JP2008015059A

JP2008015059A - 蛍光顕微鏡

Info

Publication number: JP2008015059A
Application number: JP2006184078A
Authority: JP
Inventors: Akira Ichihara; 昭市原; Takashi Hirano; 隆平野
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2006-07-04
Filing date: 2006-07-04
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2026-07-04
Also published as: JP4873462B2

Abstract

【課題】生きた細胞などを精度良く観察することができる蛍光顕微鏡を提供する。
【解決手段】ダイクロイックミラーＤＭを挟んで光源側には、マイクロレンズアレイ板、観察側には共焦点ピンホールアレイ板が設けられており、両者は接続部を介して同期して回転する。レーザ光（Ｐ偏光光）は、１つのマイクロレンズによって集光され、ダイクロイックミラーＤＭを透過し、集光位置にあるピンホールを通過して対物レンズを介して試料の限定された領域にのみ照射される。２次元ＣＣＤ固体撮像素子により、マイクロレンズとピンホールとのセットによって測定された蛍光に基づく２次元受光検出を行うことができる。レーザ光が試料に照射されると、蛍光タンパク質を含む試料から、蛍光が発せられる。試料に対して励起波長を複数波長にすることで、ダイクロイックミラーＤＭを切り替えることなしに、例えば３種類の異なる波長における蛍光観察を同時に行うことができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光顕微鏡に関し、特に、ダイクロイックミラーを利用した励起光透過型蛍光顕微鏡に関する。

ダイクロイックミラーを利用した蛍光顕微鏡においては、一般的に、励起光反射光路方式が用いられている。図８は、励起光反射光路方式の蛍光顕微鏡の簡単な構造を示す図である。図８に示すように、励起光反射光路方式の蛍光顕微鏡は、観察対象となる試料に対してその近くから順番に設けられた対物レンズと、ダイクロイックミラー（ＤＭ）と、観察用のカメラと、を有している。ダイクロイックミラーは、試料とカメラとを結ぶ光路に対して一般的に４５度の傾きを有して配置されている。ダイクロイックミラーの設けられた位置を起点として上記光路に対して垂直な方向に、励起光源が配置されている。

従来、多色の染色試料を観察する場合には、試料に対して励起波長とその波長に対する特性ＤＭを切り替えることにより、蛍光観察を行っている。このような場合において、図８に示す装置を用いると、ＤＭの切り替え時に角度（４５度）が多少動いたとしても、蛍光を透過させて観察させるため観察位置における各蛍光画像の平面内におけるずれは無視できる程度である。

特開２００４−２５８５４７号公報

しかしながら、上記励起光反射光路方式の蛍光顕微鏡において、生きた細胞などを観察しようとすると、ＤＭを切り替える作業の間にも生きた細胞が動くことにより、同時観測性が失われるという問題がある。各色素同時観察性を確保する為に、図９は、マルチダイクロイックミラーを利用した場合の透過率特性（波長依存性）を示す図である。図９に示すように、それぞれのピークＰ１０１、Ｐ１０２、Ｐ１０３の半価幅が大きくなり、また、ピーク間の波長領域においても、透過率の低い平坦な波長領域が狭いという問題がある。このようなダイクロイックミラーを用いると、明るく、良好な蛍光観察が難しいという問題がある。尚、後述する励起光透過光路方式の蛍光顕微鏡を用いると、ＤＭを切り替える時に観察画像の位置ずれを起こしやすいため、一般的な用途には使用できないという問題がある。

本発明は、生きた細胞などを精度良く観察することができる蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の一観点によれば、光源から出射されダイクロイックミラー（ＤＭ）を透過した励起光が測定試料内の蛍光色素に対して照射される際に発生する蛍光を受光して前記測定対象を観測する前記ダイクロイックミラーに対して励起光透過光路方式の蛍光顕微鏡において、前記ダイクロイックミラーに対してＰ偏光を励起光として用いることを特徴とする励起光透過光路方式の蛍光顕微鏡が提供される。前記光源と前記試料との間の光路に対して前記ダイクロイックミラーをブリュースター角に近い角度で傾斜させることにより、Ｐ偏光の割合を高めることが好ましい。

尚、ブリュースター角に近い角度は、４５度程度でも良い。このようにすることで、反
射率を極めて低くすることができ、背景光の影響等を低減できる。但し、一般的な場合よりもＰ偏光光を多くするということで、励起光の全てが必ずしもＰ偏光光でなくても良い。

