opcionalmente sustituido, heteroaplo opcionalmente sustituido, o heteroaralquilo opcionalmente sustituido, y sus mono- y di-ésteres de d-10 alquilo, fen?l-d-3 alquilo o (C5-6 heteroar?l)-C? 3 alquilo, y sales de los compuestos y sus mono- y diésteres Los compuestos preferidos del primer aspecto de esta invención incluyen aquellos compuestos que tienen una o más de las siguientes características 1 X es L-?-glutam?lo, 2 Y es C5 6 cicloalquilo opcionalmente sustituido, C5.6 cicloheteroalquilo opcionalmente sustituido, fenilo opcionalmente sustituido, o C5 e heteroaplo opcionalmente sustituido, especialmente Y es ciclopentilo, ciclohexilo, tienilo, fuplo, pipdmilo, o fenilo opcionalmente sustituido, más especialmente ciclohexilo o más especialmente fenilo, opcionalmente sustituido con 1 o 2 de flúor, cloro, metilo, hidroxi, metoxi, o grupos tpfluorometilo, en la cual el fenilo está insustituido o está sustituido y uno de los sustituyentes está en la posición 4, particularmente en la cual solo hay un
sustituyente, 3 Z es C5 9 alquilo, o es fenil, 1- o 2-naft?lo, 2-, 3-, o 4-b?fen?l?lo, o 2- 3-, o 4-(C56 heteroar?l)fen?lo, cada uno opcionalmente sustituido con
1 a 3 grupos halo, ciano, hidroxi, carboxi, tpfluorometilo, o -R, -OR, - COOR, o -NR2 (en la cual R es C1 3 alquil), especialmente fenil o 2-,
3-, o 4-b?fen?l?lo, o 2-, 3-, o 4-(C5 6 heteroar?l)fen?lo, cada uno opcionalmente sustituido con flúor, cloro, ciano, hidroxi, metoxi, metilo, o tpfluormetilo, 4A el compuesto es un diácido, o 4B el compuesto es un diéster, especialmente un diéster de C-?.6 alquilo, más especialmente un diéster de Ci 3 alquilo Generalmente un compuesto que tenga un gran número de esas características se prefiere sobre un compuesto que tenga un número menor de esas características, en particular, la adición de una de esas características a un compuesto que tenga menos de todas las características generalmente dará como resultado un compuesto que es preferido sobre un compuesto sin esta característica Sales adecuadas [ver Berge et al , J Pharm Sci , 661 (1971) que presenta una lista no exclusiva] de los compuestos de esta invención son aquellos formados cuando las bases inorgánicas (por ejemplo hidróxido de sodio, potasio y calcio) o bases orgánicas (por ejemplo etapolammas, dietanolamina, tpetanolamina, etilenodiamina, trometamma, N-metiIglucamina) reaccionan con grupos carboxilo, y aquellos formados con ácidos inorgánicos (por ejemplo ácido
clorhídrico, bromhídpco, sulfúrico, nítrico, y clorosulfónico) o ácidos orgánicos (por ejemplo ácidos acético, propiónico, oxálico, mélicos, malíco, malónico, fumárico o tartárico y alcano- o arenosulfónico tales como ácidos metansulfonicos, etanolsufonicosm bencenosulfónicos, bencenosulfónicos sustituidos tales como ácidos clorobencenosulfónico y toluensulfónico, naftalensulfónico y naftalensulfónico sustituido, naftaendisulfónico y naftalendisulfónico sustituido y canforsulfónicos) reaccionan para formar sales de adición acidas de grupos amina, de los compuestos Esas sales se forman preferentemente con ácidos y bases farmacéuticamente aceptables Las sales adecuadas para los compuestos son sales de adición de ácido, especialmente sales de clorhidrato La preparación de los compuestos del primer aspecto de la invención por medio del proceso de esta invención incluye a) oxidar un compuesto (un "compuesto de sulfuro") de la fórmula
?
en la cual X es L-?-glutam?lo o L-?-glutam?logl?c?lo, o es N-a-R1-L-?-glutam?lo o N-a -R1-L-?-glutam?logl?c?lo, en la cual R es un grupo de protección de amina y Y y Z son como se definen para los compuestos del primer aspecto de esta invención,
o sus , y sus mono- y di-ésteres de C1-10 alquilo, fenil-C 1 -3 alquilo o (C5-6 heteroapl)-C?.3 alquilo, y sales de los compuestos y sus mono- y di-ésteres para dar un compuesto del primero o quinto aspecto de esta invención, (b) si Y es N-a-R -L-?-glutam?lo o N-a-R1 -L-?-glutamiloglicilo, desproteger la sulfona resultante que es un compuesto del quinto aspecto de esta invención para dar un compuesto del quinto aspecto de esta invención, y opciopalmente c) si el compuesto del primer aspecto de esta invención preparado en la etapa (a) o la etapa (b) es un diácido, formar un mono- o diéster del compuesto, o d) si el compuesto preparado en la etapa (a) o (b) es un mono- o diéster, desestepficar el compuesto para preparar el diácido del compuesto, y (e) formar una sal del compuesto preparado en una de las etapas (a) a (d) En la etapa (a), el átomo de azufre se oxida para preparar un compuesto del primer aspecto de esta invención (si el grupo glutamil amina no está protegido) o un compuesto del quinto aspecto de esta invención (si el grupo glutamil amina está protegido por R1). Típicamente el compuesto de sulfuro se disuelve en un solvente adecuado, un agente oxidante se agrega y la mezcla de reacción se mantiene durante un tiempo suficiente y a una temperatura suficiente para completar la oxidación Las combinaciones adecuadas de solvente/oxidante incluyen
combinaciones ácido C2 3 alcanoico/peróxido de hidrógeno/ácido peroxialcanóico tales como ácido acético/ácido peroxiacético y ácido acético/peróxido de hidrógeno/ácido peoxiacético y el uso de ácidos C2"3 peroxialcanoicos o ácido peroxitpfluoroacético tanto como solvente y oxidante Después de sofocar el exceso de oxidante con un reactivo tal como sulfuro de dimetilo, el compuesto del primer (o quinto) aspecto de esta invención es asilado simplemente por medio de concentración Las combinaciones particularmente adecuadas de solvente/oxidante incluyen combinaciones en las cuales la oxidación tiene lugar en un sistema bifásico, con el compuesto de sulfuro disuelto en un solvente aprótico no polar tal como un éster (por ejemplo acetato de isopropil) y el oxidante se encuentra en solución acuosa Los oxidantes adecuados para esas oxidaciones bifásicas incluyen boratos y compuestos peroxi tales como perboratos y persulfatos, por ejemplo persulfato de amonio, sodio o potasio y un oxidante particularmente adecuado es monopersulfato de potasio, tal como OXONE™ (2KHS051KMS04-K2S04) Después de la separación de las fases acuosas y no acuosas, y el lavado opcional de la fase no acuosa para asegurar el retiro completo de cualquier oxidante, el compuesto del primer (o quinto) aspecto se aisla de la fase no acuosa por medio de concentración En la etapa opcional (b) el grupo amina protegido con R de un compuesto del quinto aspecto de esta invención se desprotege para preparar un compuesto del primer aspecto de esta invención El compuesto del quinto aspecto de esta invención puede
