JP7350936B2 - 高スループットハイパースペクトル画像化システム - Google Patents

高スループットハイパースペクトル画像化システム Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／６２０１３７号の米国特許法第１１９条に基づく優先権を主張し、本出願の内容は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ハイパースペクトル画像化システムは、サンプルから光を収集し、その光を波長のスペクトルまたは狭いスペクトルバンドに空間的に分散させる。例えば、励起光をサンプルに集束させ、サンプルからの蛍光によって生じた放射光を収集することができる。ハイパースペクトル画像には、一連のスペクトル画像が含まれる。スペクトル画像の各々は、異なる波長またはスペクトルバンドで取得される２次元空間画像である。スペクトル画像が組み合わされて、３次元（ｘ、ｙ、λ）ハイパースペクトルデータキューブを形成する。ここで、ｘおよびｙは、２つの空間次元を表し、λは、スペクトル次元を表す。
ハイパースペクトル画像化は、生体サンプルの分析に使用することができる。生体サンプルからの情報スループットを最大化することで、異なる細胞タイプと組織タイプとを区別することができる。高スループットは、手術環境において手術台で迅速な決定を下すこと、または機械学習アプリケーションの情報のデータベースを効率的に構築することに役立つ。加えて、高スループットは、高速のダイナミクスまたはモーションのキャプチャ、または細胞シグナル伝達ダイナミクスまたはタンパク質拡散の研究を可能にし得る。
一部のハイパースペクトル画像化システムでは、放出経路に液晶フィルタなどの波長可変フィルタを使用して、相当に高いスペクトル分解能（約５～１０ｎｍ）で蛍光を捕捉する。しかしながら、このアプローチは、フィルタが吸収によって蛍光の小さいスライスを選択的に捕捉するため、退色という欠点をかかえている。フルオロフォアは暗くなる前に放出することができる光子の数が限られていることが多いため、退色は問題となる。退色は、波長可変フィルタの走査中に発光強度を変化させ、それによって、スペクトル分解を用いてハイパースペクトルデータからフルオロフォア濃度を推定するときに、スペクトルを歪ませ、誤差を引き起こすため、波長可変フィルタにとって特に問題となる。また、これらのシステムは広視野のアプローチを使用しているため、共焦点性または深度セクショニングの実行が妨げられ、厚い組織サンプルでの使用が問題となる。
他のハイパースペクトル画像化システムでは、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）または円柱小型レンズアレイを使用して、サンプルにパターン化された照明を生じさせる。格子またはプリズム構造は、２次元画像化センサ全体に空間的に蛍光を分散させて、ハイパースペクトル画像を取得する。次に、パターン化された照明でサンプル全体を走査して（または、固定したままのパターン化された照明でサンプルを走査して）、ハイパースペクトルデータキューブを取得する。これらのシステムは、励起光子のすべてが収集されるため、退色を低減する。また、スペクトル全体が一度に収集されるので、スペクトル歪みがさらに低減される。さらに、これらのシステムは深度セクショニングを提供することができるため、より厚い組織サンプルで使用可能である。しかしながら、これらのシステムは、一度に１つの深度または一度に１つの励起レーザで走査することに依存しているため、データ収集速度およびスループットが制限される。
本発明の例示的な実施形態は、高スループットハイパースペクトル画像化システムを提供する。本発明の一態様によれば、システムは、励起光を放出するように構成されている、励起光源と、励起光源から励起光を受容し、かつ励起光をサンプル上に画像化して、励起光がサンプルに蛍光を放出させるように構成されている、対物レンズと、サンプルから蛍光を受容し、かつ蛍光を空間的に分散された複数のスペクトルチャネルに分離するように構成されている、チャネルセパレータと、チャネルセパレータから空間的に分散された複数のスペクトルチャネルを受容するように構成されている、センサと、を含む。励起光源は、光源および複数の第１の小型レンズアレイを含む。複数の第１の小型レンズアレイの各々は、光源からの光を受容するように、かつ光のパターンを生成するように構成されており、複数の第１の小型レンズアレイによって生成された光のパターンは、組み合わされて励起光を形成する。対物レンズは、光のパターンの各々を同時に画像化して、サンプルの異なる深度で複数の平行ラインまたは円形スポットのアレイを形成するように構成されている。
いくつかの実施形態では、チャネルセパレータは、複数の第１の反射要素を有する反射層であって、複数の第１の反射要素の各第１の反射要素は、光のパターンのうちの第１の光パターンによって生成される蛍光の第１の部分を反射するように構成されている、反射層と、光パターンのうちの第２の光パターンによって生成される蛍光の第２の部分を透過するように構成されている、パターン化層と、反射層から蛍光の第１の部分を受容するように、かつ蛍光の第１の部分のスペクトル成分を空間的に分散させるように構成されている、第１の分散光学系と、反射層から蛍光の第２の部分を受容するように、かつ蛍光の第２の部分のスペクトル成分を空間的に分散させるように構成されている、第２の分散光学系と、を含み得る。
他の実施形態では、チャネルセパレータは、蛍光を集束するように構成されている、第２の小型レンズアレイと、第２の小型レンズアレイから蛍光を受容するように、かつ蛍光のスペクトル成分を空間的に分散するように構成されている、分散光学系と、を含み得る。第２の小型レンズアレイは、蛍光を複数の平行ラインとして受容するように構成されている、小型レンズの複数の線形アレイを含み得る。
他の実施形態では、チャネルセパレータは、蛍光のスペクトル成分を空間的に分散させるように構成されている、分散光学系と、分散光学系から蛍光を受容するように、かつ蛍光を集束させるように構成されている、第２の小型レンズアレイと、を含み得る。第２の小型レンズアレイは、蛍光を複数の平行ラインとして受容するように構成されている、小型レンズの複数の線形アレイを備える。
システムはまた、励起光源からの励起光を対物レンズに向けて反射するように、かつサンプルからの蛍光をチャネルセパレータに向けて透過させるように構成されている、ダイクロイックビームスプリッタを含み得る。ダイクロイックビームスプリッタの透過スペクトルは、光源からの光の波長と一致するノッチを含み得る。
本発明の別の態様によれば、システムは、励起光を放出するように構成されている励起光源と、励起光源から励起光を受容し、かつ励起光をサンプル上に画像化して、励起光がサンプルに蛍光を放出させるように構成されている、対物レンズと、サンプルから蛍光を受容し、かつ蛍光を空間的に分散された複数のスペクトルチャネルに分離するように構成されている、チャネルセパレータと、チャネルセパレータから空間的に分散された複数のスペクトルチャネルを受容するように構成されている、センサと、を含む。励起光源は、各々が異なる波長を有する光を放出する複数の光源と、複数の光源の各々から光を受容するように、かつ複数の光源に対応する複数の光のパターンを生成するように構成されている第１の小型レンズアレイであって、第１の小型レンズアレイによって生成された光のパターンは、組み合わされて励起光を形成する、第１の小型レンズアレイと、を含む。対物レンズは、光のパターンの各々を同時に画像化して、サンプルの同じ深度で複数の平行ラインまたは円形スポットのアレイを形成するように構成されている。
いくつかの実施形態では、チャネルセパレータは、複数の第１の反射要素を有する反射層であって、複数の第１の反射要素の各第１の反射要素は、光のパターンのうちの第１の光パターンによって生成される蛍光の第１の部分を反射するように構成されている、反射層と、光パターンのうちの第２の光パターンによって生成される蛍光の第２の部分を透過するように構成されている、パターン化層と、反射層から蛍光の第１の部分を受容するように、かつ蛍光の第１の部分のスペクトル成分を空間的に分散させるように構成されている、第１の分散光学系と、反射層から蛍光の第２の部分を受容するように、かつ蛍光の第２の部分のスペクトル成分を空間的に分散させるように構成されている、第２の分散光学系と、を含み得る。
