JP2002502814A - 血管化した正常組織の大きさおよび増殖の調節のための方法 - Google Patents

血管化した正常組織の大きさおよび増殖の調節のための方法

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ロバート エス． ランガー，
ジュダ フォークマン，
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Abstract

(57)【要約】 データは、腹腔へ移植された子宮内膜組織の増殖が新脈管形成インヒビターによって抑制されることを示す。本パイロット研究において用いられたＴＮＰ−４７０の用量は、確立された腫瘍用量の１／３である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、概して、有効量の新脈管形成インヒビターを投与することによる、
肥満および正常な血管化された組織の増殖によって特徴付けられる他の障害の処
置の分野に関する。
【０００２】 （発明の背景） 過体重の蔓延は、殆どの先進国において大流行しており、そしてそれとともに
動揺させるほどの死亡率および罹病率の統計を伴う。肥満は、多数の潜在的な生
命にかかわる疾患（例えば、動脈硬化、高血圧、糖尿病、脳卒中、肺塞栓症、お
よびガン）について充分に確立された危険因子である（Ｍｅｉｓｌｅｒ、Ｊ．Ｓ
ｔ．Ｊｅｏｒ Ｓ．１９９６、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．６３：４０９Ｓ
−４１１Ｓ）。（Ｂｒａｙ Ｇ．１９９６、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ Ｍｅｔａｂ Ｃ
ｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ．２５：９０７−９１９）。さらに、これは、多
数の慢性状態（例えば、呼吸器疾患、変形性関節症、骨粗鬆症、胆嚢疾患、およ
び異常脂肪血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ））を併発する。この問題の膨大
さは、体重の増加につれて死亡率が急上昇するという事実に最も良く反映されて
いる。５０％を超える全死亡原因は、３５００万人の米国人に見られるように一
旦ボディマス指数（ＢＭＩ）が３０ｋｇ／ｍ2を超えた場合の肥満関連状態に起 因する。（Ｌｅｅ Ｌ、Ｐａｆｆｅｎｂａｒｇｅｒ Ｒ． １９９２、ＪＡＭＡ
、２６８：２０４５−２０４９）。年間３００，０００人を超える死亡に寄与す
ることによって、肥満は、喫煙にのみ次いで二番目に、最も一般的な潜在的に予
防可能な死亡原因として位置付けられる。（ＭｃＧｉｎｎｉｓ Ｊ．、Ｆｏｅｇ
ｅ Ｗ．１９９３、ＭＡ ２７０：２２０７−２２１２）。
【０００３】 この問題の壊滅的な医学的結果に伴って、米国における保健医療システムにか
かる深刻な財政的負担が存在する。肥満およびそれに伴う疾患について、医療費
および収入の損失から推定される経済的な影響は、６８０億米ドル／年を超える
と報告されている。（Ｃｏｌｄｉｔｚ Ｇ．１９９２、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎ
ｕｔｒ．５５、５０３Ｓ−５０７Ｓ）。（Ｗｏｌｆ Ａ．、Ｃｏｌｄｉｔｚ Ｇ
．１９９６、Ａｍ Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．６３：４６６Ｓ−４６９Ｓ）。（
Ｗｏｌｆ Ａ．、Ｃｏｌｄｉｔｚ Ｇ． １９９４、Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎ
ｏｍｉｃｓ，５：３４−３７）。これは、減量用食品、製品およびプログラムに
おいて年間に費やされる３００億米ドルを超えるものを含まない。（Ｗｏｌｆ
Ａ．、Ｃｏｌｄｉｔｚ Ｇ．１９９４、Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，
５：３４−３７）。（Ｅｚｚａｔｉら、１９９２、Ｖｉｔａｌ ｈｅａｌｔｈ
Ｓｔａｔ［２］、１１３）。
【０００４】 １９９０年に、米国政府は、この危機に対して、国の主要な保健における目標
として、２０００年までに肥満の蔓延を人口の２０％にまで減少させることを確
立することによって応答した。（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ
、Ｈｅａｌｔｈｙ ｐｅｏｐｌｅ ２０００：ｎａｔｉｏｎａｌ ｈｅａｌｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｂ
ｊｅｃｔｉｖｅｓ．１９９０（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔ
ｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＰＨＳ
９０−５０２１２）。
【０００５】 この目標にもかかわらず、米国における過体重の蔓延は、徐々に増加してきて
おり、最も最近のＮａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏ
ｎ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｕｒｖｅｙ（１９８８−１９９１）において、
驚くべきことに３３．０％に達した（Ｋｕｃｚｍａｒｓｋｉら、１９９４、ＪＡ
ＭＡ．２７２：２０５−２１１）。さらに、平均ＢＭＩもまた、この期間に０．
９ｋｇ／ｍ2増加した。この警戒すべき傾向は、努力の欠如の結果で生じたので はない。対照的に、推定で，男性の２５％、女性の５０％および若者の４４％が
、任意の所定の時機に減量を試みている。（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ
．Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ａｓｓｏｃ．９３：４４５−４４９）。むしろ、過去１０
年間において、３１％の速度の増加および８％の罹患率の増加は、肥満が現在の
処置（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）に極めて抵抗性であるという事実の証拠であ
る。（ＮＩＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｃｏｎｆｅｒｅ
ｎｃｅ Ｐａｎｅｌ、１９９３ Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．１１９：７６
４−７７０）。
【０００６】 確立されたアプローチの長期の失敗の主要な原因は、肥満の機構の誤認および
貧弱な理解に基づく。従来の知見は、肥満が自己に原因がある暴食癖の疾患であ
ることを維持していた。従って、包括的な処置プログラムは、膨大な数のシステ
ムを用いた、カロリー摂取の低減および身体運動の増加をするための行動改変に
焦点が当てられていた。これらの方法は、限定された効力を有し、そして９５％
を超える常習性と関連する。
【０００７】 短期のアプローチの失敗は、肥満の病理生理学を浮き彫りにする最近の進歩と
ともに、潜在的な長期のアジュバント処置として薬理学的治療の再評価をもたら
した。（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｏｂｅｓｉｔｙ．１
９９６、ＪＡＭＡ．２７６：１９０７−１９１５）。（Ｒｙａｎ、Ｄ．１９９６
、Ｅｎｄｏ Ｍｅｔａｂ Ｃｌｉｎ Ｎ Ａｍｅｒ、２５：９８９−１００４）
。この仮定は、体重が血圧に類似する生理学的に制御されたパラメーターであり
、そして肥満が高血圧に類似する慢性疾患であることである。長期（おそらく全
寿命）医学的治療の目標は、健康的な食餌療法および身体運動とともに体重減少
および続く体重の維持の両方を容易にする。このアプローチを評価するために、
現在利用可能な薬物の長期の効力を、非薬理学的介入単独の効力に対して判断し
なければならない。後者のアプローチは、処置２１週間で平均で８．５ｋｇの体
重喪失をもたらし、そして４年目においてその患者の１０〜３０％が体重減少の
５０％を維持するのみである。（Ｗａｄｄｅｎ Ｔ．１９９３、Ａｎｎ Ｉｎｔ
ｅｒｎ Ｍｅｄ．１１９：６８８−６９３）。（Ｋｒａｍｅｒら、１９８９、Ｉ
ｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ．１３：１２３−１３６）。長期の（６ヵ月を超える）単一
薬物（Ｇｕｙ−Ｇｒａｎら、１９８９、Ｌａｎｃｅｔ ２：１１４２−１１４４
）（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９９４ Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ．１８：１２９−
１３５）（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９９３：Ｏｂｅｓ Ｒｅｓ．２：９２−９
８）または組み合わせ治療（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ Ｍ．１９９２、Ｃｌｉｎ Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５１：５８１−５８５）を評価した、このわずか
な研究は、体重減少においてプラセボと比較して緩和な効力を示す。
【０００８】 肥満を処置または予防するために現在使用される全ての医薬は、エネルギー利
用可能性を減少させるかまたはエネルギー出力を増加させるかのいずれかによる
、組織および仕事の脂肪細胞区画に関する。これらの薬剤は、機構に基づいて３
つのカテゴリーへと分類され得る。（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ
ｏｎ Ｏｂｅｓｉｔｙ １９９６、ＪＡＭＡ、２７６：１９０７−１９１５）
。
【０００９】 エネルギー摂取の減少。このアプローチは、食欲の減少または満腹感の増加に
よって食餌摂取を減少させることに関する。これらの「食欲抑制」薬物は、カテ
コールアミン作用系（アンフェタミン、ベンズフェタミン、フェンジメトラジン
、フェンテルミン、マジンドール、ジエチルプロピオン、およびフェニルプロパ
ノールアミン）またはセロトニン作用系（フェンフルラミン、デクスフェンフル
ラミン、フルオキセチン、セルトラリン、または他の抗鬱選択的セロトニン再取
り込みインヒビター（ＳＳＲＩ））のいずれかに作用することによって、神経伝
達物質の活性に影響を与える。
【００１０】 栄養吸収の減少。このカテゴリーの薬物は、消化酵素の作用または栄養の吸収
をブロックする。この型の薬物の例は、オルリスタット（ｏｒｌｉｓｔａｔ）で
あり、これは、胃および膵臓のリパーゼ活性を阻害する。（Ｄｒｅｎｔ Ｍ．、
ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｅｎ Ｅ．１９９５、Ｏｂｅｓ Ｒｅｓ．３（補遺４）：
６２３Ｓ−６２５Ｓ）。これらの医薬は、米国において実験段階であり、そして
肥満の処置について利用可能ではない。
【００１１】 エネルギー消費の増加。エネルギー消費の増加は、代謝速度の増加（例えば、
交感神経系緊張の変化または酸化的リン酸化の脱共役の変化）によって達成され
