JP2005102680A - ドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株。
【選択図】 なし
Description
さらに、特許文献4には、ドコサヘキサエン酸およびドコサペンタエン酸含有油脂を生産する能力を有するウルケニア属に属する微生物の培養物から該油脂を採取できることが記載されているが、上記と同様の問題点がある。
好ましくは、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属LFF1株(受託番号FERM BP−08568(FERM P−19159より移管))、該LFF1株と同一の種に属する菌株、または該LFF1株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株が提供される。
好ましくは、ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株が、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属LFF1株(受託番号FERM BP−08568(FERM P−19159より移管))、該LFF1株と同一の種に属する菌株、または該LFF1株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株である。
好ましくは、培養時のpHは8.0以上9.0以下である。好ましくは、培養時の種菌量は、培養培地1リットル当り80g以上、さらに好ましくは100g以上である。好ましくは、炭素源濃度が4%以上7%以下の培地で培養した後、炭素源濃度が13%以上20%以下の培地で引き続き培養する。
好ましくは、本発明の油脂は、油脂中に全脂肪酸あたりドコサヘキサエン酸を50重量%以上の量で含有する。
好ましくは、本発明の油脂は、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属LFF1株(受託番号FERM BP−08568(FERM P−19159より移管)、該LFF1株と同一の種に属する菌株、または該LFF1株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株を培地中で培養し、培養物からドコサヘキサエン酸含有油脂を採取することによって得られる油脂である。
好ましくは、本発明の油脂は、菌体培養によって油脂を製造する途中の培養液若しくはその殺菌した培養液、又は培養終了時の培養液若しくはその殺菌した培養液、又はそれぞれから集菌した培養菌体若しくはその乾燥物、またはその培養液若しくはその菌体から該油脂を採取した後の残渣に含まれるものである。
本発明のさらに別の側面によれば、上記したドコサヘキサエン酸含有油脂又はドコサヘキサエン酸に水素添加を行なうことを含む、ベヘン酸の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記したベヘン酸を含むベヘン酸銀を用いる、写真感光材料の製造方法が提供される。
(1)本発明の菌株
本発明の菌株は、ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株であれば何れの菌株でもよい。好ましくは、菌株の培養物中に含まれる油脂中に、全脂肪酸あたり、ドコサペンタエン酸を10重量%以下、及びドコサヘキサエン酸を30重量%以上の量で含有することを特徴とする菌株である。
上記した本発明のドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株を培地中で培養し、培養物からドコサヘキサエン酸含有油脂を採取することによって、ドコサヘキサエン酸含有油脂を製造することができる。
また、窒素源としては、酵母エキス、コーンスチープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素、又は酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素を使用することができる。無機塩としては、リン酸カリウム等を適宜組み合わせて使用できる。
培養期間は、例えば3〜7日間とすることができ、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養で培養を行なうことができる。
乾燥菌体100g当たりのドコサヘキサエン酸含有油脂の含有量は、10〜80g程度であり、培地1リットル当たりのドコサヘキサエン酸含有油脂の生産量は、0.4〜48g程度に達する。
ドコサヘキサエン酸含有油脂からドコサヘキサエン酸を分離するには、混合脂肪酸あるいは脂肪酸エステルの状態で、常法により、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法あるいは超臨界クロマトグラフィー法などにより濃縮採取することにより行うことができる