他の実施形態では、チャネルセパレータは、蛍光を集束するように構成されている、第２の小型レンズアレイと、第２の小型レンズアレイから蛍光を受容するように、かつ蛍光のスペクトル成分を空間的に分散するように構成されている、分散光学系と、を含み得る。第２の小型レンズアレイは、蛍光を複数の平行ラインとして受容するように構成されている、小型レンズの複数の線形アレイを含み得る。
他の実施形態では、チャネルセパレータは、蛍光のスペクトル成分を空間的に分散させるように構成されている、分散光学系と、分散光学系から蛍光を受容するように、かつ蛍光を集束させるように構成されている、第２の小型レンズアレイと、を含み得る。第２の小型レンズアレイは、蛍光を複数の平行ラインとして受容するように構成されている、小型レンズの複数の線形アレイを含み得る。
システムはまた、励起光源からの励起光を対物レンズに向けて反射するように、かつサンプルからの蛍光をチャネルセパレータに向けて透過させるように構成されている、ダイクロイックビームスプリッタを含み得る。ダイクロイックビームスプリッタの透過スペクトルは、光源からの異なる波長と一致する複数のノッチを含み得る。
本発明のさらに別の態様によれば、システムは、励起光を放出するように構成されている励起光源と、励起光源から励起光を受容し、かつ励起光をサンプル上に画像化して、励起光がサンプルに蛍光を放出させるように構成されている、対物レンズと、サンプルから蛍光を受容し、かつ蛍光を空間的に分散された複数のスペクトルチャネルに分離するように構成されている、チャネルセパレータと、チャネルセパレータから空間的に分散された複数のスペクトルチャネルを受容するように構成されている、センサと、を含む。励起光源は、各々が異なる波長を有する光を放出する複数の光源と、複数の第１の小型レンズアレイであって、複数の第１の小型レンズアレイの各々は、複数の光源の１つからの光を受容するように、かつ光のパターンを生成するように構成されており、複数の第１の小型レンズアレイによって生成された光のパターンは、組み合わされて励起光を形成する、複数の第１の小型レンズアレイと、を含む。対物レンズは、光のパターンを同時に画像化して、サンプルの複数の深度で複数の平行ラインまたは円形スポットのアレイを形成するように構成されている。
いくつかの実施形態では、チャネルセパレータは、複数の第１の反射要素を有する反射層であって、複数の第１の反射要素の各第１の反射要素は、光のパターンのうちの第１の光パターンによって生成される蛍光の第１の部分を反射するように構成されている、反射層と、光パターンのうちの第２の光パターンによって生成される蛍光の第２の部分を透過するように構成されている、パターン化層と、反射層から蛍光の第１の部分を受容するように、かつ蛍光の第１の部分のスペクトル成分を空間的に分散させるように構成されている、第１の分散光学系と、反射層から蛍光の第２の部分を受容するように、かつ蛍光の第２の部分のスペクトル成分を空間的に分散させるように構成されている、第２の分散光学系と、を含む。
他の実施形態では、チャネルセパレータは、蛍光を集束するように構成されている、第２の小型レンズアレイと、第２の小型レンズアレイから蛍光を受容するように、かつ蛍光のスペクトル成分を空間的に分散するように構成されている、分散光学系と、を含む。第２の小型レンズアレイは、蛍光を複数の平行ラインとして受容するように構成されている、小型レンズの複数の線形アレイを含み得る。
他の実施形態では、チャネルセパレータは、蛍光のスペクトル成分を空間的に分散させるように構成されている、分散光学系と、分散光学系から蛍光を受容するように、かつ蛍光を集束させるように構成されている、第２の小型レンズアレイと、を含む。第２の小型レンズアレイは、蛍光を複数の平行ラインとして受容するように構成されている、小型レンズの複数の線形アレイを含む。
システムはまた、励起光源からの励起光を対物レンズに向けて反射するように、かつサンプルからの蛍光をチャネルセパレータに向けて透過させるように構成されている、ダイクロイックビームスプリッタを含み得る。ダイクロイックビームスプリッタの透過スペクトルは、光源からの異なる波長と一致する複数のノッチを含み得る。
いくつかの実施形態では、複数の光源の数は、複数の第１の小型レンズアレイの数に等しくてもよい。他の実施形態では、複数の光源の数は、複数の第１の小型レンズアレイの数よりも少なくてもよい。
本発明の他の目的、利点、および新規の特徴は、添付の図面と併せて検討すると、以下の本発明の詳細な説明から明らかになるであろう。
本開示は、添付の図面と併せて説明される。
本発明の例示的な実施形態による高スループットハイパースペクトル画像化システムのブロック図である。 励起光源内の円柱小型レンズアレイを使用する高スループットハイパースペクトル画像化システムによってサンプルに生じ得る様々な照明パターンを示す図である。 図２（ａ）の照明パターンをさらに詳細に示す図である。 励起光源内の円形小型レンズアレイを使用する高スループットハイパースペクトル画像化システムによってサンプルに生じ得る様々な照明パターンを示す図である。 図２（ｃ）の照明パターンをさらに詳細に示す図である。 ４次元画像化用の照明パターンを生じさせるために使用可能な励起光源を示す図であり、次元には、２つの空間次元および１つの放射光のスペクトル次元、ならびに励起光がサンプルに集束する深度が含まれる図である。 ４次元画像化用の照明パターンを生じさせるために使用可能な励起光源を示す図であり、次元には、２つの空間次元および１つの放射光のスペクトル次元、ならびに励起光がサンプルに集束する深度が含まれる図である。 ４次元画像化用の照明パターンを生じさせるために使用可能な励起光源を示す図であり、次元には、２つの空間次元および１つの放射光のスペクトル次元、ならびに励起光がサンプルに集束する深度が含まれる図である。 ４次元画像化用の照明パターンを生じさせるために使用可能な励起光源を示す図であり、次元には、２つの空間次元および１つの放射光のスペクトル次元、ならびに励起光がサンプルに集束する深度が含まれる図である。 ４次元画像化用の照明パターンを生じさせるために使用可能な励起光源を示す図であり、次元には、２つの空間次元および１つの放射光のスペクトル次元、ならびに励起波長が含まれる図である。 ５次元画像化用の照明パターンを生じさせるために使用可能な励起光源を示す図であり、次元には、２つの空間次元および１つの放射光のスペクトル次元、ならびに励起光がサンプルに集束する深度および励起波長が含まれる図である。 ５次元画像化用の照明パターンを生じさせるために使用可能な励起光源を示す図であり、次元には、２つの空間次元および１つの放射光のスペクトル次元、ならびに励起光がサンプルに集束する深度および励起波長が含まれる図である。 ５次元画像化用の照明パターンを生じさせるために使用可能な励起光源を示す図であり、次元には、２つの空間次元および１つの放射光のスペクトル次元、ならびに励起光がサンプルに集束する深度および励起波長が含まれる図である。 ５次元画像化用の照明パターンを生じさせるために使用可能な励起光源を示す図であり、次元には、２つの空間次元および１つの放射光のスペクトル次元、ならびに励起光がサンプルに集束する深度および励起波長が含まれる図である。 ５次元画像化用の照明パターンを生じさせるために使用可能な別の励起光源を示す図であり、次元には、２つの空間次元および１つの放射光のスペクトル次元、ならびに励起光がサンプルに集束する深度および励起波長が含まれる図である。 ５次元画像化用の照明パターンを生じさせるために使用可能な別の励起光源を示す図であり、次元には、２つの空間次元および１つの放射光のスペクトル次元、ならびに励起光がサンプルに集束する深度および励起波長が含まれる図である。 ５次元画像化用の照明パターンを生じさせるために使用可能な別の励起光源を示す図であり、次元には、２つの空間次元および１つの放射光のスペクトル次元、ならびに励起光がサンプルに集束する深度および励起波長が含まれる図である。 ５次元画像化用の照明パターンを生じさせるために使用可能な別の励起光源を示す図であり、次元には、２つの空間次元および１つの放射光のスペクトル次元、ならびに励起光がサンプルに集束する深度および励起波長が含まれる図である。 励起／発光セパレータの例を示す図である。 励起／発光セパレータ内のダイクロイックビームスプリッタの透過スペクトルの例を示す図である。 励起／発光セパレータ内のダイクロイックビームスプリッタの透過スペクトルの例を示す図である。 