JP2002521503A - 生体親和性ポリマー、その調製方法およびそれを含む組成物 - Google Patents
生体親和性ポリマー、その調製方法およびそれを含む組成物Info
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Abstract
Description
に関する。
よびカルボキシメチル−ベンジルアミド−スルホン酸塩の残基が置換して得られ
たデキストランから誘導されるポリマーが知られている。これらのポリマーの調
製方法およびそれらの特性は、フランス国特許第2461724号ならびに米国
特許第4740590に記述されている。これらのポリマーの内のいくつかはヘ
パリン様特性を示し、またそれらの抗凝固性と抗補体性のために血漿の代用品と
して使用することができる。その他のものは、FGF族の成長因子のin vi
troでの生物学的活性の安定化、保護および相乗作用より成る特性であって、
ヘパリンとは異なるものを示す(Tardieu等、細胞生理学ジャーナル、1992
年、150、194〜203ページ)。
と指定されるデキストランのカルボメチル−ベンジルアミド−スルホン酸塩誘導
体単独の、またはFGFsと結合されたものの使用を記述している。
18026号において、消化器、神経系、筋組織それぞれの病変部の治療薬とし
て、腺維芽細胞またはFGFの成長因子、および交換成長因子−β(TGFβ)
など、ヘパリンと親和性のある成長因子を保護し、安定化し、および相乗作用を
発揮することのできるポリマーの使用が提案された。このCMDBSデキストラ
ン誘導体の保護効果を説明するため、これらの特許はFGF1、FGF2または
TGFβのトリプシンによるタンパク質分解消化の結果を報告している。ヘパリ
ンと親和性のある成長因子のこれらの保護、安定化および相乗作用の特性は、筋
、神経組織および消化器の、瘢痕形成および修復活性を持ち、且つ投与の用量に
おいて抗凝固活性のない、“ヘパリン結合成長因子保護体と増強体”としてHB
GFPPと指定される新しいクラスのポリマーの特徴付けを可能にした。
号は、炎症の治療薬としてのこれらのポリマーの利用を提案している。この抗炎
活性は、白血球エラスターゼまたはプラスミンとして炎症反応に関係するタンパ
ク質分解酵素のin vitroで、およびCMDBSデキストラン誘導体によ
り処置される組織内で、低い炎症性細胞反応を示す組織学的研究によるin v
ivoでの抑制活性により説明される。
ンジルアミンなど、その有害な影響について知られる残基を塩析するリスクのあ
る化合物である。
の修復及び瘢痕化に限定される。
にも、特にいくつかのタイプの器官、組織または特定の細胞に限定されない非常
に広範な治療上の適用を可能にするといった新規な特性を有する生体親和性ポリ
マーを提供することにより、これらの課題を解決することを目的とする。
に“RGTA”とも指定する。
I)で表される同一または異なるモチーフ(motifs)原子の連鎖で構成さ
れる生体親和性ポリマーである: AaXxYy ここで、 −Aは、単量体を表し、 −Xは、単量体Aに結合し、且つ以下の構造式に対応するカルボキシル基を 表す:R−COO−R’ ここで、Rは、場合により分岐しているか、または不飽和で、且つベン ジルアミンとスルホン酸ベンジルアミンを除いて1個または複数の芳香 族環を有している脂肪族炭化水素結合あるいは鎖を表し、また、R’は水 素原子または陽イオンを表し、 −Yは、単量体Aに結合し、且つ以下の構造式のうちの一つに対応するサル フェート基またはスルホネート基を表す: −R−O−SO3−R’、 −R−N−SO3−R’、 −R−SO3−R’、 ここで、Rは、場合により分岐しているか、または不飽和で、且つベン ジルアミンとスルホン酸ベンジルアミンを除いて1個または複数の芳香 族環を有している脂肪族炭化水素結合あるいは鎖を表し、また、R’は水 素原子または陽イオンを表し、 −aは、式(I)のポリマーの質量が約5000ダルトンより大きくなるよ うな単量体Aの数を表し、 −xは、単量体A全体のX基による置換率を表すが、これは約20と150 %の間の値、好ましくは50%程度であり、 −yは、単量体A全体のY基による置換率を表すが、これは約30と150 %の間の値、好ましくは100%程度である。
アルキル、アリル、アリール基の中から選択されるものであることが好ましい。
の各単量体Aが統計的に1個のX基を含有していることを意味する。同じく、y
が100%置換率とは、本発明のポリマーの各単量体が統計的に1個のY基を含
有していることを意味する。100%を超える置換率は、各単量体が考慮する種
類の基を統計的に1個より多く含有していることを示し、逆に、100%より少
ない置換率は、各単量体が考慮する種類の基を統計的に1個より少なくしか含有
していないことを示す。
き利点を有し、このことから、ヘパリナーゼまたはヘパリチナーゼにより自然に
且つ急速に分解される生成物である硫酸ヘパランとは異なる。さらに、本発明の
ポリマーはベンジルアミン基を有するCMDBSと異なり、有害な生成物を含有
することも、放出することもない。
もよく、例えばHBGFPPについて提案されている糖類、エステル類、アルコ
ール類、アミノ酸類、ヌクレオチド類など、のあらゆる種類の単量体から選択さ
れる。これらのうち特に好ましいのは単糖類、中でもグルコースである。
に定義される。従って、RGTAは、均質(homomeriques)重合に
よる、および、例えば以下のような不均質(heteromeriques)重
合による諸構造で構成される:生合成のまたは化学合成の脂肪族ポリエステルな
ど、あるいはポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalca
noate)などの天然由来のものなどのポリエステル共重合体など。これはま
た、セルロース、キサンタン、デキストランなど細菌由来の多糖類及びそれらの
誘導体、澱粉、植物セルロースやアルギン酸塩とそれらの誘導体、fucane
sとそれらの誘導体などの単細胞または多細胞植物から抽出されたか、あるいは
ヒアルロン酸やキチンなど動物から抽出されたか、あるいは例えば共重合などの
合成により得られるものでもあり得る。例えばコラーゲンなどの、合成タンパク
質や天然のまたは化学修飾されたポリアミノ酸なども、本発明のポリマーの構成
に入り得る。
ある種々の提示形式、あるいは可溶性、または溶液、懸濁液、ゲル、粉末、海綿
、膜、加水可能か侵食可能か定着可能かの如何に拘わらず、多孔質か、半多孔質
または多孔質でない高密度の造形可能な物質などとの空間的立体配座などの物理
化学的性質に依存する。
それらのフラグメントは、本発明の範囲から除外される。何故ならば: −それらの抗凝固活性が50IUより高い可能性がある。事実、本発明のポリ
マーは、有意な抗凝固活性を欠いており、150〜170IU/mg程度である
ヘパリンに比較して、50IU/mgと活性が低い。
たはヘパリチナーゼのタイプの酵素の作用下であまりにも急速な微生物分解性を
示すようになる。
マーに付与することができ、XおよびYとは異なるZと指定される化学官能基を
含有することができる。よって、Z基は、例えば両親媒性を増加したり、血液脳
関門の通過を可能にすることなど、組織へのよりよい拡散や浸透を可能にするた
めに、より高い可溶性または脂肪親和性をRGTAに付与するのに有効である。
Z基の例としては、同一の、または異なるアミノ酸、脂肪酸、脂肪族アルコール
、セラミド、またはそれらの誘導体、あるいはアドレス指定されたのヌクレオチ
ド配列などが挙げられる。
成長因子などの治療作用または診断作用などの同一の、または異なる活性作用を
現し得る。
全体の、Z基による置換率を表し、これは0〜50%の間、好ましくは30%程
度である。
Aに結合し、他は互いに結合し得る。
によりXおよび/またはY基に結合し得る。
互作用など、共有以外の結合によっても上式(I)のポリマーに結合し得る。そ
の場合、本発明のポリマーは、Zのベクトル化システムを構成し得る。よって、
本発明のポリマーは、その用途の一環として、後述に定義する損傷を受けた部位
、または病気の組織部位まで、成長因子や酵素のように、活性因子Zを輸送する
のに有効であり得る。
発する可能性のあるポリマーは本発明の範囲に入らない。発明から除外されるZ
基として、突然変異原因子を構成するかあるいは発癌性であるか、またはその他
の毒性を有するとして既知のものを挙げることができる。CMDBS内に含まれ
るベンジルアミドから塩析することができ、且つその発癌性が専門家によく知ら
れているベンジルアミンがこのケースに当たる《Wiessler等、Carcinogenesis、
1983年;4(7):867〜871;Singer等、J Med. Chem.1983年;
26(3):309〜312》。従って、CMDBSは、本発明のポリマーから
除外される。
義のポリマーの少なくとも1つを含有する医薬または診断組成物にも関する。こ
れらの組成物は、ヒトにも動物にも使用可能である。事実、従前の技術に記述さ
れているHBGFPPのように、本発明のポリマーは以下の特性を示す: −それらは有意な抗凝固活性を持たないが、これは活性が150〜170IU
/mg程度であるヘパリンのそれに比べ、50IU/mgと低活性であることを
意味する。
びTGFβについて親和性を示し、成長因子を安定化させ、且つ薬効に相乗作用
を与える。
る。
与するプロテアーゼ活性を抑制する。
経または消化器について瘢痕形成効果を及ぼす。
、また、CMDBSについて米国特許第5693625号に報告されているよう
に皮膚および角膜に、あるいはBlanquaert F.等により記述されているように(B
one、1995年;17(6):499−506)扁平骨の瘢痕形成に関して特
性を示す新規なクラスの因子を構成する。しかし、本発明のポリマーはCMDB
Sと関連して予想外の特性も示す。例として、先験的に、長骨に移し変え不能で
あった頭蓋骨障害の修復に関するCMDBSの効果を挙げることができる(Blan
quaert F.等、Bone、1995年;17(6):499〜506)。扁平骨と長
骨は、以下のようにまったく異なる性質である: −それらは発生学的に由来が異なる。扁平骨は結合組織の細胞の誘導体である
のに対し、長骨は軟骨細胞の誘導体である。
とが示すように、穿孔時などに物質損失がある場合には自然に瘢痕形成しない(
例えば、紀元前7000年の石器時代の頭蓋骨外科治療の跡、Nature、1997
年、367、360)。ところが、驚くべきことに、本発明のポリマーは、ネズ
ミの大腿骨の骨幹の長さの3分の1程度の、非常に重大な骨の欠損の修復につい
て効果がある。骨格の修正を伴う修復のみならず、骨格が骨髄で満たされるのが
観察された。すなわち、RGTAによる治療はまさしく髄幹の修正に至るのに対
し、RGTA無しの場合には欠陥部は単に不揃いの骨材で満たされるに過ぎない
。皮膚の切開についても同じである。何故なら、この修復は事実上瘢痕が残らな
いほど優れたものである。
)の生体親和性ポリマーに関する。これらのポリマーは、以下のような一回のま
たは週当たりの用量で、10IU/mgより低い抗凝固活性を示す: −局部的施用の場合、1cm3当たり0.001〜1mg、 −投与が静脈内などの血液循環系を通じて行われる場合、0.1〜100mg
/kg、 −投与が筋肉内を通じて行われる場合、0.2〜500mg/kg、 −骨への投与では、0.1mg/kg〜5g/kg。
下である: −局部的施用では10IU、 −静脈内の施用では100IU、 −筋肉内の施用では500IU。
、むしろ組織のホメオスタシスを保持および/または復元する能力を持つ。した
がって、本発明は、中でも特に組織のホメオスタシスの機能不全の予防と治療に
有益で、且つ有意な抗凝固活性を示さない医薬の調製用としての上記ポリマーの
利用に関する。
た組織部位に局部的に投与することしか想定されなかったCMDBSについて、
従前の技術において記述されているものとは別の方法で投与可能であることを証
明した。このように、本発明のポリマーは、例えばその可溶性のゆえに、次の投
与方法:静脈内、動脈内、腹腔内、眼球内、脳脊髄液内または血液脳関門から解