desprotegerse por medio de cualquier método adecuado para retirar el grupo de protección de amina que no afecte también el resto de la molécula Cunado el grupo de protección de amina es un grupo retirable acidolíticamente, es conveniente desprotegido por el uso de un ácido fuerte, tal como ácido tpfluoroacetico opcionalmente en la presencia de diclorometano Cuando el grupo de protección de amina es un grupo de protección de amina removióle catalíticamente, es convenientemente desprotegido por medio de reducción o isomepzación catalítica, aun cuando esos grupos tales como benciloxicarbonilo, generalmente considerados como catalíticamente removibles, también pueden retirarse acidolíticamente Para la reducción catalítica típicamente el compuesto se disuelve en un solvente adecuado tal como Ci 4 alcanol, o un solvente prótico polar, o en un solvente aprótico no polar, especialmente en la presencia de agua, por ejemplo acetato de isopropilo en la presencia de agua y se pone en contacto con hidrógeno o donador de hidrógeno tal como ciclohexeno o 1 ,4-c?clohexanod?eno en la presencia de un catalizador de reducción, típicamente un catalizador de paladio tal como negro de paladio, paladio sobre sulfato de bario, y paladio sobre carbono Para la isomepzación catalítica, se usa un complejo de paladio cerovalente tal como tetrak?s(tr?fen?lfosf?na)palad?o (0), típicamente en la presencia de un depurador de grupo a lo nucleofilico tal como una amina secundaria Después de retirar el catalizador el compuesto del primer aspecto de esta invención se aisla típicamente como una sal de adición acida, (en la etapa opcional (e))
En las etapas opcionales (c) y (d), el compuesto del primer aspecto de esta invención se estepfica (si se desea un diácido y un éster), o se des-estepfica (si se desea un éster y el diácido) Esas estepficaciones o des-estepficaciones son convencionales y pueden realizarse por medio de cualquiera de los métodos bien conocidos para las personas con experiencia ordinaria en la técnica, en particular una técnica de estepficación conveniente incluye la reacción del compuesto diácido del primer aspecto de esta invención con el alcohol que produce el éster deseado, usando el alcohol como solvente en la presencia de un halosilano tal como clorotpetilsilano a temperaturas entre la temperatura ambiental y la temperatura de ebullición el alcohol En la etapa opcional (e), se forma una sal del compuesto del primer aspecto de esta invención Esta típicamente será una sal de adición de ácido (ver la anterior definición de "sales") Convenientemente esto se realiza inmediatamente después que el compuesto de esta invención se ha formado, y puede lograrse por medio de la adición de un solvente que se volverá un anti-solvente para la sal, tal como un solvente aprótico, por ejemplo un hidrocarburo o hidrocarburo halogenado tal como diclorometano, seguido por la adición del ácido seleccionado para formar la sal, especialmente en la forma de ácido anhidro solo o en un solvente aprótico, por ejemplo gas de cloruro de hidrógeno Otro anti-solvente para la sal, por ejemplo éteres de dietil, éter de metil tert-butilo, y tetrahidrofurano, especialmente éter metil tert-butilo, puede agregarse si es necesario o se desea Los materiales de partida para el proceso (los "compuestos de
sulfuro") son tppeptidos y tetrapéptidos, opcionalmente mono- o diestepficados, opcionalmente protegidos en la amina de glutamilo, y con el azufre de cisterna alquilado con un grupo Z-CH2 Esos análogos de glutation S-alquilado se preparan convenientemente por medio de métodos convencionales de síntesis de péptido bien conocidos para las personas de experiencia ordinaria en la técnica Cuando no se cuenta con una cisterna S-alquilada apropiada para la síntesis del peptido, la síntesis del péptido puede realizarse usando uno de los muchos grupos de protección S estándar, tal como tpfenilmetilo, y el péptido protegido S puede entonces desprotegerse por ejemplo por medio de acidolisis Típicamente el péptido protegido con S se disuelve en un acido que es lo suficientemente fuerte para retirar el grupo de protección de azufre retirable de forma acidolíticamente pero no lo suficientemente fuerte para retirar cualquier grupo de protección de amina, opcionalmente en la presencia de un depurador Ácidos adecuados de ese tipo incluyen ácido tpfluoroacéitco y otros ácidos fuertes tales como ácido tpflurometansulfónico, opcionalmente en la presencia de un cosolvente tal como diclorometano, los depuradores adecuados incluye éteres aromáticos y sulfuros tales como anisol y tioanisol, fenoles tales como cresol y más eficientemente silanos incluyendo tpalquilsilanos tales como tpetilsilanos y trnsopropilsilano y polímeros de silano tales como pol?(met?lh?drox?loxano), y un reactivo de desproteccion particularmente adecuado es el ácido tpfluoroacético en la presencia de pol?(met?lh?dros?loxano) El péptido
desprotegido S puede aislarse de la mezcla de reacción por medio de la adición de un anti-solvente, por ejemplo un solvente aprótico no polar tal como un hidrocarburo o un éter Entonces el anión de tiolato del péptido S-desprotegido se alquila con un compuesto de la fórmula Z-CH2-L, en la cual L es un grupo de partida tal como un halógeno (cloro o bromo) o un sulfonato de alcano o areno opcionalmente sustituido para preparar el péptido S-alquilado apropiado Esto se realiza convenientemente cuando la amina de glutamilo está desprotegida, para minimizar las reacciones secundarias, pero puede realizarse aun cuando la amina está desprotegida Típicamente, el péptido S-desprotegido se disuelve en una solución de una base fuerte [por ejemplo un hidróxido, carbonato, bicarbonato, fosfato o alcóxido de metal alcalino o alcalinotérreo o hidróxido de amonio, o una base de amina orgánica tal como tetrametilguanidina, DBU (1 ,8-d?azab?c?clo[540]undec-7-eno), y similares) en un solvente adecuado (por ejemplo a Ci 6 alcanol, un diol tal como 1 ,2-etanod?ol o 1 ,3-propanod?ol, un éter tal como 2-metoxietanol, 1 ,2-d?metox?etano, o tetrahidrofurano, y similares) para formar el anión de tiolato, el compuesto de la fórmula Z-CH2-L se agrega (típicamente en exceso), y la mezcla de reacción se mantiene a una temperatura y durante el tiempo apropiados hasta su finalización Las condiciones de reacción convenientes son el uso de 20% de tetrahidrofurano en agua y un exceso aproximadamente diez veces de bicarbonato de sodio