得る。熱産生代謝に影響を与える薬物は、エフェドリン単独ならびにカフェイン
および／またはアスピリン（Ｐａｓｓｑｕａｌｉ Ｒ．、Ｃａｓｉｍｉｒｒｉ
Ｆ．１９９３ Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ １７（補遺１）：Ｓ６５−Ｓ６８）、お
よびＢＲＬ ２６８３０Ａ（アドレナリン作用性レセプターアゴニスト）（Ｃｏ
ｎｎａｃｈｅｒら、１９９２、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．５５：２５８Ｓ
−２６１Ｓ）との組み合わせを包含する。このクラスの医薬は、体重制禦につい
て、ＦＤＡには承認されていない。
【００１２】 現在、単一薬物療法は、体重喪失を促進するかまたは維持するかのいずれかに
おいて優れたものとしては出現していない。
【００１３】 外科的処置（例えば、胃分画手順、空腸回腸バイパス、および迷走神経切断）
もまた、重症の肥満を処置するために開発されている。（Ｇｒｅｅｎｗａｙ Ｆ
．、１９９６、Ｅｎｄｏ Ｍｅｔａｂ Ｃｌｉｎ Ｎ Ａｍｅｒ．２５：１００
５−１０２７）。長期的には利点であるが、急性のリスク利益比は、肥満手術に
ついてのＮＩＨコンセンサス会議に従えば、病的肥満患者についてこれらの侵襲
的手順を反転する（４０ｋｇ／ｍ2を超えるＢＭＩ）。（ＮＩＨ Ｃｏｎｆｅｒ ｅｎｃｅ、１９９１、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．１１５：９５６−９６１
）。従って、これは、過体重患者が重度に肥満になり、そして付随の合併症に罹
患しない限り、およびそうなるまで、その過体重患者の大部分についての代替手
段ではない。
【００１４】 この組織の血管区画に指向される肥満の医薬処置または外科的処置は存在しな
い。
【００１５】 従って、本発明の目的は、肥満を減少する処置を提供することである。
【００１６】 本発明のさらなる目的は、肥満の処置のための組成物を提供することである。
【００１７】 本発明の別の目的は、他の正常で血管化した組織の過剰増殖を阻害または減少
させるための方法を提供することである。
【００１８】 （発明の要旨） 新脈管形成インヒビターが、その血管区画を調節することによって、正常で、
形質転換しておらず、血管化した組織の大きさおよび／または増殖を調節するの
に有効な量で患者に投与される。制御され得る組織の例は、脂肪組織、腸ポリー
プ、筋肉（心臓を含む）組織、および子宮内膜組織を包含する。新脈管形成イン
ヒビターに対するこれらの組織の応答は、肥満、腸ポリープ、心肥大、および子
宮内膜症の動物モデルに基づいて、容量依存的であり、可逆的であり、そして種
々の異なる新脈管形成インビビターに共通する（例は、ＴＮＰ−４７０、アンギ
オスタチンおよびエンドスタチンを使用する）。脂肪組織モデル（遺伝子的肥満
マウスおよび正常なコントロールマウス）において行われた初期の研究は、脂肪
組織の増殖および重量が微細血管内皮の制御下にあることを示した。脂肪組織の
拡大は、内皮細胞増殖と関連する。新脈管形成の阻害は、脂肪組織重量の減少を
もたらした。新脈管形成インヒビターを受ける動物の体重増加は、対飼育された
マウスにおける体重増加をもたらすに充分な食欲の増加にもかかわらず、有意に
制限された。このインヒビターの中止は、脂肪組織の迅速な拡大をもたらした。
この効果は、用量依存的であり、反復可能に可逆性であり、そして試験したすべ
てのインヒビターに応答して生じた。有意な阻害はまた、腫瘍を処置するために
使用される用量の３分の２以下の用量を用いて腸ポリープおよび心肥大の両方の
動物モデルにおいて観察された。子宮内膜症モデルにおける予備結果もまた、腫
瘍を処置するために使用される投薬量の３分の１の投薬量で、新脈管形成インヒ
ビターを用いて処置した動物における子宮内膜症の発症を減少させる性向を明ら
かに示す。脂肪組織以外の増殖性でない正常組織に対する効果は観察されなかっ
た。
【００１９】 （発明の詳細な説明） 新脈管形成は、新たな血管が形成される過程である。これは、生殖、発生およ
び創傷治癒において必須であり、そしてこれらの正常な事象において高度に調節
される。しかし、調節されず、そして恒常的な新脈管形成はまた、関節炎、眼新
生血管形成および固形腫瘍増殖のような多くの疾患の状態に寄与する。１９８３
年以来、新脈管形成の刺激または阻害のいずれかをするいくつかの分子が同定さ
れている。これらの分子は、診断研究分野における臨床的な適用および試行、創
傷治癒における新脈管形成の迅速化、ならびに新生物における新脈管形成の阻害
をもたらした。
【００２０】 新脈管形成は、固形腫瘍増殖の分野において徹底的に研究されており、そして
多くの調節因子がこれらの組織から単離されている。固形腫瘍の大きさおよび増
殖が新脈管形成依存的であるという実質的な証拠が存在する。単純に述べると、
一旦腫瘍が開始すると、腫瘍細胞集団の各々の増加は、腫瘍に供給するための新
たな毛細管の形成の増加によって進行しなければならない。この関連は、新脈管
形成と「正常」組織もしくは器官（例えば、脂肪組織）との間では決してなされ
ない。
【００２１】 脂肪組織は、高度に血管化した組織であり、そして、主に影響を受けた組織の
血管再生を促進する能力に起因して、数世紀もの間、創傷治癒を容易にするため
に開発されている（Ｂａｌｌ Ｊ．１９２８、Ｔｈｅ ｓａｃｋ−’ｅｍ−ｕｐ
ｍｅｎ：ａｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｓｅ ａｎｄ ｆａｌｌ
ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄｅｒｎ ｒｅｓｕｒｒｅｃｔｉｏｎｉｓｔｓ、Ｏｌｉｖｅ
ｒ ａｎｄ Ｂｏｙｄ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、Ｌｏｎｄｏｎ、ｐ７３）。この特
徴の結果として、脂肪組織は、腸、心筋および移植肺のような、血管供給が重要
である種々の組織を含む外科的手順において利用されつづけている。（Ｓｉｌｖ
ｅｒｍａｎら、１９８８、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ
ｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ。 Ｂｉｏｃｈ Ｂｉｏｐｈｙ Ｒｅｓ Ｃｏｍ．
１５３：３４７−３５２）。
【００２２】 脂肪組織の新脈管形成局面への調査は、血管供給の発達への増殖の依存を明ら
かにした。胚形成の間、血管新生および脂肪細胞分化は、密接に協調された事象
である。新たに形成された脂肪組織は、さらなる増殖および発達のために連続的
な新脈管形成を必要とする。（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ Ｆ．１９６５．Ｔｈｅ ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ、Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第５巻、Ｒｅｎｏｌｄ Ａ．Ｃａｈｉｌｌ
Ｇ．（編）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、Ａｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｏｃ．第
８７〜１００頁）。関連する機構はまた充分明らかになっていないが、脂肪細胞
と微細血管性内皮細胞（ＥＣ）との間の二方向性パラクリン相互作用が重要な調
節的役割を果たすことは公知である。（Ｌａｕ Ｄら、１９９６、Ｉｎｔｅｒｎ
Ｊ．Ｏｂｅｓ．２０（補遺３）、Ｓ１６−Ｓ２５）。これは、脂肪組織から単
離されたＥＣと３Ｔ３細胞（インビトロでの脂肪細胞（ｆａｔ ｃｅｌｌ）の寄
与を殆ど維持する脂肪細胞株）との相互作用を評価するインビトロ研究によって
支持される。（Ｇｒｅｅｎ Ｈ．、１９７８、Ｔｈｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｃｏｎ
ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ３Ｔ３ ｃｅｌｌｓ、１０ｔｈ Ｍｉａｍｉ Ｓｙｍｐ
ｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ． Ａｈｅａｄ Ｆ．Ｓｃｈｕｌｔｚ Ｊ．、Ｒｕｓｓｅ Ｔ．、Ｗａ
ｇｎｅｒ Ｒ．（編）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１３〜
３３頁）。これらの研究は、ＥＣおよび前脂肪細胞の両方が、細胞特異的な様式
で互いに増殖を増強する有糸分裂因子を放出することを実証する。この共生的関
係は、前脂肪細胞が、ＥＣの群の周りの「島（ｉｓｌｅｔ）」において増殖する
同時培養において見られ得る。（Ｌａｕら、１９９６、Ｉｎｔｅｒｎ Ｊ Ｏｂ
ｅｓ．２０（補遺３）Ｓ１６−Ｓ２５）。
【００２３】 関連する化合物の多くを同定するにおいて進歩がなされてきた。３Ｔ３脂肪細
胞は、インビトロでのＥＣ増殖および移動ならびにニワトリ漿尿膜における新脈
管形成を刺激する強力な因子を産生する。（Ｃｙｓｔｏｌｉｔｈら、１９８２、
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：６００７−６０１１）
。（Ｃｙｓｔｏｌｉｔｈら、１９８２、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ．７：５５９７−５６０１）。１つのこのような化合物は、そのレベル
が脂肪細胞分化の間に少なくとも２００倍に増加する脈管新生因子である１−ブ
チリル−グリセロールであると同定された。（Ｄｏｂｓｏｎら、１９９０．Ｃｅ
ｌｌ、６１：２２３−２３０）。脂肪細胞はまた、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２、ＴＮＦ
−（、ｂＦＧＦ、およびＦＧＦ−９を含む、公知の新脈管形成活性を有する他の
因子を産生する。（Ｆｏｒｍ Ｄ．、Ａｕｅｒｂａｃｈ Ｒ．、１９８３、Ｐｒ
ｏｃ．Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１７２：２１４−２１８）。（Ｓｍ
ｉｔｈ Ｓ．１９９６．Ｅｎｄｏ Ｍｅｔａｂ Ｃｌｉｎ Ｎ Ａｍｅｒ．２５
：９２１−９４２）。（Ｔｅｉｃｈｅｒｔ−Ｋｕｌｉｓｚｅｎｗｓｋａら、１９
９２、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．９０：１２２５−１２３１）。（Ｓａｍａ
ｇｈら、１９９５、Ｏｂｅｓ Ｒｅｓ．３：３０７Ｓ）。再現性良く、脂肪組織
から単離されたＥＣは、マイトジェンを培養培地に放出し、これは、用量依存的
な様式で前脂肪細胞複製を刺激した。（Ｌａら、１９９６、Ｉｎｔｅｒｎ Ｊ
Ｏｂｅｓ．２０（補遺３）Ｓ１６−Ｓ２５）。ＥＣ由来のマイトジェンの部分精
製は、分子量が１８〜６７ｋＤａに及ぶいくつかの活性タンパク質を明らかにし
、これらのいくつかは、ヘパリン結合性ＦＧＦファミリーに属し得る。（Ｌａｕ
ら、１９９０ Ｉｎｔ．Ｊ Ｏｂｅｓ．１４：１９３−２０１）。脂肪組織とＥ
Ｃとの間の複雑なオートクリン／パラクリン連絡は、活発な研究分野のままであ
る。
【００２４】 実施例に記載される研究は、脂肪生成が新たな血管の増殖に依存するという反
