JP6587190B2

JP6587190B2 - タイトジャンクション形成制御剤及び該制御剤を含む医薬組成物

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Publication number: JP6587190B2
Application number: JP2016535943A
Authority: JP
Inventors: 秀一廣明; 剛志天野; 由香子中倉; 翔太野田
Original assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2014-07-23
Filing date: 2015-07-22
Publication date: 2019-10-09
Anticipated expiration: 2035-07-22
Also published as: JPWO2016013557A1; WO2016013557A1

Description

本発明は、タイトジャンクション形成制御剤及び該制御剤を含む医薬組成物に関するもので、特に、クローディンとＬＮＸ１との相互作用を阻害することで、タイトジャンクションの形成を制御する制御剤及び該制御剤を含む医薬組成物に関するものである。

体内の恒常性を維持するためには、水分、糖分、イオンなどを体内に封じ込めることが重要である。上皮細胞は外界と内部を隔てる役割を担っている細胞であり、細胞同士をつなぐ細胞接着装置が発達している。いくつか存在する細胞接着装置のうち最も外側に存在するのがタイトジャンクションである。タイトジャンクションは上皮細胞間で膜タンパク質クローディンが強固に相互作用することで形成されており、水やイオンの自由な透過を妨げている。このようなタイトジャンクションの機能は、皮膚の保湿や、脳内への異物混入を防いでいる血液脳関門において特に重要である。したがって、タイトジャンクション形成を制御する物質は、化粧品や医療品開発のターゲットとして注目を浴びている。

タイトジャンクション形成の促進剤としては、下記式（１）で表わされる化合物のナトリウム塩及びカリウム塩を配合したタイトジャンクション形成促進剤が知られている（特許文献１参照）。

また、下記式（２）で表わされる化合物を含む医薬組成物も知られている（特許文献２参照）。

［式中、Ｌ、ＭおよびＮは、水素原子、ヒドロキシ、ハロゲン原子、低級アルキル、ヒドロキシ(低級)アルキル、低級アルカノイルオキシまたはオキソであり、ここでＬおよびＭの少なくとも１つは水素以外の基であり、５員環は少なくとも１つの二重結合を有していてもよく；Ａは、−ＣＨ_３、または−ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＯＣＨ_２ＯＨ、−ＣＯＯＨまたはそれらの官能性誘導体であり；Ｂは、単結合、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ_２−または−ＣＨ_２−Ｃ≡Ｃ−であり；Ｚは、
または単結合であり、
ここでＲ_４およびＲ_５は、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシまたはヒドロキシ(低級)アルキルであり、Ｒ_４およびＲ_５が同時にヒドロキシおよび低級アルコキシであることはなく；
Ｒ_１は、非置換、またはハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシ、オキソ、アリールまたは複素環基により置換された、二価の飽和または不飽和の低または中級の脂肪族炭化水素残基であり、脂肪族炭化水素中の少なくとも１つの炭素原子は所望により酸素、窒素または硫黄により置換されており；そして
Ｒａは、非置換、またはハロゲン、オキソ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルカノイルオキシ、シクロ(低級)アルキル、シクロ(低級)アルキルオキシ、アリール、アリールオキシ、複素環基または複素環オキシ基により置換された、飽和または不飽和の低または中級の脂肪族炭化水素残基；低級アルコキシ；低級アルカノイルオキシ；シクロ(低級)アルキル；シクロ(低級)アルキルオキシ；アリール；アリールオキシ；複素環基；複素環オキシ基である］。

更に、漏出性または損傷を受けたタイトジャンクションの処置および細胞外マトリクスの増強をするため、体液の移動を予防もしくは制限するか、組織もしくは細胞を安定化するか、または汚染を予防することが必要な部位に投与されたときに、それらを達成する、有効量の自己組織化ペプチドを含む処方物であって、該自己組織化ペプチドは、同じペプチド鎖内の、正に帯電した残基の配列および負に帯電した残基の配列；正に帯電した残基の一続きの１つ以上および負に帯電した残基の一続きの１つ以上；およびそれらの組み合わせからなる群から選択される処方物、も知られている（特許文献３参照）。

ところで、クローディンは様々な種類が知られており、その発現は細胞・組織において特異性がある。その特異性は、水やイオンの透過性において差をもたらしているため、特異的なクローディンの発現、タイトジャンクションの形成は組織特異的な機能発現においてきわめて重要である。

特許第４６８４９０６号公報国際公開第２０１０／１３７７３１号国際公開第２００８／１１３０３０号

しかしながら、上記特許文献１及び２に記載されている発明は、クローディンの発現を活性化する化合物の投与によりクローディンの発現量が増加し、その結果、タイトジャンクションの形成を促しているが、組織特異的・細胞特異的なクローディンの発現を制御する技術ではない。また、上記特許文献３に記載されている発明は、損傷を受けた細胞間を強制的に結びつけるペプチドに関する技術で、負傷や外科手術等の緊急時には役立つものの、タイトジャンクション形成を制御するものではない。

