CN110908100B - 光谱分辨高分辨率3d定位显微术 - Google Patents

光谱分辨高分辨率3d定位显微术 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种光谱分辨高分辨率3D定位显微术，并且具体涉及一种定位显微镜，包括将样品从焦平面成像到图像平面中的成像装置，成像装置包括光学操纵装置，光学操纵装置被配置成使得点发射器在图像平面中成像为旋转地不对称失真的点发射器图像；旋转地不对称失真的形式和/或定向取决于点发射器相对于焦平面的位置和样品光的波长；光学操纵装置包括影响成像的点扩散函数以产生点发射器图像的旋转不对称性的第一和第二各向异性元件，两个各向异性元件在成像方向上一个接一个地布置，并且它们的各向异性轴线相对于彼此以一定角度定位，并且两个各向异性元件在每种情况下都具有不同的中性波长，在中性波长处它们不会各向异性地影响成像的点扩散函数。

Description

光谱分辨高分辨率3D定位显微术
发明领域
本发明涉及一种包括用于将样品成像的成像装置的定位显微镜，所述样品从焦平面发射样品光到图像平面，其中所述成像装置包括光学操纵装置，所述光学操纵装置被配置用于所述成像的点扩散函数的深度依赖性影响并且影响所述成像的所述点扩散函数，使得点发射器在所述图像平面中成像到具有至少两个图像波瓣的点发射器图像中，其中所述点发射器图像的所述图像波瓣的相对位置取决于所述点发射器相对于所述焦平面的位置和所述样品光的波长，并且其中所述光学操纵装置包括第一和第二各向异性元件，所述第一和第二各向异性元件在每种情况下各向异性地影响所述成像的所述点扩散函数，以产生所述点发射器图像的所述图像波瓣，并且在每种情况下包括各向异性轴线。
本发明进一步涉及一种用于定位显微术的方法，其中发射样品光的样品从焦平面成像到图像平面中，其中使用光学操纵装置以深度依赖性方式影响所述成像的点扩散函数，使得点发射器在所述图像平面中成像为具有至少两个图像波瓣的点发射器图像，其中所述点发射器图像的所述图像波瓣的相对位置取决于所述点发射器相对于所述焦平面的位置和所述样品光的波长，并且其中在所述光学操纵装置中使用第一和第二各向异性元件，所述第一和第二各向异性元件在每种情况下各向异性地影响所述成像的所述点扩散函数，以产生所述点发射器图像的所述图像波瓣，并且在每种情况下包括各向异性轴线。
背景技术
在现有技术中已经开发了用于克服显微术中的衍射极限的各种方法。WO 2006/127692或DE 102006021317 A1公开了一种缩写为PALM(光激活光学显微术)的方法；它使用标记物质对样品成像，所述标记物质可以举例来说使用光学辐射来激活。只有在激活状态下，标记物质才能发射特定的荧光辐射。标记物质的未活化分子即使在用激发辐射辐照之后也不发射任何或至少不发射显著的荧光辐射。因此，激活辐射通常被称为切换信号。应用PALM方法中的切换信号，使得所述活化标记分子的至少特定部分布置在距相邻活化分子一定距离处，使得这些标记分子被分离，通过所述显微术的光学分辨率测量，或者可以随后通过图像处理方法分离。据说，所述荧光发射器的至少一个子集是被隔离的。因此，术语“隔离”涉及成像的光学分辨率。在记录样品光之后，对于所述隔离的发射器，确证由于分辨率极限而导致的其辐射分布的中心。可以借助于比光学分辨率本身允许的更高精度计算地确定发射器的位置。该过程称为定位步骤。通过计算确定衍射分布的质心而增加的分辨率在英语技术文献中也称为“超分辨率”。它要求样品中至少一个激活的发射器子集可以与光学分辨率区分开，即被隔离。然后可以更准确地确定它们的位置；它们可以定位。由于高分辨率是通过发射样品光的发射器的位置的计算定位获得的，因此术语“定位显微术”已经广泛用于这种类型的显微术，这种类型的显微术在不同方向上进一步发展，甚至对于待在不切换信号的情况下隔离的发射器也是如此。
一些发展涉及获得三维分辨率，即如WO 2007/127692中所解释的，不仅是在横向方向上而且还有在深度方向上的分辨率。在这个方面，应该提到DE 102009060490、DE102012200344和DE 102012224306。对于三维定位显微术，必须修改点扩散函数，以便通过发射器图像的横向性质来编码发射器的位置，所述发射器在图像中在深度方向上发射样品光。
