JP2007292620A - 流路切換えバルブ、それを用いた高速液体クロマトグラフ及び分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 流路の切換え時に圧力変化によるショックが生じないようにできる流路切換えバルブを提供する。
【解決手段】 （Ａ）ロータ溝１ｃは、分析用送液ポンプ１１と分析カラム１３を接続させる流路となる（濃縮工程）。（Ｂ）流路切換えバルブ１のロータは時計方向に３０°回転して、ロータ溝１ｃは分析用送液ポンプ１１、分析カラム１３及びトラップカラム５を接続する。トラップカラム５内の圧力は分析カラム１３内の圧力と同圧力になるまで上昇して安定し、両カラム５，１３間の圧力差は相殺される（高圧化工程）。（Ｃ）両カラム５，１３間の圧力が充分安定した後、ロータをさらに３０°回転させる事により、トラップカラム５は分析カラム１３とシリアルにつながり、サンプルの分析が行われる（溶出工程及び検出工程）。
【選択図】図２

Description

本発明は、サンプル中の各種化合物の分離分析を行なう高速液体クロマトグラフ及びその分析方法と、それに用いる流路切換えバルブに関するものである。

ライフサイエンス分野でタンパクやペプチドなどの構造を決定するのに用いられる質量分析計において、その感度を最適化するために、その前駆段階となるＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）では流量の極低流量化が求められている。

通常、一般の分析で用いられるＨＰＬＣでは、内径４．６ｍｍ前後のカラムに１ｍＬ／分程度の移動相を送液して分析するのが一般的であるが、質量分析計では内径０．３ｍｍ前後のカラムに５μＬ／分程度の流量を送液するミクロＨＰＬＣが一般的になりつつあり、さらには、内径０．０７５ｍｍのカラムに２００ｎＬ／分程度の移動相を送液するナノＨＰＬＣが商品化されている。

こういった極低流量ＨＰＬＣを用いて分析を行う場合、システム内の容量（約１００μＬ）により分析中にサンプルが拡散してしまい、質量分析計の感度を損ねてしまうことがある。そのため、サンプルをオートサンプラやマニュアルインジェクタを用いてシステム内に注入後、流路切換えバルブに接続されているトラップカラムにサンプルを吸着させて濃縮する。その後、流路切換えバルブを切り換えて分析用移動相をトラップカラムに送液し、トラップカラムに吸着したサンプルをトラップカラムより脱離させ、後段の分析カラムにて分離を行い、最終的に質量分析計にて質量分析を行う。

極低流量ＨＰＬＣに用いられる流路切換えバルブは、上記と同じ理由により内部容量が小さいものが用いられる。流路切換えバルブには一般的に流路切換えバルブへの配管を固定するハウジングトップと、回転で流路を切り換えるロータ、及び両者の間にあって液密を保つステータが主な構成品である。極低流量ＨＰＬＣでは、バルブ内容量を低減するため、ステータをハウジングトップと一体化させた流路切換えバルブが一般になりつつある。

図３は通常の流路切換えバルブを用いたＨＰＬＣ流路図であり、（Ａ）はサンプル濃縮時、（Ｂ）はサンプル分析時を示す。
流路切換えバルブ２１の各ポートは、サンプルを濃縮するトラップカラム５、濃縮ポンプ７とトラップカラム５の間の流路にサンプルを注入するサンプル注入部９、トラップカラム５で濃縮された成分を分離するために分析用移動相を送液する分析用送液ポンプ１１、及びトラップカラム５で濃縮された成分を分離する分析カラム１３が、それぞれ流路を介して接続している。分析カラム１３の下流には検出器１４が接続されている。
流路切換えバルブ２１のロータには円周状のロータ溝２１ａ〜２１ｃが３つ形成されており、（Ａ），（Ｂ）に示すように、ロータが６０°回転することによりロータ溝と対応するポートの組み合わせが切り換わり、サンプル濃縮とサンプル分離・分析が行なわれる。