更に、細胞間の接着は、クローディンとその裏打ちタンパク質ＺＯ−１／２が相互作用することで自動的に行われるが、上記特許文献１〜３に記載されている発明は、単に現象を確認しているに過ぎず、細胞のどの位置にクローディンが形成されるのか等の具体的なメカニズムに基づいた技術ではないため、医療応用性に限界があるという問題がある。

本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、（ａ）下記式（１３）、（１４）、（３０）、（３３−３）、（３４−９）に示す化合物は、クローディンを細胞内へ取り込ませることでタイトジャンクションを消失させるタンパク質であるＬＮＸ１と相互作用すること、（ｂ）前記相互作用の結果、ＬＮＸ１とクローディンとの相互作用が阻害され、クローディンは細胞内へ取り込まれなくなりタイトジャンクションは維持され続けること、を新たに見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の目的は、タイトジャンクション形成制御剤及び該制御剤を含む医薬組成物を提供することである。

本発明は、以下に示す、タイトジャンクション形成制御剤及び該制御剤を含む医薬組成物に関する。

（１）下記式（１３）、（１４）、（３０）、（３３−３）及び（３４−９）で表される化合物を少なくとも一種含むタイトジャンクション形成制御剤。
（２）前記化合物が、式（１３）又は（１４）で表される化合物である上記（１）に記載のタイトジャンクション形成制御剤。
（３）前記化合物がクローディンの細胞内への取り込みを防ぐことでタイトジャンクションの形成を制御する上記（１）又は（２）に記載のタイトジャンクション形成制御剤。
（４）上記（１）〜（３）の何れか一に記載のタイトジャンクション形成制御剤を含む医薬組成物。

本発明のタイトジャンクション形成制御剤は、ＬＮＸ１に特異的に反応することでＬＮＸ１とクローディンとが相互作用することを阻害し、その結果、クローディンの細胞内への取り込みが阻害されることでタイトジャンクション形成状態を制御することができる。したがって、タイトジャンクション形成メカニズムのどの段階での制御であるのか明らかであることから、医薬品、化粧品等への応用が可能である。

図１は、細胞接着装置の概要を説明する図である。図２は、本発明のタイトジャンクション形成の制御概要を説明する図である。図３は、ＬＮＸ１の構造を示している。図４は、実施例１及び比較例１の¹Ｈ−¹⁵ＮＨＳＱＣスペクトルの結果を示す。図５は、実施例１及び比較例１から得られた各残基のシグナル変化の大きさを示すグラフである。図６は、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２の構造のリボンモデルを示す。図７は、実施例２及び比較例１の¹Ｈ−¹⁵ＮＨＳＱＣスペクトルの結果を示す。図８は、実施例２及び比較例１から得られた各残基のシグナル変化の大きさを示すグラフである。図９は、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２の構造のリボンモデルを示す。図１０は、図面代用写真で、（１）は実施例３の〔Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ〕により得られた写真、（２）は化合物を添加しなかった〔免疫染色〕により得られた写真である。図１１は、図面代用写真で、（１）は実施例３で得られた免疫染色の写真、（２）は実施例４で得られた免疫染色の写真、（３）は実施例５で得られた免疫染色の写真、（４）は実施例６で得られた免疫染色の写真、（５）は実施例７で得られた免疫染色の写真、（６）は比較例１４で得られた免疫染色の写真である。

以下に、本発明のタイトジャンクション形成制御剤及び該制御剤を含む医薬組成物について詳しく説明する。

図１は、細胞接着装置の概要を説明する図である。上皮細胞は、隣り合う細胞と相互に接着したシートを形成することで、体の内部と外界の環境が分けられているが、細胞間の接着には、細胞膜に存在する細胞接着装置が重要な役割を果たしている。脊椎動物の上皮には、頂端面から基底面に向かって密着結合（ｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎ；ＴＪ）、接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｓｊｕｎｃｔｉｏｎ；ＡＪ）、デスモソーム、ギャップ結合と呼ばれる細胞接着装置が存在する。それぞれの細胞接着装置は機能が異なっており、タイトジャンクションは上皮層の隣接する細胞同士を密着させ、分子が細胞の間から漏れないように機能している。ＡＪは隣接する細胞のアクチンの束同士、デスモソームは隣接する細胞の中間径フィラメント同士をつなぎ、どちらも上皮細胞同士の結合に関与している。ギャップ結合は細胞間チャネルを形成し、無機イオンや水溶性小分子を通過させる機能を担っている。

このうち、最も頂端面に位置するタイトジャンクションは、空間の区画化や恒常性の維持に重要な役割を果たしている。タイトジャンクションは細胞間を通過する物質を大きさや電荷選択的に制御するバリア機能を担っている他、細胞膜上に存在するタンパク質や脂質の拡散を防ぎ、細胞極性を維持するフェンス機能を担っている。このため、タイトジャンクションの機能障害は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）や感染症、がん、血管性浮腫、血行性転移等の様々な疾病を引き起こすと考えられ、タイトジャンクション形成を適切に制御することで、医療に応用することができる。

