ES2224465T3 - Metodo para regular el tamaño y el crecimiento del tejido normal vascularizado. - Google Patents
Metodo para regular el tamaño y el crecimiento del tejido normal vascularizado.Info
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Abstract
El uso de un inhibidor de la angiogénesis en la preparación de un medicamento para regular el tamaño y/o crecimiento del tejido adiposo, cardiaco, renal, intestinal y reproductor normal vascularizado en un ser humano o un animal.
Description
Método para regular el tamaño y el crecimiento
del tejido normal vascularizado.
La presente invención se refiere generalmente al
campo del tratamiento de la obesidad y otros trastornos
caracterizados por la proliferación de tejidos normales
vascularizados, mediante la administración de una cantidad eficaz de
inhibidores de la angiogénesis.
La frecuencia del sobrepeso ha alcanzado
proporciones epidémicas en la mayoría de los países desarrollados y
conlleva una mortalidad y unas estadísticas de morbilidad
asombrosas. La obesidad es un factor de riesgo aceptado en varias
enfermedades potencialmente mortales tales como ateroesclerosis,
hipertensión, diabetes, apoplejía, embolia pulmonar y cáncer.
(Meisler J. St. Jeor S. 1996. Am J Clin Nutr.
63:409S-411S). (Bray G. 1996. Endocrin Metab Clin
North Amer. 25:907-919). Además, complica diversas
afecciones crónicas tales como enfermedades respiratorias,
osteoartritis, osteoporosis, enfermedad de vejiga irritada y
dislipidemias. La enormidad de este problema se refleja mejor en el
hecho de que las tasas de fallecimiento aumentan con un mayor peso
corporal. Más del 50% de la mortalidad de cualquier causa está
relacionada con afecciones relacionadas con la obesidad una vez que
el índice de masa corporal (BMI) excede 30 kg/m^{2}, como se puede
apreciar en 35 millones de americanos (Lee L, Paffenbarger R. 1992.
JAMA. 268:2045-2049). Con una contribución de más de
300.000 muertes por año, la obesidad está en segundo puesto sólo
después del tabaco como la causa más común de muerte potencialmente
evitable (McGinnis J., Foege W. 1993.
MA.270:2207-2212).
Además de las devastadoras consecuencias médicas
de este problema está la grave carga financiera sobre el sistema de
salud de los Estados Unidos. Se ha informado de que el impacto
económico estimado de la obesidad y sus enfermedades asociadas
provoca gastos médicos y pérdida de beneficios en más de 68 billones
de dólares por año. (Colditz G. 1992. Am J Clin Nutr.
55:503S-507S). (Wolf A., Colditz G. 1996. Am J.
Clin Nutr. 63:466S-469S). (Wolf A., Colditz G. 1994.
Pharmacoeconomics. 5:34-37). Esto no incluye los más
de 30 millones de dólares por año gastados en comidas, productos y
programas para adelgazar. (Wolf A., Colditz. G. 1994
Pharmacoeconomics. 5:34-37). (Ezzati et al.,
1992. Vital Health Stat [2] 113).
En 1990, el gobierno de los Estados Unidos
respondió a la crisis estableciendo como objetivo principal del
sistema de salud nacional la reducción en el predominio de la
obesidad (el 20% de la población en el año 2000. (Public Health
Service. Healthy people 2000: national health promotion and disease
prevention objectives. 1990 (US Department of Health and Human
Services Publications PHS 90-502.12)).
A pesar de este objetivo, el predominio del
sobrepeso en los Estados Unidos se ha incrementado de forma estable,
alcanzando un sorprendente 33,0% en el informe más reciente de la
National Health and Nutrition Examination Survey
(1988-1991). (Kuczmarski et al., 1994. JAMA.
272:205-211). Además, el BMI medio también ha
aumentado durante este periodo en 0,9 kg/m^{2}. Esta alarmante
tendencia no ha ocurrido como resultado de falta de esfuerzo. Por el
contrario, un porcentaje estimando de 25% de hombres, 50% de mujeres
y 44% de adolescentes están intentando perder peso en un momento
dado. (Robinson, et al., J. Amer Diabetic Assoc.
93:445-449). En su lugar, el aumento del 31% en la
proporción y el aumento del 8% en el predominio en la última década
es un testimonio del hecho de que la obesidad es notoriamente
resistente a las intervenciones actuales. (NIH Technology Assessment
Conference Panel. 1993. Ann Intern Med.
119:764-770).
Una razón principal para el fracaso a largo plazo
de las soluciones establecidas es que se basan en conceptos erróneos
y en una mala comprensión de los mecanismos de la obesidad. La
ciencia convencional mantenía que la obesidad es una enfermedad
auto-infligida de gula. Los programas de
tratamiento, por lo tanto, se centraban en modificaciones del
comportamiento para reducir la ingesta de calorías y aumentar la
actividad física usando una diversidad de sistemas. Estos métodos
tienen una eficacia limitada y se asocian con tasas de reincidencia
de más del
95%.
95%.
El fracaso de las soluciones a corto plazo, junto
con el reciente progreso en la clarificación de la patofisiología de
la obesidad, ha llevado a retomar la farmacoterapia como tratamiento
adyuvante potencial a largo plazo. (National Task Force on Obesity.
1996. JAMA. 276:1907-1915). (Ryan D., 1996. Endo
Metab Clin N Amer. 25:989-1004). La premisa es que
el peso corporal es un parámetro controlado fisiológicamente similar
a la presión sanguínea y la obesidad es una enfermedad crónica
similar a la hipertensión. El objetivo de la terapia médica a largo
plazo (quizá de por vida) sería facilitar la pérdida de peso y el
posterior mantenimiento del peso junto con una alimentación
saludable y la práctica de ejercicio. Para evaluar este enfoque,
debe juzgarse la eficacia a largo plazo de los fármacos disponibles
en la actualidad frente a la de las intervenciones no
farmacológicas. El último método produce una pérdida de peso media
de 8,5 kg a las 21 semanas de tratamiento y solo mantiene el 50% de
la reducción de peso a los 4 años en el 10-30% de
los pacientes. (Wadden T. 1993. Ann Intern Med.
119:688-693). (Kramer, et al., 1989. Int J
Obes. 13:123-136). Los pocos estudios que han
evaluado la terapia a largo plazo (más de seis meses) con un único
fármaco (Guy-Gran et al., 1989. Lancet.
2:1142-1144) (Goldstein, et al. 1994 Int J
Obes. 18:129-135) (Goldstein, et al., 1993
Obes Res 2:92-98) o con terapia de combinación
(Weintraub M. 1992. Clin Pharmacol. Ther.
51:581-585) muestran una eficacia modesta en
comparación con placebo en la reducción del peso corporal.
Todas las medicaciones usadas en la actualidad
para tratar o prevenir la obesidad se dirigen al adipocito del
tejido y funcionan reduciendo la disponibilidad energética o
aumentando la salida de energía. Estos agentes pueden clasificarse
en tres categorías en base a su mecanismo. (National Task Force on
Obesity. 1996. JAMA. 276:1907-1915).
Reducción de entrada energética. Este
método se dirige a una reducción de la ingesta de comida reduciendo
el apetito o aumentando la sensación de saciedad. Estos fármacos
"anorexizantes" afectan la actividad neurotransmisora actuando
en el sistema catecolaminérgico (anfetaminas, benzfetamina,
fendimetrazina, fentermina, mazindol, dietilpropion y
fenilpropanolamina) o el sistema serotonérgico (fenfluramina,
dexfenfluramina, fluoxetina, sertralina o otros antidepresivos
compuestos por inhibidores selectivos de la reabsorción de la
serotonina [SSRI]).
Reducción en la absorción de nutrientes.
Los fármacos de esta categoría bloquean la acción de las enzimas
digestivas o la absorción de nutrientes. Un ejemplo de este tipo de
fármaco es orlistat, que inhibe la actividad de la lipasa gástrica y
pancreática. (Drent M., van der Veen E. 1995. Obes Res 3 (supl.
4):623S-625S). Estas medicaciones son experimentales
en los Estados Unidos y no están disponibles para el tratamiento de
la obesidad.
Aumento del consumo de energía. Un aumento
en el consumo de energía puede lograrse aumentando la velocidad
metabólica, por ejemplo, mediante cambios en el tono del sistema
nervioso simpático o con el desacoplamiento de la fosforilación
oxidativa. Los fármacos que afectan al metabolismo de la
termogénesis incluyen efedrina sola y en combinación con cafeína y/o
aspirina (Passquali R., Casimirri F. 1993 Int J Obes. 17 (supl.
1):S65-S68) y BRL 26830A, un agonista del receptor
\alpha (Connacher, et al., 1992 Am J Clin Nutr.
55:258S-261S). Esta clase de medicaciones no está
aprobada por la FDA para el control de peso.
En la actualidad, ningún régimen con un único
fármaco destaca como superior en la promoción o mantenimiento de la
pérdida de peso.
También se han desarrollado intervenciones
quirúrgicas, tales como procedimientos de división gástrica, bypass
yeyunoileal y vagotomía para tratar la obesidad severa (Greenway F.
1996. Endo Metab Clin N Amer. 25:1005-1027). Aunque
son ventajosas a largo plazo, la relación entre riesgo agudo y
beneficio ha reservado estos procedimientos invasivos a pacientes
con obesidad mórbida de acuerdo con la conferencia sobre el consenso
NIH de la cirugía en la obesidad (BMI mayor de 40 kg/m^{2}). (NIH
Conference. 1991. Ann Intern Med. 115:956-961). Por
lo tanto, no hay una alternativa para la mayoría de los pacientes
con sobrepeso a menos y hasta que son profundamente obesos y sufren
complicaciones de atención.
No hay un tratamiento médico o quirúrgico para
obesidad que se dirija a la parte vascular del tejido.
Por lo tanto, es un objeto de la presente
invención proporcionar un tratamiento para reducir la obesidad.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar composiciones para el tratamiento de la obesidad.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar métodos para inhibir o reducir la sobreproliferación de
otros tejidos normales vascularizados.