Los compuestos de sulfuro también pueden prepararse de la siguiente manera: una cisteina (opcionalmente protegida) se alquila con un grupo Z-CH2- apropiado, y el tripéptido o tetrapéptido entonces se forma por métodos estándar de la síntesis de péptidos, acoplando primero con el aminoácido de la fórmula:
Y H2N"^COOH y entonces con la L-?-glutamina o L-?-glutamiloglicina (opcionalmente protegida); o acoplando primero con la L-?-glutamina o L-?-glutamiloglicina (opcionalmente protegida) y luego con el aminoácido de la fórmula Y
HgM OOH Muchos de los aminoácidos de la fórmula
H2N COOH tales como D-fenilglicina, D-(4-clorofenil)glicina, D-(4-hidroxifeni)glicina, D-(3-tienil)glicina, y D-cicIohexiloglicina, están disponibles comericalmente en forma redisuelta y en algunos de los casos como esteres. Otros están disponibles en forma racémica, pero pueden redisolverse por alguno de los métodos conocidos para la resolución de aminoácidos. Sin embargo otros pueden prepararse por medio de métodos conocidos para la síntesis de aminoácidos. Los compuestos de sulfuro pueden prepararse como diácidos
(aunque esto puede incluir la protección intermedia del glutamilo a-carboxilo así como la amina) o como mono- o diésteres, dependiendo del estado de los aminoácidos de partida Si el compuesto de sulfuro se prepara como un diácido, puede mono- o diestepficarse (típicamente mientras es protegido con amina) antes de la oxidación del sulfuro a la sulfona, y las condiciones de estepficación típicamente serán similares a las que pueden usarse para la estepficacion de un compuesto del primer aspecto de esta invención Una persona con una experiencia normal en la técnica no tendrá dificultad en considerar esa experiencia y esta descripción (incluyendo los ejemplos) parra preparar los compuestos de los aspectos primero y quinto de esta invención Usos de los compuestos y procesos Los compuestos del primer aspecto de la invención (especialmente en la forma de ácido) son inhibidores, típicamente inhibidores selectivos de GST P1-1 También presentan actividad para mejorar la diferenciación de las células HL-60 m vitro, y se ha mostrado que mejoran la formación de colonias de granulocitos/monocitos de las células de médula ósea de mupna ex vivo De los compuestos de esta invención por lo tanto se espera que actúen de forma terapéutica en los humanos para potenciar los efectos citotóxicos de los agentes quimioterapéuticos de células tumorales (porque GST, especialmente GST P1-1, que está elevado en muchos de los tejidos tumorales, se implica en la resistencia de células tumorales de agentes quimioterapéuticos, de tal forma que un inhibidor GST
reducirá la capacidad de las células tumorales a eliminar el agente quimioterapéutico), ejercer selectivamente citotoxicidad en las células tumorales, elevar la producción de progenitores GM en la médula ósea, estimular la diferenciación de las células de médula ósea, mitigar los efectos mielosupresores de los agentes quimioterapéuticos, y modular la hematopoyesis en la médula ósea Los compuestos del quinto aspecto de esta invención y el proceso del cuarto aspecto de esta invención son útiles en la preparación de compuestos del primer aspecto de esta invención El segundo aspecto de esta invención es composiciones farmacéuticas que contengan un compuesto del primer aspecto de esta invención, opcionalmente incluyendo también un excipiente, tal como un excipiente farmacéuticamente aceptable, métodos terapéuticos que consisten en administrar esos compuestos o una composición farmacéutica que los contenga, típicamente en una cantidad terapéuticamente efectiva y el uso de esos compuestos en el tratamiento del cáncer y para la manufactura de medicamentos para el tratamiento del cáncer Los compuestos pueden administrarse por medio de cualquier ruta adecuada para el sujeto que está siendo tratado y la naturaleza de la condición del sujeto Las rutas de administración incluyen pero no se limitan a la administración por inyección, incluyendo inyección intravenosa, intrapeptoneal, intramuscular, y subcutánea, por medio de administración transmucosa o transdermal, por medio de las aplicaciones tópicas, el rocío nasal, supositorios y similares o pueden
administrarse oralmente Las composiciones farmacéuticas que contienen esos compuestos pueden opcionalmente ser formulaciones de liposomas, emulsiones, formulaciones diseñadas para administrar el medicamento a través de las membranas mucosas o formulaciones transdermales Las formulaciones adecuadas para cada uno de esos métodos de administración pueden encontrarse por ejemplo en Remmgton The Science and Practice of Pharmacy, 20 ed , A Gennaro, ed , Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pennsylvania, EE UU , 2003 Las composiciones típicas serán ya sea orales o soluciones para la infusión intravenosa y contendrá el compuesto y típicamente también contendrá el compuesto y típicamente también contendrá uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables Las formas de dosificación típicas serán tabletas, soluciones para infusión intravenosa y polos liofilizados para la reconstitución como soluciones para la infusión intravenosa Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto del primer aspecto de esta invención es de aproximadamente 10 - 2000 mg/m2 de área de superficie corporal, especialmente 50 - 1000 mg/m2 La administración puede realizarse en intervalos de 1 - 35 días, por ejemplo, aproximadamente 250 - 1000 mg/m2, en intervalos de 1-5 semanas, especialmente intervalos de 1,2,3 o 4 semanas, o a frecuencias mayores incluyendo tan frecuentemente como una vez al día durante varios días (5 o 7), repitiéndose la administración cada 2,3 o 4 semanas o la infusión constante durante un periodo de 6-72 horas, también con la administración repetida cada 2,3 o 4 días Un régimen