蛍光を空間的に分散された複数のスペクトルチャネルに分離するチャネルセパレータの例を示す図である。 補正板の例を示す図である。 補正板の例を示す図である。 異なる深度から収集された蛍光の焦点が補正されない場合の焦点面の例を示す図である。 異なる深度から収集された蛍光の焦点が補正板で補正された場合の焦点面の例を示す図である。 蛍光を空間的に分散された複数のスペクトルチャネルに分離するチャネルセパレータの別の例を示す図である。 サンプル上に形成され得る励起光の照明パターンの例を示す図である。 図１０に示すチャネルセパレータ内の小型レンズアレイのレイアウトの例を示す図である。 図１１（ｂ）に示す小型レンズアレイによって生成された強度パターンの例を示す図である。 図１０に示すチャネルセパレータ内のセンサ上に形成されたスペクトルストライプの例を示す図である。 サンプルに形成され得る別の照明パターンの例を示す図である。 図１０に示すチャネルセパレータ内の小型レンズアレイのレイアウトの別の例を示す図である。 図１１（ｆ）に示す小型レンズアレイによって生成された強度パターンの例を示す図である。 図１０に示すチャネルセパレータ内のセンサ上に形成されたスペクトルストライプの例を示す図である。 サンプルに形成され得る別の照明パターンの例を示す図である。 図１０に示すチャネルセパレータ内の小型レンズアレイと差し替え可能なピンホールアレイの例を示す図である。 図１１（ｊ）に示すピンホールアレイによって生成された強度パターンの例を示す図である。 図１０に示すチャネルセパレータ内のセンサ上に形成されたスペクトルストライプの例を示す図である。 蛍光を空間的に分散された複数のスペクトルチャネルに分離するチャネルセパレータの別の例を示す図である。
図１は、本発明の例示的な実施形態による高スループットハイパースペクトル画像化システム１００のブロック図である。図１に示す高スループットハイパースペクトル画像化システム１００は、３次元、４次元、または５次元でデータを取得することができる。上述のように、３次元画像化データは、放射光の２つの空間次元（ｘ、ｙ）および１つのスペクトル次元（λ）について取得される。４次元画像化データは、励起波長または励起光がサンプル上に集束する深度のいずれかを第４の次元として追加する。５次元画像化データは、励起波長および励起光がサンプル上に集束する深度の両方を追加する。有利には、次元のすべてを同時に走査することができ、それにより、ハイパースペクトル画像化システム１００のスループットが増加する。
図１に示すように、システム１００は、励起光１１５を放出する励起光源１１０を含む。励起光源１１０は、単一の波長で光を放出する単一の光源、または異なる波長で光を放出する複数の光源を含み得る。光源は、レーザ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、またはハイパースペクトル画像化に好適な任意の他の光源であってもよい。励起光源１００はまた、単一の小型レンズアレイまたは複数の小型レンズアレイを含み得る。小型レンズアレイの各々の位置は、それぞれの小型レンズアレイを通過する光が集束されるサンプル１５０の深度を選択するように調整することができる。小型レンズアレイの各々は、複数の平行な円柱レンズ要素または円形レンズ要素の二次元マトリックスを含み得る。複数の平行な円柱レンズ要素を有する小型レンズアレイは、一連の平行ラインとしてサンプル１５０上に画像化される光のパターンを生成する。対照的に、円形レンズ要素の二次元マトリックスを有する小型レンズアレイは、円形スポットの二次元マトリックスとしてサンプル１５０上に画像化される光のパターンを生成する。
図１に示すように、励起光１１５は、第１のチューブレンズ１２０によってコリメートされ、励起／発光セパレータ１３０に伝達され得る。以下でさらに詳細に述べるように、励起／発光セパレータ１３０は、励起光１１５をサンプル１５０に向かって反射することができる。次に、対物レンズ１４０は、サンプル１５０上に励起光１１５を画像化する。励起光１１５がサンプル１５０に入射すると、励起光１１５はサンプル１５０に蛍光１５５を放出させる。サンプル１５０が発光色素で標識されている場合、蛍光１５５は発光色素によって放出され得る。代替的に、または加えて、蛍光１５５は、サンプル１５０からの自己蛍光であってもよい。図１に示すシステム１００は、励起光１１５が上方からサンプル１５０に入射する落射照明モードで動作するように構成されているが、システム１００は、励起光１１５が下方からサンプル１５０を透過する透過照明モードで動作するように変更することができる。本実施形態では、励起／発光セパレータ１３０は、システム１００から省略してもよく、またはサンプル１５０を透過する励起光１１５を遮断する単一ノッチフィルタ、ロングパスフィルタ、またはマルチノッチフィルタによって置き換えられてもよい。本実施形態では、サンプル１５０は、十分な蛍光１５５が対物レンズ１４０に向かって放出されるように、励起光１１５をサンプルの深度を透過させるのに十分な薄さであるべきである。
対物レンズ１４０を通過した後、蛍光１５５は、励起／発光セパレータ１３０によって透過され、励起光１１５のさらなる透過を遮断する。次に、蛍光１５５は、第２のチューブレンズ１６０によってチャネルセパレータ１７０上に集束させることができる。以下でさらに詳細に述べるように、チャネルセパレータ１７０は、蛍光１５５を、センサ１８０に入射する複数の空間的に分散されたスペクトルチャネルに分離する。１つのセンサ１８０のみが示されているが、システム１００は、複数のセンサ１８０を含み得る。例えば、複数のセンサ１８０の各々は、励起光１１５の単一の波長によって生成された蛍光１５５の一部を受容することができる。
図２（ａ）は、高スループットハイパースペクトル画像化システム１００によってサンプル１５０上に生じ得る様々な照明パターンを示す図である。本実施形態は、励起光源１１０内の円柱小型レンズアレイを使用する。図２（ａ）に示すように、励起光１１５は、サンプル１５０の励起領域２１０に入射する。励起光１１５は、サンプル１５０のｚ方向に沿って様々な深度で集束させることができる。例えば、図２（ａ）は、いくつかのｚスライスについてのｘーｚ平面上の照明の第１の投影２２０を示す。同様に、図２（ａ）は、いくつかのｚスライスについてのｙーｚ平面上の照明の第２の投影２３０を示す。照明パターン２４０、２４１、２４２、および２４３内のラインの太さは、サンプル１５０の異なる深度での励起光１１５のラインの幅を表す。励起光１１５の焦点は、最も細いラインとして示されている。例えば、照明パターン２４２の第２列は、励起光１１５がサンプルに集束された場所を示す。照明パターン２４２の他の列は、ラインの幅が異なる軸方向位置でどのように異なるかを示す。
図２（ｂ）は、様々な実施形態の第２の投影２３０の照明パターン２４０、２４１、２４２、および２４３をさらに詳細に示す。照明パターン２４０、２４１、２４２、および２４３の下の数字は、励起光１１５の波長を示す。例えば、第１の波長（「１」と表記）は、照明パターン２４０と２４１に使用され、第２の波長（「２」と表記）、第３の波長（「３」と表記）、および第４の波長（「４」と表記）は、照明パターン２４２に使用される。波長の各々は、任意の好適な値を有することができる。具体的には、照明パターン２４０は、放射光の２つの空間次元および１つのスペクトル次元が存在する三次元画像化に対応する。照明パターン２４０は、励起光源１１０内の単一の小型レンズアレイで単一の波長を放出する単一の光源を使用することによって得られてもよい。照明パターン２４１は、放射光の２つの空間次元および１つのスペクトル次元、ならびに励起光がサンプル上に集束される深度が第４の次元として存在する４次元画像化に対応する。照明パターン２４１は、励起光源１１０内の複数の小型レンズアレイで単一の波長を放出する単一の光源を使用することによって得られてもよい。代替的に、照明パターン２４１は、隣接する小型レンズが異なる焦点距離を有する単一の小型レンズアレイを使用することによって得られてもよい。照明パターン２４２は、放射光の２つの空間次元および１つのスペクトル次元、ならびに励起波長が第４の次元として存在する４次元画像化に対応する。照明パターン２４２は、励起光源１１０内の単一の小型レンズアレイで複数の波長を放出する複数の光源を使用することによって得られてもよい。照明パターン２４３は、放射光の２つの空間次元および１つのスペクトル次元、ならびに励起光がサンプル上に集束される深度および励起波長が第４および第５の次元として存在する５次元画像化に対応する。照明パターン２４３は、励起光源１１０内の複数の小型レンズアレイで複数の波長を放出する複数の光源を使用することによって得られてもよい。