在这方面，WO 2012/039636 A2公开了一种定位显微镜和用于引言部分中提到的类型的定位显微术的方法。其中，在光瞳平面中执行相位操纵，因为两个相反的相位斜坡确保每个点发射器图像(即，隔离点发射器的成像)具有两个图像波瓣。取决于深度位置，即点发射器的z位置，这些图像波瓣相对于彼此移位。
当需要光谱分辨率时，这种方法变得有问题。光谱分辨率在荧光显微术中经常是必需的，因为一般来说通常不可能用单一荧光染色在细胞生物学中进行功能性陈述，细胞生物学是高分辨率的主要应用领域。经典地，即在正常分辨率的情况下，通过在不同颜色通道中的快速顺序成像，例如通过合适的快速滤光器改变等，或者借助于检测光束路径中的分色器和每颜色通道的专用检测器来实现多色成像。然而，对于定位显微术来说，要么是不利的，要么是不可用的。由于定位显微术需要高达100 000帧的时间序列，因此顺序方法花费很长时间。另外，不能研究动态过程，因为颜色通道中的记录本质上不能同时进行。检测通道中的颜色分裂将避免这个问题，但是对于每个颜色通道需要高度复杂的检测器。另外，检测器必须以像素精度相对于彼此进行调整。
对于仅二维定位显微术，已知多种颜色的检测。为了这个目的，点扩散函数受到影响，使得它不像在引言部分中提到的3D定位显微术中那样对深度位置进行编码，而是对颜色信息进行编码。举例来说，这在DE 102012201286A1中实现。
为了获得三维分辨率和光谱分辨率，必须相对于发射器的深度位置和相对于光谱信息来影响(即编码)点扩散函数。已经提到的WO2012/039636A2在这里提供了一种其中使用光瞳分割的方法。用于深度分辨率的相位操纵元件(即，3D定位显微术)放置在一半光瞳上，并且发射滤光器放置在另一半光瞳中。然而，在WO2012/039636A2中的图14中所示出的这个实施例具有两个缺点。发射滤波器是光谱选择元件。它本质上总是导致光子的抑制，并且因此在对光子特别敏感的定位显微术中，要么导致更差的分辨率，要么导致更长的测量。此外，不同波长的图像波瓣之间的强度变得非常不相等。仅对于单个波长，有可能实现相等强度的图像波瓣。另外，这使得三维定位更加困难，结果变得更糟。
发明内容
由于这个原因，本发明基于指定定位显微镜的目的和用于定位显微术的方法，其中没有光子被光谱抑制，但是光谱分辨率和深度分辨率都是可实现的。
本发明的特征在于权利要求1和9。从属权利要求涉及本发明的优选发展。
所述定位显微镜具有用于对发射样品光的样品成像的成像装置。所述样品可以举例来说是适当激发的荧光样品。所述样品被从焦平面成像到图像平面中。
所述成像装置具有光学操纵装置。后者被配置用于所述成像的所述点扩展函数的深度依赖性波长依赖性影响。它以这样的方式影响所述成像的所述点扩散函数(下面也称为“PSF”)，使得点发射器成像到旋转地不对称失真(举例来说，具有至少两个图像波瓣)的点发射器图像上。所述点发射器图像的所述各向异性失真取决于所述点发射器相对于所述焦平面的位置和所述样品光的波长。
根据本发明，在一个实施例中，旋转不对称性是图像波瓣，并且配置是其相对位置。所述图像波瓣取决于它们相对于所述焦平面的位置和所述样品光的所述波长而相对于彼此具有依赖性相对位置。所述旋转不对称性的另一实施例是所述点发射器图像的各向异性失真。
所述光学操纵装置具有第一和第二各向异性元件。每个各向异性元件各向异性地影响所述成像的所述点扩散函数，并且产生所述各向异性失真。它还体现为各向异性失真元件。在成像期间，如术语“定位显微术”所暗示，确保在发射所述样品光的所述样品中存在隔离的发射器。
每个各向异性元件的特征在于各向异性轴线。所述两个各向异性元件在成像方向上一个接一个地布置。它们的各向异性轴线相对于彼此不平行。在实施例中，由所述各向异性轴线包围的角度取决于所述各向异性元件的实现，但所述各向异性轴线通常相对于彼此以直角定位。
每个第一各向异性元件各向异性地影响所述点扩散函数，但对于第一波长是中性的。对于第二各向异性元件，情况正好相反。它同样各向异性地影响所述点扩散函数，但对于第二波长是中性的。这可以理解为意指每个各向异性元件对于分配给它的个别波长是中性的。因此，所述各向异性元件在其各向异性轴线的位置和它们的中性波长方面不同。以这种方式，所述失真的所述定向和/或形式不仅是深度依赖性的，而且是波长依赖性的。