流路切換えバルブ２１では、トラップカラム５とバルブ２１を接続する配管には、内径２５μｍ、長さ５０ｍｍ程度のものがよく使われており、入口と出口を合わせると配管容量は５０ｎＬ程度となる。
また、ロータ溝２１ａ〜２１ｃのピッチ円は半径５ｍｍ、幅０．１ｍｍ、深さ０．１ｍｍ程度で、そのロータ溝容量は１０ｎＬである。さらに、ステータの流路は内径０．１ｍｍ、長さ１ｍｍで、その容量は１５ｎＬである。そのため２つのポート間での内部容量は２５ｎＬになり、配管容量（５０ｎＬ）と合わせると７５ｎＬ程度となる。
さらに、トラップカラム５には内径２００μｍ、長さ３０ｍｍ程度の充填カラムなどが使用されており、システム容量（７５ｎＬ）とトラップカラム容量を合計すると約１μＬの容量となる。

サンプル濃縮の際は（Ａ）に示すように、トラップカラム５内の内部圧力は１ＭＰａ程度であるが、ナノＬＣでの分析の場合、分析用送液ポンプ１１で送液された際に分析カラム１３にかかる圧力は５ＭＰａ程度になる。
サンプル濃縮終了後は（Ｂ）に示すように、流路切換えバルブ２１がサンプル分析に切り換わるとき、トラップカラム５内の圧力（１ＭＰａ）によって分析用送液ポンプ１１の圧力（５ＭＰａ）は急激に低くなる。

その際、流路切換えバルブ２１の切換えショックにより分析カラム１３に急激な圧力低下が生じ、分析用送液ポンプ１１からの移動相の送液がスムーズにいかなくなり、保持時間の再現性に影響を与えたりする。
そこで本発明は、流路の切換え時に圧力変化によるショックが生じないようにできる流路切換えバルブとそれを用いた高速液体クロマトグラフを提供することを目的とする。

本発明の流路切換えバルブは、複数のロータ溝が形成されたロータの回転によりロータ溝と接続するポートが切り換えられる流路切換えバルブにおいて、上記ロータ溝の一つは３つのポートが同時に接続する長さを備えた長ロータ溝であり、上記ロータは該長ロータ溝が３つのポートを接続する位置と２つのポートのみを接続する位置の間で切り換えられるものである。

本発明の高速液体クロマトグラフは、サンプルを濃縮するトラップカラムと、濃縮用移動相を上記トラップカラムに送液する濃縮用送液ポンプと、上記濃縮用送液ポンプと上記トラップカラムの間の流路でサンプルを上記濃縮用移動相に注入するサンプル注入部と、サンプルの成分を分離する分析カラムと、上記トラップカラムで濃縮された成分を分析用移動相により上記分析カラムに送液する分析用送液ポンプと、上記分析カラムで分離されて溶出した成分を検出する検出器とを備えている。そして、上記トラップカラム、上記分析用送液ポンプ及び上記分析カラムは本発明の流路切換えバルブの３つのポートに接続され、かつ分析用送液ポンプのポートの両側にトラップカラムのポートと分析カラムのポートが来るように隣接して配置され、上記ロータの回転により上記長ロータ溝によるトラップカラム、分析用送液ポンプ及び分析カラムの接続、分析用送液ポンプとトラップカラムの接続、並びに分析用送液ポンプと分析カラムの接続が切り換えられる。

分析カラムで分離する際には高圧が必要であり、上記分析用送液ポンプは上記濃縮用送液ポンプよりも送液圧力が高いものである。

本発明の高速液体クロマトグラフ分析方法は、本発明の高速液体クロマトグラフを用い、以下の工程（Ａ）〜（Ｅ）をその順に含むものである。
（Ａ）ロータの回転角度をサンプル注入部からの流路とトラップカラムが接続される角度として、トラップカラムにサンプルを導入してサンプル中の成分を濃縮する濃縮工程、
（Ｂ）ロータの回転角度を上記長ロータ溝によりトラップカラム、分析用送液ポンプ及び分析カラムが接続される角度として、トラップカラムと分析カラムの圧力差を解消する高圧化工程、
（Ｃ）ロータの回転角度を上記長ロータ溝により分析用送液ポンプとトラップカラムが接続され、トラップカラムと分析カラムが他のロータ溝により接続される角度として、トラップカラムに濃縮されていた成分を溶出する溶出工程、
（Ｄ）ロータの回転角度を分析用送液ポンプと分析カラムが接続される角度として、トラップカラムから溶出した成分を分析カラムで分離する分離工程、及び
（Ｅ）分析カラムから溶出する成分を検出器で検出する検出工程。

