DK175711B1 - Anvendelse af glutamin til fremstilling af et lægemiddel til behandling af atrofi - Google Patents

Description

DK 175711 B1 I

Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af glutamin eller en funktionel analog I

deraf, som bibeholder glutamins egenskaber ved fremstilling af et middel til behandling

af eller forebyggelse mod vævsskade hos et dyr, der lider af atrofi fremkaldt af kata- I

bolsk dysfunktion. I

Det er kendt fra litteraturen, at visse katabolske dysfunktioner efter kirurgi, peptiske ul- I

I cerationer og gastriske læsioner kan lindres ved indgivelse af glutaminholdige sam- I

mensætninger, som beskrevet i følgende dokumenter: I

10 - NUTRITION REPORTS INTERNATIONAL, bind 23, nr. 4,1981, side 749-753, I

J. OF PARENTERAL AND ENTERAL NUTRITION, bind 9, nr. 5, 1985, side I

1583-589, I

US-A-2 868 693, I

AKT. ERNÅHR, bind 9,1984, side 147-149, I

15 - HOPPE-SEYLER'SZ. PHYSIOL. CHEM., bind 364, 1983, side 1253, I

JAP. J. PHARMACOLOGY, bind 24, nr. 1,1974, side 169-171. I

Imidlertid beskriver ingen af disse dokumenter, at en atrofi, der kan fremkomme efter I

katabolsk dysfunktion, kan behandles ved indgivelse af glutamin eller glutaminanalo- I

20 ger. I

Glutamin er en ikke-essentiel aminosyre, der kan syntetiseres af de fleste væv. I modsætning til de fleste aminosyrer har glutamin to amingrupper: en α-aminogruppe og en amidgruppe.

Det er tilstedeværelsen af amidgruppen, der gør det muligt for 25 glutamin at fjerne ammoniak fra de perifere legemsvæv og transportere nitrogen til indre organer. Det er endvidere almindeligt for vævene at fjerne glutamin fra kredsløbet for at udnytte carbonskelettet til energi.

Glutaminase og glutaminsyntetase er to hovedenzymer, der er 3q involveret i reguleringen af giutaminmetabolisme. Glutaminase katalyserer hydrolysen af glutami-n til glutamat og ammoniak, mens glutaminsyntetase katalyserer syntesen af glutamin ud fra glutamat og ammoniak. Skønt de fleste væv har begge disse en- I DK 175711 B1

Η I

zymer er den ene sædvanligvis mere aktiv end den anden i af- I

hængighed af hvilke væv, der er tale om. I

Syntese og bortføring af glutamin sker primært i skeletmusku- I

laturen og i hjernen. Glutamin forbruges igen af sådanne under I

5 formering værende celler, som fibroblaster, lymfocytter, tu- I

morceller og tarmepitelceller. Disse celler har karakteristisk I

H høje koncentrationer af glutaminaseaktivitet og lave koncen- I

trationer af intracel lulær glutamin. De,tte kan også være k 1 i -Η n i sk betydn ingsfuldt for patienter med store sår, betændelse H 10 forbundet med infektion eller en gastrointestinal dysfunktion H som udelukker normal enteral fødeindtagelse, da den ønskelige hurtige formering af celler, for disse celletyper, under så- danne betingelser kan afhænge af tilgængeligheden af tilstræk- kelige koncentrationer af glutamin.

15 Η I mave- og tarmkanalen anvendes glutamin som et respirations- brændstof. Den enterale indgift af glutamin giver en forøget optagelse af luminal glutamin af tarmslimhinden ledsaget af samtidig nedsættelse af g 1 utam i noptage 1 se fra kredsløbet. Så- ledes afbalanceres tarmens giutaminforbrug mellem disse to 20 glutaminkilder.

Det meste af glutaminoptagelsen af mave- og tarmkanalen fore- går gennem de epitelceller, der beklæder tyndtarmens trævler.

Glutaminmetabolismen, der foregår i tyndtarmen, giver en ' 25 hovedenergikilde for tarmen og giver forstadieforb inde1 ser til I urinstofdannelse (ureagenese) og giuconeogenese i leveren ved I bearbejdning af nitrogen og carbon fra andre væv.