类似地实现用于定位显微术的方法。发射样品光的样品被从焦平面成像到图像平面中。使用光学操纵装置以深度依赖性方式影响所述成像的点扩散函数，使得点发射器被成像为各向异性地失真的点发射器图像。所述各向异性失真的配置取决于所述点发射器相对于所述焦平面的位置和所述样品光的波长。所述光学操纵装置包括第一和第二各向异性元件，所述第一和第二各向异性元件在每种情况下各向异性地影响所述成像的所述点扩散函数，以便产生所述各向异性失真。每个各向异性元件的特征在于其各向异性轴线。所述两个各向异性元件在成像方向上一个接一个地定位，并且它们的各向异性轴线包围它们之间的角度。所述两个各向异性元件分别不作用于所述第一波长和所述第二波长。
通过将所述各向异性元件一个接一个地布置并且由于它们的各向异性轴线包围的角度，结合所述各向异性元件对于所述点扩散函数的不同波长是中性的事实，确保了对于所述图像平面中的所述第一波长和所述第二波长的所述各向异性失真具有举例来说沿着不同结构轴线延伸的结构，因为所述各向异性元件中只有一个作用于此。以这种方式，有可能从所述结构轴线方向解码所述波长。所述各向异性失真点发射器图像的元素的相对位置对颜色通道的深度位置进行编码。
在传统的宽视场显微镜中出现各向异性失真会非常令人不安；将不会获得可用的成像。然而，这在定位显微术中不是问题，因为发射到所述样品光中的所述点发射器中的至少一些是隔离的，正如术语定位显微术所暗示的那样。在传统的宽场显微术中将具有不可接受的图像拖尾效应的所述各向异性失真的产生现在不是关键性的，并且可以在定位步骤中不仅相对于对应点发射器的横向位置指示，而且尤其相对于针对所述点发射器的深度指示和针对所述点发射器的颜色通道进行评估。为了这个目的，捕获所述失真的所述形式和/或定向，举例来说所述点发射器图像的元素(举例来说，图像波瓣)的相对位置。所述失真的中心指示所述点发射器的横向坐标。z坐标的定向和/或形式对其中由所述对应点发射器发射的所述样品光的颜色通道进行编码。
对于这个评估，所述显微镜通常包括对应评估装置，所述对应评估装置可以举例来说实现为计算机。所述评估可以在线执行，即直接在产生每帧时执行，或者可替选地，在已经记录多个帧之后执行。这通常从定位显微术中得知，但不是用于所述图像中的横向位置确定、深度指示和颜色通道的组合。
所述点发射器图像的所述各向异性失真的结构轴线通常在发射器精确地以所述波长中的一个发射所述样品光时存在。然而，其中发射器发射处于两个中性波长之间的波长的所述样品光的情况也是可能的。然后，所述点发射器图像就其形式而言表示具有第一结构轴线的在第一波长处的所述点发射器图像的混合或过渡形式和具有第二结构轴线的在所述第二波长处的所述点发射器图像的混合或过渡形式。这种形式可以与处于所述第一和第二波长的形式(被称为纯形式)区分开，这意味着最终在一般公式中，所述点发射器图像的所述形式对所述深度和所述波长进行编码。以这种方式，也有可能借助于两个各向异性元件来实现两个以上的颜色通道。
在简单的配置中，所述各向异性元件在每种情况下都可以呈相位元件的形式。然后，所述各向异性失真具有至少两个图像波瓣的形式。每个相位元件具有影响PSF的效应，但不影响其个别波长，即，对于所述PSF来说它是中性的。以这种方式，每个各向异性元件不会在所述中性波长的辐射下产生所述图像波瓣。通常，所述各向异性元件具有影响所述PSF的功能，即，在其中性波长之外的所有波长中产生所述图像波瓣。如所解释的，只要所述各向异性元件在一波长处没有相位影响效应，即是中性的，而另一个各向异性元件在那里失真，这是可容许的，并且甚至准许颜色通道数量的增加。因此，有利的是通过其在所述中性波长处的(缺乏)效应来有效地表征所述各向异性元件，然后可以将所述中性波长解释为在那里不是中性的另一个各向异性元件的波长。
用于实现所述各向异性元件中的一个的相位元件的特别简单配置由具有不同色散性质的两个玻璃的楔形物对组成，选择所述玻璃使得所述楔形物对的总折射率在所述中性波长处消失。因此，所述两个玻璃针对所述中性波长在其分散效应方面相互抵消。否则，并且特定来说，在分配给相应楔形物对的所述中性波长处，它们具有色散效应，并且因此产生所述图像波瓣。
选择所述楔形物对的楔形角和折射率，使得所述中性波长在没有偏转的情况下透射。较短或较长的波长经历偏转。所述楔形物对交叉的事实导致相对于所述深度和相对于所述颜色通道的所期望差异。这种方法的优点在于，可以使用技术上可非常容易管理的玻璃，因为可以使两个参数变化以用于实现所述楔形物对，具体地说，所述楔形物对中的所述楔形角和相应楔形角的折射率。总体上，这使得四个参数可用，两个折射率和两个楔形角。在特别简单的配置中，这里选择所述楔形角，使得所述楔形物对具有平行的外部面，即，所述相位元件的入射面平行于出射面。然后，所述楔形角相等地相反，并且加起来等于零。
