JP2004309135A - 液体クロマトグラフィーに於ける液体の分岐装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】液体クロマトグラフィー等の微量分析に於いて、分析カラムに試料を導入する場合、微量の成分を分岐する必要性がある。
【解決手段】カラムをパイプ内に挿通して二重管とし、カラムとパイプ端の重ね位置を選択する、或はカラムとパイプ径を変えることにより、液体のカラムとカラム及びパイプ間に流れる流量を分岐し、且つ分岐量を調整可能にする。
【選択図】 図１
【解決手段】カラムをパイプ内に挿通して二重管とし、カラムとパイプ端の重ね位置を選択する、或はカラムとパイプ径を変えることにより、液体のカラムとカラム及びパイプ間に流れる流量を分岐し、且つ分岐量を調整可能にする。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラフィーに於ける液体の分岐装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】液体クロマトグラフィーに於て、液体を分岐させる必要性としては、分析カラムに試料を導入する前にカラムの試料負荷量を超えないよう注入された成分を分岐する場合、又分岐された成分を２種以上の検出器で分析するため分岐する場合などがある。
【０００３】
これらの目的に応じ、アイソクラティック、グラジエント、ポストカラム等種々の方法に使用される各種のスプリッターが提供されている。
特に、バイオ関連分析に於いては、微量試料量しか分析に使用できず、内径の細いカラムの使用が不可欠となっている。０．１ｍｍ未満以下のカラムを用いる場合には、流量を０．１μｌ／ｍｉｎ以下の流速を正確に流す必要がある。現在の送液システムに於いては、分析装置、特にポンプ、スプリッター等の影響を受け、保持時間が大幅に変動してしまうことが起こる。
【０００４】
従来、三方ジョイントを利用して液体のスプリットが行われている。これを図６により説明する。６は三方ジョイント本体であって、Ｔ字状管に形成され、注入部７１、流出部８１、抵抗部９１より構成され、注入部７１、流出部８１、抵抗部９１に夫々流入管７、流出管８、抵抗管９を設けてある。
この場合、各接続部分に付けたパイプの液体の抵抗に応じて、スプリット量が制御されることになる。例えば流出管８、抵抗管９に同じ圧力の内径０．１ｍｍのパイプを取付を行えば、流入管７から入った液は抵抗比に応じて１：１にスプリットされることになる。
液体抵抗を変化させるためには、抵抗の異なるパイプを簡単に取外せるネジ方式が便利であり、パイプ固定を行うためには、オリフィス７２が設けられている。液体はオリフィス７２部分と三方ジョイント６の内部空間６６を通過してスプリットされる。
【０００５】
均一液体の単なるスプリットとしてはこれで充分であ。しかし、クロマトグラフィーに於いては、目的成分をバンドを広げず如何に次のパイプへ導入するのかが重要となる。従来のこの方法では、流入管７から目的成分は、この内部容量によって拡散されてから次のパイプへ導入されることになり、特に流量が１００μｌ／ｍｉｎ以下の場合には、実用上満足されるものではなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】この容量を減らすため、マイクロマシンニング技術を利用したスプリッタなども理論的には可能となるが、実際にはスプリッタとして高価になってしまい、実用的ではない。更に、ジョイント部分も同時に小さくなり、接続が複雑となり、抵抗管を自由に変更することは不可能となる。更に、内部で詰まりが生じた場合には洗浄できず、本体毎の変更になってしまう。従来からあるカラム、ポンプ、インジェクタへの接続も複雑となる。
又、微量試料分析に適した内径の細いカラムでは負荷量が多くなるとピーク形状が変化し、分離も悪くなる。特に微量成分分析が要求される生体試料などでは、成分数が多くなると、ピーク形状が変化し、分離成分も悪くなる。更に、ポンプ性能による流量再現性、保持時間の変動が大きく、再現性に難点がある。
【０００７】
クロマトグラフィーにおけるピーク幅は１０秒前後であり、拡散時間としては１０分の１である１秒以内に抑えることが必要となる。内部空間６６は、１μｌ程度であり、流出部４への流速が６０μｌ／ｍｉｎ以上の場合では、１秒間拡散することになるが、１０分の１以下になり、充分使用できる。この流速で使用できるＨＰＬＣカラムとしては、内径１ｍｍ以上のセミミクロカラムとなり、より細いキャピラリーカラムでは、数μｌ以下の流速となり、従来の方法での液体分離では実用上満足されるものではなかった。
【０００８】
【特許文献１】特表平１０−５０７５１６号
【０００９】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、スプリッターに要求される抵抗管の接続が簡単に出来、従来からあるカラム、ポンプ、インジェクタへの接続ができ、更にスプリット部分への容量を小さくするという難点が一挙に解決し、又、ポンプの種類によらず、流量再現性が向上でき、特に微少流量で分析する場合に有効な、且つ良いピーク形状が得られる構成簡単なスプリット方法及びスプリッターを提案せんとするもので、カラムと該カラムを挿通可能に被うパイプより成り、両パイプ端部の重ね位置或は両パイプの径の差の選択により、液体の分岐量の調整を可能にすることを特徴とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、図に示す実施例により、本発明を詳細に説明する。
従来より、ＨＰＬＣ分析装置は、ポンプ１により溶離液２が送られ、試料注入するインジェクタ３を介して、カラム４に送られ、検出器５で検出される構成に組まれている。生体試料を扱うバイオ関連分析や診断分析や検査分析などでは、微量試料量しか分析に使用できず、高感度検出が可能な内径が細いカラムの使用が必要となっている。特に、内径０．３ｍｍ以下のカラムは、キャピラリーＨＰＬＣカラムと云われており、微量分析には重要なＨＰＬＣカラムとなっている。キャピラリーＨＰＬＣカラムを用いる場合には、カラム流量を５μｌ／ｍｉｎ以下の流速を正確に流す必要がある。
【００１１】
現状の送液に於いては、分析環境の影響を受け、保持時間変動が１０％以上生じてしまう。正確な流量を流すためには、液体を分岐させる技術が重要となる。そのため、図１、図２のようにポンプ１で流された液を分岐するスプリッタ６が、ポンプ１とインジェクター３或はインジェクタ３とカラム４間に組まれることになる。
又、キャピラリーカラムに於いては、試料負荷量が小さく、多量成分で試料負荷量を超えなくするために、カラムに入る前のインジェクタとカラム間に分岐を設ける必要がある（図２）。又、分離された成分を２種以上の検出器５及び５１に分割する必要がある場合などがある（図３）。
【００１２】
ここで、流入管７、流出管８、抵抗管９について説明すると、流入管７はパイプを使用し、且つ流出管８との関係で、外管となるので、その用途、目的に応じて、パイプ、外管も７を使用する。流出管８については、キャピラリーカラム等の細管及びカラム又は内管を８とすることもある。抵抗管９についてはパイプとすることもある。
【００１３】
本発明では、三方ジョイント以上のジョイントを用いても効果を発揮する。
例えば、抵抗管９を取付ける抵抗部９１が４個ある六方ジョイントを用いてもよく、抵抗管９を４本取付ければ、三方ジョイントを用いた１本の抵抗管９より各抵抗管９の長さを短く出来、詰まり難くすることは出来る。
又、各接続に異なる内径の抵抗管９を取付ければ、外管が空隙部分６９を塞ぐ位置を調整でき、抵抗管９の内径の違いにより塞がれる部分が微妙に異なり、より細かい調整が可能となる。又、同一な畏敬の抵抗管９を取付け、更に外管に孔や溝を切れば、外管を回転されることにより、使用する抵抗管９を選択することも出来る。
先ず、インジェクタ３とカラム４間に三方ジョイント６を組み込んだ場合（図２）で説明する。
