JP2005526712A - 多嚢胞性卵巣症候群を治療する方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、それに罹った対象にグルカゴン−様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）を投与することを含む多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）を治療する方法に関する。

Description

発明の詳細な説明

発明の分野
本発明は分泌学および薬理学に関する。さらに詳しくは、本発明は多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）に罹った対象を治療する方法および組成物に関する。

発明の背景
多嚢胞性卵巣病またはスタイン−リーヴェンサール症候群としても知られる多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）は、米国において推定婦人の６ないし１０％が罹っている。ＰＣＯＳは無排卵（不規則なまたは存在しない月経期間）およびアンドロゲン過剰症（上昇した血清テストステロンおよびアンドロステンジオン）によって特徴付けられる。この病気のさらなる病原性および臨床的兆候は異常子宮出血、拡大多小胞卵巣、不妊症、肥満症、インスリン抵抗性、高インスリン血症、高血圧、高脂血症、２−型真性糖尿病、過剰顔面毛髪成長、毛髪喪失および座瘡を含むことができる。

インスリン抵抗性および高インスリン血症はＰＣＯＳを持つ患者でかなり流行しており、この病気の病理生理学を基礎付けると考えられる（Udoff, L.ら, Curr. Opin.Obstret. Gynecol. 7:340-343 (1995); Barbieri, R.L., Am. J. Obstet. Gynecol. 183:1412-8 (2000); Kim, L.H.ら, Fertility and Sterility 73:1097-1098 (2000); Iuorno, M.J.ら, Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 28:153-164 (2001); Zacur, H.Z., Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 28:21-33 (2001)）。最近の研究は、ＰＣＯＳに関連するアンドロゲン過剰症は、高インスリン血症による、卵巣アンドロゲン生産（例えば、テストステロンおよびアンドロステンジオン）の増加および血清アンドロゲン−結合グロブリン濃度の減少によって引き起こされることを示唆している。インスリンは、少なくとも部分的には、卵巣被膜細胞におけるテストステロンの生産に関与する酵素であるＰ４５０ｃ１７の活性を増加させることによって、卵巣によるアンドロゲンの生産を直接的に刺激することが示されている（Iuorno, M.J.ら, 前掲）。下垂体軸のレベルにおいて、アンドロゲン過剰症は卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌を抑制し、性腺刺激ホルモン−放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の放出を変化させ、黄体ホルモン（ＬＨ）の分泌を増加させる。これらの異常は、卵巣に対するアンドロゲンの局所的効果と共に、卵胞退縮、無排卵および不妊症に導く。同様に、過少月経および無月経が起こり、ひどい膣出血となる。高インスリン血症は高血圧および増大した血餅形成に導きかねず、これは、心血管病、発作および２−型糖尿病の発症に関連付けられてきた（Iuorno, M.J.ら, 前掲；Zacur, H.A., 前掲）。

伝統的には、ＰＣＯＳに治療は、基本的兆候の修正に第一に向けられた。例えば、多毛症および月経の不規則性は、出産制御ピル、スピロノラクトン、フルタミドまたはフィナステリドを含めた抗アンドロゲン薬物で治療された。不妊症の治療は体重減少ダイエット、排卵薬物投与（例えば、クロミフェン、フォリスティムおよびゴナル−Ｆ）、いわゆる「卵巣ドリリング」外科手術、およびイン・ビトロ受精を含んだ。ＰＣＯＳに対するより最近の治療はインスリンレベルを降下させることを目標としている。メトフォルミン、Ｄ−キロ−イノシトール、ジアゾキシド、およびＰＰＡＲ−ガンマ阻害剤（例えば、トログリタゾン（Rezulin）、ロシグリタゾン（Avanbia）およびピオグリタゾン（Actos））のごときインスリン−感性化剤は受精能を回復させ、ＰＣＯＳに関連する内分泌異常を逆行させることが証明されている。メトフォルミンおよびＰＰＡＲ−ガンマ阻害剤は分娩には干渉しないが、それは、一般には、その安全性に対する関心および胎児に対する効果のため妊娠の間には断続される。さらに、妊娠したＰＣＯＳを持つ婦人は、３０％ないし５０％と高い率で最初のトリメスターの間に自然発生流産を経験する（Iuorno, M.J.ら, 前掲；Zacur, H.A., 前掲；Phipps, W.R., Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 28:165-182 (2001）。かくして、ＰＣＯＳを治療するための新しくてより良好な組成物および方法に対する要望が存在する。

発明の概要
出願人らはグルカゴン−様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）がインスリン抵抗性を降下させることができるか、あるいはインスリン感受性を増加させることができることを見出したことにより前記問題を解決した。本発明は、ＧＬＰ−１を用いてＰＣＯＳを治療する方法に関する。１つの具体例において、本発明の方法は、治療上有効量のＧＬＰ−１を患者に投与することを含む。もう１つの具体例において、該方法は、ＰＣＯＳに罹った対象においてインスリン抵抗性を低下させるかそれを予防することを含む。なおもう１つの具体例において、該方法は、ＰＣＯＳに罹った対象において２−型糖尿病の開始を予防することを含む。さらなる具体例において、該方法は、ＰＣＯＳに罹った対象において規則的な月経、排卵または受精能を回復させることを含む。