típico puede incluir la administración una vez al día durante cinco días cada tres semanas Preparaciones y Eiemplos Los siguientes ejemplos muestran las preparaciones de los intermedios útiles y la síntesis de los compuestos de esta invención por medio de los procesos de esta invención, y la utilidad de los compuestos del primer aspecto de esta invención como agentes terapéuticos Las preparaciones 1 y 2 describen preparaciones de reactivos para la S-alquilacion de cisterna o la cisterna de los tppéptidos y tetrapéptidos (los "compuestos de sulfuro") Por conveniencia, los reactivos son llamados como derivados de bromuro de bencilo (a-bromotolueno) Preparación 1 Preparación de bromuro de 4-(2-pr?r?d?l)benc?lo 4-(2-P?pd?l)tolueno, 2 mL (1 98 g, 11 7 mmol), N-bromosuccinimida (NBS), 25 g (140 mmol), y a,a'-azob?s(?sobut?ron?tr?l) (AIBN), 23 mg (0 14 mmol) se suspendieron en
35 mL tetraclorometano, y se reflujaron durante 24 horas El producto se filtró, y el solvente se retiro del filtrado por medio de filtrado por evaporación rotatoria Cantidades iguales de cloroformo y agua se agregaron y el producto se extracto La capa de cloroformo se separo y se secó y el solvente se retiro El bromuro de 4-(2-p?r?d?l)benc?lo, se obtuvieron 2 g, como un solido amarillo pegajoso Preparación 2 Preparación de bromuro de 4-(2-metox?fen?l)benc?lo 4-bromotolueno, 171 mg (1 mmol), ácido 2-metox?fen?lborón?co,
152 mg (1 mmol), diacetato de paladio, 1 mg (4 µmol), de bromuro de ?/-but?lamon?o 322 mg (1 mmol), y Na2C03 acuoso 2M, 1 9 mL (38 mmol), se colocaron en un recipiente a presión para microondas y se calentó a 150° C durante 5 minutos Después de enfriar a la temperatura ambiente, el producto se vertió en un embudo separador y se agregaron 30 mL de agua y éter de dietilo Después de la extracción, las capas se separaron y la capa acuosa se lavó con otros 30 mL de éter de dietilo Los extractos de éter se combinaron se secaron sobre MgS0 , y el solvente se retiro por medio de evaporación rotatoria al vacío 2-metox?-4'-met?lb?fen?lo, 160 mg (rendimiento del 81%) se obtuvo como producto sólido, 95% de pureza por RMN 2-metox?-4'-met?lob?fen?lo, 160 mg (081 mmol), NBS, 158 mg (091 mmol), y AIBN, 1 mg (0006 mmol) se suspendieron en 7 mL tetraclorometano, y se reflujaron durante 24 horas El producto se filtró y el solvente se retiro del filtrado por medio de evaporación rotatoria Se agregaron cantidades iguales de éter de dietielo y agua y el producto se extracto La capa de éter se separo y se seco sobre MgSO , se filtro y el solvente se retiro, se obtuvieron 128 mg de bromuro de 4-(2-metox?fen?l)benc?lo, El bromuro de 4'-(2-c?anofen?l)benc?lo puede prepararse a partir de ácido 2-c?anofen?lboron?co por este método Otros bromuros de bencilo con fenilo opctonalmente sustituido o heteroaplo C56 opcionalmente sustituido puede prepararse fácilmente por medio de los métodos de estas preparaciones
La preparación 3 describe la preparación de cisteina S-alquilada Preparación 3 Preparación de ?/-a-(tert-butoxicarbon?l)-S'-(4-b?fen?l?lmet?l)-L-c?ste?na N-a-(tert-butox?carbon?l)-L-c?ste?na, 1 0 g (452 mmol), se disuelve en una mezcla de 9 mL de tetrahidrofurano y 9 mL de NaOH acuoso 1M que había sido desgasificado al burbujear argón a través del mismo Una solución de 4-(bromomet?l)b?fen?lo, 1 12 g (453 mmol), en 5 mL tetrahidrofurano (THF), se agrego a la solución agitada bajo burbujeo de argón durante 8 horas a la temperatura ambiente El THF se retiro por medio de evaporación rotatoria al vacío y el residuo se diluyó con agua y se lavó con éter de dietilo La fase acuosa se acidifico a un pH de 3 con HCl acuoso 6M, y se extracto tres veces con acetato de etilo Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua, NaHC03 acuoso saturado, agua, y salmuera y entonces se secó y concentró para dar 1 44 g N-a-(tert-butox?carbon?l)-S-(4-b?fen?l?lmet?l)-L-c?ste?na (rendimiento del 82%) como sólido blanco mate Otras cisternas S-alquiladas (opcionalmente protegidas) pueden prepararse fácilmente por medio del método de esta preparación Las preparaciones 4 a 6 describen la preparación de algunos "compuestos de sulfuro" Preparación 4 Preparación de L-?-glutam?l-J'-[(4-b?fen?l?l)met?l]-L-cisteinil-D-femlglicina L-?-glutam?l-S-[(4-b?fen?l?l)met?l]-L-c?ste?n?l-D-fen?lgl?c?na, como
la sal de clorhidrato se preparo a partir de 330 mg N-a-(benc?lox?carbon?l)-L-?-glutam?l-L-c?ste?n?l-D-fen?lgl?c?na al disolver el péptido protegido con amina en acetonitplo/agua, agregando aproximadamente un exceso de 10 veces el bicarbonato de sodio, y agregar un ligero exceso de 4-(bromomet?l)b?fen?lo, manteniendo entonces la reacción bajo nitrógeno hasta su finalización La mezcla de reacción se diluyo con agua, se lavo con éter de dietilo y la fase acuosa se separó y acidificó a un pH de 2-3 con ácido clorhídrico, luego se extracto con acetato de etilo La fase orgánica se seco sobre MgS04, se filtro, y el volumen se redujo para dar N-a-(benciloxica rbon ?l)-L-?-g I u tamil- S-[(4-b?fen ilil) met?l)-L-c?ste?n?l-D-fenilglicina El compuesto de sulfuro protegido con amina, aproximadamente 300 mg se disolvió en 2mL de 954 ácido tpfluoracético (TFA) diclorometano con 1 gota de agua y se agitó a 45° C durante la noche y se purifico por medio de HPLC preparativa para dar L-?-glutam?l-S-[(4-b?fen?l?l)met?l)-L-cyste?n?l-D-fen?lgl?c?na La L-?-glutam?l-S-[(4-b?fen?l?l)met?l)-L-c?ste?n?l-D-fen?lgl?c?na se aisló en forma de sal de clorhidrato Si se desea el compuesto de sulfuro protegido con amina podría haberse tomado directamente a la etapa de oxidación (a) para preparar un compuesto del quinto aspecto de esta invención Compuestos tales como L-?-glutam?l-S-{[4-(2-p?pd?l)fen?l]met?lo}-L-c?ste?n?l-D-fen?lghc?na, ysus análogos protegidos con amina se prepararon por medio de métodos similares Otros compuestos de sulfuro que incluyen compuestos de
