FI112943B - Pyrimidinyylijohdannaisia ja niiden käyttö lääkkeen valmistamiseksi interleukiini proteaasiaktiivisuuden inhiboimiseksi - Google Patents

Description

Pyrimidinyylijohdannaisia ja niiden käyttö lääkkeen valmis tamiseksi interleukiini proteaasiaktiivisuuden inhiboimi- seksi x 112943 5 Keksinnön tausta

Keksinnön ala Käsillä oleva keksintö kohdistuu uusien aspartaami-happoanalogien ryhmään, jotka ovat selektiivisiä interleu-kiini-lE:aa konvertoivan entsyymin in vitro ja in vivo in-10 hibitiossa, koostumuksiin, jotka sisältävät uusia aspara-giinihappoanalogeja sekä keksinnön mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan käyttöön. Täsmällisemmin käsillä olevan keksinnön mukaiset interleukiini-IS:aa konvertoivan entsyymin inhibiittorit sisältävät uusia 15 N-(pyrimidinyyli)asparagiinihappoaldehydejä ja a-substi-tuoituja metyyliketoneja, joilla on erityistä käyttökelpoisuutta hoidettaessa keuhkojen, keskushermoston ja sidekudosten tulehduksellisia ja immuunipohjaisia sairauksia.

Raportoidut kehitystulokset 20 Interleukiini-1β (IL-Ιβ) -proteaasi (tunnetaan myös nimellä interleukiini-IE:aa konvertoiva entsyymi tai ICE) on entsyymi, joka vastaa biologisesti inaktiivisen 31 kD:n prekursori IL-lE:n prosessoinnista biologisesti aktiiviseen 17 kD:n muotoon (M. J. Kostura, M. J. Tocci, G. Limjuco, J.

! 25 Chin, P. Cameron, A. G. Hillman, N. A. Chartrain, J. A.

Schmidt, Proc. Natl. Acad. Sei. 86 (1989) 5227 - 5231, ja R. A. Black, S. R. Kronheim, P. R. Sleath, FEBS Let. 247 (1989) 386 - 391). Sen lisäksi, että IL-Ιβ toimii yhtenä kehon varhaisista vasteista vammoihin ja tulehduksiin, sen ,3 0 on ehdotettu toimivan myös useiden erilaisten sairauksien, kuten nivelreuman, luu-niveltulehduksen, tulehduksisen suo- t _ . lisairauden, sepsiksen, akuutin ja kroonisen myelinisoitu- neen leukemian ja osteoporoosin, välittäjänä (C. A. Dina-rello, S. M. Wolff, New Engl. J. Med. 328 (1993) 106).

• : 35 Luonnossa esiintyvää IL-Ιβ reseptoriantagonistia on käytet ty osoitettaessa IL-lE:n välittävä vaikutus useissa ihmisen -Ί -1 Γ\ / "7 2 I ι λ., .·' *·τ ν sairauksissa ja eläinmalleissa (C. H. Hannum, C. J. Wilcox, W. P. Arend, G. G. Joslin, D. J. Dripps, P. L. Heimdal, L. G. Armes, A. Sommer, S. P. Eisenberg, R. C. Thompson, Nature 343 (1990) 336 - 340; S. P. Eisenberg, R. J. Evans, W.

5 P. Arend, E. Verderber, M. T. Brewer, C. H. Hannum, R. C.

Thompson, Nature 343 (1990), 341 - 346; K. Ohlsson, P.

Björk, M. Bergenfeldt, R. Hageman, R. C. Thompson, Nature 348 (1990) 550 - 552; G. Wakabayashi, FASEB (1991) 338 - 343; R. Pacafici et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 86 (1989) 10 2398 - 2402; ja I. Yamamoto et ai., Cancer Rsh. 49 (1989) 4242 - 4246) . IL-lS:n spesifistä roolia tulehduksissa ja vastustuskyvyn ympäristöön sopeutumisessa tukevat viimeaikaiset havainnot, että lehmärokkovirus käyttää ICE-inhibiittoria tukahduttaessaan isäntänsä tulehdusvastetta (C. 15 A. Ray, Cell 69 (1992) 597 - 604).

Yhteenvetona voidaan sanoa, että useat alan ammattilaiset ovat ehdottaneet ja osoittaneet ICE-inhibiittorei-den in vivo käyttökelpoisuuden modifioitaessa tiettyjä IL-Ιβ-välitteisiä sairaustiloja. Seuraava yhteenveto ICE-tut-20 kimuksen nykytilasta vielä tukee ICE-inhibiittoreiden tällaista käyttökelpoisuutta: 1) Julkaisussa WO 93/09 135 (julk. 11.5.1993) osoitetaan, että peptidipohjaiset asparagiinihappoaryyliasyyli-oksiketonit ja -aryyloksimetyyliketonit ovat tehokkaita 25 ICE:n inhibiittoreita in vitro. Nämä yhdisteet inhiboivat myös spesifisesti ICE:a koko solussa (in vivo) niiden kyvyllä inhiboida kypsän IL-lS:n muodostusta koko soluissa. Näillä ICE-inhibiittoreilla osoitettiin olevan käyttökelpoisuutta myös alennettaessa kuumetta ja tulehdusta/turvo-3 0 tusta rotissa.

: 2) Lymen tautia sairastavilla potilailla kehittyy ,joskus Lymen niveltulehdus. B. burgdorferi, Lymen tautia aiheuttava aine, on tehokas IL-1-synteesin kiihdytin yksitumaisilla soluilla. Miller et ai. (L. C. miller, E. A.

: 35 Lynch, S. Isa, J. W. Logan, C. A. Dinarello ja A. C. Stee- re, "Balance of synovial fluid IL-Ιβ Receptor Antagonist 1 1 n a ύ 3 I i δ. y A <w·· and Recovery from Lyme arthritis", Lancet 341 (1993) 146 - 148) osoittivat, että potilailla, jotka toipuvat nopeasti Lymen niveltulehduksesta, oli IL-l-beetan ja IL-lra:n tasapaino nivelvoiteessa IL-ra:n hyväksi. Kun tasapainoa muu-5 tettiin IL-IS:n hyväksi, kesti sairaudesta paraneminen paljon pitempään. Päätelmä oli, että IL-lra:n ylimäärä esti IL-lE:n vaikutukset tutkituissa potilaissa.

3) IL-1:a on läsnä kohdekudoksissa haavaisessa pak-susuolentulehduksessa ihmisissä. Mallissa IL-Ira:n anto vä- 10 hensi kudoskuoliota ja tulehdussolujen määrää lynkkysuoles-sa. Katso F. Cominelli, C. C. Nast, B. D. Clark, R. Schindler, R. Llerena, V. E. Eysselein, R. C. Thompson ja C. A. Dinarello, "Interleukin-1 Gene Expression, Synthesis, and Effect of Specific IL-1 Receptor Blockade in Rabbit Im-15 mune Complex Colitis", J. Clin. Investigations, vol 86, s. 972 - 980 (1990).

4) IL-lra tukahduttaa nivelten turpoamisen niveltulehduksen PG-APS-mallissa rotissa. Katso J. H. Schwab, S.

K. Amderle, R. R. Brown, F. G. Dalldorf ja R. C. Thompson, 20 "Pro- and Anti-Inflammatory Roles of Interleukin-1 in Recurrence of Bacterial Cell Wall-Induced Arthritis in Rats", Infect. Immun. 59 (1991) 4436 - 4442.

5) IL-lra osoittaa tehoa pienessä avoimessa ihmisen nivelreumatutkimuksessa. Katso M. E. Lebsack, C. C. Paul, 25 C. C. Bloedow, F. X. Burch, M. A. Sack, W. Chase ja M. A.

; Catalano, "Subcutaneous IL-1 Receptor Antagonist in Patients with Rheumatoid Arthritis", Arth. Rheum. 34 (1991) 545 .

: 6) IL-1 näyttää olevan autokriininen kasvutekijä 30 kroonisten myelinisoituneiden leukemiasoluj en lisäkasvun suhteen. Sekä IL-lra että sIL-lR inhiboivat kasvupesäkkei- » den kasvua soluissa, jotka on poistettu leukemiapotilailta. Katso Z. Estrov, R. Kurzrock, M. Wetzler, H. Kantarjian, M. Blake, D. Harris, J. U. Gutterman ja M. Talpaz, "Suppres-; 35 sion of Chronic Myelogenous Leukemia Colony Growth by In terleukin-1 (IL-1) Receptor Antagonist and Soluble IL-1 Re- 4 1 s ·- ν ceptors: a Novel Application for Inhibitors of IL-1 Activity", Blood 78 (1991) 1476 - 1484.

7) Kuten edellä kohdassa 6), mutta kroonisen myeli-nisoidun leukemian sijasta akuutin myelinisoidun leukemian 5 suhteen. Katso Z. Estrov, R. Kurzrock, E. Estey, M. Wetzler, A. Ferrajoli, D. Harris, M. Blake, J. U. Gutterman ja M. Talpaz, "Inhibition of Acute Myelogenous Leukemia Blast Proliferation by Interleukin-1 (IL-1) Receptor An- taoinist and Soluble IL-1 Receptors, Blood 79 (1992) 1938 -10 1945.