好ましい具体例においては、ＧＬＰ−１分子はＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２、ＧＬＰ−１（７−３７）およびエキセンジン−４よりなる群から選択される。もう１つの好ましい具体例においては対象はヒトである。

発明の詳細な記載
特に断りのない限り、本明細書中で用いる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の技量の者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。コンフリクトのある場合には、定義を含めた本出願が支配する。本明細書中で引用する全ての刊行物、特許および他の文献は引用してここに援用する。

本明細書中に記載するのと同様または同等の方法および材料は本発明を実施するにおいて用いることができるが、適当な方法および材料は以下に記載する。該材料、方法および実施例は例示的な目的のみのためであり、限定的なことを意図しない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な記載から、および請求の範囲から明らかであろう。

本出願を通じ、用語「を含む」または「含む」または「含んでいる」のごとき変形は、述べられた整数または整数の群を含むことを意味するが、いずれかの他の整数または整数の群を排除しないことは理解されるであろう。

本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義をここに掲げる。
本明細書中で用いる用語「脱毛症」とは、例えば、頭皮または皮膚の感染、神経症、またはＰＣＯＳのような特別な病気のため、毛髪の喪失を患者が経験する疾患をいう。毛髪は、斑点状に落ちるか、１つの領域において完全に脱毛となる代わりに毛髪の散漫な喪失であり得る。

本発明において用語「ＧＬＰ−１」「ＧＬＰ−１分子」「グルカゴン−様ペプチド」「グルカゴン−ペプチド−１分子」は、ＧＬＰ−１およびその生物学的に活性な変種、アナログ、ミメティックス、アゴニストおよび誘導体を含み、エキセンジン−４を含む。この文脈での「生物学的に活性な」はＧＬＰ−１（７−３６）アミド（ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２）の生物学的活性を有することを意味するが、変種、アナログ、ミメティック、アゴニストまたは誘導体の活性は天然のＧＬＰ−１（７−３６）アミドよりも能力が低いまたは高い可能性がある。ＧＬＰ−１のアゴニスト、アゴニストとして機能するＧＬＰ−１ミメティックスは、例えば、ＧＬＰ−１受容体を活性化するように特に設計された化合物を含む。

本明細書中で用いる「多毛症」は、患者が異常な毛髪を呈する疾患をいう。本明細書中で用いる用語「アンドロゲン過剰症」は、患者が血清中で上昇したレベルのアンドロゲン（例えば、テストステロン、アンドロステンジオン）を呈する疾患をいう。
本明細書中で用いる用語「高インスリン血症」は、患者が上昇した血漿インスリンレベルを呈する疾患をいう。本明細書中で用いる用語「高脂血症」は、血漿中のいずれかのまたは全ての脂質の上昇した濃度を患者が呈する疾患をいう。
本明細書中で用いる用語「高血圧」は、患者が終始高い血圧を経験する疾患をいう。（すなわち、１４０ｍｍＨｇと等しいかそれを超える収縮期圧力および９０ｍｍＨｇと等しいまたはそれを超える拡張期圧力）。

本明細書中で用いる用語「インスリノトロピック」はインスリンの循環系への放出を刺激する能力をいう。
本明細書中で用いる用語「インスリン抵抗性」は、与えられた濃度のインスリンに対する正常下生物学的応答を記載する（すなわち、インスリン応答下の細胞膜を横切るグルコース輸送の減少）。
本明細書中で用いる用語「医薬上許容される担体またはアジュバント」は、本発明の化合物と共に完全に投与することができ、かつその薬理学的活性を破壊しない非毒性の担体またはアジュバントをいう。

本明細書中で用いる用語「多嚢胞性卵巣症候群」、「ＰＣＯＳ」、「多嚢胞性卵巣病」または「スタイン−リーヴェンサール症候群」は、婦人を冒す病気をいう。ＰＣＯＳと診断された婦人は以下の兆候：無排卵（不規則なまたは存在しない月経期間）、アンドロゲン過剰症（上昇した血清テストステロンおよび／またはアンドロステンジオン）、異常子宮出血、拡大多小胞卵巣、不妊症、肥満症、インスリン抵抗性、高インスリン血症、高血圧、高脂血症、２−型真性糖尿病、過剰顔面毛髪成長、毛髪喪失および座瘡の１以上を呈し得る。用語「治療上または医薬上有効な」または「治療上または医薬上有効な量」とは、ＰＣＯＳの重症度、その兆候の、たとえばインスリン抵抗性、高インスリン血症、２−型真性糖尿病、肥満症、高血圧、高脂血症、無排卵または不規則な排卵、不妊症、アンドロゲン過剰症、多毛症、脱毛症、拡大多小胞卵巣および異常な子宮出血の）いずれかを低下させるか、または少なくするのに必要な本発明の化合物の量をいう。治療上または医薬上有効な量は、患者の臨床的兆候を改良するのに必要な量も意味する。

本明細書中で用いる用語「２−型真性糖尿病」はインスリン非依存性真性糖尿病（ＭＩＤＤＭ）、成人−開始真性糖尿病（ＡＯＤＭ）としても知られた病気を言い、ここに、患者は血糖レベルの上昇した濃度を有する。
本発明は、患者においてＰＣＯＳを治療する方法に関する。該方法は、治療上有効量のＧＬＰ−１を対象に投与することを含む。本発明の方法は、さらにＧＬＰ−１を用いてインスリン抵抗性を降下させることに関する。ＰＣＯＳに関連する兆候の多くは基礎となるインスリン抵抗性に由来する。