図２は、本発明のタイトジャンクション形成の制御概要を説明する図である。タイトジャンクションの主要構成因子は４回膜貫通型タンパク質クローディン（ＣＬＤ）である。クローディンは膜裏打ちタンパク質であるＺＯ−１との複合体であるが、生体中では、クローディンを消失させるタンパク質であるＬｉｇａｎｄｏｆＮｕｍｂｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＸ−１（ＬＮＸ１）、及びＺＯ−１の両方が発現している（図２（１））。そして、ＬＮＸ１よりＺＯ−１の発現が優位になると、消滅するクローディンよりＺＯ−１と複合体を形成するクローディンの方が多くなるため、タイトジャンクションが形成される（図２（２））。逆に、ＺＯ−１よりＬＮＸ１の発現が優位になると、ＺＯ−１と複合体を形成するクローディンより消滅するクローディンの方が多くなるため、タイトジャンクションは消滅する（図２（３））。本発明のタイトジャンクション形成制御剤は、ＬＮＸ１のクローディン認識部位に特異的に結合する低分子化合物を用いることでＬＮＸ１とクローディンの相互作用を阻害し、タイトジャンクション形成を制御するものである。

本発明のタイトジャンクション形成制御剤に含まれる低分子化合物は、ｉｎｓｉｌｉｃｏスクリーニング法を用い、ＬＮＸ１に結合することでＬＮＸ１とクローディンの相互作用を阻害する化合物の候補リストを作成し、各候補化合物の有用性について確認をすることで得られる。化合物の候補リストは、（１）クローディンと相互作用するＬＮＸ１の領域を同定し、（２）上記（１）で同定した領域について、単体の立体構造をＸ線結晶構造解析にて決定し、（３）クローディン由来ペプチドと相互作用する領域の相互作用面を溶液ＮＭＲ法にて同定し、（４）同定した相互作用面に結合しうる低分子化合物の候補（阻害物質の候補）について、ＤＯＣＫ、ＡｕｔｏＤｏｃｋ、ＧＯＬＤ、ＦｌｅｘＸ等の公知のドッキングソフトウェアを用いて探索する、ことで作成することができる。また、各候補化合物の有用性は、ＮＭＲ、ｉｎｖｉｔｒｏ、動物実験等、公知の有用性確認実験により確認をすればよい。

図３は、ＬＮＸ１の構造を示している。ＬＮＸ１は、細胞運命決定とエンドサイトーシスに関わるタンパク質Ｎｕｍｂと相互作用するタンパク質として知られている。ＬＮＸ１は２つのスプライシング変異体ｐ７０（分子量約７０ｋＤａ）とｐ８０（分子量約８０ｋＤａ）が存在し、共通の構造としてＮｕｍｂ結合領域ＮＰＡＹモチーフと、タンパク質−タンパク質相互作用モジュールとして機能するＰＤＺドメインを４つ有する。また、ＬＮＸ１ｐ８０のみＮ末端側にＲＩＮＧフィンガードメインを持ち、Ｅ３活性を有している。本発明においては、ＬＮＸ１ｐ８０のＰＤＺ２ドメインに結合する化合物を探索したが、ＬＮＸ１ｐ８０及びＬＮＸ１ｐ７０の他のドメインもクローディンと結合することが知られていることから、他のドメインに結合する低分子化合物を探索してもよい。ＬＮＸ１ｐ８０及びＬＮＸ１ｐ７０のアミノ酸配列は公知であり、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ｏ７０２６３）等から入手することができる。

本発明のタイトジャンクション形成制御剤は、医薬組成物、医薬部外品、化粧品または食品のいずれにも用いることができ、その剤型としては、例えば、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、座剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤等を含む）、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、錠菓、飲料等が挙げられる。また、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常の化粧品、医薬部外品、医薬組成物等に用いられる各種成分、例えば油性成分、乳化剤、保湿剤、増粘剤、薬効成分、防腐剤、顔料、粉体、ｐＨ調整剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、香料等を適宜配合することができる。更に、本発明のタイトジャンクション形成制御剤は、抗炎症剤、整腸剤、抗菌剤、抗生物質等の公知の医薬品と組み合わせた医薬組成物として用いることもできる。例えば、Ｏ１５７等の毒素を産出する大腸菌の抗菌剤にタイトジャンクション形成制御剤を添加すると、タイトジャンクションを強化することで産出した毒素の吸収を抑えながら、大腸菌を死滅させることができる。

油性成分としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ホホバ油、ミツロウ、カルナウバロウ、ラノリン、オリーブ油、ヤシ油、高級アルコール、脂肪酸、高級アルコールと脂肪酸のエステル、シリコーン油等が挙げられる。乳化剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の非イオン界面活性剤、ステアロイル乳酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤、大豆リン脂質等の両性界面活性剤、塩化アルキルトリメチルアンモニウム等のカチオン界面活性剤が挙げられる。保湿剤としては、例えばグリセリン、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどが挙げられる。増粘剤としては、例えばカルボキシビニルポリマー、キサンタンガム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ベントナイト等の粘土鉱物等が挙げられる。薬効成分としては、例えば各種ビタミンおよびその誘導体、アラントイン、グリチルリチン酸およびその誘導体、各種動植物抽出物等が挙げられる。