Los inhibidores de la angiogénesis se administran
a pacientes en una cantidad eficaz para regular el tamaño y/o
crecimiento del tejido normal no transformado vascularizado
regulando su parte vascular. Los ejemplos de tejidos que pueden
controlarse incluyen tejido adiposo, pólipos intestinales, tejido
muscular (incluyendo cardiaco) y tejido del endometrio. La respuesta
de estos tejidos a los inhibidores de la angiogénesis depende de la
dosis, es reversible y común a una diversidad de distintos
inhibidores de la angiogénesis (los ejemplos usan
TNP-470, angiostatina y endostatina), basada en
estudios en modelos animales de obesidad, pólipos intestinales,
hipertrofia cardiaca y endometriosis. Los estudios iniciales
realizados en un modelo de tejido adiposo (ratones genéticamente
obesos y ratones normales de control) mostraron que el crecimiento y
masa del tejido adiposo está bajo el control del endotelio
microvascular. La expansión del tejido adiposo se asoció con la
proliferación celular del endotelio. La inhibición de la
angiogénesis condujo a una reducción en la masa del tejido adiposo.
El aumento de peso en los animales que recibían los inhibidores de
la angiogénesis se redujo de forma significativa, a pesar de
aumentos en el apetito suficientes para provocar un aumento de peso
en ratones con la misma alimentación. La interrupción de la
administración del inhibidor tuvo como resultado la rápida expansión
del tejido adiposo. El efecto dependía de la dosis, era
repetidamente reversible y tuvo lugar en respuesta a todos los
inhibidores ensayados. También se observó una inhibición
significativa en los modelos animales de pólipo intestinal e
hipertrofia cardiaca, usando dosificaciones de dos tercios o menos
de las dosificaciones usadas para tratar tumores. Los resultados
preliminares en un modelo de endometriosis también muestran una
tendencia clara hacia un menor desarrollo de endometriosis en
animales tratados con inhibidores de la angiogénesis con una
dosificación de un tercio de la dosificación usada para tratar
tumores. No se observó ningún efecto en otro tejido no proliferante
distinto del tejido adiposo.
La Figura 1A es un gráfico de peso corporal
frente a tiempo (días) en ratones ob/ob tratados con
TNP-470 en 5 mg/kg al día o 10 mg/kg día en
comparación con ratones ob/ob tratados con fenfluramina [40 mg/kg
día intraperitoneal] y controles con solución salina.
La Figura 1B es un gráfico de peso corporal
frente a tiempo (días) en ratones ob/ob tratados con
TNP-470 (10 mg/kg al día) alimentados por parejas
[explicación] y controles con solución salina.
La Figura 2 es un gráfico de peso corporal
(gramos) frente a días de tratamiento, de ratones con dosis de 2,5,
5,0, 7,5 y 10 mg de TNP-470 mg/kg/día frente a
control. n = 4 en cada grupo distinto de 10 mg, en el que n = 8.
La Figura 3 es un gráfico de peso corporal
(gramos) frente a días de tratamiento, en ratones, con angiostatina
(20 mg/kg/día), endostatina (50 mg/kg/día) y angiostatina (50
mg/kg/día) en comparación con control tratado con solución salina. n
= 3 en cada grupo.
La Figura 4A es un gráfico de peso corporal
(gramos) frente a días de tratamiento en ratones ob/ob tratados con
10 mg de TNP-470 /kg/día (n=6) frente a ratones de
control ob/ob con solución salina (n=4) y ratones normales 9C57B1/6
tratados con solución salina (n=5).
La Figura 5 es un gráfico de peso corporal
(gramos) frente a días de tratamiento en animales ob/ob tratados con
fenfluramina (40 mg/kg/día, n=4) solo y posteriormente con
TNP-470 (10 mg/kg/día, n=4).
Las Figuras 6A y 6B son gráficos de peso corporal
(gramos) frente a días de tratamiento con TNP-470
(10 mg/kg/día) frente a controles con solución salina, en
experimentos con la misma alimentación.
La Figura 6C es un gráfico de número de
células/pocillo (x 103) frente a TNP-470 (pg/ml)
cuando se añaden los factores de crecimiento CBE y FGF o 3T\cdot y
FGF a las células.
La Figura 7 es un gráfico de peso ventricular
como porcentaje del peso corporal de los animales con hipertrofia
ventricular inducida con tironina, tratados con T3 (induce
hipertrofia), T3 y TNP-470, a 10 mg/kg qod y T3 y
TNP-470 a 20 mg/kg qod.
La Figura 8A es un gráfico del número de pólipos
en ratones de control Min/+ tratados con solución salina frente a
animales tratados con TNP-470 a una dosis de 10
mg/kg qod, después de una y tres semanas.
La Figura 8B es un gráfico de distribución de
tamaño del tamaño de los pólipos en ratones Min/+, dibujado como
número total de pólipos de cada tamaño (diámetro en mm) en animales
tratados con TNP-470 a 10 mg/kg qod, frente a
controles con solución salina.
La Figura 9 es un gráfico de diámetro de tejido
(mm) en un modelo animal de endometriosis en animales de control y
animales tratados con TNP-470.
La angiogénesis es el proceso por el cual se
forman nuevos vasos sanguíneos. Es esencial en la reproducción,
desarrollo y en la cura de heridas y está muy regulada en estos
eventos normales. Sin embargo, la angiogéneis no regulada y
persistente también contribuye en muchas enfermedades tales como
artritis, neovascularización ocular y crecimiento de tumores
sólidos. Desde 1983, se han identificado varias moléculas que
estimulan o inhiben la angiogénesis. Estas moléculas han conducido a
aplicaciones clínicas y ensayos en las áreas de estudios
diagnósticos, aceleración de la angiogénesis en la cura de heridas e
inhibición de la angiogénesis en la neoplasia.
La angiogénesis se ha estudiado extensivamente en
el área del crecimiento de tumores sólidos y se han aislado muchos
de los factores reguladores en estos tejidos. Hay una evidencia
sustancial de que el tamaño y el crecimiento de los tumores sólidos
dependen de la angiogénesis. Dicho de forma sencilla, una vez se ha
iniciado un tumor, cada aumento en la población celular del tumor
debe estar seguido de un aumento en la formación de nuevos capilares
para el suministro a ese tumor. Esta asociación nunca se ha hecho
entre la angiogénesis y tejidos u órganos normales, tales como el
tejido adiposo.
El tejido adiposo es un tejido altamente
vascularizado y se ha usado para facilitar la curación de heridas
durante siglos, (Ball J. 1928. The sack'em-up men:
an account of the rise and fall of the modern resurrectionists.
Oliver and Boyd, Edinburgh, London. pág. 73), principalmente por su
capacidad para provocar la revascularización del tejido afectado.
Como resultado de esta característica, el tejido adiposo continúa
utilizándose en procedimientos quirúrgicos que implican una
diversidad de tejidos en los que el suministro vascular es vital,
tal como en los intestinos, miocardio y pulmón transplantado.
(Silverman, et al., 1988. Angiogenic activity of adipose
tissue. Bioch Biophy Res Com. 153:347-352).
Las investigaciones en los aspectos angiogénicos
del tejido adiposo revelaron una dependencia del crecimiento del
desarrollo del suministro vascular. Durante la embriogénesis, la
vascularización y la diferenciación del adipocito son eventos
altamente coordinados. El tejido adiposo formado recientemente
requiere una angiogénesis continuada para el posterior crecimiento y
desarrollo. (Wasserman F. 1965. The development of adipose tissue.
En: Handbook of
Physiology. Vol. 5. Renold A., Cahill G., (eds.) Washington, DC. Am Physiol Soc. pág. 87-100). Aunque los mecanismos implicados todavía no se han elucidado completamente, se sabe que las interacciones paracrinas bidireccionales entre los adipocitos y las células microvasculares del endotelio (EC) tienen un papel regulador fundamental. (Lau D., et al. 1996. Intern J Obes. 20 (supl. 3) S16-S25). Esto está apoyado por estudios in vitro que evalúan las interacciones de EC aisladas de tejido adiposo con células 3T3, una línea de adipocitos que mantiene la mayoría de los atributos de las células de grasa in vivo. (Green G. 1978. The adipose conversion of 3T3 cells. En: 10th Miami Symposium on Differentiation and Development. Ahead F., Schultz J., Russe T., Wagner R. (ed.) New York, Academic Press. pág. 13-33). Estos estudios demuestran que las EC y los preadipocitos liberan factores mitogénicos que mejoran su proliferación entre sí de una forma específica de la célula. Esta relación simbiótica puede apreciarse en co-cultivos, en los que los preadipocitos proliferan en "isletas" alrededor de grupos de EC. (Lau, et al., 1996. Intern J Obes. 20 (supl. 3) S16-S25).
Physiology. Vol. 5. Renold A., Cahill G., (eds.) Washington, DC. Am Physiol Soc. pág. 87-100). Aunque los mecanismos implicados todavía no se han elucidado completamente, se sabe que las interacciones paracrinas bidireccionales entre los adipocitos y las células microvasculares del endotelio (EC) tienen un papel regulador fundamental. (Lau D., et al. 1996. Intern J Obes. 20 (supl. 3) S16-S25). Esto está apoyado por estudios in vitro que evalúan las interacciones de EC aisladas de tejido adiposo con células 3T3, una línea de adipocitos que mantiene la mayoría de los atributos de las células de grasa in vivo. (Green G. 1978. The adipose conversion of 3T3 cells. En: 10th Miami Symposium on Differentiation and Development. Ahead F., Schultz J., Russe T., Wagner R. (ed.) New York, Academic Press. pág. 13-33). Estos estudios demuestran que las EC y los preadipocitos liberan factores mitogénicos que mejoran su proliferación entre sí de una forma específica de la célula. Esta relación simbiótica puede apreciarse en co-cultivos, en los que los preadipocitos proliferan en "isletas" alrededor de grupos de EC. (Lau, et al., 1996. Intern J Obes. 20 (supl. 3) S16-S25).