グルカゴン−様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）
ＧＬＰ−１は、血漿グルコースホメオスタシスの調節で鍵となる役割を演じる。それは、膵臓によるインスリン分泌の刺激およびグルカゴン放出の阻害、胃酸分泌および運動性の阻害、および食欲および食物摂取の抑制に関連している。ＧＬＰ−１は、食物の摂取に応答しての胃腸内分泌細胞から放出される分泌促進ホルモンのインクレチングループのメンバーである。ＧＬＰ−１は、膵臓のβ−細胞で発現されるＧＬＰ−１受容体に結合する。ＧＬＰ−１のその受容体への結合は細胞内シグナリング経路をトリガーし、その結果、グルカゴン生産の阻害と共にインスリン分泌の刺激がもたらされる。今度は、これは肝グルコース生産の阻害に導き、これは血中グルコースレベルを降下させる。血漿グルコース濃度を維持するにおけるＧＬＰ−１の役割は本発明以前によく確立されているが、ＧＬＰ−１がインスリン感受性を増加させることができるのは知られていなかった。

本明細書中で用いるごとく「ＧＬＰ−１分子」は以下の化合物を含む。哺乳動物ＧＬＰペプチドおよびグルカゴンは同一遺伝子によってコードされる。回腸においては、前駆体はプロセッシングされて、２つの主なクラスのＧＬＰペプチドホルモン、すなわち、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２となる。ＧＬＰ−１（１−３７）は配列：His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly（配列番号：１）を有する。ＧＬＰ−１（１−３７）は翻訳後にアミド化されて、ＧＬＰ−１（１−３６）ＮＨ_２となり、これは配列：His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg(NH₂)（配列番号：２）を有するか、あるいは酵素によりプロセッシングされてＧＬＰ−１（７−３７）となり、これは配列：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly（配列番号：３）を有する。ＧＬＰ−１（７−３７）もアミド化されて、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドとなり、これは配列：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg(NH₂)（配列番号：４）を有する。同様に、ＧＬＰ−１（１−３６）アミドはプロセッシングされてＧＬＰ−１（７−３６）アミドとなることができる。

腸Ｌ細胞は約１：５の比率でＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号：３）およびＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２（配列番号：４）を分泌する。ＧＬＰ−１のこれらの切形形態はイン・ビボでは短い半減期を有し（１０分未満）、アミドジペプチターゼ（ＤＰＰ ＩＶ）によって不活化されてＧＬＰ−１（９−３７）が生じ、これは配列番号：Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly（配列番号：５）を有し、またはＧＬＰ−１（９−３６）アミドが生じ、これは配列：Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg(NH₂)（配列番号：６）を有する。ペプチドＧＬＰ−１（９−３７）およびＧＬＰ−１（９−３６）アミドは肝グルコース生産に影響するが、見かけ上、それらは膵臓からのインスリンの生産または放出を刺激しない。

本明細書中で用いるごとく、用語「ＧＬＰ−１分子」はＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（１−３６）ＮＨ_２、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２（「ＧＬＰ−１（７−３６）アミド」）、ＧＬＰ−１（９−３７）、ＧＬＰ−１（９−３６）ＮＨ_２（「ＧＬＰ−１（９−３６）アミド」）を含む（集合的に、「ＧＬＰ−１ペプチド」という）。本発明は、組換えまたは合成を問わず、組換えヒトＧＬＰ−１ペプチドおよび他の種に由来するＧＬＰ−１ペプチドの使用を含む。

「ＧＬＰ−１分子」は、さらに、ＧＬＰ−１ペプチドの生物学的に活性な変種、アナログおよび誘導体を示す。この文脈において「生物学的に活性な」は、ＧＬＰ−１（７−３６）生物学的活性を有することを意味するが、該変種、アナログまたは誘導体は、天然のＧＬＰ−１の生物学的活性形態であるＧＬＰ−１（７−３６）アミドよりも活力が低いかまたは高いことが理解される。Goeke & Byrne, Diabetic Medicine. 13; 854 (1996)参照。また、本発明のＧＬＰ−１分子はＧＬＰ−１のアゴニストを発現するポリヌクレオチド（すなわち、とりわけ、インスリン−生産β−細胞に見出されるＧＬＰ−１受容体分子およびその二次メッセンジャー活性のアクチベーター）も含む。ＧＬＰ−１受容体のアゴニストでもあるＧＬＰ−１ミメティックスは、例えば、ＧＬＰ−１受容体を活性化するように特別に設計された化合物を含む。

ＧＬＰ−１分子には、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド受容体のごときＧＬＰ−１受容体に結合するか、あるいはそれを活性化するペプチド、ペプチドミメティックス、または他の分子であるかを問わずいずれかの分子、およびその二次メッセンジャーカスケードが含まれる。ＧＬＰ−１分子は、インスリノトロピック活性を有し、とりわけ、インスリン生産β−細胞に対するＧＬＰ−１受容体およびその二次メッセンジャー活性のアゴニスト（すなわち、それを活性化する）種を含む。