Tehokas terapia täytyy kehittää vielä kaupallisesti IL-Ιβ välitteisten tulehdussairauksien hoitoon. Siispä on olemassa tarve saada käyttöön sellaisia terapeuttisia aineita, joilla hoidetaan ja ehkäistään näitä sairauksia.

15 Kaikki tällä hetkellä hakijoiden tuntemat ICE-inhi- biittorit ovat peptidipohjaisia, joilla saavutetaan etua entsyymin substraattispesifisyyden suhteen. Me kuvaamme tässä keksinnössä ei-peptidipohjaisia ICE-inhibiittoreita, erityisesti sellaisia, joissa pyrimidiini toimii tunnistus-20 korvikkeena P2- ja P3-aminohapoille, joita tähän asti tuli ,, olla läsnä tehokkaissa ICE-inhibiittoreissa (katso kuvio ' 1) . Eräs hyvin tunnettu ei-peptidi-inhibiittoreiden etu , niiden peptidivastinosan suhteen on se, että in vivo meta bolia ja tällaisten ei-peptidisten aineiden eritys vähenee 25 suuresti johtaen siten näiden yhdisteiden parempaan hyöty-osuuteen eläimissä ja ihmisissä (M. J. Humprey ja P. S. Ringrose, "Peptides and Related Drugs: A Revoew of Their

Absorption, Metabolism, and Excretion", Drug Metabolism Reviews 17 (1986) 283 - 310. Myös J. J. Plattner ja D. W.

: 30 Norbeck, "Obstacles to Drug Development from Peptide : Leads", Drug Discovery Technologies, luku 5, s. 92 - 126 (toim. C. R. Clark ja W. H. Moos), Horwood: Chichester, Iso-Britannia, 1990.

112943 5

Kuvio 1

Y H f rC00H

R, OC-HN'-VYi\^^N-A

Y [ H COCH2X

Peptidipohjainen ICE-inhibiittori (R. Dolle et ai., J. Med. Chem. 37 (1994) 563) 5 \ .N r2

TY ? rcooH

O R3 K4

Pyrimidiinipohjainen ICE-inhibiittori (käsillä oleva keksintö) 10 On huomattava, että pyrimidiinipohjaisia trifluori- metyyliketoneja (kuvio 2) kuvattiin äskettäin sereeniprote-aasin, elastaasin, inhibiittoreina. Koska ICE on kysteiini-proteaasi ja on sinänsä tunnettua, että trifluorimetyylike-tonit ovat melko huonoja kysteiiniproteaasien inhibiitto-15 reita (katso B. Imperialia ja R. H. Abies, Biochemistry 25 ; , (1986) 3760 - 3767), on odotettavissa, että kuvion 2 mukai- ; ; set yhdisteet eivät olisi ICE:n inhibiittoreita. Lisäksi on • ‘ tunnettua, että ICE vaatii asparagiinihappoketjun (- CH2COOH) Piissä. Pyrimidiinit, jotka inhiboivat elastaasia 20 (kuvio 2) sisältävät valiinisivuketjun (-CHMea). Lisäksi, kuten myöhemmin osoitetaan, eivät käsillä olevan keksinnön mukaiset pyrimidiinipohjaiset ICE-inhibiittorit (kuvio 1) inhiboi ihmisen valkosolun elastaasia ja siksi ne ovat erittäin selektiivisiä ICE:n suhteen ja ovat selvästi eri-, 25 laisia kuin tunnetut elastaasi-inhibiittorit.

11"0/7 6 I I,..- -/ n u

Kuvio 2

Pyrimidiinipohjainen elastaasi-inhibiittori (Imperial Chemical Industries; EPO 528633-A1, 1993) 5

Keksinnön yhteenveto Käsillä olevan keksinnön mukaisesti annetaan käyttöön kaavan (1) mukainen yhdiste tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola, 10 H\ /R2 ° Il 1^ 0

"A Ϊ >s!V

h o H M (1( j ossa Y on h7^r? tai o 15 p

Vi tai

OH

i

Rs on ORs, jossa Ra on H tai alkyyli; • R2 on Ci-C6-alkyyli, fenyyli, tienyyli tai pyridine 2 0 nyyli, .jolloin fenyyli, tienyyli tai pyridinyyli on mahdollisesti substituoitu halogeenilla; Λ 1 O ;" /i 7 I I i. y 4 u 7 R7 on H, CH20 (CO) o-i-f enyyli, jolloin fenyyliryhmä on mahdollisesti substituoitu halogeenilla, CH2OP (0) Ri4Ris, o H/CF3 Κΐ4γ\0 'Ji \ -θΗ2ο/^γίί^χγ/Η

-CH20^Xnn/ JL

I H H

R16 h 5 j oissa

Ri4 on fenyyli; R15 on fenyyli;

Ri6 on fenyyli tai pyridinyyli, jolloin fenyyli tai 10 pyridinyyli on mahdollisesti substituoitu halogeenilla; ja

Ri on Ci-C6-alkoksi, Ci-C6-alkoksifenyyli tai fenyyli, joka on mahdollisesti substituoitu Ci-C6-alkyylitiol-la .

Termillä "farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat" 15 tarkoitetaan happo- ja emäsadditiosuoloja.

Termillä "happoadditiosuolat" tarkoitetaan niitä suoloja, jotka säilyttävät vapaiden emästen biologisen tehokkuuden ja ominaisuudet ja jotka eivät ole biologisesti tai muuten ei-toivottavia, jotka muodostuvat epäorgaanisten 20 happojen, kuten suolahapon, bromivetyhapon, rikkihapon, typpihapon, fosforihapon ja vastaavien kanssa sekä orgaa-: ; : nisten happojen, kuten etikkahapon, propionihapon, glykoli- hapon, palorypälehapon, oksaalihapon, maleiinihapon, malo-. V, nihapon, meripihkahapon, fumaarihapon, viinihapon, sitruu- . ···, 25 nahapon, bentsoehapon, kanelihapon, mantelihapon, metaani - sulfonihapon, etaanisulfonihapon, p-tolueenisulfonihapon, salisyylihapon ja vastaavien happojen kanssa.

* : Termillä "emäsadditiosuolat" tarkoitetaan niitä suoloja, jotka on johdettu epäorgaanisista emäksistä, kuten 30 natriumista, kaliumista, litiumista, ammoniumista, kalsiumista, magnesiumista, raudasta, sinkistä, kuparista, man- 8 Λ Ί O O A 7 I ί L y °s u gaanista, alumiinista ja vastaavista. Erityisen edullisia ovat ammonium-, kalium-, natrium-, kalsium- ja magnesium-suolat, jotka on johdettu farmaseuttisesti hyväksyttävistä orgaanisista myrkyttömistä emäksistä, joita ovat primaaris-5 ten, sekundaaristen ja tertiääristen amiinien suolat, subs-tituoidut amiinit, kuten luonnossa esiintyvät substituoidut amiinit, sykliset amiinit ja emäksiset ioninvaihtohartsit, kuten isopropyyliamiini, trimetyyliamiini, dietyyliamiini, trietyyliamiini, tripropyyliamiini, etanoliamiini, 2-dime-10 tyyliaminoetanoli, 2-dietyyliaminoetanoli, trimetamiini, disykloheksyyliamiini, lysiini, arginiini, histidiini, kofeiini, prokaiinit, hydrabamiini, koliini, betaiini, ety-leenidiamiini, glukosamiini, metyyliglukamiini, teobromii-ni, puriinit, piperatsiini, piperidiini, N-etyylipiperidii-15 ni, polyamiinihartsit ja vastaavat. Erityisen edullisia orgaanisia, myrkyttömiä emäksiä ovat isopropyyliamiini, dietyyliamiini, etanoliamiini, trimetamiini, disykloheksyyliamiini, koliini ja kofeiini.

Seuraavilla tässä hakemuksessa käytetyillä termeil-20 lä on seuraavat merkitykset, jollei muuta mainita: "Alkyyli" tarkoittaa tyydyttynyttä alifaattista hiilivetyä, joka voi olla joko suora- tai haaraketjuinen. Edullisissa ryhmissä ei ole enempää kuin noin 12 hiiliatomia ja niitä voivat olla metyyli, etyyli, propyyli jne. ja 25 propyylin, butyylin, pentyylin, heksyylin, oktyylin, nonyy-: Iin, dekyylin, undekyylin ja dodekyylin rakenteelliset iso meerit .

"Sykloalkyyli" tarkoittaa tyydyttynyttä syklistä alifaattista hiilivetyä, jossa on vähintään 3 ja enintään 8 30 hiiliatomia. Edullisia ryhmiä ovat syklopropyyli, syklobu-; tyyli, syklopentyyli, sykloheksyyli, sykloheptyyli ja syk- i lo-oktyyli.

