ES2545525T3 - Polímeros biocompatibles, composiciones que los contienen y su uso para la preparación de medicamentos - Google Patents

Abstract

Polímero biocompatible constituido por una secuencia de componentes idénticos o diferentes de la siguiente fórmula general (II) AaXxYyZz en la que: - A es un monómero de glucosa, - X es CH2COOH o CH2COO-Na+, - Y es -SO3H o -SO3 -Na+, - Z representa grupos químicos funcionales, excepto bencilamina y sulfonato bencilamina, idénticos o diferentes, y que son diferentes de X y Y, seleccionados entre aminoácidos, ácidos grasos, alcoholes grasos, ceramidas o derivados de los mismos, secuencias nucleotídicas de direccionamiento, agentes terapéuticos y agentes de diagnóstico, fijándose los grupos X, Y en el monómero A , - a representa el número de monómeros A, siendo la masa de dichos polímeros de fórmula AaXxYy mayor de 5.000 Daltons, - x representa una tasa de sustitución de todos los monómeros A por grupos X, que está entre el 20 y el 150%, - y representa una tasa de sustitución de todos los monómeros A por grupos Y, que está entre el 30 y el 150%, - z representa la tasa de sustitución de todos los monómeros A por grupos Z, en la que 0<z50%,

Description

E99932921

17-08-2015

DESCRIPCIÓN

Polímeros biocompatibles, composiciones que los contienen y su uso para la preparación de medicamentos.

5 La presente invención se refiere a polímeros biocompatibles novedosos, composiciones que los contienen y su uso.

Se conocen en la técnica anterior derivados poliméricos de dextranos obtenidos por sustitución por residuos carboximetilo, carboximetil-bencilamida y carboximetil-bencilamida-sulfonato. Estos polímeros, el proceso para su preparación y sus propiedades, se describen en la Patente Francesa Nº 2.461.724, así como en la Patente de

10 Estados Unidos Nº 4.740.594. Entre estos polímeros, algunos de ellos imitan las propiedades de la heparina y pueden usarse como productos de sustitución del plasma debido a sus propiedades anticoagulantes y anticomplementarias. Otros imitan una propiedad diferente de la heparina que consiste en una estabilización, protección y potenciación de la actividad biológica in vitro de los factores de crecimiento de la familia de los FGF (Tardieu y col., Journal of Cellular Physiology, 1992, 150, páginas 194 a 203).

15 Además, la Patente Francesa N 2.644.066 describe el uso de derivados de carboximetil-bencilamida-sulfonato de dextrano, denominados como CMDBS, en solitario o asociados a los FGF, para la cicatrización.

Más recientemente, las Patentes Francesas Nº 2.718.023, 2.718.024 y 2.718.026 propusieron el uso de polímeros

20 capaces de proteger, estabilizar y potenciar los factores de crecimiento que tienen una afinidad para la heparina, tal como los factores de crecimiento de los fibroblastos o FGF y Factor de Crecimiento Transformante beta (TGFβ), como un fármaco para el tratamiento de lesiones del tracto gastrointestinal, el sistema nervioso y los tejidos musculares, respectivamente. Para ilustrar este efecto protector de los derivados de dextrano CMBDS, estas patentes presentan los resultados de la digestión proteolítica por tripsina de FGF1, FGF2 o TGFβ. Estas propiedades

25 de protección, estabilización y potenciación de los factores de crecimiento con una afinidad para la heparina permitieron la caracterización de una nueva clase de polímeros, designados HBGFPP para indicar "Heparin-Binding Growth Factor Protector and Potentiator", que presentan actividades cicatrizantes y reparadoras en relación a los tejidos musculares, nerviosos y del tracto gastrointestinal, y que están desprovistos de actividad anticoagulante a las dosis empleadas.

30 Además de las aplicaciones de HBGFPP anteriores, la Patente Francesa Nº 2.718.025 propone el uso de estos polímeros como profármacos para el tratamiento de inflamaciones. Esta actividad antiinflamatoria se ilustra por la acción inhibidora in vitro frente a las enzimas proteolíticas implicadas en la reacción inflamatoria tal como la elastasa leucocitaria o la plasmina e in vivo por los estudios histológicos que demuestran una reacción celular inflamatoria

35 reducida en los tejidos tratados por derivados de dextrano CMDBS.

Maiga-Revel y col., 1997 (Carbohydrate polymers, vol 32, páginas 89-93) describe, además del CMDBS mencionado en la presente memoria descriptiva, cuatro derivados de dextrano diseñados CMDSu en el que D significa dextrano, CM grupos carboximetilo y Su grupos sulfato. Este artículo describe también que CMDSu tienen una actividad

40 anticoagulante por debajo de 3,5 UI/mg. Finalmente, la solicitud de patente DE 11 52 396 desvela derivados de dextrano funcionalizados por los grupos carboxilo y sulfato que tienen una actividad capaz de impedir la coagulación de la sangre, una actividad anti-complementaria y una actividad sobre la calcificación del plasma y el tiempo de trombina.

45 Sin embargo, estos derivados de dextrano CMDBS son compuestos que son difíciles de sintetizar y tienen el riesgo de salificar residuos conocidos por sus efectos tóxicos tal como bencilamina.

Además, las aplicaciones de los HBGFPP y, por lo tanto, de CMDBS propuestas en la técnica anterior se limitan únicamente a la reparación y cicatrización de ciertos tejidos.

50 La presente invención está especialmente diseñada para paliar estos inconvenientes ofreciendo polímeros biocompatibles novedosos fáciles de preparar y que presentan las propiedades de los HBGFPP pero también, de manera inesperada, propiedades novedosas que permiten campos de aplicación especialmente terapéuticos, que no se limitan a únicamente unos pocos tipos de órganos, tejidos o células particulares.

55 Por lo tanto, los polímeros de la invención se denominan a continuación como "RGTA" para "ReGeneraTing Agents (agentes de regeneración)".

Los polímeros de la invención

E99932921

17-08-2015

Los polímeros desvelados tienen una masa molar superior a aproximadamente 5.000 Daltons y están constituidos por una secuencia de motivos idénticos o diferentes de la siguiente fórmula general (I):

5 AaXxYy

en la que:

-A representa un monómero,

10 -X representa un grupo carboxilo fijado en un monómero A y que responde a la siguiente fórmula: -R-COO-R', en la que R es un enlace o una cadena hidrocarburo alifática, posiblemente ramificada y/o insaturada, y que puede contener uno o más anillos aromáticos, con la excepción de la bencilamina y sulfonato de bencilamina, y R' representa un átomo de hidrógeno o un catión, -Y representa un grupo sulfato o sulfonato fijado en un monómero A y que responde a una de las siguientes

15 fórmulas: -R-O-SO3-R', -R-SO3-R', en la que R es un enlace o una cadena hidrocarburo alifática, posiblemente ramificada y/o insaturada, y que puede contener uno o más anillos aromáticos, con la excepción de la bencilamina y sulfonato de bencilamina, y R' representa un átomo de hidrógeno o un catión, -a representa el número de monómeros A, que es de tal forma que la masa de los polímeros de fórmula (I) es superior a aproximadamente 5.000 daltons, y son polímeros biocompatibles constituidos por una secuencia de

20 motivos idénticos o diferentes de la siguiente fórmula general (II)

AaXxYyZz

en la que:

25 -A es un monómero de glucosa, -X est CH2COOH o CH2COO-Na+, -Y est -SO3H o -SO3 Na+, -Z representa grupos químicos funcionales, excepto bencilamina y sulfonato bencilamina, idénticos o

30 diferentes, y que son diferentes de X y Y, seleccionados entre aminoácidos, ácidos grasos, alcoholes grasos, ceramidas o derivados de los mismos, secuencias nucleotídicas de direccionamiento, agentes terapéuticos y agentes de diagnóstico, fijándose los grupos X, Y en el monómero A , -a representa el número de monómeros A, siendo la masa de dichos polímeros de fórmula AaXxYy mayor

35 de 5.000 Daltons, -x representa la tasa de sustitución de todos los monómeros A por grupos X, que está entre el 20 y el 150%, -y representa una tasa de sustitución de todos los monómeros A por grupos Y, que está entre el 30 y el 150%,

40 -z representa la tasa de sustitución de todos los monómeros A por grupos Z, donde 0%<z<50%, -x representa la tasa de sustitución del conjunto de monómeros A por los grupos X, que está entre aproximadamente el 20 y el 150%, preferiblemente en el orden del 50%, -y representa la tasa de sustitución del conjunto de monómeros A por los grupos Y, que está entre aproximadamente el 30 y el 150%, preferiblemente en el orden del 100%.

45 Ventajosamente, el radical R de los grupos X e Y en la fórmula (I) se selecciona entre un grupo alquilo, alilo, arilo, lineal o ramificado.

En la definición de la tasa de sustitución que se ha citado anteriormente, se entiende por una tasa de sustitución x

50 del 100% el hecho de que cada monómero A del polímero de la invención contiene estadísticamente un grupo X. De forma análoga, se entiende por una tasa de sustitución y del 100% el hecho de que cada monómero del polímero de la invención contiene estadísticamente un grupo Y. Las tasas de sustitución superiores al 100% manifiestan el hecho de que cada monómero tiene estadísticamente más de un grupo del tipo considerado. Por el contrario, las tasas de sustitución inferiores al 100% manifiestan el hecho de que cada monómero tiene estadísticamente menos de un

55 grupo del tipo considerado.

Los polímeros ofrecen la notable ventaja de presentar in vivo una degradabilidad lenta, que los diferencia de los heparán sulfatos que son productos que se degradan de forma natural y rápidamente por la heparinasa o heparitinasa. Además, los polímeros de la invención no contienen ni liberan productos tóxicos después de la

E99932921

17-08-2015

degradación, al contrario que CMDBS, que tienen grupos bencilamina.

Los monómeros A que constituyen los elementos base de los polímeros de fórmula I pueden ser idénticos o diferentes, y se seleccionan entre todos los tipos de monómeros, tales como, por ejemplo, los propuestos para 5 HBGFPP, tales como los azúcares, ésteres, alcoholes, aminoácidos, nucleótidos y similares. Entre estos, se da preferencia especialmente a las -osas, y especialmente la glucosa.

El número de monómeros A se define de tal forma que la masa de los polímeros de la invención sea superior a aproximadamente 5.000 daltons. En consecuencia, los RGTA pueden constituirse por diversas estructuras 10 polimerizables homoméricas, así como heteroméricas, tales como, por ejemplo: los copolímeros poliéster de biosíntesis o síntesis química, tales como los poliésteres alifáticos o aquellos de origen natural, tales como los polihidroxilalcanoatos. Además, son aplicables polisacáridos y sus derivados de origen bacteriano, tales como celulosa, xantano, dextrano y similares, extractos vegetales unicelulares o multicelulares, tales como almidón, celulosa vegetal o alginatos o sus derivados, los fucanos y sus derivados y similares, o extractos animales tales

15 como ácido hialurónico o quitina y similares, o productos de síntesis tales como los obtenidos por copolimerización. También pueden emplearse proteínas sintetizadas, tales como poliaminoácidos naturales o modificados químicamente, tales como, por ejemplo, colágeno, en la constitución de los polímeros de la invención.

La selección de la estructura polimérica de los RGTA se basa en las diversas formas de presentación que pueden

20 usarse dependiendo del tejido o del órgano a tratar o las características fisicoquímicas, tales como la solubilidad, la conformación especial con las soluciones, las suspensiones, los geles, polvos, esponjas, películas materiales moldeables compactos, materiales porosos, semiporosos o no porosos, materiales que se desmenuzan o materiales que no, materiales que se erosionan y materiales que no se erosionan, materiales que pueden colonizarse o materiales que no pueden colonizarse, etc.

25 La heparina o sus fragmentos con bajas propiedades anticoagulantes y heparán sulfatos naturales y sus fragmentos se excluyen del alcance de la presente invención ya que:

-Su actividad anticoagulante puede ser superior a 50 UI. De hecho, los polímeros de la invención están

30 desprovistos de actividad anticoagulante significativa, es decir, presentan una actividad inferior a aproximadamente 50 UI/miligramo en comparación con la de la heparina cuya actividad está en el orden de 150 a 170 UI/miligramo. -Muestran una biodegradabilidad bajo la acción de enzimas del tipo heparinasa o heparitinasa que es demasiado rápida para permitir los efectos biológicos obtenidos en el contexto de esta invención.

35 Los polímeros descritos también pueden comprender grupos químicos funcionales, designados Z, que son diferentes de X e Y, y capaces de conferir en los polímeros de la invención propiedades biológicas y fisicoquímicas complementarias. Por lo tanto, los grupos Z son útiles para conferir a los RGTA una mejor solubilidad o propiedades lipófilas que permitan una mejor difusión o penetración tisular, por ejemplo, aumentando las propiedades anfílicas,

40 permitiendo el cruce de la barrera hematoencefálica, etc. A título de ejemplo, los grupos Z, que pueden ser idénticos o diferentes, pueden ser aminoácidos, ácidos grasos, alcoholes grasos, ceramidas o derivados de los mismos, o secuencias nucleotídicas de direccionamiento.

Los grupos Z también pueden representar agentes activos idénticos o diferentes, tales como agentes terapéuticos o 45 diagnósticos, por ejemplo, un antiinflamatorio, antimicrobiano, antibiótico, etc., o una enzima, un factor de crecimiento, etc.

Los polímeros de la invención en los que Z está presente tienen la siguiente fórmula II:

50 AaXxYyZz

en la que:

-A es un monómero de glucosa,

55 -X es CH2COOH o CH2COO-Na+, Y es -SO3H o -SO3-Na+, Z representa grupos químicos funcionales, excepto bencilamina y sulfonato bencilamina, idénticos o diferentes, y que son diferentes de X y Y, seleccionados entre aminoácidos, ácidos grasos, alcoholes grasos, ceramidas o derivados de los mismos, secuencias nucleotídicas de direccionamiento, agentes

E99932921

17-08-2015

terapéuticos y agentes de diagnóstico, fijándose los grupos X, Y en el monómero A , a representa el número de monómeros A, siendo la masa de dichos polímeros de fórmula AaXxYy mayor de 5.000 Daltons,

5 x representa una tasa de sustitución de todos los monómeros A por grupos X, que está entre el 20 y el 150%, y representa una tasa de sustitución de todos los monómeros A por grupos Y, que está entre el 30 y el 150%, z representa la tasa de sustitución de todos los monómeros A por grupos Z, en la que 0<z≤50%,

10 los grupos Z pueden fijarse por covalencia directamente en los monómeros A o pueden fijarse por covalencia en los grupos X e/o Y.

Sin embargo, los grupos Z también pueden conjugarse con los polímeros de fórmula (I) por enlaces distintos de

15 enlaces covalentes, tales como interacciones iónicas o hidrófilas, dependiendo de la naturaleza de A, X e Y. Después, los polímeros de la invención pueden constituir un sistema de vectorización de Z. Por lo tanto, los polímeros de la invención son útiles para transportar un agente activo Z, tal como un factor de crecimiento o una enzima, al nivel del tejido lesionado o enfermo como se define a continuación en el contexto de las aplicaciones de los polímeros de la invención.

20 Los polímeros en los que los grupos R de X e Y o los grupos Z son capaces de inducir efectos tóxicos directamente

o después de la degradación no se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Entre los grupos Z excluidos de la invención pueden citarse los grupos que constituyen agentes mutagénicos o los conocidos como carcinogénicos o que muestran otras propiedades tóxicas. Éste es el caso de la bencilamina que puede

25 desprenderse a partir de un grupo bencilamida que contiene en CMDBS y cuyas propiedades carcinogénicas se conocen bien por el experto en la técnica (Wiessler M, y col., Carcinogenesis 1983; 4(7): 867 -871; Singer GM, y col., J Med. Chem. 1983; 26(3): 309-312). En consecuencia, CMDBS se excluye de los polímeros de la invención.

La invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas o diagnósticas que contienen al menos un

30 polímero de fórmula (II) como se ha definido anteriormente asociado en la composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden usarse en seres humanos, así como en animales. De hecho, con los HBGFPP descritos en la técnica anterior, los polímeros de la invención tienen las siguientes propiedades:

35 -Están desprovistos de actividad anticoagulante significativa, lo que significa que presentan una actividad inferior a aproximadamente 50 UI/miligramo en comparación con la heparina, cuya actividad está en el orden de 150 a 170 UI/miligramo. -Estabilizan y potencian los factores de crecimiento que muestran una afinidad para heparina y particularmente, a modo de ejemplo, FGF1 y/o FGF2 y TGFβ.

40 -Protegen estos factores frente a agentes proteolíticos, tales como la tripsina. -Inhiben las actividades de proteasa implicadas en el proceso inflamatorio, tal como, por ejemplo, elastasa leucocitaria o plasmina. -Ejercen un efecto cicatrizante en al menos los modelos presentados en las patentes citadas sobre los músculos, los nervios o el tracto gastrointestinal.