对于相位元件，优选的是，所述各向异性轴线相对于彼此以在80°与90°之间优选地为90°的角度布置。
出于本发明的目的，此外，当相位元件布置在检测光束路径的光瞳平面中时，相位元件具有其最佳效应，通过所述光瞳平面将所述样品光成像为所述点发射器图像。因此，优选在光瞳平面(举例来说，物镜光瞳平面)中或附近的布置。
所述各向异性元件的另一种替代方案是各向异性透镜，所述各向异性透镜在一个波长处是中性的，并且在其余光谱范围内具有各向异性。然后，所述各向异性失真是所述点发射器图像的纵向失真。在这种情况下，所述各向异性轴线的特征在于所述各向异性透镜的圆柱轴线。它们优选地相对于彼此以在35°与55°之间的角度其中特别优选地以45°定位。
不言而喻，在不脱离本发明的范围的情况下，前述特征和下文还要解释的特征不仅可以以指定的组合使用，而且可以以其它组合或单独使用。
附图说明
下面将参考附图，基于示例性实施例更详细地解释本发明，附图同样公开了对本发明必不可少的特征。这些示例性实施例仅用于阐明，并且不应解释为限制性的。以示例方式，具有多个元件或部件的示例性实施例的描述不应被解释为所有这些元件或部件对于实现目的来说是必需的效应。而是，其它示例性实施例还可以含有替代元件和部件，更少元件或部件或额外元件或部件。除非另有说明，否则不同示例性实施例的元件或部件可以彼此组合。针对示例性实施例中的一个描述的修改和发展也可以适用于其它示例性实施例。为了避免重复，各个图中的相同元件或对应元件由相同的附图标记标示，并且不再多次解释。在图中：
图1示出了定位显微镜的示意性图示，
图2和3示出了在图1的显微镜中使用的各种光学操纵元件的截面图示，
图4A到图4D示出了用于解释光学操纵元件的效应的图示，
图5示出了可以用于图4A到图4D的操纵元件中的玻璃的色散曲线，
图6A到图6I示出了对于定位显微镜中的点发射器的不同波长和深度位置，图1的显微镜中点发射器图像可能具有的失真，
图7示出了图1的修改的显微镜，其中修改涉及光学操纵元件的配置，并且
图8A到图8C示出了对应于图4A、图4B和图4D的图示，但是在这种情况下用于图7的显微镜的图示。
具体实施方式
图1示出了被配置用于前述定位显微术的显微镜1。它使用物镜4经由管透镜6将位于焦平面3中的样品2成像到检测器8(举例来说，位于图像平面9中的照相机)上。整个成像在宽视场中执行。为了这个目的，样品2由照射源10照射，照射源10经由分束器11和物镜4将对应照射辐射引导到样品2上。其实现在这里不重要的照明光学单元12、14调节来自照射源10的照射辐射。整个显微镜由用于定位显微术的控制装置16控制，控制装置16可以被配置成举例来说计算机。在定位显微术中，已知制备样品2使得隔离发射器发射样品光。术语“隔离”在这里指的是样品2含有发射器的事实，所述发射器可以在图像平面9中通过光学分辨率区分，所述光学分辨率最终由物镜4和管透镜6确定。关于定位显微术，如上所述，参考说明书的引言部分和本发明的一般描述。
显微镜1与传统的定位显微镜的不同之处在于提供了光学操纵元件18，光学操纵元件18位于图1的实施例中的光瞳平面20中。在所示的实施例中，这是物镜4的后侧光瞳平面。然而，这不是强制性的。如果需要，光瞳平面20也可以通过对布置在其间的光学单元成像来产生。在那种情况下，它将是与物镜4的后侧光瞳平面共轭的光瞳平面。它也可以仅位于成像光束路径中。
操纵元件18影响点扩散函数，根据所述点扩散函数，样品2以使得点状发射器的点发射器图像各向异性地失真的方式成像到图像平面9中。失真导致点发射器图像旋转地不对称，即，通常它具有各向异性轴线并且举例来说旋转地不对称的图像波瓣。除了深度分辨率之外，为了实现至少两个颜色通道，即，区分用于样品光的至少两个光谱范围，操纵元件由来自两个各向异性元件22和24的两个部分组成。这些在成像方向上一个接一个(即，从物镜4到检测器8)定位地布置。在图1中，这些各向异性元件22、24的厚度被高度夸大。实际上，它们事实上位于光瞳平面20中。每个各向异性元件产生各向异性图像失真。然而，每个各向异性元件22、24具有中性波长，在中性波长处它不会产生图像失真。各向异性元件22、24的中性波长不同。此外，每个各向异性元件22、24具有单独的各向异性轴线。各向异性元件22、24的各向异性轴线彼此成一定角度布置，即它们不平行。下面将参考图4A到图4D解释这两种各向异性元件的效应。