Se ha avanzado en la identificación de muchos de
los compuestos implicados. Los adipocitos 3T3 producen potentes
factores que estimulan la proliferación y migración in vitro
de EC y la angiogénesis en la membrana coroialantónica de los pollos
(Cystolith, et al., 1982. Proc. Natl. Acad. Sci USA.
77:6007-6011). (Cystolith, et al., 1982. Proc
Natl Acad Sci USA 7:5597-5601). Uno de estos
compuestos se ha identificado como
1-butiril-glicerol, un factor
angiogénico cuyo nivel aumenta al menos 200 veces durante la
diferenciación del adipocito. (Dobson et al., 1990. Cell.
61:223-230). Los adipocitos también producen otros
factores con conocida actividad angiogénica, incluyendo PGE1, PGE2,
TNF-8, bFGF y FGF-9. (Form D.,
Auerbach R. 1983. Proc Soc Exp Biol Med.
172:214-218). (Smith S. 1996 Endo Metab Clin N Amer.
25:921-942). (Teichert-Kuliszewska,
et al. 1992. J Clin Invest. 90:1225-1231).
(Samagh et al. 1995. Obes Res 3:370S). De forma recíproca,
las EC aisladas en tejido adiposo liberan mitógenos en el medio de
cultivo que estimulan la replicación de los preadipocitos de forma
dependiente de la dosis (La, et al., 1996.
Intern J Obes. 20 (supl 3) S16-S25). La purificación parcial de los mitógenos derivados de las EC han revelado varias proteínas activas con pesos moleculares en el intervalo de 18-67 kDa, algunas de las cuales pueden pertenecer a la familia de FGF que se une a la heparina. (Lau, et al., 1990. Int J Obes. 14:193-201). Las complejas comunicaciones autocrina/paracrina entre el tejido adiposo y la EC siguen siendo un área de investigación activa.
Intern J Obes. 20 (supl 3) S16-S25). La purificación parcial de los mitógenos derivados de las EC han revelado varias proteínas activas con pesos moleculares en el intervalo de 18-67 kDa, algunas de las cuales pueden pertenecer a la familia de FGF que se une a la heparina. (Lau, et al., 1990. Int J Obes. 14:193-201). Las complejas comunicaciones autocrina/paracrina entre el tejido adiposo y la EC siguen siendo un área de investigación activa.
Los estudios descritos en los ejemplos
proporcionan evidencia irrefutable de que la adipogénesis depende
del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Por extensión y de forma
análoga al crecimiento de tumores sólidos - la prevención de la
neovascularización usando agentes anti-angiogénicos
evitará a su vez el crecimiento de tejido adiposo.
Sorprendentemente, sin embargo, también es evidente a partir de los
ejemplos que la angiogénesis puede causar pérdida de peso en
animales normales, no solo en animales en los que se da una mayor
proliferación del tejido adiposo. Estos resultados proporcionan una
fuerte evidencia de que la administración de la angiogénesis puede
usarse para regular el tamaño así como el crecimiento del tejido
adiposo.
Otros estudios descritos en los animales
proporcionan evidencia adicional de que la administración de la
angiogénesis puede usarse para regular el tamaño así como el
crecimiento de tejidos normales vascularizados, sin dañar los
tejidos. Como se usa en este documento, el término "normal" se
refiere a tejidos que no son cancerosos, es decir, transformados o
tejido de cicatrices que provienen de la curación de una herida.
Como se usa en este documento, el término "tejido
vascularizado" se refiere a tejidos tales como muscular,
intestinal, adiposo y endometrial, que se caracterizan normalmente
por un suministro de sangre que proporciona nutrientes e intercambio
gaseoso a través del tejido. La "vasculatura", en contraste con
el tejido vascularizado, se refiere a los propios vasos
sanguíneos.
Puede usarse cualquier compuesto
anti-angiogénico para regular el tamaño y/o
crecimiento de tejido normal vascularizado. Los ejemplos de
compuestos anti-angiogénicos preferidos incluyen
TNP-470, descrito en la Patente de Estados Unidos Nº
5.290.807; Angiostatina, descrita en la Patente de Estados Unidos N
5.639.725; Endostatina y Talidomida. Los especialistas en la técnica
conocen otros compuestos. La siguiente lista de inhibidores
angiogénicos se publicó en Genetic Engineering News, 1 de octubre de
1998:
Otro inhibidor de la angiogénesis que puede
usarse es CM101, un producto toxina bacteriano en desarrollo por
CarboMedi, Inc. Brentwood, TN.
Los fármacos pueden administrarse por vía
parenteral o enteral. En la realización preferida, los fármacos se
administran oralmente, en un vehículo entérico si es necesario
proteger el fármaco durante el paso a través del estómago. Otros
métodos alternativos de administración incluyen administración
intravenosa, transbucal u otros métodos
trans-membrana y formulaciones de liberación
controlada.
La composición anti-angiogénica
se administra en una cantidad eficaz para regular el tamaño y/o
crecimiento de un tejido vascularizado. La cantidad eficaz será
típicamente una cantidad eficaz para limitar la proliferación del
tejido o para reducir el tamaño del tejido, especialmente en el caso
en el que el tejido es tejido adiposo.
Las composiciones usadas en este documento
contienen una cantidad eficaz de inhibidor de angiogénesis para
tratar un paciente consiguiendo la regulación deseada en ausencia
sustancial de toxicidad sistémica.
Como se demuestra en los ejemplos, el inhibidor
de angiogénesis se administra en una cantidad y durante un periodo
de tiempo que produce como resultado niveles en sangre que regulan
el tamaño y/o crecimiento del tejido vascularizado a tratar. En la
realización preferida para el tratamiento de la obesidad, los
pacientes recibirán el fármaco una vez al día en una dosificación
eficaz para reducir el peso a niveles de mantenimiento.
Se ha demostrado que el método de tratamiento es
aplicable a individuos normales con sobrepeso y a individuos con
defectos genéticos. El método también debería ser útil en la mayoría
de los casos que implican un aumento de peso debido a defectos
hormonales o metabólicos o efectos secundarios de otros fármacos.
Además de promocionar la pérdida de grasa corporal a la vez que se
mantiene una masa corporal reducida y poder sostener la pérdida de
peso durante la administración crónica, otros beneficios del
tratamiento incluyen normalización de los niveles de glucosa en
sangre en la obesidad relacionada con la diabetes y en el caso de
algunos fármacos tales como TNP-470, la reducción
del apetito (es decir, como agente anoréxico). Estos resultados
pueden obtenerse sin efectos secundarios no deseados y sin potencial
abuso o dependencia.
La dependencia de la angiogéneis del tamaño y
crecimiento normal de los órganos tiene implicaciones en áreas en
las que el exceso o insuficiencia de crecimiento de tejido tiene
como resultado secuelas clínicas, así como en el campo de la
ingeniería de tejidos. Los ejemplos demuestran la eficacia en
modelos animales de endometriosis, poliposis, hipertrofia cardiaca,
así como obesidad. Estos resultados son indicativos de la eficacia
en el tratamiento de trastornos que implican aumentos en el tamaño o
crecimiento de otros tipos de tejido normal tales como fibroides
uterinos, hipertrofia prostática y amiloidosis. Estos trastornos
implican típicamente a pacientes en los que los aumentos en el
tamaño o crecimiento del tejido no es normal, pero el tejido no está
transformado o es de un tipo de tejido completamente diferente que
el tejido de origen, aunque la situación (como en el caso de la
endometriosis) o crecimiento (hipertrofia de órganos) sea
anormal.
La presente invención se comprenderá mejor con
referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
La primera serie de experimentos se realizó con
ratones ob/ob, una cepa de ratones que desarrolla obesidad mórbida
como resultado de una mutación espontánea en el gen leptina. (Zhang
et al., 1994. Nature. 372:425-432). Los
estudios con animales se realizaron en la instalación para animales
del Hospital Infantil de Boston de acuerdo con las pautas
institucionales. Los ratones ob/ob machos (Jackson Laboratories, Bar
Harbor, ME) con edades en el intervalo de 7 semanas a 6 meses y
pesos en el intervalo de 35 - 70 gramos se aclimataron antes de los
experimentos, se enjaularon individualmente y se les proporcionó
acceso libre a agua durante los estudios. Los animales se
anestesiaron con metoxifluorano inhalado
(Pitman-Moore Inc., Mundelein, IL) antes de todos
los procedimientos (afeitado y fotografía) y se observaron hasta que
despertaban completamente. Los animales se sacrificaron al final de
los experimentos por inhalación continua de metoxifluorano.
Los lomos de los ratones se afeitaron para
facilitar las inyecciones. Todas las inyecciones y las medidas se
realizaron entre 4-6 pm de cada día. A los ratones
se les inyectó de forma subcutánea con 5 o 10 mg/kg de
TNP-470 (AGM-1470) o solución
salina como control usando una aguja 30G durante periodos de
tratamiento de hasta 30 días (hasta aquí). Se observó que la grasa
subcutánea se reducía en el sitio de las inyecciones de
TNP-470 de forma que se cambió el sitio a lo largo
del dorso. Como comparación, un grupo de animales recibió
fenfluramina (40 mg/kg intraperitoneal, todos los días). El peso de
cada animal y la comida restante se midieron cada día. A un grupo de
animales se les alimentó por parejas para determinar si todo o parte
del efecto de pérdida de peso del TNP-470 era
resultando de la supresión de apetito. Esto se realizó emparejando
un ratón no tratado con cada ratón tratado y dando de comer al ratón
no tratado la cantidad de comida que su compañero tratado comió el
día anterior.
La Figura 1A demuestra la respuesta de pérdida de
peso de ratones tratados con TNP-470. Los ratones
tratados perdieron peso de forma dependiente de la dosis. La pérdida
de peso en los grupos tratados con TNP-470 fue
significativamente mayor que la conseguida con fenfluramina en su
dosis máxima. La pérdida de peso del grupo que recibía 10 mg/kg de
TNP continuó con una media de 1 gramo por día hasta que alcanzaron
una masa corporal de aproximadamente 22-24 gramos.