本発明のタイトジャンクション形成制御剤中に配合される化合物の量は、剤型や期待する効果の程度により異なるが、通常０．００１質量％以上、好ましくは０．１〜５０質量％程度配合するのがよい。０．００１質量％未満では十分な効果が得られにくく、５０％を超えて配合した場合、効果の増強は認められにくく不経済である。また、化合物は単独又は組み合わせて用いてもよい。

以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。

［候補化合物リストの作成］
ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ（ＰＤＢ）からｍＬＮＸ１ｐ８０のＰＤＺ２ドメインのＰＤＢファイル（ＰＤＢＩＤ：３ＶＱＦ）、化合物のデータベースＺＩＮＣ（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｚｉｎｃ．ｄｏｃｋｉｎｇ．ｏｒｇ）およびＬｉｇａｎｄＢｏｘ（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｌｉｇａｎｄｂｏｘ．ｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｓａｋａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｌｉｇａｎｄｂｏｘ／）からリガンドファイル（ＭＯＬ２ファイル）を入手した。タンパク質−リガンド・ドッキングソフトウェアＧＯＬＤＳｕｉｔｅに付属する分子ビューワーＨｅｒｍｅｓを立ち上げ、ＧＯＬＤのＷｉｚａｒｄを選択し、ＬｏａｄＰｒｏｔｅｉｎボタンで目的タンパク質のＰＤＢファイルを開き、その後は、マニュアルにしたがって、操作をした。なお、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２とドッキングする化合物の検索は、入手したリガンドファイルからランダムに抽出したＺＩＮＣ由来の化合物約２４万件、およびＬｉｇａｎｄＢｏｘ由来の化合物約２４万件から行った。以下に、候補化合物リストを記載する。なお、式（４）〜（３２）、式（３３−１）〜（３３−１１）、式（３４−１）〜（３４−１４）、式（３５−１）〜（３５−２）、式（３６−１）〜（３６−２）で表す化合物はナミキ商事株式会社から購入することができる。

［¹⁵Ｎ標識したマウス（ｍ）ＬＮＸ１ＰＤＺ２の培養・精製］
ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社から購入したｐＧＥＸ−６Ｐ−３プラスミドから作製したｐＧＥＸ−６Ｐ３−Ｐプラスミド（天野剛志他，“高効率かつ高速な融合タンパク質発現ベクターの構築法”、２００６、実験医学．２４、１６７５−１６８０参照）に、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２（ＵｎｉＰｒｏｔＩＤ：Ｏ７０２６３から入手したアミノ酸配列のアミノ酸番号３８１−４６７）をコードしているＤＮＡ断片（ＵｎｉＰｒｏｔからリンクされているＥＮＡＩＤ：ＡＦ０３７４５．１の塩基番号１３３８−１５９８）を接続した。さらに紫外線吸収向上のため、上記ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２断片の１２塩基上流にチロシン残基を挿入するための３塩基（配列：ＴＡＴ）を点変異により組み込んだｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質の発現プラスミド（ｐＧＥＸ−６Ｐ３−ＰｍＬＮＸ１ＰＤＺ２＋Ｙ１）を作製し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、¹⁵Ｎ標識したＭ９培地（１Ｌ：Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ１７．９１ｇ，ＫＨ₂ＰＯ₄ ２．９９ｇ、ＮａＣｌ０．５ｇ、ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ２０ｍｇ、ａｄｅｎｏｓｉｎｅ２０ｍｇ、ｇｕａｎｏｓｉｎｅ２０ｍｇ、ｃｙｔｉｄｉｎｅ２０ｍｇ、ｔｈｉａｍｉｎｅ２０ｍｇ、ｂｉｏｔｉｎ２０ｍｇ、１０ｍＭＦｅＣｌ₃ ３３０μｌ、１ＭＭｇＳＯ₄ １ｍｌ、５０ｍＭＭｎＣｌ₂ １ｍｌ、５０ｍＭＣａＣｌ₂ ２ｍｌ、８０％ｇｌｙｓｅｒｏｌ１．４ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ１ｍｌ、ｇｌｕｃｏｓｅ４ｇ， ¹⁵ＮＨ₄Ｃｌ０．５ｇ）中で、１ｍＭＩＰＴＧによる発現誘導後、２０℃で一晩培養した。培養後、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ（Ｊ６−Ｍ１Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）で遠心し（４０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃）、集菌した。
菌体に破砕バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０、菌体１ｇに対し約１０ｍｌ）を加え、懸濁し、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒで超音波破砕した（ｏｎｔｉｍｅ３０ｓｅｃ／ｏｆｆｔｉｍｅ３０ｓｅｃ、ｔｏｔａｌ１０ｍｉｎ×４回）。破砕後、ＨｉｔａｃｈｉＨｉｇｈ−ＳｐｅｅｄＲｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅｓ（ｈｉｍａｃＣＲ２２Ｇ）で遠心し（１８０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）、上清を回収した。上清をＤＥＡＥカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＧＳＴ−ａｃｃｅｐｔカラム（ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ）に通し、ＧＳＴ融合タンパク質を樹脂に吸着させた。カラム上にＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎｐｒｏｔｅａｓｅ２００μｌを加え、４℃で一晩インキュベートし、ＧＳＴタグを切断した。切断後、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎｃｌｅａｖａｇｅバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で目的タンパク質を溶出した。得られたタンパク質溶液は、Ｍｉｃｒｏｓｅｐ１ＫＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＤｅｖｉｃｅｓ（ＰＡＬＬ）を用いた遠心（ＲＯＴＡＮＴＡ４６０Ｒ）により濃縮し、ＡＫＴＡｐｒｉｉｍｅｐｌｕｓ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてゲル濾過（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を行った。透析を行い、凍結乾燥により濃縮した後、ＮＭＲバッファー（２０ｍＭＭＯＰＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＭｇＳＯ₄、ｐＨ６．８）に透析し、¹⁵Ｎ−ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２サンプルとした。

［ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２の主鎖帰属］
次に、¹³Ｃ／¹⁵Ｎ標識したｍＬＮＸ１ＰＤＺ２サンプル（約０．９ｍＭ）を用いて、¹Ｈ／¹⁵Ｎ−ＨＳＱＣ、ＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮＣＡ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ、ＨＮＣＯスペクトルを測定し、Ｓｐａｒｋｙ３．１１４を用いて連鎖帰属法により主鎖の帰属を行った。¹Ｈ−¹⁵ＮＨＳＱＣスペクトル上でｐｅａｋｐｉｃｋを行った後、対応するピークをＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨスペクトル上で抽出し、ｓｔｒｉｐを作成した。作成したｓｔｒｉｐを並べ替えることにより帰属を行った。ＨＮＣＡ／ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ／ＨＮＣＯスペクトルも同様にしてｓｔｒｉｐを作成し、帰属を確定させた。また、自動帰属ソフトウェアＭＡＲＳ１．２を用いて、帰属の確認を行った。ＮＭＲ測定は、Ｂｒｕｋｅｒ社ＡｖａｎｃｅIII ６００ＭＨｚデジタルＮＭＲ装置を用いた。更に、¹⁵Ｎ標識した培地でｍＬＮＸ１ＰＤＺ２の発現中に¹⁴Ｎアミノ酸を加えると、そのアミノ酸残基のＮＭＲシグナルが消失する現象に基づくインバースラベル法を用いて帰属の確認を行ったところ、帰属した結果はほぼ正確であると確認できた。

［ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２と化合物のＮＭＲ滴定実験］
＜実施例１＞
¹⁵Ｎ標識したｍＬＮＸ１ＰＤＺ２（約０．１ｍＭ）に、式（１３）の化合物（終濃度０．２ｍＭ、ＤＭＳＯ終濃度５％）を添加し、¹Ｈ−¹⁵ＮＨＳＱＣスペクトルを測定した。Ｓｐａｒｋｙ３．１１４を用いて得られたスペクトルを解析した後、シグナルの化学シフト変化から、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２と化合物の結合を確認した。なお、測定には、Ｂｒｕｋｅｒ社ＡｖａｎｃｅIII ６００ＭＨｚデジタルＮＭＲ装置を用いた。

＜比較例１＞
式（１３）の化合物を添加しなかった以外は、実施例１と同様に¹Ｈ−¹⁵ＮＨＳＱＣスペクトルを測定した。

図４は、実施例１及び比較例１の¹Ｈ−¹⁵ＮＨＳＱＣスペクトルの結果を示す。式（１３）の化合物を添加しなかった比較例１のｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のシグナルと、添加した実施例１のシグナルでは、一部のシグナルがシフトしていた。シグナルのシフトは、式（１３）の化合物がｍＬＮＸ１ＰＤＺ２と結合することでドメインの微小な構造が変化したためで、以上の結果より、式（１３）に表す化合物は、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２と結合していることが確認できた。

次に、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２における式（１３）に表す化合物の結合部位を次の手順により決定した。図５は、実施例１及び比較例１から得られた各残基のシグナル変化の大きさを示すグラフで、グラフからシグナルが０．０１５ｐｐｍ以上変化した残基を同定した。次に、公知のＸ線結晶解析により決定したｍＬＮＸ１ＰＤＺ２の結晶構造をもとに作製したリボンモデルに、シグナルが０．０１５ｐｐｍ以上変化した残基についてシグナルの変化の大きさにしたがって色付けした。図６は、色付けしたｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のリボンモデルを示す。また、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２に対するクローディンのＮＭＲ滴定実験により予め確認したｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のリガンド認識部位と、上記のシグナルが変化した残基の位置はほぼ同じであった。以上の結果より、式（１３）に表す化合物は、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のリガンド認識部位に結合していることが確認できた。

＜実施例２＞
式（１３）の化合物に換え、式（１４）の化合物（終濃度１．０ｍＭ、ＤＭＳＯ終濃度５％）を添加した以外は、実施例１と同様にスペクトル解析した。

図７は、実施例２及び比較例１の¹Ｈ−¹⁵ＮＨＳＱＣスペクトルの結果を示す。式（１４）の化合物を添加しなかった比較例１のｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のシグナルと、添加した実施例２のシグナルでは、一部のシグナルがシフトしており、式（１４）に表す化合物は、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２と結合していることが確認できた。