"Aryyli" tarkoittaa fenyyli- tai naftyylirengasta ta substituoitua fenyyli- tai naftyylirengasta, joissa yksi ' I 35 tai useampi vetyatomi on korvattu samalla tai erilaisella substituentilla, kuten Ri, CORi tai R25, jossa R25 on H, OH, 9 110 O 6 ^ halo, -0C (O) Rn, -C(0)Rn, -NRnC (0) R;l, -NRnC(O) (CR3R4) 2-eRi, -COORn, -CONR9, R11, R11S-, -NR9,RiiS02R8, -S02NR9,Rii nitro, syano, -NRnCONRg,Rn, joissa Ri, Rs, R9, Rn ja R12 ovat kuten edellä on määritelty.

5 "Heteroaryyli" tarkoittaa substituoimatonta tai va linnaisesti substituoitua mono- tai bisyklistä rengassys-teemiä, jossa on noin 5 - noin 12 hiiliatomia, ja jossa jokaisessa monosyklisessä renkaassa voi olla 0 - noin 4 hete-roatomia, ja jokaisessa bisyklisessä renkaassa voi olla 0 -10 noin 5 heteroatomia, joita voivat olla N, O tai S, sillä edellytyksellä, että mainitut heteroatomit eivät ole vierekkäisiä happi- ja/tai rikkiatomeja ja joissa substituen-tit, numeroitu nollasta viiteen, voivat sijaita missä tahansa sopivassa rengassysteemin asemassa ja ne on valinnai-15 sesti valittu substituenteista, jotka on määritelty aryylin kohdalla. Esimerkkejä tällaisista mono- ja bisyklisistä rengassysteemeistä, joita ei missään tapauksessa tule pitää käsillä olevan keksinnön piiriä rajoittavina, ovat bentso-furaani, bentsotiofeeni, indoli, bentsopyratsoli, kumarii-20 ni, isokinoliini, pyrroli, tiofeeni, furaani, tiatsoli, imidatsoli, pyratsoli, triatsoli, kinoliini, pyrrollideno-ni, pyrimidiini, pyridiini, pyridoni, pyratsiini, pyridat-siini, isotiatsoli, isoksatsoli ja tetratsoli.

"Aralkyyli" tarkoittaa alkyyliryhmää, joka on sub-25 stituoitu aryyliradikaalilla. Esimerkkinä bentsyyli.

; "Heteroaralkyyli" tarkoittaa aikyyliryhmää, joka on substituoitu heteroaryyliradikaalilla. Esimerkkinä (4-pyri-dyyli)metyyli.

"Alkoksi" tarkoittaa 0-atomia, joka on substituoitu ; 30 alkyylillä, aryylillä tai aralkyyliradikaalilla. Esimerk keinä metoksi, etoksi, fenoksi ja bentsyylioksi.

"Halo" tarkoittaa jodia, bromia, klooria ja fluoria .

Nimitys "(CR3R4)2-4" tarkoittaa alkyylisidosta, joka 3 5 koostuu ainakin kahdesta mutta korkeintaan neljästä hiiliatomista, joissa mainitut hiiliatomit on toisistaan riip- 112943 10 pumatta substituoitu radikaaleilla, joita kuvataan R3 ja R4. Esimerkkejä tällaisista sidoksista ovat, näihin kuitenkaan rajoittumatta, etyyli, propyyli, butyyli, 2-metyyli-etyyli-(MeHCCH2-) , 2,2-dimetyylietyyli-(Me2CCH2-) .

5 Käsillä oleva keksintö koskee myös farmaseuttista koostumusta ja kaavan I mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan käyttöä lääkkeen valmistamiseksi, jota käytetään IL-l6-proteaasivälitteisten tautitilojen tai häiriöiden hoitamiseksi tällaisen hoidon tar-10 peessa olevassa nisäkkäässä. Tällöin potilaalle annetaan kaavan (I) mukaisia IL-lE-proteaan-inhibiittoreita aktiivisena aineena. Tällaisia tautitiloja ja häiriöitä ovat tulehdussairaudet, kuten aivokalvontulehdus ja korvatorven tulehdus, septinen shokki, hengitysteiden sairaudet, tuleh-15 duksiset tilat, kuten niveltulehdus, sappitiehyttulehdus, paksusuolentulehdus, aivotulehdus, maksatulehdus, haimatulehdus ja reperfuusiovammat, immuunipohjaiset sairaudet, kuten liikaherkkyys, auto-immuunisairaudet, kuten MS-tauti, luusairaudet sekä tietyt kasvaimet ja leukemiat.

20 Käsillä olevalla keksinnöllä on erityistä käyttö kelpoisuutta IL-IS:n prosessoinnin moduloinnissa nivelreuman hoitamiseksi. IL-lE:n tasojen tiedetään kohoavan tätä tautia sairastavien potilaiden nivelvoidenesteessä. Lisäksi IL-Ιβ stimuloi sellaisten entsyymien synteesiä, joiden us-25 kotaan olevan mukana tulehduksessa, kuten kollagenaasin ja PLA2:n synteesiä, ja aiheuttaa niveltuhoa, joka on hyvin samankaltainen nivelreuman kanssa, sen jälkeen, kun sitä on annettu intra-artikulaarisena injektiona eläimille.

Käytännön mukaisesti annetaan tehokas määrä käsillä 3 0 olevan keksinnön mukaista yhdistettä tai sitä sisältävää ; koostumusta tällaisen hoidon tarpeessa olevalle tai sitä . haluavalle kohteelle. Näitä yhdisteitä tai koostumuksia , voidaan antaa millä tahansa tavalla riippuen spesifisestä : loppukäytöstä, kuten oraalisesti, parenteraalisesti (kuten 'h 35 subkutaanisesti, intra-artikulaarisesti, intramuskulaari- sesti ja intravenoosisesti) , rektaalisesti, bukkaalisesti 112943 11 (kuten sublinguaalisesti), transdermaalisesti tai in-tranasaalisesti. Sopivin reitti jokaisessa tapauksessa riippuu käytöstä, aktiivisesta ainesosasta ja kyseessä olevasta kohteesta. Yhdistettä tai koostumusta voidaan antaa 5 myös hitaasti vapautuvina, depot-implanttina tai injektoitavina formulaatioina, kuten jäljempänä kuvataan täsmällisemmin.

Tavallisesti käsillä olevassa keksinnössä kuvatuissa käytöissä on edullista antaa aktiivista ainesosaa noin 10 0,1 - 100 mg painokiloa kohden, edullisemmin noin 0,1 - 30 mg painokiloa kohden, ja ihmisterapiassa aktiivista ainesosaa annetaan edullisesti noin 0,1 mg - noin 20 - 50 mg painokiloa kohden päivässä. Tämä anto voidaan suorittaa yhdellä kerralla, antamalla useita kertoja päivässä tai käyt-15 tämällä hitaasti vapautuvaa muotoa mahdollisimman tehokkaiden tulosten saamiseksi. Kun aktiivista ainesosaa annetaan yksittäisenä annoksena, on se edullisimmin noin 0,1 - noin 10 mg painokiloa kohden.

Näiden yhdisteiden ja koostumusten tarkka annos 20 hoito-ohjelma riippuu välttämättä yksittäisen hoidettavan kohteen tarpeista, hoitotyypistä ja kärsimyksen tai tarpeen asteesta. Tavallisesti parenteraalisessa annossa tarvitaan alempaa annosta kuin muissa antomenetelmissä, jotka ovat enemmän riippuvaisia absorptiosta.

25 Käsillä olevan keksinnön lisäaspekti kohdistuu far maseuttisiin koostumuksiin, jotka sisältävät aktiivisena ainesosana käsillä olevan keksinnön mukaista yhdistettä yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän, myrkyttömän kantajan kanssa. Kuten edellä on jo mainittu, voidaan tällaiset 30 koostumukset valmistaa parenteraalista (subkutaanista, in-tra-artikulaarista, intramuskulaarista tai intravenoosista) . antoa varten erityisesti nestemäisten liuosten tai suspen sioiden muodossa, oraalista tai bukkaalista antoa varten erityisesti tablettien tai kapseleiden muodossa, tai in-1' 35 tranasaalista antoa varten erityisesti jauheiden, nenätip- pojen tai aerosolien muodossa.

1 1 O 0 £\ 7 12 1 * -.......' r ^

Kun yhdisteitä annetaan oraalisesti (tai rektaali-sesti), ne tavallisesti formuloidaan yksikköannosmuotoon, kuten tabletti, kapseli, peräpuikko tai tärkkelyskapseli. Tällaiset formulaatiot sisältävät tyypillisesti kiinteää, 5 puolikiinteää tai nestemäistä kantajaa tai diluenttia. Esimerkkejä diluenteista ja vehikkeleistä ovat laktoosi, dekstroosi, sakkaroosi, sorbitoli, mannitoli, tärkkelykset, arabikumi, kalsiumfosfaatti, mineraaliöljy, kaakaovoi, teo-bromiöljy, aginaatit, tragantti, gelatiini, siirappi, melo tyyliselluloosa, polyoksietyleenisorbitolimonolauraatti, metyylihydroksibentsoaatti, propyylihydroksibentsoaatti, talkki ja magnesiumstearaatti.