Esta pérdida de peso era posible independientemente del peso del
animal al inicio del estudio. El peso de los animales se estabilizó
en estos niveles a pesar de la administración continuada de fármaco.
Los animales que recibían una dosis menor de TNP-470
se estabilizaron en un peso más alto. Los animales seguían sanos y
activos durante todo el estudio.
Como se muestra en la Figura 1B, los ratones
tratados con TNP-470 experimentaron una reducción en
el apetito en comparación con animales de control que tuvo como
resultado por sí sola en una pérdida de peso. Sin embargo, la
pérdida de peso resultante de la reducción en la ingestión de comida
fue significativamente menor que la conseguida por
TNP-470. Estos resultados sugieren que
TNP-470 actúan mediante dos mecanismos para reducir
el peso - una supresión central de apetito y una inhibición
periférica de la angiogénesis. No se había informado nunca del
efecto de supresión del apetito del TNP-470.
Se repitió el experimento de alimentación por
parejas usando ratones normales sin la mutación del gen leptina que
no desarrollaban obesidad. En estos animales, que comenzaron el
estudio relativamente cerca de su masa corporal magra, se observó
una pequeña pérdida que era similar en los grupos tratados y en los
alimentados por parejas. Esto sugiere que en un animal delgado, en
el que se espera que la angiogénesis que tiene lugar en el tejido
adiposo de crecimiento lento sea limitada, la mayoría de la pérdida
de peso lograda con TNP-470 es el resultado de la
supresión de apetito. Estos animales tampoco mostraron evidencia de
toxicidad.
Las muestras de tejido adiposo se examinaron
histológicamente para detectar evidencia de proliferación de células
endoteliales que indican la formación de nuevos vasos sanguíneos en
animales tratados y no tratados usando métodos de pigmentación PCNA
y Brdu. Hubo una proliferación de células endoteliales
significativamente mayor en animales no tratados en comparación con
aquellos que recibían TNP-470. Esto apoya la
hipótesis de que se produce angiogénesis en el tejido adiposo de
estos ratones y que puede inhibirse con TNP-470.
Como conclusión, TNP-470 causa
una pérdida de peso dependiente de la dosis en ratones obesos y
normales hasta el nivel de peso corporal magra como resultado de
supresión de apetito y de inhibición de angiogénesis de forma
independiente del peso de partida del animal. La cantidad de pérdida
de peso lograda con TNP-470 es bastante superior a
la conseguida con fenfluramina. Estos resultados apoyan el uso de la
inhibición de angiogénesis para el tratamiento de la obesidad.
Además, también se establece un efecto de supresión del apetito de
TNP-470.
Se realizaron estudios animales en el Hospital
Infantil de Boston de acuerdo con las pautas institucionales. Se
compraron ratones machos ob/ob y ratones C57 (C57BL/6J) con 7
semanas de edad y se aclimataron durante una semana antes de la
experimentación (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Los ratones
se enjaularon individualmente con acceso libre a agua y pienso
convencional. Las manipulaciones se realizaron entre las
4-6 pm para minimizar la interrupción de la rutina
de alimentación. Los animales se anestesiaron con metoxifluorano
inhalado (Pitman-Moore, Inc., Mundelein, IL) antes
de los procedimientos que provocan malestar o dolor y se observaron
hasta que despertaron completamente. Se afeitó el pelo para
facilitar las inyecciones. El TNP-470 fue
proporcionado generosamente por Takeda Chemical Industries Ltd.
(Osaka, Japón) y se almacenó en seco a 40ºC. Las soluciones se
prepararon a diario en solución salina normal y se administraron de
forma subcutánea en sitios rotativos en el dorso. El peso corporal y
el pienso restante en el comedero se pesaron diariamente. Los
animales se sacrificaron por inhalación continua de
CO_{2}.
CO_{2}.
Estudio de respuesta a la dosis. Se
trataron ratones ob/ob de ocho semanas con 2,5, 5,0, 7,5 ó 10
mg/kg/día de TNP-470 durante 21 días. Un grupo de
control recibió 0,1 ml/día de solución salina. El grupo que recibió
10 mg/kg/día de TNP-470 contenía 8 ratones, todos
los demás grupos contenían 4 ratones cada uno.
Tratamiento de Ratones con obesidad
mórbida. Se enjaularon ratones ob/ob de ocho semanas hasta que
completaron su fase de crecimiento rápido y pesaban más de 60 g.
Aproximadamente a los cinco meses de edad (n=6), el tratamiento se
inició con 10 mg/kg/día de TNP-470 y continuó
durante 67 días. Un grupo de control con ratones ob/ob de la misma
edad (n=6) recibió 0,1 ml/día de solución salina.
Estudio de tratamiento a largo plazo. Se
trataron ratones ob/ob/ de ocho semanas (n=6) con 10 mg/kg/día de
TNP-470 durante 138 días. Un grupo de control (n=4)
recibió 0,1 ml/día de solución salina. Se registró diariamente el
peso corporal de ratones C57 de la misma edad (n=5) como
comparación.
Comparación con fenfluramina. Se inyectó
intraperitonealmente a ratones ob/ob/ de ocho semanas con 40
mg/kg/día de fenfluramina en 0,1 ml de solución salina durante 45 días (n=12). Después, los ratones se dividieron en 3 grupos y 1) se retiraron de la terapia, 2) continuaron con fenfluramina, o 3) cambiaron a 10 mg/kg/día de TNP-470 durante el resto del estudio de 168 días. Un grupo de control de ratones ob/ob (n=4) recibió 0,1 ml/día de solución salina.
mg/kg/día de fenfluramina en 0,1 ml de solución salina durante 45 días (n=12). Después, los ratones se dividieron en 3 grupos y 1) se retiraron de la terapia, 2) continuaron con fenfluramina, o 3) cambiaron a 10 mg/kg/día de TNP-470 durante el resto del estudio de 168 días. Un grupo de control de ratones ob/ob (n=4) recibió 0,1 ml/día de solución salina.
Estudios de alimentación por parejas. Se
trató a ratones ob/ob de ocho semanas con acceso libres a pienso con
10 mg/kg/día de TNP-470 (n=4). El pienso restante en
el comedero se pesó diariamente y se calculó la cantidad consumida
por día por cada ratón. Esta cantidad de comida se le proporcionó
posteriormente a un ratón emparejado en un segundo grupo no tratado
(n=4). También se registró el consumo de comida de un grupo de
control de ratones no tratados con acceso libre a pienso. Los pesos
corporales se midieron diariamente. El experimento se repitió con
ratones normales C57 de la misma edad (n=5/grupo). Los estudios de
alimentación por parejas también se realizaron con ratones tratados
con angiostatina y endostatina siguiendo este protocolo.
Tratamiento ciclado con
TNP-470. Se trataron ratones ob/ob de ocho
semanas (n=15) con ciclos intermitentes de 10 mg/kg/día de
TNP-470. Los ratones comenzaron con un peso de 45 g
y se trataron hasta que redujeron su peso al peso corporal de
ratones C57 de la misma edad. Después el tratamiento se interrumpió
y se permitió otra vez ganar peso hasta el peso inicial de 45 g.
Este ciclo se repitió dos veces. Habiendo demostrado la
reproducibilidad y la eficacia en ratones ob/ob con un peso mayor de
60 g, se permitió otra vez al grupo tratado ganar peso hasta un peso
medio de 59 g en el tercer ciclo (día 135) antes de reiniciar el
tratamiento. Posteriormente, los ratones se ciclaron entre los pesos
de los grupos ob/ob y C57 de control. Todos los ratones se pesaron
diariamente.
Tratamiento con angiostatina y endostatina de
ratones obesos. Se produjo endostatina y angiostatina
recombinante de murina con Escherichia Coli como se describe
en O'Reilly et al., 1994 Cell. 79:315-328;
O'Reilly et al., 1997. Cell. 88:277-285. Los
ratones ob/ob de ocho semanas (n=3/grupo) recibieron inyecciones
subcutáneas de antiostatina a 20 mg/kg/día o 50 mg/kg dos veces al
día o endostatina a 50 mg/kg dos veces al día durante 22 días. Un
grupo de control de ratones ob/ob (n=3) recibió 0,1 ml/día de
solución salina.
Ensayo de composición corporal. La
composición del cuerpo de los ratones se evaluó usando una técnica
de dilución de agua titriada (Logsdon, 1972 Radiologic Technology.
33:146-149). Para este estudio se usaron animales de
cinco meses tratados (n=6) y de control (n=3) del estudio de
tratamiento a largo plazo con TNP-470 (día 90) y
ratones normales C57 con la misma edad. Los ratones se mantuvieron
en ayunas durante 12 horas con acceso libre a agua. Después se les
administró 200 \mul de agua titriada (100 \muCi/ml) y se
mantuvieron en ayunas durante 2 horas más para permitir que el
titrio se equilibrase en el agua. Después, los animales se
anestesiaron y se colocaron bajo una lámpara de calor durante 2
minutos para inducir vasodilatación de la cola. Se realizó una
incisión profunda de 0,5 mm perpendicular al eje longitudinal
ventral de la cola a 5 mm de la base usando un bisturí del Nº 10. Se
tomaron precauciones para evitar dañar la arteria central de la
cola. Se recogió una muestra de sangre de 50 \mul de las venas de
la cola en viales de separación de suero se introdujeron en hielo.
La hemorragia se cortó por compresión leve sobre la incisión. La
actividad específica del agua titriada se midió en las muestras que
contenían 10 \mul de plasma y 3 ml de líquido de escintilación
Ecolume (ICN: Costa Mesa, CA) usando un aparato de recuento por
escintilación líquida Wallac 1409. La variabilidad entre las
muestras duplicadas tenía una media de menos del 10%. Se usaron las
siguientes fórmulas para calcular los parámetros
deseados.
deseados.