「ＧＬＰ−１分子」は、本明細書中に規定するごとく、ＧＬＰ−１変種を生物学的に活性化するポリヌクレオチドによってコードされるペプチドも含む。また、本発明には、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドと比較して、１以上のアミノ酸の置換、付加または欠失を含むペプチドであるＧＬＰ−１分子が含まれる。１つの具体例においては、置換、欠失または付加の数は３０アミノ酸以下、２５アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、１０アミノ酸以下、５アミノ酸以下、またはそれらの量の間のいずれかの整数である。本発明の１つの態様においては、置換は１以上の保存的置換を含む。「保存的」置換は、もう１つの生物学的に活性な同様の残基によるアミノ酸残基の置換を示す。保存的置換の例はもう１つのものに代えてのイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのごとき１つの疎水性残基の置換、またはリシンに代えてのアルギニン、アスパラギン酸に代えてのグルタミン、アスパラギンに代えてのグルタミンの置換のごとき、もう１つに代えての１つの極性残基の置換を含む。以下の表は例示的であるが限定的ではない保存的アミノ酸置換をリストする。

ＧＬＰ−１ペプチドの変種は、化学的に誘導体化された、または改変された前記ペプチド、例えば、非−天然アミノ酸残基（例えば、タウリン、β−およびγ−アミノ酸残基およびＤ−アミノ酸残基）、アミド、エステルのごときＣ−末端官能基の修飾、および例えば、アミノ酸ピログルタミン酸で見出されるごときアシル化アミン、シッフ塩基、または環化のようなＣ−末端ケトンの修飾およびＮ−末端官能基の修飾を持つペプチドを含む。

また、本発明には、（１）配列番号：１、２、３、４；および（２）その切形配列と５０％を超える配列同一性、好ましくは９０％を超える配列を有するペプチド配列が含まれる。本明細書中で用いるごとく、配列同一性は、当該分野でよく知られた標準的なアルゴリズムを用いて２つの分子の間でなされた比較をいう。本発明での配列同一性を計算するための好ましいアルゴリズムはSmith-Watermanアルゴリズムであり、ここに、配列番号：１［すなわちＧＬＰ−１（１−３７）］が、その長さにわたるホモログのパーセント同一性を規定するための参照配列として用いられる。マッチ、ミスマッチ、および挿入または欠失についてのパラメーター値の選択は任意であるが、いくつかのパラメーター値が他のものよりも生物学的に現実的な結果を生じることが見出されている。Smith-Watermanアルゴリズムに対するパラメーター値の１つの好ましい組が「maximum similarity segments」アプローチに記載されており、これは、マッチした残基および−ミスマッチ残基（残基は単一ヌクレオチドまたは単一アミノ酸いずれかである）に対して１の値を用いる。Waterman,Bull.Math,Biol.46; 473(1984)。挿入および欠失（indels）、ｘはｘ_ｋ＝１＋ｋとして重みづけされ、ここにｋは与えられた挿入または欠失における残基の数である。

Ｉｄ．
例えば、１８アミノ酸置換および３アミノ酸の挿入を除き、配列番号：１の３７−アミノ酸残基配列と同一である配列は：
［（１×３７マッチ）−（ ×１８ミスマッチ）−（１＋３／３ indels）］／３７＝７８％同一性によって与えられる％同一性を有するであろう。また、本発明の「ＧＬＰ−１分子」には、ＧＬＰ−１と相同なヒーラモンスター毒物における６つのペプチドが含まれる。それらの配列を表１中のＧＬＰ−１の配列と比較する。

ペプチド（ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｆおよびｇ）は位置１，７，１１および１８において相同である。ＧＬＰ−１およびエキセンジンは、さらに、１，４，５，６，８，９，１５，２２，２３，２５，２６および２９において相同である。位置２においては、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）およびＧ（Ｇｌｙ）は構造的に同様である。位置３においては、残基Ｄ（Ａｓｐ）およびＥ（Ｇｌｕ）は構造的に同様である。位置２２および２３においてＦ（Ｐｈｅ）およびＩ（Ｉｌｅ）は、各々、Ｙ（Ｔｙｒ）およびＬ（Ｌｅｕ）に対して構造的に同様である。同様に、位置２６において、ＬおよびＩは構造的に同様である。
かくして、ＧＬＰ−１の３０残基のうち、エキセンジン３および４は１５の位置において同一であり、５つのさらなる位置において同等である。主な構造的変化が明らかな位置は残基１６，１７，１９，２１，２４，２７，２８および３０におけるものである。また、エキセンジンはＣ−末端において９つの余分な残基を有する。

ＧＬＰ−１（７−３６）アミド受容体を介して活性を呈するグルカゴン様ペプチドのアゴニストが記載されている。EP 0708179 A2; Hjorthら, J. Biol. Chem. 269; 30121 (1994); Siegelら, Amer. Diabetes Assoc. 57th Scientific Session, Boston (1997); Hareterら, Amer. Diabetes Assoc. 57th Scientific Session, Boston (1997); Adelhorstら, J. Biol. Chem. 269, 6275 (1994); Deaconら, 16th International Diabetes Federation Congress Abstracts, Diabetologia Supplement (1997); Irwinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94; 7915 (1997); Mojsov, Int. J. Peptide Protein Res. 40; 333 (1992). Goeke & Byrne, Diabetic Medicine 13; 854 (1996). Recent publications disclose Black Widow GLP-1 and Ser² GLP-1. Holz & Hakner, Comp. Biochem. Physiol., Part B 121; 177 (1998)およびRitzelら, J. Endocrinol 159; 93 (1998)参照.