Koostumukset voidaan valmistaa millä tahansa farmasian alalla tunnetulla menetelmällä, kuten esimerkiksi te-15 oksessa Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. painos (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985) on kuvattu. Pa-renteraalisesti annettavat formulaatiot voivat sisältää yleisinä täyteaineina steriiliä vettä tai suolaliuosta, al-kyleeniglykoleja, kuten propyleeniglykolia, polyalkyleeni-20 glykoleja, kuten polyetyleeniglykolia, kasvisperäisiä öljyjä, hydrattuja naftaleenejä ja vastaavia. Esimerkkejä pa-renteraalisesssa annossa käytettävistä vehikkeleistä ovat , vesi, vesipitoiset vehikkelit, kuten suolaliuos, Ringerin i liuos, dekstroosiliuos ja Hankin liuos ja ei-vesipitoiset 25 vehikkelit, kuten rasvaöljyt (kuten maissi, pellavansiemen, pähkinä ja seesami), etyylioleaatti ja isopropyylimyri-staatti. Steriili suolaliuos on edullinen vehikkeli ja yhdisteet ovat riittävän vesiliukoisia ja siksi niitä voidaan • saada liuoksina kaikkiin ennalta arvattaviin tarpeisiin.

30 Vehikkeli voi sisältä pieniä määriä lisäaineita, kuten aineita, jotka parantavat liukoisuutta, isotonisuutta ja ke-; miallista pysyvyyttä, esimerkiksi antioksidantit, puskurit ja säilöntäaineet. Oraalisessa annossa formulaatiota voi-daan parantaa lisäämällä sappisuoloja ja myös lisäämällä 35 asyylikarnitiinejä (Am. J. Physiol. 251 (1986) 332). Nasaa-lisesti annettavat formulaatiot voivat olla kiinteitä ja ne 13 112243 voivat sisältää täyteaineina esimerkiksi laktoosia tai dekstraania, tai ne voivat olla vesi- tai öljyliuoksia, joita annetaan nenätippoina tai mittasuihkeina. Bukkaali-sessa annossa tyypillisiä täyteaineita ovat sokerit, kal-5 siumstearaatti, magnesiumstearaatti, esigelatinoitu tärkkelys ja vastaavat.

Formuloitaessa nasaalista antoa varten paranee absorptio nenän limakalvon yli pinta-aktiivisilla aineilla, joita ovat esimerkiksi glykolihappo, sappihappo, taurosap-10 pihappi, etosappihappo, desoksisappihappo ja vastaavat (katso B. H. Vickery, "LHRH and its Analogs - Contraception and Therapeutic Applications", osa 2 (toim. B. H. Vickery ja J. S. Nester), MTP Press, Lancaster, Iso-Britannia, 1987).

15 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Käsillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet valmistettiin käyttämällä yleisiä synteettisiä menetelmiä, joita on kuvattu kaavioissa 1, 2, 3 ja 4. Z-asparagiinihappo-a- bromimetyyliketonia (kaavio 1; kaava 1; Z = bentsyylioksi-20 karbonyyli) käsitellään alkoholilla tai karboksyylihapolla -it KF:n läsnä ollessa käyttäen DMF:a liuottimena ja näin saadaan u-substituoituja Z-asparagiinihappometyyliketoneja (kaava 2). Kaavan 1 mukaisen bromidin valmistus ja sen kon-• versio kaavan 2 mukaisiksi yhdisteiksi suoritetaan käyttä- 25 mällä menetelmiä, joita A. Krantz et ai. ovat kuvanneet (Biochemistry 30 (1991) 4678 - 4687) . Sitten Z-ryhmä pois tetaan N-terminaalisen amiinin (kaavan 3) saamiseksi hydro-genolyyttisissä olosuhteissa. Reagenssit ja olosuhteet, ; joita tyypillisesti käytetään suoritettaessa Z-ryhmän hyd- 1· 30 rogenolyyttinen poisto, ovat vetykaasu, ympäristön lämpöti- , : la ja ympäristön paine, 5-%:inen palladioitu hiili kata- . lyyttinä alkoholisessa liuottimessa, esimerkiksi metanolis- sa, joka sisältää valinnaisesti 2 ekvivalenttia suolahap-: poa. Välituotteen vapaata amiinia (tai hydrokloridisuolaa, '·"* 35 jos suolahappoa käytetään hydrogenolyysissä) ei ole tarpeen puhdistaa, joskin tämän materiaalin tulee olla kuivaa ja 14 Ί12943 alkoholitonta seuraavaa paritusreaktiota varten hyvän saannon saamiseksi. Sitten näin saatu amiini (kaava 3) konden-soidaan pyrimidiinkarboksyylihapon (kaava 4) kanssa kaavan 5 mukaisten välituotteiden saamiseksi. Yleensä on tarpeen 5 ensin aktivoida pyrimidiinikarboksyylihappo happokloridina tai seosanhydridinä ja sitten antaa sen reagoida vapaan amiinin (tai hydrokloridisuolan) kanssa orgaanisen emäksen, esimerkiksi N-metyylimorfoliinin kanssa. Vaihtoehtoisesti pyrimidiinikarboksyylihapon paritus välituoteamiinin kanssa 10 suoritetaan käyttämällä amidia kytkeviä reagensse-ja/olosuhteita, joita käytetään peptidien kytkentäkemiassa (The Practice of Peptide Synthesis, M. Bodanszky, Springer-Verlag, NY, 1984; The Peptides, voi. 1-3, (toim. E. Gross ja J. Meienhofer), Academic Press, NY, 1981). Jäljelle jää-15 vä synteettinen transformointi ICE-inhibiittoreiden saamiseksi on t-butyyliesteritoiminnan hydrolyysi. Tämä suoritetaan panemalla t-butyyliesteri (kaava 5) 25-%:iseen liuokseen, jossa on trifluorietikkahappoa (TFA) metyleeniklori-dissa 25 °C:ssa. De-esteröinti on tavallisesti täydellinen 20 3 tunnin kuluessa. Haihtuvan TFA:n ja orgaanisen liuottimen poiston jälkeen saadaan asparagiinihappoa (kaava 6) . Reaktion saanto on kvantitatiivinen useimmissa tapauksissa, jolloin t-butyyliesterilähtöaine on erittäin puhdasta. Jos ·, puhdistusta tarvitaan, se voidaan suorittaa uudelleenki- 25 teyttämällä tai kromatografisilla tekniikoilla, jotka ovat alan ammattilaisten sinänsä tuntemia. TFA:n pitoisuus voi vaihdella välillä 5 - 100 % ja muita orgaanisia liuottimia, kuten kloroformia, voidaan käyttää. TFA-metyleenikloridi-. * liuoksen sijasta voidaan käyttää yhtä suuren tehon saarni- .· 3 0 seksi myös 3-molaarista liuosta, jossa on vedetöntä suola- .' happoa etyyliasetaatissa.

Kaaviossa 2 kuvataan pyrimidiinejä sisältävän as-partyylialdehydin synteesiä. Lähtöaine synteesissä on as-partyylisemikarbatsoni (kaava 7). Z-ryhmä poistetaan tavan-• 35 omaisissa hydrausolosuhteissa vastaavan amiinin (kaava 8) saamiseksi. Sitten tämä yhdiste kytketään pyrimidiinihap- 15 1 iiv40 poon (kaava 4) käyttämällä kytkentäolosuhteita, jotka ovat samanlaiset kuin edellä on kuvattu. Kaksinkertaista suojauksen poistoa tarvitaan beetakarboksyylihapon (trifluori-etikkahapon) ja alfa-aldehydin vapauttamiseksi (37 % vesi-5 pitoinen paraformaldehydi, etikkahappo, metanoli), jolloin saadaan kaavan 10 mukaisia yhdisteitä.

Kaaviossa 3 kuvataan vaihtoehtoista synteettistä menetelmää Ri-ryhmien saamiseksi pyramidiini-5-aminofunk-tioon, joka vielä parantaa käsillä olevaa keksintöä. Pyri-10 midiinit joko vapaina happoinaan, estereinään tai aspara-giinihappoamideinaan, jotka sisältävät Z-ryhmän (kaava 11), voidaan alistaa hydrausolosuhteisiin (samanlaisiin kuin yllä on kuvattu) vastaavien 5-aminopyrimidiinien (kaava 12) saamiseksi. Amiiniosan voidaan antaa reagoida happokloridi-15 en tai aktivoitujen karboksyylihappojen kanssa (olosuhteet samankaltaiset kuin edellä esitetyssä kaaviossa 1 kuvatut kaavan 3 ja 4 mukaisten yhdisteiden kytkennässä käytetyt olosuhteet), jolloin saadaan Ri-ryhmän sisältäviä pyrimi-diinejä, joiden rakenteellinen erilaisuus on Russä.