図５のように、インジェクタ３１にパイプ７をフェラル３２やオシネネジ３３を用いて接続し、次に、片方は三方ジョイント６１の内部空間６６の中途、分岐口６６０まで、パイプ７を差込み、フェラル６２やオシネネジ６３などで固定する。三方ジョイント６１片端に、カラムへの配管又はキャピラリーカラム８を、パイプ７を挿通してその先端まで差込み二重管としフェラル６５やオシネネジ６４などで固定する。もう片方の流出部９１に、液体分岐を行うための抵抗管９を同様に取付ける。
【００１４】
ポンプ１で送液された液体は、インジェクタ３１を通り、パイプ７先端部分７１で、二重管としたパイプ７，キャピラリーカラム８の抵抗に応じた分岐に応じ分配され、インジェクタ３１より注入された試料が同様に分岐される。このように内部空間６６で分割されるのでなく、パイプ７の入口で分割され、拡散なしにカラム８に導入される。
抵抗管９の接続部分や目的流速を必要とするパイプ７やキャピラリーカラム８へは同様の接続ができ、従来と同じように簡便に使用できる。又、外管であるパイプ７の接続に於いてもＨＰＬＣ配管として最も多く使用される外径１／１６インチ（１．５８ｍｍ）を用いることができ、接続も従来通り簡便に行うことができる。
パイプ７の内径が、内管８の外径より大きく、大きな隙間なく適合できるものであれば良く、例えばパイプ７が外径１／１６インチ（１．５８ｍｍ）で、内径０．５ｍｍの湾曲しないしっかりとした直管で、内管８は、外径０．３７５ｍｍのフューズドシリカチューブや、キャピラリーＨＰＬＣカラムが挿通できることになる。
【００１５】
この分岐の方法では、液体の抵抗に応じて分岐量が制御されることになる。例えば抵抗管９と内管８に同じ内径で同じ長さ、例えば０．１ｍｍ内径のパイプを取付ければ、パイプ７から入った液は、抵抗比に応じて１：１にスプリットされることになる。
そのため、抵抗管９により液体抵抗を変化させることで分岐割合を変化させることができる。抵抗の異なるパイプ９を簡単に取替えるためには、フェラル６７とオシネネジ６８のような形式で接続取外しが出来る方式が便利であり、三方ジョイントが使用される。全ての接続に於いて、フェラル３２，６２，６５，６７とオシネネジ３３，６３，６４，６８が各々一体となった手締めのコネクタも使用される。尚、ジョイントはオシネネジ、フェラルに限定されず、通常のＨＰＬＣに使用されるものであれば使用可能である。
【００１６】
本発明の多重管を用いた液体分岐の各様式を、分岐部における模式図７〜１２で説明する。
液体は流入部７１から導入され、抵抗部９１に取付けられる抵抗管９によって、低流量に分岐され、流出部８１のキャピラリーカラム８等により目的流速の液体で流出する。
又、本発明では三方ジョイント６の内部空間６６の分岐口６６０中間までパイプ７を挿通し、該パイプ７内にカラム等の出口側パイプ８が挿入された多重構造とし、流入部７１のオリフィス７２に於いて、出口側パイプ８間に空隙を構成し、その空隙利用により分岐量を定め、導入された液体は、流入部７１で分岐される構成を為すことも出来る。
【００１７】
三方ジョイント６への流体の導入に次の場合がある。
例えば、導入される流入部７１が、インジェクタ１などの固体の場合では、図７〜９のようにオリフィス７２を持つように構成する。又、パイプなどで接続する場合では、図１０〜１２のように張出したパイプ７によって導入される。
図７のように、インジェクタ３などに直結する場合には、抵抗部９１に付けられる抵抗管９により、分岐量の大まかな調整を行い、更に流入部７１で微調整ができる。流入部７１のオリフイス７２が内管８の外径に近い場合では、内管８の位置により、空隙７４での液体分岐を調整できる。例えば、カラム等の内管８をオリフィス７２近くに設置した場合には、抵抗部９１の抵抗に加えて、外管たるパイプ７と内管８間の間隙の狭小により空隙７４部分での抵抗が生じて、カラム等の内管８へ分岐される液量は多くなる。このようにカラム等の内管８と入口オリフィス７２によって流路分割の微調整も可能となる。カラム等の内管８は、流出部８１部分でフェラルなどで止められる構成とすれば、簡単に位置調整が可能となり、空隙量が所望に応じ、調整できる。
【００１８】
又、図８のようにパイプ７端にフィルター７３を入れ、内管のカラム８を該フィルター７３に押し当てることにより、フィルター７３の厚みがオリフィス７２との距離になるため、位置が固定され、再現性のよい液体分岐が可能となる。外管のパイプ７にフィルター７３を融着固定した交換できるカップフィルターをつける構成が推奨される。浮遊物の濾過も可能で詰まり防止の効果もある。
更に加えて、外管のパイプ７の位置により、分岐比率を変えることも可能である。図９のように外管のパイプ７の位置を抵抗部９１の空隙部分６９まで挿入することで、抵抗部９１のスプリット側流路が絞られ、空隙部分６９から分岐される液量を調整できる。例えば、完全に抵抗部９１部分まで挿入し、被せれば、抵抗部９１から流出される液体はなくなり、全量が内管のカラム８に導入されることになる。外管のパイプ７の固定位置調整で簡単に分岐量を変更できることになる。特に、内管のカラム８がＨＰＬＣカラムの場合では、内部空間６６が殆ど生じず、よりシャープなピークが得られ、分岐の微調整が簡単に出来ることになる。又、液体がオリフイス７２からの導入でない場合、例えば流入部７１にパイプ７に導入される場合も同じように分岐ができる。
【００１９】
図１０、図１１のようにキャピラリーカラム８はパイプ７の中に入れられる多重管構造とすることが出来る。抵抗部９１に付けられる抵抗管９には、空隙７４部分でキャピラリーカラム８に分岐される残余部分が流され、且つパイプ７とキャピラリーカラム８間の空隙と、パイプ７と抵抗部９１との空隙により形成される空隙６９より抵抗部９１へ流されることになる。空隙７４部分での分岐は、パイプ７の内径とキャピラリーカラム８の外径差と、その挿入重なり位置で調整することも可能である。更に、図９と同じように空隙６９部分によって分岐を調整できる。例えば、図１０ではパイプ７の位置の挿入位置で空隙６９が調整され、分岐調整が可能である。図１１では移動が可能な別のパイプ８５を三方ジョイント６に設置し、空隙６９部分を調整可能としたものである。この構成としては、パイプ８６をスプリッター６に出入り自在とすることにより、パイプ８先端の位置と抵抗部９１間の空隙部分６９が調整でき、該空隙部分６９の分岐調整が出来るものがある。
これらは、入口側パイプ７の内径より出口カラム８の外径が小さい場合やキャピラリーカラム８がモノリス構造などのフューズドシリカキャピラリーカラムでは、このようにできる。出口側のキャピラリーカラム８が、充填タイプカラムなどでは外径が太く、パイプ７の中に挿入が無理な場合もある。
【００２０】
図１２のようにパイプ７を、流入部７１又は流出部８１に、そこに挿通されるパイプ８６等に挿入或は保持されるフィルター８４に押し当てることにより、フィルター８４内部に試料が導入され、拡散のないシャープなピークが得られる。特に、フィルター８４自身に濃縮効果が得られるようにすれば、その効果は非常に高くなる（図１２）。又、パイプ８６を三方ジョイント６に出入り自在とすることにより、パイプ８６先端の位置と抵抗部９１間の空隙６９部分が調整でき、該空隙６９部分では分岐調整ができる。フィルター８４を充填カラム８に被せて接続することは推奨される。又、パイプ７を充填カラム８３に対応させ、又さらに充填カラム８３に被せたフィルター８４に押し当てる構成が使用できる。
【００２１】
【実施例】
〔実施例１〕 本実施例には図１３の装置を使用した実施例について説明する。
インジェクタ３として最も汎用的に使用される外径１／１６インチのパイプ７を外管として、長さはオシネネジ３３が締められる最短の長さ３３ｍｍとした。内径はキャピラリーカラム８の外径０．３７５ｍｍに合せて４ｍｍ内径とした。ジョイントを加工して分岐口６６０の中間まで差込んだ。流入部７１を平面に当て、キャピラリーカラム８を押し入れ、オシネネジ６４でキャピラリーカラム８を流出部８１に固定した。このように簡単に先端をそろえられる。次に、インジェクタ３の奥行きに合せてオシネネジ３３で固定した。
抵抗部に付けた抵抗管９は下記のものを使用した。
カムタイプポンプ：内径０．１ｍｍ×長さ７ｍのステンレス抵抗管、ポンプトータル流速１００μｌ／ｍｉｎスプリット比１／２００