図２（ｃ）は、高スループットハイパースペクトル画像化システム１００によってサンプル１５０上に生じ得る様々な照明パターンを示す別の図である。本実施形態は、励起光源１１０内の円形小型レンズアレイを使用する。図２（ｂ）に示すように、励起光１１５は、サンプル１５０の励起領域２１０に入射する。励起光１１５は、サンプル１５０のｚ方向に沿って様々な深度で集束させることができる。例えば、図２（ｂ）は、いくつかのｚスライスについてのｘーｚ平面上の照明の第１の投影２２５を示す。同様に、図２（ｂ）は、いくつかのｚスライスについてのｙーｚ平面上の照明の第２の投影２３５を示す。照明パターン２４５、２４６、２４７、および２４８内のラインの太さは、サンプル１５０の異なる深度での励起光１１５のラインの幅を表す。励起光１１５の焦点は、最も細いラインとして示されている。例えば、照明パターン２４７の第２列は、励起光１１５がサンプルに集束された場所を示す。照明パターン２４７の他の列は、ラインの幅が異なる軸方向位置でどのように異なるかを示す。
図２（ｄ）は、様々な実施形態の第２の投影２３５の照明パターン２４５、２４６、２４７、および２４８をさらに詳細に示す。照明パターン２４５、２４６、２４７、および２４８の下の数字は、励起光１１５の波長を示す。例えば、第１の波長（「１」と表記）は、照明パターン２４５と２４６に使用され、第２の波長（「２」と表記）、第３の波長（「３」と表記）、および第４の波長（「４」と表記）は、照明パターン２４７に使用される。波長の各々は、任意の好適な値を有することができる。具体的には、照明パターン２４５は、放射光の２つの空間次元および１つのスペクトル次元が存在する三次元画像化に対応する。照明パターン２４５は、励起光源１１０内の単一の小型レンズアレイで単一の波長を放出する単一の光源を使用することによって得られてもよい。照明パターン２４６は、放射光の２つの空間次元および１つのスペクトル次元、ならびに励起光がサンプル上に集束される深度が第４の次元として存在する４次元画像化に対応する。照明パターン２４６は、励起光源１１０内の複数の小型レンズアレイで単一の波長を放出する単一の光源を使用することによって得られてもよい。代替的に、照明パターン２４６は、隣接する小型レンズが異なる焦点距離を有する単一の小型レンズアレイを使用することによって得られてもよい。照明パターン２４７は、放射光の２つの空間次元および１つのスペクトル次元、ならびに励起波長が第４の次元として存在する４次元画像化に対応する。照明パターン２４７は、励起光源１１０内の単一の小型レンズアレイで複数の波長を放出する複数の光源を使用することによって得られてもよい。照明パターン２４８は、放射光の２つの空間次元および１つのスペクトル次元、ならびに励起光がサンプル上に集束される深度および励起波長が第４および第５の次元として存在する５次元画像化に対応する。照明パターン２４８は、励起光源１１０内の複数の小型レンズアレイで複数の波長を放出する複数の光源を使用することによって得られてもよい。
ハイパースペクトルデータキューブを生成するために、サンプル１５０は、励起光源１００内の円柱小型レンズアレイを使用する実施形態では、図２（ａ）に示すｘ方向に沿って走査されてもよい。代替的に、これらの実施形態では、励起光源１１０内の小型レンズアレイでｘ方向に沿って走査することができる。照明パターン２４１については、必要な励起波長が１つだけであ場合、追加の走査は必要ないが、ただし、軸方向の解像度と焦点深度の範囲がサンプルのすべての所望の深度スライスを同時に調査することができるようなものであることを条件とする。一方、照明パターン２４１の列の間隔が３０μｍであり、軸方向の解像度が３μｍであるなど、間隔がより疎であり、かつ３０μｍを超えるステップでデータが所望される場合、深度は、サンプル１５０または小型レンズアレイを軸方向に移動することによっても走査され得る。複数の励起波長が必要とされる場合、すべてのラインで励起波長が変更される。照明パターン２４２の場合、サンプル１５０が非常に薄く、必要な深度が１つだけである場合、追加の走査は必要ない。しかしながら、軸方向走査が必要とされる場合、サンプル１５０は、ｚ方向に沿って走査されてもよい。照明パターン２４３の場合、サンプル１５０は、ｚ方向に沿って走査されてもよい。走査ごとに得られる情報内容は、照明パターン２４０、２４１、２４２、および２４３の各々について同じであることに留意されたい。したがって、どの照明パターンを使用するかの選択は、サンプル１５０の特性およびどのような種類の情報が所望されるかに依存し得る。例えば、十分に薄いサンプル１５０の場合、深度走査は必要とされない場合がある。１つの深度のみからの情報が必要とされる場合、照明パターン２４２を使用することができる。さらに、単一の波長によってのみ励起されるフルオロフォアのファミリーを有する厚いサンプル１５０の場合、波長走査は必要とされない場合がある。１つの励起波長のみからの情報が必要とされる場合、照明パターン２４１を使用することができる。少数の励起波長と少数の深度での瞬間的な粗いスナップショットからの情報が必要とされる場合、照明パターン２４３を使用することができる。
励起光源１１０内で円形の小型レンズアレイを使用する実施形態の場合、サンプル１５０は、図２（ｂ）に示されるｙ方向に沿って走査されてもよい。代替的に、これらの実施形態では、励起光源１１０内の小型レンズアレイでｙ方向に沿って走査することができる。照明パターン２４６については、必要な励起波長が１つだけである場合、追加の走査は必要ないが、ただし、軸方向の解像度と焦点深度の範囲がサンプルのすべての所望の深度スライスを同時に調査することができるようなものであることを条件とする。一方、照明パターン２４６の列の間隔が３０μｍであり、軸方向の解像度が３μｍであるなど、間隔がより疎であり、かつ３０μｍを超えるステップでデータが所望される場合、深度は、サンプル１５０または小型レンズアレイを軸方向に移動することによっても走査され得る。複数の励起波長が必要とされる場合、すべてのラインで励起波長が変更される。照明パターン２４７の場合、サンプル１５０が非常に薄く、必要な深度が１つだけである場合、追加の走査は必要ない。しかしながら、軸方向走査が必要とされる場合、サンプル１５０は、ｚ方向に沿って走査されてもよい。照明パターン２４８の場合、サンプル１５０は、ｚ方向に沿って走査されてもよい。走査ごとに得られる情報内容は、照明パターン２４５、２４６、２４７、および２４８の各々について同じであることに留意されたい。したがって、どの照明パターンを使用するかの選択は、サンプル１５０の特性およびどのような種類の情報が所望されるかに依存し得る。例えば、十分に薄いサンプル１５０の場合、深度走査は必要とされない場合がある。１つの深度のみからの情報が必要とされる場合、照明パターン２４７を使用することができる。さらに、単一の波長によってのみ励起されるフルオロフォアのファミリーを有する厚いサンプル１５０の場合、波長走査は必要とされない場合がある。１つの励起波長のみからの情報が必要とされる場合、照明パターン２４６を使用することができる。少数の励起波長と少数の深度での瞬間的な粗いスナップショットからの情報が必要とされる場合、照明パターン２４８を使用することができる。
図３（ａ）～３（ｄ）は、放射光の２つの空間次元および１つのスペクトル次元、ならびに励起光がサンプル上に集束される深度が第４の次元として存在する４次元画像化のための照明パターン２４１を生じさせるために使用され得る励起光源を示す図である。励起光源３００は、単一波長で光３１５を放出する光源３１０を含み得る。図３（ａ）～３（ｄ）に示すように、光３１５は、各経路が異なる小型レンズアレイを通って進むように、４つの異なる経路に分割され得る。次に、４つの経路からの光は、非偏光ビームスプリッタ３６０で結合されて、励起光１１５を形成する。図３（ａ）～３（ｄ）は、光を分割および再結合するための特定の例を示しているが、任意の好適な構成要素およびレイアウトを使用してもよい。
例えば、図３（ａ）に示すように、光３１５の第１の部分は、半波長板３２０、偏光ビームスプリッタ３３０、半波長板３２１、および偏光ビームスプリッタ３３１を通過する。次に、光３１５の第１の部分は、２つの反射器３４０および３４１によって反射され、第１の小型レンズアレイ３５０を通過する。次に、光３１５の第１の部分は、偏光ビームスプリッタ３３２を通過し、反射器３４２および非偏光ビームスプリッタ３６０によって反射されて、励起光１１５の一部を形成する。ダンプ３７０は、非偏光ビームスプリッタ３６０を透過した余分な光を吸収するために含まれる。