45 Por lo tanto, los polímeros descritos constituyen una nueva clase de agentes que promueven la reparación de los tejidos musculares y nerviosos y los del tracto gastrointestinal y que presentan, como se indica en la Patente de Estados Unidos Nº 5.693.625 para CMDBS, propiedades sobre la cicatrización cutánea y de la córnea o sobre hueso plano como se describe por Blanquaert F y col. (Bone, 1995; 17(6): 499 -506). Sin embargo, los polímeros de la

50 invención también presentan propiedades inesperadas con respecto a CMDBS. Como ejemplo, puede citarse el efecto de CMDBS sobre los defectos óseos en el cráneo (Blanquaert F y col., Bone, 1995; 17(6): 499 -506), que a priori no es aplicable al hueso largo. El hueso plano y el hueso largo son de una naturaleza completamente diferente ya que: -Son de origen embrionario diferente. El hueso plano es un derivado de las células del tejido conjuntivo, mientras

55 que el hueso largo es un derivado de las células cartilaginosas. -El hueso plano es un hueso esponjoso y, a diferencia del hueso largo, no contiene una cavidad medular. -El hueso plano no cicatriza de forma natural cuando hay una pérdida de sustancia, tal como tras una trepanación, como puede observarse por la ausencia de cicatrización en los cráneos procedentes de civilizaciones prehistóricas, tales como los Incas o los Egipcios (véase, por ejemplo, Evidence for stone age cranial surgery, 7000 BC, Nature,

E99932921

17-08-2015

1997, 367, 360). De manera sorprendente, los polímeros de la invención presentan efectos sobre la reparación de defectos óseos muy graves en el orden de un tercio de la longitud de la diáfisis de un fémur de rata. No sólo se observó una reparación con reforma de un tallo óseo, sino también el tallo se rellenó con médula, es decir, el tratamiento con RGTA condujo a la reforma de una cavidad medular verdadera mientras que en ausencia de RGTA,

5 el defecto simplemente se llenó con material óseo desorganizado. Lo mismo se aplica para las incisiones cutáneas ya que esta reparación es de una calidad tan alta que prácticamente no hay trazas de cicatriz.

Por lo tanto, la Invención pertenece más particularmente a los polímeros biocompatibles (II) que se han descrito previamente que están desprovistos de actividad anticoagulante significativa. Estos polímeros que presentan una 10 actividad anticoagulante inferior a aproximadamente 10 UI/mg en dosis únicas o semanales, comprenden:

-entre aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente 1 mg por cm3 cuando la aplicación es local, -entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg cuando la administración es a través de la ruta sistémica, por ejemplo, a través de la ruta intravenosa,

15 -entre aproximadamente 0,2 mg/kg y aproximadamente 500 mg/kg cuando la administración es a través de la ruta intramuscular, -entre aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 5 g/kg cuando se administra por vía oral.

La actividad anticoagulante de los polímeros de la invención en las dosis que se han indicado anteriormente es, para 20 una persona con un peso de aproximadamente 70 kg, inferior a:

-aproximadamente 10 UI para una aplicación local, -aproximadamente 100 UI para una administración intravenosa, -aproximadamente 500 UI para una administración intramuscular.

25 De forma destacada, los polímeros están desprovistos de actividad anticoagulante significativa en las dosis que se han especificado anteriormente, pero aún presentan la capacidad de conservar o restaurar la homeostasis tisular. Por lo tanto, la invención se refiere particularmente al uso de los polímeros que se han mencionado anteriormente para la preparación de un fármaco que es útil para la prevención o el tratamiento de disfunciones de la homeostasis tisular y que no presentan una actividad anticoagulante significativa.

30 De una manera completamente sorprendente, se ha descubierto que los polímeros de la invención pueden administrarse a través de rutas distintas de las descritas en la técnica anterior para CMDBS que únicamente contemplaban la administración local al tejido lesionado. Por lo tanto, es posible seleccionar entre los polímeros de la invención aquellos que sean adecuados, por ejemplo, debido a su solubilidad, para la ruta de administración

35 seleccionada: intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intraperitoneal, intraocular, en el líquido cefalorraquídeo o directamente en el sistema nervioso central para cruzar la barrera hematoencefálica, así como por vía oral. Todas estas rutas de administración, posiblemente incluso combinadas, han mostrado ser particularmente eficaces.

Por lo tanto, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas en las que el polímero de la invención está

40 relacionado con un vehículo farmacéutico en una forma que permite una administración oral, cutánea, subcutánea, tópica, intramuscular, intravenosa o intra-arterial o una administración en cualquiera de los compartimentos líquidos del organismo. Los estudios realizados en el marco de esta invención revelaron que los RGTA actúan especialmente dentro de las ventanas de dosis más allá de las cuales no siempre se obtuvieron efectos biológicos satisfactorios. Estas dosis eficaces óptimas se definen a continuación y dependen de la ruta de administración y el tipo de lesión.

45 Ventajosamente, de una manera que cubra completamente la superficie de la herida o llene el volumen de una lesión tisular, las composiciones farmacéuticas se dosifican para permitir la administración de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1 miligramo de polímero por centímetro cuadrado o de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 1 miligramo de polímero por centímetro cúbico de tejido a tratar. Así, la composición de la

50 invención contiene preferiblemente entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 miligramos de polímero por mililitro de solución fisiológica de disolución.

Para la administración a través de la ruta sistémica (venosa, arterial), a través de la ruta intraperitoneal o la ruta intraocular, en el líquido cefalorraquídeo, en el líquido intracoclear o en cualquier fluido peritisular o intratisular, las 55 composiciones de la invención se dosifican para permitir una administración de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 100 miligramos de polímero por kilogramo de peso del humano o animal que se va a tratar.

Para una administración a través de la ruta intramuscular, las composiciones de la invención se dosifican para permitir una administración de entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 500 miligramos de polímero por

E99932921

17-08-2015

kilogramo de peso del ser humano o animal que se va a tratar, preferiblemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 mg por kg.

Para una administración oral, las composiciones de la invención se dosifican para permitir una administración de 5 entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5000 miligramos de polímero por kilogramo de peso del ser humano o animal que se va a tratar, preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 500 mg por kg.

Además, las propiedades que se han indicado previamente de los HBGFPP, es decir, que presentan una actividad cicatrizante y reparadora sobre los tejidos musculares y nervioso y sobre los del tracto gastrointestinal, y que pueden

10 usarse como fármacos para el tratamiento de inflamaciones, los inventores han demostrado los efectos sorprendentes de los polímeros de la invención sobre la regulación de la homeostasis de la masa y la funcionalidad de los tejidos y los órganos, demostrando que actúan sobre la regeneración, protección, conservación y envejecimiento tisular y celular in vivo y ex vivo, así como las actividades antifibróticas y actividades protectoras contra los efectos perjudiciales de las isquemias, la radiación ionizante y los productos de oxidación inducidos por

15 enfermedades o estrés o derivados de la alimentación. En consecuencia, los RGTA deben considerarse reguladores de la homeostasis tisular puesto que regulan la masa de los tejidos regenerados y actúan sobre la reorganización de la matriz ya que ejercen un efecto antifibrótico y cicatricial sobre los tejidos y los órganos sometidos a procesos destructivos agudos, así como crónicos.

20 Estas propiedades de los RGTA se caracterizan por efectos únicos sobre la calidad y la velocidad de las reparaciones tisulares. Estos efectos se traducen en una reconstitución casi completa e idéntica de la estructura tisular original (antes de la lesión) y en la ausencia casi completa de trazas cicatriciales tales como, en particular, signos de fibrosis o pérdida de su integridad funcional. Más particularmente, los resultados de búsqueda que se presentarán a continuación en la parte experimental demostraron las propiedades de protección y de regeneración

25 tisular in vivo de los RGTA en los siguientes modelos:

-lesión de heridas cutáneas, -regeneración de tejidos óseos, tales como huesos largos con el ejemplo del fémur, -protección frente a la pérdida de tejido óseo y regulación de su restauración en un modelo de enfermedad

30 periodontal crónica, -protección frente a los efectos perjudiciales de la radiación ionizante, -protección frente a los efectos perjudiciales de las isquemias independientemente de su ubicación.

Por lo tanto, las propiedades que se muestran a continuación de los polímeros de la invención se han demostrado 35 particularmente:

-Un efecto protector frente a los efectos perjudiciales vinculados al estrés oxidativo y a los agentes de oxidación. Los polímeros de la invención actúan en particular como agentes protectores y potenciadores de enzimas, tales como superóxido dismutasa o SOD. Esta propiedad permite contemplar el uso de los

40 polímeros de la invención para la preparación de un fármaco diseñado para el tratamiento y/o la prevención de lesiones y trastornos inducidos por estrés oxidativo y los agentes de oxidación. Pero esta propiedad también permite usar los polímeros de la invención en solitario o junto con otro compuesto como un conservante para alimentos o nutrientes que contienen de forma natural antioxidantes a los que se les añadieron antioxidantes, tales como SOD animal o vegetal.

45 -Un efecto conservante y protector frente a isquemias. Esta propiedad permite contemplar el uso de los polímeros de la invención para la preparación de un fármaco diseñado para el tratamiento y/o la prevención de patologías relacionadas con hipoxia, con degeneración celular, tales como las neuropatías, miopatías, hepatopatías, nefropatías, cardiopatías y similares, y a las peroxidaciones de moléculas, tales como los lípidos. Esta propiedad también permite usar los polímeros de la invención en composiciones para la

50 conservación de la funcionalidad de los tejidos y los órganos, especialmente con el fin de su conservación, el transporte de órganos ex vivo, trasplantes de órganos, su injerto, así como prótesis. -Una actividad inhibidora frente a las enzimas de la familia de las calpaínas. Esta propiedad permite contemplar el uso de los polímeros de la invención para la p-reparación de un fármaco diseñado para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades cardiacas y enfermedades del sistema nervioso central.

55 -Una actividad inhibidora de la degradación de las enzimas de heparina o los heparán sulfatos, tales como heparinasa o heparitinasa. Esta propiedad permite contemplar el uso de los polímeros de la invención para la preparación de un fármaco diseñado para el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades relacionadas con un crecimiento anárquico de las células y los procesos patológicos en relación con la angiogénesis.

E99932921

17-08-2015

-Una acción de las células protectoras frente a los efectos de la radiación ionizante y de regulación tanto cuantitativa como cualitativa de los constituyentes de la matriz celular, tales como, por ejemplo, los colágenos, que permite aumentar la supervivencia y función de las células. Esta actividad permite

5 contemplar el uso de los polímeros de la invención para la preparación de un fármaco diseñado para el tratamiento y/o la prevención de los efectos perjudiciales de la radiación ionizante, así como el uso de estos polímeros en la preparación de productos cosméticos. -Una actividad antifibrótica que se manifiesta in vitro e in vivo por los efectos reguladores sobre la proliferación de célula mesenquimales, tales como las células del músculo liso, fibroblastos o células

10 hepáticas, y la calidad del tipo de colágeno que secretan, así como una actividad sobre la calidad fenotípica de los colágenos sintetizados por estas células y por la reducción notable de las secuelas cicatriciales fibróticas. Esta actividad permite contemplar el uso de los polímeros de la invención para la preparación de un fármaco diseñado para el tratamiento y/o la prevención de patologías pulmonares, renales, hepáticas, cardiacas, vasculares y dermatológicas, así como patologías de injertos y su integración funcional, de

15 múltiples derivados vinculados al parasitismo.

Por lo tanto, de forma inesperada, los inventores descubrieron que los RGTA tenían la capacidad de:

-proteger, estabilizar las actividades enzimáticas de la superóxido dismutasa o SOD, 20 -potenciar las actividades enzimáticas de la superóxido dismutasa o SOD.

Por lo tanto, esta enzima puede protegerse in situ e in vivo o ex vivo. Por lo tanto, los RGTA pueden usarse en solitario como agentes protectores de la SOD endógena y en esta función protegen la SOD en todas sus funciones o pueden usarse junto con SOD en las indicaciones conocidas por los expertos en la técnica en todos los campos

25 terapéuticos y cosméticos. Debido a esta propiedad, los RGTA también actúan como conservantes de alimentos o nutrientes.

Los RGTA actúan como agentes protectores y reparadores de los efectos perjudiciales relacionados con el estrés tisular. Por lo tanto, en la isquemia, independientemente de su origen o en respuesta a una agresión celular o tisular, 30 por ejemplo, bajo el efecto de la radiación ionizante, o en respuesta a una invasión por un agente patógeno, independientemente de que sea vírico, microbiano, parasitario o incluso del tipo que causa patologías del tipo TSSE (Transmissible Subacute Spongiform Encephalopathies (Encefalopatías espongiformes subagudas transmisibles)), tales como priones, o durante una ruptura vascular causada por hemorragias cuyos efectos son perjudiciales causando pérdidas funcionales, por ejemplo, en el caso de hemorragias de los vasos retinianos que pueden

35 conducir a ceguera o en el cerebro que puede conducir a una pérdida de funciones motoras u otras.

En consecuencia, la invención pertenece a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un RGTA en los campos de aplicación tanto humano como animal. Estas composiciones son beneficiosas en los campos médico, veterinario y cosmético, así como en los campos alimentario, como conservantes de alimentos o nutrientes que

40 contienen naturalmente antioxidantes o a los que se les añaden antioxidantes, tales como SOD animal o vegetal.

Las cualidades protectoras de la SOD endógena o SOD que se proporciona de forma exógena se refuerzan por los RGTA. Por lo tanto, los RGTA pueden administrarse en todos los casos en los que se han descrito los efectos beneficiosos de la SOD.

45 Para el tratamiento de enfermedades en las que la SOD suministrada de forma exógena ha mostrado ser eficaz, los efectos terapéuticos resultantes del efecto protector de la SOD endógena pueden actuar entonces más eficazmente en presencia de RGTA. Los RGTA limitan o evitan la actuación de la captación exógena indirectamente como agentes antioxidantes. Los siguientes efectos terapéuticos resultan de estos efectos:

50 -Una protección frente a las agresiones de una enfermedad o degeneración de los tejidos nerviosos. Por ejemplo, en el estrés (Shahen y col., Effects of various stressors on the level of lipid peroxide antioxidants and Na+, K+ -ATPase activity in brain, Experentia, 1996,52, 336 -339) o la degeneración neuronal y las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con accidentes vasculares, accidentes traumáticos o en

55 patologías, tales como Parkinson, en los que la actividad protectora de la SOD endógena permite un efecto más intenso (Bostantjopoulos y col., Superoxide dismutase activity in early and advanced Parkinson's disease, Funct. Neurol., 1997, 12, 63 -68). -El envejecimiento debido a un efecto antiapoptosis (Fernandez Novoa y col., Methods Find Exper Clin Pharmacol, 1997, 9, 99-106).

E99932921

17-08-2015

-Una protección antioxidante en isquemias de las articulaciones. En esta aplicación, los RGTA pueden administrarse en solitario. La protección proporcionada por el tratamiento con la SOD en solitario se reforzará por la administración de los RGTA. En vista de las propiedades descritas, las de los RGTA serán beneficiosas cuando se administran en solitario y/o junto con la SOD en las numerosas aplicaciones que

5 describen los efectos de la SOD (D’Agnillo and Chang, Reduction of hydroxyl radical generation in a rat hind limb model of ischemia -reperfusion injury using cross-linked hemoglobin -superoxide dismutase -catalase, Artif. Cells Blood Substiti Immobil Biotechnol, 1997, 25, 163 -80). -La administración de los RGTA en solitario o junto con la SOD serán beneficioso frente a trastornos del corazón, el cerebro y el sistema nervioso central como en el caso de lesiones de la médula espinal

10 (Nakauchi y col., Effects of lecithinized superoxide dismutase on rat spinal cord injury, J. Neurotrauma, 1996, 13, 573 -82) o de la retina. -En el tratamiento de insuficiencias respiratorias relacionadas con la fatiga diafragmática (Supinski y col., Effects of free radical scavengers on diaphragmatic fatigue, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1997, 155, 622). Esto puede ser particularmente interesante en pacientes con distrofia muscular.

15 -Todos los tejidos, especialmente aquellos para los que el nivel de SOD activa endógena es mayor (células endoteliales vasculares, en el hígado, los riñones, los músculos cardiacos y esqueléticos, el páncreas, las células epiteliales de la mucosa intestinal, el colon, la traquea, el esófago, el tejido conectivo y el cartílago). -El tratamiento de los efectos perjudiciales relacionados con la diabetes, tales como las retinopatías diabéticas (Szabo y col., Direct measurement of free radicals in ischemic/reperfused diabetic rat retina, Clin.

20 Neurosci., 1997, 4, 240 -5). -El tratamiento de la lepra (Serum, zinc, copper, magnesium, proteins and superoxide dismutase in leprosy patients on multidrug therapy -a follow-up study, Indian J. Lepr., 1996, 68, 325 -53). -En el tratamiento del choque endotóxico (Hepatic response to the oxidative stress induced by E. coli endotoxin, Mol. Cell. Biochem. 1996, 159, 115 -121).