放されるように直接に中枢神経系に、あるいは経口から;から適切なものを選択
することが可能であり、これらのすべての投与方法が、場合により組合せたとき
にも、特に有効であることが判明した。
下に、局所的に、筋肉内、静脈内または動脈内に、あるいは生体のあらゆる体液
部分に投与可能な形で、薬学的に許容可能な担体に結合されるようなあらゆる医
薬組成物に関する。本発明の一環として実施した作業により、RGTAがそれ以
外では満足すべき生物学的効果が得られない用量の範囲内で、特により大きく作
用することを証明した。投与方法と病変部のタイプにより、最適な有効用量を以
下に記述する。
ように、本発明の医薬組成物を1平方センチメートル当たり0.001〜1mg
の、あるいは処置する組織1立方センチメートル当たり0.005〜1mgのポ
リマー投与が可能なように服用量を決定する。このことから、本発明の組成物は
、生理的溶解溶液1ミリリットル当たり0.01〜10mgのポリマーを含有す
ることが好ましい。
いは周囲のあらゆる流体内への投与では、処置すべきヒトまたは動物の体重1k
g当たり0.1〜100mgのポリマー投与が可能なように本発明の組成物の服
用量を決定する。
00mg、好ましくは1kg当たり1〜50mgのポリマー投与が可能なように
本発明の組成物の服用量を決定する。
0mg、好ましくは1kg当たり10〜500mgのポリマー投与が可能なよう
に本発明の組成物の服用量を決定する。
に、瘢痕形成および修復活性を示し、また炎症治療用の医薬品に使用可能である
が、本発明者等は、本発明のポリマーがin vivoおよびex vivoで
、再生、保護、保存ならびに組織と細胞の老化に作用すること、さらに虚血、電
離線および罹患時またはストレスの際にもたらされるか、あるいはまた食品から
摂取される酸化促進生成物の有害な影響に対する抗腺維症活性を実証することに
より、組織と器官の、質と機能性のホメオスタシスの調整に関するそれらの素晴
らしい効果を証明した。したがって、RGTAは、再生された組織の質、および
それらの機能性を調整すること、またマトリックスの再編に作用すること、急性
および慢性の破壊プロセスにおかれた組織と器官内で抗腺維症および瘢痕形成効
果を及ぼすことから、組織のホメオスタシスの調整剤と考えられねばならない。
より特徴付けられる。これらの効果は、元々(病変以前)の組織構造のほぼ完全
且つ同一のものへの再形成、また特に腺維症の兆候またはその機能的完全性の喪
失などの瘢痕の、ほぼ完全な消滅となって現れる。より特定的には、後述の実験
部分で述べる研究作業により、以下のモデルにおいてRGTAのin vivo
での組織の保護と再生の特性を証明した: −皮膚の創傷病変部、 −大腿骨を例とする長骨などの骨組織の再生、 −慢性的歯周炎モデルでの骨組織の損失に対する保護とその再編の調整、 −電離線の有害な影響に対する保護、 −その部位に関わらず、虚血の有害な影響に対する保護。
明のポリマーは、スーパーオキシドジムスターゼ、すなわちSODのように、特
に保護剤および酵素の薬効増強剤として作用する。この特性は、酸化性ストレス
と酸化剤により誘発される病変部と苦痛の治療および/または予防用の医薬の調
製のために、本発明のポリマーの使用を可能にする。しかし、この特性はまた、
本発明のポリマーを、必然的に抗酸化剤を含むか、または動物性あるいは植物性
のSODなどの抗酸化剤が添加されている食品または直接栄養物の保存のために
、単独で、あるいは他の化合物と一緒に使用することも可能にする。
ー、肝疾患、腎疾患、心臓疾患などの細胞の変性に、および脂質などの分子の過
酸化に付随する罹患時の治療および/または予防用の医薬の調製のために、本発
明のポリマーの使用を可能にする。この特性はまた、組織と器官の保存、組織と
器官の機能を保存するための、より特定的には、ex vivoで器官の保存、
器官の移動、および人工器官などの移植のための組成物に、本発明のポリマーを
使用することも可能にする。
び/または予防用の医薬の調製のために、本発明のポリマーの使用を可能にする
。
の抑制活性。この特性は細胞のランダムな成長に、および血管形成に関連する病
理学的プロセスに付随する病気の治療および/または予防用の医薬の調製のため
に、本発明のポリマーの使用を可能にする。
例えばコラーゲンなどの細胞マトリックス成分の質的量的調整の活性。この活性
は電離線の有害な影響の治療および/または予防用の医薬の調製のために本発明
のポリマーの使用を、ならびに化粧品の調製においてこれらのポリマーの使用を
可能にする。
それらが分泌するコラーゲンのタイプの質に関する調整効果により、in vi
troおよびin vivoで発現する抗腺維剤の活性、ならびにこれらの細胞
により、および腺維症の瘢痕後遺症の顕著な低減により合成されるコラーゲンの
タイプの質に関する活性。この活性は肺、腎臓、肝臓、心臓、脈管、皮膚科学の
病理学、移植およびそれらの機能的完全性、寄生関連の多数の病変の治療および
/または予防用の医薬の調製のために本発明のポリマーの使用を可能にする。
見した: −スーパーオキシドジスムターゼ、すなわちSODの酵素活性を保護し、安定
化させる、 −スーパーオキシドジスムターゼ、すなわちSODの酵素活性を高める。
よび医療又は化粧品の分野の専門家に知られている用途において、そのすべての
機能について単独で、あるいはSODと一緒に使用することができる。この特性
により、これらは食品や滋養剤あるいは直接栄養物の保存剤としても機能する。
修復剤として作用する。このような場合としては、その由来の如何にかかわらず
虚血の時、または例えば電離線の影響下での細胞あるいは組織の侵害への対応時
、またはその性質の如何に関わらずウィルス、細菌、寄生生物、あるいはプリオ
ンの場合のようなESST(伝染性亜急性海綿状脳症)タイプの病気を引き起こ
すような病原性因子の進入時、または例えば、失明に至る可能性のある網膜での
、あるいは運動機能やその他の機能の喪失に至る可能性のある脳内での出血のケ
ースなど、その影響により機能の喪失を引き起こすほど有害な出血を伴う脈管の
破裂時がある。
のRGTAを含有する医薬組成物に関する。これらの組成物は医療、獣医学およ
び化粧品分野において、または必然的に抗酸化剤を含むか、あるいは動物性また
は植物性のSODを添加した食品または直接栄養物として、食料品の分野におい
て有効である。
化される。よって、RGTAは、SODの有効な効果が現されているすべてのケ
ースにおいて投与可能である。
の保護作用の結果である治療効果は、RGTAの存在でより効果的に作用する可
能性がある。RGTAは間接的に抗酸化剤として作用し、外因性のものの施用を
制限または回避させ得る。これらの特性の結果として、以下の治療効果が得られ
る: −神経組織の攻撃、苦痛また変性に対する保護。例えば、ストレスにおいて(
Shahen等、過酸化脂質抗酸化剤レベルに及ぼすストレッサーの効果、および脳内
のNa+、K+−ATPアーゼの活性、Experentia、1996年、52、336〜
339)、あるいはニューロンの変性および外因性SODの保護活性がより効果
的な治療を可能にする脈管、外傷性の偶発症候、またはパーキンソンなどの罹患
時に付随するニューロン変性性の病気(Bostantjopoulos等、初期および進行し
たパーキンソン病でのスーパーオキシドジスムターゼの活性、Funct. Neurol.、
1997年、12、63〜68)。
in Pharmacol、1997年、9、99〜106)。
することができる。SOD単独での治療により得られる保護は勿論RGTAの投
与により増強される。記述された特性に照らし、RGTA単独で、および/また
はSODの効果を記述している数多くの使用法において、SODと一緒に投与す
ると有効のようである(D'AgnilloとChang、虚血のネズミの後肢モデルでのヒド
ロキシルラジカル生成の減少−架橋ヘモグロビンを使用した再潅流障害−スーパ
ーオキシドジスムターゼ−カタラーゼ、Artif. Cells Blood Subsiti Immobil B
iotechnol、1997年、25、163〜80)。
に、心臓、脳、中枢神経系(Nakauchi等、ネズミの脊髄傷害へのレシチン化した
スーパーオキシドジスムターゼの効果、神経外傷ジャーナル、1996年、13
、573〜82)あるいは網膜の苦痛に対して有効である。
る遊離基スキャベンジャーの効果、Am. J. Respir. Crit. Care Med.、1997
年、155、622)。これは筋ジストロフィーに罹った病人に対し、特に興味
深い可能性がある。
筋及び骨格筋、膵臓内の脈管の内皮細胞、腸、結腸、気管、食道、結合組織、軟
骨の粘膜の上皮細胞)。
再潅流糖尿病のネズミの網膜における遊離基の直接測定、Clin. Neurosci.、1
997年、4、240〜5)。
ンパク質およびスーパーオキシドジスムターゼ−追跡研究、Indian J. Lepr.、
1996年、68、325〜33)。
ストレスへの肝臓の応答、Mol. Cell. Biochem.、1996年、159、115
‐121)。
、あらゆる種類の病原性因子の存在に起因するストレスにより誘発される病変の
治療。
影響が、RGTAの予防および/または治療により軽減され得る。RGTAの使
用は、癌の治療条件における放射線量を低減するか(Prevention of radioinduc
ed cystisi by orgotein;a random ranomized study、Anticancer Res.、19
96年、16、2025〜8)、または照射により誘発される染色体破壊効果の
防止を可能にする。放射線療法に付随する高熱の影響は、SODと同じようにR
GTAの使用により軽減され得る(Kandasamy等、ネズミのインターロイキン1
アルファによる放射線被爆の際の高熱の軽減での、スーパーオキシドジスムター
ゼとグルタチオンペルオキシダーゼの使用、Brain res.、1993年、606、
106〜10)。
ーパーオキシドジスムターゼを考慮した紫外線照射による網膜への慢性的影響、
Histol. Histopathol.、1996年、11、695〜702)、およびぶどう膜
炎の治療(Koch等、レンズ誘発のぶどう膜炎に対する種々の抗酸化剤の影響、Ge
r. J. Ophthalmol.、1996年、5、1185〜8)。RGTAによる処置で
は単独で、またはSODと一緒に使用することができ、またその使用は医療にお
いても、化粧品においても可能である。
n Ke yan等、ヒトでのスーパーオキシド陰イオンの生成、高血圧の発病学に関す
る可能なメカニズム、J. Hum. Hypertens.、1996年、10、305〜309
)。RGTAの付与はこの活性を増加し、高血圧を軽減する効果を有するであろ
う。
り、これにより、以下の使用法が可能になる: −例えば血液透析において、血液やその細胞成分などの生物学的流体中で。
存用に(Razak等、腸内虚血‐再潅流障害のネズミ・モデルに於いて架橋ヘモグロ
ビン−スーパーオキシドジスムターゼ−カタラーゼが遊離基を補修する。、Arti
f. Cells Blood substiti immobil. Biotechnol.、1997年、25、181〜
192)。器官保存溶液にRGTAを添加することによる再潅流での投与により
、これらの器官の保存を可能となる。
の病気で、骨粗鬆症やミオパシーのような組織の質の損失で、心・血管、神経学
、皮膚科学などの分野で、皮膚下部または筋肉、骨、脳、心臓、内臓などのより
深い部分の修復あるいは形成外科を必要とする外傷で起こるものなどといった、
組織の病変と苦痛の治療および/または予防用である少なくとも1つのポリマー
を含有する医薬組成物に関する。
れにより治療および/または診断目的での標的ベクトルとしてRGTAを使用す
ることが可能になる。本発明のポリマーは、前記でZ基として表した治療活性を
備えた分子に、あるいは損傷のある組織の探知を容易にする分子に結合すること
ができる。
イプであるか、あるいは多糖質であるような本発明のポリマーに関する、また他
方では、本発明のポリマーの特性に関する下記の例で説明される。
り置換されたモチーフAが、図1に示した一般式(II)のβリンゴ酸の共重合