さらに、図３（ｂ）に示すように、光３１５の第２の部分は、半波長板３２０、偏光ビームスプリッタ３３０、および半波長板３２１を通過する。次に、光３１５の第２の部分は、偏光ビームスプリッタ３３１によって反射され、第２の小型レンズアレイ３５１を通過する。次に、光の第２の部分は、偏光ビームスプリッタ３３２、反射器３４２、および非偏光ビームスプリッタ３６０によって反射されて、励起光１１５の一部を形成する。
加えて、図３（ｃ）に示すように、光３１５の第３の部分は、半波長板３２０を通過し、偏光ビームスプリッタ３３０によって反射される。次に、光３１５の第３の部分は、半波長板３２２、偏光ビームスプリッタ３３３、第３の小型レンズアレイ３５２、および偏光ビームスプリッタ３３４を通過する。次に、光３１５の第３の部分は、反射器３４５によって反射され、非偏光ビームスプリッタ３６０を通過して、励起光１１５の一部を形成する。
さらに、図３（ｄ）に示すように、光３１５の第４の部分は、半波長板３２０を通過し、偏光ビームスプリッタ３３０によって反射される。次に、光３１５の第４の部分は、半波長板３２２を通過し、偏光ビームスプリッタ３３３によって反射される。次に、光の第４の部分は反射器３４３および３４４で反射され、第４の小型レンズアレイ３５３を通過し、偏光ビームスプリッタ３３４および反射器３４５で反射され、非偏光ビームスプリッタ３６０を通過して、励起光１１５の一部を形成する。
図４は、放射光の２つの空間次元および１つのスペクトル次元、ならびに励起光がサンプル上に集束される深度が第４の次元として存在する４次元画像化のための照明パターン２４２を生じさせるために使用され得る励起光源を示す図である。励起光源４００は、それぞれ光４２０、４２１、４２２、および４２３を放出する複数の光源４１０、４１１、４１２、および４１３を含むことができ、各光４２０、４２１、４２２、および４２３は、異なる波長を有する。図４に示すように、光４２０、４２１、４２２、および４２３は、単一の小型レンズアレイ４４０に到達する前に、ダイクロイックミラー４３０、４３１、４３２、および４３３を介して結合され得る。次に、結合された光は、チューブレンズ４５０によってコリメートされ、プリズムまたは格子などの分散要素４６０によって分散されて、励起光１１５を形成する。図４は、光４２０、４２１、４２２、および４２３を結合させるための特定の例を示しているが、任意の好適な構成要素およびレイアウトを使用してもよい。
図５（ａ）～５（ｄ）は、放射光の２つの空間次元および１つのスペクトル次元、ならびに励起光がサンプル上に集束される深度および励起波長が第４および第５の次元として存在する５次元画像化のための照明パターン２４３を生じさせるために使用され得る励起光源を示す図である。励起光源５００は、異なる波長で光５２０、５２１、５２２、および５２３を放出する複数の光源５１０、５１１、５１２、および５１３を含み得る。図５（ａ）～５（ｄ）に示すように、各光５２０、５２１、５２２、および５２３は、それぞれの小型レンズアレイ５３０、５３１、５３２、および５３３を通って進む。次に、光５２０、５２１、５２２、および５２３は、ダイクロイック５４１で結合されて、励起光１１５を形成する。図５（ａ）～５（ｄ）は、光を結合させるための特定の例を示しているが、任意の好適な構成要素およびレイアウトを使用してもよい。
例えば、図５（ａ）に示すように、光源５１０からの光５２０は、小型レンズアレイ５３０を通過し、ダイクロイック５４０および５４１によって反射されて、励起光１１５の一部を形成する。図５（ｂ）に示すように、光源５１１からの光５２１は、小型レンズアレイ５３１およびダイクロイック５４０を通過し、ダイクロイック５４１によって反射されて、励起光１１５の一部を形成する。図５（ｃ）に示すように、光源５１２からの光５２２は、小型レンズアレイ５３２を通過し、ダイクロイック５４２によって反射され、ダイクロイック５４１を通過して、励起光１１５の一部を形成する。図５（ｄ）に示すように、光源５１３からの光５２３は、小型レンズアレイ５３３、ダイクロイック５４２、およびダイクロイック５４１を通過して、励起光１１５の一部を形成する。
図６（ａ）～６（ｄ）は、放射光の２つの空間次元および１つのスペクトル次元、ならびに励起光がサンプル上に集束される深度および励起波長が第４および第５の次元として存在する５次元画像化のための照明パターン２４３を生じさせるために使用され得る別の励起光源を示す図である。励起光源６００は、異なる波長で光６２０および６２１を放出する複数の光源６１０および６１１を含み得る。図６（ａ）～６（ｄ）に示すように、各光６２０および６２１は、２つの経路に分割され、合計４つの経路の各々が異なる小型レンズアレイを通過する。次に、４つの経路からの光は、ダイクロイック６７０で結合されて、励起光１１５を形成する。図６（ａ）～６（ｄ）は、光を分割および再結合するための特定の例を示しているが、任意の好適な構成要素およびレイアウトを使用してもよい。
例えば、図６（ａ）に示すように、光源６１０からの光６２０の一部は、半波長板６３０および偏光ビームスプリッタ６４０を通過し、反射器６５０および６５１によって反射され、その後、第１の小型レンズアレイ６６０を通過する。次に、光は偏光ビームスプリッタ６４１を通過し、反射器６５２およびダイクロイック６７０によって反射されて、励起光１１５の一部を形成する。
さらに、図６（ｂ）に示すように、光源６１０からの光６２０の一部は、半波長板６３０を通過し、偏光ビームスプリッタ６４０によって反射される。次に、光は第２の小型レンズアレイ６６１を通過する。次に、光は、偏光ビームスプリッタ６４１、反射器６５２、およびダイクロイック６７０によって反射されて、励起光１１５の一部を形成する。
加えて、図６（ｃ）に示すように、光源６１１からの光６２１の一部は、半波長板６３１を通過し、偏光ビームスプリッタ６４２によって反射される。次に、光は反射器６５４によって反射され、第３の小型レンズアレイ６６２を通過する。次に、光は偏光ビームスプリッタ６４３によって反射され、ダイクロイック６７０を通過して、励起光１１５の一部を形成する。
また、図６（ｄ）に示すように、光源６１１からの光６２１の一部は、半波長板６３１および偏光ビームスプリッタ６４２を通過する。次に、光は反射器６５３によって反射され、第４の小型レンズアレイ６６３を通過する。次に、光は偏光ビームスプリッタ６４３およびダイクロイック６７０を通過して、励起光１１５の一部を形成する。
図７は、励起／発光セパレータ７００の例を示す図である。図７に示すように、励起光源１１０からの励起光１１５は、ダイクロイックビームスプリッタ７１０に入射し、ダイクロイックビームスプリッタ７１０は、励起光１１５を対物レンズ１４０に向かって反射させる。ダイクロイックビームスプリッタ７１０によって反射されない励起光１１５の漏れ光７２０を吸収するために、ビームダンプ７３０も提供され得る。励起光１１５がサンプル１５０に蛍光１５５を放出させた後、ダイクロイックビームスプリッタ７１０は、蛍光１５５をチャネルセパレータ１７０に向けて透過させる。
図８（ａ）および８（ｂ）は、ダイクロイックビームスプリッタ７１０の透過スペクトルの例を示す。これらのグラフは、ダイクロイックビームスプリッタ７１０の透過を波長の関数として示している。スペクトルのノッチは、励起光１１５の中心波長と一致する。この例は、励起光源１１０が異なる波長を放出する３つの光源を含むことを想定している。図８（ａ）に示す狭いノッチを有する透過スペクトルは、可能な限り多くの蛍光１５５のスペクトルを捕捉するために好ましい場合がある。例えば、ノッチは、０．５ｎｍ未満のライン幅を有していてもよい。ノッチの伝達がゼロになる必要はない。
図９（ａ）は、蛍光１５５を複数の空間的に分散されたスペクトルチャネルに分離するチャネルセパレータの例を示す図である。チャネルの各々は、図２に示す照明パターンの１つによって生成された蛍光１５５の一部を含む。具体的には、チャネルの各々は、サンプル１５０の単一の深度における単一の励起波長によって生成された蛍光１５５の一部を含む。図９（ａ）は、５つのチャネルが使用される例を示す。しかしながら、チャネルセパレータは、任意の好適な数のチャネルのために変更されてもよい。