25 -En el tratamiento de las lesiones inducidas por el estrés causado por la presencia de agentes patógenos de todos los tipos, especialmente virus, incluyendo el virus del SIDA, o los agentes que inducen TSSE, tales como los priones. -En el tratamiento preventivo y/o curativo frente a irradiaciones. Por lo tanto, los efectos adversos de la radioterapia pueden reducirse por un tratamiento preventivo y/o curativo con los RGTA. El uso de los RGTA

30 permite la reducción de la dosis de radioterapia en condiciones de tratamiento contra el cáncer (Prevention of radioinduced cystisi by orgotein, a randomized study, Anticancer Res., 1996, 16, 2025 -8) o permite la prevención de los efectos clastógenos inducidos por la irradiación. Los efectos hipertérmicos relacionados con la radioterapia pueden disminuirse por el uso de RGTA de la misma manera que la SOD (Kandasamy y col., Involvement of superoxide dismutase and glutathione peroxidase in attenuation of radiation-induced

35 hyperthermia by interleukin 1 alpha in rats, Brain Res., 1993, 606, 106 -10). -En la protección contra los efectos inducidos por la radiación Ultravioleta, por ejemplo sobre la retina. (Oguni y col., Chronic retinal effects by ultraviolet irradiation with special reference to superoxide dismutase, Histol. Histopathol., 1996, 11, 695 -702) y el tratamiento de la uveitis (Koch y col., Effects of different antioxidants on lens-induced uveitis, Ger. J. Ophthalmol., 1996, 5; 1185 -8). El tratamiento con RGTA

40 puede ser en solitario o en combinación con SOD y su uso puede ser médico, así como cosmético. -En el tratamiento de la hipertensión. De hecho, la actividad de la SOD endógena se disminuye en sujetos con hipertensión (Jun Ke Yan y Catalano, Increased superoxide anion production in humans, a possible mechanism for the pathogenesis of hypertension, J. Hum. Hypertens. 1996, 10, 305 -309). La captación de RGTA puede tener el efecto de aumentar esta actividad y reducir la hipertensión.

45 -En el tratamiento de las enfermedades inflamatorias, tales como la artritis.

Los RGTA también son útiles para la conservación de órganos o tejidos, así como en el mantenimiento de fluidos biológicos de tal forma que puedan contemplarse las siguientes aplicaciones:

50 -En los fluidos biológicos, tales como la sangre y sus constituyentes celulares, por ejemplo, en la hemodiálisis. -Para la conservación de órganos en el caso de injertos o el tratamiento ex vivo o en la reperfusión (Razak y col., Cross-linked hemoglobin-superoxide dismutase-catalase scavenges free radicals in a rat model of intestinal ischemia-reperfusion injury, Artif. Cells Blood Substiti Immobil. Biotechnol. 1997, 25, 181 -192). La

55 adición de RGTA a soluciones para la conservación de órganos y los administrados en reperfusión permite la conservación de estos órganos.

La invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un polímero como se ha definido anteriormente y destinado al tratamiento y/o prevención de lesiones y trastornos tisulares, tales como los

E99932921

17-08-2015

encontrados en traumatología, que requieren cirugía reparadora o plástica de suelos cutáneos o más profundos, tales como los de los músculos, hueso, cerebro, corazón, vísceras, etc., en las enfermedades degenerativa posiblemente relacionadas con la fibrosis, en la pérdida de masa tisular, tal como osteoporosis o miopatías, en los campos cardiovascular y neurológico, en dermatología, etc.

5 Una propiedad notable de los RGTA es su capacidad para fijarse a los tejidos dañados, lo que permite el uso de los RGTA como vectores de direccionamiento en un objetivo terapéutico y/o diagnóstico. En consecuencia, los polímeros de la invención pueden acoplarse a moléculas, representadas anteriormente por el grupo Z, dotadas de actividades terapéuticas o a moléculas que facilitan la reparación del tejido dañado.

10 Otras ventajas y características de la invención se harán más evidentes a partir de los siguientes ejemplos de interés, por un lado, la preparación de polímeros de la invención en los que la estructura del polímero es del tipo poliéster o de una naturaleza polisacárida, por otro lado, las propiedades de los polímeros de la invención.

15 A) PREPARACIÓN DE LOS POLÍMEROS DE LA INVENCIÓN

EJEMPLO 1: Síntesis de derivados de poli (ácido β-málico) de una estructura no polisacárida

En este ejemplo, el polímero es un copolímero de ácidos β-málicos de fórmula general (II), cuyos motivos A, 20 sustituidos por X y/o Y y/o Z, se representan en la figura 1. En la figura 1:

A es -(O-CH2-CH2-CO)-X es -COON o -COO-Na+ Y es -CO-CH2-CHOH-CH2-SO3H o -CO-CH2-CHOH-CH2-SO3-Na+

25 Z es -CO-OCH3-CH(CH2-CH3)-CH3 x, y y z corresponden a los porcentajes de los grupos X, Y y Z mostrados en la Tabla I que se indica a continuación en relación con los diferentes polímeros sintetizados.

Tabla I

Referencia

Tipo de polímero Grupos carboxílicos = X Grupos sulfonato = Y Grupos hidrófobos = Z

RGTA 2010

Pcoo 100% 0% 0%

RGTA 2011

P1S 60% 10% 10%

RGTA 2012

P2S 75% 11% 12%

30 Pcoo-corresponde a un polímero compuesto exclusivamente por grupos carboxílicos o carboxilato X.

P1S y P2S corresponden a polímeros compuestos por grupos sulfonato Y y grupos butilo hidrófobos Z además de los grupos X,

35 La síntesis de este polímero pasa por la preparación de β-lactonas β-sustituidas y se sigue de una polimerización aniónica mediante apertura de anillo. Las tres β-lactonas sintetizadas se muestran en la figura 2.

Los monómeros se obtienen a partir de ácido DL-aspártico en cuatro etapas antes de la polimerización como se 40 muestra en la figura 3.

La síntesis del malolactonato de alquilo se realiza a partir de ácido DL-aspártico donde R representa -CH2-C6H5 (malolactonato de bencilo) o -CH(CH3)-CH2-CH3 (malolactonato de 2-butilo) o CH2-CH=CH2 (malolactonato de alilo).

45 I -Síntesis de los monómeros (ruta de ácido aspártico)

1) Síntesis de ácido (2R,S) bromosuccínico

La síntesis de ácido (2R,S) bromosuccínico se obtiene después de una reacción de diazotación de ácido DL50 aspártico. Para esta reacción, el carbono que tiene el grupo amina experimenta una doble inversión de configuración (Guerin y col., Optically active poly(β-malic acid), 1985, Polymer Bulletin, 14: 187).

E99932921

17-08-2015

Se disuelven 100 g (0,75 moles) de ácido DL-aspártico y 415 g (4,04 moles; 5,5 equiv.) de bromuro sódico en 1620 mililitros de ácido sulfúrico 2 N en un baño de hielo. Después, se añaden en pequeñas cantidades 62 g (0,9 moles; 1,2 equiv.) de nitrito sódico, en agitación. Treinta minutos después del final de esta adición, el medio de reacción se

5 neutraliza con 8 g (0,13 moles; 0,18 equiv.) de urea durante 30 minutos a temperatura ambiente. El ácido bromosuccínico se extrae con 1 litro de acetato de etilo y la fase acuosa se lava con 1 litro de acetato de etilo. Las fases orgánicas se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran en un embudo Büchner y después el acetato de etilo se elimina en un evaporador rotatorio.

10 Después, el ácido bromosuccínico se recristaliza 4 veces en acetonitrilo, se filtra en un embudo Büchner y después se seca durante 4 h a 45 ºC al vacío en un desecador.

Características: PM = 197; m = 52,8 g; Rendimiento del 36%; p.f. = 168 ºC; aspecto: polvo de color blanco.

15 2) Síntesis de monoésteres

La síntesis de monoésteres comprende la preparación anterior del anhídrido sin racemización de los centros quirales. El anhídrido se sintetiza a partir de ácido (2R,S) 2-bromo-succínico bajo la acción de un agente deshidratante, anhídrido trifluoroacético (TFAA), en condiciones anhidras y en una atmósfera de nitrógeno. La

20 siguiente etapa es la apertura del anhídrido por un alcohol que conduce a dos monoésteres, únicamente uno de los cuales será lactonizable. La elección del alcohol se basa en la naturaleza de la lactona deseada.

a) Síntesis de bromosuccinato de bencilo

25 Se desgasifican 50 g (0,25 moles) de ácido bromosuccínico en una corriente de nitrógeno durante 2 h. En un baño de hielo, se añaden gota a gota 125 mililitros de tetrahidrofurano anhidro (THF) y después 43,4 mililitros (0,30 moles; 1,2 equiv.) de anhídrido trifluoroacético (TFAA) mediante un embudo de adición por goteo. La solución se deja durante 2 h a temperatura ambiente en agitación, después el THF, el TEA formado y el TFAA en exceso se eliminan en el evaporador rotatorio. El anhídrido bromosuccínico se deja desgasificar durante 2 horas.

30 Después, se añaden 27,7 mililitros (0,25 moles; 1 equiv.) de alcohol bencílico. La solución se agita a 40 ºC en una atmósfera inerte durante 12 h. La mezcla de monoésteres obtenida de esta manera se disuelve en 150 mililitros de éter. La fase eterizada se lava 3 veces con 100 mililitros de agua, se seca sobre sulfato de magnesio y se filtra en un embudo Büchner.

35 Características: PM = 287; m = 71,3 g; Rendimiento del 95%; aspecto: aceite de color amarillo pálido.

b) Síntesis de bromosuccinato de alilo

40 Se usa el mismo protocolo que se ha empleado previamente pero se añaden 17,86 mililitros (0,25 moles; 1 equiv.) de alcohol alílico. El medio de reacción se agita durante 22 h a 60 ºC en una atmósfera inerte en lugar de 12 h a 40 ºC. Los monoésteres se purifican de manera idéntica.

Características: PM = 237; m = 17,6 g; Rendimiento del 72,8%; aspecto: aceite viscoso.

45 c) Síntesis de bromosuccinato de 2-butilo

El mismo protocolo que anteriormente en 2)b), pero con 18,8 g (1 equiv.) de (RS)2-butanol que se ha destilado de antemano. El medio de reacción se agita durante 12 horas a 60 ºC en una atmósfera inerte.

50 Características: PM = 253; m = 45 g; Rendimiento del 90%; aspecto: aceite de color amarillo anaranjado.

3) Síntesis de las lactonas

55 La reacción de lactonización se realiza en el único monoéster lactonizable y presenta una inversión de configuración. Se realiza directamente en la mezcla de monoésteres después de la neutralización a pH 7,2 con sosa 2 N. La reacción tiene lugar en un medio bifásico de diclorometano/agua. La lactona se purifica por cromatografía en columna sobre sílice. La naturaleza del eluyente varía dependiendo de la naturaleza de la lactona. Después, esta lactona se destila en una columna apropiada.

E99932921

17-08-2015

a) Síntesis de malolactonato de bencilo

Se disuelven 71 g (de los cuales el 70% es monoéster lactonizable, es decir, 0,173 moles) de la mezcla de

5 monoésteres en 300 mililitros de éter y 250 mililitros de agua en un globo. Se añade gota a gota una solución 2 N de hidróxido sódico hasta alcanzar un pH 7,2, y después se añaden 450 mililitros de diclorometano. El matraz se pone en un sistema refrigerante y el sistema bifásico se agita fuertemente durante 3 h a 40 ºC.

Después de la decantación, la fase orgánica se lava 2 veces con 250 mililitros de agua y después 2 veces con 250

10 mililitros de salmuera, se seca sobre sulfato y se filtra. El disolvente se elimina en el evaporador rotatorio. Esta lactona se purifica en una columna de sílice (eluyente: 8/2 de diclorometano/éter de petróleo) y se destila 3 veces al vacío.

Características: PM = 206; m = 20,7 g antes de la purificación, es decir, un rendimiento del 40,5%; m = 3,41 g 15 después de la purificación, es decir, un rendimiento del 6,7%; Te = 116-118 ºC en 3·10-2 mbar; IR (n, cm-1); n(CO lactona) = 1825 cm-1; n(CO éster) =1740 cm-1; aspecto: aceite incoloro.

b) Síntesis de malolactonato de alilo

20 Según el mismo protocolo anteriormente en 3)a), pero el pH de la fase acuosa es 7,8 en lugar de 7,2 y la solución se agita durante 5 h en lugar de 3 h. La lactona se purifica sobre columna de sílice (eluyente: 4/6 de éter de petróleo/éter dietílico) y se destila 3 veces al vacío.

Características: PM = 156; m = 15,3 g antes de la purificación, es decir, un rendimiento del 53,4%; m = 4 g después 25 de la purificación, es decir, un rendimiento del 13%; Te = 62-65 ºC en 3·10-2 mbar; IR (n, cm-1): n(CO lactona) = 1825 cm -1; n(CO éster) = 1740 cm-1; aspecto: líquido incoloro.

c) Síntesis de malolactonato de 2-butilo

30 Se emplea el mismo protocolo que en 3)a) anteriormente. La lactona se purifica en una columna sobre sílice (eluyente: 8/2 de diclorometano/éter de petróleo) y se destila 3 veces al vacío.

Características: PM = 172; m = 26,7 g antes de la purificación, es decir, un rendimiento del 55%; m = 14,4 g después de la purificación, es decir, un rendimiento del 28%; Te = 80-65 ºC en 3·10-2 mbar; IR (n, cm-1): n(CO lactona) = 1825 35 cm -1; n(CO éster) = 1740 cm-1; aspecto: aceite viscoso incoloro.

II -Síntesis de los polímeros

Las lactonas se polimerizaron en presencia de amonio benzoato de tetrametilo (10-3 equiv.) a 37 ºC durante 15 días. 40 La polimerización se controló por análisis de infrarrojos con observación de la desaparición de la banda de lactona a 1850 cm-1 .

1) Síntesis de alil butil-co-malato bencilo-co-malato polimalato

45 Se desgasifican 5 g (24,2 mmoles) de malolactonato de bencilo, 1,4 g (9,3 mmoles) de malolactonato de alilo y 0,7 g (4,1 mmoles) de malolactonato de butilo durante 2 h y se transfirieron a través de una cánula en un globo que contiene 471 mililitros de una solución de cebador (benzoato de tetraetillamonio: 10-3 equiv.; 37,72·10-6) a 80·10-3 M que se desgasificó por adelantado durante 2 h en una corriente de nitrógeno. La copolimerización se realizó a 37 ºC durante 15 días en una atmósfera interna y en agitación. Después, el polímero se disolvió en un mínimo de

50 cloroformo. Las cadenas se terminaron mediante la adición de una gota de ácido clorhídrico concentrado y el polímero se precipitó con etanol y después se secó al vacío a 40 ºC durante 48 h.

Características; m = 4,37 g; rendimiento el 61,5%; Tv = -5 ºC; IR (n, cm-1): n(C=O) = 1748 cm-1; SEC (THF, estándar poliestireno); Mn = 6600; PM = 9200; Ip = 1,4; MSEC = 10.000; S 134 (CH=); 168 (C=O cadena lateral); 170 (C=O 55 cadena principal); aspecto: polímero vítreo transparente.

2) Epoxidación de alil butil-co-malato bencil-co-malato polimalato

Se disuelven 1,12 g (7,91 mmoles de unidades insaturadas) de polímero en 3 mililitros de diclorometano anhidro en

E99932921

17-08-2015

un globo. Se añade mediante una cánula una solución que contiene 466,34 miligramos (4,69 mmoles; 6 equiv.) de ácido metacloroperbenzoico (MCPBA) en 2 mililitros de diclorometano. La mezcla se agita durante 24 horas a temperatura ambiente. Después, el polímero se precipita con etanol y se seca en un desecador al vacío.

5 Características: m = 4 g; rendimiento de precipitación del 92%; rendimiento de la reacción de epoxidación del 100%.

La masa molar no cambió tras la epoxidación ya que MCPBA no induce una modificación de longitud de cadena.

3) Hidrogenólisis de alil butil-co-malato bencil-co-malato polimalato

10 Se disuelven 4 g del polímero en 5 mililitros de dioxano recién destilado en sodio en un globo. Se añaden 800 miligramos (20% en peso) de paladio sobre carbón activo y la hidrogenólisis se inicia. Cuando el volumen de hidrógeno consumido no aumenta más (24 h después del comienzo de la reacción), la hidrogenólisis se detiene. La solución se filtra sobre Celite y el dioxano se elimina en el evaporador rotatorio.