ＧＬＰ−１受容体は、例えば、インスリン−生産膵臓β−細胞に見出される細胞−表面蛋白質であり；ＧＬＰ−１（７−３６受容体）は当該分野で特徴づけされている。化学物質またはペプチドがＧＬＰ−１受容体に結合するかまたはそれを活性化するかを判断する方法は当業者に知られている。

ＧＬＰ−１分子の生物学的活性は、当業者によく知られているようにイン・ビトロおよびイン・ビボの動物モデルおよびヒトでの研究によって決定することができる。ＧＬＰ−１生物学的活性は、一般に、例えば、ＲＩＮｍＳＦ細胞またはＩＮＳ−１細胞のごときインスリノーマ細胞系で、その表面にＧＬＰ−１受容体を発現する適当な細胞を供することを含む、受容体結合活性スクリーニング手法によって標準的手法によって測定することができる。Mojsov, Int. J. Peptide Protein Res. 40; 333 (1992)およびEP0708179 A2参照。ＧＬＰ−１受容体を発現するように、作成された細胞を用いることもできる。ラジオイムノアッセイ方法を用いるトレーサーの膜への特異的結合を測定することに加え、ｃＡＭＰ活性またはグルコース依存的インスリン生産も測定することができる。１つの方法において、ＧＬＰ−１受容体をコードするポリヌクレオチドを用いて、細胞がＧＬＰ−１受容体蛋白質を発現するように該細胞をトランスフェクトする。かくして、例えば、そのような細胞をスクリーニングすべき化合物と接触させて、そのような化合物がシグナルを生じるか、（すなわち、受容体を活性化させるか）否かを測定することによって、これらの方法は、受容体アゴニストにつきスクリーニングするのに使用することができる。他のスクリーニング技術、受容体活性化によって引き起こされた細胞外ｐＨまたは変化を測定する系において、ＧＬＰ−１受容体を、例えばトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いることを含む。例えば、潜在的アゴニストは、ＧＬＰ−１蛋白質受容体および二次メッセンジャー応答（例えば、シグナル変換またはイオンもしくはｐＨの変化）と接触させることができ、該潜在的アゴニストは効果的であるか否かを決定するために測定することができる。

本明細書中で記載した方法で用いるために、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を利用して、ＧＬＰ−１−様ペプチドを検出し、精製し、同定することができる。ＡＢＧＡ１１７８のごとき抗体は完全にＧＬＰ−１（１−３７）またはＮ−末端−切形ＧＬＰ−１（７−３７）またはＧＬＰ−１（７−３６）アミドを検出する。他の抗体は、前駆体分子のＣ−末端の端部を検出し、これは減算によって、生物学的に活性な切形ペプチド、すなわちＧＬＰ−１（７−３７）アミドの量を計算することを可能とする。Orskovら, Diabetes 42; 658 (1993); Orskovら, J. Clin. Invest. 1991, 87; 415 (1991)。

本発明のＧＬＰ−１分子は、固体−状態化学ペプチド合成によって作成することができるペプチドである。そのようなペプチドは、例えば、Sambrook & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manualに記載された標準的な手法を用い慣用的に処方し作成することもできる。本明細書中で用いられる「組換え体」は、遺伝子が、本明細書中で記載されたＧＬＰ−１をコードするポリヌクレオチドを含むように遺伝子が抽出された組換え（例えば、微生物または哺乳動物）発現系に由来することを意味する。

本発明のＧＬＰ−１分子ペプチドは天然に精製された産物、または合成化学手法の産物であってもよく、または原核または真核宿主（例えば、培養中のまたはイン・ビボでの、細菌、酵母、高等植物、昆虫、または哺乳動物細胞）から組換え技術によって生産することもできる。組換え生産手法で使用する宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、一般に非−グリコシル化されているか、グリコシル化されていてもよい。

ＧＬＰ−１様ペプチドは、限定されるものではないが、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含めた方法によって組換え細胞培養から回収し、精製することができる。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は最終精製工程で使用することができる。
本発明の特に好ましいＧＬＰ−１分子はＧＬＰ−１（７−３６）アミド、ＧＬＰ−１（７−３７）、およびエキセンジン−４である。

ＧＬＰ−１の使用
本発明の方法および組成物はＰＣＯＳを治療するのに用いることができる。ＰＣＯＳに関連する兆候の多くは元となるインスリン抵抗性に由来する。ＰＣＯＳに関連する兆候はインスリン抵抗性、高インスリン血症、アンドロゲン過剰症、２−型真性糖尿病、不規則な月経、無排卵および不妊症を含む。従って、本発明は、ＧＬＰ−１を投与する工程を含むＰＣＯＳに罹った対象においてインスリン抵抗性を治療する方法を提供する。