体である。図1において: Aは、−(O−CH2−CH2−C)−, Xは、−COOH、または、−COO-Na+, Yは、−CO−CH2−CHOH−CH2−SO3H、または、 −CO−CH2−CHOH−CH2−SO3-Na+, Zは、−CO−OCH3−CH(CH2−CH3)−CH3,である。
Z基のパーセントに相当する。
マーに相当する。
するポリマーに相当する。
よる陰イオン重合による。合成する3種のβ-ラクトンを図2に示す。
られる。
Rは−CH2−C6H5(ベンジルマロラクトナート)、または−CH(CH3)−
CH2−CH3(2−ブチルマロラクトナート)、あるいは−CH2−CH=CH2 (アリルマロラクトナート)である。
後に得られる。この反応のため、アミン基を持つ炭素は立体配置の2重の反転を
受ける(Guerin等、光学的に活性なポリ(βリンゴ酸)、1985年、Polymer Bu
lletin、14:187)。
4.04モル;5.5当量)を氷浴内で1620ミリリットルの2N硫酸に溶解
した。62gの亜硝酸ナトリウム(0.9モル;1.2当量)を少量ずつ攪拌し
ながら添加した。この添加が終了してから30分後に、反応系を8g(0.13
モル;0.18当量)の尿素により室温で30分間中和した。1リットルのエチ
ルアセテートによりブロモコハク酸を抽出し、液相を1リットルのエチルアセテ
ートで洗浄した。有機相は硫酸マグネシウム上で乾燥し、吸引漏斗でろ過してか
らロータリーカルチベーター(rotavapor)でエチルアセテートを除去
した。
してから乾燥in vitroで真空状態、45℃で4時間乾燥した。 性質:PM=197;m=52.8g;収率36%;Tf=168℃;外観=白
色粉末。
して行った。無水物は無水条件および窒素下で乾燥剤、無水トリフルオロ酢酸(
TFAA)の作用下で、2−ブロモコハク酸(2R,S)から合成した。次の段
階は、2つのモノエステルに至るアルコールによる無水物の開環であり、そのう
ち一つのみがラクトン化可能である。アルコールの選択は所望のラクトンにより
行った。
氷浴内で、125ミリリットルのテトラヒドロフラン(THF)を無水化してか
ら、43.4ミリリットル(0.30モル;1.2当量)の無水トリフルオロ酢
酸(TFAA)を1滴ずつ臭素用フラスコにより添加した。その溶液を攪拌しな
がら2時間室温に放置し、その後形成されたTFAおよび過剰なTFAAをロー
タリーカルチベーターで除去した。得られた無水ブロモコハク酸を2時間脱気し
た。
を加えた。その溶液を不活性雰囲気中で12時間、40℃で攪拌した。こうして
得られたモノエステルの混合物を、150ミリリットルのエステルに溶解した。
エーテル相を3回、100ミリリットルの水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾
燥させ、吸引漏斗でろ過した。 性質:PM=287;m=71.3g;収率95%;外観:薄黄色のオイル。
量)のアリルアルコールを添加した。反応系を12時間、40℃ではなく、22
時間、60℃の不活性雰囲気中で攪拌した。モノエステルを同じ方法で洗浄した
。 性質:PM=237;m=17.6g;収率72.8%;外観:粘性オイル。
RS)−2−ブタノールで実施した。反応系を12時間、60℃の不活性雰囲気
中で攪拌した。 性質:PM=253;m=45g;収率90%;外観:オレンジ黄色のオイル。
立体配置の反転を示す。これは2N水酸化ナトリウムによりpH7.2で中和後
のモノエステルの混合物で直接行う。反応は、ジクロロメタン/水の2相系で起
こる。ラクトンをシリカ・カラムのクロマトグラフィーにより精製する。溶離剤
の性質はラクトンの性質により異なる。それからこのラクトンを、適当なカラム
で蒸留する。
ル)のモノエステル混合物を、丸底フラスコ中で300ミリリットルのエーテル
と250ミリリットルの水に溶解させた。2N水酸化ナトリウム溶液を1滴ずつ
pH7.2まで添加してから、450ミリリットルのジクロロメタンを加えた。
フラスコに冷却装置を取り付け、40℃で3時間強く攪拌した。
ミリリットルの塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させてからろ過した。こ
れを、ロータリーカルチベーターで溶剤を除去した。このラクトンを、シリカ・
カラムで精製し(溶離剤:ジクロロメタン/石油エーテル 8/2)、真空で3
回蒸留した。
洗浄後のm=3.41g、すなわち収率=6.7%:Te=116〜118℃(
3.10-2mbars);IR(n、cm-1):n(CO ラクトン)=182
5cm-1;n(CO エステル)=1740cm-1;外観:無色のオイル。
で行い、溶液を3時間ではなく5時間攪拌した。ラクトンをシリカ・カラムで精
製し(溶離剤:石油エーテル/エチルエーテル 4/6)、真空で3回蒸留した
。
洗浄後のm=4g、すなわち収率=13%:Te=62〜65℃(3.10-2m
bars);IR(n、cm-1):n(CO ラクトン)=1825cm-1;n
(CO エステル)=1740cm-1;外観:無色の液体。
離剤:ジクロロメタン/石油エーテル 8/2)、真空で3回蒸留した。
後のm=14.4g、すなわち収率=28%:Te=80〜82℃(3.10−
2mbars);IR(n、cm-1):n(CO ラクトン)=1825cm-1 ;n(CO エステル)=1740cm-1;外観:無色の粘性液体。
在中で、15日間37℃で重合した。重合のトラッキングは、赤外線分析により
1850cm-1でラクトン帯の分布を観察しながら行った。
)の合成 5g(24.2mmol)のベンジルマロラクトナート、1.4g(9.3m
mol)のアリルマロラクトナートおよび0.7g(4.1mmol)のブチル
マロラクトナートを2時間脱気し、カニューレにより窒素気流中であらかじめ2
時間脱気した80.10-3Mの重合開始剤溶液471ミリリットル(テトラエチ
ルアンモニウム:10-3当量;37.72.10-6モル)の入った丸底フラスコ
に移した。共重合は37℃で15日間、不活性雰囲気中で攪拌しながら行った。
それから、ポリマーを最小限のクロロホルム中に溶解した。連鎖の最後に濃塩酸
を1滴追加して、そのポリマーをエタノールに沈殿させてから、真空中48時間
、40℃で乾燥させた。
1):n(C=O)=1748cm−1;SEC(THF、標準ポリスチレン)
:;Mn=6600;Mw=9200;Ip=1.4;MSEC=10000;
S 134(CH=);168(C=O側鎖);170(C=O主鎖);外観:
透明なガラス状のポリマー。
)のエポキシ化 1.12g(不飽和単位7.91mmol)のポリマーを丸底フラスコ内の3
ミリリットルの無水ジクロロメタンに溶解した。2ミリリットルのジクロロメタ
ン中に466.34ミリグラム(4.69mmol;6当量)のメタクロロ過安
息香酸(MCPBA)を含む溶液を、カニューレにより添加した。混合物を室温
で24時間攪拌してからろ過した。エタノールに沈殿したポリマーを、真空の乾
燥器で乾燥した。
BAは鎖の長さを変えないため、エポキシ化後のモル量に変化はない。
)の水素化分解 4gのポリマーを、丸底フラスコのナトリウム上で、蒸留したばかりの5ミリ
リットルのジオキサンに溶解した。活性炭に担持したパラジウム800ミリグラ
ム(質量の20%)を加え、水素化分解を開始した。消費される水素の体積が増
加しなくなった時点で(反応開始後24時間)、水素化分解を停止した。溶液を
セライト上でろ過し、ジオキサンをロータリーカルチベーターで除去した。 性質:m=2g;水素化分解の効率100%。
)のスルホン化 4gのポリマー(すなわち、5.64.10−3モルのエポキシド)を20ミ
リリットルの水に溶解した。これに2.14gの亜硫酸ナトリウム(2当量、1
1.28.10−3モル)を添加した。この溶液のpHを7.4に調製した(Ho
usse-Ferrari、“N、N’ジメチルアクリミドの重合体と共重合体により修正さ
れたシリカの調製と特性決定”、パリ大学の論文VI、1990年1月30日)
。その溶液を攪拌しながら7時間氷の中に放置してから、水に対して4℃で24
時間限外ろ過し、凍結乾燥した。
この例では、本発明のポリマーは、Xおよび/またはYで置換され、およびZ 無しのグルコースAのモチーフとして、図5に示す置換されたデキストランで構
成される。種々のタイプのグラフト化を図5に示すが、ここで、 Aはグルコースの単量体で、そのX、YおよびZは、位置2および/または位
置3および/または位置4でヒドロキシル基を介して、および/または、Yおよ
び/またはZについてはX基を介して、および/またはZについてはY基を介し
てグラフトし、 Xは、−CH2COOH、または、−CH2COO-Na+, Yは、−SO3H、または、SO3 -Na+, Zは、変更可能な基であり、そのいくつかの例を後述する。
る。置換される最初のタイプの単量体は、位置2および/または3および/また
は4で置換されるA−Xタイプのカルボキシメチルグルコースである(図5にモ
チーフを紹介)。Y基=(図5にモチーフを紹介)の追加はO−硫酸化に相当し
、R=無しおよびR’=H+またはNa+と共に、Y=O−SO3−H+/Na+と
なる。YがXに結合すると、YのRがCH2−COとなり、失われたX(COO - )の官能価は、もはや存在するとは見なされない。この場合、これはYの一部
となり、活性基Yの置換パーセントとして測定される。
コースか、カルボキシメチルグルコースか、硫酸グルコースか、または硫酸カル
ボキシメチルグルコースである。種々の異性体を図5に図式化する。よって、こ
れらのポリマーは、これらの種々の形の単量体の可能な組合せに相当し、また遊
離XおよびY基の残余率により定義される。
コース、および/または硫酸カルボキシメチルグルコースである。
環状の組合せを考え得る単量体を表す。
された手順により実施できる(Mauzac等、デキストラン誘導体の抗凝固活性 第
I部:合成と特性決定、1984年、医用生体材料 6/61−63)。これは
カルボキシメチルデキストランを得るための、デキストランのグルコース残基の
ヒドロキシル基のエーテル化に関するものである。この反応は複数回再生可能で
あり、CMnDと呼ばれる生成物に至るが、ただし、ここでnはカルボキシメチ
ル化のステップ数を表す。CMnDと呼ばれる種々の生成物は、COOHの増加
%により特徴付けられる。よってこの方法では、図6の表に示すように、デキス
トランの種々のカルボキシメチル化率を得ることができる。
0000DのデキストランT40(37.37g、9.34.10-4mol)を
4℃で溶解させた(182ミリリットルの蒸留水)。同じく4℃に冷却した水酸
化ナトリウム溶液(74g、124ミリリットルの蒸留水中に1.85mol)
を、温度を4℃に保ちながらデキストラン溶液にゆっくり注いだ。微粒粉末にし
たモノクロロ酢酸(76.2g、0.806mol)を同じ反応温度に保ちなが
らゆっくり添加した。しかしながら、媒質の温度は反応終了時には数分間で4℃
から21℃まで上昇した。次いで、混合物を40分間、サーモスタット付きの油
浴で50℃まで昇温した。加熱中、反応媒質は黄色くなった。冷却後、pHを氷
酢酸で7.2に中和した(Takakura、1990)。冷えた無水エタノール中に、
沈殿によりカルボキシメチルデキシトランを集めた(反応量の5〜6倍)。次い
で、それを真空の低温器で乾燥させた。ポリマーCM1Dを限外ろ過により洗浄
してから、凍結乾燥した(総質量=56g)。
した塩基は1N水酸化ナトリウムである。結果はCOOH基の%で表した。CM 1 DのCOOH%=48.98%。
されたことを意味する。
こうして、同じ手順を適用してCM1DからCM2Dを、CM2DからCM3Dを合
成した:CM2DのCOOH%=91.8%、およびCM3DのCOOH%=11
8.3%。
ロロスルホン酸で行う。これは図6の表にCMnDSmと命名している化合物にな
る。ただし、mは下記の例で定義するようなクロロスルホン酸の当量に相当する
。
(CM1D)を40ミリリットルの乾燥したジクロロメタンに分散させた。硫酸
化反応に関与する可能性のある遊離したヒドロキシル残基の数は、nOH=4.