15 Características: m = 2 g; rendimiento de hidrogenólisis del 100%.

4) Sulfonación de alil butil-co-malato bencil-co-malato polimalato

20 Se disuelven 4 g de polímero (es decir, 5,64·10-3 moles de epóxido ) en 20 mililitros de agua. Se añaden 2,14 g de bisulfito sódico (2 equiv., 11,28·10-3 moles). El pH de la solución se ajusta a 7,4 (Housse-Ferrari, "Preparation and characterization of porous silicas modified by polymers and copolymers of N,N1-dimethyl acrylamide", Thesis, University of Paris VI, 30 enero de 1990). La solución se deja en agitación durante 7 h en hielo, después se ultrafiltra durante 24 h a 4 ºC contra agua y se liofiliza.

25 La figura 4 resume las etapas de síntesis de los derivados de poli(ácido β-málico).

EJEMPLO 2: Síntesis de polímeros polisacáridos constituidos por motivos de glucosa sustituidos

30 I -Síntesis de carboximetil dextrano sulfatos designados CMDS

En este ejemplo, el polímero de la invención se constituye por dextrano sustituido en el que los motivos de glucosa A sustituidos por X y/o Y y en los que Z es nada se representan en la figura 5. Los diferentes tipos de inserto se muestran en la figura 5 en la que:

35 A es un monómero de glucosa en el que X, Y y Z se injertan por medio de las funciones hidroxilo en la posición 2 y/o la posición 3 y/o la posición 4 y/o por medio de los grupos Y para Z, X es -CH2COOH o -CH2COO-Na+ Y es -SO3H o SO3Na+

40 Z es un grupo variable, varios ejemplos del cual se presentan a continuación.

Los polímeros de tipo CMDS en los que Z = nada contienen múltiples tipos de monómeros. Los primeros tipos de monómeros sustituidos son la carboximetil glucosa de tipo A-X sustituida en la posición 2 y/o 3 y/o 4 (motivos presentados en la figura 5). La adición del grupo Y = (motivos A-Y representados en la figura 5) corresponde a una

45 O-sulfatación y se convierte en, con R = nada y R1 = H+ o Na+, Y = O-SO3-H+/Na+. Si Y se fija en X, R de Y se convierte en CH2-CO y la funcionalidad perdida de X (COO-) ya no se considera que exista. Después, se convierte en parte de Y y entra en la medición de los porcentajes de sustitución de los grupos activos Y.

Por lo tanto, los diferentes monómeros que constituyen el polímero CMDS son glucosa no sustituida o glucosa

50 carboximetilo o glucosa sulfato o glucosa carboximetil sulfato. Las formas isoméricas diferentes se representan en diagrama en la figura 5. Por lo tanto, los polímeros corresponden a todas las combinaciones posibles de las diferentes formas monoméricas y se definen por la tasa residual de los grupos X e Y libres.

Los monómeros obtenidos de esta manera son glucosa sulfato en la posición 2, 3 y/o 4 y/o glucosa carboximetil 55 sulfato. El sulfato se fija sobre la glucosa o sobre el grupo carboxílico.

Por lo tanto, en la figura 5, en la que los enlaces de los grupos esquematizados por una línea de puntos representan los monómeros en los que pueden contemplarse todas las combinaciones circulares.

E99932921

17-08-2015

1) Síntesis de carboximetil dextrano sulfato denominado CMnDSm

a) Carboximetilación

5 La primera etapa de carboximetilación de dextrano se realiza de acuerdo con el protocolo descrito en Mauzac y col. (Mauzac y col., Anticoagulant activities of dextran derivatives. Part I: Synthesis and characterization, 1984, Biomaterials 6/61 -63). Comprende una eterificación de las funciones hidroxilo de los residuos de glucosa del dextrano con el fin de obtener un carboximetil dextrano. Esta reacción puede reproducirse múltiples veces y da como resultado productos denominados CMnD en los que n representa el número de etapas de carboximetilación. Los

10 diversos productos denominados CMnD se caracterizan por un porcentaje creciente de COOH. Por lo tanto, este proceso permite obtener diferentes tasas de carboximetilación del dextrano como se indica en la tabla de la figura 6.

Por lo tanto, en un globo refrigerado de 250 mililitros, Dextrano T40 (37,37 g, 9,34 10-4 mol), de Sigma y de peso molecular 40.000 D, se solubiliza (182 mililitros de agua destilada) a 4 ºC. Se vierte lentamente una solución de sosa

15 (74 g, 1,85 mol en 124 mililitros de agua destilada), también enfriada a 4 ºC, en la solución de dextrano mientras que se mantiene constante la temperatura de 4 ºC. Se añade lentamente ácido monocloroacético (75,2 g, 0,806 mole), reducido a un polvo fino, mientras que se mantiene la misma temperatura de reacción. Sin embargo, la temperatura del medio de reacción se eleva al final de la reacción de 4 ºC a 21 ºC en varios minutos. Después, la mezcla se lleva a 50 ºC en un baño de aceite termostatizado durante 40 minutos. Durante el calentamiento, el medio de reacción

20 adquiere una coloración amarilla. Después de la refrigeración, el pH se neutraliza a 7,2 con ácido acético glacial (Takakura, 1990). El carboximetil dextrano se recoge por precipitación en etanol absoluto frío (de 5 a 6 veces el volumen de reacción). Después, se seca en un horno al vacío. El polímero CM1D se purifica por ultrafiltración y después se liofiliza (masa = 56 g en bruto).

25 La presencia de los iones carboxílicos se cuantifica por cuantificación ácido-básico inversa usando ácido nítrico. La base usada es sosa 1 N. El resultado se expresa en % de grupos COOH. % de COOH de CM1D = 48,98%.

Este porcentaje significa que estadísticamente aproximadamente una de cada dos unidades de glucosa estaba carboximetilada.

30 En la práctica, esta reacción puede realizarse múltiples veces para conseguir las tasas de sustitución deseadas. Por lo tanto, se aplicó el mismo protocolo para la síntesis de CM2D a partir de CM1D y de CM3D a partir de CM2D: % de COOH de CM2D = 91,8% y % de COOH de CM3D = 118,3%.

35 b) Sulfatación

La reacción de sulfatación de las funciones hidroxilo residuales después de las etapas de carboximetilación se realiza con ácido clorosulfónico. Produce los compuestos denominados como CMnDSm que se presentan en la figura 6, en la que m corresponde a los equivalentes de ácido clorosulfónico como se define en el ejemplo que se indica a

40 continuación.

Ejemplo de sulfatación de CM1D

Se dispersan 500 miligramos (PM = 7,8 mmol/g) de carboximetildextrano (CM1D) en 40 mililitros de diclorometano

45 seco. El número de residuos hidroxilo que permanecen libres y capaces de reaccionar en una reacción de sulfatación es nOH = 4,10-3 mol. La reacción se realizó en presencia de un equivalente de ácido clorosulfónico (nCISO3H = 4,10-3 mol) o aproximadamente = 0,5 g o un volumen de 0,3 mililitros, siendo la densidad de la solución de ácido clorosulfónico 1,75. Los 0,3 mililitros de ácido clorosulfónico se diluyen en 4 mililitros de diclorometano deshidratado. El CM1DS1 obtenido de esta manera se recupera por filtración del medio de reacción al vacío en una

50 frita.

La misma reacción puede realizarse en presencia de 0,5 o 1,5 o 2 o 3 equivalentes de ácido clorosulfónico o un exceso para injertar las cantidades crecientes de grupos O-sulfato. Los polímeros RGTA obtenidos de este modo se denominan como CMnDSm, con n = 1, 2, etc. y m = 0,5, 1, 2, etc.

55 Usando el mismo principio y en vistas a comparar estos polímeros con otras moléculas sulfatadas, se consideró como productos de comparación con CMnDSm cualquier dextrano sulfato comercial (producto Pharmacia Biotech, código 17-0270-01) o dextranos sulfatados de dextrano T40 en presencia de m equivalentes de ácido clorosulfónico, es decir, en condiciones de reacción comparables con las empleadas para producir el CMnDSm.

E99932921

17-08-2015

Los resultados de diferentes determinaciones cuantitativas de los grupos X por valoración y los grupos Y por análisis elemental de los niveles de átomos de azufre permiten especificar los valores correspondientes x e y para cada uno de los compuestos CMnDSm sintetizados. Estos datos se presentan en la figura 6. Esta figura también indica este

5 porcentaje para sulfato de dextrano comercial y para los dextranos sulfatados en las mismas condiciones que el CMnDSm.

2) Síntesis de polímeros carboximetil dextrano-sulfonato de fenilo indicados como CM2DPhS y de un derivado dextrano carboximetil sulfato fenil sulfonato designado CM2DPhSS

10 Estos polímeros se constituyen por una secuencia de motivos mostrados en la figura 7 y corresponden a los de la figura 4 en la que Z era nulo. Estos polímeros se constituyen por una secuencia de motivos del tipo A-X, A-Y y A-Z como se muestra en la figura 6.

15 En este ejemplo, el grupo Z es sulfonato de fenilo indicado como PhS. La figura 7 muestra un monómero A-Z en el caso en el que Z recibió como un producto de adición un radical carboxilo injertado en la posición 2 de la glucosa original, que se sulfató en las posiciones 3 y 4.

El polímero CM2D (2 g; 3,90 mmol) se disuelve en 13 mililitros de agua destilada. El pH de la solución se ajusta a 3,5

20 con HCl 3 M. El agente de acoplamiento EEDQ (1,93 g, 2 equiv.) se disuelve en 16 mililitros de etanol (0,12 g de EEDQ/mililitro) a 40 ºC. La solución de EEDQ se añade progresivamente al polímero y la mezcla de reacción se agita vigorosamente durante 30 minutos. Después, se añade la sal del ácido fenilsulfanílico (NH2PhSO3Na, 3-045 g, 2 equiv.) en pequeñas cantidades. El pH de la reacción se ajusta a 9 con sosa. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 4 horas y después se neutraliza con HCI diluido. Después, el producto CM2DPhS se ultrafiltra, se

25 evapora al vacío y después se liofiliza (1,66 g).

Los análisis elementales y ácido-base del CM2DPhS produjeron: % de C = 33,9; % de H = 5,28; % de N = 0,3; % de S = 0,67; % de COOH = 81%.

30 Los análisis elementales y titrimétricos ácido-base del polímero CM2DPhSS*1 produjeron % de C = 23,16; % de H = 3,72;% deN = 0,27;% de S=9-60;% deCOOH = 52%.

3) Síntesis de un derivado carboximetil dextrano N y O sulfato

35 Estos polímeros se constituyen por una secuencia de motivos del tipo A-X, A-Y y A-Z como se muestra en la figura 6, en los que uno de los motivos característicos A-Z se presenta en la figura 8. En este ejemplo, el grupo Z que es etilendiamina, indicado como DE, se injerta en el radical carboxilo del carbono 2 del monómero de glucosa original que se sulfata en las posiciones 3 y 4.

40 El mismo protocolo que se ha empleado anteriormente se aplicó a CM2D con la adición, en una primera fase, de un grupo etilendiamina Z, indicado como DE, para producir el producto designado CM2DE.

Los análisis elementales y titrimétricos ácido-base del polímero CM2DE mostraron: % de C = 37,67; % de H = 6-25; % de N = 5,35; % de COOH = 19%.

45 El protocolo de sulfatación se realizó en una fracción de este polímero usando 1 equivalente de ácido clorosulfónico. Los productos obtenidos corresponden al CM2DES1 representado en la figura 7. En este caso, de acuerdo con la fórmula general de los RGTA, Z es dietilamina.

50 Los análisis elementales y titrimétricos ácido-base del polímero CM2DDES1 mostraron: % de C = 36,83; % de H = 5,82;% deN = 4,67;% de S=1,82;% de COOH = 10,7%.

Estas síntesis permiten injertar los grupos N-sulfato además de los grupos O-sulfato de CMDS. Estos diferentes polímeros permiten la evaluación de los roles específicos de los grupos N-sulfato y O-sulfato del CM2DES con

55 respecto a los grupos sulfonato de fenilo, indicados como PhS, de los compuestos CM2DPhS, los compuestos sulfato y sulfonato del CM2DPhSS o a los compuestos. En este tipo de polímero, parece que los grupos sulfato se vinculan básicamente a las propiedades de los RGTA.

4) Síntesis de los polímeros de dextrano carboximetil-fenilalanina sulfato designado CM3DPheS y de dextrano

E99932921

17-08-2015

carboximetil-tirosina sulfato designado CM3DTrS representados en la figura 9.

Estos polímeros se constituyen por una secuencia de motivos de tipo A-X, A-Y y A-Z como se muestra en la figura 6 en la que estos motivos característicos se representan en la figura 9. En este ejemplo, los grupos Z son 5 respectivamente fenilalanina para Phe o tirosina para Tyr. Se sometieron al proceso de adición sobre un radical carboxilo injertado en la posición 2 de la glucosa original que se sulfata en las posiciones 3 y 4.

En estos polímeros, Z es un aminoácido con fenilalanina (Phe) o tirosina (Tyr) e Y es un grupo -OSO3-.

10 Estas síntesis se realizaron para evaluar la importancia de las estructuras aromáticas de estos dos aminoácidos Phe y Tyr reemplazando la bencilamida indicada como B como se conoce en el CMBDS de la técnica anterior, pero cuya precipitación salina en aplicaciones in vivo puede ser perjudicial generando riesgos de tumorigenicidad.

El polímero CM3D (% de COOH = 136 %, 0,6 g, 3,014 mmol) se disuelve en 6 mililitros de agua destilada. El pH de

15 la solución se ajusta a 3,5 con HCI 3 M. El agente de acoplamiento EEDQ (745 miligramos, 1 equiv.) se disuelve en 6,2 mililitros de etanol a 40 ºC. La solución EEDQ se añade gota a gota al polímero y la mezcla de reacción se agita vigorosamente durante 30 minutos a temperatura ambiente. A la mezcla se le añade muy lentamente fenilalanina metil éster (1,3 g, 2 equiv.) y el pH se lleva de 5 a 9 con sosa. La reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 4 horas. Después, la solución se neutralizó con HCI diluido. Después, el polímero CM3DPhe se ultrafiltra, se

20 evapora al vacío y después se liofiliza (524 miligramos).

Los análisis elementales y titrimétricos ácido-base del polímero CM3DPh mostraron: % de C = 36,9; % de H = 5,03; % de N = 0,44; % de COOH = 101,05%.

25 Se realizó el mismo protocolo en CM3D con tirosina metil éster CM3DTyr.

Los análisis elementales y titrimétricos del polímero CM3DTyr mostraron: % de C = 34,41; % de H = 5,12; % de N = 0,28; % de COOH = 101,76%.

30 El protocolo de sulfatación se realizó en estos dos polímeros usando 2 equivalentes de ácido clorosulfónico.

Los análisis elementales y tritrimétricos de ácido-base del polímero CM3DPheS*2 mostraron: % de C = 18,08; % de H = 2,89; % de N = 0,30; % de S = 14,71; % de COOH = 28,79.

35 Los análisis elementales y tritrimétricos de ácido-base del polímero CM3DTyrS2 mostraron: % de C = 17,99; % de H = 3,13; % de N = 0,3; % de S = 14,35; % de COOH = 19,85.

5) Síntesis de los polímeros lipídicos: ejemplo con dextrano carboximetilo-sulfato de ácido oleico (CM1DoleicS) y dextrano carboximetil-sulfato de ácido palmítico (CM1DpalmS) representados en la figura 10

40 Estos polímeros están constituidos por una secuencia de motivos de tipo A-X, A-Y y A-Z como se muestra en la figura 6 en los que los motivos característicos se representan en la figura 10. En este ejemplo, los grupos Z, que son respectivamente ácido oleico, indicado como oleico, o ácido palmítico indicado como palm, se añadieron en el hidroxilo del carbono 3 de una carboximetil glucosa en la posición 2 sulfatada en la posición 4.

45 Estos compuestos responden a la fórmula (I) en la que Y = -OSO3-y Z es ácido oleico o palmítico. Estos ácidos grasos se injertaron para evaluar la importancia del equilibrio hidrofobicidad/hidrofilia de los polímeros además de la propia función de estos ácidos grasos.

50 Al polímero CM1D (1 g, 2,43 mmol) disuelto en DMSO (16 mililitros) se le añadió trietilamina (0,8 mililitros) y después se añadió gota a gota cloruro oleico (1,6 mililitros). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El polímero se precipitó en 120 mililitros de acetato de etilo, se centrifugó y después se secó al vacío. El precipitado se disolvió en 20 mililitros de acetato sódico 2 M y la sal formada se precipitó en etanol (160 mililitros), se filtró, se disolvió en 20 mililitros de agua destilada y después finalmente se dializó contra agua. Después de la diálisis

55 (24 h), la solución evaporada al vacío produjo el dextrano lipídico CM1Doleic (751 miligramos).

Análisis elemental del producto CM1Doleic: % de C = 34,25 y % de H = 5,91.