20 Kaaviossa 4 kuvataan tarpeellisten pyrimidiinien synteesiä. Käytetyt lähtöaineet ovat 3-karboksietyylipyri-midiinejä, joissa on joko N-allyyli (kaava 13) tai N-aset-aldehydidimetyyliasetaali (kaava 14) . Alan ammattilaiset osaavat helposti päätellä näiden synteesit käyttämällä kir-25 jallisuudessa esitettyjä reaktio-olosuhteita (C. A. Veale, et ai., J. Org. Chem. 58 (1993) 4490 - 4493; K. A. Gupta, et ai., Ind. J. Chem. 21B, 228; M. P. Nemeryuk, et ai.,

Collect. Czech. Chem. Commun. 51 81986) 215 - 233) . Etyy-* liesterit hydrolysoidaan vesipitoisen emäksen (LiOH H2O- 30 THF: ssa tai NaOH H20-THF:ssa) läsnä ollessa, ja näin saadaan vastaavia happoja (kaavat 15 ja 16) . Karboksyylihapot puolestaan alistetaan Curtiuksen uudelleenjärjestelyyn (J. R. Pfister, et ai., Synthesis (1983) 38; A. S. Radhakrish- . na, et ai., Synthesis (1983) 538; K. Ninomiya, et ai., tet- 35 rahedron 30 (1974) 2151), jolloin saadaan erittäin reaktiivista isosyanaattia (kaavat 17 ja 18), jota ei eristetä, 112943 16 vaan sen annetaan reagoida heti alkoholin tai amiinin kanssa (katso K. Ninomiya et ai., supra). Tästä kokonaisprosessista saadaan joko karbamaattia (isosyanaatti kiinni alkoholin kanssa) tai ureaa (isosyanaatti kiinni amiinin kans-5 sa) , kuten kaavoissa 19 ja 20 esitetään. Tässä kohdassa synteesi menee eri suuntiin siinä, että jos lähtöaineena käytettiin N-allyylipyrimidiiniä (kaava 19), hapetetaan olefiini osmiumtetroksidi/N-metyylimorfoliini-N-oksidin (katso V. VanRheenen, et ai., Tetrahedron Lett. (1976) 10 1973 - 1976; Organic Synthesis, voi. 58, s. 43 - 51) ja natrium- tai kaliumperjodaatin (H. O. House, Modern Synthetic Reactions, W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA, 1972, s. 353 - 359) kanssa, jolloin saantona saadaan välituoteal-dehydiä (kaava 13 _> kaava 19 _> kaava 21) . Vaihtoehtoises-15 ti, jos lähtöaineena käytettiin N-asetaldehydidimetyyliase-taalia (kaava 20) , käsitellän dimetyyliasetaalifunktionaa-lisuutta laimealla hapolla (vesipitoinen HC1) välituoteal-dehydin vapauttamiseksi (kaava 14 kaava 20 -» kaava 21) . Kaavan 4 mukaiset hapot saadaan kaavan 21 mukaisista alde-20 hydeistä natrium- tai kaliumkloriittivälitteisellä hapetuksella (B. S. Bal, et ai., Tetrahedron 37 (1981) 2091). Oli-. si huomattava, että kiinnittämällä isosyanaatti (kaavat 17 ja 18) bentsyylialkoholin kanssa, saadaan Z-karbamaattivä-lituotteita, jotka lopulta johtavat kaavan 11 mukaiseen yh-25 disteeseen (kaavio 3).

Kaavio 1 ]_ 7 It d „> 4 \j ^COO!-Bu -COOl-Bu

Γ H-R26 ja KF

Z-HN^'cOCH^Bf DMF:Ssa Z'HN COCH2R26

Kaava 1 Kaava 2

H2 '.pd/C; pCOOt-Bu ^ Q EtOCOCI

X J, I) N-metyylimorfoliini

HjN^cOCI-tR^ ---- i- J J Λ

Kaava 3 Kaava 4 VV^O »ry,. D Trifluori- n XT i r ussa_ XT i r T V/h 000¾¾ -H.OC.HNJty Λ O Ra ^ o Ra ^

Kaava 5 Kaava 6 5 Kaavio 2 COOt-Bu pCOOt-Bu Z-HhAc.NNHCONH2 —C-NNHCONH2

Kaava 7 Kaava 8 n EtOCDCl • X 1 N-metyyli- 11 1, 11 morfoliini o Ra R< KäaVä 4 H. ^Rj i) Trifluori- 'V''1^-'''02 O rmi4 > jX X[^ j? pCOOt-Bu etikkahappo Jj I fl Γ ' R'°C'Hf'rXX%<T^|fjr' C-NNHCONH, vesipitoinen B'OC HrrjX It α|α O Ra R< paraformaldehydi, O “3 4 : Kaava 9 HOAc ja MeOH Kaava 10

Kaavio 3 18 1 '\2946

YY2I

δ fC** \ Η2; Pd/C;

Kaava 11 \2 ekv. HC1 R?. N N/ Y 3 o h2w^\/n\<^w

O R< RS

Kaava 12

RjCOCI tai R^C^COR

ΗγΝγ*2 o i dT Ra R<

; Kaava 4: VV = OH

^COOl-Bu ; Kaava 5: VV = HN COCH2R26 ^COOt-Bu ; Kaava 9: VV = HN C=N-NHCONH2

Kaavio 4 19 112:-:-43 VV"'’* I Ϊ T (Ph0)2P(0)N3

EtOOC-^\^N\^R27 - --

Kaava 13: R27 .= CH=CH2 Kaava 15: R27 = CH=CH2

Kaava 14: R27 = CH(OMe)2 Kaava 16; R27 «= CH(OMe)2 Ηγ^^γ"Η2 hi^ r2 I I R23OH, RnNHR9·tai R24NHRU V Ύ o=c=nY^/ "yC 27 R,OC-HN-^v^n\^r27 ä r< Rs T z* r27 «= ch=ch2 R27 = CH(OMe) Kaava 19: R27 - CH=CH2

Kaava 20: R27 « CH(OMe)2 jos R27= CH(OMe)2: (i) H* H m r jos R27 = CH=CH2: (i) OsCVpyr; V" ^h-i^ & Ra R<

Kaava 21 : HjY!

R,OC-HN'Yx^n\/COOH

T rN

·’ Kaava 4 112 y 4 3 20 j oissa R3 ja R4 ovat toisistaan riippumatta H, alkyyli tai aralkyyli; R2 on H, alkyyli, - (CH2) o-4-sykloalkyyli,-(CH2)o--r\3i <· 5 RT9 -(CH2)o-4^\!^ ' arYYli/ heteroaryyli, aralkyyli, hetero- aralkyyli, - (CH2) 2-4-Rio, j ossa n on 1 - 3; 10 Rio on ai koksi, CH2F, CHF3, CF3/ CF2CF3, OH, COORu, CONR9R11 tai NR9R11; R9 on toisista riippumatta H, alkyyli, aryyli, aralkyyli, heteroaryyli, heteroaralkyyli, -CH2CH20-alkyyli tai C (O) -R12 ; 15 R11 on toisista riippumatta H, alkyyli, aryyli, aralkyyli, heteroaryyli tai heteroaralkyyli; ja kun Rg ja Ru ovat yhdessä, ne voivat olla seu-raavan tyyppisiä 5-, 6- tai 7-jäsenisiä renkaita & (I.

: 20 joissa n on 1 - 3 ja m on 0 - 1; ja

Ri on määritelty siten, että se on R19-R2, R19-R2O/ Rl9 ~ R2I / R19-NR9R11, 25 jossa R19 on (CR3R4) o - 4;

_ O

: R2o on ^ ^ ja , jossa X on O, S, NR9 3 0 R21 on ja / jossa n on 1 - 3; 1 R22O- 112943 21 jossa R22 on alkyyli, aryyli, heteroaryyli, aralkyyli, heteroaralkyyli, Rig-sykloalkyyli, R19-R21, R23-R10/ R23-R20, jossa R23 on (CR3R4)2-4; 5 R9R11N- ja R24R11N-, jossa r24 on Rig-sykloalkyyli, R19-R21, R23-R10/ R23-R20, CR3R4C-OOR11 tai CR3CR4CONR9R11, Z on kuten bentsyylioksikarbonyyliryhmän kohdalla 10 on määritelty, W on OH-ryhmä, HNC(-H) (CH2C00tBu) COCH2R26-osa tai HNC(H) (CH2COOtBu) C=NNHC0NH2-osa, jossa R26 on F, -O (CO) 0-1-aryyli, -OP (O) R14R15,

rk 9 S

hwr’7 vs y~f° XX Λ

R,6 H 1 H

H

% \--^Rl8 tai /»

-0 VN

- joissa ; 15 Rg on toisista riippumatta H, alkyyli tai aralkyy li;

Ri4 on H, alkyyli tai aryyli; . R15 on H, alkyyli tai aryyli; t

Ri6 on H, alkyyli, aryyli, heteroaryyli, aralkyyli 20 tai heteroaralkyyli;

Rl·7 on H, alkyyli, CF3, CF2CF3, aryyli, heteroaryyli, aralkyyli, heteroalkyyli, COORn tai CONRgRn ja ; Rie on H, alkyyli, CF3, CF2CF3, aryyli, heteroaryy- • li, arylkyyli, heteroaralkyyli.