シリンジポンプ：内径５０μｍ×長さ１１ｍのフューズドシリカ抵抗管、ポンプトータル流速１０μｌ／ｍｉｎスプリット比１／２０
図２に示す溶離液２，ポンプ１、インジェクタ（レオダイン（登録商標）７５２０ ２μｌ内臓ループ）３、分析カラム４、ＵＶ検出器（ＵＶ７０２キャピラリーセル）５を基本構成として，本発明スプリッタの効果を保持時間変動により検討した。
分析カラム：モノキャップＣ１８ 内径１００μｍ×長さ１５０ｍ
試料： １．アセトフェノン、２．フェノール、３．安息香酸メチル、４．３−メチルインドール
検出波長：２５４ｎｍ
実施例２のようにリーディングピークになるため、４番目の３−メチルインドールのピークエンドがベースに戻った時点の時間を測定し、変動率を計算した。
従来の通常最も使用されているカムタイプポンプと現在最も低流量精度が高いとされるシリンジタイプポンプで比較した。具体的には従来カムタイプにはＰＵ６１０を用いて、１μｌ／ｍｉｎの流量設定で送液した。
溶離液条件：アセトニトリル／水 ３０／７０
従来のスプリッタ（図２０）を使用した場合、５分から１２分まで、ピークエンド時間が５０％以上変化した。
シリンジタイプポンプにはＭＰ６８０を用いて、０．５μｌ／ｍｉｎの流量設定で送液した。
溶離液条件：アセトニトリル／水 ５０／５０を用いて
従来のスプリッタ（図２０）を使用した場合、６．８分から７．６分まで５％以上の変化が見られた。
それに対して、図２１のように、本発明スプリッター６を取付け、キャピラリーカラム８をインジェクター３に直結し、分析したところ、カムタイプで５％、シリンジタイプで１％以下の変動率となり、大幅に再現性が向上した。
どのようなポンプを使用しても、本発明スプリットを利用することによって、流量再現性が向上され、低流量で分析する場合には、特に本発明スプリットが有効であることが判った。又、本発明スプリットは、従来のインジェクタなどに合せて簡単に取付けられ、且つ抵抗管を簡単に変えられる。
【００２２】
〔実施例２〕 溶離液：アセトニトリル／水 ５０／５０、ポンプＭＰ６８０、インジェクタ（レオダイン（登録商標）７５２０ ２μｌ内臓ループ）、分析カラム（モノキャップＣ１８ 内径１００μｍ×長さ１５０ｍ）、ＵＶ検出器（キャピラリセル）を基本構造として、本発明スプリッターの分離に対する効果を検討した。
試料： １．アセトフェノン０．５μｌ／ｍｌ、２．フェノール４ｍｇ／ｍｌ、３．安息香酸メチル２．５μｌ／ｍｌ、４．３−メチルインドール２．５ｍｇ／ｍｌ
検出波長：２５４ｎｍ
１０μｌ注入し、ループ計量注入をし、スプリット無しでポンプ流速５μｌ／ｍｉｎで分析した場合、クロマトグラム図１４のようにピークリーディングが生じた。接近した１，２ピークが不分離となった。
実施例１と同じように、本発明スプリットが組まれたカラムをインジェクタに直結し、抵抗管を内径５０μｍ×長さ１１ｍのフューズドシリカとし、ポンプ流速５μｌ／ｍｉｎ、スプリット比１／２０で分析した結果、図１５に示すクロマトグラムのような対称性の良いピークが得られた。対称性がよいため、接近したピークも分離した。
このように、微量試料分析に適した内径の細いカラムでは、負荷量が多くなるとピーク形状が変化し、分離も悪くなる。特に、微量成分分析が要求される生体試料などでは、成分数が多く高分離を行う必要がある。本発明スプリットを用いると、良いピーク形状が得られ、又、実施例１のように再現性も高くなる。
【００２３】
〔実施例３〕 実施例２のスプリットと同じ条件で、従来から行われている三方ジョイントを用いたスプリット方法（図４）と三方ジョイントを加工し、本発明の多重管とした（図１３）スプリッターによる違いを検討した。
ボリュームが０．５６６μｌの市販の三方ジョイントを用いて図４のカラム８にした。インジェクタより配管が可能なもっとも小さい内径０．０５ｍｍ、外径１／１６インチ、長さ３３ｍｍのパイプで接続した。
抵抗管、流速、実施例２のスプリットと同じものを使用した。
分析したところ、図１６に示されるクロマトグラムが得られ、テーリングが見られた。
本発明に於いては、管内部でスプリットが起こればよく、三方ジョイントを用いず、図１９のようにインジェクタ側のパイプを溶接などで固定したものでも可能である。よりインジェクタからの距離が短く出来るので、より微量で行う場合には有効となる。
オシネネジ６４の締付けにより、キャピラリーカラム８位置が簡単に変えられ、又抵抗管を交換できる構造が推奨される。
本発明のスプリッターで分析したところ、図１７に示されるシャープなクロマトグラムが得られた。
更に、本発明スプリッターに於いて、キャピラリーカラム８位置を奥に０．５ｍｍずらすことにより、インジェクタからのスプリット状態が変化し、ピークの高さを大きくすることができた（図１８）。スプリット比としては、大きな変化がなく、保持時間は同じで、キャピラリーカラム８に入る量を微妙に調整できる。逆に、手前にずらすと、小さくなり、負荷量を超えた場合の微調整に使用できる。図８のようにフィルター７３を入れることによっても同様の効果が得られた。
【００２４】
〔実施例４〕 ポンプＰＵ６１０、インジェクタ（レオダイン（登録商標）７１２５）、カラム（２５０ｍｍ×６ｍｍ）ｌ．Ｄ イナートシル（登録商標）ＯＤＳ−３を用いて、図３に於いて、カラム４の出口側に従来のスプリッタ（図２０）及び本スプリッタ（図２１）の２種のスプリットを取付けた。
溶離液として、５０ｍＭリン酸アンモニウム水溶液（ｐＨ２．５）を流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで流した。検出器として５１汎用タイプＲＩと５キャピラリー用ＵＶ７０２（ＵＶ２６０ｎｍ）を用いた。試料として、１．シトシン、２．果糖３．グアニン、４．アデニン、５．乳糖，６．酢酸の混合液を用いた。
カラム４の出口に内径０．５ｍｍ×長さ１０ｃｍのステンレスパイプ７を接続し、ＲＩ５１へは内径０．２５ｍｍ×長さ５０ｃｍのテフロンパイプ５２で接続した。ＵＶ５へは、内径０．１ｍｍ×長さ２ｍのフューズドシリカキャピラリーチューブ５３で接続した。
従来の三方ジョイントは、図２０となる。本発明では、図２１を使用し、カラムからのパイプ７を三方ジョイント６の分岐口６６の半分程度まで入れ、ＵＶへのフューズドシリカキャピラリーチューブ５３を中まで入れて多重管とした。
分析した結果、従来三方ジョイントではＲＩ５１側、図２２、ＵＶ５側、図２３のようになった。本発明では５１ＲＩ側、図２４、ＵＶ５側、図２５のようになった。
従来タイプ及び本発明品ともＲＩ５１側は、流速１．４９ｍｌ／ｍｉｎで流れているため、デッドボリューム影響は殆ど受けずに、シャープなピークが得られた（図２２、図２４）。流速が１０μｌ／ｍｉｎと遅いＵＶ５側では、従来タイプではデッドボリュームによるテーリングが見られた（図２３）。本発明スプリットでは、図２５のようにシャープなピークが得られた。
この例の他に、ＬＣ−ＭＳなどの検出器では、高流速を流せないため、スプリットして分岐する必要があり、本発明のスプリットを用いると、シャープなピークが得られる。各個体との接続は従来と同じように使用でき、性能アップを行うことが出来る。
【００２５】
〔実施例５〕 図２の配置で実施例１のシステムを用いて、図１１に応じたスプリット可変の多重管構造のスプリッタを構成し（図２６）接続した。三方ジョイント６はインジェクタ３側に接続するパイプ７を固定する固定部分６０１とカラム８を固定する固定部分６０２が構成され、突起８９を形成した外管８８が固定部分６０１と固定部分６０２間に設置されている。該固定部分６０１と同６０２とはシール６１０でシールされ、抵抗部９１の分岐口６９部分を変化させることが出来るように、左右にスライドして移動できるようになっている。本実施例では外管８８にネジを切り、手動で回転させることによって移動させる方法としたが、他の方法でも、例えば単なる嵌合でも可である。又、外部モータなどで自動で動かすことも出来る方法が推奨される。
実施条件は以下のようである。