Se realizó el mismo protocolo con el polímero de cloruro palmítico CM1Dpalm.

E99932921

17-08-2015

Los análisis elementales del polímero CM1Dpalm mostraron: % de C = 35,13, % de H = 5,96. El protocolo de sulfatación se realizó en estos dos polímeros usando 1 equivalente de ácido clorosulfónico. Los análisis elementales del polímero CM1DoleicS*1 mostraron: % de C = 28,28; % de H = 5,04; % de S = 5,26. Los análisis elementales del producto CM1DpalmS*1 mostraron: % de C = 29,17; % de H = 4,88; % de S = 5,14.

10 Los diferentes ejemplos presentados que implican el injerto de un grupo Z producen los compuestos, las definiciones de varios de los cuales se presentan en la Tabla II a continuación. Tabla II

Referencia

Grupos X Y Z

RGTA 1110

CM2DPhSS1 52,1 43,8 8,9

RGTA 1111

CM2DES1 10,7 42,4 21,2

RGTA 1112

CM2DPheS2 28,9 56,2 17,9

RGTA 1113

CM3DTyrS2 19,8 65,9 23,9

RGTA 1114

CM1DpalmS1 39,8 47,4 3,8

RGTA 1115

CM1Doleic1 36,0 43,9 2,2

15 La Tabla II anterior indica los porcentajes de sustitución de los polímeros que contienen un grupo Z.

6) Etapas de purificación para los diferentes derivados de dextrano de los ejemplos anteriores

a) Diálisis de equilibrio

20 Después de cada etapa de síntesis, los polímeros se recogieron en forma sólida (precipitación o filtración seguido de liofilización). Después, los polímeros se solubilizan de nuevo en el volumen mínimo de agua destilada y después se introducen en tubos de diálisis (Spectrapor) con un umbral de corte de 6000 a 8000 g/mol-1. La diálisis se realiza contra agua destilada dos veces (MilliQ) en una relación de 1 volumen de producto por 50 volúmenes de agua

25 durante 4 a 5 días con dos cambios de agua por día.

b) Cromatografía

La etapa anterior se asocia con cromatografía HPLC en un tamiz molecular (Columna TSK) para establecer las 30 masas molares de los polímeros purificados.

c) Ultrafiltración tangencial

Después de la diálisis, el contenido del tubo se ultrafiltra en una célula de ultrafiltración (Pellikon, Millipore) en una

35 membrana de celulosa con un umbral de corte de 10.000 g/mol-1. La calidad de la purificación se controló con una célula de conductimetría. Cuando la conductividad del agua eliminada a la salida de la célula recuperó la conductividad del agua destilada pura (2µS), la purificación se detuvo y la solución se concentró antes de la liofilización.

40 7) Determinación de los porcentajes de sustitución

Para los dos grupos de ejemplos que se han presentado anteriormente, los porcentajes de sustitución de los grupos X, Y y posiblemente Z, se determinaron de la siguiente manera.

45 a) Polímeros poli ácido β-málico (Ejemplos 1)

Para estos polímeros, los porcentajes de sustitución se definen a priori con respecto a la proporción de los diferentes monoésteres sometidos a polimerización.

50 b) Polímeros de dextrano (Ejemplos 2)

Deben contemplarse dos casos para estos polímeros obtenidos a partir de dextrano dependiendo de la definición del

E99932921

17-08-2015

grupo Z.

El primer caso corresponde al caso del CMnDSm en el que Z = nulo; el segundo caso depende de la naturaleza química de Z.

5 En cada residuo de glucosa, pueden hacerse reaccionar tres funciones hidroxilo. Una masa molar relativa de 54 g/mol-1 se atribuye a cada función hidroxilo, es decir, un tercio de la masa molecular de 162 g/mol-1 de un residuo constitutivo de dextrano. Se asume que cada hidroxilo tiene la misma reactividad y que las sustituciones afectan en primer lugar a cada unidad de glucosa una vez antes de una segunda posible segunda sustitución en el mismo

10 residuo.

Por lo tanto, un dextrano T 40 de 40.000 g/mol-1 contiene 247 residuos de glucosa de masa molar 162 g/mol-1 .

Las tasas de sustitución alcanzadas durante las carboximetilaciones se determinan por determinación ácido-base 15 con un titrímetro automático (Tacussel). Esta determinación encuentra un valor x1 que corresponde al número de moles de ácido fijados por gramo de polímero.

Por lo tanto, cuando un hidroxilo se sustituye, aparece en la glucosa un motivo: -OCH2COONa. Cada una de estas subunidades sustituidas tiene una masa molecular relativa de 240 g/mol-1 . 20 Aparecen múltiples motivos después de la sulfatación.

Las tasas de grupos carboxílicos libres determinadas por la determinación ácido-base proporcionan un valor X2 que es siempre inferior al valor inicial X1. La diferencia X1-X2 corresponde a los motivos -OCH2COO-SO3Na. Cada una de 25 estas subunidades sustituidas tiene una masa molecular de 320 g/mol-1 .

Los análisis por RMN revelaron que S corresponde a una sulfatación de los hidroxilos libres de los residuos de glucosa además de la reacción anterior. En este caso, aparece un motivo -OSO3Na. Cada una de estas subunidades de glucosa sulfatadas tiene una masa molecular relativa de 200 g/mol-1. Los microanálisis proporcionan las tasas de

30 S como un porcentaje de la masa del polímero.

Por lo tanto, es posible al final de la síntesis obtener los porcentajes de los radicales carboxilo libres X1 y X2 determinados respectivamente antes y después de la etapa de sulfatación, teniendo en cuenta que el polímero contiene:

35 -a residuos de glucosa no sustituida de masa 162 g. -X2 residuos carboxílicos libres de masa 240 g. -X1 residuos carboxílicos libres de masa 320 g. -Y residuos de glucosa sulfatados de masa 200 g. En base a estos resultados, es posible establecer el

40 porcentaje de sustitución de los grupos X e Y.

Por lo tanto, el porcentaje de azufre proporcionado por los resultados de microanálisis (S%) permite determinar el número de átomos de azufre (Σs) injertado en el polímero. Este número de átomos es Σs = (S% x MM)/32 x 100, donde 32 es la masa atómica de S y MM es la masa molar del polímero sintetizado.

45 Es posible obtener a partir de este porcentaje Y de los radicales SO3-como igual a: (100 x S% x MM)/247 x 3200.

En el segundo caso en el que el grupo injertado Z es, por ejemplo, tirosina, el mismo razonamiento es aplicable con el valor del nitrógeno dado por los resultados del análisis elemental. 50 B) PROPIEDADES DE LOS POLÍMEROS DE LA INVENCIÓN

Las propiedades que son comunes a los RGTA y los HBGFPP

55 1) Están desprovistos de actividad anticoagulante significativa, es decir, presentan una actividad inferior a 50 UI/miligramo en comparación con la de la heparina cuya actividad está en el orden de 150 a 170 UI/miligramo. 2) Estabilizan y potencian los factores de crecimiento que muestran una afinidad para heparina, particularmente, a modo de ejemplos FGF1 y/o FGF2 y TGFβ.

E99932921

17-08-2015

3) Protegen estos factores frente a agentes proteolíticos, tales como la tripsina. 4) Muestran las actividades de proteasa implicadas en el proceso inflamatorio, tal como, por ejemplo, elastasa leucocitaria o plasmina. 5) Ejercen un efecto cicatrizante en al menos uno de los modelos presentados en las patentes citadas, es

5 decir, los músculos, los nervios o el tracto gastrointestinal.

Las propiedades novedosas de los RGTA

6) Protegen y potencian las actividades enzimáticas implicadas en combatir el estrés oxidativo, tal como,

10 por ejemplo, superóxido dismutasa o SOD. Debido a esta propiedad, actúan como agentes antioxidantes y pueden usarse en solitario o junto con SOD en las indicaciones terapéuticas y/o cosméticas de SOD o como un agente protector antioxidante especialmente en la protección de alimentos y nutrientes. 7) Inhiben la actividad de las enzimas, tal como calpaína. 8) Inhiben la actividad de las enzimas, tales como heparitinasa o heparinasa.

15 9) Aumentan la supervivencia de las células sometidas a radiación ionizante y regulan la secreción tanto a nivel cuantitativo como cualitativo de los constituyentes de su matriz, así como los colágenos, por ejemplo. 10) Actúan como agentes antifibróticos modulando el crecimiento de las células mesenquimales, tales como las células de músculo liso, los fibroblastos o las células hepáticas y la calidad del tipo de colágeno que secretan.

20 11) Presentan una lenta degradabilidad, un criterio que permite su diferenciación de los heparán sulfatos que son productos que se degradan naturalmente por heparinasa o heparitinasa. 12) No contienen ni liberan después de la degradación productos que se sabe que son tóxicos, tal como, por ejemplo, puede ocurrir con CMDBS con los grupos injertados Z = bencilamina, que, por lo tanto, descarta el CMDBS.

25 13) Presentan capacidades in vivo de protección y regeneración tisular en los siguientes modelos diferentes:

a) lesión de heridas cutáneas, b) regeneración de tejidos óseos, tales como huesos largos con el ejemplo del fémur,

30 c) protección frente a la pérdida de tejido óseo y regulación de su reorganización, tal como en el caso de la osteoporosis o enfermedad periodontal. Por lo tanto, son agentes reguladores de la homeostasis tisular y de masas tisulares, tales como la masa ósea o muscular. d) regeneración hepática o protección frente a la degeneración del sistema nervioso central, e) protección frente a los efectos perjudiciales de la isquemia independientemente de su ubicación.

35 EJEMPLO 3: Medición de las actividades anticoagulantes de los polímeros de los Ejemplos 1 y 2

Las pruebas de coagulación se realizaron usando la técnica tiempo de cefalina activa o A.C.T. (Biggs, 1972, en: Human Blood Coagulation, Oxford Blackwell Scientific Publications). Se incubaron 100 microlitros de una solución

40 polimérica a diferentes concentraciones en tampón Owen Koller durante 5 minutos a 37 ºC con 100 microlitros de plasma bajo en plaquetas y 100 microlitros de una solución de cefalina de cerebro de conejo. Se añaden 100 microlitros de cloruro de calcio 0,25 M y el tiempo hasta la aparición del coágulo se reconoce por cronometría.

Como se muestra en la figura 11, los polímeros de los Ejemplos 1 y 2 no presentan actividades anticoagulantes

45 superiores a 50 UI/miligramo, especialmente con respecto a heparina que se usó como un control positivo. Cabe apreciar que todos los valores para las actividades anticoagulantes de los productos presentados en el presente documento como ejemplo son inferiores a 10 UI/miligramo de producto.

EJEMPLO 4: Estabilización y potenciación de los polímeros de los Ejemplos 1 y 2 sobre los factores de crecimiento 50 que presentan una afinidad para heparina y, particularmente como ejemplos, FGF1 y/o FGF2 y/o TGFβ

Este ejemplo considera el efecto de los polímeros en la estabilización de FGF1 y el efecto en la potenciación de FGF1 y FGF2. Estos efectos se evalúan sobre el crecimiento de células 3T3 BALB/c o CCL39. Las condiciones empleadas para estos experimentos son aquellas descritas en la técnica anterior en las patentes relativas a los

55 HBGFPP.

1) Efectos de los polímeros de la invención en la estabilización de FGF1 o FGF2

La figura 12 muestra los efectos de los RGTA frente a la degradación térmica a 20 ºC y a 37 ºC con respecto a la

E99932921

17-08-2015

incubación de FGF2 conservado en solitario o en presencia de los productos ensayados. La ED50 representa la concentración en microgramos/mililitro de FGF1, aquí 6 nanogramos/mililitro, que debe inocularse en un cultivo de células fibroblásticas, las células CCL 39, con el fin de obtener el 50% de la tasa máxima de incorporación de timidina valorada.

5 Los resultados obtenidos muestran que todos los polímeros ensayados ejercen a 20 ºC, así como a 37 ºC, efectos protectores comparables a los de la heparina, y con mayor eficacia en algunos casos.

2) Efectos de los polímeros de la invención en la potenciación de FGF1 o FGF2

10 El protocolo es el mismo que se ha descrito previamente con una cantidad variable de FGF asociada posiblemente a una cantidad constante de polímero. La concentración de polímero empleada corresponde a la que potencie al máximo el efecto mitógeno del FGF. Estas pruebas se realizaron en células 3T3 para FGF1 y FGF2. Los controles son los mismos que se han mencionado previamente con la excepción de una determinación sistemática para cada

15 prueba del valor de ED50.

Las moléculas de estas dos familias de polímeros ensayados potencian las acciones de FGF1 y FGF2 porque los valores de ED50 se obtienen para valores de FGF que son inferiores o comparables a los obtenidos en presencia de heparina (figura 13).

20 EJEMPLO 5: Protección de los factores frente a agentes proteolíticos, tal como tripsina

La tripsina es una enzima proteolítica con un amplio espectro de acción que se usa en ensayos in vitro y que es una de las enzimas funcionales primordiales en el proceso digestivo.

25 Por lo tanto, se realizó la prueba de protección contra tripsina. Un nanogramo/mililitro final de FGF2 yodado o 5 microgramos/mililitro final de tripsina se incuban en una primera etapa durante 15 minutos a 37 ºC con concentraciones diferentes de polímeros (0,5 a 500 microgramos/mililitro) en un tampón Tris HCI 100 mM, NaCl 0,18 M, Brij al 0,03% pH 7,6. Después, se añadieron 5 microgramos/mililitro final de tripsina o 1 nanogramo/mililitro final

30 de FGF2 yodado respectivamente. El volumen de reacción total es de 30 µl. La reacción enzimática se detiene después de 2 h de incubación a 37 ºC por la adición de tampón Laemmli y calentamiento durante 5 minutos a 90 ºC (Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of the bacteriophage T4, Nature, 1970,

227: 680 -685).

35 Cada muestra se pone en un gel de poliacrilamida al 15%. La migración se realiza durante 1 h a 200 V en hielo. Los geles se secan durante 2 h a 80 ºC al vacío y se exponen a -80 ºC en presencia de una película autoradiográfica. La intensidad de las bandas se mide mediante análisis por imagen y se calcula el porcentaje de FGF2 protegido con respecto al porcentaje de FGF2 degradado.

40 Protección de FGF1 y TGFβ

La figura 14 muestra los efectos protectores expresados como % de protección de los polímeros poli-ácido β-málico en FGF1, FGF2 y TGFβ con respecto a un ataque por tripsina. La figura 15 presenta los efectos protectores expresados en % de protección de los polímeros obtenidos a partir de dextrano en FGF2 y TGFβ con respecto a un

45 ataque por tripsina.

La mayor parte de estos polímeros ejerce un efecto protector que es comparable al de la heparina que se usó como referencia positiva.

50 EJEMPLO 6: Inhibición de las actividades de proteasa implicadas en el proceso inflamatorio, tal como, por ejemplo, elastasa leucocitaria o plasmina

La elastasa leucocitaria y la plasmina son proteasas clave en la instalación y el desarrollo de los ensayos inflamatorios. Estas pruebas pretenden establecer si los polímeros protegen los factores de crecimiento de la

55 degradación por la elastasa leucocitaria humana.

Por lo tanto, se realizan las pruebas para de protección contra la elastasa leucocitaria. El protocolo empleado es el mismo que el usado con la tripsina con 30 nanogramos/mililitro final de elastasa y de 0,5 a 500 microgramos/mililitro de polímeros. El tampón es Tris HCl 100 mM, NaCI 0,18 M, Brij al 0,03% pH 8. La intensidad de las bandas se

E99932921

17-08-2015

evalúa por análisis de imagen y se calcula el porcentaje de FGF2 no degradado. El control positivo para estas pruebas es la heparina. Se usaron Dextrano T40 y sulfato de dextrano como referencias internas.

La figura 16 presenta los efectos inhibidores de los diferentes polímeros expresados por sus valores de CI50.

5 EJEMPLO 7: Ejemplo de los efectos de los RGTA en la regeneración, protección y restauración funcional de los tejidos: caso de la regeneración del músculo esquelético

El modelo empleado para evaluar de forma más eficaz las propiedades de cicatrización de los RGTA fue el del 10 músculo aplastado como se define y se presenta en la Patente Francesa Nº 2 718 026.

Después de aplastar el EDL (Extensor Digitorum Longus (músculo extensor largo de los dedos)) de la pata trasera de la rata y la inyección del músculo aplastado con una solución de suero fisiológico que contiene o no contiene las sustancias de ensayo, los músculos tratados de esta manera se recuperan 8 días después de la operación. El

15 análisis de los pesos, así como un estudio histológico permiten una posible cuantificación de los efectos de los polímeros en la regeneración muscular. Los resultados se expresan en % con respecto a las características de un músculo que únicamente recibió una inyección del suero fisiológico sin polímero en las mismas condiciones experimentales. La figura 17 presenta los resultados obtenidos que demuestran que los nuevos polímeros obtenidos a partir de la estructura de dextrano, así como los copolímeros de ácido β-málico ejercen los efectos reivindicados.