sulfuro que son mono- y diesteres pueden prepararse fácilmente por medio de métodos similares Preparación 5 preparación de ester de dietilo de L-?-glutam?l-S-[(4-b?fen?l?l)met?l]-L-c?ste?n?l- D-feniighcina El éster de dietilo de L-?-glutam?l-S-[(4-b?fen?l?l)met?l]-L-cistemil- D-feniIghcina en forma de la sal de clorhidrato se preparo a partir de L-?-glutam?l-S-[(4-b?fen?l?l)met?l]-L-c?ste?n?l- D-femlglicina, 30 mg, por medio de estepficación con etanol y clorotpmetilsilano, dando éster de dietilo de L-?-glutam?l-S-[(4-b?fen?l?l)met?l]-L-c?ste?n?l-D-feniIglicina El ester de dietilo de L-?-glutam?l-S-[(4-b?fen?l?l)met?l]-L-cisteinil-D-femlglicina se aislo como la sal de clorhidrato Compuestos tales como el éster de dietilo de L-?-glutam?l-S-[(4-b?fen?l?l)met?l]-L-c?ste?n?l- D-feniIg cina se prepararon por medio de métodos similares Otros esteres, en particular diésteres, de los compuestos sulfuro pueden prepararse fácilmente por medio de métodos similares Preparación 6 Preparación de L-?-glutam?l-S-[(4-b?fen?l?l)met?l]-L-cisteinil-D-cicIohexiloglicina Se preparo éster de etilo de D-cicIohexiloglicina a partir de D-ciclohexilg cina, 500 mg (3 1 mmol), al suspender el ácido en 15 mL de etanol, agregando clorotpmetilsilano, 2 02 mL (5 equivalente), y calentando la mezcla a 50° C durante 18 horas Los componentes volátiles se retiraron al vació y el residuo se disolvió en acetato de etilo, se lavó con NaHC03 y dos veces con salmuera, se secó sobre MgS04, se filtro y se evaporo para dar 401 mg de éster de etilo de D-
ciclohexiloglicina en forma de un solido aceitoso ?/-a-(tert-butox?carbon?l)-S-(4-b?fen?l?lmet?l)-L-c?ste?na, 588 mg (1 9 mmol), se disolvieron en 5 mL dimetilformamida (DMF), y hexafluorofosfato de 0-benzotr?azol-?/,?/,?/',?/'-tetramet?l-uron?o (HBTU), 860 mg (1 2 equivalentes), y se agregaron d?(?soprop?l)et?loam?na, 990 µL (3 equiv ), y d?(?soprop?l9et?lam?na, 900 µL (3 equiv) Después de 3 minutos se agregó éster de etilo de D-cicIohexiIghcina, 360 mg (1 equivalente), disuelto en 4 mL de DMF, y la mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante 2 horas, luego se aisló el éster de etilo de N-a-(tert-butox?carbon?l)-S-(4-b?fen?l?lmet?l)-L-c?ste?n?l-D-c?clohex?logl?c?na crudo El dipéptido se disolvió en 10 mL de 20% TFA/diclorometano y se agitó a la temperatura ambiente durante 2 horas, luego el producto crudo se aisló al retirar los volátiles al vacio El tpfluoroacetato de S-(4-b?fen?l?lmet?l)-L-c?ste?n?l-D-c?clohex?logl?c?na crudo puede usarse directamente en la siguiente etapa o puede procesarse posteriormente ?/-a-(tert-butox?carbon?l)-0-a-tert-but?l-L-?-glutam?na se disolvieron en 2 mL de DMF, y se agregaron HBTU, 174 mg (1 2 equivalentes) y d??soprop?l)et?lam?na, 230 µL (5 equivalentes) después de 5 minutos, se agregaron tpfluoroacetato de S-(4-b?fen?l?lmet?l)-L-c?ste?n?l-D-c?clohex?logl?c?na, 200 mg (038 mmol), dtsueltos en 2 mL DMF, y la mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante 2 horas La mezcla se vertió en ácido cítrico acuoso 0 1N, y se extracto con acetato de etilo La capa orgánica se
lavó cuatro veces con salmuera, se seco sobre MgS04 y los volátiles se evaporaron para dar ?/-a-(tert-butox?carbon?l)-0-a-tert-but?l-L-?-glutam?l-S-(4-b?fen?l?lmet?l)-L-c?ste?n?l-D-c?clohex?logl?c?na en forma de un aceite café Este se disolvió en 10 mL de 20% TFA/diclorometano y se agitó a la temperatura ambiente durante 24 horas Los volátiles se retiraron al vacio y el producto se purifico por medio de HPLC de fase inversa, luego la L-?-glutam?l-S-(4-b?fen?l?lmet?l)-L-c?ste?n?l- D-cicIohexiloghcina se aisló como la sal de clorhidrato, 47 mg Si se desea al compuesto de sulfuro pudo también tomarse directamente a la etapa de oxidación (a) Se preparo L-?-glutam?l-S-(4-b?fen?l?lmet?l)-L-c?ste?nil-D-(4-clorofen?l)gl?c?na como la sal de clorhidrato por medio de un método similar Ejemplo sintético 1 Síntesis de L-?-glutam?l-3-[(fen?lmet?l)sulfon?l]-L-alanil-D-femlglicina, 1A A 100 mg (02 mmol) de clorhidrato de L-?-glutam?l-S-fen?lmet?l)-L-c?ste?n?l-D-fen?lgl?c?na (clorhidrato de TLK117) disuelto en ácido acético se agregaron 200 µL de una solución al 32% de acido peracetico en ácido acético (095 mmol) La mezcla reacción se mantuvo a la temperatura ambiente, seguido por la reacción por LCMS Al completar la reacción, la mezcla de reacción se concentró al vacío para formar un sólido, luego se tomo en 50% de acetonitplo/agua, se filtró y el residuo se lavó con más acetonitplo/agua El filtrado se 11 of 11 izó luego el residuo y el filtrado se purificaron por medio de HPLC preparativa, y las fracciones que
contienen el producto se volvieron a liofilizar. Después de la disolución en acetonitrilo/agua y la liofilización, luego la trituración con metanol/éter y se seco al vacío, se obtuvo L-?-glutamil-3-[(fenilmetil)sulfonil]-L-alanil-D-fenilglicina, 1A, en forma de un producto sólido, con una pureza de 96% por medio de LC (detección ELSD). El espectro de RMN de protones (DMSO- 6) coincidió con la estructura propuesta. Se prepararon otros dos lotes de forma similar en una escala mayor (0.4 mmol y 11 mmol, respectivamente), usando un exceso de 2.3-2.5 veces de ácido peracético y alterando las proporciones de solvente y cantidades ligeramente. El mismo producto se obtuvo en cada caso. Ejemplo sintético 2. Síntesis de éster de dietilo de L-?-glutamil-3-[(fenílmetil)sulfonil]-L-alanil- D-fenílglicina, 1B. A 123 mg (0.22 mmol) clorhidrato de éster de dietilo de L-?-glutamil-S-(fenilmetil)-L-cisteinil-D-fenilglicina disueltos en 3 mL de ácido acético se agregaron 225 µL de una solución 32% de ácido paracético en ácido acético (1.06 mmol). La mezcla de reacción se mantuvo a la temperatura ambiente, seguido por la reacción por LCMS. Al completar la reacción, la mezcla de reacción se concentró al vacío para formar un sólido, luego se tomo en metanol/sulfóxido de dimetilo/agua y se purifico por medio de HPLC preparativa, y las fracciones que contienen el producto otra vez se liofilizaron se obtuvo éster de dietilo de L-?-glutamil-3-[(fenílmetil)sulfonil]-L-alanil-D-fenilglicina, 1B en forma de un producto sólido. El espectro de RMN de protones (DMSO-d6) coincidió con la estructura propuesta.