(1) Agua Total
en Cuerpo = \frac{\text{(actividad habitual) x
2.000}}{(actividad\_muestra \ - \ actividad \ de \ fondo) \ x \
1.064}
El factor de 1.064 se usa para corregir el hecho
de que el suero es aproximadamente 94% agua. El factor de 2.000 es
el factor de dilución que se necesita para calcular la actividad
total de titrio en la dosis administrada.
(2) Masa
Corporal Magra = \frac{\text{Agua Total en
Cuerpo}}{0,73}
El factor de 0,73 es el porcentaje medio de agua
total en el cuerpo que se encuentra en la masa corporal magra
derivada del análisis de cadáveres (Widdowson et al.,
1968).
(3) Masa de
Grasa = Peso Corporal Total - Masa Corporal
magra
(4) Porcentaje
de Grasa Corporal = \frac{\text{Masa de Grasa x 100}}{\text{Peso
Corporal
Total}}
Medidas de glucosa en suero. Se midieron
los niveles de glucosa en suero de ratones ob/ob de 9 meses tratados
(n=5) y no tratados (n=13) al final del estudio de respuesta de
peso. Se tomaron muestras de sangre (100 \mul) de las venas de la
cola de ratones anestesiados como se ha descrito anteriormente. Los
niveles de glucosa en suero se midieron en el laboratorio químico
clínico del Hospital Infantil de Boston y se expresan en mg/dl
Se obtuvieron células endoteliales capilares
bovinas (BCE) como ha descrito previamente Folkman et al.,
1979 Proc Natl Acad Sci USA 76:5217-5221. Las BCE se
introdujeron en placas de cultivo de tejido recubiertas con gelatina
al 1,5% y se cultivaron en DMEM que contenía suero bovino al 10%
(BCS), glutamina al 1%/antibióticos (GPS) y 3 ng/ml de factor de
crecimiento del fibroblasto básico humano recombinante (bFGF; Scios
Nova, Mountainview, CA). Las BCE se mantuvieron a 37ºC en CO_{2}
al 10% y se pasaron a confluencia usando una solución de tripsina al
0,5%. Se obtuvieron células 3T3-L1 de ATCC y se
mantuvieron de acuerdo con las instrucciones acompañantes. Las
3T3-L1 se cultivaron en DMEM que contenía BCS al 10%
sin antibióticos y se introdujeron en placas de cultivo de tejido no
recubiertas. Las células se pasaron con una confluencia del 70% para
evitar la diferenciación en los adipocitos usando una solución de
tripsina al 0,5%.
Ensayo de proliferación de células
endoteliales capilares bovinas. Se mantuvieron BCE en
confluencia durante 5 días antes de usarse en los ensayos de
proliferación. Las células se lavaron con PBS y se dispersaron en
una solución de tripsina al 0,05%. Las BCE se resuspendieron en DMEM
que contenía BCS al 10% y GPS al 1% (25.000 células/ml) y se
colocaron en placas de cultivo de 24 pocillos gelatinizadas con una
densidad de 12.500 células/ml (0,5 ml/pocillo). Las placas se
incubaron durante 24 horas. El medio se reemplazó con 0,25 ml de
medio de ensayo (DMEM + BCS al 5% + GPS al 1%) que contenía la
muestra de prueba a una concentración final de 2x. Después de 30
minutos de incubación, se añadieron 0,25 ml de medio de ensayo que
contenía 2 ng/ml de bFGF. Los pocillos contenían 0,5 ml de medio de
ensayo con la muestra de prueba a una concentración de 1x y 1 ng/ml
de bFGF. Después de 72 horas de incubación, las células se
dispersaron en tripsina, se resuspendieron en Hematall (Fisher
Scientific, Pittsburg, PA) y se recontaron usando un Coulter
Counter.
Ensayo de proliferación de células
3T3-L1. Se lavaron cultivos subconfluentes de
3T3-L1 con PBS y se dispersaron en una solución de
tripsina al 0,05%. Las células se resuspendieron en DMEM que
contenía BCS al 10% (16.000 células/ml) y se dispusieron en placas
de cultivo de 24 pocillos con una densidad de 8.000 células/pocillo
(0,5 ml/pocillo). Las placas se incubaron durante 24 horas. El medio
se reemplazó con 0,25 ml de medio de ensayo (DMEM + BCS al 5%) y la
muestra de prueba a una concentración final de 2x. Después de 30
minutos de incubación, se añadieron 0,25 ml de medio de ensayo que
contenía 2 ng/ml de bFGF. Los pocillos contenían 0,5 ml de medio de
ensayo con la muestra de prueba a concentración 1x y 1 ng/ml de
bFGF. Después de 72 horas de incubación, las células se dispersaron
en tripsina, se resuspendieron en Hematall y se contaron usando un
Coulter Counter.
Se usó una técnica de marcado fluorescente doble
para permitir la identificación simultánea de las células en
proliferación (Brdu) y células endoteliales (factor von Willebrandd,
vWF) en secciones de tejido adiposo. El tejido adiposo se fijó
durante 4 horas en fijador de Carnoy y se traspasó a etanol al 100%.
Los tejidos se introdujeron en parafina después de los
procedimientos histológicos convencionales. Se permeabilizaron
secciones (espesor 5 \mum) con 10 \mug/ml de proteinasa K a 37ºC
durante 20 minutos y se lavó con PBS. Para marcar las células
proliferantes, las secciones se incubaron con una mezcla
anti-Brdu/nucleasa (Brdu Labeling and Detection Kit
1; Boehringer Mannheim, Alemania) a temperatura ambiente durante 60
minutos y después se lavaron con PBS. Las placas se incubaron con
IgG de caballo anti-ratón fluoresceinada (Vector;
Burlingane, CA) a 4ºC durante una noche. Para marcar el endotelio,
las secciones se bloquearon con suero de caballo al 5% durante 30
minutos y después se incubaron con antisuero de conejo contra factor
de von Willebrand humano (DAKO) diluido en suero de cabra al 5% en
PBS. La unión de anticuerpos se detectó con IgG de cabra
anti-conejo conjugado con Rojo de Texas (Vector
Laboratories). Las secciones tintadas se conservaron con Fluoromount
G (Southern Biotechnology Associates, Inc.). Las placas se
analizaron posteriormente usando un microscopio de fluorescencia
Zeiss Axiophot (Zeiss, Oberkochen, FRG) con luz azul a 485 nm para
observar la excitación FITC (Brdu) y con luz verde a
510-560 nm para observar la excitación del Rojo de
Texas (endotelio). Se tomaron fotografías con un aumento de 40X con
película Ecktachrome p1600 (Eastman Kodak. Rochester, NY). El
endotelio proliferante era detectable en la película como células
amarillas (verde + rojo).
Se usó un análisis de t de Student de una cola
para la comparación de los pesos corporales, porcentaje de grasa
corporal y niveles de glucosa en suero entre los grupos tratados y
no tratados. La comparación entre los grupos de alimentación por
parejas se realizó usando un análisis con t de Student por
parejas.
Tanto los ratones obesos (ob/ob) como no obesos
(C57) usados en estos estudios experimentaron un periodo de rápido
crecimiento y aumento de peso durante los primeros meses de vida,
que se redujo al envejecer los animales. Sin embargo, los ratones
ob/ob aumentaron su peso 2-3 veces más a velocidades
mucho más rápidas en comparación con los controles de la misma edad.
Esta diferencia se achacó en gran medida a la acumulación de un
exceso de tejido adiposo. En estos estudios, los ratones ob/ob de 8
semanas pesaron 44,6 \pm 0,7 g y aumentaron su peso con una
velocidad media de 0,4 g/día (n+12). Como comparación, los ratones
normales C57 de la misma edad pesaron 23,0 \pm 0,6 g y aumentaron
su peso con una velocidad media de 0,1 g/día (n=5). Los ratones
obesos alcanzaron pesos máximos de más de 70 g a los
8-9 meses de edad, en comparación con sus homólogos
correspondientes que tenían pesos máximos de más de 30 g a los
3-4 meses.
Se comprobó el efecto de los inhibidores de la
angiogénesis en la capacidad de los ratones ob/ob para aumentar de
peso. Se administró TNP-470, un inhibidor selectivo
de la angiogénesis, a ratones obesos con dosis de 2,5, 5,0, 7,5 y 10
mg/kg/día durante 21 días. Los ratones obesos que recibían
TNP-470 perdieron peso con una velocidad, una
duración y hasta un punto que dependía de la dosis (Figura 2). Las
velocidades de pérdida de peso variaban de 0,5 g/día a una dosis de
2,5 mg/kg/día a un máximo de 1,2 g/día con dosis iguales o mayores a
10 mg/kg/día (p <0,00001). Como comparación, la velocidad máxima
de pérdida de peso en ratones sin ninguna ingestión calórica durante
4 días fue de 1,2 g/día. A pesar del tratamiento continuo, los
ratones se estabilizaron en pesos corporales de 40,5 \pm 0,9 g
después de 10 días con 2,5 mg/kg/día (p<0,000001). En relación al
peso inicial medio de 45 g, esto suponía pérdidas de peso de
4-25 g dependiendo de la dosis de
TNP-470. Por el contrario, los ratones no tratados
aumentaron una media de 9 g, alcanzando un peso de 53,8 \pm 0,6 g
en la conclusión del estudio. En relación a los pesos finales de los
ratones de control, los ratones tratados con TNP-470
pesaron 13-34 g menos.