インスリン抵抗性は、異常なプレ受容体（例えば、異常なリガンドまたは競合）、受容体（例えば、異常な構造、受容体に対するリガンドの親和性、または受容体の数）、またはポスト受容体（例えば、異常なシグナリング）事象を含めたいずれかの１以上の事象によるものであろう。インスリン抵抗性は当該分野で知られた多数の方法によって測定することができる。例えば、オイグリセミック高インスリン血症クランプ技術を用いてインスリン抵抗性を診断することができる（Rao, G., Am. Fam. Physician (2001) 63:1159-63）。この技術は、やはりグルコースを投与することによって、正常な範囲内の予め設定されてレベルにグルコースを同時に維持しつつ、インスリン用量を静脈内投与することを含む。平衡においては、インスリンのある用量の存在下における特定の組織によるグルコース摂取の量を計算することができる。インスリン抵抗性を検出するのに用いられる他の方法はインスリン抑制テスト、静脈内グルコース許容テスト、およびモデル評価を伴うグルコースの一定注入を含む（Rao, G., 前掲）。

もう１つの具体例において、本発明は、ＧＬＰ−１を投与する工程を含むＰＣＯＳに罹った対象において２−型真性糖尿病の開始を予防する方法を提供する。２−型真性糖尿病は、しばしば、インスリン抵抗性によって引き起こされた高インスリン血症の結果である。かくして、これらの患者におけるインスリン抵抗性の治療は、２−型真性糖尿病の発症を妨げるであろう。２−型真性糖尿病を診断する方法は当該分野でよく知られている。
さらにもう１つの具体例において、本発明は、ＧＬＰ−１を投与する工程を含むＰＣＯＳに罹った対象において規則的な月経を回復し、規則的な排卵を回復しおよび／または受精を回復する方法を提供する。ＰＣＯＳ患者は、しばしば、アンドロゲン過剰症を呈し、これは高インスリン血症によって引き起こされると考えられる。該アンドロゲン過剰症は卵胞退縮、無排卵および不妊症に導く。かくして、ＧＬＰ−１分子を投与することによるインスリン抵抗性の低下は高インスリン血症を軽減することができ、それにより、規則的な月経、排卵および／または受精を回復することができる。

もう１つの具体例において、本発明は、排卵を誘導する薬物（例えば、クロミフェン、フォリスティム、またはゴナル−Ｆ）と共にそれを必要とする患者にＧＬＰ−１を同時投与することを含むＰＣＯＳを治療する方法を提供する。
さらにもう１つの具体例において、本発明は、限定されるものではないが、出産制御ピルを含めた抗−アンドロゲン薬物（例えば、プロゲストゲンおよびエストロゲン）、スピロノラクトン、フルタミドおよびフィナステリドを含めた抗−アンドロゲン薬物と共にそれを必要とする患者にＧＬＰ−１を同時投与することを含むＰＣＯＳを治療する方法を提供する。

さらにもう１つの具体例において、本発明は、限定されるものではないが、メトフォルミン、Ｄ−キロ−イノシトール、ジアゾオキシド、およびＰＰＡＲ阻害剤（例えば、トリグリタゾン（Rezulin）、ロシグリタゾン（Avandia）およびピオグリタゾン（Actos））を含めたインスリン−感性化剤と共にそれを必要とする患者にＧＬＰ−１を同時投与することを含むＰＣＯＳを治療する方法を提供する。

もう１つの具体例において、本発明は、グルコースと共にＧＬＰ−１をそれを必要とする患者に同時投与することを含むＰＣＯＳを治療する方法を提供する。より好ましい具体例においては、グルコースは静脈内投与される。

本発明の化合物を前記した組合せ療法にて投与する場合、それらは順次にまたは同時に患者に投与することができる。別法として、本発明の医薬組成物は、ＧＬＰ−１分子および前記したもう１つの剤の組合せよりなることができる。
好ましい具体例においては、ＰＣＯＳに罹った対象は哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、齧歯類である。より好ましい具体例においては、ＰＣＯＳに罹った対象はヒトである。

医薬組成物
ＧＬＰ−１分子は、ヒトを含めた対象への投与のための医薬組成物に処方することができる。これらの医薬組成物は、好ましくは、ＰＣＯＳに罹った対象において、例えば、インスリン抵抗性を治療するのに、２−型真性糖尿病の開始を予防するのに、規則的な月経および／または排卵を回復し、不妊症を治療するのに効果的な量のＧＬＰ−１、および医薬上許容される担体を含む。

これらの医薬組成物で有用な医薬上許容される担体は、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのごとき血清蛋白質、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムのごとき緩衝液物質、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩のごとき塩または電解質、コロイド状シリカ、トリケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース−ベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックコポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛油を含む。

本発明の組成物は非経口、経口、吸入スプレー、局所、直腸、鼻孔、頬、膣内、移植容器を介して投与することができる。本明細書中で用いる用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、包膜内、肝内、病巣内および頭側内注射、または注入技術を含む。好ましくは、組成物は遅延放出処方の注入ポンプまたは皮下注射によって投与される。