Ejemplo sintético 3 Síntesis de ester de dnsopropilo de L-?-glutam?l-3-[(fen?lmet?l)sulfon?l]-L-alan?l- D-femlglicina, 1D A 309 mg (061 mmol) de clorhidrato de L-?-glutam?l-S-(fen?lmet?l)-L-c?ste?n?l-D-fen?lgl?c?na suspendidos en 6 mL de alcohol isorpopí co se agregaron 767 µL de clorotpmetilsilano (605 mmol) La mezcla de reacción se agito bajo nitrógeno a la temperatura ambiente, cuando se formo gradualmente un precipitado blanco La mezcla se calentó a 50° C, se agregaron 300 µL adicionales de clorotpmetilsilano, y la mezcla de reacción se mantuvo a una temperatura elevada Después de varias horas, se encontró que la reacción se había completado en un 85% (siendo el resto monoéster), y el precipitado que se había formado se filtró, lavó con isopropanol, seco (240 mg de rendimiento), disueltos en metanol y se purificaron por medio de CPLC preparativa usando 955 agua/acetonitplo con 001% de ácido clorhídrico como solvente El éster de dnsopropilo, 87 mg (016 mmol) se disolvieron en 2 L de ácido acético y se oxidaron con el uso de una solución de 82 µL de ácido peraético (2 5 equivalentes Al completar la reacción, se agregaron 2 mL de metanol, el producto se purifico por medio de HPLC usando 955 agua/acetonitplo con 001% de ácido tpfluoroacético como el solvente, y las fracciones que contenían al producto se ofi lizaron Se obtuvo clorhidrato de éster de dnsopropilo de L-?-glutam?l-3-[(fen?lmet?l)sulfon?l]-L-alan?l- D-fenilglicina se obtuvo como producto solido, con una pureza del 98% por medio de HPLC El espectro de RMN de protones (DMSO-d6)
coincidió con la estructura propuesta Ejemplo sintético 4 Síntesis de ester de dimetilo de de L-?-glutam?l- 3-[(fen?lmet?l)sulfon?l]-L-alan?l- D-feniIghcma, 1C Se preparo ester de dimetilo de de L-?-glutam?l-3-[(fen?lmet?l)sulfon?l]-L-alan?l- D-fenilglicina, 1C, como sal de clorhidrato, se preparo desde 500 mg (098 mmol) de clorhidrato de L-?-glutam?l-S-(fen?lmet?l)-L-c?ste?n?l-D-fen?lgl?c?na usando el método del ejemplo sintético 3 usando metanol en vez de isopropanol en la estepficacion y oxidando el ester de dimetilo de la misma manera como para el éster dnsopropilo, usándose tres ciclos de disolucion/hofilizacion para la purificación Pureza 98% por HPLC Ejemplo sintético 5 Síntesis de L-?-glutam?l-3-[(4-b?fen?l?lmet?l)sulfon?l]-L-alan?l-D-fen?lgl?c?na, 11A L-?-glutam?l-3-[(4-b?fen?l?lmet?l)sulfon?l]-L-alan?l-D-fen?lgl?c?na, 11A, como la sal de clorhidrato, se preparo en tres etapas a partir de 330 mg ?/-a-(benc?lox?carbon?l)-L-?-glutam?l-L-c?ste?n?l-D-fen?lgl?c?na al disolver el peptido protegido con amina en acetonitplo/agua agregando aproximadamente un exceso de 10 veces de bicarbonato de sodio, y agregar un ligero exceso de 4-(bromomet?l)b?fen?lo, manteniendo entonces la reacción bajo nitrógeno hasta su finalización La mezcla de reacción se diluyó con agua, se lavó con éter de dietilo y la fase acuosa se separo y acidificó a un pH de 2-3 con acido clorhídrico, luego se extrajo con acetato de etilo La fase orgánica se seco sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el volumen se redujo para dar N-a-(benc?lox?carbon?l)-L-?-glutam?l-3-
[(4-bife nililmetil)-sulfonil]-L-aIanil- D-fenílg licina. El sulfuro desprotegido se oxido en la misma manera que en los ejemplos sintéticos previos para dar éster de L-?-glutamil-3-[(4-bifenililmetil)sulfonil]-L-alanil-D-fenilglic¡na, 11A como sal de clorhidrato, pureza 92% por HPLC. Ejemplo sintético 6. Síntesis de L-?-glutamil-3-[(2-bifenílilmetíl)sulfonil]-L-alanil- D-fenílglícina, 4A. L-?-glutamil-3-[(2-bifenililmetil)sulfonil]-L-alanil-D-fen¡lglicina, 4A, como sal de clorhidrato, se preparo en tres etapas a partir de 500 mg N-a-(benciloxicarbonil)-L-?-glutamil-L-c¡steinil-D-fenilglicina usando el método del ejemplo sintético 5, con 2-(bromomeitl)-bifenilo como agente alquilante para el péptido protegido. Pureza 99% por medio de HPLC. Ejemplo sintético 7. Síntesis de éster de dietilo L-?-glutamil-3-[(2-bifenilílmetil)sulfonil]-L-alanil- D-fenilglicina, 4B. Ester de dietilo L-?-glutamil-3-[(2-bifenililmetil)sulfonil]-L-alanil-D-fenílglicina, 4A, como sal de clorhidrato, se preparo a partir de 143 mg de clorhidrato de L-?-glutamil-S-(2-bifenililmetil)-L-cisteinil-D-fenilglicina (un intermedio en el ejemplo 6) por medio de esterificación con etanol y clorotrimetilsilano, luego oxidando el éster de dietilo como en el ejemplo sintético 3. Pureza 94% por HPLC. Ejemplo sintético 8. Síntesis de L-?-glutamil-3-[(2-naftilmetil)sulfonil]-L-alanil-D-fenilglicina, 3A.
Se preparó L-?-glutamil-3-[(2-naftilmetil)sulfonil]-L-alanil-D-fenilglicina, 3A, como la sal de clorhidrato, en tre etapas a partir de ?/-a-(benciloxica rbo nil)-L-?- glut a mil -L-c ¡stein i l-D-fen ilg licina usando el método sintético del ejemplo 5, con 2-(bromometil)naftaleno como el agente alquilante para el péptido protegido. Pureza 92% por HPLC. L-?-glutamil-3-[(5-nitrofuran-2-ilmetil)sulfonil]-L-alanil-D-fenilglicina, 14A, como la sal de clorhidrato, se preparo por un método similar. Pureza 99% por HPLC. Los compuestos representativos del primer aspecto de esta invención se dan en la siguiente tabla 1: Tabla 1. Compuesto de diácido del primer aspecto de esta invención
# denota el punto de unión de A al átomo de azufre de sulfonilo del compuesto Los esteres de dietilo 1B a 12B de los compuestos 1A a 12A se prepararon por uno de los métodos antes descritos; y se analizaron por medio de espectrometría de masa, dando cada compuesto un pico de masa (M/z) correspondiente a su masa, típicamente M + H con ionización positiva, o M-H con ionización negativa. Los esteres de
dimetilo y de dnsopropilo 1C y 1D de diácido 1A también se preparo y analizó por medio de espectrometría de masa, cada compuesto da un pico de masa de M + H con ionización positiva Otros compuestos de esta invención pueden prepararse de manera similar usando métodos bien conocidos para las personas con experiencia ordinaria en la técnica haciendo referencia a sus conocimientos y esta descripción Eiemplos de ensayos in vitro Esos ejemplos ilustran los efectos de compuestos de esta invención (y uno u otros de los compuestos comparadores TLK117 y TLK199 y la "sulfona de vinilo" y su éster de dietilo) en ensayos predictivos in vitro Isoenzimas recombinantes humanas GST P1-1, A1-1 y M-1, y anticuerpo se obtuvieron de EMD Biosciences, Ine , San Diego, California, EE UU El anticuerpo GSTp anti-humano policlonal de conejo se obtuvo de Dakoctyomation, Ine , Carpintería, California, EE UU El anticuerpo IgG de anti-conejo de cabra purificado por afinidad conjugado con IRDyedOO se obtuvo de Rockland Immunochemicals, Ine , Gilbertsville, Pennsylvania, EE UU El linaje celular de cáncer humano HL-60 (leucemia mielocítíca promieloide) se obtuvo del National Cáncer Institute, Bethesda, Maryland, EE UU medio RPMI 1640 y medio Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) se obtuvieron de Invitrogen, Ine , Carlsbad, California, EE UU El equipo de ensayo CelITiter-Glo™ se obtuvo de Promega Corporación, Madison, Wisconsin, EE UU , y se uso de acuerdo con las