駁し得ない証左を提供する。次いで、固形腫瘍増殖への拡張および類似により、
抗新脈管形成薬剤を用いた血管新生の予防は、脂肪組織の増殖を予防する。しか
し、驚くべきことに、実施例からもまた、脂肪組織の増殖の増加が存在する動物
のみならず正常動物において新脈管形成が体重喪失を生じ得ることは明らかであ
る。これらの結果は、新脈管形成の投与が脂肪組織の大きさおよび増殖を調節す
るために使用し得るという強力な証左を提供する。
【００２５】 これらの動物において記載されるさらなる研究は、新脈管形成の投与を使用し
て、その組織に該を与えることなく、正常な血管化した組織の大きさおよび／ま
たは増殖を調節し得るというさらなる証左を提供する。本明細書において使用さ
れる場合、「正常」組織とは、ガン性でない（すなわち、形質転換されていない
）組織か、または創傷治癒から生じる瘢痕組織をいう。本明細書において使用さ
れる場合、「血管化した組織」とは、筋肉、腸、脂肪組織、および子宮内膜のよ
うな組織をいい、これらはその組織を通じて栄養および気体交換を提供する血液
供給によって通常特徴付けられる。「血管系」とは、血管化した組織とは対照的
に、血管自体をいう。
【００２６】 Ｉ．脂肪組織を減少させるための組成物 Ａ．新脈管形成機構を阻害する化合物 任意の抗新脈管形成化合物を使用して正常な血管化した組織の大きさおよび／
または増殖を調節し得る。好ましい例示的な抗新脈管形成化合物は、ＴＮＰ−４
７０（米国特許第５，２９０，８０７号に記載される）；アンギオスタチン（Ａ
ｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ；米国特許第５，６３９，７２５号に記載される）；エン
ドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）およびサリドマイド（Ｔｈａｌｉｄｏｍｉ
ｄｅ）を包含する。他の化合物も、当業者に公知である。以下の新脈管形成イン
ヒビターのリストは、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ、１
９９８年１０月１日に公開された。
【００２７】
【表１】 Ｂ．投与のためのキャリア／経路／手段： 薬物は、非経口または腸内投与され得る。好ましい実施態様では、薬物は、胃
への通過の間、薬物を保護するために必要であれば、腸溶性キャリア中で経口投
与される。代替的な送達方法は、静脈内、経頬、または他の経膜送達、および徐
放性処方を包含する。
【００２８】 Ｃ．投薬量 抗新脈管形成組成物は、血管化組織の大きさおよび／または成長を調節するの
に有効な量で投与される。有効な量は、代表的には、組織増殖を制限するか、ま
たは組織の大きさを減少させる（特に、組織が脂肪組織である場合）のに有効な
量である。本明細書中で用いられるような組成物は、全身毒性を実質的に存在さ
せることなく所望の調節を達成するように患者を処置するために、有効量の新脈
管形成インヒビターを含む。
【００２９】 ＩＩ．処置方法 Ａ．提案される処置スケジュール 実施例によって実証されるように、新脈管形成インヒビターは、処置されるべ
き血管組織の大きさおよび／または成長を調節する血管レベルを生じる量および
期間で投与される。肥満症の処置のために好ましい実施態様では、患者は、維持
レベルに体重を減少させるのに有効な投薬量で一日に一度、薬物を受容する。
【００３０】 Ｂ．患者のタイプ 処置方法は、通常の超過体重の個体および遺伝的欠陥を有する個体の両方に適
用可能であることが実証されている。この方法はまた、ホルモンもしくは代謝の
欠陥または薬物副作用に起因する体重増加を伴うほとんどの場合において有用で
あるはずである。除脂肪体重を維持し、かつ慢性投与の間の体重減少を持続し得
ながら体脂肪の減少を促進することに加えて、処置の他の利点は、肥満関連糖尿
病において、そしていくつかの薬物（例えば、ＴＮＰ−４７０、食欲減少（すな
わち、食欲抑制薬））の場合において、血中グルコースレベルの正常化を包含す
る。これらの結果は、望ましくない副作用もなく得られ得、乱用または依存性に
なる可能性がない。
【００３１】 正常な器官の大きさおよび成長の新脈管形成依存性は、過剰または不充分な組
織成長が臨床続発症を生じる領域、ならびに組織工学の分野において密接な関係
を有する。実施例は、子宮内膜症、ポリープ症、心肥大、ならびに肥満症の動物
モデルの効力を実証する。これらの結果は、他のタイプの正常組織の大きさまた
は成長の増大を伴う障害（例えば、子宮類腺維、前立腺肥大、およびアミロイド
症）の処置のための効力を示している。これらの障害は、代表的には、組織の大
きさまたは成長が正常でなく、しかし、組織が悪性形質転換されておらず、もと
の組織と完全に異なっているわけではないが、位置（子宮内膜症の場合のような
）または成長（器官肥大）が異常である患者を伴う。
【００３２】 ＩＩＩ．実施例 本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解される・ （実施例１：ＴＮＰ−４７０による遺伝的肥満マウスの処置） 第一のシリーズの実験をｏｂ／ｏｂマウス（レプチン遺伝子における自発性変
異の結果として病的肥満を生じるマウス系統）において実施した。（Ｚｈａｎｇ
ら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ．３７２：４２５−４３２）。動物研究は、Ｃｈｉ
ｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｂｏｓｔｏｎの動物施設において施
設ガイドラインに従って実施した。７週齢から６ヵ月齢の、そして３５〜７０ｇ
の体重の雄のｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を実験前に順応させ、個々に収容し、そして研究
の間中は自由に水に接近できるようにした。全ての手順（剃毛および写真撮影）
の前に、動物を吸入メトキシフルオラン（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ，Ｉｎｃ．
，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）で麻酔し、そして完全に目覚めるまでモニタリン
グした。動物を実験の最後に、メトキシフルオランの連続吸入によって屠殺した
。
【００３３】 注射を容易にするために、マウスの背中を剃った。全ての注射および測定を各
日午後４時から６時の間に実施した。マウスに、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／
ｋｇのＴＮＰ−４７０（ＡＧＭ−１４７０）または生理食塩水コントロールを、
（ここまで）３０日までの処置期間の間、３０Ｇ注射針を用いて皮下注射した。
皮下脂肪は、ＴＮＰ−４７０注射の部位で減少することが観察されたので、注射
部位を背側に沿って変化させた。比較のために、１つの動物群は、フェンフルラ
ミン（４０（：ｇ／ｋｇ、腹腔内、毎日）を受容した。各動物の体重および残り
の食物を各日測定した。１つの動物群には、ＴＮＰ−４７０の体重減少効果の全
体または一部が食欲抑制の結果であるか否かを決定するために、ペアで給餌した
。これは、未処理マウスを各処理マウスと対にし、未処理マウスに、その処理パ
ートナーが前日食餌した量を食餌させることにより行った。
【００３４】 図１Ａは、ＴＮＰ−４７０で処置したマウスの体重減少応答を示す。処置マウ
スは、用量依存様式で体重を減少した。ＴＮＰ−４７０処置群における体重減少
は、最大用量のフェンフルラミンで達成されたより有意に大きかった。１０ｍｇ
／ｋｇのＴＮＰを受容する群の体重減少は、それらが約２２〜２４ｇの除脂肪体
重に達するまで、平均して１日あたり１ｇで続いた。この体重減少は、研究の開
始時の動物の体重とは独立して達成された。動物の体重は、継続した薬物投与に
関わらず、これらのレベルで安定した。より低い用量のＴＮＰ−４７０を受容し
た動物は、より高い体重で安定した。動物は、研究を通して健常でかつ活動的な
ままであった。
【００３５】 図１Ｂに示すように、ＴＮＰ−４７０で処置されたマウスは、単独では体重の
減少を生じたコントロールマウスと比較して、食欲の低下を有した。しかし、食
物摂取の減少から生じる体重減少は、ＴＮＰ−４７０により達成された体重減少
より有意に低かった。これらの結果は、ＴＮＰ−４７０が、体重を減少させるた
めに２つの機構によって作用していることを示唆する。この２つの機構は、中枢
食欲抑制および末梢新脈管形成阻害である。ＴＮＰ−４７０の食欲抑制効果は、
これまで報告されていない。
【００３６】 （実施例２：ＴＮＰ−４７０の投与による脂肪を減少させるための正常マウス
の処置） ペア給餌実験を、肥満症を発症しなかったレプチン遺伝子変異を有さない正常
マウスを用いて繰り返した。これらの動物（それらの除脂肪体重に比較的近くで
研究を開始した）では、処置群およびペアの給餌群に類似した少ない体重減少が
観察された。このことは、痩せ動物では、緩慢に成長する脂肪組織において生じ
る新脈管形成が制限されると予期されるが、ＴＮＰ−４７０による体重減少のほ
とんどが、食欲抑制の結果であることを示唆する。これらの動物はまた、毒性の
形跡を示さなかった。
【００３７】 脂肪組織の試料を、ＰＣＮＡおよびＢｒｄｕ染色法を用いて、処置マウスおよ
び未処置マウスの両方において、新規な血管形成を示す内皮細胞増殖の証拠のた
めに、組織学的に試験した。未処置マウスでは、ＴＮＰ−４７０を受容したマウ
スと比較して有意に大きい内皮細胞増殖が存在した。このことは、これらのマウ
スの脂肪組織において新脈管形成が存在すること、およびそれは、ＴＮＰ−４７
０によって阻害され得るという仮説を支持する。
【００３８】 結論として、ＴＮＰ−４７０は、肥満症マウスおよび正常マウスの両方におい
て、除脂肪体重のレベルにまで、用量依存性での体重減少を引き起こした。これ
は、動物の出発体重とは独立した、食欲抑制および新脈管形成の阻害の両方の結
果としてである。ＴＮＰ−４７０を用いて達成された体重減少の量は、フェンフ
ルラミンを用いて達成されたよりもはるかに優れている。これらの結果は、肥満
症の処置のための新脈管形成阻害の使用を支持する。さらに、ＴＮＰ−４７０の
食欲抑制効果もまた確立される。
【００３９】 （実験手順） （動物研究） 動物研究を、ＢｏｓｔｏｎにあるＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌで
、施設ガイドラインに従って実施した。雄のｏｂ／ｏｂ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マ
ウスおよびＣ５７（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスを７週齢で購入し、そして実験前
の１週間、順応させた（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ
Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）。マウスを、水および標準的な固形飼料に自由に接近でき
るようにして、個々に収容した。取り扱いは、食餌規則の破壊を最小限にするた
めに、午後４時から６時の間に行った。動物を、不快または苦痛を引き起こす手
順の前に吸入メトキシフルオラン（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｍｕ
ｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）で麻酔し、そして完全に目覚めるまでモニタリングした
。注射を容易にするために、マウスの背中を剃った。ＴＮＰ−４７０は、Ｔａｋ
ｅｄａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｌｔｄ（Ｏｓａｋａ、Ｊａ
ｐａｎ）の好意により提供していただき、４０℃で乾燥保存した。溶液を正常生
理食塩水中で毎日調製し、背面に沿って部位を変えながら皮下投与した。体重お
よび給餌器内に残っている固形飼料を毎日測定した。動物をＣＯ2の連続吸入に よって屠殺した。
【００４０】 用量応答研究 ８週齢のｏｂ／ｏｂマウスを２．５、５．０、７．５、または
１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０で２１日間処置した。コントロール群は、
０．１ｍｌ／日の生理食塩水を受容した。１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０
を受容した群には８匹のマウスが含まれ、そして他の全ての群にはそれぞれ４匹
のマウスが含まれた。
【００４１】 病的肥満症マウスの処置 ８週齢のｏｂ／ｏｂマウスを、急速成長期を完了し
、そして６０ｇを超える体重になるまで収容した。約５ヶ月齢（ｎ＝６）で、１
０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０で処置を開始し、そして６７日間続けた。ｏ
ｂ／ｏｂマウスの年齢適合コントロール群（ｎ＝６）は、０．１ｍｌ／日の生理
食塩水を受容した。
【００４２】 長期処置研究 ８週齢（ｎ＝６）のｏｂ／ｏｂマウスを、１０ｍｇ／ｋｇ／日
のＴＮＰ−４７０で１３８日間処置した。コントロール群（ｎ＝４）は、０．１
ｍｌ／日の生理食塩水を受容した。正常な年齢適合Ｃ５７マウス（ｎ＝５）の体
重を比較のために毎日記録した。
【００４３】 フェンフルラミンを用いる比較 ８週齢のｏｂ／ｏｂマウスを、０．１ｍｌの
生理食塩水中の４０ｍｇ／ｋｇ／日で４５日間腹腔内注射した（ｎ＝１２）。次
いで、マウスを、均等に３群に分割し、そして以下のいずれかを行った：１）治
療をとりやめる；２）フェンフルラミンで続ける；または３）１６８日の研究の
残りの間、１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０に変更した。ｏｂ／ｏｂマウス
のコントロール群（ｎ＝４）は、０．１ｍｌ／日の生理食塩水を受容した。
【００４４】 ペア給餌研究 固形飼料に自由に接近できる８週齢のｏｂ／ｏｂマウスを、１
０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０で処置した（ｎ＝４）。給餌器内に残ってい
る固形飼料を毎日秤量し、各マウスによって１日あたりに消費された量を計算し
た。次いで、この食物量を、第二の未処置群（ｎ＝４）におけるペアのマウスに
給餌した。固形飼料に自由に接近できる未処置マウスのコントロール群の食物消
費もまた記録した。体重を毎日測定した。実験を、正常な年齢適合Ｃ５７マウス
（ｎ＝５／群）を用いて繰り返した。ペア給餌実験をまた、このプロトコルの後
にアンジオスタチンおよびエンドスタチンで処置したマウスを用いて行った。
【００４５】 ＴＮＰ−４７０での循環処置 ８週齢のｏｂ／ｏｂマウスを（ｎ＝１５）を、
１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０の断続的な周期で処置した。マウスは、４
５ｇの体重で出発し、そして年齢適合Ｃ５７マウスの体重にそれらが減少するま
で処置した。次いで、処置を中断し、そしてマウスを４５ｇの出発体重に戻るま
で体重増加させた。この周期を２回繰り返した。ここでの再現性および６０ｇを
超える体重のｏｂ／ｏｂマウスにおける効力を実証すると、次いで、処置群を、
処置を再開する前に第三周期（１３５日目）で５９ｇの平均体重にまで増加させ
た。続いて、マウスを、ｏｂ／ｏｂ群の体重とＣ５７コントロール群の体重との
間を循環させた。全てのマウスを毎日、重量測定した。
【００４６】 肥満症マウスのアンジオスタチンおよびエンドスタチン処置 組換えマウスエ
ンドスタチンおよびアンジオスタチンを、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、１９９４ Ｃｅ
ｌｌ．７９：３１５−３２８；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、１９９７．Ｃｅｌｌ．８８
：２７７−２８５により記載のように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉによ
って産生した。８週齢のｏｂ／ｏｂマウス（ｎ＝３／群）は、２０ｍｇ／ｋｇ／
日でのもしくは１日に２回の５０ｍｇ／ｋｇでのアンジオスタチン、または１日
に２回の５０ｍｇ／ｋｇでのエンドスタチンの皮下注射を２２日間受容した。ｏ
ｂ／ｏｂマウスのコントロール群（ｎ＝３）は、０．１ｍｌ／日の生理食塩水を
受容した。
【００４７】 体組成アッセイ マウスの体組成を、トリチウム化水希釈技術（Ｌｏｇｓｄｏ
ｎ、１９７２ Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４４：１４６−
１４９）を使用して評価した。ＴＮＰ−４７０（９０日目）を用いる長期処置研
究からの５ヶ月齢の処置（ｎ＝６）動物およびコントロール（ｎ＝３）動物、お
よび正常年齢適合Ｃ５７マウス（ｎ＝３）をこの研究のために使用した。マウス
を、水に自由に接近できるようにして１２時間絶食させた。次いで、それらに２
００μｌのトリチウム化水（１００μＣｉ／ｍｌ）を給水し、そしてさらに２時
間絶食させ、トリチウムを水区画内で平衡させた。次いで、動物を麻酔し、２分
間熱ランプ下に置き、尾部血管拡張を誘導した。０．５ｍｍの深さの切開を、＃
１０手術刃を用いて基部から５ｍｍで、尾の腹側の長軸に対して垂直に行った。
中枢尾動脈に傷を与えることを避けるために注意を払った。５０μｌの血液試料
を尾静脈から血清分離バイアルに採集し、氷上に置いた。出血を切開全面を軽く
圧迫することにより停止させた。トリチウム化水比活性を、Ｗａｌｌａｃ １４
０９液体シンチレーションカウンターを用いて、１０μｌの血漿および３ｍｌの
Ｅｃｏｌｕｍｅシンチレーション液（ＩＣＮ；Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ、ＣＡ）を
含有する試料において測定した。反復試料間の変動は、平均して１０％未満であ
った。所望のパラメーターを計算するために、以下の式を使用した：
【００４８】
【数１】 血清の約９４％が水であるという事実のために補正するために、１．０６４の
係数を使用した。２，０００の係数は、投与した用量中の総トリチウム化活性を
計算するために必要とされる希釈係数である。
【００４９】
【数２】 ０．７３の係数は、死体の分析から得られるような、除脂肪体重で見出される
総身体水分の平均パーセントである（Ｗｉｄｄｏｗｓｏｎら、１９６８）。
【００５０】
【数３】
【００５１】
【数４】 血清中グルコース測定 ９ヶ月齢の処置（ｎ＝５）および未処置（ｎ＝１３）
ｏｂ／ｏｂマウスの血清中グルコースレベルを、体重応答研究の終了時に測定し
た。血液試料（１００μｌ）を、上述のように、麻酔したマウスの尾静脈から採
集した。血清中グルコースレベルを、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ
、Ｂｏｓｔｏｎの臨床化学実験室によって測定し、そしてｍｇ／ｄｌで表す。
【００５２】 （細胞培養研究） ウシ毛管内皮細胞（ＢＣＥ）を、Ｆｏｌｋｍａｎら、１９７９ Ｐｒｏｃ Ｎ
ａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：５２１７−５２２１に以前に記載の
ようにして得た。ＢＣＥを、１．５％ゼラチンでコーティングした組織培養プレ
ート上にプレートし、そして１０％ウシ胎児血清（ＢＣＳ）、１％グルタミン／
抗生物質（ＧＰＳ）、および３ｎｇ／ｍｌ組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子
（ｂＦＧＦ；Ｓｃｉｏｓ Ｎｏｖａ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）を含有
するＤＭＥＭ中で培養した。ＢＣＥを、３７℃で１０％ＣＯ2中に維持し、そし て０．５％トリプシン溶液を用いてコンフルエントで継代させた。３Ｔ３−Ｌ１
細胞を、ＡＴＣＣから得、そして付随の指示書に従って維持した。３Ｔ３−Ｌ１
を、抗生物質を含まない１０％ＢＣＳを含有するＤＭＥＭ中で培養し、そして未
コーティングの組織培養プレート上にプレートした。細胞を、７０％コンフルエ
ントのとき、脂肪細胞における分化を避けるために、０．５％トリプシン溶液を
用いて継代した。
【００５３】 ウシ毛管内皮細胞増殖アッセイ ＢＣＥを、増殖アッセイにおいて使用する前
に５日間コンフルエントに維持した。細胞をＰＢＳで洗浄し、そして０．０５％
トリプシン溶液中に分散した。ＢＣＥを、１０％ＢＣＳおよび１％ＧＰＳを含有
するＤＭＥＭ中に再懸濁し（２５，０００細胞／ｍｌ）、そして１２，５００細
胞／ウェル（０．５ｍｌ／ウェル）の密度でゼラチン処理した２４ウェル培養プ
レート上にプレートした。プレートを２４時間インキュベートした。培地を、最
終濃度の２倍で試験試料を含有する０．２５ｍｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ＋５
％ＢＣＳ＋１％ＧＰＳ）と置き換えた。インキュベーションの３０分後、２ｎｇ
／ｍｌのｂＦＧＦを含有する０．２５ｍｌのアッセイ培地を添加した。次いで、
ウェルは、１倍濃度の試験試料および１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと共に０．５ｍｌ
のアッセイ培地を含有した。インキュベーションの７２時間後、細胞をトリプシ
ン中に分散させ、Ｈｅｍａｔａｌｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐ
ｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）中に再懸濁し、そしてＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅ
ｒを用いて計数した。
【００５４】 ３Ｔ３−Ｌ１細胞増殖アッセイ ３Ｔ３―Ｌ１の細胞のサブコンフルエント培
養物をＰＢＳで培養し、そして０．０５％トリプシン溶液中に分散させた。細胞
を、１０％ＢＣＳを含有するＤＭＥＭ中に再懸濁し（１６，０００細胞／ｍｌ）
、８，０００細胞／ウェル（０．５ｍｌ／ウェル）の密度で２４ウェル組織培養
プレート上にプレートした。プレートを２４時間インキュベートした。培地を、
最終濃度の２倍で試験試料を含有する０．２５ｍｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ＋
５％ＢＣＳ）と置き換えた。インキュベーションの３０分後、２ｎｇ／ｍｌのｂ
ＦＧＦを含有する０．２５ｍｌのアッセイ培地を添加した。次いで、ウェルは、
１倍濃度の試験試料および１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと共に０．５ｍｌのアッセイ