ロータ溝の一つは３つのポートが同時に接続する長さを備えた長ロータ溝であり、ロータはその長ロータ溝が３つのポートを接続する位置と２つのポートのみを接続する位置の間で切り換えられるようにしたので、３個のポート間に生じる圧力差を相殺することが可能となる。

分析用送液ポンプのポートが長ロータ溝を介してトラップカラムのポート及び分析カラムのポートに同時接続できるように隣接して配置したので、トラップカラムと分析カラム間の圧力差を相殺するような状態をとることができ、分析用送液ポンプからスムーズに移動相が送液されるようにできるので、高い保持時間の再現性を得ることが可能となる。

トラップカラムにサンプルを導入してサンプル中の成分を濃縮する濃縮工程、トラップカラムと分析カラム間の圧力差を解消する高圧化工程、分析用送液ポンプとトラップカラムを接続して、トラップカラムに濃縮されていた成分を溶出する溶出工程、トラップカラムから溶出した成分を分析カラムで分離する分離工程、及び分析カラムから溶出する成分を検出器で検出する検出工程、を行なうようにしたので、分析用送液ポンプからスムーズに移動相が送液され、高い保持時間の再現性を得ることが可能となる。

本発明の一実施例を以下に詳細に説明する。
図１は流路切換えバルブを示しており、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はハウジングトップの平面図、（Ｃ）はロータの平面図、（Ｄ）は（Ｂ）のＸ−Ｘ’線における垂直断面図である。流路切換えバルブ１は、流路を切り換える回転子であるロータ４と、ロータ４の回転を液密に保つためのステータの機能を兼ねるハウジングトップ２を組み合わせたものである。本実施例では、バルブ１内の容量を低減するために、ハウジングトップ２はステータを兼ねるものとする。

ハウジングトップ２には外部の流路と接続するための６個のポート３ａ〜３ｆが設けられている。ポート３ａ，３ｂはトラックカラムへのＩＮ側ポート及びＯＵＴ側ポート、ポート３ｃは濃縮用移動相接続用ポート、ポート３ｄはドレイン接続用ポート、ポート３ｅ及び３ｆは分析用移動相のＩＮ側ポート及びＯＵＴ側ポートである。

ロータ４のハウジングトップ２と対向する表面には、２つのポート間を接続させる円弧状のロータ溝１ａ，１ｂ、及び３つのポート間を接続させる円弧状の長ロータ溝１ｃが形成されている。ロータ溝１ａ，１ｂの１つのピッチは、例えば半径２．５ｍｍ、内角６０度、幅０．１ｍｍ、深さ０．１ｍｍ程度で、その容量は約４０ｎＬである。長ロータ溝１ｃのピッチは、例えば半径２．５ｍｍ、内角１２０度、幅０．１ｍｍ、深さ０．１ｍｍ程度で、その容量は約４０ｎＬである。ロータ溝１ａ〜１ｃは、例えば機械加工で形成することができる。

次に同実施例の動作を説明する。
ロータ４のロータ溝１ａ，１ｂは中心軸から６０°ずつの回転角度で形成されているので、ロータ溝１ａ，１ｂをポートと接続させて流路とするときは、ロータ４を６０°回転することで、ロータ溝１ａ〜１ｃとポート３ａ〜３ｆの組み合わせを切り換えることができる。
例えばポート３ｂ，３ｄ間にロータ溝１ａが位置し、ポート３ａ，３ｃ間にロータ溝１ｂが位置し、ポート３ｅ，３ｆ間に長ロータ溝１ｃが位置している状態から、ロータ４を６０°時計回りに回転させると、ポート３ａ，３ｂ間にロータ溝１ｂが位置し、ポート３ｄ，３ｆ間にロータ溝１ａが位置し、ポート３ｃ，３ｅ間に長ロータ溝１ｃが位置する。