インジェクタとして最も汎用的に使用される外径１／１６インチのパイプ７を外管として、長さはオシネネジ３３が締められる最短の長さ３３ｍｍとした。内径はカラム８の外径０．３７５ｍｍに合せて４ｍｍ内径とした。パイプ７とキャピラリーカラム８の先端は合せてインジェクタ３に接続した。
分析カラム：モノキャップＣ１８ 内径１００μｍ×長さ１５０ｍｍ
抵抗管９：内径５０μｍ×長さ７ｍのフューズドシリカチューブ
ポンプ流速：１０μｌ／ｍｉｎ
溶離液：８０％メタノール
検出器：ＵＶ２８０ｎｍ
試料：１．ベンゼン、２．トルエン、３．イソプロピルベンゼン、５．イソブチルベンゼン、６．ブチルベンゼン
とした。
外管８８の位置を調整し、パイプ７から流入液体流速の４０分の１がキャピラリーカラム８に導入されるようにした。クロマトグラム結果図２７に示すクロマトグラムが得られた。
外管８８の位置を変え、０−４ｍｉｎ間を１０分の１、４−８ｍｉｎ間を２０分の１、８−１２ｍｉｎ間を５０分の１になるように、分析中に順次変化させた結果図２８に示すクロマトグラムが得られた。成分容量が大きい区間の外部への排出抵抗を落とし、ピーク面積の小さな部分は排出を絞り込み、ピーク面積を変化させることが出来た（図２８）。
【００２６】
〔実施例６〕 図１２に応じた本発明装置（図２９）を使用した濃縮分析の例である。
１０％オクタデシルトリクロロシラントルエン溶液中で、還流しＯＤＳ化したガラスフィルター８６を用いて、樹脂パイプに窒素中で３００℃で溶融しながら嵌め込んだ。そこに、内径１００μｍ×長さ２５０ｍｍのフューズドシリカキャピラリーチューブに、イナートシル（登録商標）ＯＤＳ−３をメタノール溶媒にて３０Ｍｐａで充填したカラム８３を差込んだ。このカラム８３先端が分岐６９部分に抵抗管９の溶出オリフィスの真中に来るようにして、オシネフェラル６４で固定した。
次に、流入部７１から内径５０μｍ×長さ３３ｍｍのフューズドシリカチューブ７を流出部８１から挿通したカラム８のフィルター８４に当たるまで挿入し、オシネネジ３３によって接続固定した。同様にインジェクタ側に取付けた。
システム図３０として、ポンプ１（ＭＰ６８０）、インジェクタ３（レオダイン（登録商標）７５２０ ２μｌ内蔵ループ）、上記分析カラム８、ＵＶ検出器５（ＵＶ７０２キャピラリーセル）、波長２１０ｎｍとした。
抵抗管９として、内径５０μｍ×長さ１１ｍのフューズドシリカチューブを用いた。
第１初期液２として、０．１％ＴＦＡ水溶液、第２溶出液２１として０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液とした。
ポンプトータル流速２０μｌ／ｍｉｎ、スプリット比１／２０とした。
試料としてＢＳＡトリプシン消化物を用いた。
初期液１０分間一定で流し、１０分後溶出液７０％まで３０分間グラジエントを行った。グラジエントシステムを用いると、注入された時点では、初期液によってフィルター部分に濃縮される。フィルターのみでも効果はあるが、本実施例のようにＯＤＳ化したフィルターを用いれば、濃縮され、更に効果が上がる。
次に、溶出液に順次切り替わってゆくにつれ、フィルターより脱着され分析カラムに送られ、シャープなピークが得られる。このときにフィルター部分からの直接脱着になるため再現性よいスプリットが得られる。又、注入した試料成分はフィルターに直接当たるため、濃縮効果が得られ、感度アップする。ペプチドマッピングのクロマト例を図３１に示す。本発明スプリッターを用いることにより、シャープなピークが得られた。
【００２７】
【発明の効果】本発明の請求項１によれば、カラム等の外管と該外管を挿通可能に被う外管より成り、両管端部の重ね位置或は両管の径の差の選択により、液体の分岐量の調整を可能にしたので、外管のパイプと、その中に挿入する内管としてのカラムの二重管、更には多重管構造とし、その外管と内管の径の差を利用し、或は外管と内管の一端の重なり具合により、即ち一方の又は両方の移動による空隙部の形成具合により、流入される流体の分岐量を微調整することが可能になる。
【００２８】
又、請求項２によれば、インジェクタ部分に直結し、内径０．３ｍｍ以下のＨＰＬＣカラムの入口側スプリッターとしたので、流体試料の分岐量の大まかな調整を抵抗部の抵抗管で行い、流入部では両パイプの重ね位置或はパイプの径の差により、分岐量の微調整が簡単に出来る。
【００２９】
又、請求項３によれば、ＨＰＬＣカラム出口側に接続し、スプリッターとしたので、分離された成分を２種以上各検出器の分割して供給することが簡単に行える。
【００３０】
又、請求項４によれば、外管と内管の位置関係を一方又は両方の移動自在とすることにより可変としたので、分析中に外管と内管の位置関係を容易に変更でき、且つこの変更により、排出抵抗を変更でき、ピーク面積の変化をさせることができ、極めてシャープなピークのクロマトグラムを得ることが出来る。
【００３１】
又、請求項５によれば、外管と内管の位置を選択可能としたフィルターの厚みにより選択自在としたので、フィルターの厚みの自由な選択により、液体の分岐量の調整が出来る他、フィルターによる濃縮が出来，フィルターより脱着された液により、シャープなピーク形状のクロマトグラムが得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＰＬＣ分析装置の一実施例概略説明図
【図２】ＨＰＬＣ分析装置の一実施例概略説明図
【図３】ＨＰＬＣ分析装置の一実施例概略説明図
【図４】従来のスプリッターの説明図
【図５】本発明一実施例一部縦断説明図
【図６】従来のジョイントの説明図
【図７】本発明一実施例概略縦断説明図
【図８】本発明一実施例概略縦断説明図
【図９】本発明一実施例概略縦断説明図
【図１０】本発明一実施例概略縦断説明図
【図１１】本発明一実施例概略縦断説明図
【図１２】本発明一実施例概略縦断説明図
【図１３】本発明一実施例一部縦断説明図
【図１４】実施例１に於けるスプリット使用、不使用の対比クロマトグラム
【図１５】実施例１に於けるスプリット使用、不使用の対比クロマトグラム
【図１６】実施例３に於けるスプリット使用、不使用の対比クロマトグラム
【図１７】実施例３に於けるスプリット使用、不使用の対比クロマトグラム
【図１８】実施例３に於けるスプリット使用、不使用の対比クロマトグラム
【図１９】従来の三方ジョイントを用いたスプリット装置の一部縦断説明図
【図２０】実施例４に於いて使用の従来スプリッター一実施例一部縦断説明図
【図２１】実施例４に於いて使用の本発明一実施例一部縦断説明図
【図２２】従来のスプリッタ使用により得られたクロマトグラム
【図２３】従来のスプリッタ使用により得られたクロマトグラム
【図２４】本発明のスプリッタ使用により得られたクロマトグラム
【図２５】本発明のスプリッタ使用により得られたクロマトグラム
【図２６】本発明スプリッター一実施例一部縦断説明図
【図２７】図２６図示のスプリッター使用により得られたクロマトグラム
【図２８】図２６図示のスプリッター使用により得られたクロマトグラム
【図２９】本発明スプリッター一実施例一部縦断説明図
【図３０】本発明スプリッターを使用するシステム概略図
【図３１】図２９、図３０を使用して得られたクロマトグラム
【符号の説明】
１ ポンプ
２ 溶離液
３ インジェクタ
４ カラム
５ 検出器
６ スプリッター
７ パイプ
８ カラム
【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラフィーに於ける液体の分岐装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】液体クロマトグラフィーに於て、液体を分岐させる必要性としては、分析カラムに試料を導入する前にカラムの試料負荷量を超えないよう注入された成分を分岐する場合、又分岐された成分を２種以上の検出器で分析するため分岐する場合などがある。
【０００３】
これらの目的に応じ、アイソクラティック、グラジエント、ポストカラム等種々の方法に使用される各種のスプリッターが提供されている。
特に、バイオ関連分析に於いては、微量試料量しか分析に使用できず、内径の細いカラムの使用が不可欠となっている。０．１ｍｍ未満以下のカラムを用いる場合には、流量を０．１μｌ／ｍｉｎ以下の流速を正確に流す必要がある。現在の送液システムに於いては、分析装置、特にポンプ、スプリッター等の影響を受け、保持時間が大幅に変動してしまうことが起こる。