在图2和图3中以示例方式示出了各向异性元件22的一种可能的建构。各向异性元件22在这里由两个玻璃楔形物26、28组成，在图2的实施例中，两个玻璃楔形物26、28被配置成使得它们形成各向异性元件22的平行端面。玻璃楔形物在使用的玻璃方面不同。选择它们使得玻璃的折射率在中性波长处是相同的，否则不同。以这种方式，在用于深度编码的所期望PSF失真的意义上，这样的玻璃楔形物以相位影响的方式在中性波长之外的每个波长处起作用，并且在点发射器图像中产生旋转地不对称(即，各向异性)失真。如果使用两个玻璃楔形物，这两个玻璃楔形物相对于它们在光瞳20的两半部中的楔形方向反转，则对于中性波长之外的所有波长，产生由两个图像波瓣组成的点发射器图像。如果发射器位于焦平面3中，则图像波瓣位于一个轴线上。当点发射器位于焦平面3的上方或下方时，它们垂直于所述轴线偏移。偏移在有可能区分发射器是位于焦平面上方还是下方的范围内是唯一的。图像中轴线的方向由楔形物的倾斜面沿着其定向的方向唯一地确定。
除了两个差异之外，各向异性元件24与各向异性元件22相同。首先，玻璃不同，并且被选择使得中性波长是不同的波长。其次，玻璃楔形物对22的楔形方向以及因此各向异性轴线相对于玻璃楔形物对24的楔形方向旋转，优选地旋转达90°。出于调整原因，所述值可以在85°与105°之间波动。楔形方向在这里理解为楔形面沿着其向上或向下倾斜的方向。
图2示出了纯粹作为各向异性元件22的示例的平面平行双楔形物的情况。除了自然波长(并且当然还有光束路径中的布置)之外，各向异性元件24对应于元件22。在图3中，元件22/24被修改成使得楔形物对的入射面和出射面相对于彼此不平行。在这种情况下，中性波长不会出现在玻璃楔形物26和28的折射率相同的值处，而是出现在不同波长处，所述不同波长的位置使得玻璃楔形物26和28之间的折射率差确保所述样品光仅仅是偏移的，但不会在不同的方向上传播。图3的方法在选择楔形角和玻璃材料(即折射率)方面提供了更大的自由度。
图4A到图4D示出了两个各向异性元件22、24的效应，在这里呈依据图2的玻璃楔形物形对的形式。图4A以截面图示示出了两个玻璃楔形物形对，其中中性波长在附图中不同。在玻璃楔形物对22的情况下，λ1是中性波长。在这里，折射率相同，并且样品光不会偏转到不同的方向。在玻璃楔形物对24的情况下，λ2是中性波长。
图4B以平面图示出了在每种情况下玻璃楔形物22、24如何位于光瞳平面上。图4B示出了上部图示中的各向异性元件22和下部图示中的各向异性元件24。显然，两个玻璃楔形物对放置到光瞳的两半部中，其中光瞳半部中的楔形方向相对于彼此反转。两个玻璃楔形物沿着轴线23延伸，轴线23是各向异性轴线。另一方面，各向异性元件24由类似地布置的两个玻璃楔形物形对形成，但是其中各向异性轴线25旋转达90°。图4C示出了具有交叉的各向异性轴线23、25的各向异性元件22、24如何最终在成像方向上一个接一个地定位。
图4D示出了由此引起的效应，具体来说，在左部图示中针对波长λ1并且在右部图示中针对波长λ2。在λ1处，仅各向异性元件24是有效的，因为元件22在这里是中性的。在λ2处恰好相反。当点发射器图像被分成两个图像波瓣30、32和36、38时，失真的“纯形式”发生，当点发射器被想象为沿着深度方向(即z轴线)移位时，所述两个图像波瓣沿着结构轴线34和40相对于彼此移位。实际上，当然不会发生失真，因为点发射器是位置固定的。另外，只有当点发射器的样品光以对应波长λ1或λ2发射时才获得纯形式。由于这个原因，结构轴线34由各向异性轴线25在波长λ1处的定向来指定。相比之下，各向异性元件24在波长λ2处是中性的，并且只有各向异性元件22是有效的——其中结构轴线40由各向异性轴线23限定。
以这种方式，这不仅对于从旋转地不对称失真的点发射器图像来解码深度位置是可能的，而且对于解码通过结构轴线34、38的方向进行编码的波长也是可能的，所述深度位置通过沿着结构轴线34或38的偏移进行编码，所述旋转地不对称失真的点发射器图像在这种情况下由图像波瓣30和32组成。这通过控制装置16成为可能。