次に、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２における式（１４）に表す化合物の結合部位を、次の手順により決定した。図８は、実施例２及び比較例１から得られた各残基のシグナル変化の大きさを示すグラフで、グラフからシグナルが０．０４ｐｐｍ以上変化した残基を同定した。次に、実施例１と同様に、シグナルが０．０４ｐｐｍ以上変化した残基についてシグナルの変化の大きさにしたがってｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のリボンモデルに色付けした。図９は、色付けしたｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のリボンモデルを示す。また、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のリガンド認識部位と、上記のシグナルが変化した残基の位置はほぼ同じであった。以上の結果より、式（１４）に表す化合物は、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のリガンド認識部位に結合していることが確認できた。

＜比較例２〜１３＞
式（１３）に表す化合物に換え、式（４）〜（１２）及び式（１５）〜（１７）に表す化合物を用いた以外は、実施例１と同様にスペクトル解析し比較例１のスペクトルと対比した。しかしながら、何れの化合物もスペクトルのシグナル変化は見られなかった。

以上の結果より、式（１３）及び（１４）に共通する構造であるアントラニル酸が、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２との結合に重要であることが判明した。また、本発明者らは、以前にＰＤＺドメインと低分子化合物との相互作用をＮＭＲ滴定実験により検証しており、複数のＰＤＺドメインに対し群特異的に結合する化合物として、ＤＩＦ（ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ）、ＦＬＦ（ｆｌｕｆｅｎａｍｉｃａｃｉｄ）、ＦＵＡ（ｆｕｓｉｄｉｃａｃｉｄ）を同定している（Ｔｅｎｎｏ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，“ＡｃｃｉｄｅｎｔａｌＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＰＤＺＤｏｍａｉｎｓａｎｄＤｉｃｌｏｆｅｎａｃＲｅｖｅａｌｅｄｂｙＮＭＲ−ＡｓｓｉｓｔｅｄＶｉｒｔｕａｌＳｃｒｅｅｎｉｎｇ”、２０１３、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．１８、９５６７−９５８１参照）。これらの化合物には、部分構造として安息香酸またはフェニル酢酸骨格が含まれる。さらに、これまでにＰＤＺドメインの相互作用を阻害する低分子化合物としていくつか報告されているが、それらの化合物のほとんどに安息香酸骨格が含まれている（例えば、Ｆｕｊｉｉ，Ｎ．，ｅｔ．ａｌ．，“ＲａｔｉｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｏｆａｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅｇｅｎｅｒａｌｃｈｅｍｉｃａｌｓｃａｆｆｏｌｄｆｏｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＰＤＺｄｏｍａｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”、２０１３、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７、５４９−５５２、等参照）。以上の結果から、ＰＤＺドメインとの結合には安息香酸骨格が重要であり、さらにＬＮＸ１ＰＤＺ２との結合にはアントラニル酸骨格が重要であることが示唆された。なお、化合物は、ＬＮＸ１ＰＤＺ２の立体構造からみて、分子量が１０００以下であることが望ましい。また、ＰＤＺドメインとの結合を検証するため、化合物は水溶性であることが好ましく、ＣＬｏｇＰ３．５以下であることが望ましい。

［化合物の細胞アッセイ］
＜実施例３＞
次に、ＮＭＲでｍＬＮＸ１ＰＤＺ２に結合することが確認された式（１３）で表される化合物について、イヌ腎臓尿細管上皮細胞を用いてタイトジャンクション形成に与える影響についてアッセイを行った。アッセイは、ＭＤＣＫ−II細胞（Ｍａｄｉｎ−ＤａｒｂｙＣａｎｉｎｅＫｉｄｎｙＳｔｒａｉｎＩＩ；本研究では神戸大学大学院医学研究科細胞生物学の古瀬幹夫教授から入手した細胞を用いたが、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社からも購入可能である。）を用い、下記［免疫染色］に記載されている手順で行った。また、ＭＤＣＫ−II細胞に関して、内在性ＬＮＸ１が発現しているのか否かについても確認を行った。内在性ＬＮＸ１の発現の確認は、下記［Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ］に記載されている手順、及び下記［免疫染色］において、化合物を添加せず、化合物添加後の４８ｈ培養をしなかった以外は［免疫染色］と同様の手順で行った。