また、長ロータ溝１ｃは１２０°の回転角度で形成されているので、６０°の回転角度で形成されている３つのポートを同時に接続することが可能である。
例えばポート３ｂ，３ｄ間にロータ溝１ａが位置し、ポート３ａ，３ｃ間にロータ溝１ｂが位置し、ポート３ｅ，３ｆ間に長ロータ溝１ｃが位置している状態から、ロータ４を３０°時計回りに回転させると、ポート３ｃ，３ｅ，３ｆ間に長ロータ溝１ｃが位置し、ポート３ｄはロータ溝１ａに位置し、ポート３ａはロータ溝１ｂに位置する。このときポート３ｂはいずれのロータ溝にも位置しない。

図２は本発明のＨＰＬＣの一実施例を示す流路図であり、（Ａ）は濃縮工程、（Ｂ）は高圧化工程、（Ｃ）は溶出工程と分離・検出工程を示している。
流路切換えバルブ１の各ポート（３ａ〜３ｆ）は、サンプルを濃縮するトラップカラム５、濃縮ポンプ７とトラップカラム５の間の流路にサンプルを注入するサンプル注入部９、トラップカラム５で濃縮された成分を分析用移動相で分離するために送液する分析用送液ポンプ１１、トラップカラム５で分離された分離成分を検出する分析カラム１３、及びドレインにそれぞれ流路を介して接続している。分析カラム１３の下流には検出器１４が接続されている。

流路切換えバルブ１のロータには、図１で説明したように、３つの円周状のロータ溝（１ａ〜１ｃ）が形成されており、ロータが回転することによりロータ溝と対応するポートの組み合わせが切り換わる。
ロータ溝は、２つのロータ溝（１ａ，１ｂ）が内角６０°、他の１つの長ロータ溝１ｃが内角１２０°に形成されている。

（Ａ）サンプル濃縮時、長ロータ溝１ｃは、分析用送液ポンプ１１と分析カラム１３を接続させる流路となり、ロータ溝１ａ，１ｂは、濃縮ポンプ７、サンプル注入部９、トラップカラム５及びドレインを接続させる流路となる。これにより、サンプル注入部９から注入されたサンプルはトラップカラム５で濃縮され、濃縮に使われた濃縮移動相はドレインから排出される。

（Ｂ）サンプル濃縮が完了すると、流路切換えバルブ１のロータは時計方向に３０°回転して、長ロータ溝１ｃは分析用送液ポンプ１１、分析カラム１３及びトラップカラム５を接続する。トラップカラム５の他端のポート３ｄはロータ溝１ａと接続しているが、このロータ溝１ａは他の流路と接続していないため、分析用移動相はトラップカラム５を流れない。
また、濃縮ポンプ７につながるポート３ａはどのロータ溝とも接続していないため、流路切換えバルブ１のロータを回転させる前に濃縮ポンプの流量を０ｍＬ／分に設定しておく必要がある。これにより、トラップカラム５の圧力は分析カラム１３の圧力と同圧力になるまで上昇して安定し、両カラム５，１３間の圧力差は相殺される。

（Ｃ）両カラム５，１３間の圧力差が安定した後、ロータを時計方向にさらに３０°回転させる事により、トラップカラム５は分析カラム１３とシリアルにつながり、トラップカラムに濃縮されていた分析カラム１３によって分離される。このとき、分析用送液ポンプ１１に圧力ショックが生じないため、分析用移動相の送液はスムーズに行われ、良好なサンプル保持時間再現性が確保される。
両カラム５，１３間の圧力差を測定して確認するために、両カラム５，１３を接続する流路に圧力計を備えるようにしてもよい。
その後、分析カラム１３から溶出する成分は検出器１４で検出される。

なお、ＨＰＬＣで一般に用いられている１ｍＬ／分などの流量では、流量に比べてトラップカラムの容量は充分に小さいため、このような圧力ショックによる影響は小さく保持時間再現性への影響は無視できる。
また、６方バルブにおいては３０°と６０°の回転角度が適当であるが、ロータの回転角度はこれに限定されるものではなく、８方バルブなど、他の形態のバルブにおいても実施可能である。