图5以示例的方式示出了可以如何选择玻璃。绘制了针对三种不同玻璃的色散曲线，所述玻璃在图例中指定。很容易看出，很容易找到在特定波长处具有相同折射率但在不同波长处不同的玻璃对组合(即可以中性地组合)。一种可能的组合将会是举例来说玻璃对OHA-SBAL 11和OHA-SBAL 14。在大约500nm的波长处，它们具有相同的折射率，但在大约610nm的波长处具有高度不同的折射率。这可以举例来说在各向异性元件22中使用。具有玻璃对OHA-SBAL14和OHA-PDL 26Y的各向异性元件24的配置将补充前者。该类对在波长610nm处将具有相同的折射率，但在大约500nm处具有不同的折射率。以这种方式，具有这种玻璃选择的楔形物对的中性波长将不同，并且有可能根据图4D精确地实现失真，其中，波长λ1和λ2然后将是大约500纳米和610纳米。
图6A到图6I示出了针对不同情况以两个图像波瓣30、32的形式出现的失真。在图6D、图6E和图6F中，点发射器在每种情况下位于焦平面3中，但是在图6A、图6B和图6C中它们位于焦平面3上方，并且在图6G、图6H和图6I中，它们位于焦平面3下方。在图6A、图6D和图6G中，发射器仅在波长λ1处发射样品光。另一方面，在图6C、图6F和图6I中，发射器仅在λ2处发射。在图6B、图6E和图6H中，由点发射器发射的样品光的波长位于λ1与λ2之间。
可以看出，图6D和图6F中的失真，即图像波瓣30、32的定向仅沿结构轴线34、38展开，结构轴线34、38由各向异性轴线23、25指定。在图6A、图6C、图6G和图6I中，图像波瓣相对于所述结构轴线34、38正交地移位。因此，有可能依据结构轴线34、38的方向编码颜色通道，并且依据相对于结构轴线34、38的偏移编码深度位置。对于既不具有纯波长λ1也不具有λ2的点发射器同样也是如此，即产生点发射器图像6B、6E和6H。它们可以与“纯”形式区分开，并且因此可以关于颜色通道和深度进行分类。
在图1中，各向异性元件被布置为光瞳平面中的相位操纵元件。然而，还可以利用其它各向异性失真。图7示出了显微镜1的实施例，其中两个图像变形透镜对42和44用作光学操纵元件18。它们可以位于管透镜6的上游或下游或者与其组合。图8A到图8C中示出了它们的配置和效应。显而易见，透镜对42和44在每种情况下对于不同的中性波长λ1和λ2并不图像变形。此外，在图像变形透镜对42、44一个接一个地布置的情况下，它们的圆柱轴线相对于彼此旋转达45°。因此，圆柱轴线再次分别对应于各向异性轴线23和25。图8C示出了失真如何不同。图8C的左列示出了针对不同深度位置的点发射器在波长λ1处的失真。点发射器在上半部分中位于焦平面上方，在下半部分中位于焦平面下方。右半部分示出在波长λ2处的失真。
在控制装置16中执行对失真点发射器图像的评估。
在根据图2或图3组合以形成阿米西(Amici)棱镜22、24的两个棱镜26、28的一般情况下，在小的楔形角ε处，对于总偏转，δ＝(n1-1)*ε1+(n2-1)*ε2＝0，这给出任何所期望的折射率n1和n2>1，在中性波长处，棱镜楔形角的比率ε2/ε1＝-(n1-1)/(n2-1)，以及因此总楔形角ε1+ε2＝ε1*(1-(n1-1)/(n2-1))。在中性波长处折射率相同n1＝n2的特殊情况下，ε2/ε1＝-1，并且因此“平面板”ε1+ε2＝0。
另一方面，有可能在可以经由不同的阿贝数v1和v2描述两个玻璃26、28的不同色散的情况下，针对非中性波长，设置偏转角δλ＝ε1*(n1λ-1-(n2λ-1)*(n1-1)/(n2-1))，通过所述偏转角确定楔形角ε。在这种情况下，n1λ和n2λ描述了两种材料在偏转波长处的折射率。
以这种方式，有可能针对任何所期望的介质粘结棱镜进行设计，所述介质粘结棱镜在中性波长处透射，并且在另一波长处产生特定的目标偏转。
还有可能在z方向上布置具有不同的(特定来说互换的)中性波长的这样的棱镜。
如图6B、图6E和图6H中所示，位于两个设计波长λ1、λ2之间的第三颜色通道由于两个正交地定向的各向异性元件22、24的相位效应的“混合”而变得可利用。
然而，通过具有不同中性波长λ1、λ2、λ3的三个各向异性元件的顺序布置，该原理也可以针对三个设计波长来设计。这里应该注意的是，所产生的光束偏转是由其它各向异性元件的总组合产生的。类似于之前所说的，有可能组合来自不同材料的至少三种各向异性元件，以下条件适用于所述各向异性元件：
δ(λ1)＝0＝(n1(λ1)-1)*ε1+(n2(λ1)-1)*ε2+(n3(λ1)-1)
*ε3
δ(λ2)＝0＝(n1(λ2)-1)*ε1+(n2(λ2)-1)*ε2+(n3(λ2)-1)
*ε3
δ(λ3)＝δ＝(n1(λ3)-1)*ε1+(n2(λ3)-1)*ε2+(n3(λ3)-1)