20 Es importante apreciar que estos efectos en la regeneración muscular se obtienen no sólo por inyección in situ de los polímeros sino también por inyección intravenosa, intra-arterial o intramuscular siempre que las dosis inyectadas se seleccionan en relación a las rutas de administración.

25 EJEMPLO 8: Efectos de los RGTA en la regeneración del hueso plano

El modelo empleado para evaluar las propiedades de cicatrización de los RGTA es el método ya conocido en la técnica anterior y descrito por Blanquaert F, y col., Bone, 1995; 17(6): 499 -506.

30 Este modelo comprende realizar una trepanación circular de 5 milímetros de diámetro en la bóveda craneal de una rata adulta. El defecto se rellena con un tampón de colágeno que se ha cortado a la misma dimensión y se impregna

o no con una solución que contiene los RGTA. En el ejemplo presentado en el presente documento, los polímeros estudiados son los polímeros tipo CMS (RGTA 1005 y 1012) y los copolímeros de ácido β-málico (RGTA 2011). La Tabla III que se indica a continuación presenta los porcentajes del relleno óseo establecidos por análisis de imagen

35 de las radiografías tomadas 35 días después del tratamiento.

Tabla III

Tipo de tratamiento

% de relleno óseo

control

18 ± 4,8

RGTA 2011

56 ± 7,0

RGTA 1005

54 ± 6,9

RGTA 1012

72 ± 8,9

Por lo tanto, ambos tipos de polímeros estimulan la regeneración ósea pues que en las condiciones de cicatrización 40 la sutura sagital se restaura ad integrum.

EJEMPLO 9: Protección y potenciación de las actividades enzimáticas implicadas en combatir el estrés oxidativo, tal como, por ejemplo, superóxido dismutasa o SOD

45 La producción de iones de O2-y la de peróxido de hidrógeno (H2O2) representan radicales que ejercen efectos citotóxicos especialmente destructivos. SOD o superóxido de dismutasa son enzimas acopladas en la detoxificación de estos radicales. Son agentes que preservan el organismo del estrés oxidativo.

Los RGTA presentan diversos tipos de actividad en relación a SOD:

50 -Ejercen un efecto potenciador en la actividad catalítica de SOD a pH neutro y un efecto protector y potenciador en valores de pH ácido y básico. -Presentan la propiedad de proteger la SOD en relación con degradaciones enzimáticas, tal como, por ejemplo, la tripsina y también en relación con tratamientos térmicos.

E99932921

17-08-2015

-En modelos de cultivos de monocitos activos, estimulan la actividad catalítica de la SOD endógena y permiten la disminución de la producción de los iones de superóxidos.

En todos los casos, la determinación cuantitativa de la actividad de la SOD se realiza usando la técnica de Pick

5 (Freund M y Pick E, The mechanism of action of lymphokines. IX. The enzymatic basis of hydrogen production by lymphokine-activated macrophages. J Immunol 1986, 15; 137(4): 1312 -1318). Esta técnica se basa en la determinación de los iones de O2-mediante la reducción del citocromo c. Se disuelve MnSOD (Sigma ref. S 8151) a 30 U/mililitro en presencia de RGTA diferentes a la concentración de 10 microgramos/mililitro. Estas mezclas se someten a diferentes tratamientos.

10 La actividad de SOD se evalúa en presencia de diferentes concentraciones de polímeros en condiciones de reacción normales.

Las mezclas de SOD y polímeros se someten a temperatura ambiente a la acción de la tripsina (mismas condiciones

15 que para la las pruebas de protección del Ejemplo 5) o se someten a un tratamiento térmico a 60 ºC durante 30 minutos. Después, la actividad catalítica residual de la SOD de estas mezclas se evalúa mediante técnicas enzimáticas convencionales o en un sistema celular.

Las muestras tratadas de esta manera se incuban en una suspensión de monocitos (2,5·106 células/mililitro)

20 estimulada por 200 nM de PMA. Esta condición induce la producción de anión superóxido por estos monocitos activados en macrófagos. La estimulación por PMA induce un aumento en la producción de iones superóxidos producidos normalmente a un nivel basal en ausencia de activación. La adición de MnSOD activo usado como control positivo disminuye la cantidad de iones superóxido producidos.

25 En estas condiciones, cuanto menor es la producción de iones superóxido, mayor será la actividad catalítica residual de la SOD contenida en las mezclas. Por lo tanto, estas pruebas permiten evaluar los efectos protectores y potenciadores de los polímeros sobre la actividad de la SOD exógena, así como endógena.

La figura 18 ilustra los efectos protectores y potenciadores de los RGTA sobre la actividad catalítica de la SOD in

30 vitro a diferentes valores de pH. La figura 19 ilustra los efectos protectores de los RGTA sobre la SOD sometida a un ataque por tripsina o después de un choque térmico y la figura 20 ilustra los efectos potenciadores de la actividad de la SOD sobre la producción de iones superóxido por los macrófagos activados.

Conclusión: Por lo tanto, los polímeros ejercen efectos potenciadores y protectores tanto en los sistemas acelulares

35 como celulares. Por lo tanto, la adición de diferentes polímeros modula la actividad catalítica de la SOD añadida de forma endógena, así como la SOD producida de forma endógena por las células.

EJEMPLO 10: Inhibición de la actividad de las enzimas, tal como por los RGTA

40 1) Introducción

Se usa calpaína 1 (Sigma P 4533) en este ejemplo. Por lo tanto, se incuban 0,78 unidades enzimáticas (57,2 nM) en 1 mililitro de tampón Tris-HCI 50 mM, pH 7,4, Brij al 0,5%, CaCl2 2 mM, DT 2 mM y NaCl 0,15 M. Las soluciones de RGTA a ensayar se añaden durante 5 minutos a 27 ºC. Después, se añade el sustrato (250 micromolar de N

45 succinil-leu-tyr-amido-7-metil coumarin, de Sigma (S 1153) a un depósito de cuarzo al que después se le añade la mezcla que se ha descrito anteriormente. Después, las mediciones se realizan cada 3 a 5 minutos por excitación a 380 nm y detección en fluorescencia a 460 nm de la transformación del sustrato en 7-amino-4-metil-coumarin (de acuerdo con el protocolo descrito por Sasaki, Kikuchi, Yumoto N, Yoshimura y Murachi T, 1984, en J. Biol. Chem. 259 (20), págs. 12489-12494).

50 Los resultados obtenidos se resumen en la figura 21.

2) Conclusión

55 Se puede predecir a partir de los resultados obtenidos en la inhibición de la actividad de calpaína por los RGTA que los RGTA tienen una actividad protectora frente a las lesiones inducidas por la isquemia cerebral como pudo anticiparse a partir de las publicaciones de Markgraf C G y col. (Stroke, 1998, 29, 152 -15.8) o Saido y col. (Neuroscience Letters, 1997, 16; 227: 75 -78) que describen el efecto de los inhibidores de calpaína, tal como MDL28170 o la proteína calpastatina en el tratamiento de lesiones post-isquémicas del córtex o el hipocampo. La

E99932921

17-08-2015

administración de RGTA a través de la ruta local o intravenosa tiene el efecto de inhibir las calpaínas y promover la reparación del tejido nervioso que se ha dañado especialmente por la falta de suministro de oxígeno como es el caso en la isquemia.

5 EJEMPLO 11: Inhibición de la actividad de las enzimas, tal como heparitinasa, por los RGTA

a) Actividad inhibidora de la heparinasa y la heparitinasa

La medición de la inhibición por los RGTA de las actividades heparinasa o heparitinasa se realiza usando como

10 sustrato heparán sulfatos radiomarcados con azufre 35 y presentes en una matriz extracelular sintetizada por células endoteliales cultivadas en presencia de Na2 35SO4 durante 7 días. El protocolo usado es el descrito por Ishai-Michaeli R y col. (Importance of size and sulfation of heparin in release of basic fibroblast growth factor from the vascular endothelium and extracellular matrix. Biochemistry 1992; 31(7): 2080 -2088). Después, la matriz extracelular obtenida después de la eliminación de las células endoteliales se incuba durante 24 h a 37 ºC en

15 presencia o ausencia de heparinasa y 0,5 microgramo/ml de RGTA. El medio de incubación se recoge y se deposita en una columna Sepharose 6B de acuerdo con el protocolo descrito en Ishai-Michaeli (Biochemistry 1992; 313(7): 2080 -2088) para medir la degradación de los heparán sulfatos radiomarcados. La figura 22 ilustra los resultados obtenidos. Los heparán sulfatos de alto peso molecular correspondientes al material no degradados por la enzima heparinasa se eluyeron en primer lugar (fracciones 3 a 20). El tratamiento en heparinasa provocó la desaparición de

20 este pico y la aparición de un pico correspondiente a fracciones de bajo peso molecular de heparán sulfatos degradados (fracciones 20 a 40). En el ejemplo mostrado, el efecto de RGTA 1005 en 50 microgramos/ml induce una inhibición al 50% y 100 microgramos/ml inducen una inhibición del 100% de la actividad heparinasa.

EJEMPLO 12: Efectos de los RGTA sobre la protección de células de músculo liso intestinales humanas sometidas a

25 radiación ionizante; efectos sobre la supervivencia y sobre sus efectos anti-fibróticos evaluados por medio de la cantidad y calidad de los colágenos secretados

La formación de un tejido fibroso o fibrótico es una etapa fisiológica esencial relacionada con los procesos de reparación y reestructuración tisular. El tejido fibrótico es un tejido de relleno, normalmente transitorio, destinado a

30 conservar la integridad estructural y funcional de los tejidos y los órganos. Se caracteriza por su riqueza en colágenos de la matriz extracelular.

Cuando esta condición persiste o se desarrolla, corresponde a una patología que ilustra una alteración de la homeostasis estructural y funcional de los tejidos y se manifiesta por una acumulación anormalmente alta de matriz

35 extracelular que genera una fibrosis. Una fibrosis, independientemente de su origen, se caracteriza por:

la presencia de un infiltrado inflamatorio permanente, la existencia de un desequilibrio en el equilibrio entre un estado proliferativo y un estado inactivo de las células conjuntivales o mesenquimales tales como fibroblastos o células de músculo liso, la destrucción progresiva del tejido invadido que se renueva sólo

40 ligeramente o de una forma por defecto, la existencia de un desequilibrio del equilibrio entre la síntesis y la degradación de la matriz extracelular.

Puede inducirse una fibrosis posterior a un traumatismo de diversos orígenes (infeccioso, mecánico, tóxico, etc.) o posterior a radiación ionizante (particularmente por rayos γ). En este caso, se trata de fibrosis radioinducidas como

45 es frecuentemente el caso en pacientes que se someten a radioterapia.

Los colágenos son los componentes principales de la matriz extracelular de tejidos normales, así como de los tejidos fibróticos. Los colágenos se sintetizan básicamente por las células mesenquimales, tales como los fibroblastos y las células de músculo liso. En un tejido fibroso, el colágeno total aumenta cuantitativamente debido a razones que 50 afectan, tanto en los niveles cuantitativos como cualitativos, a la síntesis y/o la degradación de los colágenos, es decir, la dinámica de la reestructuración. Las fibrosis se caracterizan por un aumento del colágeno de tipo III, teniendo éste lugar preferiblemente en el caso de fibrosis radioinducidas. Este aumento del colágeno de tipo III está relacionado con un aumento pero a menor grado de la proporción entre el colágeno de tipo III y el colágeno de tipo I. Otro colágeno, colágeno de tipo V, está relacionado con la calidad de la organización de las fibras de colágeno en la

55 matriz, es decir, la fibrilogénesis. En los tejidos fibróticos, el descenso en los niveles del colágeno tipo V es uno de los orígenes de la pérdida de estructura de las fibras de colágeno de la matriz extracelular.

El modelo celular empleado en este ejemplo es el de las células HISM, células de músculo liso intestinales humanas (Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland ATCC CRL 192), procedentes de la muscularis propia

E99932921

17-08-2015

de yeyuno humano (Graham M., Diegelmann R., Elson C., Bitar K. y Ehrlich H., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 176 (1984) 503). Esta línea de células de músculo listo intestinales humanas se usó para evaluar los efectos de la radiación sobre la supervivencia celular y la inducción de fenómenos fibróticos analizados por medio de la cantidad y la calidad de los tipos de colágeno secretado por estas células normales o en una situación inflamatoria o en el

5 proceso de reparación por una fibrosis.

Las células se cultivaron en medio DMEM que contenía 1 g/l de glucosa, 1% de L glutamina, penicilina al 1%estreptomicina y el 10% de suero fetal de ternero y se conservaron en una incubadora a 37 ºC en una atmósfera saturada en CO2 al 5% y humedad relativa al 95%, en placas de 75 cm2. Las células HISM se sembraron sobre

10 placas con 24 pocillos de fondo plano a la velocidad de 20.000 células por pocillo. El volumen de cada pocillo se lleva hasta 2 mililitros de medio. Se implementan diversas cinéticas de crecimiento en presencia o ausencia de RGTA a diferentes concentraciones que varían de 0,4 a 400 microgramos/mililitro.

La irradiación se realiza a partir de una fuente de irradiación 60 cobalto en una incubadora en la que se disponen las

15 placas de cultivo. Dos placas se sometieron simultáneamente a esta irradiación cuya fuente es vertical y las dosis se evaluaron con respecto a la superficie irradiada. El caudal del irradiador es de 1 Gy/min. Las dosis absorbidas son 10 Gy para un tiempo de irradiación por placa de 10 minutos.

Se usan diferentes protocolos para evaluar la función de los RGTA dependiendo de si se añaden al medio de cultivo

20 antes, durante o después de la irradiación, es decir, a nivel preventivo o curativo, o ambos al mismo tiempo. La Tabla IV a continuación proporciona información más específica sobre los diferentes protocolos.

Tabla IV

Secuencia

RGTA Irradiación RGTA

Control

- - -

Irradiación

- 0 -

Curativo

- 0 0

Preventivo

0 0 -

Preventivo y curativo

0 0 0

25 El efecto preventivo se evalúa por la adición de RGTA (+) a la dosis de 400 microgramos/ml en el medio de cultivo 48 horas antes de la irradiación. El efecto curativo se evalúa por la adición de RGTA 2 horas después de la irradiación a las mismas dosis que para el efecto preventivo. Para los efectos preventivos y curativos acumulados, las células se cultivan continuamente en presencia de las mismas dosis de RGTA.

30 72 horas después de la irradiación, las células se incuban en un medio libre de suero en presencia de prolina valorada (10 microCi/ml) y ácido ascórbico (50 microgramos/ml) durante 24 horas. Después, el sobrenadante se recoge y la capa celular se recubre usando una espátula de caucho en un volumen final de 18 ml. Los medios de cultivo y las capas celulares recuperadas se dializan extensamente (umbral de corte de 6 a 8 kDa) contra agua corriente (24 horas a 4 ºC) para eliminar las pequeñas moléculas de las macromoléculas. Después de la diálisis, se

35 recogieron las fracciones de alícuotas y se hidrolizaron (HCI 6 M, 105 ºC, 24 h) para la determinación de la radioactividad de hidroxi(3H)prolina, marcador específico de los colágenos. En esta fase, se usa una fracción de alícuota para la cuantificación por recuento de la radiactividad de la síntesis total de los colágenos.

El volumen restante se dializa de nuevo en presencia de pepsina y colágeno I frente ácido acético 0,5 M durante 24

40 h a 4 ºC. La pepsina digerirá los contaminantes no colagénicos que se eliminarán en el dializado en forma de péptidos. Se añade colágeno de tipo I para aumentar la proporción de colágeno que es baja en cada muestra y para tender hacia una relación enzima/sustrato de 1:5. Las condiciones de reacción son como se indica a continuación: 1 ml de solución de pepsina (0-5 M) + 1 ml de solución de colágeno I (0,5 M) + 0,514 ml de ácido acético para tener una concentración final de ácido acético de 0,5 M en una muestra de 18 ml. Cada dializado obtenido de esta manera

45 se liofiliza en el estado frío (-50 ºC) y se conserva a -20 ºC hasta su uso.

Las diferentes cadenas α de colágeno se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (dodecil sulfato sódico) de acuerdo con el método de Leammli, después de la reducción con β-mercaptoetanol. La radioactividad incorporada en cada colágeno se determina por hidrólisis de las cadenas α obtenidas por el corte de

50 las bandas de gel correspondientes a cada cadena de colágeno de un tipo específico. Después, estas bandas se disuelven en agua oxigenada a 60 ºC y la radiactividad contenida en las diferentes bandas disueltas se cuenta con el contador β por centelleo líquido o por auto-radiografía directa en los geles.

E99932921

17-08-2015

La separación electroforética se realiza con 5 microlitros de colágeno V y 50 microlitros de cada muestra reducida.