前記ダイクロイックミラーに設けられ、屈折率の異なる誘電体膜を含む誘電体多層膜からなり多波長領域に高い透過率と狭い波長半値幅を持つ透過帯域を形成する波長フィルタを備えることが好ましい。これにより、目的とする複数の波長に関する蛍光像を同時に観察することができる。前記多波長領域に対応する波長は、観測対象となる蛍光たんぱくの蛍光スペクトルのピーク波長の近くに合わせられている。

また、前記励起光の光源と測定対象との間の光路であって前記ダイクロイックミラーを挟んで前記光源側に設けられ多数のマイクロレンズを有するマイクロレンズアレイと、前記試料側に設けられ多数のピンホールを有し前記マイクロレンズアレイと同期して移動するピンホールアレイとを有するようにすることもできる。このようにすれば、２次元的に試料のボケの少ない蛍光測定を行うことができる。励起された蛍光光を例えばＣＣＤ個体撮像装置により撮像すれば、ある領域の試料を連続的に測定することができる。

前記Ｐ偏光光の割合を多くする手段、例えば、偏光板を設けることで、背景光をさらに低減することができる。また、レーザ光源では一般に直線偏光光であるから、ダイクロイックミラーに対してＰ偏光方向に導入すればよい。また、前記ダイクロイックミラーの傾斜角度を調整する手段を設けることで、ダイクロイックミラーの透過率をより増大できる角度に調整することができる。

本発明によれば、多色蛍光観察の測定精度を向上させることができるという利点がある。

図１（ａ）は、図８に示す励起光反射光路方式の蛍光顕微鏡と異なる方式の励起光透過光路方式の蛍光顕微鏡の一構成例を示す図である。

多色の染色試料を観察する場合には、試料に対して励起波長とその波長に対する特性ＤＭを切り替えることにより、蛍光観察を行おうとすると、フィルタなどに工夫をしない場合の図１（ａ）に示す構造の装置を用いると、ＤＭの切り替え時に角度（４５度）が少し動いただけでも、蛍光を反射させて観察させるため、観察位置における各蛍光画像の平面内におけるずれが無視できない程度に大きくなる。

そこで、生きた細胞などの動きのある測定対象を観測するためには、各色を同時に観測できるように、上記のようなフィルタの工夫を行うことが必要となる。図３は、多波長同時励起用ダイクロイックミラーの理想的な特性を示す図である。主として、可視光及び蛍光発光帯域におけるダイクロイックミラーの特性を示す図である。図３に示すように、フィルタを工夫することにより、例えば、波長λ_１、λ_２、λ_３を中心とする透過半値幅が極めて狭い領域に３つの透過ピークＰ_１、Ｐ_２、Ｐ_３が得られる。理想的な透過率のピークを含む特性は、半価幅が狭く（半値幅１０〜１５ｎｍ）、かつ、ピークにおける透過率が１００％に近く、かつ、透過帯域以外の波長透過帯域（蛍光観察帯域）における透過率が可能な限り小さく（０％に近い）ものである。

次に、生きた細胞、組織等を観察する場合に用いられる蛍光タンパクについて説明する。図２Ａ及び図２Ｂは、ある蛍光タンパク質（くらげの蛋白）において観察される励起光と蛍光とのスペクトル特性（光強度の波長依存性）の測定例をそれぞれ示す図である。一
般に、これら蛍光タンパク質の蛍光発光波長帯域は、５０〜１００ｎｍのものが多い。そこで、可視光領域で同時多色染色をする場合、各蛍光波長が重ならないように染色するためには、一蛍光色１００ｎｍ程度の波長幅にすれば、各色が重ならないので、観察が可能である。すなわち、多色染色を行う場合、可視光域（約４００ｎｍから７００ｎｍ）に数色（３色程度）染色し、同時に観測できる。

上記の図１（ａ）は、本実施の形態による蛍光顕微鏡の一構成例を示す図である。図１（ａ）に示す励起光透過光路方式の蛍光顕微鏡は、観察対象となる試料Ｓに対してその近くから順番に設けられた対物レンズ１と、ダイクロイックミラー（ＤＭ）３と、励起光源５と、を有している。ダイクロイックミラーは、試料Ｓと励起光源５とを結ぶ光路に対して一般的に４５度の傾きを有して配置されている。ダイクロイックミラーの設けられた位置を起点として上記光路に対して垂直な方向に、観察用のカメラ７等が配置されている。ダイクロイックミラー３を透過したレーザ光Ｌ１２は、試料Ｓに照射され、試料Ｓから発生した蛍光Ｌ１３は、ダイクロイックミラー３により反射されてカメラ７に入射する（Ｌ１４）。