*ε3
其中，δ指定在有效波长处的分裂，并且λ1和λ2指定中性波长。对于分裂的目标效应，然后必须确定适合介质的三个棱镜角度。
基于这个模型，有可能举例来说在SYGH 51楔形角-0.328°，S-FTM 16楔形角+33.158°和S-NBH 51楔形角-25.891°的情况下在546nm和643nm处实现中性效应，而波长480nm偏转达0.2'。在-0.303°的S-YGH 51楔形物、-72.384°的S-FTM 16楔形物和57.548°的S-NBH51楔形物的情况下，可以借助于546nm的相同0.2'分裂获得在480nm和643nm处的中性效应。在0.644°的S-YGH 51楔形物、39.269°的S-FTM 16楔形物、-31.701°的S-NBH 51楔形物的情况下，在546nm和480nm的中性波长处的643nm的0.2'分裂是类似地可想到的。短标识符指定制造商小原株式会社(Ohara)的传统玻璃类型。
此外，棱镜单元的方位角旋转应该从90°减小到60°，并且在PSF计算时考虑在内。
以类似于楔形物对的倾斜平面和光点位移如何相互连接的方式，这些失真也可以径向地实现，这导致元件的产生并且在技术上省去了(分开的)光瞳中不同楔形布置的组合。类似于图2，这最初可以在基片上产生单色螺旋掩模。然后，在共同平面侧部上粘结在一起的不同材料上的两个这样的结构的组合可以在总体效应中产生类似的中性波长，因为部分棱镜粘结以形成阿米西棱镜。然后，具有不同中性波长的这样的单元的顺序布置再次准许相对于波长分离的相位结构的效应。原则上，因此有可能为不同应用实现各种各样的彩色相位掩模。
基于实验确证或模拟的PSF实现隔离的(即分离的)发射器的3D定位。原则上，也有可能使用评估PSF的特定参数的算法(参见S.Pavani等人的“Three-dimensional,single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function”，《美国国家科学院论文集》(Proceedings of theNational Academy of Sciences)，106.9(2009)：2995-2999)。使用先前测量的3D PSF具有以下优点：还可以考虑系统引起的像差，并且仍然可以使用在不同颜色PSF之间的个别参数不再能够唯一分离的其它散焦区域中的PSF。
分离发射器的3D定位可以有利地通过适应实验确定的或模拟的3D PSF来实现，通常通过最大似然估计算法(如M.Juette等人的《自然方法》(Nature Methods)，第5卷，第6期，第527页，2008年6月)以及相关联补充材料(Li,Yiming等人的“Fast,robust andprecise3D localization for arbitrary point spread functions”，《预印本在线期刊》(bioRxiv)(2017)：172643)来实现。
方法可选地也可用于2D成像，举例来说在TIRF照射下或在非常薄的样品的情况下。在那种情况下，仅利用焦点中的PSF形式的颜色编码(参见图6，中心线)，并且这比在3D情况下更加独特和明确。

Claims (16)

1.一种定位显微镜，包括用于将发射样品光的样品(2)从焦平面(3)成像到图像平面(9)中的成像装置，
其中，所述成像装置包括光学操纵装置(18)，所述光学操纵装置被配置用于所述成像的点扩散函数的深度依赖性影响并且影响所述成像的所述点扩散函数，使得点发射器在所述图像平面中成像为旋转地不对称失真的点发射器图像(30、32；42)，
其中，所述点发射器图像(30、32；42)的所述旋转地不对称失真的形式和/或定向取决于所述点发射器相对于所述焦平面(3)的位置和所述样品光的波长，并且
其中，所述光学操纵装置(18)包括第一各向异性元件(22)和第二各向异性元件(24)，所述第一各向异性元件(22)和所述第二各向异性元件(24)在每种情况下各向异性地影响所述成像的所述点扩散函数以产生所述点发射器图像的旋转不对称性，并且所述第一各向异性元件(22)和所述第二各向异性元件(24)在每种情况下包括各向异性轴线(23、25)，
其中，
所述第一各向异性元件(22)和所述第二各向异性元件(24)在成像方向上一个接一个地布置，并且所述第一各向异性元件(22)和所述第二各向异性元件(24)的各向异性轴线(23、25)相对于彼此以一角度定位，并且