25 Seuraavat esimerkit kuvaavat käsillä olevan keksin nön mukaisia yhdisteitä lisää.

112943 22

Esimerkki 1 N- [2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(4-fluorifenyyli)-1,β-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli-L-as-paragiinihappo-2,6-diklooribentsoyylioksimetyyliketoni 5 Osa A: N-bentsyylioksikarbonyyli-L-asparagiinihapon bromimetyyliketoni-S-tert-butyyliesteriä (0,3 g, 0,76 tnM) liuotettiin 12 ml:aan vedetöntä DMF:a. Tähän liuokseen lisättiin jauhettua kaliumfluoridia (0,11 g, 19 mmol) ja 2,6-diklooribentsoehappoa (0,17 g, 0,91 mmol) ja reaktioseosta 10 sekoitettiin yön yli. Liuos laimennettiin Et20:lla ja pestiin vedellä, vesipitoisella kyllästetyllä NaHC03:lla sekä suolavedellä ja kuivattiin (MgS04) . Näin saatu ketoni puhdistettiin silikageelikromatografisesti käyttäen etyyliase-taatti/heksaania eluointiliuottimena (¾ NMR (CDCI3) δ 7,36 15 (m, 9H) , 5,90 (d, 1H) , 5,20 (m, 4H) , 4,67 (m, 1H) , 3,00 ja 2,75 (dublettien dubletti, 1H kukin), 1,42 (s, 9H)).

Osa B: N-bentsyylioksikarbonyyli-L-asparagiinihapon 2,6-diklooribentsoyylioksimetyyliketoni-E-tert-butyylieste-riä (1,02 g, 2 mmol, saatu edellä esitetyn osan A mukaises-20 ti) liuotettiin absoluuttiseen etanoliin (100 ml, 4 mmol), joka sisälsi 2 ekvivalenttia 6 N vesipitoista suolahappoa : (4 mmol) ja 10-%:ista palladioitua hiiltä (96 mg). Reaktio- seosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa vetykaasun il-, makehässä noin 1 tunti (ohutlevykromatografointi [5 % MeOH- 25 CH2CI2] osoitti lähtöaineen häviämisen). Liuos suodatettiin ja liuotin poistettiin tyhjössä, jolloin saatiin L-asparagiinihapon 2,6-diklooribentsoyylioksimetyyliketoni-S-tert-butyyliesterin HCl-suolaa, joka käytettiin välittömästi seuraavassa reaktiossa, jota on kuvattu osassa C.

1 30 Osa C: Liuos, jossa oli 2-(5-bentsyylioksikarbonyy- : liamino-6-okso-2-(4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro-l-pyrimidi- : nyyli) etikkahappoa (771 mg, 2,05 mmol) CH2Cl2:ssa (10 ml), jäähdytettiin -20 °C:een ja siihen lisättiin peräkkäin iso-butyylikloroformaattia (0,28 ml, 2,05 mmol) ja N-metyyli-• 35 morfoliinia (0,23 ml, 2,05 mmol). Reaktioseosta sekoitet tiin 15 minuuttia ja siihen lisättiin liuosta, jossa oli 112943 23 asparagi ini hapon 2,6-diklooribentsoyylioksiinetyyliketoni -β-tert-butyyliesterin HCl-suolaa (valmistettu edellä esitetyssä osassa B) ja sitten siihen lisättiin vielä toistamiseen N-metyylimorfoliinia (0,23 ml, 2,05 mmol). Reaktio-5 seosta sekoitettiin 30 minuuttia ja sitten se laimennettiin EtOAc:lla, pestiin vedellä, vesipitoisella, kyllästetyllä NaHC03:lla sekä suolavedellä ja kuivattiin (MgS04) . Liuottimet poistettiin tyhjössä ja tuote puhdistettiin sili-kageelikromatografisesti käyttämällä 40-%:ista EtOAc-hek-10 saania eluenttina ja näin saatiin N-[2-(5-bentsyylioksikar-bonyyliamino-6-okso-2-(4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro-l-pyri-midinyyli)asetoyyli-L-asparagiinihappo 2,6-diklooribentso-yylioksimetyyliketoni-S-tert-butyyliesteriä (1,2 g, 80 %).

Osa D: Liuosta, jossa oli N-[2-(5-bentsyylioksikar-15 bonyyliamino-6-okso-2-(4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro-l-pyri-midinyyli)asetoyyli-L-asparagiinihappo 2,6-diklooribentsyy-lioksimetyyliketoni-β-tert-butyyliesteriä (valmistettu edellä esitetyssä osassa C) metyleenikloridissa, joka sisälsi 25 tilavuus-% (v/v) trifluorietikkahappoa (20 ml), 20 sekoitettiin 2 tuntia 0 °C:ssa. Liuotin poistettiin tyhjössä ja jäännös puhdistettiin silikageelikromatografisesti, . jolloin saatiin analyyttisesti puhdasta N- [2-(5-bentsyyli- oksikarbonyyliamino-6-okso-2-(4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro- 1- pyrimidinyyli)asetoyyli-L-asparagiinihappo-2,6-dikloori-25 bentsoyylioksimetyyliketonia, matala resoluutiomassaspekt- ri: m/z = 699 (M+H).

Esimerkki 2 N- [2- (5-tiometyylibentsoyyliamino-6-okso-2-(4-fluorifenyyli) -1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-aspara-30 giinihappo-2,6-diklooribentsoyylioksimetyyliketoni : Osa A: N- [2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso- 2- (4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli-L-asparagiinihappo- 5- (1-(4-kloorifenyyli)-3-trifluorimetyy- ‘ li)pyratsolioksimetyyliketoni-E-tert-butyyliesteri (2,5 g, 35 3,0 mmol) liuotettiin absoluuttiseen etanoliin (100 ml, 4 mmol), joka sisälsi 2 ekvivalenttia 6 N vesipitoista HCl:a.

24 1:1:43

Liuoksesta poistettiin kaasu typellä ja siihen lisättiin 10-%:ista palladioitua hiiltä (300 mg). Reaktioseosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa vetykaasun ilmanpaineessa noin 5 tuntia (ohutlevykromatografointi [50 % EtOAc-5 heksaani; lähtöaineen Rf = 0,5; tuotteen Rf = 0,0] osoitti lähtöaineen häviämisen). Liuos suodatettiin ja liuotin poistettiin tyhjössä, jolloin saatiin N-[2-(5-amino-6-okso-2-(4-fluorifenyyli-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-asparagiinihappo-5-(1-(4-kloorifenyyli)-3-trifluorimetyy-10 li)pyratsolioksimetyyliketoni-6-tert-butyyliesteriä, jota käsiteltiin aseotrooppisesti tolueenin kanssa ja tätä tuotetta käytettiin ilman lisäpuhdistusta seuraavassa reaktiossa, jota kuvataan osassa B.

Osa B: Liuokseen, jossa oli N-[2-(5-amino-6-okso-2-15 fenyyli-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-asparagiinihappo-5- (1-(4-kloorifenyyli)-3-trifluorimetyyli)pyratso-lioksimetyyliketoni-S-tert-butyyliesteriä (713 mg, 1,0 mmol, valmistettu edellä kuvatussa osassa A) metyleeniklo-ridissa (30 ml), lisättiin 5 °C:ssa 4-tiometyylibentsoyyli-20 kloridia (279 mg, 1,5 mmol) ja sitten N-metyylimorfoliinia (0,5 ml, 4,5 mmol) ja 4-N, N-dimetyyliaminopyridiiniä (10 mg). Reaktioseosta sekoitettiin 2 tuntia 5 °C:ssa ja sitten sen annettiin lämmetä huoneenlämpöön. Liuos laimennettiin EtOAc:11a, pestiin vedellä, vesipitoisella, kyllästetyllä 25 NaHC03:lla sekä suolavedellä ja kuivattiin (MgS04) . Liuot-; timet poistettiin tyhjössä. Tuote puhdistettiin silikagee- likromatografisesti käyttämällä noin 30-%:ista EtOAc-hek-saania eluenttina ja näin saatiin N-[2-(5-(4-tiometyyli-bentsoyyliamino)-6-okso-2-(4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro-l-• 30 pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-asparagiinihappo-5-(1-(4-kloori- ‘ fenyyli)-3-trifluorimetyyli)pyratsolioksimetyyliketoni-β- tert-butyyliesteriä 50 %:n saannolla.