また、ドコサヘキサエン酸含有量の高い油脂は、ドコサヘキサエン酸含有油脂から鎖長の短い脂肪酸を遊離除去することにより製造することができる。この反応はエステラーゼ、リパーゼ等各種加水分解酵素を利用できるが、特にリパーゼで処理することによることが好ましく、更に好ましくは1,3位選択的リパーゼで処理することが好ましい。
上記(2)および(3)に記載した油脂およびドコサヘキサエン酸は、種々の飲食品、飼料、または餌料に添加して使用することができる。このような食品の例としては、例えば、栄養補助食品、乳幼児用または未熟児用調製乳、健康食品、機能性食品、幼児用食品、妊産婦用食品、および老人用食品などが挙げられる。飼料としては、豚および牛などの家畜用飼料、鶏などの家禽用飼料、犬又は猫用のペットフード、および養魚用の飼料などが挙げられる。餌料としては、例えば、魚貝類の養殖のために餌料として与える微小生物(いわゆる、動物プランクトン)のための餌料が挙げられる。特に、飼料および餌料用には、本発明の菌株の培養物、この培養物から集めた菌体、または油脂を採取した後の菌体の残渣を用いることが経済的に好ましい。
本明細書中上記したドコサヘキサエン酸含有油脂、ドコサヘキサエン酸含有油脂、又はドコサヘキサエン酸に水素添加を行なうことによってベヘン酸を製造することができる。原料として油脂を用いる場合には、水素添加後に加水分解を行なうことによりベヘン酸を製造することができる。
写真感光材料を製造の具体的手法は当業者に既知であり、例えば、特開2002−341484号公報、特開2002−328444号公報、特開2002−318431号公報、特開2002−311533号公報、特開2002−311531号公報などに記載されている。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
LFF1株は瀬戸内海から採取された菌株である。LFF1株は適当な寒天培地(3%グルコース、0.5%酵母エキス、0.5%ペプトン、2%人工海水を含む2%寒天培地)において,直径10〜20μmの球状の細胞から伸長した外質ネットを観察することができ、クロミスタ界(Kingdom Chromista)ラビリンチュラ綱(Class Labyrinthulea)ヤブレツボカビ科(Family Thraustochytriaceae)に属することが認められた。また、栄養細胞は運動性を示さず、細胞質分裂を伴わない核分裂を繰り返して多核状態となった後、遊走子を形成して、これを細胞外に放出した。このような生活史はトラウストキトリウム属(Genera Thraustochytrium)に特徴的である(Olive, L.S., The Mycetozoans. Academic Press, New York, USA,1975; 本多大輔, ラビリンチュラ類の系統と分類. 海洋と生物 23:7-18, 2001)。
ジェーファーメンターを用いて以下の条件でLFF1株を培養し、油脂を製造した。また、製造した油脂をガスクロマトグラフィにより組成分析した。
(1)培養条件
3Lファーメンタ使用
培養量:1.8Lカルチャー
培地組成
10% グルコース
3.3%酵母エキス
50% 人工海水
0.1% 消泡剤
0.2% 酢酸アンモニウム
0.2% リン酸二水素カリウム
出現したコロニーを冷蔵保存した。
アガロース培地
3% グルコース
1% 酵母エキス
50%人工海水
0.2%酢酸アンモニウム
0.2%リン酸二水素カリウム
1.5%アガロース
菌体の抽出は、クロロホルム:メタノール=2:1を湿潤重量の10倍量、ガラスビーズを等倍量加え、高速掻き混ぜ機で水冷下攪拌した。濾過で粉砕菌体を分離し、等量の飽和食塩水で2回抽出洗浄を行なった後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗精製オイルは、エバポレーターで溶媒を除去し、重量を測定した。
オイルをクロロホルムで溶解し、10%KOH(aq):エタノール=1:1を加え、95℃で2時間加水分解した。2NのHClで中和後、エーテルで抽出しTMSジアゾメタンを加え室温で2時間エステル化反応を行い、最後に酢酸を加えて反応を終了した。この反応液をガスクロマトグラフで解析した。ガスクロマトグラフのチャートを図1に示す。
・カラム:DB−17 0.25mm×30m
・キャリアーガス:He入口圧 250kPa
・カラム温度:100℃→250℃(昇温速度:10℃/分)
・検出:FID
培養時間:40時間
乾燥菌体重量:24.0g/Lカルチャー
全油脂量:5.95g/Lカルチャー
油脂含有率:24.8%(全油脂量/乾燥菌体重量)
DHA量:3.50g/Lカルチャー
C22脂質:3.69g/Lカルチャー
C15:0 1.8%
C16:0 18.8%
C17:0 9.7%
C20:5(EPA) 2.2%
C22:5(DPA) 3.2%
C22:6(DHA)58.8%