本発明の組成物の滅菌注射形態は水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用い、当該分野で知られた技術に従って処方することができる。滅菌注射製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液であり得る。使用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌した不揮発性油が溶媒または懸濁化媒体として用いられる。この理由で、いずれかの温和な不揮発性油を用いることができ、これは合成モノ−またはジ−グリセリドを含む。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のごとき脂肪酸は、特にそのポリオキシエチル化バージョンにおいて、オリーブ油またはヒマシ油のごとき天然の医薬上許容される油のごとく、注射の製剤で有用である。これらの油溶液または懸濁液は、エマルジョンおよび懸濁液を含めた、医薬上許容される投与形態の処方で通常用いられるカルボキシメチルセルロースまたは同様な分散剤のような長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含むこともできる。医薬上許容される固体、液体または他の投与形態の製造で通常使用されるTween、Spanおよび他の乳化剤またはバイオアベイラビリティー増強剤のごとき他の通常に使用される界面活性剤も処方の目的で用いることができる。

非経口処方は単一のボーラス用量、注入または負荷ボーラス用量とすることができ、これは維持用量を伴う。これらの組成物は１日につき１回、または「必要」に応じて投与することができる。
本発明の医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液または溶液を含めたいずれかの経口的に許容される投与形態で経口投与することができる。経口用途の錠剤の場合には、通常に使用される担体はラクトースおよびコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムのごとき滑沢剤も典型的には添加される。カプセル形態の経口投与では、有用な希釈剤はラクトースおよび乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁液が経口用途で必要な場合、有効成分は乳化剤および懸濁化剤と組み合わせる。所望であれば、ある種の甘味剤、フレーバー剤または着色剤を添加することもできる。

別法として、本発明の医薬組成物は直腸投与のための座薬の形態で投与することができる。これらは、室温では固体であるが、直腸温度では液状であり、従って、直腸で融解して薬物を放出する適当な非刺激性賦形剤と当該剤とを混合することによって調製することができる。そのような物質はカカオバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールを含む。
本発明の医薬組成物は局所投与することもできる。局所投与は直腸座薬処方（前記参照）にて、または適当な浣腸処方で行うことができる。局所経皮パッチを用いることができる。

局所適用では、医薬組成物は、１以上の担体に懸濁または溶解させた有効成分を含む適当な軟膏に処方することができる。本発明の化合物の局所投与用の担体は鉱油、液状ペトロラタム、白色ペトロラタム、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水を含む。別法として、医薬組成物は、１以上の医薬上許容される担体に懸濁または溶解させた有効成分を含む適当なローションまたはクリームに処方することができる。適当な担体は、限定されるものではないが、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水を含む。

目で用いるには、医薬組成物は等張のｐＨ−調整滅菌生理食塩水中のミクロン化懸濁液として、または好ましくは、塩化ベンザルコニウムのごとき防腐剤を含む、または含まない等張のｐＨ−調整滅菌生理食塩水として処方することができる。別法として、目で用いるには、医薬組成物はペテロラタムのごとき軟膏に処方することができる。

本発明の医薬組成物は鼻孔エアロゾルまたは吸入によって投与することもできる。そのような組成物は医薬処方の分野でよく知られて技術に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の適当な防腐剤、バイオアベイラビリティーを増強させるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の慣用的可溶化剤または分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製することができる。

単一投与形態を得るための担体物質と組み合わせることができるＧＬＰ−１分子の量は、治療すべき宿主および特定の投与態様に応じて変化するであろう。組成物は、ＧＬＰ−１分子の０．１ないし１０００ピコモル／ｋｇ体重／分（注入により投与する場合）の間の用量がこれらの組成物を受容する患者に投与されるように処方することができる。本発明のいくつかの具体例においては、該用量は１ないし１０ピコモル／ｋｇ体重／分である（吸入により投与する場合）。好ましい具体例においては、該用量は静脈内注入によって投与する場合、０．５ないし２．０ピコモル／ｋｇ体重／分である。組成物は、単一用量、複数用量として、または注入で確立された期間の間にわたって投与することができる。

好ましい具体例において、ＧＬＰ−１は、確認された多嚢胞性卵巣症候群を持つ患者に投与される。もう１つの好ましい具体例においては、ＧＬＰ−１は１日少なくとも１回注射によってまたはポンプを介する連続的注入によって投与される。さらにもう１つの好ましい具体例においては、ＧＬＰ−１は、数日ないし数週間の期間にわたって皮下デポ剤から、経口投与により、または間歇的吸入による投与のために処方される。

いずれかの特定の患者についての具体的投与量および治療方法は、特定のＧＬＰ−１分子量、患者の年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、ならびに投与の時期、排出速度、薬物の組み合わせおよび治療すべき病気の重症度を含めた種々の因子に依存する。
医療従事者によるそのような因子の判断は当業者の通常の技量の範囲内である。また、ＣＬＰ−１分子の量は治療すべき個々の患者、処方のタイプ、使用する化合物の特徴、病気の重症度および望まれる効果に依存する。ＣＬＰ−１分子の量は当該分野でよく知られた薬理学的および薬物動態学的原理によって決定することができる。

本明細書中で記載した、本発明をより理解するために以下の実施例を掲げる。
これらの実施例は、説明目的のためだけであって、断じて本発明を限定するように解釈されるべきではないことは理解すべきである。