instrucciones del fabricante El anticuerpo ant?-CD11b conjugado con ficoeptpna y el anticuerpo de control de isotipo conjugado con ficoeppna se obtuvieron de BD losciences, Ine , San José California, EE UU , medio de metilcelulosa MethoCult™ M3234 (25% de etilcelulosa en IMDM suplementado con suero bovino fetal, albúmina de suero bovino, insulina rh, transferpna h 2-mercaptoetanol y L-glutamina) se obtuvieron de StemCell Technologies, Ine , Vancouver, Canadá, y se diluyo (a una concentración de metilcelulosa de 1%) de acuerdo con las direcciones del fabricante Ejemplo m vitro 1 Inhibición de las insoenzimas de S-transferasa de glutation Este ejemplo ilustra el efecto de los compuestos como inhibidores de las isoenzimas S-transferasa de glutatión GST P1-1, A1-1 y M1-1, m vitro La inhibición de GST P1-1 se considera predictiva de la eficacia en los métodos terapéuticos del tercer aspecto de la invención, debido a que TLK199 (el éster de dietilo de TLK117 probado en estos ensayos) ha mostrado actividad mieloestimulante en humanos y actividad de quimiopotenciación en un modelo animal Las isoenzimas humanas recombinantes GST P1-1, A1-1 y M1-1 se usaron a concentraciones finales de 002, 0011 y 00083 unidades/mL, respectivamente [1 unidad es la cantidad de enzima que conjugara 1 µmol de 1 -cloro-24-d?n?trobenceno (CDNB) para reducir el glutation (GSH) por minuto a 20° C y pH de 65], en amortiguador de ensayo (100 mM K2P04/K2HP04, 0 1 mM EDTA, pH 65 en agua) GSH se preparo como una solución madre de 100 mM
en agua, y CDNB como una solución madre de 100 mM en etanol, y ambas se diluyeron con el amortiguador de ensayo a la concentración apropiada (para dar una concentración final de 2XKm para la isoenzima que se está evaluando) Los compuestos de prueba (diácidos, compuesto 1A a 12A y TLK117) se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se diluyo con DMSO a la concentración apropiada para el ensayo (8 concentraciones en un rango con un punto medio cercano a la IC50 esperado - la concentración que provoca la inhibición del 50% de la actividad enzimática) Para cada ensayo, el compuesto de prueba y GSH se agregaron a la insoenzima Inmediatamente después de la adición de solución CDNB a la solución de isoenzima/compuesto/GSH, la absorbencia a 340 nm se registro continuamente durante 5 minutos en un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices, Ine , Sunnyvale, California, EE UU ) La actividad inhibidora de GST de cada compuesto se calculó a partir de las pendientes de las curvas de absorbencia/tiempo a diferentes concentraciones del compuesto de prueba Todos los ensayos se condujeron en pozos duplicados con control DMSO, manteniéndose la concentración final de DMSO al 2% Los resultados de esos ensayos se dan en la tabla 2 Ejemplo In vitro 2 Citotoxicidad en células HL-60 Este ejemplo ilustra la citotoxicidad de los compuestos de esta invención contra el linaje celular de leucemia humana HL-60 m vitro Las células en fase logarítmica se inocularon en placas de 96 pozos a 1500 células/pozo en un 150 µL de medio RPMI 1640
suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de L-glutamína, y se incubaron a 37° C bajo aire/5% CO2 durante 4-5 horas. Los compuestos de prueba (esteres de dietilo, compuestos 1B a 12B y TLK199) se disolvieron y se diluyeron en serie en DMSO (8 concentraciones en un rango con un punto medio cerca del CC50 esperado). Después de otra dilución 1:50 en el medio RPMI 1640 suplementado, 50 µL de los compuestos diluidos se agregaron para dar una concentración DMSO final de 0.5%. Las células entonces se incubaron durante 72 horas (aproximadamente tres tiempos de suplicación). Las células entonces se cosecharon por centrifugación (1200 rpm durante 5 minutos a 20° C), y 100 µL de la nata del cultivo se retiro y se reemplazo por el mismo volumen del reactivo CelITiter-Glo. Después de la incubación durante 10 minutos a la temperatura ambiente con mezclado constante la placa se leyó con un luminométro, siendo el número de células vivas es proporcional a la luminiscencia observada. Todos los ensayos se condujeron en pozos triplicados, con control de solvente DMSO. La CC50 (concentración que provoca la inhibición del 50% al crecimiento) se calculo desde la curva de luminiscencia/concentración. Los resultados de este ensayo se dan en la Tabla 2. Ejemplo in vitro 3. El ensayo de inmunoprecipitacíón de GSTp. Este ejemplo ilustra los efectos benéficos de los compuestos de esta invención para provocar inmunoprecipitación de GSTp. Esos resultados se consideran predictivos de la eficacia en los métodos terapéuticos del tercer aspecto de esta invención, porque TTLK199
(el éster de dietilo de TLK118 probado en estos ensayos) ha mostrado actividad mieloestimulante en humanos y actividad de quimiopotenciación en un modelo animal. Las células HL-60 se inocularon en una proporción de 6x105 células/mL en 20 mL de medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 1 mM de glutamina y 20 µM de gentamicína en un matraz T75 y se cultivaron durante la noche en una atmósfera de CO2 al 5% a 37° C. Las células se trataron con 0.1% DMSO o 20 µM de los compuestos de prueba (esteres de dietilo, compuestos 1B a 12B y TLK199) en medio de cultivo que contiene 0.1% DMSO durante 2 horas. Después del tratamiento, las células se recolectaron por medio de centrifugación y se lavaron dos veces con solución salina amortiguada con fosfato. Las pelotillas de células se resuspendieron en 1 mL de amortiguador de lísis (50 mM Tris, pH 8.0, 120 mM NaCI, 0.5% surfactante NP-40, 100 mM NaF; al cual se le habían agregado inhibidores de proteasa y fosfatasa (Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana, EE.UU.) antes del uso) y se incubaron con agitación suave durante 30 minutos a 4° C. Los lisados celulares se limpiaron por centrifugación a 13,000 rpm durante 10 minutos para retirar los desechos celulares. Para la inmunoprecípitación, 2.1 µg de anticuerpo GSTp anti-humano monoclonal de ratón se agregaron a 500 µL de lisato celular de 1 mg/mL de proteína total. Después de la incubación durante la noche a 4° C, se agregaron 30 µL de granulos de agarosa de proteína A/G (Pierce Rokford, IL) a la mezcla y se incuban durante 1 hora a 4o C. Los granulos se recolectaron
entonces por centrifugación, se lavaron tres veces en amortiguador de lísis y se resuspendieron en 10 µL de amortiguador de muestra de sulfato de dodecil de litio no reductos (Invitrogen, Carlsbad, California, U.S.A.). Las muestras suspendidas se calentaron a 95° C durante 5 minutos y se someten a SDS-PAGE en un gel 4-12%, seguido por análisis Western blot usando anticuerpo GSTp antihumano policlonal de conejo seguido por anticuerpo IgG anti-conejo de cabra purificado por afinidad conjugado con ITDye 800. Las bandas de proteína GSTp se visualizaron y se cuantifico la intensidad de las bandas en un explorador infrarrojo Odyssey (Li-Cor, Lincoln, Nebraska, EE.UU.). La intensidad de la banda de un tratamiento de compuesto se comparo a su correspondiente control DMSO y se expreso como inhibición porcentual. Los resultados se muestran en la tabla 2. Tabla 2. Inhibición de isoenzimas GST por medio de compuestos diácidos de esta invención, y citotoxicidad HL-60 e inmunoprecipitación GSTp de los compuestos de éster de dietilo de esta invención.