培地を含有した。インキュベーションの７２時間後、細胞をトリプシン中に分散
させ、Ｈｅｍａｔａｌｌ中に再懸濁し、そしてＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ
を用いて計数した。
【００５５】 （免疫組織化学） 脂肪組織切片における増殖細胞（Ｂｒｄｕ）および内皮細胞（フォン ビルブ
ラント因子；ｖＷＦ）の同時同定を可能にするために、二重蛍光標識化技術を使
用した。脂肪組織を、冷Ｃａｒｎｏｙ固定液中に４時間固定し、そして１００％
エタノールに移した。組織を、標準的な組織学的手順に従って、パラフィン中に
包埋した。切片（５μｍ厚）を１０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで、３７℃で２
０分間、透過処理し、そしてＰＢＳで洗浄した。増殖細胞を標識化するために、
切片を、抗Ｂｒｄｕ／ヌクレアーゼ混合物（Ｂｒｄｕ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎ
ｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に、室温で６０分間インキュベートし、そしてＰＢＳ
で洗浄した。スライドを、フルオレセイン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ
；Ｂｕｒｌｉｎｇａｎｅ、ＣＡ）中に４℃で一晩インキュベートした。内皮を標
識化するために、切片を、３０分間５％ウマ血清を用いてブロックし、次いでＰ
ＢＳ中に５％ヤギ血清中に希釈したヒトフォンビルブラント因子（ＤＡＫＯ）に
対するウサギ抗血清と共にインキュベートした。抗体結合を、Ｔｅｘａｓ Ｒｅ
ｄ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に
よって検出した。染色切片を、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）で保存した
。スライドを、ＦＩＴＣ励起について４８５ｎｍの青色光（Ｂｒｄｕ）、および
Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ励起について５１０〜５６０ｎｍの緑色光（内皮）を使用し
てＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅ
ｎ、ＦＲＧ）を用いて分析した。写真をＥｃｋｔａｃｈｒｏｍｅ ｐ１６００フ
ィルム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を用いて４
０倍の倍率で撮影した。増殖内皮は、黄色細胞（緑＋赤）としてフィルム上に検
出可能であった。
【００５６】 （統計学的分析） 片側スチューデントｔ検定を、処置群と未処置群との間の体重、体重脂肪パー
セント、および血清中グルコースレベルの比較のために使用した。処置群とペア
給餌群との間の比較を、両側スチューデントｔ検定を用いて行った。
【００５７】 （結果） （肥満症マウスおよび非肥満症マウスにおける体重増加） これらの研究に使用した肥満症（ｏｂ／ｏｂ）マウスおよび非肥満症（Ｃ５７
）マウスは共に、生存中の最初の数ヶ月の間に急速成長期および体重増加着を経
験した。これは、動物の加齢につれて遅延した。しかし、ｏｂ／ｏｂマウスは、
年齢適合コントロールに比較して、ずっとより速い速度で２〜３倍に体重を増加
した。この差異は、過剰な脂肪組織の蓄積によって大部分は説明された。これら
の研究において、８週齢のｏｂ／ｏｂマウスは、４４．６±０．７ｇの体重であ
り、０．４ｇ／日の平均速度で増加した（ｎ＝１２）。比較のために、正常な年
齢適合Ｃ５７マウスは、２３．０±０．６ｇの体重であり、０．１ｇ／日の平均
速度で増加した（ｎ＝５）。肥満症マウスは、３〜４ヶ月齢で３０ｇを超える最
大体重を減少させたそれらの正常な対応のマウスと比較して、８〜９ヶ月齢で７
０ｇより大きい最大体重に達した。
【００５８】 （新脈管形成インヒビターに対する肥満症マウスの体重応答） ｏｂ／ｏｂマウスが体重を増加させる能力に対する新脈管形成インヒビターの
効果を試験した。ＴＮＰ−４７０（選択的な新脈管形成インヒビター）を、肥満
症マウスに、２．５、５．０、７．５、および１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で２１
日間投与した。ＴＮＰ−４７０を受容した肥満症マウスは、一定速度で、一定期
間の間、かつ用量に依存する程度に、体重を減少させた（図２）。体重減少の速
度は、２．５ｍｇ／ｋｇ／日の用量での０．５ｇ／日から、１０ｍｇ／ｋｇ／日
以上の用量での最大１．２ｇ／日までの範囲であった（ｐ＜０．００００１）。
比較のために、４日間カロリー摂取のないマウスで生じた体重減少の最大速度は
、１．２ｇ／日であった。継続した処置にもかかわらず、マウスは、２．５ｍｇ
／ｋｇ／日での１０日後には、４０．５±０．９ｇの範囲の体重で一様になるか
、または降下した（ｐ＜０．００００１）。４５ｇの平均出発体重に対して、こ
れは、ＴＮＰ−４７０の用量に依存して、４〜２５ｇの体重減少となった。対し
て、未処置マウスは、平均して９ｇの体重を増加し、本研究の終了時までに５３
．８±０．６ｇの体重に達した。コントロールマウスの最終体重に対して、ＴＮ
Ｐ−４７０処置マウスは、１３〜３４ｇ少ない体重であった。
【００５９】 肥満症マウスの体重をまた、特異的新脈管形成インヒビターに応じて評価した
。マウスを、２０ｍｇ／ｋｇ／日もしくは１日に２回の５０ｍｇ／ｋｇの用量の
アンジオスタチン、または５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量のエンドスタチンで、２１
日間処置した（図３）。コントロールマウスは、４５ｇの平均出発体重から０．
４ｇ／日で増加し、２２日目までに５４．６±０．２ｇに達した。対して、新脈
管形成インヒビターを受容するマウスは、体重を、相対的にわずかに増加したか
、または減少した。アンジオスタチンに対する応答は用量依存性であった。２０
ｍｇ／ｋｇ／日では、体重増加は、コントロールの３分の１に制限され、そして
マウスは、研究の終了時までに４８．５±１．１ｇに達した（ｐ＜０．０３）。
１日２回の５０ｍｇ／ｋｇのアンジオスタチンでは、マウスは、４１．７±０．
２ｇに減少し、そして水平に達した（ｐ＜０．０００４）。エンドスタチンで処
置したマウスは、まず約２ｇ減少し、次いで２２日目までに、４８．９±０．８
ｇまで徐々に増加した（ｐ＜０．００２）。最終コントロール体重に対して、処
置マウスは、５〜１３ｇ少ない体重であった。
【００６０】 （ＴＮＰ−４７０での長期処置） 長期研究を、慢性療法に対する体重応答のパターンを決定するために実施した
。マウスを、全部で１３８日間、１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０で処置し
、そして体重を毎日測定した（図４Ａ）。最初に、動物は、１．２ｇ／日の平均
速度で体重を減少し、２０日目には２０．２±０．５ｇの最下点まで減少した。
この後に、急速体重増加の限定された期間が続いた。体重は、本研究の５４日目
までに約３２ｇで一様になり、次いで正常な年齢適合Ｃ５７マウスの成長曲線と
平行になった 動物を、トリチウム化水希釈実験を実施するために、本研究の８９〜９０日目
に全部で２４時間の期間、絶食させた。これは、全ての群において体重減少を生
じた。しかし、処置マウスは、随意食餌に戻したにもかかわらず、この減少した
体重を再増加しなかった。これは、曲線が急降下し、続いてより低い体重への傾
斜が再確立されていることによって反映される。
【００６１】 本研究の終了時には、処置マウスは、３４．８±１．１ｇの体重であった。こ
れに対して、コントロールｏｂ／ｏｂマウスは、７１．０±０．９ｇ（ｐ＜０．
００００１）の体重であり、そして正常な年齢適合Ｃ５７マウスは、３３．１±
０．７ｇの体重であった。処置マウスは、未処置マウスｏｂ／ｏｂよりも３６ｇ
少ない体重であった。
【００６２】 （５ヶ月齢でのＴＮＰ−４７０に対する肥満症マウスの体重応答） 肥満症マウスが加齢するにつれて、マウスは、正常Ｃ５７マウスの２〜３倍の
体重となり、そして体重増加の速度は減少し、ヒトにおける慢性肥満症（Ｃｈｌ
ｏｕｖｅｒａｋｉｓおよびＨｏｊｎｉｃｋｉ，１９７４）により類似するように
なった。ＴＮＰ−４７０がこれらの条件下で同様に有効であるか否かを決定する
ために、ｏｂ／ｏｂマウスを急速成長期が完了するまで収容した。これらのマウ
スは、５ヶ月齢であり、実験開始時には６０ｇより多い体重であった。未処置マ
ウスは、０．１ｇ／日の速度で体重を増加し、本研究の終了時までには７３．０
±１．０ｇに達した。対して、処置マウスは、０．２ｇ／日の速度で、処理の４
０日目までに３９．０±１．９ｇに減少し、そして本研究の６７日の期間一様で
あった（ｐ＜０．００００１）（図４）。正常なＣ５７マウスは、この齢で約３
４ｇの体重であった。従って、これらのより高齢の、非常に肥満である、そして
より多くの体重の安定した動物は、ＴＮＰ−４７０に対して等しく応答性であっ
た。
【００６３】 （ＴＮＰ−４７０で処置した肥満症マウスの身体組成） 正常動物における唯一の成長中の成体器官および新脈管形成部位として、肥満
組織が抗新脈管形成療法に対して選択的に感受性であると仮定された。処置動物
の体重が、出発体重または治療期間に関わらず、正常な年齢適合Ｃ５７マウスの
近似の体重で一様になったという所見は、この仮説と一致した（図４Ａおよび４
Ｂ）。トリチウム化水希釈技術を使用して、マウスの身体組成を評価し、体重減
少が体脂肪パーセントにおける減少（Ｌｏｇｓｄｏｎ，１９７２）と関連するか
どうかを決定した。ＴＮＰ−７４０（１０ｍｇ／ｋｇ／日）で９０日間処置した
マウス（図４Ａ）ならびに年齢適合ｏｂ／ｏｂマウスおよび正常Ｃ５７Ｂ１／６
マウスを使用した。抗新脈管形成療法に応じた体重減少は、３５％から１９％へ
の体脂肪パーセントの４６％減少と関連した（表２；ｐ＜０．００１）。
【００６４】
【表２】 （ＴＮＰ−４７０で処置された肥満マウスの血清グルコースレベル） ｏｂ／ｏｂマウスにおける病的肥満は、インスリン耐性および高血糖症の発達
と関連する（ＣｏｌｅｍａｎおよびＨｕｍｍｅｌ，１９７３）。抗血管形成治療
から生じる体重減少が、糖尿病の発症に対する保護をしたか否かを決定するため
に、血清グルコースレベルを、ＴＮＰ−４７０で１１５日間処置したｏｂ／ｏｂ
マウスおよび非処置コントロールにおいて測定した。非処置マウス（７３ｇ）は
、２２４±１６ｍｇ／ｄｌという平均グルコースレベルを有していた。対照的に
、ＴＮＰ−４７０で処置したｏｂ／ｏｂマウス（４１ｇ）は、１５８±１２．６
ｍｇ／ｄｌ（ｐ＜０．０５）の平均グルコースレベルを有していた。これは、こ
の種について報告された６２〜１７５ｍｇ／ｄｌの正常範囲内にある（Ｈａｒｋ
ｎｅｓｓおよびＷａｇｎｅｒ，１９９５ Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ ｒａｂｂｉｔｓ ａｎｄ ｒｏｄｅｎｔｓ． Ｌｅａ＆
Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｂｏｏｋｓ．Ｍｅｄｉａ，ＰＡ．９３頁）。
【００６５】
【表３】 （肥満マウスのＴＮＰ−４７０での循環処置） 正常組織増殖のこのモデルにおいて抗血管形成治療の可逆性および再現性を実