Los pesos corporales de los ratones obesos
también se evaluaron en respuesta a inhibidores específicos de la
angiogénesis. Los ratones se trataron con angiostatina con dosis de
20 mg/kg/día o 50 mg/kg dos veces al día, o endostatina con una
dosis de 50 mg/kg/día durante 21 días (Figura 3). Los ratones de
control aumentaron 0,4 g/día desde un peso inicial medio de 45 g,
alcanzando 54,6 g \pm 0,2 g en el día 22. Por el contrario, los
ratones que recibían inhibidores de la angiogénesis ganaron poco
peso o perdieron peso. Las respuestas a la angiostatina fueron
dependientes de la dosis. A 20 mg/kg/día, el aumento de peso se
limitó a un tercio del de los controles y los ratones alcanzaron
48,5 \pm 1,1 g al final del estudio (p<0,03). A 50 mg/kg de
angiostatina dos veces al día, los ratones redujeron su peso a 31,7
\pm 0,2 g
y se estabilizaron (p<0,0004). Los ratones tratados con endostatina perdieron inicialmente aproximadamente 2 g, después ganaron peso gradualmente hasta los 48,9 g \pm 0,8 g en el día 22 (p<0,002). En relación a los pesos finales de los ratones de control, los ratones tratados pesaron 5-13 g menos.
y se estabilizaron (p<0,0004). Los ratones tratados con endostatina perdieron inicialmente aproximadamente 2 g, después ganaron peso gradualmente hasta los 48,9 g \pm 0,8 g en el día 22 (p<0,002). En relación a los pesos finales de los ratones de control, los ratones tratados pesaron 5-13 g menos.
Se realizaron estudios a largo plazo para
determinar el patrón de respuesta de peso corporal a la terapia
crónica. Los ratones se trataron con 10 mg/kg/día de
TNP-470 durante un total de 138 días y los pesos
corporales se midieron diariamente (Figura 4A). Inicialmente, los
animales perdieron peso a una velocidad media de 1,2 g/día,
reduciendo a 20,2 \pm 0,5 g en el día 20. A esto le siguió un
periodo limitado de rápido aumento de peso. Los pesos corporales se
estabilizaron aproximadamente en 32 g el día 54 del estudio y
después siguieron paralelamente la curva de crecimiento de ratones
normales C57 de la misma edad.
Los animales se mantuvieron en ayunas durante
periodos de 24 horas en los días 89-90 del estudio
para realizar experimentos de dilución de agua titriada. Esto tuvo
como resultado una pérdida de peso en todos los grupos. Sin embargo,
los ratones trataros no volvieron a ganar esta pérdida de peso, a
peso de volver a la dieta ad librium. Esto se refleja por una
bajada en la curva seguida de un reestablecimiento de la pendiente
con un menor peso corporal.
Al finalizar este estudio, los ratones tratados
pesaban 34,8 g \pm 1,1 g, en comparación con ratones ob/ob de
control que pesaban 71,0 \pm 0,9 g (p<0,00001) y ratones
normales C57 de la misma edad que pesaban 33,1 \pm 0,7 g. Los
ratones tratados pesaban 36 g menos que los ratones ob/ob no
tratados.
Al envejecer los ratones obesos, son
2-3 veces más pesados que ratones C57 normales y la
velocidad de aumento de peso se reduce, siendo más análoga a la
obesidad crónica en humanos (Chlouverakis y Hojnicki, 1974). Para
determinar si TNP-470 sería igualmente eficaz en
estas condiciones, los ratones ob/ob se enjaularon hasta que
completaron su fase de crecimiento rápido. Los ratones tenían 5
meses y pesaban más de 60 g al inicio del experimento. Los ratones
no tratados ganaban peso con una velocidad de 0,1 g/día, alcanzando
73,0 \pm 1,0 g al final del estudio. Por el contrario, los ratones
tratados redujeron su peso con una velocidad de 0,2 g/día hasta 39,0
\pm 1,9 g en el día 40 del tratamiento y se estabilizaron durante
la duración del estudio de 67 días (p<0,00001) (Fig. 4). Los
ratones normales C57 pesaron aproximadamente 34 g con esta edad. Por
lo tanto, estos animales obesos, más viejos y con peso más estable
respondieron igualmente a TNP-470.
Como único órgano adulto en crecimiento y único
sitio de angiogénesis en animales normales, se tomó como hipótesis
que el tejido adiposo sería susceptible de forma selectiva a la
terapia antiangiogénica. La observación de que el peso corporal de
los animales tratados se estabilizó aproximadamente en el peso de
ratones normales C57 de la misma edad, independientemente del peso
inicial o de la duración de la terapia, era consistente con esta
hipótesis (Figura 4A y 4B). Se usó una técnica de dilución de agua
titriada para evaluar la composición corporal de los ratones y
determinar si la pérdida de peso estaba asociada con una reducción
en el porcentaje de grasa corporal (Logsdon, 1972). Se usaron
ratones tratados con TNP-470 (10 mg/kg/día) durante
90 días (Fig. 4A) y ratones ob/ob de la misma edad y ratones
normales C57B1/6. La pérdida de peso en respuesta a la terapia
antiangiogénica se asoció con una reducción del 46% en el porcentaje
de grasa corporal de 35% a 19% (Tabla 2; p<0,001).
Los ratones tratados (TNP-470, 10
mg/kg/día x 90 días) y los ratones ob/ob de control y los ratones
normales C57 de control se mantuvieron en ayunas y se les administró
una cantidad conocida de agua titriada. Se dejó que el radiomarcador
se equilibrase en las partes acuosas del animal. Después se midió la
cantidad de marcador en un volumen pequeño de plasma y se usó el
factor de dilución para determinar el agua total en el cuerpo, a
partir del cual se calculó el porcentaje de grasa.
* p <0,00001
\hskip1cm** p<0,001
La obesidad mórbida en ratones ob/ob se asocia
con el desarrollo de una resistencia a la insulina e hiperglicemia
(Coleman y Hummel, 1973). Para determinar si la pérdida de peso
resultante de la terapia antiangiogénica protegió frente a la
aparición de diabetes, se midieron los niveles de glucosa en suero
de ratones tratados con TNP-470 durante 115 días y
los de los controles no tratados. Los ratones no tratados (73 g)
tenían un nivel medio de glucosa de 224 \pm 16 mg/dl. Por el
contrario, los ratones ob/ob tratados con TNP-470
(41 g) tenían un nivel medio de glucosa de 158 \pm 12,6 mg/dl
(p<0,05). Esto está dentro del intervalo normal de
62-175 mg/dl para esta especie (Harkness y Wagner,
1995 The biology and medicine of rabbits and rodents. Lea &
Febiger Books. Media, PA, pág. 93).
Se tomaron muestras de sangre de la vena de la
cola de ratones tratados (TNP-470, 10/mg/kg/día x
115 días) y ob/ob de control. Los niveles de glucosa en suero se
midieron en muestras de suero en los Laboratorios Químicos Clínicos
del Hospital Infantil de Boston. *p<0,00001 **p<0,05
Para demostrar la reversibilidad y
reproducibilidad de la terapia antiangiogénica en este modelo de
crecimiento normal de tejido, los ratones ob/ob se trataron con
ciclos intermitentes de TNP-470 con dosis de 10
mg/kg/día (Figura 4C). Los ratones comenzaron con un peso de 45 g y
se trataron hasta que redujeron su peso al de los ratones C57 de la
misma edad. Después el tratamiento se interrumpió y se permitió otra
vez ganar peso hasta el peso inicial de 45 g. Este ciclo se repitió
dos veces. Habiendo demostrado la reproducibilidad y la eficacia en
ratones ob/ob con un peso mayor de 60 g (Figura 4B), se permitió
otra vez al grupo tratado ganar peso hasta un peso medio de 59 g en
el tercer ciclo (día 135) antes de reiniciar el tratamiento. Este
experimento continua y los ratones se ciclan entre los pesos de los
grupos de ratones ob/ob y los grupos de control C57. La velocidad de
aumento de peso de la terapia fue mayor que la de los controles. Se
ha informado anteriormente de un aumento de peso acelerado en estos
animales después de estudio de restricción calórica hasta que se
establece el peso obeso normal (Chlouverakis, 1970). Los ratones
tratados han reducido su peso de forma similar y repetida cuando
reciben TNP-470 y lo vuelven a ganar cuando se
interrumpe la administración del fármaco.
La respuesta de pérdida de peso al
TNP-470 se comparó con la de la fenfluramina, una
inhibidor de la absorción de serotonina con efectos anoréxicos
(Figura 5). Los ratones obesos tratados con una alta dosis
terapéutica (40 mg/kg/día) de fenfluramina perdieron
4-5 g en los primeros 5 días de terapia
(p<0,005). Posteriormente, volvieron a ganar peso gradualmente a
pesar del tratamiento continuado. El día 45 del estudio, los ratones
tratados con fenfluramina se dividieron en 3 grupos y 1) se
retiraron de la terapia, 2) continuaron con fenfluramina, o 3)
cambiaron a 10 mg/kg/día de TNP-470. El día 94, los
ratones de control pesaban 65,8 \pm 1,4 g; los ratones a los que
se les retiró la fenfluramina pesaban 65,6 \pm 1,4 g; y los
ratones que continuaron tomando fenfluramina pesaban 62,4 g \pm
1,9 g. No hubo una diferencia significativa entre ninguno de los
grupos. Por el contrario, al sustituir la fenfluramina por
TNP-470 en un subgrupo de ratones se tuvo como
resultado una reducción en el peso de los ratones normales C57, 38,5
\pm 0,7 g (p<0,000001). Esto se ilustra adicionalmente por la
apariencia de los ratones. Los ratones ob/ob no tratados no son
fácilmente distinguibles de los tratados con fenfluramina mientras
que los ratones que reciben TNP-470 son del mismo
tamaño que sus homólogos C57.
El tratamiento con TNP-470 ha
sido muy bien tolerado en dosis de hasta 10 mg/kg/día durante
periodos de hasta 138 días. Esto es aproximadamente 1/5 de la vida
de los animales. El único efecto adverso apreciado es una pequeña
cicatriz superficial en el lugar de las inyecciones repetidas del
fármaco. El apetito se suprime ligeramente durante los primeros
10-20 días de tratamiento y después se normaliza
gradualmente. El nivel de actividad de los ratones tratados fue
similar al de los ratones C57 al contrario que los ratones de
control ob/ob que se volvieron inactivos al ganar peso.