図１（ｂ）は、ＤＭ３の構成をより詳細に示すものであり、ＤＭ３の光反射面側に波長フィルタ１１が設けられている。図１（ｃ）に示すように、波長フィルタ（光の透過率が観測対象となる色素の励起に対応する波長群において非常に高く、それ以外、蛍光の波長領域においては非常に低いようにする。この様子については後述する。）１１は、例えば、スパッタリング法により光学ガラス基板に屈折率の小さな誘電体（例えばＳｉＯ_２、屈折率ｎ＝1.5）と屈折率の大きな誘電体（例えばＴａ_２Ｏ_５、屈折率ｎ＝２．２）などか
らなる薄膜の多層膜により形成されており、任意の波長特性の光学フィルタを構成することができる。

多波長同時励起用ダイクロイックミラーの特性は、図３に示す特性に近づけることが重要である。尚、理想的誘電体膜で作成した多層膜フィルタにおいては、光の吸収は無視できるため、レーザ励起波長帯域は９７％近い透過率・蛍光観察帯域は１００％近い反射率特性をもたせることが可能である。

ここで、本発明に関する発明者の考察について図面を参照しながら説明を行う。図４は、誘電体への光の透過・反射に関する基本原理を示す図である。図４に示すように、屈折率ｎ_１の誘電体と屈折率ｎ_２の誘電体とが、隣接して配置されている場合には、屈折率ｎ_１の誘電体中の光は両誘電体の界面の法線との成す角度がθ_１で反射するか、或いは、界面の法線との成す角度がθ₂で屈折率ｎ_２の誘電体中へ抜ける。反射するか透過するかは
、入射角θ_１と屈折率ｎ_１、ｎ_２により決まる。

数１は、入射光がＳ偏光の場合の反射率と透過率とを求める式を示し、数２は、入射光がＰ偏光の場合の反射率と透過率とを求める式を示すものである。これらの式に基づいて、入射光がＳ偏光の場合とＰ偏光の場合のエネルギーの反射率（透過率）の入射角依存性を示す図が図５であり、誘電体のフレネルの公式に基づくＳ偏光・Ｐ偏光の反射率、透過率を示す図である。図５に示すように、Ｓ偏光のみが入射すると、反射率Ｒは入射角に対してほぼ単調に増加するのに対して、Ｐ偏光のみが入射すると、反射率Ｒは入射角に対して一旦減少し、ある入射角（この場合には、ｎ_１＝１、ｎ_２＝１．５）５０〜６０度の入射角で反射率Ｒが一旦“０”に近づき（ブリュースター角で０になる）、その後は、ほぼ単調に増加するという特性を示す。発明者は図５に示す特性、特にブリュースター角の近く（鉛直方向（光源から試料に向かう方向）に対して４５度の傾きをもつダイクロイックミラーに対してＰ偏光が入射する場合のＰ偏光の反射特性、特に、Ｐ偏光の透過率がほぼ１００％になる点に着目した。このようにすると、図３に示すような特性に近いものが得られる。

レーザ光源は一般に直線偏光している。従って、Ｐ偏光の割合を多くするには、導入角度調整すれば良い。一方、光源として水銀ランプ・キセノンランプなどを利用する場合は、これらの光源がランダム偏光であるため、光源とダイクロイックミラーとの間に偏光板などを入れて、偏光方向をそろえ、ダイクロイックミラーに対してＰ偏光で導入するようにすれば良い。尚、Ｐ偏光の割合を多くするためには、ダイクロイックミラーと光路との成す角度をブルスター角度に近つけるように調整する方法と、光源の偏波面角度を調整する方法との両方が含まれる。

以上の考察に基づいて、以下に、本発明の実施例による蛍光顕微鏡について詳細に説明を行う。

以下に、本発明の一実施例による蛍光顕微鏡について図面を参照しながら説明を行う。図１０は、図１（ａ）に示される基本的な構成と同じ原理を利用した、より具体的な蛍光顕微鏡の一構成例を示す図である。図１（ａ）と同様な構造に関しては説明を省略する。図１０に示すように、ダイクロイックミラーＤＭ３を挟んで光源５側には、レーザ光の進行方向を法線とする円盤状で、多数のマイクロレンズ２１ａが配置されているマイクロレンズアレイ板２１が設けられ、これと接続されるとともに、ダイクロイックミラーＤＭ３を挟んで対向するように配置され多数の共焦点ピンホール３１ａが形成された円盤状のピンホールアレイ板３１が設けられている。マイクロレンズアレイ板２１とピンホールアレイ板３１とは接続部３５を介して同期して回転するようになっている。