証するために、ｏｂ／ｏｂマウスを、１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量でのＴＮＰ−４
７０の断続的なサイクルによって処置した（図４Ｃ）。４５ｇの体重で開始した
マウスを、それらが齢の一致するＣ５７マウスの体重まで低減するまで処置した
。次いで、処置を中止し、そしてそのマウスを４５ｇの開始体重まで戻させた。
このサイクルを２回繰り返した。ここで再現性および６０ｇを超える体重のｏｂ
／ｏｂマウスにおける効力を実証したので（図４Ｂ）、次いで、処置を再度開始
する前に第３のサイクル（１３５日目）において、処置グループに約６０ｇまで
体重を増加させた。これは、継続する研究であり、そしてそのマウスは、ｏｂ／
ｏｂグループの体重とＣ５７コントロールグループの体重との間の体重を循環す
る。治療をやめたときの体重増加速度は、コントロールの体重増加速度よりも大
きかった。加速された体重増加が、カロリー制限研究後に、通常の肥満体重が確
立されるまで、これらの動物において以前に報告されている（Ｃｈｌｏｕｖｅｒ
ａｋｉｓ，１９７０）。処置マウスは、ＴＮＰ−４７０を受けている間同様に、
そして繰り返し減少し、そして薬物を中止したときに再び増加した。
【００６６】 （ＴＮＰ−４７０のフェンフルラミンに対する比較） ＴＮＰ−４７０に応答しての体重減少を、食欲不振効果を有するセロトニン取
込み阻害剤であるフェンフルラミンの体重減少と比較した（図５）。高治療用量
（４０ｍｇ／ｋｇ／日）のフェンフルラミンで処置した肥満マウスは、治療の最
初の５日間で４〜５ｇ減少した（ｐ＜０．００５）。その後、それらは継続的な
処置にもかかわらず徐々に体重を再び増加し始めた。研究の４５日目に、そのフ
ェンフルラミン処置マウスを、３つのグループに分割し、そして１）治療から外
すか、２）フェンフルラミンで継続するか、または３）１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴ
ＮＰ−４７０に変更するかのいずれかとした。９４日目までに、コントロールマ
ウスは、体重６５．８±１．４ｇであった；フェンフルラミンから外したマウス
は、体重６５．６±１．４ｇであった；そして、フェンフルラミンで継続したマ
ウスは、体重６２．４±１．９ｇであった。これらのグループのいずれの間にお
いても有意な差異は存在しなかった。対照的に、マウスのサブグループにおいて
ＴＮＰ−４７０でフェンフルラミンを置換することによって、正常Ｃ５７マウス
の体重である３８．５±０．７ｇまで減少させた（ｐ＜０．０００００１）。こ
れは、マウスの外観によりさらに説明された。非処置ｏｂ／ｏｂマウスは、フェ
ンフルラミンで処置したマウスとは容易に区別できないのに対し、ＴＮＰ−４７
０を受けているマウスは、それらのＣ５７対応物と同じ大きさである。
【００６７】 （肥満マウスにおけるＴＮＰ−４７０での長期処置の耐性） ＴＮＰ−４７０での処置は、これまでのところ、１３８日までの期間、１０ｍ
ｇ／ｋｇ／日までの用量に非常によく耐性であった。これは、その動物の寿命の
約１／５である。注目された唯一の有害な効果は、薬物の繰り返し注射の部位で
の中等度の表面的な瘢痕である。食欲は、処置の最初の１０〜２０日間中等度に
抑制され、次いで徐々に正常化した。処置マウスの活動レベルは、Ｃ５７マウス
の活動レベルと同様であり、そしてコントロールｏｂ／ｏｂマウス（これらは体
重が増加するにつれて不活発になった）とは対照的であった。
【００６８】 結論として、これらの研究は、抗血管形成治療が、３つの異なる血管形成イン
ヒビターを用いて、遺伝的に肥満のマウスにおいて有意な体重減少および体脂肪
の減少をもたらすことを実証した。これは、アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔ
ａｔｉｎ）およびエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）の不活性な調製物が
、体重に影響を及ぼさなかった実例によりさらに実証された。以下の一連の実験
は、そのメカニズムを決定することに関した。食欲および末梢組織に対する効果
が調査されている。その結果を以下に要約する。
【００６９】 （血管形成インヒビターで処置された肥満マウスを用いた対の給餌研究） ＴＮＰ−４７０処置マウスの体重に対する食欲の効果を、対の給餌実験におい
て単離した。各処置マウスによって毎日消費される正確な量の餌を、非処置グル
ープの対のマウスに与えた（図６Ａおよび６Ｂ）。対のマウスの体重を使用して
、処置動物における食欲の変化の効果を単離しそして測定した。ＴＮＰ−４７０
を受けている肥満マウスは、処置の最初のおよそ１８日間は、より少なく食べた
。これは、最初の体重減少の５６％を説明した。その後、食欲は、処置を続けた
（１３８日まで）にも関わらず、対のマウスのコントロール体重に近づくまでの
着実な増加に反映されるように、徐々に正常になった。食欲不振効果が同じ動物
において可逆的であり、そして再現性があるか否かを決定するために、マウスの
１グループを、ＴＮＰ−４７０の断続的なサイクルで処置し、対の給餌グループ
を用いて、食欲の変化の影響を追跡した（図６Ａ）。ＴＮＰ−４７０を２０日間
受けたマウスを、１５日間治療から外し、次いで２回目に３６日間処置した。食
欲不振効果は、ＴＮＰ−４７０への最初の曝露の間にのみ存在した。治療の２回
目のサイクルの間に、処置された動物は、体重を減少させたが、対で給餌したマ
ウスの体重の着実な増加によって反映されるように、食欲は維持した。食欲は、
２回目のサイクルの間の、処置マウスと非処置マウスとの間のわずか１７％の体
重の差を説明するに過ぎなかった。食欲不振のメカニズムは、未だ決定されてい
ない。
【００７０】 ２０ｍｇ／ｋｇ／日で、エンドスタチンまたはアンジオスタチンと関連する食
欲不振効果は存在しない。１日２回、５０ｍｇ／ｋｇでのアンジオスタチンは、
全体重減少の２０％未満を占める、食欲のわずかな減少と関連した。
【００７１】 （ＴＮＰ−４７０で処置した正常Ｃ５７マウスでの対の給餌研究） ＴＮＰ−４７０で処置した正常Ｃ５７マウスもまた、体重を減少させた（図６
Ｂ）。この場合、ほとんど全ての最初の体重の減少は、対で給餌したマウスによ
って反映されるように、食欲の減少に起因した。食欲不振効果は、約８日続き、
その後処置マウスの食欲は、徐々に増加し、そして対のマウスは体重を増加させ
た。処置マウスは、コントロール体重の平均８５％まで減少した（ｐ＜０．００
００１）。これは、同じ用量のＴＮＰ−４７０でのｏｂ／ｏｂマウスにおいて観
察されたもの（コントロール体重の５６％）よりも有意に少ない。これは、これ
らの正常動物がずっと低い体脂肪パーセントを有する事実を反映し得、これはこ
の治療の選択的な標的であるようである。
【００７２】 食欲によって説明されない処置動物における体重の減少は、組織レベルでの周
辺効果の結果である可能性が最も高い。この結論は、ｏｂ／ｏｂおよびＣ５７の
両方のマウスの体重増加が、血管形成インヒビターによって制限されるという観
察によってさらに支持される。処置マウスは、対で給餌されたグループにおいて
体重の増加を引き起こすのに十分な増加した食料消費にもかかわらず、比較的わ
ずかに増加した。
【００７３】 （肥満マウスおよび正常マウスの脂肪組織における内皮細胞増殖） 脂肪組織の増殖が内皮細胞増殖と関連しているか否かを決定するために、処置
および非処置のｏｂ／ｏｂマウスおよび正常Ｃ５７マウス由来の皮下脂肪組織切
片を試験した。二重蛍光染色手順を使用して、内皮細胞および任意の増殖細胞の
両方を同時に同定した。内皮細胞マーカーであるフォン・ビルブラント因子（ｖ
ＷＦ）を赤色蛍光タグで染色し、そして増殖細胞中のＢｒｄｕを緑色蛍光タグで
染色した。増殖する内皮細胞を、両方のタグで染色し、そして黄色に呈色させた
。
【００７４】 正常Ｃ５７マウスの脂肪組織は、赤に染まった細胞が多量にあることから示さ
れるように、細胞比較的小さな脂肪細胞および高密度の内皮細胞を含んでいた。
増殖する内皮細胞はまた、時々観察された（黄色の細胞）。非処置の肥満マウス
の脂肪組織は、多数の増殖する内皮細胞を含有していた。内皮細胞の密度は、肥
満マウスにおける大きなサイズの介在脂肪細胞によって希釈された。処置ｏｂ／
ｏｂマウスの脂肪組織は、血管形成の阻害と一致して、内皮細胞の百分率は低く
、そして増殖している細胞は稀である拡張された蛇行微細血管を含んでいた。Ｔ
ＮＰ−４７０を１週間止めた肥満マウス由来の組織切片もまた試験した。これら
の動物は、コントロールよりも速い速度で体重を増加させた。内皮細胞の密度は
、正常脂肪組織の密度よりも顕著に低かった。しかし、増殖細胞は豊富に存在す
る。増殖する内皮細胞（黄色）および非内皮細胞（緑）が存在する。処置動物に
て観察されたものと同様に、拡張された微細血管もまた観察された。
【００７５】 （ＴＮＰ−４７０に応答した内皮細胞および３Ｔ３−Ｌ１細胞の増殖） ＴＮＰ−４７０が前肥満細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｏ）に対して直接的効
果を有し得るか否かを決定するために、３Ｔ３−Ｌ１細胞を使用して増殖アッセ
イを行った。この細胞株は、インビボで脂肪細胞の寄与のほとんどを有する（Ｇ
ｒｅｅｎ １９７８．Ｔｈｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ
３Ｔ３ ｃｅｌｌｓ．１０ｔｈ Ｍｉａｍｉ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｄｉ
ｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｅｍｅｎｔ． Ａｈｍａ
ｄ Ｆ， Ｓｃｈｕｌｔｚ Ｊ， Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｔ，Ｗｅｒｎｅｒ Ｒ（編
）。Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１３頁）。細胞を、Ｔ
ＮＰ−４７０濃度の範囲で７２時間インキュベートし、続いて計数した。ウシ毛
細血管内皮細胞（ＢＣＥ）と比較した。内皮細胞増殖の細胞増殖抑制阻害の最大
半値は、約１００ｐｇ／ｍｌであった。対照的に、１０μｇ／ｍｌのＴＮＰ−４
７０が、３Ｔ３−Ｌ１培養において、同程度の阻害のために必要とされた。
【００７６】 （結論） これらの研究は、脂肪組織の増殖および質量が、血管形成依存的であること；
血管形成インヒビターが体重および脂肪組織質量を減少させること；抗血管形成
剤での体重の減少が用量依存的であり、可逆的であり、そして開始体重にかかわ
らず起きること；体重減少が、試験された全ての血管形成インヒビターで達成さ
れたこと；ＴＮＰ−４７０が食欲の一過性の減少を生じること；血管形成インヒ
ビターでの長期処置が十分に耐性であること；血管形成インヒビターでの病的な
肥満の処置が高血糖を予防することを実証した。
【００７７】 （実施例３：血管形成インヒビターを使用しての心肥大を有する動物の処置） （モデル） 慢性的に上昇した甲状腺ホルモンレベルは、心臓の容量過剰負荷をもたらし、
これは動物およびヒトの両方において遠心性心肥大を導く（Ｏｓｌｅｒ Ｗ．１
８９２．Ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ． Ｄ．Ａｐｐｅｌｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，７１２−７１４頁）。心筋肥大は、通常、冠状血管系の異常および最