10-3モルである。反応は1当量のクロロスルホン酸(nClSO3H=4.1
0-3モル、すなわち約0.5gまたは体積で0.3ミリリットル、ただし、クロ
ロスルホン酸溶液の密度は1.75)の存在下で実施した。0.3ミリリットル
のクロロスルホン酸を4ミリリットルの脱水したジクロロメタンで希釈した。こ
のようにして得られたCM1DS1を、frite上で真空の反応媒質をろ過する
こと回収した。
加量のO−サルフェート基をグラフトするように過剰なクロロスルホン酸の存在
中で行うことができる。このようにして得られるポリマーRGTAは、CMnD
Smと呼ばれ、n=1、2など、またm=0.5、1、2などである。
我々はCMnDSmとの比較製品として、市販の硫酸デキストラン(Pharmacia Bi
otech製品、コード番号17-0270-01)、あるいはm当量のクロロスルホン酸の存
在中で、すなわちCMnDSmが得られる条件に相当する反応条件での、デキスト
ランT40からの硫酸デキストランを考慮に入れた。
により、それぞれの合成化合物CMnDSmについて相当するXおよびY値が明ら
かとなる。これらの全データを図6の表に示す。他方、この図は市販の硫酸デキ
ストランについて、およびCMnDSmと同じ条件での硫酸デキストランについて
、このパーセントを明記する。
ニルと、CM2DPhSSと指定する硫酸デキストランカルボキシメチルスルホ
ン酸フェニル誘導体の合成 これらのポリマーは図7に示したモチーフの連鎖で構成され、またZ無しの図
4のものに相当する。これらのポリマーは図6に示すようにA−X、A−Yおよ
びA−Zタイプのモチーフの連鎖で構成される。
、それ自身が位置3と4で硫酸化されている元々のグルコースの、位置2にグラ
フトされたカルボキシルラジカル上にZを結合させたA−Z単量体を表す。
溶解した。3Mの塩酸でこの溶液のpHを3.5に調製した。カップリング剤E
EDQ(1.93g、2当量)を40℃で16ミリリットルのエタノール(EE
DQ 0.12g/ミリリットル)に溶解した。EEDQ溶液を段階的にポリマ
ーに添加し、反応混合を30分間強く攪拌した。次いでフェニルスルファニル酸
塩(NH2PhSO3Na、3.045g、2当量)を少しずつ添加した。これ
を水酸化ナトリウムでpHを9に調製した。この混合物を室温で4時間攪拌して
から、希塩酸で中和した。ここでCM2DPhS生成物を限外ろ過し、真空で蒸
発させて凍結乾燥した(1.66g)。
9%;H=5.28%;N=0.3%;S=0.67%;COOH=81%。
ある:C=23.16%;H=3.72%;N=0.27%;S=9.60%;
COOH=52%。
モチーフの連鎖で構成されるが、そのうちA−Zの特徴的なモチーフの一つを図
8に示す。この例でDEと記されているエチレンジアミンであるZ基は、それ自
身が位置3と4で硫酸化される元々の単量体グルコースの、炭素2のカルボキシ
ルラジカル上にグラフトされる。
DEと記されているエチレンジアミンのZ基と共に、CM2Dに適用した。
=37.67%;H=6.25%;N=5.35%;COOH=19%。
た。得られた生成物は図7に示したCM2DES1に相当する。この場合、RGT
Aの一般式に基づき、Zはジエチルアミンである。
る:C=36.83%;H=5.82%;N=4.67%;S=1.82%;C
OOH=10.7%。
基をグラフトすることを可能にする。これら種々のポリマーは、CM2DPhS
化合物のPhSと記したスルホン酸フェニル基、CM2DPhSSの硫酸塩を含
有する化合物およびスルホン酸塩を含有する化合物、または化合物に対してCM 2 DESのN−サルフェートおよびO−サルフェート基の特殊な役割の評価を可
能にする。このタイプのポリマーの中で、硫酸塩基は基本的にRGTAの特性に
結びついていることが分かる。
チルフェニルアラニンと、CM3DTyrSと指定する硫酸デキストランカルボ
キシメチルチロシンの合成 これらのポリマーは、図6に示すA−X、A−YおよびA−Zタイプのモチー
フの連鎖で構成されるものであり、そのうちの特徴的なモチーフを図9に示す。
この例で、夫々のZ基は、Pheはフェニルアラニン、Tyrはチロシンである
。これらは、それ自身位置3および4で硫酸化される元々のグルコースの、位置
2でグラフトされたカルボキシルラジカル上に結合される。
r)の付いたアミノ酸、またYは−OSO3-基である。
vivo使用でのその塩析で、腫瘍形成リスクが発生するため有害であり得るB
と指定したベンジルアミンの代わりとして、これら二つのPheとTryアミノ
酸の芳香族構造の重要性を評価するために実施した。
6ミリリットルの蒸留水に溶解した。溶液のpHを3Mの塩酸で3.5に調製し
た。カップリング剤EEDQ(745mg、1当量)を40℃で6.2ミリリッ
トルのエタノールに溶解した。EEDQ溶液を1滴ずつポリマーに加え、反応混
合物を室温で30分間強く攪拌した。フェニルアラニンメチルエステル(1.3
g、2当量)をゆっくり加えて、水酸化ナトリウムでpHを5〜9にした。反応
を室温で4時間維持した。それから、その溶液を希塩酸で中和した。ここでポリ
マーCM3DPheを限外ろ過してから、真空で蒸発させて凍結乾燥させた(5
24mg)。
:C=36.9%;H=5.03%;N=0.44%;COOH=101.05
%。
適用した。
:C=34.41%;H=5.12%;N=0.28%;COOH=101.7
6%。
施した。
ある:C=18.08%;H=2.89%;N=0.30%;S=14.71%
;COOH=28.79%。
ある:C=17.99%;H=3.13%;N=0.3%;S=14.35%;
COOH=19.85%。
オレイン酸(CM1DoleicS)およびカルボキシメチルデキストラン−硫
酸パルミチン酸(CM1DpalmS)の例 これらのポリマーは、図6に示すA-X、A−Y、A−Zタイプのモチーフの
連鎖で構成されるものであり、その特徴的なモチーフを図10に示す。この例で
は、それぞれoleicはオレイン酸、palmはパルミチン酸であるZ基を位置4で硫
酸化されたカルボキシメチルグルコースの位置2の炭素3のヒドロキシルに結合
させた。
上式(I)に対応する。これらの脂肪酸はそれら自身の役割に加えて、ポリマー
の疎水性/親水性バランスの重要性を評価するためにグラフトした。
mmol)にトリエチルアミン(0.8ミリリットル)および1滴ずつ塩化オレ
イン(1.6ミリリットル)を添加した。反応混合物を室温で2時間攪拌した。
得られたポリマーを120ミリリットルの酢酸エチル中に沈殿させ、遠心分離し
てから真空乾燥した。沈殿物を酢酸ナトリウム2Mに溶解し、形成された塩をエ
タノール(160ミリリットル)に沈殿させ、ろ過して、20ミリリットルの蒸
留水に溶解してから、最後に水に透析した。透析後(24時間)、溶液を真空で
蒸発させ、脂質デキストランCM1Doleic(751mg)が得られた。
%。
%、H=5.96%。
に対し実施した。
.28%;H=5.04%;S=5.26%。
7%;H=4.88%;S=5.14%。
表2に示す。
結乾燥)。それから、ポリマーを最小の体積の蒸留水で溶解しやすくしてから、
切断の閾値が6000〜8000g.mol−1の透析円筒部に導入した。透析
は2重蒸留水(MilliQ)に対して、50体積の水について1体積の生成物
の比率で4〜5日間、毎日水を2回交換して行った。
SKカラム)にHPLCクロマトグラフィーを結合した。
ス膜上の限外ろ過セルで限外ろ過をした。精製の質は、電気伝導度測定セルを使
用して管理した。セルの出口で除去される水の伝導度が、純粋な蒸留水の伝導度
(2μS)になったら、精製を停止して、溶液を濃縮してから凍結乾燥した。
のように定量した。
ステルの割合に従って、先験的に決定される。
て、2つのケースを考慮しなければならない。
に依る。
各ヒドロキシル基に54g.mol−1の相対モル量、すなわち、デキストラン
の成分残基のモル量162g.mol−1の3分の1を割当てる。各ヒドロキシ
ル基は同じ反応性を持つこと、および置換は一旦各グルコース単位に影響し、場
合にっては同じ残基上に第2の置換をすることが認められている。
mol-1のグルコース残基247個を含んでいる。
−塩基滴定により決定する。この定量は、ポリマー1g当たりに結合した酸のモ
ル数に相当する。
−OCH2COONaが現れる。これらの置換されるサブユニットのそれぞれは
、相対分子量240g.mol-1を持つ。
さい値X2を与える。X1−X2の差はモチーフ−OCH2COO−SO3Naに
相当する。これらの置換されるサブユニットのそれぞれが320g.mol-1の
分子量を持つ。
ル基の硫酸化に相当することを示すことを可能にする。この場合、モチーフ−O
SO3Naが現れる。これら硫酸化されたグルコースのサブユニットは、相対分
子量200g.mol-1を持つ。微量分析Sの率は、ポリマーの質量のパーセン
トで与える。
カルボキシルラジカルX1とX2のパーセントを知れば、そのポリマーが以下のも
のを含んでいると考えることができる: ‐質量162gの非置換グルコース残基1個、 ‐質量240gの遊離カルボキシル残基X2個、 ‐質量320gの硫酸カルボキシル残基X1−X2個、 ‐質量200gの硫酸グルコース残基Y個。
ポリマーにグラフトされた硫黄原子数(ΣS)を知ることができる。この原子数
がΣS=(S%×MM)/32×100であり、ここで32はSの原子量、MM
は合成されたポリマーのモル量である。
7×3200に等しいとして導き出すことができる。
果から与えられる窒素の値で、同じ理論が適用される。
gであるヘパリンと比較して、その活性は50IU/mgより小さい。 2)これらはヘパリンおよび、特に、例えばFGF1および/またはFGF2お
よび/またはTGFβについて親和性があるので、成長因子を安定化し、および
その効果を高める。 3)これらは、トリプシンなどのタンパク質分解剤に対し、これらの因子を保護
する。 4)これらは、例えば白血球エラスターゼおよび/またはプラスミンなどの炎症
プロセスに関係するプロテアーゼ活性を抑制する。 5)これらは、上述の特許で紹介されているモデル、すなわち筋肉、神経、また
は消化器の少なくとも一つで瘢痕形成効果を有する。
化性ストレスに対する攻撃に関係する酵素活性を保護し、効果を高める。この特
性により、これらは抗酸化剤として作用し、単独で、または治療用および/また
は化粧用でのSODの用途でSODと一緒に、あるいは特に食品の保護において
、または栄養分などの抗酸化保存剤として使用することができる。 7)これらはカルパインなどの酵素の活性を抑制する。 8)これらはヘパリチナーゼやヘパリナーゼなどの酵素の活性を抑制する。 9)これらは、電離線を受けた細胞の寿命を延長し、また、例えばコラーゲンな
ど、それらのマトリックスの成分の分泌を定性的にも定量的にも調節する。 10)これらは、平滑筋細胞、腺維芽細胞または肝細胞などの間葉細胞の成長、
およびそれらが分泌するコラーゲンのタイプの質を調整し、抗腺維症剤として働
く。 11)これらは、ヘパリナーゼやヘパリチナーゼにより自然に変性される生成物
である硫酸ヘパランとは異なり、緩やかな変性を行う。 12)これらは変性後に、例えばCMDBSを排除する理由であるCMDBSが
グラフト基Z=ベンジルアミンとで起こす可能性を有し、その毒性により知られ
た生成物を含有せず、また放出することもない。 13)これらは以下の種々のモデルにおいて、組織の保護と再生の能力をin
vivoで持つ: a)皮膚の創傷の病変部。 b)例えば大腿骨などの長骨などの骨組織の再生。 c)骨組織の損失に対し、および、例えば骨粗鬆症や歯周炎のケースなどでのそ
の再編成の調節作用の保護。実際、これらは組織のホメオスタシスおよび骨や筋
肉の質などの組織の質の調節剤である。 d)肝臓の再生、または中枢神経系および周囲神経系の変性に対する保護。 e)その部位に関係なく、虚血の有害な影響に対する保護。