上記の構成において、レーザ光（ダイクロイクミラーに対してＰ偏光光）は、１つのマイクロレンズ２１ｂによって集光され、ＤＭ３を高い透過率で透過し、上記マイクロレンズ２１ｂによるレーザ光の集光位置と対応する位置に設けられているピンホール３１ｂを通過して対物レンズ１を介して試料Ｓの限定された領域にのみ照射されるようになっている。マイクロレンズ２１ａとピンホール３１ａとを複数設けることにより、ＣＣＤカメラ
７に設けられ２次元平面に多数の図示しないＣＣＤ固体撮像素子が配置された固体撮像素子のそれぞれに対して、マイクロレンズ２１ｂとピンホール３１ｂとのセットによって測定された蛍光に基づく２次元受光検出を行うことができる。

レーザ光５が試料Ｓに照射されると、蛍光タンパク質を含む試料から、対応する蛍光が発せられる。試料Ｓに対して励起波長を図３のように複数波長にすることで、ダイクロイックミラーＤＭ３を切り替えることなしに、例えば３波長（λ１、λ２、λ３）の３種類の異なる波長における蛍光観察を同時に行うことができる。さらに、フィルタの構造を設計することにより、任意の複数波長の励起光を試料に照射することができる。

図６は、上記の多波長同時励起用ダイクロイックミラーを用い、かつ、Ｐ偏光とＳ偏光を同等特性にして作成した場合の励起光透過光路方式に蛍光顕微鏡における反射率の波長依存性例を示す図である。図６に示すように、（Ｐ＋Ｓ）／２の励起光とした場合の透過率Ｔ（％）の波長依存性は、４０５ｎｍ付近、４７３ｎｍ付近、５６０ｎｍ付近のそれぞれにおいて、高い透過率のピークを示す。但し、Ｐ１１，Ｐ１２、Ｐ１３のそれぞれの透過率Ｔのピークは、半価幅がやや広がっており、ピーク間の波長領域における透過率もやや大きくなっている。

これに対して、図７に示すように、４５度に配置されたダイクロイックミラーに入射する光をＰ偏光に絞った場合には、図６に比較しても、それぞれのピークＰ１ｐ、Ｐ２ｐ、Ｐ３ｐにおける透過率が１００％に近く、かつ、ピーク間の領域における透過率を極めて低くすることができる。図３に示す特性に近い理想的な特性と言える。例えば、レーザ等により単一波長に近い励起光源を用いると、ダイクロイックミラーの励起波長帯域は狭くできる。例えば、ダイクロイックミラーの励起帯域範値幅を１０ｎｍにできれば、３波長（λ_１、λ_２、λ_３）各々で例えば３０ｎｍの帯域が必要になり、可視光４００〜７００ｎｍの波長範囲内で、蛍光観察帯域として２７０ｎｍ（３００ｎｍマイナス（−）３０ｎｍ）の広い帯域を使えることになり、良好な蛍光観察が可能となる。

図７は、本実施例による蛍光顕微鏡において、上記のようにＰ偏光に着目して構成したダイクロイックミラーの波長特性図である。一例としての３波長ダイクロイックミラーは、４０５ｎｍ・４７３ｎｍ・５６１ｎｍのレーザ光をＰ偏光で入射角４５になるように装置を構成した構成による特性を示す図である。図７に示すように、この装置において、それぞれ励起光の約９７％が透過するという優れた特性が得られた。尚、Ｓ偏光の透過率は低いがＰ偏光のピークと同様の波長域内に収まっている。励起光はＰ偏光のみが使われるので、励起光の特性には影響を与えない。蛍光観察光は観察試料からランダム偏光としてあらゆる方向の光が発光している。そこで蛍光観察波長領域（透過率０に近い波長域）ではＰ偏光・Ｓ偏光とも透過率０に近く（反射率１００％に近く）蛍光観察光のロスがほとんど無く、明るい像の顕微鏡観察ができることになる。

すなわち、ダイクロイックミラーとして理想的な特性が得られていることがわかる。

このように、図７に示す特性が得られることから、励起光・蛍光観察光ともロスの非常に少ない蛍光顕微鏡システムを実現することが可能となる。

[比較例１]
図９は、Ｐ偏光とＳ偏光を同等にした場合の３波長ダイクロイックミラーを利用した場合の透過率の波長依存性を示す図である。図９に示すように、Ｐ偏光とＳ偏光との透過率のピークがほぼ同等になっており、本願実施例１による特性と比較すると、ピーク領域以外の波長領域においても有意の透過率を持っており、図７と比較すると、蛍光顕微鏡に利用する場合には、不利であることがわかる。