NM - valor no medido; * - éster de dietilo no realizado Los compuestos de diácido de esta invención son potentes inhibidores de GST P1-1, y también son generalmente selectivos para GST P1-1 sobre GST A1-1 y GST M1-1, las otras dos isoenzimas humanas GST. Los esteres de dietilo muestran todas buena citotoxicidad en células HL-60, y muchas muestran inhibición significante de GSTp medida en el ensayo de inmunoprecipitación. Algunos de los compuestos de éster de dietilo de esta invención también se prueban por su habilidad para mejorar la diferenciación de las células HL-60. Esto ¡lustra el efecto benéfico de
los compuestos de esta invención al estimular la diferenciación in vitro del linaje celular de la leucemia humana HL-60. Esos resultados se consideran predictivos de la eficacia en la mieloestimulacíón humana, porque TLK199, que mejora la diferenciación en este ensayo, ha mostrado actividad mieloestimulante en humanos. Las células en fase logarítmica (1x105 células/mL) se incubaron a 37° C bajo aire/5% de CO2 durante 24 horas en 2 mL del medio RPMI 1640 suplementado usado en el ejemplo in vitro 2 y los compuestos de prueba se disolvieron en DMSO, con una concentración final de DMSO de 0.1%. Las células se cosecharon por centrifugación(1250 rpm durante 5 minutos a 20° C) y se lavaron con 2 mL de solución salina amortiguada con fosfato helada (PBS) que contiene 2% de FBS, luego se tino con 10 µL de anticuerpo anti-CD11b conjugado ficoeritrina o 10 µL de anticuerpo de control isotipo conjugado con ficoeritrina. Después de reposar durante 30 minutos en helo, las células se resuspendieron en 2 mL de PBS helado que contiene 2% de FBS. Las células se cosecharon por medio de centrifugación (1250 rpm durante 5 minutos a 20° C) y se resuspendieron en 0.4 mL PBS que contiene 2% de FBS. La expresión superficial celular específica de CD11b, un marcador para granulocitos y monocitos se detecto por medio de citometría de flujo usando un analizador FACSCalíbur (BD Bíosciences). Todos los ensayos se condujeron en triplicado, con control DMSO. La extensión de la diferenciación se expreso como un múltiplo de una señal del control DMSO. Varios de los compuestos probados mejoraron la
diferenciación de las células HL-60 De estos resultados y la similapdad estructural de esos compuestos a TLK199, los compuestos especialmente los diésteres se espera que actúen terapéuticamente para para potenciar los efectos citotóxicos de los agentes quimioterapéuticos en las células tumorales, ejercer selectivamente la citotoxicidad en las células tumorales, elevar la producción de progenitores GM en la médula ósea, estimular la diferenciación de la medula ósea, estimula la diferenciación de la médula ósea, mitigar los efectos mielosupresivos de los agentes quimioterapéuticos y modular la hematopoyesis en la medula ósea Ejemplo de formulación Este ejemplo ilustra formulaciones adecuadas para los compuestos de esta invención especialmente los diésteres Se prepara una formulación sólida para la administración oral se prepara la combinar lo siguiente Compuesto 250% p/p Estearato de magnesio 05% p/p Almidón 20% p/p Celulosa de hidroxipropilmetilo 1 0% p/p Celulosa microcpstalina 71 5% p/p y la mezcla se comprime para formar tabletas o se introduce en cápsulas de gelatina dura que contienen por ejemplo 250 mg del compuesto Las tabletas pueden recubrirse si se desea al aplicar una suspensión de un agente formador de película (por ejemplo, celulosa
de hidroxipropílmetilo), pigmento (por ejemplo dióxido de titanio) y plastificantes (por ejemplo ftalato de dietilo) y secado de la película por medio de evaporación del solvente. Una formulación para la administración intravenosa se prepara la disolver el compuesto, por ejemplo como una sal farmacéuticamente aceptable a una concentración de 1% p/v, en solución salida amortiguada con fosfato; y la solución se esteriliza por ejemplo por medio de filtrado estéril y se sella en contenedores estériles que contienen por ejemplo 250 mg de un compuesto la invención. Alternativamente una formulación liofilizada se prepara al disolver el compuesto, otra vez por ejemplo como sal farmacéuticamente aceptable en un amortiguador adecuado, por ejemplo el amortiguador de fosfato de la solución salina amortiguada con fosfato mencionada antes, esterilizar la solución e introducirla en frascos estériles adecuados, liofilizar la solución para retirar el agua sellar los frascos. La formulación liofilizada se reconstituye por medio de la adición de agua estéril, y la solución reconstituida puede además diluirse para la administración con una solución tal como una infusión intravenosa de cloruro de sodio al 0.9% o infusión intravenosa al 5% de dextrosa. Alternativamente, se prepara una formulación de liposomas por medio del método descrito en la solicitud publicada norteamericana no. 2003/0100511 (por ejemplo, ejemplos 4 y 5) usando un compuesto de esta invención en vez del compuesto 9 de esa
publicación y puede ofilizarse como se describe en esa publicación Ejemplo terapéutico Este ejemplo ilustra un método terapéutico adecuado para los compuestos de esta invención Un compuesto de esta invención, en una formulación intravenosa como se describe en el ejemplo de formulación anterior, se administra de forma intravenosa durante 30 minutos a un paciente que sufre de síndrome mielodisplástico a una dosis inicial de 50 mg/m2, y esta dosis se elevó a 100 mg/m2, 200 mg/m2, 400 mg/m2, y 600 mg/m2 El compuesto se administra una vez al día durante cinco días cada tres semanas Aunque esta invención ha sido descrita conjuntamente con modalidades y ejemplos específicos, será evidente para una persona con experiencia normal en la técnica haciendo referencia a sus conocimientos y a esta descripción, que también pueden aplicarse equivalentes de los materiales y métodos también serán aplicables a esta invención, y que se pretende que esos equivalentes queden incluidos en las siguientes reivindicaciones