［免疫染色］
カバーガラスを入れた６ｗｅｌｌｄｉｓｈに細胞を播種し、ＣＯ₂インキュベータで一晩培養した。培地をアスピレーターで吸引した後、ＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒ）培地１ｍｌと調整した式（１３）で表される化合物１ｍｌを加え（終濃度１００μＭ、ＤＭＳＯ終濃度０．１％）、ＣＯ₂インキュベータで４８ｈ培養した。培養後、培地をアスピレーターで吸引し、無血清ＤＭＥＭ培地を１ｍｌ加え、アスピレーターで吸引した（×２回）。冷メタノールを１ｍｌ加え、−２０℃で２０分静置した。新しい６ｗｅｌｌｄｉｓｈにＰＢＳを２ｍｌ加え、その中にカバーガラスを入れて洗浄した。ＰＢＳをＰ−１０００ピペットマンで吸い出し、新たにＰＢＳを１ｍｌ加えて洗浄した（×２回）。ＰＢＳを吸い出した後、ブロッキング溶液（５％スキムミルク溶液）を１ｍｌ加えて、室温で１ｈインキュベートした。スキムミルク溶液で希釈した１００μｌの一次抗体溶液の上に、固定した細胞面が下になるようにカバーガラスをかぶせ、４℃で一晩インキュベートした。翌日、６ｗｅｌｌｄｉｓｈにＰＢＳを１ｍｌ加え、その中にカバーガラスを入れて洗浄した。ＰＢＳをＰ−１０００ピペットマンで吸い出し、新たにＰＢＳを１ｍｌ加えて洗浄した（×２回）。スキムミルク溶液で希釈した１００μｌの二次抗体溶液の上に、固定した細胞面が下になるようにカバーガラスをかぶせ、室温で１ｈインキュベートした。６ｗｅｌｌｄｉｓｈにＰＢＳを１ｍｌ加え、その中にカバーガラスを入れて洗浄した。ＰＢＳをＰ−１０００ピペットマンで吸い出し、新たにＰＢＳを１ｍｌ加えて洗浄した（×２回）。封入剤１０μｌをスライドガラスの上に滴下し、その上にカバーガラスをかぶせた。遮光し、翌日ＯＬＹＭＰＵＳ社の顕微鏡ＩＸ７１を用いて検鏡した。なお、露光時間は固定して撮影した（１／５ｓｅｃ）。
なお、一次抗体には、Ｒａｂｂｉｔａｎｔｉ−Ｃｌａｕｄｉｎ−２ａｎｔｉｂｏｄｙ（５１−６１００、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をスキムミルク溶液で２５０倍に希釈したもの、及びＲａｂｂｉｔａｎｔｉ−ＬＮＸ１ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＡＶ４７３３６７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をスキムミルク溶液で１００倍に希釈したものを用いた。
また、二次抗体には、Ａｎｔｉ−ＲａｂｂｉｔＩｇＧ（ｗｈｏｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅ），Ｆ（ａｂ’）２ｆｒａｇｍｅｎｔ−Ｃｙ３ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃ２３０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をスキムミルク溶液で５００倍に希釈したもの、及びＡｎｔｉ−ＲａｂｂｉｔＩｇＧ（ｗｈｏｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅ），Ｆ（ａｂ’）２ｆｒａｇｍｅｎｔ−ＦＩＴＣａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆ１２６２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をスキムミルク溶液で２００倍に希釈したものを用いた。

［Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ］
細胞を６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに播種し、ＣＯ₂インキュベータで培養した。培地をアスピレーターで吸引し、ＰＢＳ１ｍｌで洗浄した（×２回）。ＳＤＳ−Ｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒを適量加え、セルスクレーパーでかきとった。Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒで２ｍｉｎ超音波破砕した後、９５℃で３ｍｉｎ加熱し、サンプルとした。
サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そのゲルをＢ液（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ０．３０ｇ、ｍｅｔｈａｎｏｌ５ｍｌ、ＭｉｌｌｉＱ、ｔｏｔａｌ１００ｍｌ）に浸した。ＰＶＤＦ膜（ＡＥ−６６６８、ＡＴＴＯ）は１００％ｍｅｔｈａｎｏｌに約２０ｓｅｃ浸した後、Ｂ液中に３０ｍｉｎ以上浸透させた。濾紙（ＣＢ−０６Ａ、ＡＴＴＯ）はＡ液（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ１．８２ｇ、ｍｅｔｈａｎｏｌ２．５ｍｌ、ＭｉｌｌｉＱ、ｔｏｔａｌ５０ｍｌ）に２枚、Ｂ液に１枚、Ｃ液（６−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃａｃｉｄ０．２６ｇ、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ０．１５ｇ、ｍｅｔｈａｎｏｌ２．５ｍｌ、ＭｉｌｌｉＱ、ｔｏｔａｌ５０ｍｌ）に３枚浸した。コンパクトブロットＡＥ−７５００（ＡＴＴＯ）の陽極板に濾紙、ＰＶＤＦ膜、ゲルを重ねた後、陰極をセットし、通電することによりタンパク質をＰＶＤＦ膜に移行させた。ＰＶＤＦ膜をｂｌｏｃｋｉｎｇａｇｅｎｔ（５％スキムミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ｉｎＰＢＳ）に浸し、室温で１ｈ振とうさせた。ＰＶＤＦ膜をｂｌｏｃｋｉｎｇａｇｅｎｔで希釈した一次抗体溶液に浸し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＤＶＦ膜をｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ（１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）に浸し、５ｍｉｎ振とうさせて（×４回）洗浄した後、ｂｌｏｃｋｉｎｇａｇｅｎｔで希釈した二次抗体溶液に浸し、室温で１ｈインキュベートした。ＰＤＶＦ膜をｗａｓｈｂｕｆｆｅｒに浸し、５ｍｉｎ振とうさせて（×４回）洗浄した。ＰＤＶＦ膜上にＣｈｅｍｉ−ＬｕｍｉＯｎｅＳｕｐｅｒ（ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ）をかけ、インキュベートし、ＬＡＳ−３０００ｍｉｎｉで検出した。
なお、一次抗体には、Ｒａｂｂｉｔａｎｔｉ−ＬＮＸ１ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＡＶ４７３３６７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用い、ｂｌｏｃｋｉｎｇａｇｅｎｔで１０００倍に希釈したものを用いた。
また、二次抗体には、Ａｎｔｉ−ＲａｂｂｉｔＩｇＧＨＲＰ（Ｗ４０１Ｂ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、ｂｌｏｃｋｉｎｇａｇｅｎｔで１００００倍に希釈したものを用いた。