本発明は、サンプル中の各種化合物の分離分析を行なう高速液体クロマトグラフ及びその分析方法に利用することができる。

流路切換えバルブの一実施例を示しており、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はハウジングトップの平面図、（Ｃ）はロータの平面図、（Ｄ）は（Ｂ）のＸ−Ｘ’線における断面図である。 本発明のＨＰＬＣの一実施例を示す流路図であり、（Ａ）はサンプル濃縮時、（Ｂ）は圧力差相殺時、（Ｃ）はサンプル分離・検出時を示している。 従来の流路切換えバルブを用いたＨＰＬＣ流路図であり、（Ａ）はサンプル濃縮時、（Ｂ）はサンプル分析時を示す。

符号の説明

１，２１ 流路切換えバルブ
１ａ〜１ｂ ロータ溝
１ｃ 長ロータ溝
２ ハウジングトップ
３ａ〜３ｆ ポート
４ ロータ
５ トラップカラム
７ 濃縮ポンプ
９ サンプル注入部
１１ 分析用送液ポンプ
１３ 分析カラム
１４ 検出器

Claims (4)

1. 複数のロータ溝が形成されたロータの回転によりロータ溝と接続するポートが切り換えられる流路切換えバルブにおいて、
   前記ロータ溝の一つは３つのポートが同時に接続する長さを備えた長ロータ溝であり、前記ロータは該長ロータ溝が３つのポートを接続する位置と２つのポートのみを接続する位置の間で切り換えられることを特徴とする流路切換えバルブ。
2. サンプルを濃縮するトラップカラムと、濃縮用移動相を前記トラップカラムに送液する濃縮用送液ポンプと、前記濃縮用送液ポンプと前記トラップカラムの間の流路でサンプルを前記濃縮用移動相に注入するサンプル注入部と、サンプルの成分を分離する分析カラムと、前記トラップカラムで濃縮された成分を分析用移動相により前記分析カラムに送液する分析用送液ポンプと、前記分析カラムで分離されて溶出した成分を検出する検出器と、を備えた液体クロマトグラフにおいて、
   前記トラップカラム、前記分析用送液ポンプ及び前記分析カラムは請求項１に記載の流路切換えバルブの３つのポートに接続され、かつ分析用送液ポンプのポートの両側にトラップカラムのポートと分析カラムのポートが来るように隣接して配置され、
   前記ロータの回転により前記長ロータ溝によるトラップカラム、分析用送液ポンプ及び分析カラムの接続、分析用送液ポンプとトラップカラムの接続、並びに分析用送液ポンプと分析カラムの接続が切り換えられる高速液体クロマトグラフ。
3. 前記分析用送液ポンプは前記濃縮用送液ポンプより大きい圧力で送液するものである請求項２に記載の高速液体クロマトグラフ。
4. 請求項２又は３に記載の高速液体クロマトグラフを用い、以下の工程（Ａ）〜（Ｅ）をその順に含む高速液体クロマトグラフ分析方法。
   （Ａ）ロータの回転角度をサンプル注入部からの流路とトラップカラムが接続される角度として、トラップカラムにサンプルを導入してサンプル中の成分を濃縮する濃縮工程、
   （Ｂ）ロータの回転角度を前記長ロータ溝によりトラップカラム、分析用送液ポンプ及び分析カラムが接続される角度として、トラップカラムと分析カラムの圧力差を解消する高圧化工程、
   （Ｃ）ロータの回転角度を前記長ロータ溝により分析用送液ポンプとトラップカラムが接続され、トラップカラムと分析カラムが他のロータ溝により接続される角度として、トラップカラムに濃縮されていた成分を溶出する溶出工程、
   （Ｄ）ロータの回転角度を分析用送液ポンプと分析カラムが接続される角度として、トラップカラムから溶出した成分を分析カラムで分離する分離工程、及び
   （Ｅ）分析カラムから溶出する成分を検出器で検出する検出工程。

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