所述第一各向异性元件(22)和所述第二各向异性元件(24)在每种情况下都具有中性波长(λ1、λ2)，所述第一各向异性元件(22)和所述第二各向异性元件(24)在所述中性波长(λ1、λ2)处不会各向异性地影响所述成像的所述点扩散函数，
其中，所述中性波长(λ1、λ2)不同。
2.根据权利要求1所述的定位显微镜，其中，各向异性元件在每种情况下均形成为相位元件，该相位元件在另一个各向异性元件的中性波长处具有相位影响效应，并且在中性波长处不具有相位影响效应。
3.根据权利要求2所述的定位显微镜，其中，每个相位元件被实施为由具有不同色散性质的两块玻璃制成的楔形物对(26、28)，其中，折射率和楔形角被选择为使得楔形角对在所述中性波长处产生直接视觉，否则不产生直接视觉。
4.根据权利要求1所述的定位显微镜，其中，所述各向异性轴线(23、25)相对于彼此以在80度与100度之间的角度定位。
5.根据权利要求1所述的定位显微镜，其中，所述各向异性元件在每种形式中实施为在所述中性波长处没有圆柱效应的图像变形透镜。
6.根据权利要求5所述的定位显微镜，其中，所述各向异性轴线(23、25)相对于彼此以在35度与55度之间的角度定位。
7.根据权利要求4所述的定位显微镜，其中，所述各向异性轴线(23、25)相对于彼此以90度的角度定位。
8.根据权利要求6所述的定位显微镜，其中，所述各向异性轴线(23、25)相对于彼此以45度的角度定位。
9.一种用于定位显微术的方法，其中，发射样品光的样品(2)从焦平面(3)被成像到图像平面(9)中，
其中，使用光学操纵装置(18)以深度依赖性方式影响所述成像的点扩散函数，使得点发射器在所述图像平面中被成像为旋转地不对称失真的点发射器图像(30、32；42)，
其中，所述点发射器图像(30、32；42)的所述旋转地不对称失真的形式和/或定向取决于所述点发射器相对于所述焦平面(3)的位置和所述样品光的波长，并且
其中，在所述光学操纵装置(18)中使用第一各向异性元件(22)和第二各向异性元件(24)，所述第一各向异性元件(22)和所述第二各向异性元件(24)在每种情况下各向异性地影响所述成像的所述点扩散函数，以产生所述点发射器图像的旋转不对称性，并且在每种情况下包括各向异性轴线(23、25)，
其中，
所述第一各向异性元件(22)和所述第二各向异性元件(24)在成像方向上一个接一个地布置，并且所述第一各向异性元件(22)和所述第二各向异性元件(24)的各向异性轴线(23、25)相对于彼此成一角度，并且
所述第一各向异性元件(22)和所述第二各向异性元件(24)在每种情况下都具有中性波长(λ1，λ2)，所述第一各向异性元件(22)和所述第二各向异性元件(24)在所述中性波长(λ1，λ2)处不会各向异性地影响所述成像的所述点扩散函数，
其中，所述中性波长(λ1，λ2)不同。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，对于每个各向异性元件，使用一相位元件，所述相位元件在另一个各向异性元件的所述中性波长处具有相位影响效应，并且在所述中性波长处不具有相位影响效应。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，对于每个相位元件，使用由具有不同色散性质的两块玻璃制成的楔形物对(26、28)，其中折射率和楔形角被选择为使得楔形角对在所述中性波长处产生直接视觉，否则不产生直接视觉。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述各向异性轴线(23、25)相对于彼此以在80度与100度之间的角度定位。
13.根据权利要求9所述的方法，其中，对于每个各向异性元件，使用在所述中性波长处没有圆柱效应的图像变形透镜。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述各向异性轴线(23、25)相对于彼此以在35度与55度之间的角度定位。
15.根据权利要求12所述的定位显微镜，其中，所述各向异性轴线(23、25)相对于彼此以90度的角度定位。
16.根据权利要求14所述的定位显微镜，其中，所述各向异性轴线(23、25)相对于彼此以45度的角度定位。
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