【０００４】
従来、三方ジョイントを利用して液体のスプリットが行われている。これを図６により説明する。６は三方ジョイント本体であって、Ｔ字状管に形成され、注入部７１、流出部８１、抵抗部９１より構成され、注入部７１、流出部８１、抵抗部９１に夫々流入管７、流出管８、抵抗管９を設けてある。
この場合、各接続部分に付けたパイプの液体の抵抗に応じて、スプリット量が制御されることになる。例えば流出管８、抵抗管９に同じ圧力の内径０．１ｍｍのパイプを取付を行えば、流入管７から入った液は抵抗比に応じて１：１にスプリットされることになる。
液体抵抗を変化させるためには、抵抗の異なるパイプを簡単に取外せるネジ方式が便利であり、パイプ固定を行うためには、オリフィス７２が設けられている。液体はオリフィス７２部分と三方ジョイント６の内部空間６６を通過してスプリットされる。
【０００５】
均一液体の単なるスプリットとしてはこれで充分であ。しかし、クロマトグラフィーに於いては、目的成分をバンドを広げず如何に次のパイプへ導入するのかが重要となる。従来のこの方法では、流入管７から目的成分は、この内部容量によって拡散されてから次のパイプへ導入されることになり、特に流量が１００μｌ／ｍｉｎ以下の場合には、実用上満足されるものではなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】この容量を減らすため、マイクロマシンニング技術を利用したスプリッタなども理論的には可能となるが、実際にはスプリッタとして高価になってしまい、実用的ではない。更に、ジョイント部分も同時に小さくなり、接続が複雑となり、抵抗管を自由に変更することは不可能となる。更に、内部で詰まりが生じた場合には洗浄できず、本体毎の変更になってしまう。従来からあるカラム、ポンプ、インジェクタへの接続も複雑となる。
又、微量試料分析に適した内径の細いカラムでは負荷量が多くなるとピーク形状が変化し、分離も悪くなる。特に微量成分分析が要求される生体試料などでは、成分数が多くなると、ピーク形状が変化し、分離成分も悪くなる。更に、ポンプ性能による流量再現性、保持時間の変動が大きく、再現性に難点がある。
【０００７】
クロマトグラフィーにおけるピーク幅は１０秒前後であり、拡散時間としては１０分の１である１秒以内に抑えることが必要となる。内部空間６６は、１μｌ程度であり、流出部４への流速が６０μｌ／ｍｉｎ以上の場合では、１秒間拡散することになるが、１０分の１以下になり、充分使用できる。この流速で使用できるＨＰＬＣカラムとしては、内径１ｍｍ以上のセミミクロカラムとなり、より細いキャピラリーカラムでは、数μｌ以下の流速となり、従来の方法での液体分離では実用上満足されるものではなかった。
【０００８】
【特許文献１】特表平１０−５０７５１６号
【０００９】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、スプリッターに要求される抵抗管の接続が簡単に出来、従来からあるカラム、ポンプ、インジェクタへの接続ができ、更にスプリット部分への容量を小さくするという難点が一挙に解決し、又、ポンプの種類によらず、流量再現性が向上でき、特に微少流量で分析する場合に有効な、且つ良いピーク形状が得られる構成簡単なスプリット方法及びスプリッターを提案せんとするもので、カラムと該カラムを挿通可能に被うパイプより成り、両パイプ端部の重ね位置或は両パイプの径の差の選択により、液体の分岐量の調整を可能にすることを特徴とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、図に示す実施例により、本発明を詳細に説明する。
従来より、ＨＰＬＣ分析装置は、ポンプ１により溶離液２が送られ、試料注入するインジェクタ３を介して、カラム４に送られ、検出器５で検出される構成に組まれている。生体試料を扱うバイオ関連分析や診断分析や検査分析などでは、微量試料量しか分析に使用できず、高感度検出が可能な内径が細いカラムの使用が必要となっている。特に、内径０．３ｍｍ以下のカラムは、キャピラリーＨＰＬＣカラムと云われており、微量分析には重要なＨＰＬＣカラムとなっている。キャピラリーＨＰＬＣカラムを用いる場合には、カラム流量を５μｌ／ｍｉｎ以下の流速を正確に流す必要がある。
【００１１】
現状の送液に於いては、分析環境の影響を受け、保持時間変動が１０％以上生じてしまう。正確な流量を流すためには、液体を分岐させる技術が重要となる。そのため、図１、図２のようにポンプ１で流された液を分岐するスプリッタ６が、ポンプ１とインジェクター３或はインジェクタ３とカラム４間に組まれることになる。
又、キャピラリーカラムに於いては、試料負荷量が小さく、多量成分で試料負荷量を超えなくするために、カラムに入る前のインジェクタとカラム間に分岐を設ける必要がある（図２）。又、分離された成分を２種以上の検出器５及び５１に分割する必要がある場合などがある（図３）。
【００１２】
ここで、流入管７、流出管８、抵抗管９について説明すると、流入管７はパイプを使用し、且つ流出管８との関係で、外管となるので、その用途、目的に応じて、パイプ、外管も７を使用する。流出管８については、キャピラリーカラム等の細管及びカラム又は内管を８とすることもある。抵抗管９についてはパイプとすることもある。
【００１３】
本発明では、三方ジョイント以上のジョイントを用いても効果を発揮する。
例えば、抵抗管９を取付ける抵抗部９１が４個ある六方ジョイントを用いてもよく、抵抗管９を４本取付ければ、三方ジョイントを用いた１本の抵抗管９より各抵抗管９の長さを短く出来、詰まり難くすることは出来る。
又、各接続に異なる内径の抵抗管９を取付ければ、外管が空隙部分６９を塞ぐ位置を調整でき、抵抗管９の内径の違いにより塞がれる部分が微妙に異なり、より細かい調整が可能となる。又、同一な畏敬の抵抗管９を取付け、更に外管に孔や溝を切れば、外管を回転されることにより、使用する抵抗管９を選択することも出来る。
先ず、インジェクタ３とカラム４間に三方ジョイント６を組み込んだ場合（図２）で説明する。
図５のように、インジェクタ３１にパイプ７をフェラル３２やオシネネジ３３を用いて接続し、次に、片方は三方ジョイント６１の内部空間６６の中途、分岐口６６０まで、パイプ７を差込み、フェラル６２やオシネネジ６３などで固定する。三方ジョイント６１片端に、カラムへの配管又はキャピラリーカラム８を、パイプ７を挿通してその先端まで差込み二重管としフェラル６５やオシネネジ６４などで固定する。もう片方の流出部９１に、液体分岐を行うための抵抗管９を同様に取付ける。
【００１４】
ポンプ１で送液された液体は、インジェクタ３１を通り、パイプ７先端部分７１で、二重管としたパイプ７，キャピラリーカラム８の抵抗に応じた分岐に応じ分配され、インジェクタ３１より注入された試料が同様に分岐される。このように内部空間６６で分割されるのでなく、パイプ７の入口で分割され、拡散なしにカラム８に導入される。
抵抗管９の接続部分や目的流速を必要とするパイプ７やキャピラリーカラム８へは同様の接続ができ、従来と同じように簡便に使用できる。又、外管であるパイプ７の接続に於いてもＨＰＬＣ配管として最も多く使用される外径１／１６インチ（１．５８ｍｍ）を用いることができ、接続も従来通り簡便に行うことができる。
パイプ７の内径が、内管８の外径より大きく、大きな隙間なく適合できるものであれば良く、例えばパイプ７が外径１／１６インチ（１．５８ｍｍ）で、内径０．５ｍｍの湾曲しないしっかりとした直管で、内管８は、外径０．３７５ｍｍのフューズドシリカチューブや、キャピラリーＨＰＬＣカラムが挿通できることになる。
【００１５】
この分岐の方法では、液体の抵抗に応じて分岐量が制御されることになる。例えば抵抗管９と内管８に同じ内径で同じ長さ、例えば０．１ｍｍ内径のパイプを取付ければ、パイプ７から入った液は、抵抗比に応じて１：１にスプリットされることになる。