図９（ａ）に示すように、チャネルセパレータ９００は、第１の反射層９１０およびパターン化層９１５を有する光学系を含み得る。第１の反射層９１０は、複数の反射要素を含み、パターン化層９１５は、蛍光９５５を透過または吸収する領域を含む。蛍光１５５は、励起光の照明パターンと一致する一連のラインとして、対物レンズ１４０およびチューブレンズ１６０によって画像化される。第１の反射層９１０およびパターン化層９１５の構成は、ライン同士の間隔と、対物レンズ１４０およびチューブレンズ１６０によって提供される倍率と、に基づく。例えば、第１の反射層９１０およびパターン化層９１５は、蛍光１５５の第１のチャネル９５０が光学系を透過するように構成されている。第１の反射層９１０の反射器によって覆われていないパターン化層９１５の一部は、第１のチャネル９５０からの光を透過することができる。次に、第１のチャネル９５０からの光は、レンズ９２０によってコリメートされ、分散光学系９３０および９３１によって分散され、レンズ９２１によってセンサ９４０上に画像化され得る。例えば、分散光学系９３０および９３１は、一組のダブルアミチプリズムであってもよい。分散光学系９３０および９３１は、第１のチャネル９５０のラインがセンサ９４０全体にわたって分散されるように、より多いまたはより少ない分散を提供するように調整されてもよい。例えば、第１のチャネル９５０が長波長を放出する光源によって生成された場合、分散光学系９３０および９３１の分散は、センサ９４０を均一に覆うように増加させてもよい。ほとんどのフルオロフォアは、約４００ｎｍ～約９００ｎｍの波長の光を放出する。励起波長が４８８ｎｍである場合、異なるフルオロフォアから５００ｎｍ～９００ｎｍの範囲で蛍光が生成されることがある。一方、励起波長が７８０ｎｍである場合、８２０ｎｍ～９００ｎｍの範囲で蛍光が生成されることがある。これははるかに小さい波長範囲であるため、分散を増加させて、より広い波長範囲の場合と同じ数の画素にスペクトルを広げてもよい。
第１の反射層９１０の反射器は、蛍光１５５の異なる部分からのチャネルを異なる方向に反射するように構成され得る。例えば、蛍光１５５の第２のチャネル９５１からの光は、反射器のサブセットに入射し、かつ第２の反射層９６０に向かって反射されてもよい。第２の反射層１６０内の反射器は、反射器のピッチおよび角度によって波面を平坦化させて、第２のチャネル９５１からの光をレンズ９２２に向かって反射させることができる。次に、第２のチャネル９５１からの光は、レンズ９２２によってコリメートされ、分散光学系９３２および９３３によって分散され、レンズ９２３によってセンサ９４１上に画像化されてもよい。例えば、分散光学系９３２および９３３は、一組のダブルアミチプリズムでもよい。上述のように、分散光学系９３２および９３３は、第２のチャネル９５１のラインがセンサ９４１全体にわたって分散されるように、より多いまたはより少ない分散を提供するように調整されてもよい。例えば、第２のチャネル９５１が長波長を放出する光源によって生成された場合、分散光学系９３２および９３３の分散は、センサ９４１を均一に覆うように増加させてもよい。
図９（ａ）には、第２の反射層９６０を含む光学系の１つの列のみが示されているが、蛍光１５５の残りのチャネルの各々にはさらなる光学系の列があることを理解されたい。特に、第３のチャネル９５２、第４のチャネル９５３、第５のチャネル９５４の各々について、別の一組の第２の反射層９６０、レンズ９５１、分散光学系９３２および９３３、レンズ９２３、およびセンサ９４１を含む光学系のさらなる列がある。蛍光１５５の開口数に応じて、第１の反射層９１０から第２の反射層９６０へのラインまたはスポットを中継するために、第１の反射層９１０と第２の反射層９６０との間に千鳥配列の小型レンズ対が提供されてもよい。さらに、共焦点性を提供するために、第２の反射層９６０とレンズ９２２との間にリレーおよび開口のアレイが提供されてもよい。ロングパスフィルタおよび／またはノッチフィルタなどの追加のフィルタを、対物レンズ１４０とチューブレンズ１６０との間などの第１の反射層９１０の前に提供して、平行蛍光９５５を調整してもよい。
照明系統２４１および２４３については、とりわけ、異なるストライプがサンプル１５０内の異なる深度で集束する場合、チューブレンズ１６０によって集束される蛍光１５５は、画像平面において異なる深度で集束する。そのため、単一の反射層９１０は、共焦点ピンホールの必要性に応じて、すべてのストライプに対して同時に焦点を合わせることができない。上述のように、図９（ａ）に示すチャネルセパレータ９００内に、さらなる光学系およびピンホールを含むことが可能である。別の考えられる解決策は、チャネルセパレータ９００内の異なる平面に、いくつかのプレートを追加することであろう。各プレートには、異なる照明ストライプと合致する一組の疎な反射ファセットがある。さらに別の代替策として、チャネルセパレータ９００内の画像平面の前に、補正板を挿入してもよい。図９（ｂ）および９（ｃ）は、補正板の例を示す。図９（ｂ）は、明確にするために曲率が誇張された小型レンズアレイを示す。図９（ｃ）は、図９（ｂ）に示す小型レンズアレイよりも厚いスペーサアレイを示す。
信号が間違った補正板ファセットを通過するのを回避するために、補正板から画像平面までの距離ｚは、Ｍ＊ｄｘ＊ｆ＃未満でなければならず、ここで、Ｍは、対物レンズ１４０およびチューブレンズ１６０による倍率であり、ｄｘは、サンプル１５０における励起ストライプ間隔であり、ｆ＃は、画像平面での焦点比である。ｆ＃＝Ｍ／（２＊ＮＡ）（ＮＡは、対物レンズ１４０の開口数である）を使用して、距離ｚは、ｚ＜Ｍ２ｄｘ／（２＊ＮＡ）として表すことができる。同時に、補正板が画像平面で焦点比を大幅に変更することは、下流の光学系にとって望ましくない。したがって、距離ｚは、ｚ＞＞Ｍ２ｄｚを満たすように選択され得、ここで、ｄｚは、サンプル１５０における異なる励起ストライプ間の焦点シフトである。したがって、この方式を可能にするために、励起ストライプ間隔ｄｘは、ｄｘ＞＞ｄｚ＊（２＊ＮＡ）を満たすように選択され得る。例えば、０．５のＮＡにおいて、ｄｚは、３μｍであってもよく、ｄｘは、３０μｍであってもよい。図９（ｂ）に示す補正板の補正板ファセットの曲率、または図９（ｃ）に示す補正板の厚さは、特定の焦点シフトｄｚを実現するように設計してもよい。この補正板は、複数の焦点深度を生成するために、均一な小型レンズアレイとともに励起パスに挿入することもできる。図９（ｄ）は、異なる深度から収集された蛍光１５５の焦点が補正されない場合の焦点面の例を示し、図９（ｅ）は、異なる深度から収集された蛍光１５５の焦点が補正板９８０で補正された場合の焦点面の例を示す。
図１０は、蛍光１５５を複数の空間的に分散されたスペクトルチャネルに分離するチャネルセパレータの別の例を示す図である。図１０に示すように、チャネルセパレータ１０００は、蛍光１５５の各ストライプを集中させる小型レンズアレイ１０１０と、蛍光１５５を再コリメートするレンズ１０２０と、蛍光１５５を分散させるプリズム１０３０と、蛍光１５５を一連のスペクトルストライプとしてセンサ１０５０上に画像化するレンズ１０４０と、を含む。サンプル１５０を走査して、サンプル１５０全体からデータを収集することができる。センサ１０５０は、高速電子読み出しのために最適化された、大面積センサまたはより小さいセンサのモザイクであってもよい。
図１１（ａ）は、サンプル１５０上に形成され得る照明パターンの例を示す。図１１（ａ）に示す照明パターンは、図２に示す照明パターン２４２と同様であるが、５つの波長λ１～λ５を有する励起光に対応したストライプを含む。この照明パターンによって生成される蛍光１５５は、同様のストライプの構造を有し、大きい倍率で小型レンズアレイ１０１０上に画像化される。
図１１（ｂ）は、小型レンズアレイ１０１０のレイアウトの例を示す。小型レンズアレイ１０１０は、図１１（ａ）に示す照明パターンによって生成された蛍光１５５を受容するように構成されている小型レンズの複数の線形アレイを含む。蛍光１５５のストライプの各々は、小型レンズアレイ１０１０内の小型レンズの線形アレイのそれぞれ１つに画像化される。小型レンズ間の領域は、共焦点性を提供し、かつコントラストを改善するためにマスクされてもよい。線形アレイは、センサ上のスペクトル間の重なりを最小限に抑えるために、小型レンズのピッチの数分の１だけ、互いに対して垂直にオフセットされてもよい。小型レンズは、円形、正方形、または他の任意の形状の開口を有してもよい。