実施例
１．ＰＣＯＳ患者のＧＬＰ−１での治療
ＰＣＯＳを持つ患者は、もっぱら女性である。典型的には、閉経前婦人は、不規則な月経、不妊症、体毛の過剰な成長、座瘡および頭皮毛髪の喪失の病訴を持つ病気を呈する。閉経後婦人は、不規則な月経を除いてこれらの病訴の全てを有するであろう。肥満症、高血圧および糖尿病は通常はＰＣＯＳを伴う病気である。ＰＣＯＳの診断は、血清テストステロンのレベルおよび／または血清ＬＨ／ＦＳＨの比率を測定することによって確認される。血清テストステロンの上昇したレベル（＞６０ｎｇ／ｍｌ）または異常な血清ＬＨ／ＦＳＨ比率（＜２．５）はＰＣＯＳの指標である。

確認されたＰＣＯＳを持つ患者は、ＧＬＰ−１で治療される。ＧＬＰ−１は毎日の一回以上の注射によって、または定常的量の薬物を送達するポンプを介する連続的吸入によって投与される。別法として、ＧＬＰ−１は皮下デポ剤から、数日間ないし数週間に渡って、間欠的吸入または経口により投与用に処方される。

投与の形態にかかわらず、ＰＣＯＳを持つ患者の血液に送達されるＧＬＰ−１の合計量は７２０ないし２８７０ピコモル／ｋｇ／日の範囲である。これは、静脈内注入によって投与する場合、０．５ないし２．０ピコモル／ｋｇ／分と同等である。ＧＬＰ−１の効果は、限定されるものではないが、月経の正常化、受精の回復、過剰な体毛の喪失、座瘡の回復および毛髪喪失の停止を含めた呈する病訴の軽減または逆行を測定することによって確立される。限定されるものではないが血清テストステロンレベルおよびＬＨ／ＦＳＨ比率を含めたＧＬＰ−１効率の他のインジケーターを用いることができる。ＧＬＰ−１効率は、血清テストステロンレベルの減少およびＬＨ／ＦＳＨ比の増加によって決定される。

Claims (18)

1. ＧＬＰ−１分子を投与する工程を含むことを特徴とするＰＣＯＳに罹った対象を治療する方法であって、該対象がＰＣＯＳの少なくとも１つの兆候を呈することを特徴とする該方法。
2. 該兆候がインスリン抵抗性、高インスリン血症、２−型糖尿病、肥満症、高血圧、高脂血症、無排卵または不規則な排卵、不妊症、アンドロゲン過剰症、多毛症、脱毛症、座瘡、拡大多小胞卵巣、異常子宮出血、および自然発生流産よりなる群から選択される請求項１記載の方法。
3. ＧＬＰ−１分子を投与する工程を含むことを特徴とするＰＣＯＳに罹った対象においてインスリン抵抗性を低下させる方法。
4. ＧＬＰ−１分子を投与する工程を含むことを特徴とするＰＣＯＳに罹った対象において２−型糖尿病の開始を防止する方法。
5. ＧＬＰ−１分子を投与する工程を含むことを特徴とするＰＣＯＳに罹った対象において規則的な月経を回復する方法。
6. ＧＬＰ−１分子を投与する工程を含むことを特徴とするＰＣＯＳに罹った対象において規則的な排卵を回復する方法。
7. ＧＬＰ−１分子を投与する工程を含むことを特徴とするＰＣＯＳに罹った対象において受精能を回復する方法。
8. ＧＬＰ−１分子を投与する工程を含むことを特徴とするＰＣＯＳに罹った対象において自然発生流産を予防する方法。
9. 対象がヒトである請求項１ないし８いずれか１記載の方法。
10. 該ＧＬＰ−１分子がＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２、ＧＬＰ−４（７−３７）、およびエキセンジン−４よりなる群から選択される請求項１ないし８いずれか１記載の方法。
11. 該ＧＬＰ−１分子がＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２およびＧＬＰ−１（９−３６）ＮＨ_２よりなる群から選択される請求項１ないし８いずれか１記載の方法。
12. 該ＧＬＰ−１が、注入ポンプによって、または遅延放出処方の皮下注射によって投与される請求項１ないし８いずれか１記載の方法。
13. 該ＧＬＰ−１が排卵誘導薬物、抗−アンドロゲン薬物、インスリン−感性化剤およびグルコースよりなる群から選択される剤と共に投与される請求項１ないし８いずれか１記載の方法。
14. 該排卵誘導薬物がクロミフェン（clomiphene）、フォリスティム（follistim）およびゴナル−Ｆ（Gonal-F）よりなる群から選択される請求項１３記載の方法。
15. 該抗−アンドロゲン薬物が出産制御ピル、スピロノラクトン、フルタミドおよびフィナステリドよりなる群から選択される請求項１３記載の方法。
16. 該インスリン−感性化剤がメトフォルミン、Ｄ−キロ−イノシトール、ジアゾキシド、およびＰＰＡＲ阻害剤（例えば、トログリタゾン（レズリン（Rezulin））、ロシグリタゾン（アバンディア（Avandia））、およびピオグリタゾン（アクトス（Actos）））よりなる群から選択される請求項１３記載の方法。
17. 該グルコースが静脈内投与される請求項１３記載の方法。
18. 該ＧＬＰ−１および該剤が順次に、または同時に投与される請求項１３記載の方法。