そのため、抵抗管９により液体抵抗を変化させることで分岐割合を変化させることができる。抵抗の異なるパイプ９を簡単に取替えるためには、フェラル６７とオシネネジ６８のような形式で接続取外しが出来る方式が便利であり、三方ジョイントが使用される。全ての接続に於いて、フェラル３２，６２，６５，６７とオシネネジ３３，６３，６４，６８が各々一体となった手締めのコネクタも使用される。尚、ジョイントはオシネネジ、フェラルに限定されず、通常のＨＰＬＣに使用されるものであれば使用可能である。
【００１６】
本発明の多重管を用いた液体分岐の各様式を、分岐部における模式図７〜１２で説明する。
液体は流入部７１から導入され、抵抗部９１に取付けられる抵抗管９によって、低流量に分岐され、流出部８１のキャピラリーカラム８等により目的流速の液体で流出する。
又、本発明では三方ジョイント６の内部空間６６の分岐口６６０中間までパイプ７を挿通し、該パイプ７内にカラム等の出口側パイプ８が挿入された多重構造とし、流入部７１のオリフィス７２に於いて、出口側パイプ８間に空隙を構成し、その空隙利用により分岐量を定め、導入された液体は、流入部７１で分岐される構成を為すことも出来る。
【００１７】
三方ジョイント６への流体の導入に次の場合がある。
例えば、導入される流入部７１が、インジェクタ１などの固体の場合では、図７〜９のようにオリフィス７２を持つように構成する。又、パイプなどで接続する場合では、図１０〜１２のように張出したパイプ７によって導入される。
図７のように、インジェクタ３などに直結する場合には、抵抗部９１に付けられる抵抗管９により、分岐量の大まかな調整を行い、更に流入部７１で微調整ができる。流入部７１のオリフイス７２が内管８の外径に近い場合では、内管８の位置により、空隙７４での液体分岐を調整できる。例えば、カラム等の内管８をオリフィス７２近くに設置した場合には、抵抗部９１の抵抗に加えて、外管たるパイプ７と内管８間の間隙の狭小により空隙７４部分での抵抗が生じて、カラム等の内管８へ分岐される液量は多くなる。このようにカラム等の内管８と入口オリフィス７２によって流路分割の微調整も可能となる。カラム等の内管８は、流出部８１部分でフェラルなどで止められる構成とすれば、簡単に位置調整が可能となり、空隙量が所望に応じ、調整できる。
【００１８】
又、図８のようにパイプ７端にフィルター７３を入れ、内管のカラム８を該フィルター７３に押し当てることにより、フィルター７３の厚みがオリフィス７２との距離になるため、位置が固定され、再現性のよい液体分岐が可能となる。外管のパイプ７にフィルター７３を融着固定した交換できるカップフィルターをつける構成が推奨される。浮遊物の濾過も可能で詰まり防止の効果もある。
更に加えて、外管のパイプ７の位置により、分岐比率を変えることも可能である。図９のように外管のパイプ７の位置を抵抗部９１の空隙部分６９まで挿入することで、抵抗部９１のスプリット側流路が絞られ、空隙部分６９から分岐される液量を調整できる。例えば、完全に抵抗部９１部分まで挿入し、被せれば、抵抗部９１から流出される液体はなくなり、全量が内管のカラム８に導入されることになる。外管のパイプ７の固定位置調整で簡単に分岐量を変更できることになる。特に、内管のカラム８がＨＰＬＣカラムの場合では、内部空間６６が殆ど生じず、よりシャープなピークが得られ、分岐の微調整が簡単に出来ることになる。又、液体がオリフイス７２からの導入でない場合、例えば流入部７１にパイプ７に導入される場合も同じように分岐ができる。
【００１９】
図１０、図１１のようにキャピラリーカラム８はパイプ７の中に入れられる多重管構造とすることが出来る。抵抗部９１に付けられる抵抗管９には、空隙７４部分でキャピラリーカラム８に分岐される残余部分が流され、且つパイプ７とキャピラリーカラム８間の空隙と、パイプ７と抵抗部９１との空隙により形成される空隙６９より抵抗部９１へ流されることになる。空隙７４部分での分岐は、パイプ７の内径とキャピラリーカラム８の外径差と、その挿入重なり位置で調整することも可能である。更に、図９と同じように空隙６９部分によって分岐を調整できる。例えば、図１０ではパイプ７の位置の挿入位置で空隙６９が調整され、分岐調整が可能である。図１１では移動が可能な別のパイプ８５を三方ジョイント６に設置し、空隙６９部分を調整可能としたものである。この構成としては、パイプ８６をスプリッター６に出入り自在とすることにより、パイプ８先端の位置と抵抗部９１間の空隙部分６９が調整でき、該空隙部分６９の分岐調整が出来るものがある。
これらは、入口側パイプ７の内径より出口カラム８の外径が小さい場合やキャピラリーカラム８がモノリス構造などのフューズドシリカキャピラリーカラムでは、このようにできる。出口側のキャピラリーカラム８が、充填タイプカラムなどでは外径が太く、パイプ７の中に挿入が無理な場合もある。
【００２０】
図１２のようにパイプ７を、流入部７１又は流出部８１に、そこに挿通されるパイプ８６等に挿入或は保持されるフィルター８４に押し当てることにより、フィルター８４内部に試料が導入され、拡散のないシャープなピークが得られる。特に、フィルター８４自身に濃縮効果が得られるようにすれば、その効果は非常に高くなる（図１２）。又、パイプ８６を三方ジョイント６に出入り自在とすることにより、パイプ８６先端の位置と抵抗部９１間の空隙６９部分が調整でき、該空隙６９部分では分岐調整ができる。フィルター８４を充填カラム８に被せて接続することは推奨される。又、パイプ７を充填カラム８３に対応させ、又さらに充填カラム８３に被せたフィルター８４に押し当てる構成が使用できる。
【００２１】
【実施例】
〔実施例１〕 本実施例には図１３の装置を使用した実施例について説明する。
インジェクタ３として最も汎用的に使用される外径１／１６インチのパイプ７を外管として、長さはオシネネジ３３が締められる最短の長さ３３ｍｍとした。内径はキャピラリーカラム８の外径０．３７５ｍｍに合せて４ｍｍ内径とした。ジョイントを加工して分岐口６６０の中間まで差込んだ。流入部７１を平面に当て、キャピラリーカラム８を押し入れ、オシネネジ６４でキャピラリーカラム８を流出部８１に固定した。このように簡単に先端をそろえられる。次に、インジェクタ３の奥行きに合せてオシネネジ３３で固定した。
抵抗部に付けた抵抗管９は下記のものを使用した。
カムタイプポンプ：内径０．１ｍｍ×長さ７ｍのステンレス抵抗管、ポンプトータル流速１００μｌ／ｍｉｎスプリット比１／２００
シリンジポンプ：内径５０μｍ×長さ１１ｍのフューズドシリカ抵抗管、ポンプトータル流速１０μｌ／ｍｉｎスプリット比１／２０
図２に示す溶離液２，ポンプ１、インジェクタ（レオダイン（登録商標）７５２０ ２μｌ内臓ループ）３、分析カラム４、ＵＶ検出器（ＵＶ７０２キャピラリーセル）５を基本構成として，本発明スプリッタの効果を保持時間変動により検討した。
分析カラム：モノキャップＣ１８ 内径１００μｍ×長さ１５０ｍ
試料： １．アセトフェノン、２．フェノール、３．安息香酸メチル、４．３−メチルインドール
検出波長：２５４ｎｍ
実施例２のようにリーディングピークになるため、４番目の３−メチルインドールのピークエンドがベースに戻った時点の時間を測定し、変動率を計算した。
従来の通常最も使用されているカムタイプポンプと現在最も低流量精度が高いとされるシリンジタイプポンプで比較した。具体的には従来カムタイプにはＰＵ６１０を用いて、１μｌ／ｍｉｎの流量設定で送液した。
溶離液条件：アセトニトリル／水 ３０／７０
従来のスプリッタ（図２０）を使用した場合、５分から１２分まで、ピークエンド時間が５０％以上変化した。
シリンジタイプポンプにはＭＰ６８０を用いて、０．５μｌ／ｍｉｎの流量設定で送液した。
溶離液条件：アセトニトリル／水 ５０／５０を用いて
従来のスプリッタ（図２０）を使用した場合、６．８分から７．６分まで５％以上の変化が見られた。
それに対して、図２１のように、本発明スプリッター６を取付け、キャピラリーカラム８をインジェクター３に直結し、分析したところ、カムタイプで５％、シリンジタイプで１％以下の変動率となり、大幅に再現性が向上した。