った(Biggs、1972年、ヒトの血液凝固、Oxford Blackwell Scientific Pub
lications)。Owen Koller緩衝液での異なる濃度のポリマー溶液1
00マイクロリットルを、血小板の少ない血漿100マイクロリットルおよびウ
サギの脳のセファリン溶液100マイクロリットルと共に、37℃で5分間イン
キュベーションした。0.25M塩化カルシウム100マイクロリットルを追加
し、血栓の発生時間を経時的に測定した。
たヘパリンに比較して、50IU/mgを超える活性を示さない。ここで例とし
て挙げた生成物の抗凝固活性はすべて10IU/mg(生成物)であることは注
目に値する。
よび/またはTGFβについて親和性のある成長因子に関する実施例1および2
のポリマーの安定化と相乗作用 この実施例では、FGF1の安定化、およびFGF1とFGF2の相乗作用に
対するポリマーの影響を検討した。これらの影響は、BALB/cの細胞3T3
、あるいはCCL39の成育について評価した。これらの実験で使用した条件は
、参考用として本発明に組込まれているHBGFPPsに関する特許で、従前の
技術として記述されているものである。
ュベーション時間の関数として、20℃と37℃での熱変性に対するRGTAの
影響を示す。ED50は、FGF1のマイクログラム/ミリリットルでの濃度を
表すが、ここではトリチウム化したチミジンの50%の最大取込み率を得るため
、6ナノグラム/ミリリットルを培養した腺維芽細胞、CCL39細胞に植種し
なければならない。
と同程度の、また時にはより重大な影響を与えることを示す。
問わずFGFの量は変更可能である。採用したポリマーの濃度は、FGFのマイ
トジェン効果を最大限に高めるものに相当する。これらのテストはFGF1とF
GF2について細胞3T3に対し行った。対照は、ED50値の各テストについ
ての系統的研究を除き、前述したものと同じである。
得られたものより低いか、同等のFGF値について得られることから、FGF1
とFGF2の作用について相乗作用がある(図13)。
vitroでのテストに用いられ、また消化プロセス上、最も重要な作用を有
する酵素の一つである。
2の1ナノグラム/ミリリットル(最終)、または5マイクログラム/ミリリッ
トル(最終)のトリプシンを、最初は15分間37℃で、Tris−HCl 1
00mM、0.18M NaCl、brij 0.03% pH7.6の緩衝液
中で異なる濃度のポリマー(0.5〜500マイクログラム/ミリリットル)と
ともにインキュベーションした。その際、5マイクログラム/ミリリットル(最
終)のトリプシン、または1ナノグラム/ミリリットル(最終)のヨウ素化した
FGF2をそれぞれ加えた。総反応量は30マイクロリットルであった。37℃
で2時間のインキュベーション後に、Laemmli緩衝液を添加し、90℃で
5分間の加熱することで酵素反応を停止した(Laemmli U.K.バクテ
リオファージT4の頭部の組立て中の構造タンパク質の開裂、Nature、1970
、227:680〜685)。
で電気泳動を行った。上記前後のゲルを80℃で2時間乾燥させ、オートラジオ
グラフィフィルムの存在下、−80℃で露出させた。バンドの強度を画像分析に
より測定し、変性したFGF2に対する保護されたFGF2のパーセントを計算
した。
に関するポリβリンゴ酸ポリマーの保護効果を、保護%で表す。図15には、ト
リプシンによる攻撃に対するFGF2とTGFβに関するデキストラン誘導体ポ
リマー保護効果を、保護%で表す。
同程度の保護効果を示す。
に関係するプロテアーゼ活性の抑制 白血球エラスターゼおよびプラスミンは、炎症過程の定着と進行に対する、基
本的なプロテアーゼである。これらのテストは、本発明のポリマーがヒトの白血
球エラスターゼによる変性から成長因子を保護するか否かを測定することを目的
とする。
順は、30ナノグラム/ミリリットル(最終)のエラスターゼと、0.5〜50
0マイクログラム/ミリリットル(最終)の、トリプシンと使用したものと同じ
ポリマーである。緩衝液はトリスHCl 100mM、NaCl 0.18M、
0.03% brij pH8である。バンドの強度を画像分析で評価し、変性
のないFGF2のパーセントを計算した。これらのテスト用の対照はヘパリンで
ある。デキストランT40と硫酸デキストランを内部標準として採用した。
筋の再生のケース RGTAの瘢痕形成特性を最も効率的に評価するために採用したモデルは、フ
ランス国特許第2718026号に定義され、紹介されている筋肉損傷モデルで
ある。
us)を切開し、切開した筋肉内に、テストする物質を含むかまたは含まない生
理的血清の注入後、このように処置した筋肉を手術の8日後に回収した。重量分
析に組織学的研究を組合せることにより、筋肉の再生に対するポリマーの影響を
定量化することができる。結果は、同じ実験条件でポリマー無添加の生理的血清
しか注入しなかった筋肉の性質に対する%で表した。図17は、得られた結果を
示したものであり、デキストランの骨格構造から誘導された新規のポリマーも、
βリンゴ酸共重合体も共に、所望の効果を有することを示している。
、また静脈内、動脈内又は筋肉内でも同様に、筋肉の再生効果が得られることは
注目に値する。
に知られているものであり、Blanquaert F.等により記述されている(Bone、1
995年;17(6):499〜506)。
る。あらかじめ同じ寸法に切取り、RGTAを含有する溶液で湿らせたか、ある
いは湿らせていないコラーゲンでこの傷を埋めた。ここで紹介する例では、検討
したポリマーは、CMSタイプのポリマー(RGTA1005と1012)およ
びβリンゴ酸の共重合体(RGTA2011)である。処置の35日後に行った
X線撮影の画像分析により測定した骨の埋戻しパーセントを、表3に示す。
れらの条件で外皮の矢状縫合を改善することができる。
性ストレスに対する攻撃に対する酵素活性の保護と相乗作用 O2 -イオンと過酸化水素(H2O2)が生成すると、細胞への毒性、特に破壊的
な影響を与えるラジカルが出現する。SOD、すなわちスーパーオキシドジスム
ターゼはこれらのラジカルによる毒性の除去に関与する酵素である。これらは酸
化性ストレスから生体を保護する因子である。
および塩基性のpHでも安定して相乗作用を持つ。
熱処置に対してSODを保護する作用を有する。
刺激してスーパーオキシドイオンの生成を低減させる。
った(Freund M および Pick E、リンホカインの作用メカニズムIX.リンホカ
インで活性化したマクロファージによる過酸化水素の生成のベース酵素、J Immu
nol、 1986年、15;137(4):1312〜1318)。この技術は、
チトクロムcの減少によるO2 -イオンの調整に基づく。10マイクログラム/ミ
リリットルの濃度でMnSOD(Sigma ref. S 8151)30U/ミリリットルを
添加し、種々の濃度のRGTA溶液にした。これらの混合物に種々の処理を行っ
た。
した。
リプシンを作用させるか、またはそれらを60℃で30分間熱処置した。その後
、これらの混合物の触媒残留活性を、典型的な酵素技術によるか、または細胞系
に関して評価した。
(2.5 106細胞/ミリリットル)の懸濁液中でインキュベーションした。
この条件は、マクロファージで活性化された単核細胞によるスーパーオキシドア
ニオンの生成を誘発する。PMAで刺激すると、活性化しないときの塩基性レベ
ルで通常生成されるスーパーオキシドイオンの生成量の増加が誘発される。対照
として使用される活性MnSODの添加は、生成されるスーパーオキシドイオン
量を減少させた。
に含まれるSODの触媒残留活性は高くなった。よって、これらのテストにより
、内因性ならびに外因性のSOD活性に関してポリマーの保護効果と相乗作用を
評価することができる。
するRGTAの保護効果と相乗作用を、図19は、トリプシンによる攻撃を受け
たか、または熱ショック後のSODに関するRGTAの保護作用を、また図20
は、活性化されたマクロファージによるスーパーオキシドイオンの生成量に関す
るSOD活性の相乗作用を示す。
と保護効果を与える。よって、種々のポリマーの添加は、細胞により内因的に生
成されたSODのように、外因的に添加されたSODの触媒活性を制御する。
ち、0.78Uの酵素(57.2nM)を、1ミリリットルの50mM Tri
s−HCl緩衝液 pH7.4、0.05% Brij、2mM CaCl2、2
mMDTおよび0.15M NaClでインキュベーションした。テストするR
GTA溶液を27℃、5分間で添加した。次いで、基質《Sigma社のN−ス
クシニル−leu−tyr−アミド−7メチルクマリン(S 1153)を25
0マイクロモル》を石英の容器にとり、その中に上記の混合物を添加した。次い
で、7アミノ−4メチルクマリンの基質の変化を、380nmでの励起(exc
itation)と460nmでの蛍光を検出することにより、3〜5分ごとに
測定した(1984年、J. Biol. Chem. 259、(20) p12489〜124
94において、Sasaki、Kikuchi、Yumoto N、YoshimuraおよびMurachi Tにより
記述された手順による)。
馬の虚血後病変部の処置でMDL28170、あるいはカルパスタチンタンパク
質などのカルパインの抑制効果を記述するMarkgraf CG等(Stroke、
1998年、29、152〜158)、あるいはSaido等(神経科学.Lett
ers、1997年、16;227:75〜78)の発表から予想されるように、
我々はRGTAが脳虚血により誘発される病変に対して保護活性を持つことが予
言できる。RGTAを局所投与、または静脈内投与すると、カルパインの抑制効
果が見られ、また虚血の場合のように特に酸素の失活により損傷した神経組織の
修復が可能となる。
射性標識したNa2 35SO4の存在下で7日間培養したた内皮細胞により合
成された細胞外マトリックス中に存在する硫酸ヘパランを基質として使用するこ
とにより行った。使用した手順は、Ishai−Michaeli Rらにより
開示されたものである(脈管内皮と細胞外マトリックスからの代表的腺維芽細胞
成長因子の放出におけるヘパリンのサイズと硫酸化の重要性、Biochmis
try、1992年、31(7):2080〜2088)。次いで、内皮細胞の除
去後、得られた細胞外マトリックスを、ヘパラナーゼと、0.5マイクログラム
/ミリリットルのRGTAの存在下で、または非存在下、37℃で24時間イン
キュベーションした。放射性標識した硫酸ヘパランの変性を測定するため、イン
キュベーション媒質を回収して、Ishai−Michaeliに記述されてい
る手順に従ってSepharose 6B柱上に載せた(Biochemist
ry、1992年;31(7):2080〜2088)。得られた結果を図22示
す。最初にヘパラナーゼ酵素により変性されていない物質に相当する高分子量の
硫酸ヘパランが最初に溶離する(フラクション3〜20)。ヘパリナーゼでの処
理すると、このピークの消滅および変性した硫酸ヘパランの低分子量フラクショ
ンに相当するピークの出現が誘発される(フラクション20〜40)。実験例で
は、50マイクログラム/ミリリットルのRGTA 1005はヘパラナーゼ活
性の50%を抑制し、100マイクログラム/ミリリットルでは100%を抑制
した。
響;それらの生存と分泌されるコラーゲンの質および量を通じて評価される抗腺
維症効果への影響 腺維または腺維症組織の形成は、組織の修復と再編成プロセスに付随する代表
的な生理的ステップである。腺維症組織は、構造的および機能的に組織と器官を
完全に保護することを目的とし、通常は過渡的な埋戻し組織である。これは細胞