図１１（ｃ）は、図１１（ｂ）に示す小型レンズアレイ１０１０によって生成された強度パターンの例を示す。この強度パターンは、蛍光１５５のストライプが小型レンズアレイ１０１０の線形アレイ上に画像化されるときに、小型レンズアレイ１０１０の焦点面に形成される。
図１１（ｄ）は、センサ１０５０上に形成されたスペクトルストライプの例を示す。スペクトルストライプは、蛍光１５５を再コリメートするレンズ１０２０、蛍光１５５を分散させるプリズム、および蛍光１５５をセンサ１０５０上に画像化するレンズ１０４０によって形成されている。図１１（ｄ）に示す水平ストライプの各組内の垂直の千鳥配列は、図１１（ｃ）に示す小型レンズアレイ１０１０内の小型レンズの線形アレイ間の垂直の千鳥配列に対応する。
図１１（ｅ）は、サンプル１５０上に形成され得る別の照明パターンの例を示す。図１１（ｅ）に示す照明パターンは、図２（ｃ）に示す照明パターン２４７と同様である。この照明パターンによって生成された蛍光１５５は、同様の円形スポットの構造を有し、倍率の高い小型レンズアレイ１０１０上に画像化される。
図１１（ｆ）は、小型レンズアレイ１０１０のレイアウトの別の例を示す。小型レンズアレイ１０１０は、図１１（ｅ）に示す照明パターンによって生成された蛍光１５５を受容するように構成されている小型レンズアレイを含む。蛍光１５５の円形スポットの各々は、小型レンズアレイ１０１０内の円形小型レンズのそれぞれ１つに画像化される。小型レンズ間の領域は、共焦点性を提供し、かつコントラストを改善するためにマスクされてもよい。
図１１（ｇ）は、図１１（ｆ）に示す小型レンズアレイ１０１０によって生成された強度パターンの例を示す。この強度パターンは、蛍光１５５の円形が小型レンズアレイ１０１０の線形アレイ上に画像化されるときに、小型レンズアレイ１０１０の焦点面に形成される。
図１１（ｈ）は、センサ１０５０上に形成されたスペクトルストライプの例を示す。スペクトルストライプは、蛍光１５５を再コリメートするレンズ１０２０、蛍光１５５を分散させるプリズム、および蛍光１５５をセンサ１０５０上に画像化するレンズ１０４０によって形成されている。
図１１（ｉ）は、サンプル１５０上に形成され得る別の照明パターンの例を示す。図１１（ｅ）に示す照明パターンは、図２（ｃ）に示す照明パターン２４７と同様である。この照明パターンによって生成される蛍光１５５は、同様の円形スポットの構造を有し、倍率の高い小型レンズアレイ１０１０に代わるピンホールアレイ上に画像化される。
図１１（ｊ）は、小型レンズアレイ１０１０に代わるピンホールアレイの例を示す。ピンホールアレイは、図１１（ｉ）に示す照明パターンによって生成される蛍光１５５を受容するように構成されているピンホールアレイを含む。蛍光１５５の円形スポットの各々は、ピンホールアレイ内のピンホールのそれぞれ１つに画像化される。
図１１（ｋ）は、図１１（ｊ）に示すピンホールアレイによって生成された強度パターンの例を示す。この強度パターンは、蛍光１５５の円形スポットがピンホールアレイ上に画像化されるときに、ピンホールアレイの焦点面に形成される。
図１１（ｌ）は、センサ１０５０上に形成されたスペクトルストライプの例を示す。スペクトルストライプは、蛍光１５５を再コリメートするレンズ１０２０、蛍光１５５を分散させるプリズム、および蛍光１５５をセンサ１０５０上に画像化するレンズ１０４０によって形成されている。
図１２は、蛍光１５５を複数の空間的に分散されたスペクトルチャネルに分離するチャネルセパレータの別の例を示す図である。図１２に示すように、チャネルセパレータ１２００は、蛍光１５５を分散させるプリズムアレイ１２１０および回折格子１２２０と、蛍光１５５の各ストライプを一連のスペクトルストライプとしてセンサ１２４０上に集中させる小型レンズアレイ１２３０と、を含む。小型レンズアレイ１２３０は、図１１（ｂ）に示す小型レンズアレイと同じ構造を有してもよい。プリズムアレイ１２１０は、特定の設計波長に対する格子の１次回折角をキャンセルするように選択されたファセット角を有してもよい。これにより、分散した光が垂直入射により近いように小型レンズアレイ１２３０に入射することができ、それにより非点収差が低減され、場合によってはセンサ１２４０の性能も改善される。プリズムアレイ１２１０のピッチ（周期）は、集束を改善するために小型レンズアレイ１２３０のピッチと一致するように選択されてもよい。小型レンズアレイ１２３０のピッチはまた、センサ１２４０で生成されたスペクトルの均一性を改善するために、回折格子１２２０のピッチの整数倍になるように選択されてもよい。サンプル１５０を走査して、サンプル全体からデータを収集することができる。センサ１０５０は、高速電子読み出しのために最適化された、大面積センサまたはより小さいセンサのモザイクであってもよい。
上述の次元に加えて、システム１００は、第６の時間の次元でデータを取得するために使用されてもよい。システム１００は、上述のように異なるサンプル位置でハイパースペクトルデータを取得し、その後、それらの位置を時間の関数として監視することができる。例えば、これは、異なる退色率を有するフルオロフォアを分離するために使用され得る。また、高速センサと併用して蛍光寿命を判定することもできる。
本発明の例示的な実施形態は、いくつかの利点を提供し得る。例えば、蛍光子の収集を最大化することが可能であり、これにより、退色を最小限にし、信号対雑音比を最大化して、スペクトルの分離を改善する。加えて、各蛍光チャネルの分散を調整して、センサ内の画素の使用を最大化することができる。さらに、複数の励起チャネルを同時に取得することができるため、複数の深度で走査することができ、および／または複数の励起波長を使用することができる。
上記の説明では、実施形態の完全な理解を提供するために、特定の詳細を述べている。しかしながら、実施形態は、これらの特定の詳細を伴わずに実施することができることが理解される。例えば、回路は、不必要な詳細によって実施形態を不明瞭にしないために、ブロック図で示され得る。他の例では、周知の回路、プロセス、アルゴリズム、構造、および技法は、実施形態が不明瞭になることを回避するために、不必要な詳細を伴わずに示され得る。
上記の技術、ブロック、ステップ、および手段は、様々な方法で実装することができる。例えば、これらの技術、ブロック、ステップ、および手段は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせで実装することができる。ハードウェア実装の場合、処理ユニットは、１つ以上の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、デジタル信号処理デバイス（ＤＳＰＤ）、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、プロセッサ、コントローラ、マイクロコントローラ、マイクロプロセッサ、上記の機能を実行するように設計された他の電子ユニット、および／またはそれらの組み合わせにおいて、実装されてもよい。
また、実施形態は、フローチャート、フロー図、データフロー図、構造図、またはブロック図として示されたプロセスとして説明することができることに留意されたい。フローチャートでは、操作を順次プロセスとして説明することができるが、操作の多くは、並列または同時に実行することができる。加えて、操作の順序を並べ替えることができる。プロセスは、その操作が完了すると終了するが、図に含まれていない追加のステップを有する場合がある。プロセスは、メソッド、関数、プロシージャ、サブルーチン、サブプログラムなどに対応し得る。プロセスが関数に対応する場合、その終了は、呼び出し元の関数またはメイン関数への関数の戻りに対応する。
さらに、実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、スクリプト言語、ファームウェア、ミドルウェア、マイクロコード、ハードウェア記述言語、および／またはそれらの任意の組み合わせによって実装することができる。ソフトウェア、ファームウェア、ミドルウェア、スクリプト言語、および／またはマイクロコードで実装される場合、必要なタスクを実行するためのプログラムコードまたはコードセグメントは、記憶媒体などの機械可読媒体に格納することができる。コードセグメントまたは機械実行可能命令は、プロシージャ、関数、サブプログラム、プログラム、ルーチン、サブルーチン、モジュール、ソフトウェアパッケージ、スクリプト、クラス、または命令、データ構造、および／またはプログラムステートメントの任意の組み合わせを表すことができる。コードセグメントは、情報、データ、引数、パラメータ、および／またはメモリの内容を渡すおよび／または受信することによって、別のコードセグメントまたはハードウェア回路に結合することができる。情報、引数、パラメータ、データなどは、メモリの共有、メッセージの受け渡し、チケットの受け渡し、ネットワーク送信など、任意の好適な手段を介して受け渡し、転送、または送信することができる。