Osa C: N-[2-(5-(4-tiometyylibentsoyyliamino)-6- okso-2-(4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro-1-pyrimidinyyli)aseto-: 35 yyli]-L-asparagiinihappo-5-(1-(4-kloorifenyyli)-3-trifluo rimetyyli ) pyratsolioksimetyyliketoni-β-tert-butyyliesteri 25 11 V04- I I i-. i V.· konvertoitiin vastaavaksi hapokseen, N- [2-(5-(4-tiobentso-yyliamino)-6-okso-2-(4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro-1-pyrimi -dinyyli)asetoyyli]-L-asparagiinihappo-5-(1-(4-kloorifenyy-li)-3-trifluorimetyyli)pyratsolioksimetyyliketonia käyttä-5 mällä esimerkin 1 osassa D kuvattuja olosuhteita.

Massaspektri: m/z = 787 (M+H).

Kaavioiden 1 ja 2 mukaisten menetelmien ja esimerkeissä 1 ja 2 kuvattujen menetelmien mukaisesti valmistettiin seuraavat yhdisteet.

10 Esimerkki 3 N-[2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-as-paragiinihappodifenyylifosfiinioksimetyyliketoni

Massaspektri: m/z = 727 (M+H).

15 Esimerkki 4 N-[2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-asparagiinihappo-5- (1-(4-kloorifenyyli)-3-trifluorimetyyli)-pyratsolioksimetyyliketoni 20 Massaspektri: m/z = 771 (M+H).

,, Esimerkki 5 N-[2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-asparagiinihappo-5- (3-fenyyli)kumarinyylioksimetyyliketoni ! 25 Massaspektri: m/z = 747 (M+H).

Esimerkki 6 N- [2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-asparagiinihappo-5- (l-fenyyli-3-trifluorimetyyli)pyratsoliok-, * 3 0 simetyyliketoni • Massaspektri: m/z = 737 (M+H).

i ' I'0 A

26 I * -·

Esimerkki 7 N- [2-(5-isopropyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-fe-nyyli-1,6-dihydro-1-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-asparagiini-happo- 5 - (1- f enyy1i-3-trifluor ime tyy1i)pyra t so1ioks ime tyy1i-5 ketoni

Massaspektri: m/z = 671 (M+H).

Esimerkki 8 N-[2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2- (3-pyridinyyli)-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-aspa- 10 ragiinihappo-5-(l-fenyyli-3-trifluorimetyyli)pyratsolioksi-metyyliketoni

Massaspektri: m/z = 720 (M+H).

Esimerkki 9 N- [2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(2- 15 tienyyli)-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-aspara-giinihappo-5-(l-fenyyli-3-trifluorimetyyli)pyratsolioksime-tyyliketöni

Massaspektri: m/z = 725 (M+H).

Esimerkki 10 20 N-[2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-me- tyyli-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-asparagiini-; happo-5-(l-fenyyli-3-trifluorimetyyli)pyratsolioksimetyyli- ketoni

Massaspektri: m/z = 657 (M+H).

25 Esimerkki 11 N-[2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(2-tienyyli)-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-aspara-giinihappo-5-(1-(2-pyridinyyli)-3-trifluorimetyyli)pyratso-lioksimetyyliketoni : 30 Massaspektri: m/z = 726 (M+H).

Esimerkki 12 N- [2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(2-tienyyli)]-L-asparagiinihappo-5-(1-(4-kloorifenyyli)-3-tri-fluorimetyyli)pyratsolioksimetyyliketoni 35 Massaspektri: m/z = 759 (M+H).

112043 27

Esimerkki 13 N-[2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(2-tienyyli)]-L-asparagiinihappo-2,6-diklooribentsoyylioksime-tyyliketoni 5 Massaspektri: m/z = 687 (M+H).

Esimerkki 14 N- [2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(2-tienyyli)-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-aspara-giinihappoaldehydi 10 Massaspektri: m/z = 485 (M+H).

Käsillä olevan keksinnön mukaisista yhdisteistä testattiin IL-lfi-proteaasi-inhibitioaktiivisuus seuraavien ohjeiden mukaisesti:

In vi t ro 15 Toisen kertaluvun nopeusvakiot inaktivoinnin suh teen saatiin käyttämällä entsyymimääritystä, jonka R. E. Dolle et ai., ovat kuvanneet julkaisussa J. Medicinal Chemistry 37 (1994) 781.

Esimerkkien 1-13 yhdisteillä on IL-lfe-proteaasi-20 inhibitiota (kobs/1 olivat > 50.000 M"1s"1) .

In vivo

In vivo inhibitio (IC5o) määritettiin seuraavasti: . Ihmisen monosyyttejä eristettiin heparinisoiduista leukofereesiyksiköistä, jotka saatiin yhtiöstä Biological 25 Specialty Corporation (Lansdale, PA). Monosyytit puhdistettiin Ficoll-Hupaque (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) gradienttisentrifugoinnilla ja enemmän kuin 95 % puhtaista monosyyttipopulaatioista saatiin sentrifugointihuuh-telulla. Määritys suoritettiin kaksoisnäytteillä juuri 30 eristettyjä ihmisen monosyyttejä, joita oli viljelty suspensiossa 37 °C:ssa ja pyöritetty varovasti kartionmuotoi-sissa polypropyleeniputkissa (Sardstedt Inc., Princeton, NJ) . Ihmisen monosyyttejä pitoisuudessa 5 x 106 solua per ; millilitra uudelleensuspendoitiin 1 ml:aan RPMI 1 640:tä • 35 (yleinen kudospuskuri yhtiöstä M. A. Bioproducts, Walkers- ville, MD) , joka sisälsi 1 % vasikkasikiön seerumia (FCS) 28 Λ Ί ! . , / Λ ι ί ,·:. .> 4 ο· (HyClone, Logan, UT) ja 50 μ9/τη1 gentamysiiniä (Gibco, Grand Island, NY) . Soluja käsiteltiin joko käsillä olevan keksinnön mukaisella yhdisteellä (eli testiyhdisteellä) tai non-inhibiittorilla (kontrolliyhdiste, tyypillisesti 0,03 % 5 DMSO) 15 minuuttia ja sitten aktivoitiin 0,01-%:isella kiinteällä Staphylococcus aureus -mikrobilla (The Enzyme Center, Maiden, MA) 1 tunti. Sitten soluja sentrifugoitiin ja ne uudelleensuspendoitiin 1 ml:aan kysteiiniä, metionii-nivapaata RPMI-väliainetta, joka sisälsi 1 % dialysoitua 10 FCS:a (Hyclone). Soluja esikäsiteltiin testiyhdisteellä tai kontrolliyhdisteellä 15 minuuttia, jonka jälkeen niihin lisättiin 0,01 % kiinteää S. aureusta sekä 100 MCi Tran 35-S leimaa (ICN, Irvine, CA) ja soluja inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunti. Inkuboinnin jälkeen solut sentrifugoitiin, pestiin 15 kerran fosfaattipuskurisuolaliuoksessa ja uudelleensuspendoitiin 1 ml: aan RPMI-.a, joka sisälsi 1 % vasikkasikiön seerumia. Soluja esikäsiteltiin taas testiyhdisteellä tai kontrolliyhdisteellä 15 minuuttia ja sitten 0,01 % S. aureus -mikrobeilla 2 tuntia. Inkuboinnin lopussa solut sentri-20 fugoitiin ja supernatantit säästettiin immunosaostusta var-,, ten. Solut pestiin kerran fosfaattipuskurisuolaliuoksessa ja sitten liuotettiin RIPA:aan, jatkuvaan soluväliainee-, seen, joka sisälsi 2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 mM jodiassetaattia, 1 Mg/ml pepstatiinia A, 1 Mg/ml leu-25 peptiiniä ja 0,5 TIU aprotiniinia.

Immunosaostuksia varten supernatantteihin lisättiin yhtä suuri tilavuus l-%:ista kuivamaitoa RIPA-puskurissa ja 50 μΐ uudelleensuspendoitua proteiini-A-sefaroosi CL-4B:a , · (Pharmacia, Piscataway, New York) ja 1 ml 4-%:ista kuiva- 30 maitoa, joka sisälsi proteiini-A-sefaroosi CL-4B:a, soluly- saatteihin ja näytteitä pyöritettiin 30 minuuttia 4 °C:ssa. Sitten helmet sentrifugoitiin alas, näytteet siirrettiin tuoreisiin putkiin ja niitä inkuboitiin yön yli 40 /xg kanin • ei-ihmisen IL-Ιβ-polyklonaalisessa vasta-aineen kanssa - 35 (Genzyme, Cambridge, MA) . Sitten IL-Ιβ-proteiinit saostet- tiin 70 μΐ proteiini-A-sefaroosia, uudelleensuspendoitiin λ 1·,. ' a I ( ,·- , *ΐ 29 60 mikrolitraan SDS-puskuria ja laitettiin 15-%lisille SGD-PAGE-geeleille. Autoradiografia suoritettiin kuivatuilla geeleillä ja radioaktiivisuuden määrä (lukemat minuutissa, cpm) määritettiin käyttämällä Beta Scope 603 analysaatto-5 ria.