I Vidnesbyrd om glutamins essentielle rolle i opretholdelsen af 30 normal tarmstruktur og tarmfunktion blev antydet ved en under- I søgelse af Baskerville et al., British Journal of Experimental I Pathology, 61: 132 (1980). Oisse forfattere sænkede koncentra- tionen af plasmaglutamin til upåviselige koncentrationer ved I infusion af renset glutaminase til rhesusaber, egernaber, ka- I gg niner og mus. Som et resultat af denne behandling udviste dis- se dyr opkastning, diarré, vi 11usatrofi, s 1 imhindeu1cerat ioner og tarmnekrose.

I Martin et al. (US. patentskrift nr. 2.283.817) beskriver et I præparat, der indeholder glutamin, som anvendes som et afgift-

DK 175711 B1 I

ningsmiddel snarere end som et kosttilskud. Ifølge patent- I

skriftet kombineres glutamin synergistisk med andre aminosyrer I

for at virke direkte på et toxin for at inhibere enhver skade- I

lig virkning. I

5 I Shive et al. (US patentskrift nr. 2.868.693) beskrives glu- I

taminholdige præparater til behandling af peptiske ulceratio- I

Endvidere blev tegn på glutamins potentielle beskyttende virk- I

10 ning vist af Okabe et al., Digestive Disease, 20:66 (1975), I

som fandt at glutamin kunne beskytte mod acetylsalicylsyre - I

fremkalde gastriske ulcerationer hos mennesker.

Dette behov for glutamin hos de indre organer kan være endnu jg'større under kritisk sygdom, når det er kendt at glutaminmeta-bolismen i tyndtarmen forøges (Souba et al., Surgery, 94(2): 1342 (1983)).

For tiden opfyldes de ernæringsmæssige behov hos patienter, der ikke er i stand til selv at indtage føde, på passende måde ved indgift af enteral eller parenteral kost. Enteral kost indgives sædvanligvis under anvendelse af en slange eller et rør med en lille indre diameter, hvilken slange eller rør føres gennem næsen ind i maveområdet eller tolvfingertarmens område eller ved kirurgisk implantation, som f.eks. ved gastro-25

stomi eller jejunostomi. De enterale formuleringer, der for tiden er til rådighed, kan deles i fire grundkatagorier: elementære, polymere, modulerede og ændrede aminosyrer. Disse formuleringer indeholder glutamin. Koncentrationen af næringsmidler, der er til stede i den enterale kost, er imidlertid 3 O

baseret på et normalt individs kostbehov og ikke behovet hos en patient, der lider af en katabolisk sygdom.

Elementære formu1 er i nger kræver minimal fordøjelsesvirkning og er sammensat hovedsageligt af små peptider og/eller amino-35 syrer, glucose, oligosaccharider · og vegetabilsk olie eller triglycerider med middelkædelængde.

I polymere formuleringer anvendes komplekse næringsstoffer som f.eks. sojaprotein, lactalbumin eller kasein som en protein- I DK 175711 B1

i I

kilde; må 1todextriner eller majssirupfaststoffer som en kilde I

for carbohydrater; og vegetabilske olier eller mælkefedt som I

en kilde for fedtstof. I

Modulerede kostformuleringer kan fremstilles ved at kombinere I

H 5 protein, carbohydrat eller fedtstof med en monomer eller poly- mer formel for at opfylde specielle ernæringsmæssige behov.

Formuleringer, der er sammensat af ændrede am inosyresammensæt- ninger anvendes hovedsageligt til patienter med genetiske fejl 10 i nitrogenmetabolismen eller erhvervede nitrogenakkumulerings- H sygdomme, idet formålet her er at begrænse patientens indta- gelse af visse aminosyrer, der kan være skadelige.

Parenterale kostformuleringer indgives sædvanligvis intrave- nøst. Disse intravenøse væsker er sterile opløsninger sammen-15 j sat af simple kemiske stoffer, som f.eks. sukkerarter, amino- j syrer og elektrolytter, som let kan assimileres..

I Betegnelsen "total parental ernæring" (TPN) anvendes til at beskrive formuleringer til anvendelse til patienter, der får.