外マトリックスのコラーゲンの豊富化により特徴付けられる。
オスタシスが乱れた病理学へと進み、腺維症を引き起こす細胞外マトリックスが
異常に高く蓄積して現れる。その原因に関係なく、腺維症は以下の特徴を有する
: 恒常的な炎症浸潤巣の存在、腺維芽細胞や平滑筋細胞などの結合または間葉細
胞の増殖状態と静止状態の間のバランスにおける不平衡の存在、若干の、または
障害があるときのみしか修復されない攻撃を受けた組織の漸進的破壊、細胞外マ
トリックスの合成と変性との間のバランスにおける不平衡の存在。
たは電離線(特にγ線)により誘発され得る。このケースは、放射線治療を受け
た患者に頻繁に見られる放射線被爆による腺維症に関する。
スの主要な構成成分である。これらは腺維芽細胞および平滑筋細胞のように間葉
細胞により合成される。腺維組織中で、量的にも質的にも、コラーゲンの合成お
よび/または変性を促す改変、すなわち、再編成のダイナミズムゆえに、総コラ
ーゲンが増加する。腺維症はタイプIIIのコラーゲンの増加により特徴付けら
れ、これは放射線由来の腺維症に多い。このタイプIIIのコラーゲンの増加は
、より少ない頻度ではあるが、タイプIIIのコラーゲンとタイプIのコラーゲ
ンの割合の増加をもたらす。もう一つのコラーゲンであるタイプVのコラーゲン
は、マトリックス内のコラーゲン繊維の質と組織に、すなわち、原腺維形成に関
係する。腺維症組織内で、タイプVのコラーゲン率の低下は細胞外マトリックス
のコラーゲン繊維の損傷の原因となる。
pria由来のHISM細胞、ヒトの腸平滑筋(米国型培養条件、Rckvil
le、Maryland ATCC CRL 192)である《Graham
M.、Diegelmann R.、Elson C.、Bitar K.およ
びEhrlich H.、Proc.Soc.Exp.Med.176(198
4)503》。腺維症現象の誘発に対する放射線の影響を評価するために、この
系統のヒトの腸平滑筋細胞を、細胞の維持、および正常または炎症状態、または
腺維症による修復プロセスの細胞により分泌されるコラーゲンタイプの量と質を
通じて分析するのに使用した。
ン−ストレプトマイシン、および10%のウシ胎児血清を含むDMEM培地で培
養し、5%のCO2と95%の相対湿度の飽和雰囲気下、75cm2のフラスコ中
に入れ、37℃のインキュベータに保存した。HISM細胞は、平底の24穴プ
レートに穴当たりの細胞数20000個添加した。各穴の容積を2ミリリットル
の培地で埋めた。0.4〜400マイクログラム/ミリリットルの、種々の濃度
のRGTAまたはRGTA無しで複数の成長速度を検討した。
から行った。照射源から垂直に、2個のボックスに同時に照射を行い、照射表面
で線量を評価した。照射装置の線量は1Gy/mnである。吸収線量はボックス
当たり10分間の照射時間につき10Gyである。
ち、予防、治療あるいは両者同時の場合におけるRGTAの作用を評価するため
、種々の手順を実施した。表4にこれらの手順を示す。
ルの用量でRGTA(+)を添加することにより評価した。治療効果は、照射の
2時間後に、予防効果の場合と同量のRGTAを添加して評価した。予防と治療
の同時効果については、同量のRGTAの存在下、細胞を連続培養した。
とアスコルビン酸を添加した非血清の環境下、24時間インキュベーションした
。その後、表面浮遊物を採取し、robber−policemanを使用して
細胞層を最終容積18mL回収した。培地と回収した細胞層を流水(4℃で24
時間)で十分透析し(切断の閾値6〜8kDa)、巨大分子から小分子を除去す
る。透析後、分取できるフラクションを採取して、コラーゲンの特殊なマーカー
であるヒドロキシ(3H)プロリンの放射能を測定するために加水分解した(H
Cl 6M、105℃、24h)。この段階で、分取できるフラクションを使用
して、コラーゲンの総合成量を放射能測定により定量した。
4時間透析した。ペプシンはペプチドの形態となって透析物内に排除される非コ
ラーゲン性汚染物質を消化する。各試料中に含まれるコラーゲンの少ない割合を
増加させて酵素/基質比を1/5に近づけるため、タイプIのコラーゲンを添加
した。反応条件は以下の通りである:1mLのペプシン溶液(0.5M)+1m
LのコラーゲンI溶液(0.5M)+0.514mLの酢酸、使用中の18mL
の酢酸の最終濃度を0.5Mにするためである。こうして得られた各透析物を凍
結乾燥(−50℃)し、使用するまで−20℃で保存した。
(硫酸ドデシルナトリウム)の存在下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
種々のコラーゲンのα鎖を分離した。α鎖の加水分解により、特定タイプの各コ
ラーゲン鎖に相当するゲルのバンドの切断に由来する各コラーゲンに取込まれた
放射能を測定する。これらを60℃で過酸化水素水に溶解し、溶解された諸バン
ドに含まれる放射能を、液体シンチレーションβ計数管で、またはゲルを直接オ
ートラジオグラフィにより計量した。
い、電気泳動による分離を行った。
ンの定量。
たた(HCl 6M、105℃、24h)。次いで酢酸を蒸発させてから、アン
プルの内容物を1mlの蒸留水に再び懸濁した。RojkindとGonzal
ezの方法によって、プロリンとヒドロキシプロリンを分離した(Rojkin
d MおよびGonzalez E、コラーゲン中非コラーゲンタンパク質のプ
ロリン−14Cとヒドロキシプロリン−14Cの比放射能の測定改善方法、An
alytical Biochmistry、1974年;57(1):1〜7
)。この原理は、プロリンとヒドロキシプロリンをクロラミンTで酸化すること
にある。プロリンはトルエンに可溶性のカルボン酸ピロリンに変化するが、ヒド
ロキシプロリンは水溶性のカルボン酸塩に変化する。処理後、プロリンとヒドロ
キシプロリンの2フラクションを各試料ごとに回収し、放射能測定により定量し
た。
定性的には、分泌コラーゲンの表現型(図24)により特徴付けられる。
は少数である。タイプVのコラーゲン量は原腺維形成の組織の質に関係する。
かし腺維症の場合は恒常的に合成される“警告コラーゲン”である。タイプIの
コラーゲンに対するタイプIIIのコラーゲンの割合は、組織病変、ストレスま
たは例えば電離線などの照射に対する応答により大きく増加する。タイプIII
のコラーゲンは、急性でも慢性でも腺維症反応を示す腺維のマトリックス内で優
勢となる。このコラーゲンは、腺維症反応の特徴的成分である。
胞はこれら3タイプのコラーゲンを合成する(図24)。照射により精製される
コラーゲンの量(図23)と質(図24)が変化する。コラーゲンの全合成量は
約50%増加する(図23)。タイプIおよび、特にタイプIIのコラーゲンの
分泌が格段に増加する(それぞれ50%、および約500%)。逆に、タイプV
のコラーゲンの合成は50%以上減少する。
照射によってそれらが暴露されるかかわらず細胞をほぼ同一のものに修復された
。図23は、コラーゲンの総合成量が、予防または同時(予防+治療)処置条件
では特に正常な値になることを示す。図24から、特に同時処置の場合、標準ホ
メオスタシスへ修復を確認できる。タイプIとタイプIIIのコラーゲンの分泌
比の値は、ブランク細胞の値に近似することから、治療処置は、予防の場合と同
様の効果を及ぼす。これらのRGTAは、コラーゲンに対するHISM細胞の機
能を回復する。
能を浴びた集団の50%以上の重大な死亡率を引き起こす。ポリマーの存在によ
り、顕著な保護作用が示され、死亡率は約25%に低減するが、最も顕著な効果
は予防+治療の同時処置によって得られる。
それらが分泌するコラーゲン・タイプの質を調整する抗腺維症剤としての作用 前記実施例12に述べたように、腺維症とは、間葉細胞の成長の変性を意味し
、合成されたコラーゲンの量と質の修復を伴う。
る。これらの細胞は大動脈から体外培養組織方法によって得られる。大動脈は腺
維芽細胞を含む外膜(外層)、平滑筋(CML)を含む中間膜(中心層)および内
皮細胞を含む内膜(内層)の3つの細胞層で構成されている。
MEM 1g/Lのグルコースを含有し、ウシ胎児血清(SVF)を20%、L
−グルタミンを1%、およびペニシリン−ストレプトマイシンを1%添加した2
5cm2のフラスコ中で培養した。細胞をこれらの体外培養組織から分離し、培
地に移植した(P0段階)。培養開始から2週間後に、細胞をDMSO 10%
とDMEM 20% SVFに細胞数2百万の細胞密度で冷凍した。
自動粒子カウンター(Coulter Counter ZM、Coutron
ics)を使用し、一穴当たりの細胞数を評価することにより、成長の速度を測
定した。
を使用し、細胞が切り離された4つの穴の平均を採って行った。
ポリマーのときは、RGTA1000から1025シリーズのポリマーの存在中
、および存在しない場合について、またZが存在するときは、RGTA1110
から1115シリーズについて、ヘパリンを対照として、0.4〜400mg/
mLの間の種々の濃度で測定した。
味の成長)。
った細胞数との差を表す。
Aは、細胞の生物学的活性を制御する可能性のある種々の奏効テストに相当する
。
実施した。
照標準分子として使用したヘパリンのそれに近い平滑筋細胞増殖抑制作用を有す
る。しかしながら、ヘパリンとは異なり、これらのポリマーはコラーゲンの分泌
の表現型を修復する。事実、コラーゲンの総合成量は、RGTA 1005、1
012および1013の存在により有意に減少した。質的側面から見ると、これ
らの同じポリマーが、ヘパリンとは逆にタイプIとタイプIIIのコラーゲンの
合成率を減少させる一方、これらはタイプVのコラーゲンの分泌を増加させた。
できる。
Aの影響を示すものである。
Mを注入して麻酔をかけた。3cmの切除を2か所、背中の対称軸に対して横方
向に脊柱の両側で実施した(図27)。RGTA 1012処理を行わないブラ
ンク動物に対し、処理される動物は、切除の30分前に1キログラム当たり1ミ
リグラムのRGTA溶液、および縫合の直前に傷への局所的適用として1ミリリ
ットル当たり100マイクログラムで、100マイクロリットルの溶液を筋肉内
に注入した。縫合はprolene 2−0で、真皮内連続縫合を一列のみ行っ
た。処置したネズミと対照動物を、手術の7日目、21日目および60日目に拡
大撮影した。これらの期間のそれぞれおいて、各実験シリーズのネズミ3匹を皮
膚瘢痕採取の組織学的研究用に安楽死させた。
物の背中の図。
理的血清により処理処置された対照動物に相当する。C1では写真C2と異なり
、抜糸しなかった。瘢痕が見え、特に縫合手術で使用した針の痕跡レベルで、凝
固血液のかさぶたが依然として存在する。C3とC4はRGTA 1012を含
む生理的血清で処置した動物に相当する。同様に、瘢痕が見えない。縫合糸はC
3では見えるが、C4では抜糸して、無い。この写真のみで、細い縁取りが元々
の切開を示している。
断面図を表す。D1はRGTA 1012を含有しない生理的血清で処理した対
照動物で、D2はRGTA 1012含有生理的血清で処理した動物に相当する
。D1では、上皮の成熟が未だ不完全な下層真皮では、正常な皮膚のものと同一
の構造が見つからなかった。再編成はごく一部である。逆に、D2では全く病変
していない皮膚と同じ構造の皮膚と組織が見られる。唯一の瘢痕の痕跡が真皮の
深い部分で見られ、不完全な再編成の部分が有ることが分かる。この後者のケー
スでは、外部瘢痕はまったく存在しない。
痕が消滅したが、対照動物では前述の2ケース(C1およびC2)で瘢痕が見ら
れる。
いない真皮を示すのに対し、RGTAで処理した動物は、深い部分で軽度の真皮
痕跡しか示していない。処置した動物(D2)の皮膚の組織は、如何なる瘢痕形
成プロセスも受けていないブランク動物の皮膚に近い。このモデルでは、RGT
Aは皮膚床の瘢痕形成を促進するのみならず、特に瘢痕組織の再編成を可能にし