Estos geles permiten diversos tipos de procesamiento:

5 -La determinación de los diferentes tipos de colágeno mediante el análisis de la radiactividad incorporada. -La cuantificación de estos tipos diferentes de colágeno por análisis densiométrico después de la autoradiografía.

Las fracciones de alícuotas recogidas después de la diálisis contra agua corriente se hidrolizan (HCl 6 M, 105 ºC, 24

10 h) en ampollas selladas. Después, el ácido acético se evapora, y después el contenido de la ampolla se suspende de nuevo en 1 ml de agua destilada. La prolina y la hidroxiprolina se separan por el método de Rojkind y Gonzales (Rojkind M y Gonzalez B, An improved method for determining specific radioactivities of proline-14C and hydroxyproline-14C in collagen and noncollagenous proteins. Analytical Biochemistry 1974; 57(1): 1 -7). El principio se basa en la oxidación de la prolina y la hidroxiprolina con cloramina T. La prolina se transforma en carboxilato de

15 pirrolina que es soluble en tolueno mientras que la hidroxiprolina se transforma en carboxilato soluble en agua. Después del tratamiento, las fracciones de prolina e hidroxiprolina se recubren para cada muestra y se cuantifican por la medición de la radiactividad.

En condiciones normales, las células HISM se caracterizan por la cantidad de colágeno sintetizado (figura 23) y 20 especialmente a nivel cualitativo por el fenotipo de los colágenos secretados (figura 24).

En condiciones normales, el colágeno que comprende la mayor parte del colágeno es colágeno de tipo I. Los colágenos de tipo III y de tipo V están presentes en menores proporciones. La cantidad de colágeno de tipo V está relacionada con la calidad de la organización de la fibrilogénesis.

25 El colágeno de tipo III es un "colágeno de alerta", sintetizado en teoría de manera transitoria en el caso de una reacción a un estrés pero de forma permanente en el caso de una fibrosis. La cantidad proporcional de colágeno de tipo III en relación con el colágeno de tipo I aumenta de manera significativa en situaciones que implican una respuesta a una lesión tisular, estrés o agresión, tal como, por ejemplo, radiación ionizante. El colágeno de tipo III se

30 vuelve preponderante en las matrices de tejidos que presentan una reacción fibrótica aguda, así como crónica. Este colágeno puede considerarse como un componente de señalización de la reacción fibrótica.

Cuando las células HISM se cultivan en condiciones de control, es decir, sin RGTA, se sintetizan estros tres tipos de colágeno (figura 24). La irradiación modifica la cantidad (figura 23) y la calidad (figura 24) de los colágenos

35 producidos. La síntesis general del colágeno aumenta en casi un 50% (figura 23). La secreción de este colágeno de tipo I y especialmente del colágeno de tipo III aumenta considerablemente (respectivamente en un 50% y casi en un 500%). Por el contrario, la síntesis del colágeno de tipo V disminuye en más del 50%.

La presencia de diferentes RGTA (RGTA 1005 y RGTA 1025) restaura casi de forma exacta el comportamiento de

40 control de las células a pesar de su exposición a la irradiación. La figura 23 muestra que la síntesis general del colágeno regresa a valores normalmente especialmente para las condiciones de tratamientos preventivos y acumulativos (preventivo + curativo). La figura 24 confirma este regreso a una homeostasis de referencia especialmente en el caso de tratamientos acumulados. Los tratamientos curativos, así como los preventivos, ejercen los mismos tipos de efectos, especialmente con respecto a los valores de las relaciones de secreción de colágenos

45 de tipo I y de tipo III que regresan a valores comparables a los de las células de control. Estos RGTA restauran el funcionamiento de las células HISM en relación con los colágenos.

Los RGTA también actúan sobre la supervivencia de las células (figura 25). De hecho, la irradiación induce una elevada tasa de mortalidad celular de más del 50% de la población irradiada. En presencia de los polímeros, se

50 registra un efecto protector claro ya que la tasa de mortalidad se reduce hasta aproximadamente el 25%, obteniéndose el efecto más pronunciado para los tratamientos acumulados preventivo + curativo.

EJEMPLO 13: Acción como agentes antifibróticos en la modulación del crecimiento de células mesenquimales, tales como células de músculo liso, fibroblastos o células hepáticas y la calidad del tipo de colágeno que secretan

55 Como se ha analizado en el ejemplo 12 anterior, la fibrosis manifiesta una alteración en el crecimiento de las células mesenquimales asociado a una modificación de la cantidad y calidad de los colágenos sintetizados.

Este ejemplo usa otro modelo celular que comprende células de músculo liso de aorta de cerdo. Estas células se

E99932921

17-08-2015

obtienen por medio del método de explantes a partir de aortas. La aorta está compuesta por tres capas celulares: la adventicia (capa externa) que contiene las células fibroblásticas, la media (capa central) que contiene las células de músculo liso (SMC) y la íntima (capa interna) que contiene las células endoteliales.

5 La media, después de la extracción se trocea en trozos pequeños. Los explantes se cultivan en una placa de 25 cm2 que contiene DMEM 1 g/l de glucosa con rojo de fenol, con la adición del 20% de suero fetal de ternero (FCS), 1% de L-glutamina y el 1% de penicilina-estreptomicina. Las células se desprenden de estos explantes y colonizan el medio (fase P0). Dos semanas después del comienzo de la fase de cultivo, las células se congelaron a una densidad celular de 2 millones de células en DMSO al 10% y DMEM al 20% FCS.

10 Las cinéticas de crecimiento se determinaron evaluando el número de células por pocillo por medio de un contador de partículas automático (Coulter Counter ZM, Coultronics) que se calibró previamente por una evaluación del diámetro celular por medio de una célula de Malassez. Cada recuento se realizó en un promedio de 4 pocillos de los cuales las células se desprendieron por medio de 500 microlitros/pocillo de una solución de tripsina-EDTA (10 mM).

15 Las CML se sembraron en las mismas condiciones experimentales que las células HISM. Las cinemáticas de crecimiento se determinaron en presencia o no de polímeros de la serie RGTA 1000 a 1025 para los polímeros en los que Z es nulo, y de las series RGTA 1110 a 1115 para los polímeros en los que Z existe, y de heparina como control, a diferentes concentraciones que varían de 0,4 a 400 mg/ml.

20 El porcentaje de inhibición de la proliferación se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:

I% = 100 x (1 -crecimiento neto con polímeros/crecimiento neto de control)

25 en la que el crecimiento neto representa la diferencia entre la cantidad de las células contadas cuando se fusionan con el número de células sembradas al comienzo del cultivo.

El control corresponde a los cultivos de CML en ausencia de polímeros. La heparina y los RGTA representan los diferentes efectores ensayados que son capaces de modificar la actividad biológica de la célula.

30 En las mismas condiciones que se emplean para las células HISM, se determinó la síntesis y la tipificación del colágeno por las CML.

La figura 26 muestra los resultados obtenidos. Los RGTA ejercen un efecto inhibidor sobre la proliferación de las

35 células del músculo liso que es comparable al de la heparina que se usó como módulo de referencia de control. Este efecto puede observarse a partir de los valores en las dos primeras columnas. Sin embargo, y al contrario que la heparina, estos polímeros restablecen el fenotipo de secreción de los colágenos. En resumen, la velocidad de síntesis general de colágenos se disminuye significativamente en presencia de RGTA 1005, 1012 y 1013. A nivel cualitativo, estos mismos polímeros, de nuevo a diferencia de la heparina, disminuyen la velocidad de síntesis de los

40 colágenos de tipo I y tipo III al mismo tiempo que aumenta la secreción de colágeno de tipo V.

Estos efectos confirman las propiedades antifibróticas de los polímeros de la invención.

EJEMPLO 14: Efectos de los RGTA sobre la regeneración de la piel en la rata

45 Este ejemplo ilustra el efecto de los RGTA sobre la cicatrización cutánea profunda después de la sutura en la rata.

Se anestesiaron ratas sin pelo macho con un peso de 250 gramos mediante una inyección IM de ketamina y Largactil. Se hicieron lateralmente dos excisiones de 3 cm en relación con el eje dorsal de simetría de los animales

50 en cada lado de la columna vertebral (figura 27). En relaciones con los animales de control que no se trataron con RGTA 1012, los animales tratados recibieron a través de la ruta intramuscular una inyección de una solución de RGTA 1012 a 1 miligramo por kilogramo 30 minutos antes de la escisión y 100 microlitros de una solución a 100 microgramos por mililitro en forma de aplicación tópica en la herida justo antes de la sutura. La sutura se realizó en un único plano con una sutura continua intradérmica con Proleno 2-0. Las ratas tratadas y las ratas de control se

55 macrofotografiaron los días 7, 21 y 60 después de la operación. En cada uno de estos puntos temporales, se eutanasiaron tres ratas de cada serie experimental para poder realizar un estudio histológico de las muestras cicatriciales cutáneas.

La figura 27 muestra los efectos de los RGTA sobre la cicatrización cutánea:

E99932921

17-08-2015

-Figura 27-A: Incisión cutánea profunda realizada en el suelo muscular subyacente, 3 cm de largo, en ambos lados de la columna vertebral. -Figura 27-B: Vista dorsal del animal después de suturar los bordes de la herida por sutura continua.

5 -Figura 27-C: Aspecto de las cicatrices diez días después del tratamiento. C1 y C2 corresponden a un animal de control tratado con suero fisiológico sin RGTA 1012. En C1 los hilos no se han eliminado a diferencia de la fotografía C2. La cicatriz es visible y aún presenta costras de sangre coagulada especialmente donde pueden observarse trazas de las agujas usadas para la sutura. C3 y C4 corresponden a un animal tratado con suero fisiológico que contiene RGTA 1012. Al mismo tiempo, las

10 cicatrices ya no son visibles. Los hilos de sutura son visibles en la figura C3 mientras que se eliminaron en la figura C4. En esta fotografía, únicamente un fino borde marca la escisión original. -Figura 27-D: Análisis histológico. D1 y D2 presentan las secciones histológicas de la piel a la que se hizo escisión 60 días antes. D1 corresponde a un animal de control que se trató con suero fisiológico sin RGTA 1012; la figura D2 corresponde a un animal tratado con suero fisiológico que contenía RGTA 1012. En D1,

15 la dermis subyacente a un epitelio aún imperfectamente maduro no ha recuperado una estructura idéntica a la de la piel normal. La reestructuración es muy parcial. A la inversa, en D2 la piel ha recuperado una estructura y una organización idénticas a la de la piel que nunca se lesionó. La única traza de una cicatriz es visible en la profundidad de la dermis donde puede detectarse una zona reestructurada de forma incompleta. En este último caso, hay una ausencia completa de cicatriz externa.

20 Las fotografías de la figura 27 muestran al final de 7 días la desaparición de la cicatriz superficial se hayan eliminado (C4) o no (C3) los hilos, mientras que en los animales de control puede observarse una cicatriz en ambas de estas condiciones (C1 y C2).

25 Un análisis histológico realizado a los 60 días reveló que la piel de los animales no tratados (D1) presentaba una dermis absolutamente no madura mientras que los animales tratados con los RGTA revelaron únicamente una ligera traza dérmica en el nivel profundo. La histología de la piel de los animales tratados (D2) tiene un aspecto comparable a la piel de un animal de control no sometido a ningún proceso cicatricial en absoluto. En este modelo, los RGTA no sólo aceleran la velocidad de cicatrización del suelo cutáneo sino también y especialmente permiten

30 una restauración del tejido cicatricial que da como resultado un tejido regenerado en el que no puede detectarse ninguna traza de fibrosis. Este ejemplo muestra que los RGTA son reguladores especialmente potentes de la homeostasis tisular.

EJEMPLO 15: Efectos protectores contra la isquemia manifestada por los RGTA

35 Este ejemplo demuestra, usando el polímero RGTA 1005, los efectos protectores de los RGTA frente a un daño tisular que permitió la conservación del 80% de la masa de un órgano en comparación con los órganos no tratados (figura 28). Estos efectos protectores de los RGTA contra los efectos perjudiciales inducidos por el estrés causado por una falta de suministro de oxígeno derivado de una isquemia de los músculos se representan en la

40 experimentación que se ha descrito a continuación.

El modelo empleado se inspira por el modelo descrito por Hansen-Smith, F. M., Carlson, B. M. & Irwin, K. L. (1980, Revascularization of the freely grafted extensor digitorum longus muscle in the rat. Am. J. Anat. 158, 65 -82). El procedimiento experimental consiste en seccionar el tronco neurovascular de los músculos EDL (extensor largo de

45 los dedos) en las dos patas traseras de ratas Wistar adultas (350 g) a nivel de su entrada en el músculo y en completar la isquemia por una ligadura de los dos tendones. Después, se hizo una inyección de 100 microlitros de una solución de RGTA 1005 en 50 microgramos por mililitro en suero fisiológico directamente en un músculo EDL. El mismo volumen de suero fisiológico sin RGTA se inyectó en el otro músculo contralateral.

50 Siete días después de la inyección, los músculos se retiraron y se examinaron con un microscopio después de una preparación histológica. En cada grupo de músculos tratados o no tratados, los grupos de parámetros, tales como el diámetro medio del músculo, el espesor del epimisio, de la zona periférica y el diámetro medio de la zona isquémica se midieron usando un objetivo de 10 x y una escala micrométrica. El número de capas de fibras musculares que sobreviven a las isquemia en la zona periférica se contó en treinta campos diferentes seleccionados aleatoriamente

55 y observados con un objetivo 20 x.

La figura 28 muestra los efectos protectores de los RGTA (RGTA 1005) frente a una lesión tisular en un modelo de isquemia muscular en la rata. La figura 28-A y la figura 28-B muestran, respectivamente, secciones musculares histológicas de una rata de control (28-A) y de una rata tratada (28-B) con una solución de RGTA 1005. En el

E99932921

17-08-2015

control, la isquemia causó la degeneración de las fibras musculares con la excepción de una corona de fibras periféricas en contacto con el epimisio. La administración de RGTA 1005 limita a un grado considerable la degeneración de las fibras musculares profundas hasta que disminuye de manera muy significativa la reacción inflamatoria y la degradación que esta reacción induce. Por lo tanto, RGTA 10015 protege las células de los efectos

5 perjudiciales inducidos por la isquemia.

Puede observarse en la figura 28 que después de una semana, el diámetro medio está inalterado después del tratamiento con RGTA (5,2 ± 0,3 mm) en comparación con el diámetro (5,1 ± 0-2 mm) de un músculo de control no lesionado. La reacción inflamatoria en el epimisio se disminuye en los músculos tratados con los RGTA de una 10 manera muy significativa ya que los espesores de los epimisios son 10 ± 5 micrómetros con tratamiento con los RGTA en comparación con 85 ± 10 micrómetros sin tratamiento con los RGTA (p<0,01). La zona isquémica central de los músculos EDL no tratados con RGTA presenta un diámetro medio de 4,4000 ± 100 micrómetros en la que las fibras musculares han desaparecido completamente. Esta zona está rodeada por una zona periférica de 270 ± 50 micrómetros que contiene un promedio de 3,2 ± 0,5 capas de fibras musculares. El tratamiento con los RGTA se

15 caracteriza por un descenso claro del tamaño de la zona degenerada central cuyo diámetro medio es de 300 ± 200 micrómetros (p<0,05) y un aumento de la zona periférica cuyo espesor es de 700 ± 40 micrómetros (p<0,05) y que contiene 8-3 ± l,8 capas (p<0,01) de fibra.

EJEMPLO 16: Efectos de los RGTA en la regeneración del hueso largo

20 Este ejemplo ilustra la reconstrucción de un defecto óseo creado en el tubo diafisario de un fémur de rata, restaurado al estado original después de 8 semanas y mejor a las 12 semanas, con una reconstitución de una cavidad medular idéntica a la original y cortezas maduras como en el hueso no fracturado original (figura 29).

25 Se usaron ratas Wistar macho (Ico: WI (IOPS AF/Han), Iffa Credo) con un peso de 275 a 325 gramos. El estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la CEE sobre experimentación animal (decreto 87-848 04/19/1987). Los animales se anestesiaron por inyección de pentobarbital sódico. El fémur se abordó lateralmente. Los tejidos musculares y periósticos se separaron del tubo diafisario. Una plata de polietileno de alta densidad se fijó a la superficie del fémur con agujas de Kirschner. Un defecto segmentario de 5 milímetros se implementó en el

30 centro de la diáfisis femoral. Se insertó un implante en el lugar del defecto óseo antes de suturar los tejidos. Este implante corresponde a una matriz ósea alogénica desmineralizada preparada a partir de diáfisis femorales de otras ratas de acuerdo con el procedimiento descrito por F. Blanquaert y col. (1995, Bone, 17: 499 -506), que se impregnaron o no con RGTA 1012 mediante incubación en una solución salina que comprendía 100 microgramos por mililitro de este producto. Después, los animales se mantuvieron en jaulas sin limitaciones deambulatorias. El

35 fémur de los animales se radiografió cada dos semanas durante 12 semanas antes de someterlos a eutanasia. Después, los fémures se retiraron y se sometieron a los tratamientos requeridos para el estudio histológico. Las radiografías se estudiaron especialmente en sus aspectos densitométricos mediante análisis por imagen.