H 2 0 hele deres kostbehov intravenøst. Formuleringer til total pa- rental ernæring indeholder i modsætning til enterale formule- ringer normalt ikke glutamin. Den manglende tilstedeværelse af glutamin i parenterale formu 1 er i nger skyldes delvis problemer- ne med hensyn til dets ustabilitet ved stuetemperatur og den ^5 resulterende dannelse af ammoniak og pyrog1 utam i nsyre. Der har også været betænkelighed ved dannelsen ved glutaminsyre ud fra I glutamin på grund af giutaminsyres potentielle giftighed som en neurotransmitter. I virkeligheden synes disse problemer ik- I ke at være retfærdiggjort. Ved en pH-værdi netop under neutra- 30 litet nedbrydes glutamin meget langsomt (Souba, S.C.D. Thesis I in Harvard Medical School Library, Juni 1984).

I Total parenteral ernæring giver vi 1 lusatrofi, et fænomen der I almindeligvis er reversibelt, når oral fødeindtagelse genop- I 35 tages. Da TPN-formu1 eringer mangler glutamin, må legemets be- I hov for denne aminosyre tilfredsstilles ved hjælp af syntese- vejene i legemsvævene.

DK 175711 B1 I

5 I

Hos patienter med kritiske sygdomme er nettoproteinkataboli s- I

me forbundet med en udtalt formindskelse af musklernes gluta- I

miniagre (Askanazi et al.. Annals of Surgery, 192: 78 (1980); I

Askanazi et al., Annals of Surgery, 191: 465 (1980)),' nedsatte I

5 plasmakoncentrationer af glutamin (Askan2i et al.. Annals of I

Surgery, 192: 78 (1980; Askanazi et al., Annals of Surgery, I

191: 465 (1980)), og en formodet stigning i tarmens glutamin- I

udnyttelse (Souba et al.. Archives of Surgery 120: 66 (1985); I

Souba et al., Surgery, 94(2); 342 (1983)). Giucokortikoider er I

10 kendt for at forøge tyndtarmens giutaminforbrug (Souba et al . , I

Surgical Forum, 34; 74 (1983)). I

I Ingen af de tidligere beskrevne undersøgelser har vist, at atrofi i skeletmuskulatur I

1 og/eller tarmens slimhinde, hvor atrofien er forårsaget af katabolsk dysfunktion, der fo- I

15 rekommer under total parenteral ernæring, kan forhindres ved indgivelse af høje gluta- I

minkoncentrationer. I

I forbindelse med den foreliggende opfindelse er der til et I

dyr, der har eller som har risiko for at have en katabolisk I

20 dysfunktion, givet en terapeutisk effektiv mængde glutamin. I

Oenne glutaminmængde er større end den man normalt møder i I

sunde individers kost. Dette forøgede g 1 utam inniveau er nød- I

vendigt for at kompensere for det større behov for glutamin, der forekommer under visse kataboliske dysfunktioner, i fra-25 værelse af exogent glutamin under disse kataboliske dysfunk tioner, ville glutamin blive udvundet ved nedbrydning af muskelvæv. Faldet i glutaminkoncentrationer i plasmaet til trods for accelereret glutaminfrigivelse fra muskler under kataboliske dysfunktioner indikerer systemisk glutaminmangel. Til 30 trods for accelereret giutaminfri g i ve 1 se fra musklerne over skrider tarmsiimhindecellernes behov tilførslen. Dette prædisponerer igen til tarmvi 11usatrofi.

Den foreliggende opfindelse angår således anvendelsen af glutamin eller en funktionel 3 5 analog deraf, som bibeholder glutamins egenskaber ved fremstilling af et middel til behandling af atrofi i skeletmuskulatur og/eller i tarmens slimhinde, hvilken atrofi er forårsaget af katabolsk dysfunktion.

Ι· DK 175711 B1

Tilvejebringelse af exogen glutamin til en under stress værende patient kan på bedre måde understøtte tyndtarmens metaboliske behov og muligvis nedsætte graden af systemisk proteinkatabolisme.

5

Fig. 1 viser en kurve over nitrogenbalancen som funktion af ni trogen indtage 1 se.