ファームウェアおよび／またはソフトウェア実装の場合、方法は、本明細書に記載の機能を実行するモジュール（たとえば、手順、機能など）で実装することができる。本明細書に記載の方法を実施する際に、命令を有形的に具現化する任意の機械可読媒体を使用することができる。例えば、ソフトウェアコードは、メモリに格納することができる。メモリは、プロセッサ内またはプロセッサの外部に実装することができる。本明細書で使用される「メモリ」という用語は、任意のタイプの長期、短期、揮発性、不揮発性、または他の記憶媒体を指し、特定のタイプのメモリ、特定の数のメモリ、またはメモリが格納されている特定のタイプの媒体に限定されない。
さらに、本明細書で開示するように、「記憶媒体」という用語は、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、磁気ＲＡＭ、コアメモリ、磁気ディスク記憶媒体、光学記憶媒体、フラッシュメモリデバイス、および／または情報を格納するための他の機械可読媒体を含む、データを記憶するための１つ以上のメモリを表すことができる。「機械可読媒体」という用語は、可搬または固定記憶デバイス、光学記憶デバイス、無線チャネル、および／または命令および／またはデータを含むまたは搬送することができる他の様々な記憶媒体を含むが、これらに限定されない。
本開示の原理を、特定の装置および方法に関連して上記で説明しているが、この説明は単に例示を目的とするものであって、本開示の範囲を限定するものではないことを明確に理解されたい。

Claims (18)

  1. 励起光を放出し、かつサンプルを通って前記励起光を誘導して、前記励起光が前記サンプルに蛍光を放出させるように構成されている、励起光源であって、光源と、前記光源から光を受容しかつ励起ストライプを生成するように構成されている、レンズと、を備える、励起光源と、
    前記サンプルから前記蛍光を受容し、かつ画像化された蛍光を生成するように構成されている、対物レンズと、
    前記画像化された蛍光を受容するように位置決めされ、かつ前記画像化された蛍光を透過させるように構成されている、スリットと、
    前記スリットを通って透過した蛍光を受容し、かつ前記蛍光を空間的に分散された複数のスペクトルチャネルに分離するように構成されている、チャネルセパレータであって、第１のコリメーティングレンズと、第２のコリメーティングレンズと、前記第１のコリメーティングレンズと前記第２のコリメーティングレンズとの間の１つ以上の分散光学系と、を備える、チャネルセパレータと、
    前記チャネルセパレータから前記空間的に分散された複数のスペクトルチャネルを受容するように構成されている、センサと、を備え、
    前記励起光源は、１つ以上の追加の光源をさらに備え、
    前記レンズは、前記１つ以上の追加の光源から光を受容し、かつ１つ以上の追加の励起ストライプを生成するように構成されており、
    前記１つ以上の追加の励起ストライプの各々は、前記サンプルに追加の蛍光を放出させ、
    前記対物レンズは、前記蛍光と、前記追加の蛍光とを画像化して、前記サンプルの同じ深度もしくは異なる深度の平行ライン、または、前記サンプルの同じもしくは異なる深度の円形スポットのアレイを形成するように構成されている、システム。
  2. 前記スリットは、透過領域と、１つ以上の反射または吸収領域と、を備えるパターン化層を備え、前記透過領域は、前記画像化された蛍光を透過させるように構成されている、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記光源から光を受容し、かつ前記励起ストライプを生成するように構成されている前記レンズは、円柱レンズを備える、請求項１に記載のシステム。
  4. 前記励起光源からの光が前記センサに到達するのを阻止するように構成されている、フィルタをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
  5. 前記フィルタは、単一ノッチフィルタ、ロングパスフィルタ、およびマルチノッチフィルタのうちの１つ以上を備える、請求項４に記載のシステム。
  6. 前記対物レンズとともに前記蛍光を画像化するように構成されている、１つ以上のチューブレンズをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
  7. 前記１つ以上の分散光学系は、複数のプリズムを備える、請求項１に記載のシステム。
  8. 前記１つ以上の分散光学系は、一組のダブルアミチプリズムを備える、請求項１に記載のシステム。
  9. 前記１つ以上の分散光学系は、より多いまたはより少ない分散を提供するように調整可能である、請求項１に記載のシステム。
  10. 励起光源によって、励起光を放出することであって、前記励起光源は、光源と、前記光源から光を受容しかつ励起ストライプを生成するように構成されているレンズと、を備える、励起光を放出することと、
    前記励起ストライプをサンプル上に誘導して、前記励起ストライプが前記サンプルに蛍光を放出させることと、
    対物レンズを使用して、前記蛍光から画像化された蛍光を生成することと、
    スリットを通って前記画像化された蛍光を透過させることと、
    チャネルセパレータによって、前記スリットを通って透過した蛍光を空間的に分散された複数のスペクトルチャネルに分離することであって、前記チャネルセパレータは、第１のコリメーティングレンズと、第２のコリメーティングレンズと、前記第１のコリメーティングレンズと前記第２のコリメーティングレンズとの間の１つ以上の分散光学系と、を備える、前記複数のスペクトルチャネルに分離することと、
    センサによって、前記チャネルセパレータから前記空間的に分散された複数のスペクトルチャネルを受容することと、を含み、
    前記励起光源は、１つ以上の追加の光源をさらに備え、
    前記レンズは、前記１つ以上の追加の光源から光を受容し、かつ１つ以上の追加の励起ストライプを生成するように構成されており、
    前記１つ以上の追加の励起ストライプの各々は、前記サンプルに追加の蛍光を放出させ、
    前記対物レンズを使用して前記画像化された蛍光を生成することは、前記蛍光と、前記追加の蛍光とを画像化して、前記サンプルの同じ深度もしくは異なる深度の平行ライン、または、前記サンプルの同じもしくは異なる深度の円形スポットのアレイを形成することを含む、方法。
  11. 前記スリットは、透過領域と、１つ以上の反射または吸収領域と、を備えるパターン化層を備え、前記透過領域は、前記画像化された蛍光を透過させるように構成されている、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記光源から光を受容し、かつ前記励起ストライプを生成するように構成されている前記レンズは、円柱レンズを備える、請求項１０に記載の方法。
  13. フィルタを使用して、前記励起光源からの光が前記センサに到達するのを阻止することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記フィルタは、単一ノッチフィルタ、ロングパスフィルタ、およびマルチノッチフィルタのうちの１つ以上を備える、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記蛍光から画像化された蛍光を生成することは、前記対物レンズとともに１つ以上のチューブレンズを使用することを含む、請求項１０に記載の方法。
  16. 前記１つ以上の分散光学系は、複数のプリズムを備える、請求項１０に記載の方法。
  17. 前記１つ以上の分散光学系は、一組のダブルアミチプリズムを備える、請求項１０に記載の方法。
  18. 前記１つ以上の分散光学系は、より多いまたはより少ない分散を提供するように調整可能である、請求項１０に記載の方法。
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