どのようなポンプを使用しても、本発明スプリットを利用することによって、流量再現性が向上され、低流量で分析する場合には、特に本発明スプリットが有効であることが判った。又、本発明スプリットは、従来のインジェクタなどに合せて簡単に取付けられ、且つ抵抗管を簡単に変えられる。
【００２２】
〔実施例２〕 溶離液：アセトニトリル／水 ５０／５０、ポンプＭＰ６８０、インジェクタ（レオダイン（登録商標）７５２０ ２μｌ内臓ループ）、分析カラム（モノキャップＣ１８ 内径１００μｍ×長さ１５０ｍ）、ＵＶ検出器（キャピラリセル）を基本構造として、本発明スプリッターの分離に対する効果を検討した。
試料： １．アセトフェノン０．５μｌ／ｍｌ、２．フェノール４ｍｇ／ｍｌ、３．安息香酸メチル２．５μｌ／ｍｌ、４．３−メチルインドール２．５ｍｇ／ｍｌ
検出波長：２５４ｎｍ
１０μｌ注入し、ループ計量注入をし、スプリット無しでポンプ流速５μｌ／ｍｉｎで分析した場合、クロマトグラム図１４のようにピークリーディングが生じた。接近した１，２ピークが不分離となった。
実施例１と同じように、本発明スプリットが組まれたカラムをインジェクタに直結し、抵抗管を内径５０μｍ×長さ１１ｍのフューズドシリカとし、ポンプ流速５μｌ／ｍｉｎ、スプリット比１／２０で分析した結果、図１５に示すクロマトグラムのような対称性の良いピークが得られた。対称性がよいため、接近したピークも分離した。
このように、微量試料分析に適した内径の細いカラムでは、負荷量が多くなるとピーク形状が変化し、分離も悪くなる。特に、微量成分分析が要求される生体試料などでは、成分数が多く高分離を行う必要がある。本発明スプリットを用いると、良いピーク形状が得られ、又、実施例１のように再現性も高くなる。
【００２３】
〔実施例３〕 実施例２のスプリットと同じ条件で、従来から行われている三方ジョイントを用いたスプリット方法（図４）と三方ジョイントを加工し、本発明の多重管とした（図１３）スプリッターによる違いを検討した。
ボリュームが０．５６６μｌの市販の三方ジョイントを用いて図４のカラム８にした。インジェクタより配管が可能なもっとも小さい内径０．０５ｍｍ、外径１／１６インチ、長さ３３ｍｍのパイプで接続した。
抵抗管、流速、実施例２のスプリットと同じものを使用した。
分析したところ、図１６に示されるクロマトグラムが得られ、テーリングが見られた。
本発明に於いては、管内部でスプリットが起こればよく、三方ジョイントを用いず、図１９のようにインジェクタ側のパイプを溶接などで固定したものでも可能である。よりインジェクタからの距離が短く出来るので、より微量で行う場合には有効となる。
オシネネジ６４の締付けにより、キャピラリーカラム８位置が簡単に変えられ、又抵抗管を交換できる構造が推奨される。
本発明のスプリッターで分析したところ、図１７に示されるシャープなクロマトグラムが得られた。
更に、本発明スプリッターに於いて、キャピラリーカラム８位置を奥に０．５ｍｍずらすことにより、インジェクタからのスプリット状態が変化し、ピークの高さを大きくすることができた（図１８）。スプリット比としては、大きな変化がなく、保持時間は同じで、キャピラリーカラム８に入る量を微妙に調整できる。逆に、手前にずらすと、小さくなり、負荷量を超えた場合の微調整に使用できる。図８のようにフィルター７３を入れることによっても同様の効果が得られた。
【００２４】
〔実施例４〕 ポンプＰＵ６１０、インジェクタ（レオダイン（登録商標）７１２５）、カラム（２５０ｍｍ×６ｍｍ）ｌ．Ｄ イナートシル（登録商標）ＯＤＳ−３を用いて、図３に於いて、カラム４の出口側に従来のスプリッタ（図２０）及び本スプリッタ（図２１）の２種のスプリットを取付けた。
溶離液として、５０ｍＭリン酸アンモニウム水溶液（ｐＨ２．５）を流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで流した。検出器として５１汎用タイプＲＩと５キャピラリー用ＵＶ７０２（ＵＶ２６０ｎｍ）を用いた。試料として、１．シトシン、２．果糖３．グアニン、４．アデニン、５．乳糖，６．酢酸の混合液を用いた。
カラム４の出口に内径０．５ｍｍ×長さ１０ｃｍのステンレスパイプ７を接続し、ＲＩ５１へは内径０．２５ｍｍ×長さ５０ｃｍのテフロンパイプ５２で接続した。ＵＶ５へは、内径０．１ｍｍ×長さ２ｍのフューズドシリカキャピラリーチューブ５３で接続した。
従来の三方ジョイントは、図２０となる。本発明では、図２１を使用し、カラムからのパイプ７を三方ジョイント６の分岐口６６の半分程度まで入れ、ＵＶへのフューズドシリカキャピラリーチューブ５３を中まで入れて多重管とした。
分析した結果、従来三方ジョイントではＲＩ５１側、図２２、ＵＶ５側、図２３のようになった。本発明では５１ＲＩ側、図２４、ＵＶ５側、図２５のようになった。
従来タイプ及び本発明品ともＲＩ５１側は、流速１．４９ｍｌ／ｍｉｎで流れているため、デッドボリューム影響は殆ど受けずに、シャープなピークが得られた（図２２、図２４）。流速が１０μｌ／ｍｉｎと遅いＵＶ５側では、従来タイプではデッドボリュームによるテーリングが見られた（図２３）。本発明スプリットでは、図２５のようにシャープなピークが得られた。
この例の他に、ＬＣ−ＭＳなどの検出器では、高流速を流せないため、スプリットして分岐する必要があり、本発明のスプリットを用いると、シャープなピークが得られる。各個体との接続は従来と同じように使用でき、性能アップを行うことが出来る。
【００２５】
〔実施例５〕 図２の配置で実施例１のシステムを用いて、図１１に応じたスプリット可変の多重管構造のスプリッタを構成し（図２６）接続した。三方ジョイント６はインジェクタ３側に接続するパイプ７を固定する固定部分６０１とカラム８を固定する固定部分６０２が構成され、突起８９を形成した外管８８が固定部分６０１と固定部分６０２間に設置されている。該固定部分６０１と同６０２とはシール６１０でシールされ、抵抗部９１の分岐口６９部分を変化させることが出来るように、左右にスライドして移動できるようになっている。本実施例では外管８８にネジを切り、手動で回転させることによって移動させる方法としたが、他の方法でも、例えば単なる嵌合でも可である。又、外部モータなどで自動で動かすことも出来る方法が推奨される。
実施条件は以下のようである。
インジェクタとして最も汎用的に使用される外径１／１６インチのパイプ７を外管として、長さはオシネネジ３３が締められる最短の長さ３３ｍｍとした。内径はカラム８の外径０．３７５ｍｍに合せて４ｍｍ内径とした。パイプ７とキャピラリーカラム８の先端は合せてインジェクタ３に接続した。
分析カラム：モノキャップＣ１８ 内径１００μｍ×長さ１５０ｍｍ
抵抗管９：内径５０μｍ×長さ７ｍのフューズドシリカチューブ
ポンプ流速：１０μｌ／ｍｉｎ
溶離液：８０％メタノール
検出器：ＵＶ２８０ｎｍ
試料：１．ベンゼン、２．トルエン、３．イソプロピルベンゼン、５．イソブチルベンゼン、６．ブチルベンゼン
とした。
外管８８の位置を調整し、パイプ７から流入液体流速の４０分の１がキャピラリーカラム８に導入されるようにした。クロマトグラム結果図２７に示すクロマトグラムが得られた。
外管８８の位置を変え、０−４ｍｉｎ間を１０分の１、４−８ｍｉｎ間を２０分の１、８−１２ｍｉｎ間を５０分の１になるように、分析中に順次変化させた結果図２８に示すクロマトグラムが得られた。成分容量が大きい区間の外部への排出抵抗を落とし、ピーク面積の小さな部分は排出を絞り込み、ピーク面積を変化させることが出来た（図２８）。
【００２６】
〔実施例６〕 図１２に応じた本発明装置（図２９）を使用した濃縮分析の例である。
１０％オクタデシルトリクロロシラントルエン溶液中で、還流しＯＤＳ化したガラスフィルター８６を用いて、樹脂パイプに窒素中で３００℃で溶融しながら嵌め込んだ。そこに、内径１００μｍ×長さ２５０ｍｍのフューズドシリカキャピラリーチューブに、イナートシル（登録商標）ＯＤＳ−３をメタノール溶媒にて３０Ｍｐａで充填したカラム８３を差込んだ。このカラム８３先端が分岐６９部分に抵抗管９の溶出オリフィスの真中に来るようにして、オシネフェラル６４で固定した。