Fig. 2 er en grafisk præsentation af resultater fremkommet i 10 eksempel 5 til sammenligning af den samlede koncentration af aminosyrer med forgrenet kæde (BCAA) i arterieblod med indgivelseshastigheden for BCAA. Resultaterne repræsenterer middelværdi ± SEM. Resultater fra dyr, der modtager saltvand, er ikke indbefattet.

Fig. 3 er en grafisk præsentation af resultater frembragt i eksempel 5 med sammenligning af forholdet mellem BCAA-strøm (bagparti) og BCAA-infusion.

Fig. 4 er en grafisk præsentation af resultater frembragt i 20 ; eksempel 5 sammenlignende BCAA-strøm (bagparti) δ timer efter operation samt stigningen i koncentrationen af BCAA-arter ie-blodkoncentration.

Fig. 5 er en grafisk præsentation af resultater frembragt i 25 eksempel 5 sammenlignende nitrogenstrøm (bagparti) og BCAA- strøm (bagparti) seks (6) timer efter operation.

Fig. 6 er en grafisk præsentation af resultater tilvejebragt i eksempel 5 sammenlignende nitrogen-strøm (bagparti) 6 timer efter operation og forandringen i musklernes i ntrace 11ulære aminosyren i trogen målt 24 timer efter operation.

Fig. 7 er en grafisk præsentation af virkningen af en oral kost på plasmanitrogenniveauer efter subtotal resektion af tyndtarmen.

35

DK 175711 B1 I

Fig. 8 er en grafisk præsentation af resultater, der viser I

virkningen af oral kost på vægten af distal ileum efter subto-

tal tyndtarmsresektion. I

5 Fig. 9 er en grafisk afbildning af resultater, der viser virk-

ningen af oral kost på muske1 tykke 1 sen i det distale ileum I

efter subtotal resektion af tyndtarmen. I

Fig. 10 er en grafisk afbildning af resultater, der viser I

virkningen af oral kost på slimhindetykkelsen i det distale I

ileum efter subtotal resektion af tyndtarmen. I

Fig. 11 er en grafisk præsentation af virkningen af oral kost I

på villushøjden i det distale ileum efter subtotal resektion I

af tyndtarmen. I

Der er med den foreliggende opfindelse anvist en ny metode til I

behandlingen af kataboliske dysfunktioner. Den foreliggende I

opfindelse angår anvende Ise af glutam in eller funktionelle I

analoge deraf til fremstilling af et lægdemiddel til behand- I

2Q ling af kataboliske forstyrrelser ved indgivelse til et dyr, I

der er angrebet af eller har sandsynlighed for at udvikle ka- I

taboliske dysfunktioner. Ved behandlingen indgives en terapeutisk effektiv mængde af glutamin eller en funktionel analog deraf, hvilken effektive mængde er større end den, der er til 25 stede i normal kost. Den normale kostindtagelse for mennesker er ca. 2 til 4 g/dag.

En katabolisk dysfunktion er en tilstand, der fremkalder en katabolisk biokemisk vej, ad hvilken der sker nedbrydning af en anatomisk struktur. Indgivelse med kosten af glutamin ses 30 at tilfredsstille disse kataboliske tilstandes biokemiske behov således, at det ikke er nødvendigt for legemet at syntetisere glutamin eller at opnå glutamin ved nedbrydning af skeletmuskulaturen.

gen foreliggende opfindelse er tænkt anvendt i forbindelse med alle kataboliske dys funkti oner, hvor der er et forøget behov for glutamin. Disse kataboliske dysfunktioner kan være enten enterale eller parenterale. F.eks. er atrofi i tyndtarmens I DK 175711 B1