Como conclusión, estos estudios han demostrado
que la terapia antiangiogénica tiene como resultado una pérdida de
peso significativa y una reducción en la grasa corporal en ratones
genéticamente obesos usando tres inhibidores distintos de la
angiogénesis. Esto se ve apoyado adicionalmente por la demostración
de que las preparaciones inactivas de angiostatina y endostatina no
afectaron al peso corporal. La siguiente serie de experimentos se
dirigió a la determinación de los mecanismos. Los efectos sobre el
apetito y en los tejidos periféricos se están investigando. Los
resultados se resumen a continuación.
Se aisló el efecto del apetito en el peso
corporal de ratones tratados con TNP-470 en
experimentos de alimentación por parejas. La cantidad precisa de
pienso consumida diariamente por cada ratón tratado se le
proporcionó a un ratón emparejado en un grupo no tratado (Figura 6A
y 6B). Los pesos corporales de los ratones emparejados se usaron
para aislar y medir los efectos de los cambios de apetito en los
animales tratados. Los ratones obesos que recibían
TNP-470 comieron menos durante aproximadamente los
primeros 18 días de tratamiento. Esto correspondía al 56% de la
pérdida de peso inicial. Posteriormente el apetito se normalizó
gradualmente a pesar del tratamiento continuado (hasta 138 días),
como se refleja en un aumento estable de los ratones emparejados
frente a los pesos de ratones de control. Para determinar si el
efecto anoréxico era reversible y reproducible en los mismos
animales, un grupo de ratones se trató con ciclos intermitentes de
TNP-470 y se uso un grupo alimentado en pareja para
seguir el impacto de los cambios de apetito (Figura 6A). Los ratones
recibieron TNP-470 durante 20 días, se interrumpió
la terapia durante 15 días y después se les trató una segunda vez
durante 36 días. El efecto anoréxico solo estuvo presente durante la
exposición inicial al TNP-470. Durante el segundo
ciclo de terapia, los animales tratados perdieron peso pero
mantuvieron su apetito como se refleja en el aumento estable en los
pesos de los ratones alimentados por parejas. El apetito solo era
responsable del 17% de la diferencia de peso entre los ratones
tratados y no tratados durante el segundo ciclo. El mecanismo
anoréxico todavía no se ha determinado.
No hubo ningún efecto anoréxico asociado con la
endostatina o angiostatina a 20 mg/kg/día. La angiostatina a 50
mg/kg dos veces al día se asoció con una pequeña reducción en el
apetito responsable de menos del 20% de la pérdida total de
peso.
Los ratones normales C57 tratados con
TNP-470 también perdieron peso (Figura 6B). En este
caso, casi toda la pérdida inicial de peso se atribuyó a una
reducción en el apetito, como se refleja en los ratones alimentados
por parejas. El efecto anoréxico duró aproximadamente 8 días,
después de los cuales el apetito de los ratones tratados aumentó
gradualmente y los ratones emparejados ganaron peso. Los ratones
tratados redujeron su peso en una media de 85% del peso de control
(p<0,00001). Esto es significativamente menor que lo apreciado en
los ratones ob/ob con la misma dosis de TNP-470 (56%
del peso de control). Esto puede reflejar el hecho de que estos
animales normales tienen un porcentaje de grasa corporal mucho
menor, que parece ser el objetivo selectivo de esta terapia.
La pérdida de peso en los animales tratados que
no se explica por la reducción en el apetito, es probablemente el
resultado de un efecto periférico a nivel de tejido. Esta conclusión
se ve apoyada adicionalmente por la observación de que el aumento de
peso de los ratones ob/ob y C57 se restringió con los inhibidores de
la angiogénesis. Los ratones tratados ganaron relativamente poco
peso, a pesar de un mayor consumo de comida suficiente para causar
un aumento de peso en los grupos alimentados por parejas.
Para determinar si el crecimiento del tejido
adiposo estaba asociado con la proliferación celular endotelial, se
examinaron secciones subcutáneas de tejido adiposo en ratones ob/ob
no tratados y en ratones normales C57. Se uso un procedimiento con
doble marcador fluorescente para identificar simultáneamente el
endotelio y las células proliferantes. El marcador de las células
endoteliales, factor de von Willebrand (vWF), se marcó con un
marcador fluorescente rojo y el Brdu de células proliferantes se
marcó con un marcador verde fluorescente. Las células proliferantes
endoteliales se marcaron con ambos marcadores y parecían
amarillas.
El tejido adiposo de ratones normales C57
contenía adipocitos relativamente pequeños y una alta densidad de
células endoteliales como se demuestra por la abundancia de células
marcadas en rojo. También se observaron ocasionalmente células
endoteliales proliferantes (células amarillas). El tejido adiposo de
ratones obesos no tratados contenía numerosas células endoteliales
proliferantes. La densidad de células endoteliales estaba diluida
por el gran tamaño de los adipocitos de los ratones obesos. El
tejido adiposo de ratones ob/ob tratados contenía microvasos
tortuosos dilatados con un menor porcentaje de células endoteliales
y pocas células proliferantes, de forma consistente con la
inhibición de la angiogénesis. También se examinaron las secciones
de tejido de ratones obesos sin terapia de TNP-470
durante una semana. Estos animales estaban ganando peso a
velocidades mayores que los de control. La densidad de células
endoteliales es notablemente menor que la de tejido adiposo normal.
Sin embargo, hay una abundancia de células proliferantes. Hay
presentes células endoteliales proliferantes (amarillo) así como
células no endoteliales (verde). También se observaron microvasos
dilatados, similares a los observados en los animales tratados.
Para determinar si TNP-470 puede
tener un efecto directo en los preadipocitos, se realizaron ensayos
de proliferación usando células 3T3-L1. Esta línea
celular tiene la mayoría de los atributos de las células adiposas
in vivo (Green 1978. The adipose conversion of 3T3 cells. En:
10th Miami Symposium on Differentiation and Development. Ahead F.,
Schultz J., Russe T., Wagner R. (ed.) New York, Academic Press. pág.
13-33). Las células se incubaron en distintas
concentraciones de TNP-470 durante 72 horas y se
contaron posteriormente. Se realizaron comparaciones con células
endoteliales capilares bovinas (BCE). La mitad de la inhibición
máxima citostática de proliferación celular endotelial fue de
aproximadamente 10 pg/ml. por el contrario, se requerían 10
\mug/ml de TNP-470 para obtener un grado similar
de inhibición en los cultivos de 3T3-L1.
Estos estudios demuestran que el crecimiento y
masa del tejido adiposo depende de la angiogénesis; los inhibidores
de la angiogénesis reducen el peso corporal y la masa del tejido
adiposo; la reducción del peso corporal con agentes antiangiogénicos
depende de la dosis y tiene lugar independientemente del peso
inicial; la reducción de peso se logró con cada inhibidor de
angiogénesis ensayado; TNP-470 da como resultado una
reducción temporal del apetito; el tratamiento a largo plazo con
inhibidores de angiogénesis se tolera bien; el tratamiento de la
obesidad mórbida con inhibidores de la angiogénesis evita la
hiperglicemia.
Los niveles crónicamente altos de hormona tiroide
tienen como resultado una sobrecarga de volumen del corazón que
conduce a una hipertrofia cardiaca excéntrica en animales y seres
humanos (Osler W. 1892. The Principles and practice of medicine. D.
Appelton and Company. New York. Pág. 712-714). La
hipertrofia miocárdica se asocia normalmente con anormalidades del
sistema vascular coronario y pérdida eventual de función ventricular
(Tomanek y Hovanec, 1981 J Mol Cell Cardiol.
13:471-488; Friberg, 1988 Cardiovasc Res.
22:329-339). Sin embargo, la hipertrofia cardiaca
inducida con hormona tiroide es única ya que se da frecuentemente
una mejor función ventricular y una proliferación del sistema
microvascular (Tomanek et al., 1998 Circ Res.
82:587-593). Se hipotetizó que el crecimiento del
tejido cardiaco en este modelo de hipertrofia miocárdica podía estar
mediado por el endotelio vascular y podría suprimirse con el uso de
inhibidores de la angiogénesis. Las implicaciones tal descubrimiento
se refieren al papel del endotelio vascular como regulador de la
masa y función cardiaca normal.
Los estudios con animales se realizaron en el
Hospital Infantil de Boston de acuerdo con pautas institucionales.
Se compraron ratones C57BL1/6 con 6 semanas de edad y se aclimataron
durante una semana antes de la experimentación (Jackson
Laboratories, Bar Harbor, ME). Los ratones se enjaularon de forma
colectiva y tenían acceso libre a agua y pienso convencional. Los
animales se anestesiaron con metoxifluorano inhalado antes de
realizar procedimientos que causan malestar o dolor y se observaron
hasta que despertaban completamente. El pelo se afeitó para
facilitar la inyección. Los ratones se trataron con tironina (0,2
mg/kg/día, i.p.) durante 12 días para inducir hipertrofia cardiaca.
Además, los ratones recibieron simultáneamente inyecciones s.c. de
solución salina o TNP-470 a 10 mg/kg o 20 mg/kg en
días alternos (n=3/grupo). Los resultados se compararon con los
controles tratados solo con solución salina (sin tironina). Los
animales se pesaron al final del estudio y se sacrificaron por
dislocación cervical. Los corazones se retiraron inmediatamente y se
introdujeron en solución tampón caliente mientras todavía latía para
vaciar el órgano de la sangre restante. Los ventrículos se
diseccionaron para limpiar los grandes vasos, atria y el tejido
conectivo y se abrieron las cámaras. Los tejidos se secaron y se
pesaron. Los pesos ventriculares se normalizaron con el peso
corporal y se presentan como porcentaje del peso corporal.
El tratamiento con tironina tuvo como resultado
una hipertrofia cardiaca, aumentando el peso ventricular de 0,38% a
0,58% de peso corporal. Este efecto se suavizó con
TNP-470 de forma dependiente de la dosis (Figura 7).