終的な心室機能の損失と関連する（ＴｏｍａｎｅｋおよびＨｏｖａｎｅｃ，１９
８１ Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．１３：４７１−４８８；Ｆｒｉ
ｂｅｒｇ，１９８８ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２２：３２９−３３９）
。しかし、甲状腺ホルモン誘導性の心肥大は、増強された心室機能および支持し
ている微細血管系の増殖が、頻繁に存在する点で独特である（Ｔｏｍａｎｅｋら
、１９９８ Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．８２：５８７−５９３）。心筋肥大のこのモデ
ルにおける心臓組織の増殖は、血管内皮によって媒介され得、そして血管形成イ
ンヒビターの使用によって抑制され得ることが仮定された。このような知見の意
味は、正常な心臓質量および機能の調節因子としての血管内皮の役割に関連する
。
【００７８】 （方法） 動物研究を、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｏｓｔｏｎにおい
て施設のガイドラインにしたがって行った。雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、６
週齢で購入し、実験の前に１週間環境に順応させた（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）。マウスを一緒にかごの中に
入れ、そして水および標準的な餌へのアクセスを自由にした。動物を、不快感ま
たは苦痛を引き起こす手順の前に、メトキシフルラン（ｍｅｔｈｏｘｙｆｌｕｏ
ｒａｎｅ）を吸入させて麻酔し、そして完全に目覚めるまでモニターした。毛を
剃って、注射を容易にした。マウスをサイロニン（０．２ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔
内）で１２日間処置し、心肥大を引き起こした。さらに、マウスは、生理食塩水
またはＴＮＰ−４７０（１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇのいずれか）の皮
下注射を一日おきに同時に受けた（ｎ＝３／グループ）。結果を生理食塩水単独
（サイロニンなし）で処置したコントロールと比較した。研究の最後に動物の体
重を計り、そして頸椎脱臼により屠殺した。心臓を迅速に取り出し、そして未だ
脈打っている間に、残存する血液を出してその臓器を空にするために暖かい緩衝
液中に置いた。心室から、大動脈（ｇｒｅａｔ ｖｅｓｓｅｌ）、房、および結
合組織をきれいに切開して除き、そして室を開口した。組織をふきとって乾かし
、そして計量した。心室の重量を体重に対して正規化し、そして体重のパーセン
トとして表した。
【００７９】 （結果） サイロニン処置は、心肥大をもたらし、心室重量を体重の０．３８％から０．
５８％まで増大させた。この効果は、ＴＮＰ−４７０によって、用量依存的様式
で鈍らされた（図７）。２０ｍｇ／ｋｇのＴＮＰ−４７０用量で、サイロニン処
置で達成された心室重量は、体重の０．５１％で、コントロールよりも顕著に少
なかった（Ｐ＜０．０５）。さらに、これらの数値は、１２日の研究の間に、Ｔ
ＮＰ−４７０を受けているマウスにおいて１〜２ｇの体重減少があったことを考
慮すると、ＴＮＰ−４７０の効果を過小評価している可能性がある。重量の減少
は、脂肪組織質量の減少から生じる。しかし、処置動物の心臓サイズは、それら
のより高い開始重量について適切であることが期待される。これを証明するため
の研究が進行中である。試験された用量は、これまでのところ、マウスの癌を処
置するために代表的に使用される用量よりも２／３少ない。肥大のより大きな減
少が、より高い用量で予想される。
【００８０】 （実施例４：腸管ポリポーシスの血管形成インヒビターでの処置） （モデル） ＡｐｃMinマウスは、腸管腺腫様ポリープのモデルとして役立つ。Ｍｉｎ（多 発性腸腫瘍症）は、ネズミＡｐｃ（腺腫様結腸ポリポーシス）遺伝子におけるエ
チルニトロソ尿素（ＥＮＵ）誘導性変異である（Ｍｏｓｅｒら、１９９０）。こ
れは、家族性腺腫様ポリープまたはガードナー症候群を有するヒトのＡＰＣ遺伝
子における生殖系列変異に類似する（Ｊｏｓｌｙｎら、１９９１ Ｃｅｌｌ．６
６：６０１−６１３）。これらは、腸管ポリープによって特徴付けられる遺伝性
の状態であり、最終的に癌に形質転換する。ＡＰＣは散発性のヒト結腸癌におい
てもまた最も頻繁に変異した遺伝子である（Ｎｉｓｈｉｓｈｏら、１９９１ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ．２５３：６６５−６６８）。
【００８１】 異型接合性のＣ５７Ｂ１／６Ｊ Ｍｉｎ／＋マウスは、その寿命の間の経過に
わたって、腸管全体を通して３０〜６０の腺腫を自然に発達させる（Ｍｏｓｅｒ
ら、１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４７：３２２−３２４）。ポリープはサイズ
が増大し続け、最終的には、約１２０日齢までにその動物は死に至る。
【００８２】 これらの前新生物病変の増殖は、血管内皮に依存し、そして血管形成インヒビ
ターの使用によって抑制され得ると仮定された。
【００８３】 （方法） 動物研究を、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｏｓｔｏｎにおい
て施設のガイドラインにしたがって行った。雄のＭｉｎ／＋（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ
）マウスを、６週齢で購入し、そして実験の前に１週間環境に順応させた（Ｊａ
ｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）。マウ
スを一緒にかごの中に入れ、そして水および標準的な餌へのアクセスを自由にし
た。動物を、不快感または苦痛を引き起こす手順の前に、メトキシフルラン（Ｐ
ｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）を吸入させて
麻酔し、そして完全に目覚めるまでモニターした。毛を剃って、注射を容易にし
た。
【００８４】 ＴＮＰ−４７０を乾燥状態で４０℃で保存した。溶液を通常の生理食塩水中に
新たに調製し、そして背中に沿って回転する部位に皮下投与した。マウスを１０
ｍｇ／ｋｇのＴＮＰ−４７０で一日おきに１または３週間処置した（ｎ＝３／グ
ループ）。コントロールグループは、一日おきに０．１ｍｌの生理食塩水を受け
た（ｎ＝３）。
【００８５】 餌を、各研究を終える前の１２時間差し控え、腸管をきれいにした。動物をＣ
Ｏ2の連続的な吸入によって屠殺した。腸管の全てを取り出し、そしてリン酸緩 衝化生理食塩水で流した。腸を長軸方向に切り開き、そして管腔表面を、解剖顕
微鏡を使用して（倍率１８×）、ポリープの数、サイズ、および位置について試
験した。組織サンプルを緩衝化ホルマリン（ｆｏｒｍａｌｙｎ）中で固定し、そ
してパラフィン中に包埋した。切片を、組織学的評価のためにＨ＆Ｅで染色した
。
【００８６】 （結果） 腸管ポリープの数およびサイズは、血管形成インヒビターで処置されたＭｉｎ
／＋マウスにおいて有意に減少した。３週間の処置の後、コントロールマウスは
、２３±１．５のポリープを有していたが、一方ＴＮＰ−４７０処置マウスは、
８±１．７のポリープを有していた（図８Ａ）。これは、６６％の減少である（
ｐ＜０．０５）。コントロールマウスにおけるポリープの直径は、平均で１．９
０±０．８６ｍｍ（０．０７５〜０．４２５ｍｍの範囲）であった（図８Ｂ）。
対照的に、処置マウスにおけるポリープの直径は、平均で１．０２±０．４０ｍ
ｍ（０．０５〜０．１７５ｍｍの範囲）であった。
【００８７】 コントロールマウス由来のポリープの組織学的検査は、顕著な細胞異形成およ
び多数の海綿状血管を示した。病変は、倍数体であり、粘膜から管腔へと、そし
て場合によっては臓側面を通って外側へと広がっていた。対照的に、処置マウス
由来のポリープは、周囲の粘膜との形態学的な類似性を保持しており、形成異常
の細胞がより少なく、そして血管はより少なく、より小さかった。
【００８８】 （結論） 腸管腺腫様ポリープの発生、増殖、そしておそらく形質転換は、血管形成に依
存し、そして血管内皮によって調節されている。
【００８９】 （実施例５：子宮内膜症を有する動物の処置。血管形成インヒビターを使用す
る。） （モデル） 全ての月経のある女性の５０％までが、子宮内膜症に罹患し得る（Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓおよびＰｒａｔｔ、１９７７ Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ
． １２９：２４５）。ヒト子宮内膜症は、齧歯類モデルにおいて外科的に模倣
され得る（ＣｕｍｍｉｎｇｓおよびＭｅｔｃａｌｆ，１９９６ ＰＳＥＢＭ．２
１２：３３２）。研究を、これらの組織インプラントの増殖が、血管内皮に依存
するか否か、および血管形成インヒビターの使用により抑制され得るか否かを試
験するために設計した。
【００９０】 （方法） 動物研究を、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ
において施設のガイドラインにしたがって行った。雌のマウス（Ｂ６Ｃ３Ｆ１）
を、８週齢で購入し、実験の前に１週間環境に順応させた（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）。マウスを一緒にかご
の中に入れ、そして水および標準的な餌へのアクセスを自由にした。動物を、不
快感または苦痛を引き起こす手順の前に、メトキシフルラン（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍ
ｏｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）を吸入させて麻酔し、そして
完全に目覚めるまでモニターした。毛を剃って、注射を容易にした。
【００９１】 ＴＮＰ−４７０を乾燥状態で４０℃で保存した。溶液を通常の生理食塩水中に
新たに調製し、そして背中に沿って回転する部位に皮下投与した。マウスを１０
ｍｇ／ｋｇのＴＮＰ−４７０で一日おきに３週間処置した（ｎ＝４／グループ）
。コントロールグループは、一日おきに０．１ｍｌの生理食塩水を受けた（ｎ＝
３）。
【００９２】 無菌技術を使用して、マウスを麻酔し、そして腹部の毛を剃った。腹部中央で
切開し、そして左の子宮角を露出させ、そして両方の末端を結紮した。子宮角を
切り出し、暖かい培地（Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２）に置き、そして長軸方向に沿って
切り開いた。組織切片を、皮膚パンチ生検（ｄｅｒｍａｌ ｐｕｎｃｈ ｂｉｏ
ｐｓｙ）を使用して２ｍｍの直径に切った。その組織切片を腸間膜（４切片／動
物）上に置いた。インプラントをフィブリングルー調製物で適所に固定した。腹
部の切開を閉じ、そしてそのマウスを４８時間回復させた。その後、そのマウス
を各々４匹のマウスからなる２つのグループに分割した。コントロールグループ