以上に説明したように、本実施の形態による蛍光顕微鏡によれば、透過率のピーク値が大きい上に半価幅が小さく、かつ、ピーク領域以外の波長領域における透過率が小さいという特性を有している。従って、背景光を低減することができ、多色染色された蛍光タンパクなどの観察に適している。

尚、上記の実施の形態では、ダイクロイックミラーの傾斜角度に関しては固定されていることを前提として説明したが、ダイクロイックミラーの傾斜角度を調整する手段を設け、図５のＰ偏光光の透過率を高める角度に可能な限り近づけるように調整するミラー回動機構を設けておいても良い。例えば、を両側から挟んで回転させる機構を設けることも可能であり、或いは、光路の角度の方を変更する機構を設けても良い。このようにすれば、測定状況に応じてダイクロイックミラーの傾斜角度を適した角度に調整して使用することが可能になるという利点がある。

本発明は、蛍光顕微鏡に利用可能である。

図１（ａ）は、本発明の一実施の形態による蛍光顕微鏡の一構成例を示す図である。図１（ｂ）は、ＤＭの構成をより詳細に示すものであり、ＤＭの光反射面側に波長フィルタが設けられている。図１（ｃ）は、波長フィルタ（光の透過率が観測対象となる色に対応する波長群において非常に高く波長フィルタの構成例を示す図である。図２（ａ）及び図２（ｂ）は、ある蛍光タンパク質（くらげの蛋白）おいて観察される励起光と蛍光との蛍光スペクトル特性（光強度の波長依存性）の測定例をそれぞれ示す図である。多波長同時励起用ダイクロイックミラーの理想的な特性を示す図である。R1・R2・R3：蛍光観察帯域、λ_１・λ_２・λ_３：励起帯域誘電体への光の透過・反射に関する基本原理を示す図である。入射光がＳ偏光の場合とＰ偏光の場合のエネルギーの反射率（透過率）の入射角依存性を示す図である。多波長同時励起用ダイクロイックミラーを用い、かつ、Ｐ偏光とＳ偏光を同等特性にして作成した場合の励起光透過光路方式に蛍光顕微鏡における反射率の波長依存性例を示す図である。４５度に配置されたダイクロイックミラーＤＭに入射する光をＰ偏光に絞った場合の透過率の波長依存性を示す図である。励起光反射光路方式の蛍光顕微鏡の簡単な構造を示す図である。マルチダイクロイックミラーを利用した場合の透過率特性（波長依存性）を示す図である。図１（ａ）に対応する本発明の一実施の形態による蛍光顕微鏡の一構成例を示す図である。

符号の説明

Ｓ…試料、Ｌ…光路、１…レンズ、３…ダイクロイックミラー、５…光源、７…ＣＣＤカメラ。

Claims

光源から出射されダイクロイックミラー（ＤＭ）を透過した励起光が測定試料内の蛍光色素に対して照射される際に発生する蛍光を受光して前記測定対象を観測する前記ダイクロイックミラーに対して励起光透過光路方式の蛍光顕微鏡において、
前記ダイクロイックミラーに対してＰ偏光を励起光として用いることを特徴とする励起光透過光路方式の蛍光顕微鏡。
前記光源と前記試料との間の光路に対して前記ダイクロイックミラーをブリュースター角に近い角度で傾斜させることにより、Ｐ偏光の割合を高めることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
前記ダイクロイックミラーに設けられ、屈折率の異なる誘電体膜を含む誘電体多層膜からなり多波長領域に高い透過率と狭い波長半値幅を持つ透過帯域を形成する波長フィルタを備えることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光顕微鏡。
前記多波長領域に対応する波長は、観測対象となる蛍光たんぱくの蛍光スペクトルのピーク波長に合わせられていることを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
前記励起光の光源と測定対象との間の光路であって前記ダイクロイックミラーを挟んで前記光源側に設けられ多数のマイクロレンズを有するマイクロレンズアレイと、前記試料側に設けられ多数のピンホールであって前記マイクロレンズアレイと同期して移動するピンホールアレイと、を有することを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
さらに、前記Ｐ偏光の割合を多くする手段を有することを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
前記ダイクロイックミラーの傾斜角度を調整する手段を有することを特徴とする請求項１から６までのいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。