次に、流入部７１から内径５０μｍ×長さ３３ｍｍのフューズドシリカチューブ７を流出部８１から挿通したカラム８のフィルター８４に当たるまで挿入し、オシネネジ３３によって接続固定した。同様にインジェクタ側に取付けた。
システム図３０として、ポンプ１（ＭＰ６８０）、インジェクタ３（レオダイン（登録商標）７５２０ ２μｌ内蔵ループ）、上記分析カラム８、ＵＶ検出器５（ＵＶ７０２キャピラリーセル）、波長２１０ｎｍとした。
抵抗管９として、内径５０μｍ×長さ１１ｍのフューズドシリカチューブを用いた。
第１初期液２として、０．１％ＴＦＡ水溶液、第２溶出液２１として０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液とした。
ポンプトータル流速２０μｌ／ｍｉｎ、スプリット比１／２０とした。
試料としてＢＳＡトリプシン消化物を用いた。
初期液１０分間一定で流し、１０分後溶出液７０％まで３０分間グラジエントを行った。グラジエントシステムを用いると、注入された時点では、初期液によってフィルター部分に濃縮される。フィルターのみでも効果はあるが、本実施例のようにＯＤＳ化したフィルターを用いれば、濃縮され、更に効果が上がる。
次に、溶出液に順次切り替わってゆくにつれ、フィルターより脱着され分析カラムに送られ、シャープなピークが得られる。このときにフィルター部分からの直接脱着になるため再現性よいスプリットが得られる。又、注入した試料成分はフィルターに直接当たるため、濃縮効果が得られ、感度アップする。ペプチドマッピングのクロマト例を図３１に示す。本発明スプリッターを用いることにより、シャープなピークが得られた。
【００２７】
【発明の効果】本発明の請求項１によれば、カラム等の外管と該外管を挿通可能に被う外管より成り、両管端部の重ね位置或は両管の径の差の選択により、液体の分岐量の調整を可能にしたので、外管のパイプと、その中に挿入する内管としてのカラムの二重管、更には多重管構造とし、その外管と内管の径の差を利用し、或は外管と内管の一端の重なり具合により、即ち一方の又は両方の移動による空隙部の形成具合により、流入される流体の分岐量を微調整することが可能になる。
【００２８】
又、請求項２によれば、インジェクタ部分に直結し、内径０．３ｍｍ以下のＨＰＬＣカラムの入口側スプリッターとしたので、流体試料の分岐量の大まかな調整を抵抗部の抵抗管で行い、流入部では両パイプの重ね位置或はパイプの径の差により、分岐量の微調整が簡単に出来る。
【００２９】
又、請求項３によれば、ＨＰＬＣカラム出口側に接続し、スプリッターとしたので、分離された成分を２種以上各検出器の分割して供給することが簡単に行える。
【００３０】
又、請求項４によれば、外管と内管の位置関係を一方又は両方の移動自在とすることにより可変としたので、分析中に外管と内管の位置関係を容易に変更でき、且つこの変更により、排出抵抗を変更でき、ピーク面積の変化をさせることができ、極めてシャープなピークのクロマトグラムを得ることが出来る。
【００３１】
又、請求項５によれば、外管と内管の位置を選択可能としたフィルターの厚みにより選択自在としたので、フィルターの厚みの自由な選択により、液体の分岐量の調整が出来る他、フィルターによる濃縮が出来，フィルターより脱着された液により、シャープなピーク形状のクロマトグラムが得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＰＬＣ分析装置の一実施例概略説明図
【図２】ＨＰＬＣ分析装置の一実施例概略説明図
【図３】ＨＰＬＣ分析装置の一実施例概略説明図
【図４】従来のスプリッターの説明図
【図５】本発明一実施例一部縦断説明図
【図６】従来のジョイントの説明図
【図７】本発明一実施例概略縦断説明図
【図８】本発明一実施例概略縦断説明図
【図９】本発明一実施例概略縦断説明図
【図１０】本発明一実施例概略縦断説明図
【図１１】本発明一実施例概略縦断説明図
【図１２】本発明一実施例概略縦断説明図
【図１３】本発明一実施例一部縦断説明図
【図１４】実施例１に於けるスプリット使用、不使用の対比クロマトグラム
【図１５】実施例１に於けるスプリット使用、不使用の対比クロマトグラム
【図１６】実施例３に於けるスプリット使用、不使用の対比クロマトグラム
【図１７】実施例３に於けるスプリット使用、不使用の対比クロマトグラム
【図１８】実施例３に於けるスプリット使用、不使用の対比クロマトグラム
【図１９】従来の三方ジョイントを用いたスプリット装置の一部縦断説明図
【図２０】実施例４に於いて使用の従来スプリッター一実施例一部縦断説明図
【図２１】実施例４に於いて使用の本発明一実施例一部縦断説明図
【図２２】従来のスプリッタ使用により得られたクロマトグラム
【図２３】従来のスプリッタ使用により得られたクロマトグラム
【図２４】本発明のスプリッタ使用により得られたクロマトグラム
【図２５】本発明のスプリッタ使用により得られたクロマトグラム
【図２６】本発明スプリッター一実施例一部縦断説明図
【図２７】図２６図示のスプリッター使用により得られたクロマトグラム
【図２８】図２６図示のスプリッター使用により得られたクロマトグラム
【図２９】本発明スプリッター一実施例一部縦断説明図
【図３０】本発明スプリッターを使用するシステム概略図
【図３１】図２９、図３０を使用して得られたクロマトグラム
【符号の説明】
１ ポンプ
２ 溶離液
３ インジェクタ
４ カラム
５ 検出器
６ スプリッター
７ パイプ
８ カラム
Claims (5)
- カラム等の内管と該内管を挿通可能に被う外管より成り、両管端部の重ね位置或は両管の径の差の選択により、液体の分岐量の調整を可能にすることを特徴とする液体クロマトグラフィーに於ける液体の分岐装置。
- インジェクタ部分に直結し、内径０．３ｍｍ以下のＨＰＬＣカラムの入口側スプリッターとすることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の液体クロマトグラフィーに於ける液体の分岐装置。
- ＨＰＬＣカラム出口側に接続し、スプリッターとすることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の液体クロマトグラフィーに於ける液体の分岐装置。
- 外管と内管の位置関係を一方又は両方の移動自在とすることにより可変とすることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の液体クロマトグラフィーに於ける液体の分岐装置。
- 外管と内管の位置を選択可能としたフィルターの厚みにより選択自在としたことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の液体クロマトグラフィーに於ける液体の分岐装置。
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| JP2003098491A JP2004309135A (ja) | 2003-04-01 | 2003-04-01 | 液体クロマトグラフィーに於ける液体の分岐装置 |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010101630A (ja) * | 2008-10-21 | 2010-05-06 | Tosoh Corp | 微小流量送液装置、及び送液方法 |
| WO2016031008A1 (ja) * | 2014-08-28 | 2016-03-03 | 株式会社島津製作所 | 分析装置 |
| JP2020125912A (ja) * | 2019-02-01 | 2020-08-20 | 山善株式会社 | 分取液体クロマトグラフ方法、分取用液体クロマトグラフ装置及び分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラム |
-
2003
- 2003-04-01 JP JP2003098491A patent/JP2004309135A/ja active Pending
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