La figura 29 muestra los efectos de los RGTA sobre la regeneración de los huesos largos y muestra especialmente 40 los estudios histológicos y radiográficos de fémures de ratas que se trataron o no con RGTA 1015.

La figura 29-A muestra el defecto del modelo creado en la diáfisis femoral.

Las figuras 29-B, 29-D, 29-F y 29-H representan radiografías de fémures de diferentes grupos experimentales. Las

45 figuras 29-C, 29-E y 29-G representan secciones histológicas de piezas operativas correspondientes a los especimenes presentados en 29-D, 29-F y 29-H, respectivamente.

Las figuras 29-C y 29-D muestran el defecto femoral que no recibió ningún tratamiento particular. Durante el periodo de 12 semanas no hubo ningún fenómeno cicatricial y el tronco óseo no se reconstituyó.

50 Las figuras 29-E y 29-F muestran que el defecto óseo se rellenó por la matriz ósea desmineralizada. En este caso, el relleno tuvo lugar pero no puede observarse reorganización. La estructura del relleno no presenta la organización de un hueso largo tradicional.

55 En las figuras 29-G y 29-H, puede observarse que el defecto óseo se rellenó por la matriz ósea desmineralizada impregnada en una solución de RGTA 1015. En este caso, la estructura de los tejidos de relleno corresponde a la del hueso normal. El hueso cortical compacto es comparable con la zona no lesionada en la que puede observarse la marca del tornillo de fijación. Esta parte delimita una cavidad rellena con médula ósea en continuidad con la cavidad medular original.

E99932921

17-08-2015

Las figuras 29-I1, 29-I2, 29-J1 y 29-J2 muestran el efecto de RGTA 10I5 en la velocidad de reforma del hueso largo. Las radiografías I1 e I2 se tomaron a las 8 semanas; las radiografías J1 y J2 se tomaron a las 12 semanas. I1 y J1 corresponden al tratamiento presentado en 29-E y 29-F en el que el defecto óseo se rellenó únicamente por la matriz 5 ósea desmineralizada sin RGTA. I2 y J2 corresponden al tratamiento presentado en 29-G y 29-H donde el defecto óseo se rellenó por la matriz ósea desmineralizada impregnada en una solución de RGTA 1015. Estas radiografías muestran una aceleración de la cicatrización y especialmente de la maduración de los huesos reformados y en cuanto a una corticalización pronunciada (12 y J2) no detectable I1 y J1. RGTA 1015 actúa como un agente de regeneración que permite una reconstitución acelerada de la estructura ósea del hueso largo con una estructura

10 idéntica a la del hueso original.

Por lo tanto, de una manera sorprendente, RGTA 1012 impregnado en la matriz ósea desmineralizada, en comparación con una matriz impregnada en suero fisiológico sin el polímero, induce una aceleración extremadamente significativa en los procesos de reestructuración y maduración del hueso. Este efecto se manifiesta 15 en la aparición de nuevas cortezas después de sólo 8 semanas, mientras que este fenómeno no tuvo lugar en la condición de control. Después de 12 semanas, seis de los sietes animales tratados por la asociación con RGTA 1012 presentaron en el estudio radiológico la evidencia de una unión completa del defecto con la reforma de cortezas gruesas y delimitadas mientras que sin CM1DS2 únicamente puede observarse la unión con imágenes radiológicas de hueso inmaduro sin corticalización. Un estudio cuantitativo de análisis por imagen de las radiografías

20 confirmó estas observaciones. Este estudio también mostró que el perfil de los huesos tratados por RGTA 1012 es comparable al del hueso normal, siendo la única diferencia que el material óseo tiene una densidad relativamente baja en el punto de tiempo experimental de 12 semanas. La proyección de la densidad del hueso que se forma de nuevo en el defecto original muestra que el tratamiento por el polímero RGTA 1012 induce una reestructuración tisular a través de la reforma cortical y una cavidad medular.

25 Los estudios histológicos se relacionan con y confirman los resultados establecidos en base al análisis por imagen de los datos radiológicos. Estos estudios histológicos demuestran la presencia de nuevas cortezas constituidas por hueso compacto con aún varias regiones de médula y la presencia de una cavidad medular en continuidad con el tronco diafisario original, relleno con médula ósea nueva. Los fémures tratados sin RGTA 1012 no muestran ninguna

30 figura de maduración. El hueso reconstituido no presenta ninguna organización específica. Está constituido por una mezcla heterogénea de hueso compacto y tejido medular sin una delimitación territorial específica.

Estos resultados ilustran los efectos osteoinductores de los polímeros de la invención sobre su capacidad para inducir no sólo la reparación de los huesos largos sino también, y especialmente, su potencial para regular la

35 homeostasis de los tejidos regenerados a nivel de su masa, así como su reorganización.

Las propiedades de RGTA como agente regulador de la homeostasis de los tejidos óseos, es decir, de la masa tisular, su funcionalidad y su reestructuración se confirman por el Ejemplo 17 a continuación.

40 EJEMPLO 17: Efectos de los RGTA sobre la reestructuración y la protección de la masa ósea en un modelo de enfermedad periodontal aguda en el hámster

El modelo usado en este ejemplo pertenece a la reestructuración ósea de la mandíbula del hámster.

45 Se induce una enfermedad periodontal en hámsteres Syrian dorados (centro de crianza Dépré, referencias HSM 41/50) después de dos semanas de una dieta hiperglúcida. El alimento administrado estaba compuesto por sacarosa (56%), leche desnatada en polvo (28%), harina de trigo integral (6%), levadura de cerveza (4%), alfalfa en polvo (3%), polvo de hígado (1%) y cloruro sódico (2%).

50 Los animales se distribuyeron en grupos experimentales. Catorce animales constituyeron los grupos de control que recibieron una dieta normal compuesta por pienso seco. Veinticuatro animales constituyeron los grupos experimentales sometidos a la dieta hiperglúcida. Desarrollaron enfermedad periodontal crónica que se estableció al final de dos meses. Después de este punto temporal, los grupos experimentales recibieron cada semana durante 3 semanas una inyección intramuscular de RGTA 1005 en diferentes dosis comprendidas entre 0,1 y 15 miligramos

55 por kilogramo en un volumen de 0,5 mililitros de suero fisiológico tamponado. Los grupos de control recibieron una inyección de suero fisiológico sin RGTA 1005 (SHAM). El peso de los animales se midió cada semana. Un mes después de cada tipo de tratamiento, los animales se sacrificaron, las mandíbulas se recogieron y se prepararon para su estudio histológico. Las inclusiones de las piezas operativas se implementaron en metacrilato de metilo estabilizado.

E99932921

17-08-2015

En este modelo de enfermedad periodontal, únicamente pudieron procesarse 200 micrómetros en altura para cada hemimandíbula. El sistema se estandariza para estudiar siempre la misma secuencia de secciones a una profundidad que se define y se referencia por los tejidos óseos entre las raíces de los dos primeros molares del lado

5 lingual.

La enfermedad periodontal a nivel de estos molares se manifiesta por la aparición de una bolsa periodontal que delimita un volumen relleno con placa bacteriana. Esta enfermedad conduce a una significativa destrucción del hueso periodontal que se caracteriza por una notable resorción osteoclástica y una reducción de las superficies

10 óseas en aposición, es decir, con respecto a una fase de osteosíntesis.

La resorción ósea se cuantifica midiendo las zonas de contacto entre el hueso y los osteoclastos (Oc). Estas células gigantes que se tiñen en azul mediante azul de toluidina. A su vez, la aposición se caracteriza por una banda de tejido osteoide, identificado por una coloración azul atenuada cubierta por osteoblastos. Por el contrario a los OC, los 15 osteoblastos son células de pequeño tamaño, de forma cúbica y mononucleares. Las cuantificaciones de estos fenómenos se realizan con un sistema de diagnóstico por imagen que usa un programa de tratamiento de imágenes.

La figura 30 presenta las cuantificaciones obtenidas en las diversas condiciones experimentales. En los animales de control que no desarrollaron la enfermedad, la actividad de resorción es prácticamente inexistente mientras que la

20 actividad de aposición es destacada. En los animales no tratados (SHAM), la enfermedad se desarrolló fuertemente y se caracterizó por una resorción intensa y un bajo grado de aposición. En los animales tratados con CM1DS2, particularmente a la dosis de 1,5 miligramos por kilogramo, la tasa de resorción se disminuye en gran medida y se asocia a una tasa de aposición muy grande que alcanza casi el 80% de la tasa observada en los animales de control.

25 Estos efectos se obtuvieron por inyección intramuscular. Muestran que los RGTA regulan la masa tisular ósea reequilibrando el equilibrio de la reestructuración entre la resorción y la aposición.

EJEMPLO 18: Datos farmacocinéticos que demuestran las propiedades de los RGTA para vectorizar moléculas 30 hacia tejidos lesionados

Este ejemplo ilustra la capacidad presentada por los polímeros de la invención para su fijación de manera específica y su concentración en cuanto a los sitios de lesión tisular.

35 En el modelo de la regeneración de músculo aplastado descrito en el Ejemplo 7, se implementa una lesión en las EDL de la pata izquierda de los animales. Cada animal recibe una inyección intravenosa de 2·106 cpm de RGTA 1012 radiomarcado con tritio por la empresa SibTech, Inc. (NY, Estados Unidos). La actividad específica de este trazador es de 20 milicurios por miligramo.

40 En diferentes puntos postoperativos, los músculos de EDL lesionados de las patas izquierdas y los músculos no lesionados de las patas derechas se recogieron y se congelaron en nitrógeno líquido. La implementación de secciones histológicas congeladas permite, por medio un beta generador de imágenes (Société Biospace), la medición de la cantidad de producto radiomarcado fijado en cuanto a las secciones de los tejidos estudiados. Los resultados presentados en la Tabla V a continuación muestran que los músculos lesionados concentraron después

45 de 24 horas una cantidad de producto radioactivo aproximadamente 5 veces mayor que los músculos no lesionados cuyo nivel de marcado no difería del ruido de fondo del dispositivo.

Tabla V

cpm de RGTA 1012 fijado en los tejidos

Tiempo postoperativo

24 horas 48 horas 96 horas

Tejido muscular lesionado

11800 ± 890 10150 ± 10120 9000 ± 790

Tejido muscular de control contralateral

2060 ± 530 1980 ± 390 1870 ± 640

Ruido de fondo de registro

1800 ± 160 1780 ± 210 1950 ± 180

50 Estos resultados demuestran las capacidades de autodireccionamiento de los polímeros de la invención que se concentran específicamente en cuanto a los tejidos que presentan un trastorno o una lesión. Por lo tanto, una propiedad particularmente interesante de estos polímeros reside en su capacidad de vectorizar un principio médico o diagnóstico.

E99932921

17-08-2015

EJEMPLO 19: Efectos de RGTA en periodoncia y sobre la masa ósea

En el campo de la periodoncia, se realizó un estudio macroscópico de la pérdida de hueso alveolar en la 5 periodontitis del hámster.

Después de un periodo de 2 meses para la inducción de la enfermedad, los animales (n = 20) se trataron a través de la ruta IM durante 2 meses más sin actuar sobre la causa inicial de la enfermedad, es decir, el componente bacteriano. Otros animales se dejaron sin tratar (n = 20). Estos dos grupos se compararon con hámsteres sanos (sin

10 periodontitis) (n = 12).

Al final del experimento, todos los tejidos carnosos se retiraron de los maxilares superiores para permitir la determinación de la pérdida ósea. La zona del primer molar se fotografió de forma estandarizada. Se trazó una línea de referencia en cada fotografía que correspondía a la unión esmalte-cemento. Después, se trazó una segunda línea

15 que transcurría a lo largo de los contornos de la cresta ósea. Estas dos líneas se unieron de nuevo delante y detrás del primer molar. Esta superficie se midió.

Cabe apreciar que en los controles, hay una zona de exposición de la raíz que corresponde a:

20 -una zona de inserción fibrosa fisiológica que ancla la encía sobre la raíz, -una pérdida de altura ósea que se produce en relación al envejecimiento de los animales.

En estos animales esta exposición representó 0-96 mm2.

25 En los animales enfermos, la pérdida ósea fue de 1,34 mm2, que incluye la zona fisiológica inicial (que se destruyó durante el transcurso de la periodontitis) y una parte de la pérdida debido al envejecimiento. No obstante, se puede concluir que la enfermedad indujo una pérdida ósea en el orden de 0,38 mm2 (diferencia: p<0,0001).

En los animales tratados, siempre hay una zona incompresible (igual que en los controles). La exposición de la raíz

30 representa 1,02 mm2 en estos animales. Por lo tanto, hay un déficit neto con respecto a los controles de 0,06 mm2 (diferencia no significativa) y una mejora en 0,32 mm2 con respecto a los animales no tratados (p = 0,0005).

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Polímero biocompatible constituido por una secuencia de componentes idénticos o diferentes de la siguiente fórmula general (II)

   5 AaXxYyZz

   en la que:

   10 -A es un monómero de glucosa, -X es CH2COOH o CH2COO-Na+, -Y es -SO3H o -SO3-Na+, -Z representa grupos químicos funcionales, excepto bencilamina y sulfonato bencilamina, idénticos o diferentes, y que son diferentes de X y Y, seleccionados entre aminoácidos, ácidos grasos, alcoholes

   15 grasos, ceramidas o derivados de los mismos, secuencias nucleotídicas de direccionamiento, agentes terapéuticos y agentes de diagnóstico, fijándose los grupos X, Y en el monómero A , -a representa el número de monómeros A, siendo la masa de dichos polímeros de fórmula AaXxYy mayor de 5.000 Daltons,

   20 -x representa una tasa de sustitución de todos los monómeros A por grupos X, que está entre el 20 y el 150%, -y representa una tasa de sustitución de todos los monómeros A por grupos Y, que está entre el 30 y el 150%, -z representa la tasa de sustitución de todos los monómeros A por grupos Z, en la que 0<z≤50%,

   25
2. 2. Polímero biocompatible de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el grupo Z se selecciona entre un antiinflamatorio, un antimicrobiano, un antibiótico, una enzima y un factor de crecimiento.
3. 3. Polímero biocompatible de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los 30 grupos Z se unen covalentemente directamente a los monómeros A o se unen covalentemente a los grupos X e/o Y.
4. 4. Polímero biocompatible de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 1 a 3, en el que los grupos Z se conjuntan a los polímeros por enlaces distintos de enlaces covalentes.

   35 5. Polímero biocompatible de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 1 a 4, en el que los grupos Z se conjugan a los polímeros por interacciones iónicas o hidrófilas.
5. 6. Composición farmacéutica o de diagnóstico, que comprende al menos un polímero de acuerdo con

   una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 asociado a un vehículo farmacéuticamente aceptable. 40
6. 7. Composición farmacéutica o de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la dosificación permite una administración de 0,001 a 1 miligramos de dicho polímero por centímetro cuadrado o de 0,005 a 1 miligramos de polímero por centímetro cúbico.

   45 8. Composición farmacéutica o de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 6 que contiene entre 0,01 y 1 miligramos de dicho polímero por mililitro de la solución fisiológica de dilución.
7. 9. Composición farmacéutica o de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la dosificación permite una administración por vía sistémica, intraperitoneal, intraocular, en el líquido cefalorraquídeo,

   50 en el líquido intracoclear o en cualquier fluido peritisular o intratisular, de 0,1 y 100 miligramos de dicho polímero por kilogramo de peso de un ser humano o animal a tratar.
8. 10. Composición farmacéutica o de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la

   dosificación permite una administración por vía intramuscular de entre 0,2 y 500 miligramos de dicho polímero por 55 kilogramo de peso de un ser humano o animal a tratar.
9. 11. Composición farmacéutica o de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la dosificación permite una administración por vía oral de entre 1 y aproximadamente 5000 miligramos de dicho polímero por kilogramo de peso del ser humano o animal a tratar.

   32
10. 12. Composición farmacéutica o de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, que tiene una actividad anticoagulante inferior a 50 UI/miligramo.

    5 13. Uso de un polímero biocompatible de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 como un medicamento que presenta una actividad reparadora y/o cicatricial de los tejidos musculares, nerviosos y del tracto digestivo y el hueso largo.
11. 14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho medicamento está destinado a la 10 cicatrización de tejidos musculares, nerviosos y del tracto digestivo.
12. 15. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho medicamento está destinado a la cicatrización cutánea.

    15 16. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho medicamento está destinado a la cicatrización de la cornea.
13. 17. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho medicamento está destinado a la

    cicatrización del hueso plano. 20
14. 18. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho medicamento está destinado a la cicatrización del hueso largo.

    33