実施例2で生産し抽出した全油脂分であるラビリンチュラオイル抽出物10gを安定化Ni触媒0.05gを触媒とし、エタノール100mL中でオートクレーブを用い150℃で2Mpaで5時間反応させた。反応後、室温まで冷却しクロロホルム100mLを加え生成物を溶解した後、この溶液からNi触媒をセライト濾過により除き、溶媒を減圧下流去した。
LFF1株より抽出した脂質0.2gに0.05M(pH7.0)リン酸緩衝液4.0ml及び10%アラビアゴム溶液1.0mlを加え、ハイフレックスホモジナイザーで15000rpm、4分間処理して乳化させる。500μlずつ分注した後50U/100μlのRhizopus oryzae(アマノリパーゼF-AP15)を加え、37℃で振とうする。所定時間後エーテル1.0mlを添加して反応を停止し、脂質混合物をエーテルで抽出する。これにTMSジアゾメタン(東京化成)を加え室温で2時間エステル化反応を行い、最後に酢酸を加えて反応を終了した。この反応液をガスクロマトグラフ(島津GC-2010、DB-17キャピラリーカラム)で解析した。ガスクロマトグラフ上で遊離した脂肪酸メチルエステルが検出された。表1に抽出脂質の脂肪酸組成を示す。油脂はC16成分とC22成分で組成の90%以上を占める。また、反応初期から2時間後まで遊離脂肪酸に占めるC16(パルミチン酸)とドコサヘキサエン酸の比を図2に示す。
ジェーファーメンターを用いて、実施例2と同様の条件でLFF1株を培養し、油脂を製造した。但し、培養(40時間、通気下500rpmでの攪拌培養)は、pHを4.5、7.5、又は8.0に制御して行った。また、製造した油脂を、実施例2と同様にガスクロマトグラフィにより組成分析した。
ジェーファーメンターを用いて以下の条件でLFF1株を培養し、油脂を製造した。また、製造した油脂をガスクロマトグラフィにより組成分析した。
(1)培養条件
3Lファーメンタ使用
培養量:1.5Lカルチャー
培地組成
15% グルコース
3.3%酵母エキス
50% 人工海水
0.1% 消泡剤
0.2% 酢酸アンモニウム
0.2% リン酸二水素カリウム
出現したコロニーを冷蔵保存した。
アガロース培地
3% グルコース
1% 酵母エキス
50%人工海水
0.2%酢酸アンモニウム
0.2%リン酸二水素カリウム
1.5%アガロース
菌体の抽出は、クロロホルム:メタノール=2:1を湿潤重量の10倍量、ガラスビーズを等倍量加え、高速掻き混ぜ機で水冷下攪拌した。濾過で粉砕菌体を分離し、等量の飽和食塩水で2回抽出洗浄を行なった後、硫酸ナトリウムで乾燥
させた。粗精製オイルは、エバポレーターで溶媒を除去し、重量を測定した。
オイルをクロロホルムで溶解し、10%KOH(aq):エタノール=1:1を加え、95℃で2時間加水分解した。2NのHClで中和後、エーテルで抽出しTMSジアゾメタンを加え室温で2時間エステル化反応を行い、最後に酢酸を加えて反応を終了した。この反応液をガスクロマトグラフで解析した。
・カラム:DB−17 0.25mm×30m
・キャリアーガス:He入口圧 250kPa
・カラム温度:100℃→250℃(昇温速度:10℃/分)
・検出:FID
ジェーファーメンターを用いて以下の条件でLFF1株を培養し、油脂を製造した。また、製造した油脂をガスクロマトグラフィにより組成分析した。
(1)培養条件
3Lファーメンタ使用
培養量:1.5Lカルチャー
6% グルコース
3.3%酵母エキス
50% 人工海水
0.1% 消泡剤
0.2% 酢酸アンモニウム
0.2% リン酸二水素カリウム
培地組成2
15% グルコース
3.3%酵母エキス
50% 人工海水
0.1% 消泡剤
0.2% 酢酸アンモニウム
0.2% リン酸二水素カリウム
出現したコロニーを冷蔵保存した。
アガロース培地
3% グルコース
1% 酵母エキス
50%人工海水
0.2%酢酸アンモニウム
0.2%リン酸二水素カリウム
1.5%アガロース
菌体の抽出は、クロロホルム:メタノール=2:1を湿潤重量の10倍量、ガラスビーズを等倍量加え、高速掻き混ぜ機で水冷下攪拌した。濾過で粉砕菌体を分離し、等量の飽和食塩水で2回抽出洗浄を行なった後、硫酸ナトリウムで乾燥
させた。粗精製オイルは、エバポレーターで溶媒を除去し、重量を測定した。
オイルをクロロホルムで溶解し、10%KOH(aq):エタノール=1:1を加え、95℃で2時間加水分解した。2NのHClで中和後、エーテルで抽出しTMSジアゾメタンを加え室温で2時間エステル化反応を行い、最後に酢酸を加えて反応を終了した。この反応液をガスクロマトグラフで解析した。
・カラム:DB−17 0.25mm×30m
・キャリアーガス:He入口圧 250kPa
・カラム温度:100℃→250℃(昇温速度:10℃/分)
・検出:FID
Claims (18)
- ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株。
- スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属LFF1株(受託番号FERM BP−08568(FERM P−19159より移管))、該LFF1株と同一の種に属する菌株、または該LFF1株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株。
- ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株を培地中で培養し、培養物からドコサヘキサエン酸含有油脂を採取することを含む、ドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法。
- ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株が、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属LFF1株(受託番号FERM BP−08568(FERM P−19159より移管))、該LFF1株と同一の種に属する菌株、または該LFF1株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株である、請求項3に記載のドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法。
- 培養時のpHが8.0以上9.0以下である、請求項3又は4に記載のドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法。
- 培養時の種菌量が培養培地1リットル当り80g以上である、請求項3から5の何れかに記載のドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法。
- 培養時の種菌量が培養培地1リットル当り100g以上である、請求項6に記載のドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法。
- 炭素源濃度が4%以上7%以下の培地で培養した後、炭素源濃度が13%以上20%以下の培地で引き続き培養する、請求項3から7の何れかに記載のドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法。
- 油脂中に全脂肪酸あたり、ドコサペンタエン酸を10重量%以下、及びドコサヘキサエン酸を30重量%以上の量で含有する、ドコサヘキサエン酸含有油脂。
- 油脂中に全脂肪酸あたりドコサヘキサエン酸を50重量%以上の量で含有する、請求項9に記載の油脂。
- ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株を培地中で培養し、培養物からドコサヘキサエン酸含有油脂を採取することによって得られる油脂である、請求項9又は10に記載の油脂。
- スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属LFF1株(受託番号FERM BP−08568(FERM P−19159より移管))、該LFF1株と同一の種に属する菌株、または該LFF1株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株を培地中で培養し、培養物からドコサヘキサエン酸含有油脂を採取することによって得られる油脂である、請求項9から11の何れかに記載の油脂。
- 菌株の培養物から採取することによって得られる油脂を精製することによって得られる油脂である、請求項9から12の何れかに記載の油脂。
- 油脂が、菌体培養によって油脂を製造する途中の培養液若しくはその殺菌した培養液、又は培養終了時の培養液若しくはその殺菌した培養液、又はそれぞれから集菌した培養菌体若しくはその乾燥物、またはその培養液若しくはその菌体から該油脂を採取した後の残渣に含まれるものである、請求項9から13の何れかに記載の油脂。
- 請求項3から8の何れかに記載の製造方法により得られるドコサヘキサエン酸含有油脂又は請求項9から14の何れかに記載のドコサヘキサエン酸含有油脂から、ドコサヘキサエン酸を単離することを含む、ドコサヘキサエン酸の製造方法。
- ドコサヘキサエン酸含有油脂をリパーゼで処理した後に、ドコサヘキサエン酸を単離する、請求項15に記載のドコサヘキサエン酸の製造方法。
- 請求項3から8の何れかに記載の製造方法により得られるドコサヘキサエン酸含有油脂、請求項9から14の何れかに記載のドコサヘキサエン酸含有油脂、又は請求項15又は16に記載の方法により得られるドコサヘキサエン酸に水素添加を行なうことを含む、ベヘン酸の製造方法。
- 請求項17に記載のベヘン酸を含むベヘン酸銀を用いる、写真感光材料の製造方法。
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