Η I

trævler (villi), der forekommer, når der indgives TPN-kost, en I

enteral katabolisk dysfunktion. Atrofi i tarmtrævlerne fore- I

kommer sædvanligvis ikke på grund af den direkte kataboliske I

aktivitet på enterocytterne, men skyldes snarere mangel af I

5 glutamin i kosten hos patienter på en parenteral kost. I

Parenterale kataboliske dysfunktioner, der udviser forøget be- I

H hov for glutamin, forekommer under eller efter kirurgiske ind- I

H greb, sepsis, brændsårslæsioner, anoreksi og ukontrolleret di- I

I 20 abetes. I

H Dyr, hvori anvendelsen ifølge opfindelsen er effektiv, er dem I

der almindeligt klassificeres som pattedyr, indbefattet menne- I

sker. I

l5 Betegnelsen "enteral" skal her angive den del af fordøjelses- I

H kanalen, der ligger mellem maven og anus. I

Betegnelsen "parenteral" angiver området uden for fordøjelses- I

kanalen. I

H 20 I

Betegnelsen "i det væsentlige forbundet med" anvendt i forbin- I

delse .med kataboliske dysfunktioner for hvilke den omhandlede I

metode er effektiv menes sådanne, hvori det biokemiske behov I

for glutamin fremkommer under eller efter de kataboliske dys- I

funktioner, og er forbundet dermed. I

25 I

H Indgivelsen af glutamin kan være ad både enteral og parenteral I

I vej. I

Et eksempel på, hvorledes enteral indgift af glutamin gennem- I

I 30 føres, er ved anvendelse af et rør eller en slange med lille I

I boring anbragt gennem næsen og ført ned i maven eller tolvfin- I

I gertarmsområdet eller ved kirurgisk implantation som f.eks. I

I ved gastrostomi eller jejunostomi. I

Eksempler på parenterale indgiftsveje indbefatter men er ikke I

I begrænset til sådanne veje som subkutan, intramuskulær eller I

I intravenøs injektion, nasopharyngeal eller mucosal absorption I

I eller transdermal absorption. I det fleste tilfælde indgives I

DK 175711 B1 I

glutaminen intravenøst. Ved intravenøs indgift, indgives den I

s terapeutisk effektive glutaminmængde i en flydende form fra et I

reservoir direkte ved placering af en nål i en stor vene hos I

patienten, hvor nålen er forbundet med reservoiret ved hjælp I

5 af slanger. I

Uanset hvilken indgiftsvej, der anvendes, kan glutaminen ind- I

gives enten alene eller som et kostsupplement. Når den anven- I

des som et kostsupplement, kan glutaminen blandes med en eksi- I

2g sterende enteral eller parenteral kost, før den indgives til I

patienten. Det er også muligt at indgive glutaminen uden at I

blande den direkte med andre bestanddele af en kost, som I

f.eks. ved intravenøs fodring, hvor glutaminen ikke sættes I

direkte til den intravenøse hovedflaske, men i stedet sættes I

til et fælles reservoir under anvendelse af en flaske, der I

"ridder på ryggen af hovedreservoi ret" (eng.: "piggyback" I

bottle). I

I Funktionelle analoger, derivater, substitutionsprodukter, i so- I

merer eller homologe af glutamin, som bibeholder glutamins I

20 I

egenskaber, betragtes som ækvivalenter. Foretrukne er sådanne I

analoger, der er i stand til at give en amingruppe, og som kan I

metaboli seres ved Krebs-cyklusen. Mest foretrukne er forbin- : I

delser, der har aminosyreresten ved den ene ende af en car- I

bonkæde og en amindel ved den anden ende af carbonkæden. I

25 I

De terapeutisk effektive dosisgrænser for indgivelsen af glu- I

tamin er sådanne, der er store nok til at forhindre katabolis- I

men eller atrofi af kroppens væv for at opretholde metabolisk homøostase. Ved en enteral kost vil glutamin blive indgivet i 30 en hastighed, der er større end eller lig med 0,3 g pr. kg legemsvægt pr dag. Sådanne indgiftshastigheder kunne være 0,3 til 2,0 g pr. kg legemsvægt pr. dag, fortrinsvis 0,3 til 1,5 g pr. kg legemsvægt pr. dag og mere foretrukket 0,4 til 1,0 g pr. kg legemsvægt pr. dag. Indgiftshastigheden for glutamin, 35 når den indgives intravenøst, vil være større end eller lig med 0,1 g pr. kg legemsvægt pr. dag. Sådanne indgiftshastig- j heder kunne være 0,2 til 3,0 g pr. kg legemsvægt pr. dag, fortrinsvis 0,3 til 2,5 g pr. kg legemsvægt pr. dag, mere foretrukket 0,4 til 2,0 g pr. kg legemsvægt pr. dag.