、腺維症の痕跡がまったく検出できない程度の再生組織にまで達する。これらは
組織のホメオスタシスの特別な強力調整剤であることが分かる。
)に比較して、器官質量の80%の保存を可能にする組織異常に対するRGTA
の保護効果を証明するものである。筋肉の虚血の結果、酸素の供給不足から誘発
されたストレスにより引き起される有害な影響に対するRGTAの保護効果を、
後述の実験で紹介する。
M.およびIrwin K.L.により記述されたモデルを参考にしている(1
980年、ネズミの遊離移植のExtensor digitorum Lon
gus筋の血管の再構築、Am.J.Anat.、158、65〜82)。実験手
順は、成熟したウィスターラット(350g)の2本の後足のEDL筋(Ext
ensor digitorum Longus)の神経血管幹を、筋肉への入
口で切断し、2つの腱を結索して虚血をもたらすことより成る。ここで、1ミリ
リットル当たり50マイクログラムのRGTA 1005溶液100マイクロリ
ットルを生理的血清に入れ、これをEDL筋中に直接注入した。もう一つの対側
筋には、同量のRGTA無しの生理的血清を注入した。
。処理したもの、および未処理の各筋肉グループで、筋肉の平均直径、筋外膜、
周囲ゾーンの厚み、虚血ゾーンの平均直径などのパラメータの全てを×10のレ
ンズとマイクロメータを使用して測定した。周囲ゾーンにおいて虚血下でも生き
残った筋繊維層の数を無作為に選択した異なる30フィールドで計数し、×20
のレンズで観察した。
RGTA 1005)の保護効果を示す。図27−Aと図27−Bは夫々、対照
ネズミ(27−A)およびRGTAで処理したネズミ(27−B)の筋肉を、2
つにカットした組織断面を示す。対照では、虚血が筋外膜と接触する周囲繊維の
冠1個を除き、筋肉繊維の変性を引き起した。RGTA 1005の投与により
、深い部分の筋肉繊維の変性が大幅に制限されると同時に、それによって引き起
こされる炎症反応と変性も、大幅に有意に減少する。よって、RGTA 100
15は、虚血により引き起される有害な影響から細胞を予防する。
)に比較して、RGTA処理後の平均直径(5.2+/−0.3mm)は修復さ
れていないことが観察される。筋外膜の厚みはRGTA処置無しの85+/−1
0マイクロメートル比較して、RGTAによる処理では10+/−5マイクロメ
ートルであり、筋外膜内の炎症反応は、RGTAで処置された筋肉では、大幅に
有意に減少している(p<0.01)。RGTA処理無しのEDL筋の虚血の中
心ゾーンは、平均直径が44000+/−100マイクロメートルであり、その
中の筋肉繊維は完全に失われている。このゾーンは平均して3.2+/−0.5
の筋肉層を含む270+/−50マイクロメートルの周囲ゾーンに囲まれている
。RGTAでの処置は、平均直径が3600マイクロメートル+/−200(p
<0.05)の変性した中心ゾーンの大きさの顕著な減少と、厚みが700+/
−40(p<0.05)マイクロメートルで8.3+/−1.8の腺維層(p<
0.01)を含有する周囲ゾーンの増加によって特徴付けられる。
が、8週間後には同程度であるが、12週間後にはさらによく、元の状態と同じ
髄管と骨折なしの骨のように成熟した皮質の再形成を示している(図29)。
F/Han)、Iffa Credo)を使用した。研究は動物に対する作業に
関するCEEの勧告に基づいて実施した(令87−848 −1987年4月1
9日)。ペンチオバルビタールナトリウム注入麻酔下、大腿骨に側面から着手し
た。骨幹部管で筋組織と骨膜をはずした。Kirschnerブローチにより高
密度ポリエチレンプレートを大腿骨表面に固定した。5ミリメートルの分節傷を
大腿骨幹の中央に付けた。骨の傷の場所に、組織の縫合前にインプラントを挿入
した。このインプラントは、RGTA 1012を1ミリリットル当たり100
マイクログラム含有する塩水中でのインキュベーションによりこの生成物が含浸
するか否かにかかわらず、F.Blanquaert等(1995年、Bone
、17:499〜506)により記述された手順に基づき、他のネズミの大腿骨
幹で準備した脱塩した他種族の骨のマトリックスに相当する。その後、動物を歩
行制限せずに籠に入れておいた。安楽死前の12週間、2週間ごとに動物の大腿
骨をX線撮影した。その後、大腿骨を採取し、組織学的研究に必要な処置を施し
た。X線写真は画像分析のため、その濃度計測レベルを特に検討した。
Aで処理したネズミと未処理ネズミの大腿骨の組織学的、およびX線写真の検討
を報告する。
の大腿骨のX線写真を示す。図28−C、28−E、および28−Gは、28−
D、28−F、および28−Hに夫々示したサンプルに相当する手術部品の組織
断面である。
観察される。12週間後に瘢痕形成現象がなく、骨柱は再形成されていない。
るのが観察される。この場合、埋戻しは行われているが、如何なる再編成も観察
されない。埋戻し構造は従来の長骨の組織を示していない。
塩した骨マトリックスにより埋められているのが観察される。この場合、埋戻し
組織の構造は正常な骨のそれに相当している。緻密質な皮層骨は傷のないゾーン
と関係しており、固定ビスの痕跡が見られる。この部分は元の骨髄腔と連続する
軟骨により埋められる空洞を特定する。
速度に対するRGTA 1015の影響を示す。X線写真I1とI2は8週間後
に、X線写真J1とJ2は12週間後に撮影したものである。I1とJ1は28
−Eと28−Fで示した処置に相当し、骨の傷は単にRGTA無しの脱塩された
骨マトリックスにより埋められている。I2とJ2は28−Gと28-Hに示し
た処置に相当し、骨の傷はRGTA 1015溶液で湿された脱塩した骨マトリ
ックスで埋められている。これらのX線写真は、瘢痕形成の加速、および特にI
1とJ1では検出できない顕著な皮質形成(I2とJ2)中での、再形成された
骨の成熟を示している。RGTA 1015は、短期間で、元の骨の構造と同一
の長骨構造に再形成可能な再生剤として作用する。
リックスに比較して、脱塩した骨マトリックスに浸潤したRGTA 1012は
、骨の再形成と成熟のプロセスを、まさに有意に促進する。この効果は、わずか
8週間後に新しい皮質の出現として表れるのに対し、対照条件ではこの現象は起
こらない。12週間後には、RGTA 1012を加えて処理した7匹の動物の
うち6匹で、放射線学的検討において、厚く且つ限定された皮質の再形成との欠
陥の完全な結合結果を示しているが、CM1DS2無しでは、唯一の結合が皮質形
成なしの未成熟の骨の放射線画像で観察される。X線撮影の画像分析での定量的
研究により、これらの観察を確認する。この検討は他方、RGTA 1012で
処置した骨の形状が、実験期間の12週間では骨の材料が比較的小さい密度であ
ることを唯一の相違として、正常な骨の形状に近いことが明らかとなった。元々
の欠陥に新しく形成された骨の密度のプロジェクションは、ポリマーRGTA
1012による処置が、皮質と髄管の再形成を通じて組織の再形成を誘発するこ
とを明らかにした。
付け、且つ確認する。これらの組織学的検討により、依然としていくつかの軟骨
区域とともに高密度な骨で構成された新しい皮質の存在と、新しい軟骨で満たさ
れた元々の骨幹と連続した髄管の存在が証明された。RGTA 1012無しで
処置した大腿骨は如何なる成熟の形も見せない。再形成された骨は特別な組織を
示さない。この骨は、高密度の骨と、特に部位の限定されない骨髄組織との不均
質な混合で構成される。
メオスタシス調整潜在能力、ならびにそれらの再編成を誘発する能力についての
、本発明のポリマーの骨誘導(osteoinducteurs)効果を示して
いる。
整剤としてのRGTAの特性は、下記の実施例17により確認できる。
に対するRGTAの影響 この実施例で使用したモデルは、ハムスターの下顎骨の再編成に関するもので
ある。
参照)に、超過糖質(hypergulcidique) を2か月間摂取させた
後に、歯周炎を誘発させた。投与した食餌は、蔗糖(56%)、脱脂粉乳(28
%)、完全な小麦粉(6%)、ビール酵母(4%)、ウマゴヤシ粉末(3%)、
粉末レバー(1%)および塩化ナトリウム(2%)である。
の食餌を与えたブランク・グループを、14匹の動物で構成した。超過糖質の食
餌を与えた実験グループを、24匹の動物で構成した。2か月後にははっきりと
慢性歯周炎が発達した。これらの実験グループには、この期間後の3週間、毎週
、生理的血清緩衝液0.5ミリリットルの容積中、1キログラム当たり0.1〜
15ミリグラムの用量のRGTA 1005の筋肉内注入した。対照グループは
RGTA 1005無しの生理的血清(SHAM)を注入した。そして、動物の
体重を毎週計量した。各タイプの処置の1か月後に、動物を屠殺し、下顎骨を採
取して組織学的研究に用いた。手術部品の封入は安定化したメタクリル酸メチル
中で行った。
ートルのみが使用可能である。システムは、常に舌側の第1臼歯2本の根の間の
骨組織により決定され、且つ位置を探知する深さの部分と同じ断面配列を検討す
るように標準化した。
の出現により表面化する。この病気は、多くの骨溶解吸収と、付着での、すなわ
ち骨接合フェーズでの骨表面積の減少といった特徴である歯周骨の重篤な障害を
引き起こす。
はトルイジンブルーにより青色に染まる巨大細胞である。付着は、破骨細胞に被
われており薄青色へ変色することにより同定される骨様組織帯により特徴付けら
れる。OCとは逆に、造骨細胞は立方体で単核の小さい細胞である。これらの現
象の定量化は画像処置ソフトで支援された画像ステーションを使用して行った。
ブランク動物では、吸収活性はほぼゼロに近いのに対し、付着のそれは大きい。
未処理の動物(SHAM)では、病気が速やかに進行し、強い吸収と低付着率に
より特徴付けられる。CM1DS2で処理した動物、特に1キログラム当たり1.
5ミリグラムで処理したものでは、吸収率が大幅に減少し、またブランクで確認
された率のほぼ80%にも達する付着率の大幅な増加を伴う。
間の再形成バランスを再平衡して骨組織の質量を調整することを示している。
は集結能力を示すものである。
変部を形成した。夫々の動物に、SibTech社(NY、米国)製のトリチウ
ムで放射線標識した2 106cpmのRGTA 1012を静脈注入した。こ
のトレーサーの比活性は、1ミリグラム当たり20ミリキューリーである。
を採取して液体窒素で凍結した。凍結状態で組織断面を作成することによって、
放射線標識した生成物の、beta imager(Biospace社)で検
査用組織断面部位に固定された量の測定が可能となる。下記表5に表した結果は
、病変した筋肉は24時間後には、装置のバックグラウンド放射能とほとんど変
わらない非病変筋肉の標識部位より、5倍も高い放射性生成物量が集まることを
示している。
リマーの、自動ターゲット設定能力を証明するものである。よって、これらのポ
リマーの特に興味深いひとつの特性は、医薬または診断成分の方向づけ能力にも
ある。
行った。
、細菌成分に作用することなく、IMを通じてさらに2か月処置した。他の動物
は処置を行わなかった(n=20)。これらの2グループを、健康な(歯周炎の
ない)ハムスターと比較した(n=12)。
を標準化した方法で撮影した。各写真についてエナメル−セメントの接続部に相
当する基準線を引いた。次いで、骨稜の輪郭に一致する第2の線を引いた。これ
らの2本の線を第1臼歯の前後で結んだ。この面積を測定した。
することである: −歯茎を根に定着させる生理的な繊維挿入ゾーン、 −動物の老化に関連して発生する骨の高さの損失。
周炎中に破壊される)と老化による損失部分が含まれる。しかしながら、我々は
、病気が0.38mm2程度の骨損失を引起したと考えることができる(差:p
<0.0001)。
の動物での根の裸化は1.02mm2である。よって、ブランクに比較して0.