Tietojen analysointi

Monosyyttien sykeleikkausmäärityksessä jokaisesta testiparametristä ajettiin kaksoiskoe. Tiedot otettiin talteen Beta Scope -analysaattorista käyttämällä tietokonetta, 10 sitten siirrettiin VAX-systeemiin cpm-keskiarvon ja keskiarvon keskihajonnan laskemiseksi. Kun testiyhdisteitä evaluoitiin, laskettiin kypsien IL-lE:n vapautumisen prosentuaalinen inhibitio seuraavasti: 15 100 x [1 - (stimuloidut solut + testiyhdiste - sti- muloimattomat solut) : (stimuloidut solut + kontrolliyhdis- te - stimuloimattomat solu)]

Sitten näitä prosentuaalisia inhibitioarvoja käy-20 tettiin laskettaessa ICso-arvo kullekin yhdisteelle. Koska ihmisen monosyyttien sykeleikkausmäärityksessä käytetään primaarisoluja eri luovuttajista, tehtiin jokaisesta ko-, keesta 2-3 erillistä koetta käyttäen monosyyttejä 2-3 eri luovuttajasta.

2 5 Esimerkkien 1, 6, 7 ja 9 yhdisteiden kohdalla in vivo IC50-arvot vaihtelivat välillä noin 0,1 - noin 10 μΜ.

Elastaasi-inhibitio (in vitro)

Esimerkkien 1, 6 ja 7 yhdisteistä tutkittiin niiden kyky inhiboida elastaasia. In vitro määritys suoritettiin, > 30 kuten Cha on kuvannut julkaisussa Biochem. Pharmacol. 24 (1975) 2177 - 2185. Esimerkkien 1, 6 ja 7 yhdisteet, jotka ; ovat tämän ICE-inhibiittoriluokan edustajia, eivät inhiboi neet elastaasia arvolla IC5o > 10 μΜ.

Claims (9)

1. 30 1 4.:
2. 1. Kaavan (I) mukainen yhdiste tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola, 5 H\ /'V /R2 ° (I 0 /K Jk ^ Rl I i Χϊ H O H n H j ossa Y on "Χγ"7 tai o 10 &Λ o tai OH % t R6 on ORs, jossa R8 on H tai alkyyli; R2 on Ci-C6-alkyyli, fenyyli, tienyyli tai pyridi- 15 nyyli, jolloin fenyyli, tienyyli tai pyridinyyli on mahdollisesti substituoitu halogeenilla; R 7 on H, CH20 (CO) 0_χ - fenyyli , jolloin fenyyliryhmä on mahdollisesti substituoitu halogeenilla, CH2OP (O) R14R15, 20 o H CF3 R’4 ; \ -cH2o^Y^yH -CHsO^^N^ A. JL. j h h R16 , H 31 112:,43 joissa Rn on fenyyli; Rl s on fenyyli; Rl6 on fenyyli tai pyridinyyli, jolloin fenyyli tai 5 pyridinyyli on mahdollisesti substituoitu halogeenilla; ja Ri on Cx-Cg-alkoksi, Ci-C6-alkoksifenyyli tai fenyyli, joka on mahdollisesti substituoitu Ci-C6-alkyylitiol-la.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tun-10 nettu siitä, että R2 on fenyyli, pyridinyyli tai tienyy- li.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että se on valittu seuraavasta ryhmästä: N-[2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(4-fluorifenyy- 15 li)-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli-L-asparagiinihap- po-2,6-diklooribentsoyy1ioksimetyyliketöni, N-[2-(5-tiomet-yylibentsoyyliamino-6-okso-2-(4 - fluorifenyyli)-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-asparagiinihappo-2,6-dikloori-bentsoyylioksimetyyliketoni, N- [2-(5-bentsyylioksikarbonyy-2 0 liamino-6-okso-2-(4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro-1-pyrimidin- yyli)asetoyyli]-L-asparagiinihappodifenyylifosfiinioksimet-yyliketoni, N-[2 - (5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-; (4 - fluorifenyyli)-1,6-dihydro-1-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L- : asparagiinihappo-5 -(1-(4-kloorifenyyli)-3-trifluorimetyy- : 25 li)pyratsolioksimetyyliketoni, N-[2-(5-bentsyylioksikarbon- yyliamino- 6 -okso-2 - (4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro-1-pyrimidinyyli) asetoyyli]-L-asparagiinihappo-5-(3-fenyyli)kumarin-yylioksimetyyliketoni, N-[2-(5-bentsyylioksikarbonyyliami-no-6-okso-2-(4-fluorifenyyli)-1,6-dihydro-l-pyrimidinyyli)-30 asetoyyli]-L-asparagiinihappo-5-(l-fenyyli-3-trifluorime- tyyli)pyratsolioksimetyyliketoni, N-[2-(5-isopropyylioksi-karbonyyliamino-6-okso-2- fenyyli-1,6-dihydro-1-pyrimidinyyli) asetoyyli] -L-asparagiinihappo-5-(l-fenyyli-3-trifluori-metyyli)pyratsolioksimetyyliketoni, N-[2-(5-bentsyylioksi-35 karbonyyliamino-6-okso-2-(3-pyridinyyli)-l,6-dihydro-l-py- rimidinyyli)asetoyyli]-L-asparagiinihappo-5-(l-fenyyli-3- 32 trifluorimetyyli)pyratsolioksimetyyliketoni, N-[2-(5-bents-yylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(2 -tienyyli)-1,6-dihydro-1-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-asparagiinihappo-5 -(1-fenyyli- 3-trifluorimetyyli)pyratsolioksimetyyliketoni, N- [2-(5- 5 bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-metyyli-l,6-dihydro- 1-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-asparagiinihappo-5-(1-fenyyli- 3-trifluorimetyyli)pyratsolioksimetyyliketoni, N- [2-(5- bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(2-tienyyli)-1,6-di-hydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-asparagiinihappo-5- (1-10 (2-pyridinyyli)-3-trifluorimetyyli)pyratsolioksimetyyli- ketoni, N- [2-(5-bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(2-tienyyli)]-L-asparagiinihappo-5-(1-(4-kloorifenyyli)-3-tri-fluorimetyyli)pyratsolioksimetyyliketoni, N-[2-(5-bentsyy-lioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(2-tienyyli)]-L-asparagiini-15 happo-2,6-diklooribentsoyylioksimetyyliketoni, N-[2-(5- bentsyylioksikarbonyyliamino-6-okso-2-(2-tienyyli)-1,6-di-hydro-l-pyrimidinyyli)asetoyyli]-L-asparagiinihappoaldehy-di .
5. 4. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, 20 että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukaista yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää · suolaa ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa. • 5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 -3 mukaisen : yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan 25 käyttö lääkkeen valmistuksessa, joka lääke on tarkoitettu interleukiini - 1/3-proteaasiaktiivisuuden inhiboimiseksi tällaisen hoidon tarpeessa olevassa nisäkkäässä.
6. 6. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suo-; 30 lan käyttö lääkkeen valmistamiseksi, joka on tarkoitettu sairauksien tai häiriöiden hoitamiseksi tai ehkäisemisek-: si, jotka valitaan tarttuvien tautien, hengitystiesairauk- • · sien, tulehdustilojen, immuuniperäisten sairauksien, au- ; toimmuunisairauksien, luusairauksien, kasvainten ja leuke- 35 mioiden joukosta, sellaisen hoidon tarpeessa olevassa nisäkkäässä. 33 11:343
7. 7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan käyttö lääkkeen valmistamiseksi, joka on tarkoitettu sairauksien tai häiriöiden hoitamiseksi ja ehkäisemiseksi, 5 jotka valitaan aivokalvontulehduksen, korvatorven tuleh duksen, septisen sokin, niveltulehduksen, sappitiehyttu-lehduksen, paksusuolitulehduksen, aivotulehduksen, endoke-roliitin, hepatiitin, haimatulehduksen, reperfuusiovammo-jen, liikaherkkyyden, MS-taudin, nivelreuman, nivelrikon, 10 tulehduksellisen suolistosairauden, verenmyrkytyksen, akuutin myelogeenisen leukemian, kroonisen myelogeenisen leukemian, osteoporoosin ja haavaisen paksusuolitulehduksen joukosta, sellaisen hoidon tarpeessa olevassa nisäkkäässä .
8. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että sairaus tai häiriö on septinen sokki, nivelreuma, nivelrikko, tulehduksellinen suolistosairaus, haimatulehdus tai haavainen paksusuolitulehdus.
9. 9. Kaavan (I) mukainen yhdiste käytettäväksi tera-20 peuttisena aineena. 34 ιι:·;43