DK 175711 B1

H

M Ved anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse H kan glutamin indgives ved, at man simpelthen modificerer eksi- H sterende kost- eller foderformu1 er i nger således, at de kommer til at indeholde den rigtige glutaminkoncentration. Det fore- 5 trækkes mest, at glutaminen forbliver i en tør form, som H f.eks. et sterilt frysetørret pulver som hydratiseres aseptisk på det tidspunkt, hvor det skal indgives og blandes til den korrekte koncentration med andre bestanddele i kost- eller fo-dermaterialet. Alternativt kan glutamin blandes i forvejen med 10 de øvrige bestanddele af den tørre formulering, som aseptisk genhydrat i seres på indgiftstidspunktet eller opbevares som et frossent koncentrat, som optøés og blandes i den rigtige kon-H centration på anvendelsestidspunktet.

Anvendelsen af glutamin ifølge opfindelsen er velegnet til fremstilling af sammensætninger. Oisse sammensætninger eller præparater kan omfatte glutamin alene eller i kombination med andre kemiske stoffer. Disse andre kemiske stoffer kan være farmaceutisk acceptable bærere såvel som kostens andre aktive 20 stoffer, som f.eks. frie aminosyrer, proteinhydrolysater eller olier.

Præparatertil parentera 1 i ndgi ft indbefatter sterile vandige eller ikke-vandige opløsninger, suspensioner og emulsioner.

Bærere eller tillukkende dressinger eller bandager kan anven- 25 des til at forøge hudpermeabi1 i teten og forøge absorption.

Ved anvendelsen ifølge opfindelsen fremstilles et lægemiddel I eller et farmaceutisk præparat, der omfatter de omhandlede bestanddele, hvilket lægemiddel anvendes til inhibering af ka- 30 taboliske dysfunktioner.

Opfindelsen angår også glutaminrige præparater eller foderblandinger til at forhindre eller lindre kataboliske dysfunktioner. Glutaminrige materialer eller fodere indeholder gluta- 35 min i koncentrationer, der er terapeutisk effektive, og som er større end det, der er til stede i normal kost eller normalt foder.

DK 175711 B1 I

11 I

Beholdere, der indeholder materialet ifølge opfindelsen, kan I

anvendes til at lette indgivelsen af glutamin ved den ifølge I

I opfindelsen anviste metode. Disse beholdere er udformet til at I

indeholde f.eks. den daglige dosis af glutamin, der skal ind- I

5 gives til patienten. I

Beholdere tilpasset til intravenøs indgift af glutamin alene I

eller i kombination med andre aminosyrer er særligt nyttige. I

Sådanne beholder kan omfatte et reservoir for det flydende I

glutam inholdige præparat og et væskeførende organ, der er i I

stand til at kunne fastgøres til en nål. I

Det væskeførende organ kan være et hvilket som helst organ, I

der er i stand til at føre det flydende præparat i reservoiret I

til nålen, som f.eks. en plastslange. I

Den nål, der fastgøres til det væskeførende organ, kan enten I

indsættes direkte i et blodkar hos den humane recipient eller I

den kan indsættes i et reservoir for at gøre det muligt, at I

der sker blanding med en anden opløsning, før det indgives til I

20 patienten. I

Det ovenfor anførte beskriver generelt den foreliggende opfin- I

delse. En mere fuldstændig forståelse kan opnås ved henvisning I

til de følgende specifikke eksempler, der gives her kun til 25 illustration og ikke er tænkt som nogen begrænsning med mindre andet er specificeret.

Eksempel 1

Dvrepleie og operative procedurer.