を生理食塩水で処置した。処置グループは、ＴＮＰ−４７０（１０ｍｇ／ｋｇ、
一日おき）を受けた。動物を、手術の３週間後、ＣＯ2の連続的な吸入により屠 殺した。腹膜腔を子宮内膜組織について検査した。組織を計数し、そして直径を
カリパスを使用してｘおよびｙ次元において測定し、平均化した。
【００９３】 （結果） 子宮内膜組織のサイズは、血管形成インヒビターで処置したマウスにおいて減
少していた。処置の３週間後、図９に示すように、コントロールマウスの子宮内
膜組織は２．９±０．４ｍｍと測定され、一方ＴＮＰ−４７０で処置したマウス
の子宮内膜組織は、１．９±０．５ｍｍと測定された。組織インプラントの数は
、２つのグループの間で類似していた。
【００９４】 （結論） データは、腹膜腔中に移植された子宮内膜組織の増殖が、血管形成インヒビタ
ーによって抑制されることを示す。このパイロット研究で使用されたＴＮＰ−４
７０の用量は、確立された腫瘍用量の１／３である。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、フェンフルラミン（一日４０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与）および生理食
塩水コントロールで処置したｏｂ／ｏｂマウスと比較した、ＴＮＰ−４７０を、
一日５ｍｇ／ｋｇまたは一日１０ｍｇ／ｋｇのいずれかで処置したｏｂ／ｏｂマ
ウスでの経時的な（日数）体重のグラフである。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、ＴＮＰ−４７０（一日１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した対飼育された（
説明）ｏｂ／ｏｂマウス、および生理食塩水コントロールでの経時的な（日数）
体重のグラフである。
【図２】 図２は、ＴＮＰ−４７０ ２．５、５．０、７．５、および１０ｍｇ／ｋｇ／
日の用量対コントロールでのマウスの、体重（グラム）対処置の日数のグラフで
ある。各群について、１０ｍｇがｎ＝８である以外はｎ＝４である。
【図３】 図３は、生理食塩水で処置したコントロールと比較した場合の、アンギオスタ
チン（２０ｍｇ／ｋｇ／日）、エンドスタチン（５０ｍｇ／ｋｇ／１２ｈ）、お
よびアンギオスタチン（５０ｍｇ／ｋｇ／１２ｈ）での、マウスの、体重（グラ
ム）対処置の日数のグラフである。各群ｎ＝３である。
【図４Ａ】 図４Ａは、生理食塩水で処置したコントロールｏｂ／ｏｂ（ｎ＝４）、および
生理食塩水で処置した正常マウスの９Ｃ５７Ｂ１／６（ｎ＝５）に対する、１０
ｍｇ／ＴＮＰ−４７０／ｋｇ／日（ｎ＝６）で処置したｏｂ／ｏｂマウスについ
ての、体重（グラム）対処置の日数のグラフである。
【図４Ｂ】 図４Ｂは、コントロール生理食塩水処置と比較した、１０ｍｇ／ＴＮＰ−４７
０／ｋｇ／日で処置したｏｂ／ｏｂマウスについての、体重（グラム）対処置日
数のグラフである。各群についてｎ＝６である。
【図４Ｃ】 図４Ｃは、生理食塩水で処置した正常Ｃ５７／Ｂ１／６マウス（ｎ＝５）およ
び生理食塩水で処置したｏｂ／ｏｂマウス（ｎ＝４）に対する、１０ｍｇ／ｋｇ
／日（ｎ＝１５）の用量でのＴＮＰ−４７０で処置したｏｂ／ｏｂマウスの、体
重（グラム）対日数のグラフである。
【図５】 図５は、フェンフルラミン（４０ｍｇ／ｋｇ／日、ｎ＝４）単独で、次いでＴ
ＮＰ−４７０で処置した（１０ｍｇ／ｋｇ／日、ｎ＝４）ｏｂ／ｏｂマウスの、 体重（グラム）対処置の日数のグラフである。
【図６Ａ】 図６Ａは、対飼育実験において、ＴＮＰ−４７０（１０ｍｇ／ｋｇ／日）対生
理食塩水コントロールでの、体重（グラム）対処置日数のグラフである。
【図６Ｂ】 図６Ｂは、対飼育実験において、ＴＮＰ−４７０（１０ｍｇ／ｋｇ／日）対生
理食塩水コントロールでの、体重（グラム）対処置日数のグラフである。
【図６Ｃ】 図６Ｃは、成長因子、ＢＣＥ、およびＦＧＦあるいは３Ｔ３およびＦＧＦをそ
の細胞に添加した場合の、細胞数／ウェル（×１０3）対ＴＮＰ−４７０（ｐｇ ／ｍｌ）のグラフである。
【図７】 図７は、Ｔ３（肥大を誘発する）、１０ｍｇ／ｋｇ ｑｏｄでのＴ３およびＴ
ＮＰ−４７０、ならびに２０ｍｇ／ｋｇ ｑｏｄでのＴ３およびＴＮＰ−４７０
で処置した、チロニン誘発した心室肥大を有するマウスの体重比率としての心室
重量のグラフである。
【図８Ａ】 図８Ａは、１および３週間後の、Ｍｉｎ／＋ マウス、生理食塩水コントロー
ル対１０ｍｇ／ｋｇ ｑｏｄの用量でのＴＮＰ−４７０で処置したマウスにおけ
るポリープ数のグラフである。
【図８Ｂ】 図８Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇ ｑｏｄでのＴＮＰ−４７０で処置したマウス対生
理食塩水コントロールについて各大きさ（ｍｍ直径）のポリープ数の合計として
グラフ化した、Ｍｉｎ／＋ マウスにおけるポリープの大きさおよび大きさの分
布のグラフである。
【図９】 図９は、コントロールマウスおよびＴＮＰ−４７０で処置したマウスについて
の子宮内膜症の動物モデルにおける組織の直径（ｍｍ）のグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 15/00 13/08 35/00 15/00 43/00 35/00 １１１ 43/00 Ａ６１Ｋ 37/02 １１１ 37/64 (71)出願人 300 Ｌｏｎｇｗｏｏｄ Ａｖｅｎｕｅ， Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅ ｔｔｓ 02115， Ｕ．Ｓ．Ａ． (71)出願人 マサチューセッツ・インスティチュート・ オブ・テクノロジー ＭＡＳＳＡＣＨＵＳＥＴＴＳ ＩＮＳＴＩ ＴＵＴＥ ＯＦ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02139， ケンブリッジ，マサチューセッツ・アベ ニュー 77 (72)発明者 ルプニック， マリア アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02148， モルデン， ケネディー ドラ イブ 181， アパートメント 211 (72)発明者 ランガー， ロバート エス． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02158， ニュートン， ランバード ス トリート 77 (72)発明者 フォークマン， ジュダ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02146， ブルックリン， チャザム サ ークル 18 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA17 BA44 CA18 DC50 NA14 ZA702 ZA812 ZB262 ZC202 4C086 BC21 GA07 MA52 NA12 NA14 ZA70 ZA81 ZB26 ZC20

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトまたは動物において正常な血管化した組織の大きさおよ
    び／または増殖を調節する方法であって、有効量の新脈管形成インヒビターを該
    動物に投与して、該血管化した正常な脂肪組織、心臓組織、腎臓組織、腸組織お
    よび生殖組織の大きさおよび増殖を調節する工程、を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記インヒビターがコラゲナーゼインヒビターである、請求
    項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記インヒビターがＴＮＰ−４７０、アンギオスタチン、エ
    ンドスタチン、およびサリドマイドからなる群より選択される、請求項１に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】 前記正常な血管化した組織が脂肪組織である、請求項１に記
    載の方法。
  5. 【請求項５】 前記動物またはヒトが肥満を生じる遺伝的欠損を有する、請
    求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記インヒビターが食欲を抑制することによる、請求項４に
    記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記インヒビターが食欲を抑制するに有効な量で投与される
    ＴＮＰ−４７０である、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記ＴＮＰ−４７０が脂肪組織への血管供給を減少させるに
    有効な量で投与される、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記組織が、心臓組織、腎臓組織、腸組織および生殖組織か
    らなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記動物またはヒトがポリープ症（ｐｏｌｙｐｓｉｓ）を
    有する、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記動物またはヒトが子宮内膜症を有する、請求項９に記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記動物またはヒトが前立腺の拡大を有する、請求項９に
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記動物またはヒトが心肥大または腎肥大を有する、請求
    項９に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ヒトまたは動物において正常な血管化した脂肪組織、心臓
    組織、腎臓組織、腸組織および生殖組織の大きさおよび／または増殖の調節に使
    用するための組成物であって、薬学的に受容可能なキャリア中に新脈管形成を阻
    害する化合物の有効量を含み、ここで、その投薬量は、腫瘍の処置についての投
    薬量未満である、組成物。
  15. 【請求項１５】 肥満を減少させるための処方物中の、請求項１４に記載の
    組成物。
  16. 【請求項１６】 体脂肪を減少させるに有効な量で食欲を減少させる、請求
    項１５に記載の組成物。
  17. 【請求項１７】 前記化合物が脂肪組織における新脈管形成を阻害する量で
    ある、請求項１４に記載の組成物。
  18. 【請求項１８】 経口投与について薬学的に受容可能なキャリアを含む、請
    求項１４に記載の組成物。
  19. 【請求項１９】 局所投与について薬学的に受容可能なキャリアを含む、請
    求項１４に記載の組成物。
  20. 【請求項２０】 徐放性の薬学的に受容可能なキャリアを含む、請求項１４
    に記載の組成物。
  21. 【請求項２１】 前記化合物が、ＴＮＰ−４７０、アンギオスタチン、エン
    ドスタチン、およびサリドマイドからなる群より選択される、請求項１４に記載
    の組成物。
  22. 【請求項２２】 前記化合物がＴＮＰ−４７０である、請求項１４に記載の
    組成物。
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