06mm2の正味の欠損(有意的でない差)が、また処置なしのものに対しては
0.32mm2の増加が存在する(p=0.0005)。
ある。
スキームである。
量を示す表である。
ある。
る。
。
表である。
表である。
活性抑制効果を示す表である。
ある。
である。
ーゲン分泌に対する作用を示すグラフである。
コラーゲン対する作用を示すグラフである。
果を示すグラフである。
表である。
真である。
示す写真である。
ある。
ある。
Claims (62)
- 【請求項1】 下記一般式(I)で示される同一または異なるモチーフの連
鎖により構成される生体親和性ポリマー: AaXxYy ここで、 −Aは、単量体を表し、 −Xは、単量体Aに結合し、且つ以下の構造式に対応するカルボキシル基を 表す:R−COO−R’ ここで、Rは、場合により分岐しているか、または不飽和で、且つベン ジルアミンとスルホン酸ベンジルアミンを除く1個または複数の芳香族環 を有している脂肪族炭化水素結合あるいは鎖を表し、また、R’は水素 原子または陽イオンを表し、 −Yは、単量体Aに結合し、且つ以下の構造式のうちの一つに対応するサル フェート基またはスルホネート基を表す: −R−O−SO3−R’、 −R−N−SO3−R’、 −R−SO3−R’、 ここで、Rは、場合により分岐しているか、または不飽和で、且つベン ジルアミンとスルホン酸ベンジルアミンを除いて1個または複数の芳香 族環を有している脂肪族炭化水素結合あるいは鎖を表し、また、R’は水 素原子または陽イオンを表し、 −aは、式(I)のポリマーの質量が約5000ダルトンより大きくなるよ うな単量体Aの数を表し、 −xは、単量体A全体のX基による置換率を表し、約20と150%の間の 値、好ましくは50%程度であり、 −yは、単量体A全体のY基による置換率を表し、約30と150%の間の
、 値、好ましくは100%程度である。 - 【請求項2】 XおよびY基のラジカルRが、直鎖の、または分岐したアル
キル、アリル、アリール基の中から選択されるものである請求項1に記載の生体
親和性ポリマー。 - 【請求項3】 前記単量体Aが、糖類、エステル類、アルコール類、アミノ
酸類、ヌクレオチド類の中から選択される同一の、または異なるものである請求
項1または2に記載の生体親和性ポリマー。 - 【請求項4】 前記単量体Aが同一の、または異なる単糖類、より特定的に
はグルコースである請求項1〜3のいずれかに記載の生体親和性ポリマー。 - 【請求項5】 上記ポリマーに、さらに生物学的または生理的特性を付与す
ることができ、前記XおよびYとは異なる化学官能基Zを含有するものである請
求項1〜4のいずれかに記載の生体親和性ポリマー。 - 【請求項6】 前記単量体A全体の、前記Z基による置換率が0と50%の
間、好ましくは30%程度である請求項5に記載の生体親和性ポリマー。 - 【請求項7】 前記Z基が、ポリマーにより良好な可溶性または脂肪親和性
を付与し得る物質である請求項5または6に記載の生体親和性ポリマー。 - 【請求項8】 前記Z基が、同一の、または異なるアミノ酸、脂肪酸、脂肪
族アルコール、セラミド、またはこれらの誘導体、もしくはアドレス指定された
されたヌクレオチド配列である請求項7に記載の生体親和性ポリマー。 - 【請求項9】 前記Z基が、同一の、または異なる治療作用あるいは診断作
用を発するものである請求項5または6に記載の生体親和性ポリマー。 - 【請求項10】 前記Z基が、抗炎性物質、抗菌性物質、抗生物質、酵素、
成長因子の中から選択されるものである請求項9に記載の生体親和性ポリマー。 - 【請求項11】 前記X、YおよびZ基が、前記単量体Aに直接結合してい
るか、あるいは1個のみが前記単量体Aに結合し、他は互いに結合している前記
各請求項のいずれかに記載の生体親和性ポリマー。 - 【請求項12】 前記X、YおよびZ基が、前記単量体Aに直接共有結合し
ているか、あるいは前記X基および/または前記Y基に共有結合している請求項
5〜11のいずれかに記載の生体親和性ポリマー。 - 【請求項13】 前記Z基が、共有結合以外の結合で、式(I)のポリマー
に結合している請求項5〜11のいずれかに記載の生体親和性ポリマー。 - 【請求項14】 前記Z基が、イオンまたは親水性の相互作用により式(I
)のポリマーに結合している請求項13に記載の生体親和性ポリマー。 - 【請求項15】 薬学的に許容可能な担体により結合するものである請求項
1〜14のいずれかに記載のポリマーの少なくとも1つを含有することを特徴と
する医薬または診断組成物。 - 【請求項16】 生体親和性ポリマーと薬学的に許容可能な担体が、静脈内
、動脈内、筋肉内、腹腔内、眼球内、脳脊髄液内または直接に中枢神経内に、あ
るいは経口、骨、皮膚、皮下、器官のあらゆる体液隔室内、または場合によりこ
れらの組合せで局所的に投与可能な形で結合したものである請求項15に記載の
医薬組成物。 - 【請求項17】 処置する組織の1平方センチメートル当たり0.001〜
1mgのポリマー、あるいは1立方センチメートル当たり0.005〜1mgの
ポリマーを投与可能となるように調製されたものである請求項15または16に
記載の組成物。 - 【請求項18】 生理的溶解溶液1ミリリットル当たり0.01〜10mg
のポリマーを含有するものである請求項15または16に記載の組成物。 - 【請求項19】 血液循環系、腹腔内、眼球内、脳脊髄液内または組織内あ
るいは周囲のあらゆる流体内を通じて、処置するヒトまたは動物の体重1kg当
たり0.1〜100mgのポリマーを投与し得るように調製されたものである請
求項15または16に記載の組成物。 - 【請求項20】 処置するヒトまたは動物の体重1kg当たり0.2〜50
0mg、好ましくは1kg当たり1〜50mgのポリマーを筋肉内を通じて投与
し得るように調製されたものである請求項15または16に記載の組成物。 - 【請求項21】 処置するヒトまたは動物の体重1kg当たり1〜5000
mg、好ましくは1kg当たり10〜500mgのポリマーを骨から投与し得る
ように調製されたものである請求項15または16に記載の組成物。 - 【請求項22】 有意な抗凝固活性を持たないものである請求項15〜21
のいずれかに記載の医薬組成物。 - 【請求項23】 ヘパリンとの親和性を有する成長因子の安定化および相乗
作用に使用されるものである請求項15〜22のいずれかに記載の医薬組成物。 - 【請求項24】 ヘパリンとの親和性を持つ成長因子の、トリプシンなどの
タンパク質分解剤に対する保護で使用されるものである請求項15〜23のいず
れかに記載の医薬組成物。 - 【請求項25】 炎症プロセスに関係するプロテアーゼ活性の抑制に使用す
るものである請求項15〜21のいずれかに記載の医薬組成物。 - 【請求項26】 組織または器官の病変、ならびに苦痛の治療および/また
は予防のための、請求項1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少な
くとも1つを含有することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項27】 筋肉、神経組織ならびに消化器の治療および/または予防
のための請求項26に記載の医薬組成物。 - 【請求項28】 皮膚の瘢痕形成のための請求項26に記載の医薬組成物。
- 【請求項29】 角膜の瘢痕形成のための請求項26に記載の医薬組成物。
- 【請求項30】 扁平骨の瘢痕形成のための請求項26に記載の医薬組成物
。 - 【請求項31】 長骨の瘢痕形成のための請求項26に記載の医薬組成物。
- 【請求項32】 炎症の治療および/または予防のため、請求項1〜14の
いずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを含有することを特徴と
する医薬組成物。 - 【請求項33】 組織および器官の、質および機能性のホメオスタシスの調
整に使用するための、請求項1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの
少なくとも1つを含有することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項34】 in vivoまたはex vivoで、組織と細胞の再
生、保護、保存および老化に使用するために、請求項1〜14のいずれかに記載
の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを含有することを特徴とする医薬組成物
。 - 【請求項35】 虚血、電離線および罹患時もしくはストレス時、またはさ
らに食品中から摂取される酸化促進生成物による有害な影響の処置および/また
は予防のための、請求項1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少な
くとも1つを単独で、あるいはSODと共に含有することを特徴とするる医薬組
成物。 - 【請求項36】 虚血に対する予防および保護で使用するための、請求項1
〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを含有すること
を特徴とする医薬組成物。 - 【請求項37】 低酸素症、神経疾患、ミオパシー、肝障害、心臓疾患など
の細胞変性に、および脂質などの分子の過酸化に付随する病理学的処置および/
または予防のための、請求項1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの
少なくとも1つを含有することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項38】 組織、器官および人工器官の保存のための、請求項1〜1
4のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを含有することを特
徴とする医薬組成物。 - 【請求項39】 心臓と神経病の治療および/または予防のための、請求項
1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを含有するこ
とを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項40】 細胞のランダムな成長、および血管形成に関連する病理学
上のプロセスに付随する病気の治療および/または予防のための、請求項1〜1
4のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを含有することを特
徴とする医薬組成物。 - 【請求項41】 電離線の有害な影響の処置および/または予防のための、
請求項1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを含有
することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項42】 腺維症の治療および/または予防のための、請求項1〜1
4のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを含有することを特
徴とする医薬組成物。 - 【請求項43】 平滑筋、腺維芽細胞又は肝細胞などの間葉細胞の増殖の調
整、およびそれらの分泌するコラーゲンタイプの質的調整で使用するための、請
求項1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを含有す
ることを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項44】 肺、腎臓、肝臓、心臓、脈管、皮膚科学、移植とそれらの
機能的完全性、寄生に関連した多数の病変の、病理学的に治療および/または予
防のための、請求項1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくと
も1つを含有することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項45】 酸化性ストレスおよび酸化剤により誘発された病変および
苦痛の、治療および/または予防のための、請求項1〜14のいずれかに記載の
生体親和性ポリマーの少なくとも1つを含有することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項46】 必然的に抗酸化剤を含むか、または動物性あるいは植物性
のSODなどの抗酸化剤が添加されている食品または直接栄養物の保存のため、
請求項1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを単独
で、あるいは他の化合物と共に含有することを特徴とする組成物。 - 【請求項47】 請求項1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの
少なくとも1つと、動物性または植物性のSODを含有することを特徴とする組
成物。 - 【請求項48】 神経組織の攻撃、苦痛あるいは変性の治療および/または
予防のため、請求項1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくと
も1つを単独で、あるいはSODと共に含有することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項49】 老化の治療および/または予防のため、請求項1〜14の
いずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを単独で、あるいはSO
Dと共に含有することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項50】 心臓、脳、中枢神経の苦痛の治療および/または予防のた
めの、単独のあるいはSODと組み合わされた請求項1〜14のいずれかに記載
の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを含有することを特徴とする医薬組成物
。 - 【請求項51】 脊髄あるいは網膜の病変の治療および/または予防のため
、請求項1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを単
独で、あるいはSODと共に含有することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項52】 筋ジストロフィーなど、横隔膜の衰弱に付随した呼吸不全
の治療および/または予防のため、請求項1〜14のいずれかに記載の生体親和
性ポリマーの少なくとも1つを単独で、あるいはSODと共に含有することを特
徴とする医薬組成物。 - 【請求項53】 糖尿病性網膜症などの糖尿病に付随する有害な影響の治療
および/または予防のため、請求項1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリ
マーの少なくとも1つを単独で、あるいはSODと共に含有することを特徴とす
る医薬組成物。 - 【請求項54】 ライ病の治療および/または予防のため、請求項1〜14
のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを単独で、あるいはS
ODと共に含有することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項55】 内毒素ショックの治療および/または予防のため、請求項
1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを単独で、あ
るいはSODと共に含有することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項56】 ウィルス、微生物、寄生生物、プリオンなどの病原性因子
の侵入の処置および/または予防のため、請求項1〜14のいずれかに記載の生
体親和性ポリマーの少なくとも1つを単独で、あるいはSODと共に含有するこ
とを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項57】 癌治療用の放射線療法で使用するため、請求項1〜14の
いずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを単独で、あるいはSO
Dと共に含有することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項58】 紫外線により誘発される影響の予防および/または治療の
ため、請求項1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つ
を単独で、あるいはSODと共に含有することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項59】 高血圧の予防および/または治療のため、請求項1〜14
のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なくとも1つを単独で、あるいはS
ODと共に含有することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項60】 外傷治療学上での組織の病変と苦痛の予防および/または
治療のための、請求項1〜14のいずれかに記載の生体親和性ポリマーの少なく
とも1つを含有することを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項61】 病変組織の部位まで活性因子を運ぶための請求項1〜4の
いずれかに記載のバイオポリマーの使用。 - 【請求項62】 活性因子が、治療因子または診断因子である請求項61に
記載の使用。
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