［ＭＤＣＫ−II細胞における内在性ＬＮＸ１の発現確認］
図１０（１）は、上記〔Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ〕により得られた写真である。また、図１０（２）は、上記〔免疫染色〕において、化合物を添加せず、添加後の４８ｈ培養をしなかった以外は同様の手順で免疫染色した写真である。

図１０（１）に示すように、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇでは、７５ｋＤａ付近にバンドが確認出来たので、ＬＮＸ１の発現が確認できた。また、図１０（２）に示すように、免疫染色では、細胞内に輝点が存在していることからＬＮＸ１の発現が確認できた。以上の結果から、ＭＤＣＫ−II細胞において、ＬＮＸ１が内在的に発現していることを確認した。

［式（１３）で表される化合物のアッセイ］
図１１（１）は、実施例３で得られた免疫染色の写真である。

＜実施例４〜７＞
式（１３）で表される化合物に換え、実施例４として式（１４）、実施例５として式（３０）、実施例６として式（３３−３）、実施例７として式（３４−９）で表される化合物を用いた以外は実施例３と同様の手順で免疫染色を行った。図１１（２）は実施例４、図１１（３）は実施例５、図１１（４）は実施例６、図１１（５）は実施例７で得られた免疫染色の写真である。

＜比較例１４＞
式（１３）で表される化合物を添加しなかった以外は実施例３と同様の手順で免疫染色を行った。図１１（６）は、比較例１４で得られた免疫染色の写真である。

図１１（６）の比較例１４の写真と比べ、実施例３〜７の図１１（１）〜（５）の写真は、細胞と細胞の間の白色部分が明らかに濃くなっており、クローディンのタイトジャンクションへの増蓄が確認された。この結果、及びＮＭＲ滴定実験の結果から、式（１３）、（１４）、（３０）、（３３−３）及び（３４−９）で表される化合物がｍＬＮＸ１ＰＤＺ２に結合し、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２とクローディンの結合を阻害することで、クローディンの細胞内への取り込みを阻害し、結果的にタイトジャンクションを強化したと考えられる。

また、ヒト、マウス、イヌのＬＮＸ１ＰＤＺ２ドメインのクローディンが相互作用する面に位置するアミノ酸配列について調べた。調べたアミノ酸配列は、何れもＵｎｉＰｒｏｔから入手した次の部分である。
＜ヒト＞ＩＤ：Ｑ８ＴＢＢ１のアミノ酸番号３７７−４６３（８７配列）
＜マウス＞ＩＤ：Ｏ７０２６３のアミノ酸番号３８１−４６７（８７配列）
＜イヌ＞ＩＤ：Ｅ２ＲＢＥ８のアミノ酸番号３８１−４６７（８７配列）
ヒト、マウス、イヌのＬＮＸ１ＰＤＺ２ドメインのアミノ酸配列（上記８７配列）の相同性は、ヒトとマウスは９５％、ヒトとイヌは９４％、マウスとイヌは９４％と非常に高かった。また、クローディンが相互作用する面に位置するアミノ酸の配列（上記８７配列の１８番目のグリシン〜２３番目のアルギニン、及び６６番目のプロリン〜７４番目のグルタミン）は、ヒト、マウス、イヌで完全に一致していた。したがって、式（１３）及び（１４）で表される化合物は、ヒトのタイトジャンクション形成の制御にも用いることができる。

本発明の式（１３）、（１４）、（３０）、（３３−３）及び（３４−９）で表される化合物は、ＬＮＸ１に特異的に反応することで、ＬＮＸ１とクローディンとが相互作用することを阻害し、その結果、クローディンの細胞内への取り込みが阻害されることでタイトジャンクション形成状態を制御することができる。したがって、タイトジャンクション形成メカニズムのどの段階での制御であるのか明らかであることから、医薬品、化粧品等への応用が可能である。

Claims

下記式（１４）、（３０）及び（３４−９）で表される化合物を少なくとも一種含むタイトジャンクション形成制御剤。
前記化合物が、式（１４）で表される化合物である請求項１に記載のタイトジャンクション形成制御剤。
前記化合物がクローディンの細胞内への取り込みを防ぐことでタイトジャンクションの形成を制御する請求項１又は２に記載のタイトジャンクション形成制御剤。
請求項１〜３の何れか一項に記載のタイトジャンクション形成制御剤を含む医薬組成物。