Con una dosis de TNP-470 de 20 mg/kg, el peso
ventricular alcanzado con tratamiento con tironina fue
significativamente menos que con los controles, en 0,51% de peso
corporal (p<0,05). Además, estas cifras pueden subestimar los
efectos de TNP-470, ya que hubo una pérdida de peso
de 1-2 g en los ratones que recibían
TNP-470 durante el estudio de 12 días. La reducción
en peso se tiene como resultado de una reducción en la masa del
tejido adiposo. Sin embargo, se espera que el tamaño cardiaco de los
animales tratados sea apropiado para su mayor peso de partida. Se
están realizando estudios para verificar esto. Las dosis ensayadas
hasta el momento son 2/3 menores de las usadas típicamente para
tratar cáncer en ratones. Se espera obtener una mayor reducción en
la hipertrofia con mayores dosis.
Los ratones Apc^{Min} sirven como modelo
de pólipos intestinales adenomatosos. Min (neoplasia intestinal
múltiple) es una mutación inducida con etilnitrosourea en el gen Apc
murina (coli poliposis adenomatosa) (Moser et al., 1990). Es
similar a las mutaciones en la línea germinal en el gen Apc de seres
humanos con poliposis adenomatosa familiar o Síndrome de Gardner
(Joslyn et al., 1991 Cell. 66:601-613).
Estas son afecciones heredadas caracterizadas por pólipos
intestinales que eventualmente se transforman en cáncer. APC es
además el gen mutado más frecuentemente en cáncer de colon en seres
humanos (Nishisho et al., 1991. Science.
253:665-668).
Los ratones heterocigóticos C57B1&6J
Min/+ desarrollan espontáneamente 30-60
adenomas en el intestino durante el transcurso de su vida (Moser
et al., 1990. Science. 247:322-324). Los
pólipos continúan creciendo en tamaño, llevando finalmente a la
muerte de los animales aproximadamente a los 120 días de edad.
Se hipotetizó que el crecimiento de estas
lesiones pre-neoplásicas dependía del endotelio
vascular y que podría suprimirse con el uso de inhibidores de la
angiogénesis.
Los estudios con animales se realizaron en el
Hospital Infantil de Boston de acuerdo con pautas institucionales.
Se compraron ratones macho Min/+ (C57BL/6J) con 6 semanas de
edad y se aclimataron durante una semana antes de la experimentación
(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Los ratones se enjaularon de
forma colectiva y tenían acceso libre a agua y pienso convencional.
Los animales se anestesiaron con metoxifluorano inhalado
(Pitman-Moore, Inc., Mundelein, IL) antes de
realizar procedimientos que causan malestar o dolor y se observaron
hasta que despertaban completamente. El pelo se afeitó para
facilitar la inyección.
El TNP-470 se almacenó en seco a
40ºC. Las soluciones se prepararon en solución salina normal y se
administraron subcutáneamente en sitios rotativos en el dorso. Los
ratones se trataron con 10 mg/kg de TNP-470 en días
alternos durante 1 o 3 semanas (n=3/grupo). Un grupo de control
recibió 0,1 ml de solución salina en días alternos (n=3).
El pienso se retiró durante 12 horas antes de la
finalización de cada estudio para limpiar el tracto
gastrointestinal. Los animales se sacrificaron por inhalación
continua de CO_{2}. Se retiró todo el tracto gastrointestinal y se
limpió con solución salina con tampón fosfato. El intestino se abrió
longitudinalmente y se examinó la superficie luminal para observar
el número, tamaño y localización de los pólipos usando un
microscopio de disección (magnificación 18X). Las muestras de
tejidos se fijaron en tampón de formalina y se introdujeron en
parafina. Las secciones se marcaron con H&E para la evaluación
histológica.
El número y tamaño de pólipos intestinales se
redujo significativamente en ratones Min/+ tratados con un
inhibidor de la angiogénesis. Después de 3 semanas de tratamiento,
los ratones de control tenían 23 \pm 1,5 pólipos, mientras que los
ratones tratados con TNP-470 tenían 8 \pm 1,7
pólipos (Figura 8A). Esta es una reducción del 66% (p<0,05). El
diámetro de los pólipos en los ratones de control tenía una media de
1,90 \pm 0,86 mm (intervalo de 0,7 a 0,425 mm) (Figura 8B). Por el
contrario, el diámetro de los pólipos en los ratones tratados tenía
una media de 1,02 \pm 0,40 mm (intervalo de 0,05 - 0,175 mm).
El examen histológico de pólipos en los ratones
de control demostró una alta displasia celular y numerosos vasos
cavernosos. Las lesiones eran polipoides, extendiéndose desde la
mucosa al lumen y ocasionalmente hacia fuera a través de la
superficie visceral. Por el contrario, los pólipos en ratones
tratados tenían una similitud morfológica con la mucosa circundante,
con menos células displásicas y menor cantidad de vasos y más
pequeños.
La existencia, crecimiento y posible
transformación de pólipos adenomatosos intestinales depende de la
angiogénesis y está regulada por el endotelio vascular.
Hasta un 50% de mujeres en periodo de
menstruación pueden sufrir endometriosis (Williams y Pratt, 1977 Am
J Obstet Gynecol. 129-245). La endometriosis en
seres humanos puede imitarse quirúrgicamente en un modelo en
roedores (Cummings y Metcalf, 1996, PSEBM. 212:332). Se realizaron
estudios para demostrar si el crecimiento de estos implantes de
tejido depende del endotelio vascular y podría suprimirse con el uso
de inhibidores de la angiogénesis.
Los estudios con animales se realizaron en el
Hospital Infantil de Boston de acuerdo con pautas institucionales.
Se compraron ratones hembra (B6C3F1) con 8 semanas de edad y se
aclimataron durante una semana antes de la experimentación (Jackson
Laboratories, Bar Harbor, ME). Los ratones se enjaularon de forma
colectiva y tenían acceso libre a agua y pienso convencional. Los
animales se anestesiaron con metoxifluorano inhalado
(Pitman-Moore, Inc., Mundelein, IL) antes de
realizar procedimientos que causan malestar o dolor y se observaron
hasta que despertaban completamente. El pelo se afeitó para
facilitar la inyección.
El TNP-470 se almacenó en seco a
40ºC. Las soluciones se prepararon en solución salina normal y se
administraron subcutáneamente en sitios rotativos en el dorso. Los
ratones se trataron con 10 mg/kg de TNP-470 en días
alternos durante 3 semanas (n=4/grupo). Un grupo de control recibió
0,1 ml de solución salina en días alternos (n=3).
Usando técnica aséptica, los ratones se
anestesiaron y se les afeitó el pelo abdominal. Se realizó una
incisión midventral y se expuso la trompa uterina izquierda y se
ligó en ambos extremos. La trompa uterina se extirpó, se introdujo
en medio caliente (Ham's F12) y se abrió longitudinalmente. Se
cortaron trozos de tejido de 2 mm de diámetro usando un punzón para
biopsia dérmica. Los trozos de tejido se colocaron en el mesenterio
intestinal (4 trozos/animal). Los implantes se mantuvieron fijos con
una preparación de pegamento de fibrina. La incisión abdominal se
cerró y se permitió a los ratones recuperarse durante 48 horas.
Posteriormente, los ratones se dividieron en dos grupos de 4 ratones
cada uno. El grupo de control se trató con solución salina. El grupo
de tratamiento recibió TNP-470 (10 mg/kg, días
alternos). Los animales se sacrificaron por inhalación continua de
CO_{2} tres semanas después de la cirugía. La cavidad peritoneal
se examinó para detectar tejido de endometrio. El tejido se recontó
y se midieron los diámetros en las dimensiones x e y usando calibres
y se calculó la media.
El tamaño del tejido endometrial se redujo en
ratones tratados con un inhibidor de la angiogénesis. Después de 3
semanas de tratamiento, el tejido endometrial de los ratones de
control medía 2,9 \pm 0,4 mm, mientras que en los ratones tratados
con TNP-470 el tejido endometrial medía 1,9 \pm
0,5 mm, como se muestra en la Figura 9. El número de implantes de
tejido era similar entre los dos grupos.
Los datos indican que el crecimiento del tejido
endometrial implantado en la cavidad abdominal se suprime con los
inhibidores de la angiogénesis. La dosis de TNP-470
usada en este estudio piloto es 1/3 de la dosis establecida para
tumores.
Claims (13)
1. El uso de un inhibidor de la angiogénesis en
la preparación de un medicamento para regular el tamaño y/o
crecimiento del tejido adiposo, cardiaco, renal, intestinal y
reproductor normal vascularizado en un ser humano o un animal.
2. El uso de la reivindicación 1 en el que el
inhibidor es un inhibidor de la colagenasa.
3. El uso de la reivindicación 1 en el que el
inhibidor se selecciona entre el grupo compuesto por
TNP-470, angiostatina, endostatina y talidomida.
4. El uso de la reivindicación 1 en el que el
tejido normal vascularizado es tejido adiposo.
5. El uso de la reivindicación 4 en el que el
animal o ser humano tiene un defecto genético que tiene como
resultado obesidad.
6. El uso de la reivindicación 4 en el que el
inhibidor suprime el apetito.
7. El uso de la reivindicación 6 en el que el
inhibidor es TNP-470 usado en una cantidad eficaz
para suprimir el apetito.
8. El uso de la reivindicación 7 en el que el
TNP-470 se usa en una cantidad eficaz para reducir
el suministro vascular al tejido adiposo.
9. El uso de la reivindicación 1 en el que el
tejido se selecciona entre el grupo compuesto por tejido cardiaco,
renal, intestinal y reproductor.
10. El uso de la reivindicación 9 en el que el
animal o ser humano tiene poliposis.
11. El uso de la reivindicación 9 en el que el
animal o ser humano tiene endometriosis.
12. El uso de la reivindicación 9 en el que el
animal o ser humano tiene una próstata hipertrofiada.
13. El uso de la reivindicación 9 en el que el
animal o ser humano tiene hipertrofia cardiaca o renal.
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