22 hunde af blandet race med en vægt på mellem 20 og 40 kg opnåedes fra en gård, hvor de havde fået regelmæssig motion og var sorteringsundersøgt for parasitter. Alle hundyr var ikke-gravide. Mens dyrene blev holdt i hundehus, blev de passet i 25 overensstemmelse roed retningslinierne ifølge The Committee on Animals at Harvard Medical School and the Committee on Care and Use of Laboratory Animals of the Institute for Laboratory Animal Resources, the National Research Council (DHEW Publika- H DK 175711 B1 Η H tion nr. NIH 78-23, revideret 1978). Dyrene holdtes i indivi- H duel le hundehuse ved en konstant temperatur på 20°C udsat for lys i 24 timer. De fik motion i 2 timer hver morgen, var for-H synet med vand ad libitum og fik givet en enkelt daglig fod- 5 ring mellem kl. 13,00 og 15,00 af Agway Respond 2000 Dry Dog Chow® (indeholdende mindst 25% protein, 10% fedt og de reste-I rende kalorier i form af carbohydrat). Dyrene fik 5 til 7 dage til at akklimatisere sig til hundehusets betingelser, i løbet af hvilket tidsrum de blev tranet til at hvile roligt i en 10 Pavlov-forsøgsopsti 11 ing. På dagen før, der blev udtaget grundprøver, blev alt foder fjernet fra hundehuset kl. 17,00. Efter faste natten over blev hunden bragt til at gå i mindst 20 minutter, og den blev anbragt i en Pavlov-forsøgsopsti11ing H og der indførtes en kanyle i en forbensvene. Efter at hunden Η 15 havde hvilet i forsøgopstillingen i mindst 20 minutter blev H der udtaget en veneblodprøve til aminosyrebestemmelse. Efter H hurtig induktion af anæsti med intravenøs natriumthiopental H (Abbott Laboratories, 5 mg/kg legemsvægt) blev der foretaget biopsi af vastus lateralis musklen, ved den metode der er an- 20 vist af Bergstrøm et al., Journal of Applied Physiology, 36: 693-697 (1974). Oyret blev derefter taget ud af forsøgsopstil- lingen og en 5 ml prøve af arterieblod blev udtaget fra lårar- terien ved perkutan punktur.

I 25 Dyret fik lov til at restituere sig fra biopsi en i mindst 2 I i dage, før der blev foretaget en operativ standardprocedure. På j dagen før, der blev foretaget kirurgi, blev alt foder igen I fjernet fra hundehuset kl. 17,00. Kl. 7,00 gik hunden tur i 20 minutter, og derefter blev den taget ind til operationsstuen, I 30 hvor den bedøvedes med intravenøs natriumpentabarbital (Abbott

Laboratories, 30 mg/kg legemsvægt). Der indførtes en endotra- cheal slange, og dyret fik lov til spontant at indånde en blanding af oxygen og stueluft. Hunden blev anbragt på et operationsbord i rygleje, og en kanyle blev placeret ved perku- 35 tan punktur ind i den ydre halsvene og rettet ind i det øvre vena cava. Efter notering af starttidspunktet blev der indgivet infusionsopløsning gennem denne kanyle med konstant infusion (IMED punp®, San Diego, Californien, USA) ved 4 ml/time/

DK 175711 B1 I

kg. Penicillin G (E. R. Squibb, Princeton, New Jersey, USA; I

600 mg) og Keflin® (Eli Lilly, Indianapolis, Indiana, USA; 1 I

g) blev indgivet intravenøst. Oer indførtes kateter i urinblæ- I

ren, den første urinprøve blev kastet bort, og kateteret blev I

5 forbundet til en lukket urinpose til opsamling i 24 timer. I

Hundens bug og sider blev barberet, og huden blev vasket med I

sæbe og vand og præpareret med en povidone jod præparatoplos- I

ning (Clinpad Corporation, Guilford, CT, USA). Hunden blev I

draperet med sterile lagener, og bughulen blev åbnet ved et 10 lodret infraumbilicalt indsnit hos hunner og et højre parame-dialt indsnit hos hanner. Tarmen blev trukket tilbage til den øvre bug, og der blev foretaget incision i det frilagte retro-peritonium. Den højre dybe omkringbøjede bækkenarterie- og vene og den mediale sakrale arterie isoleredes ved præcis og 15 hurtig dissektion. Et specielt fremstillet kateter bestående af et segment på 6 cm po1 yethy1ens1ange (ydre diameter 2,08 mm) belagt med si 1 iconep1 ast (eng.: silastic) og forbundet med et polyethylenkateter med en ydre diameter på 2,8 mm indførtes 6 cm kranialt i aorta gennem en højre dyb omkringbøjet bækken-20 arterie. Et tilsvarende kateter indførtes i den mellemste sa-cralarterie, idet dets spids blev placeret ca. 1 cm proximalt til aortas gaffeldeling, roen distalt til den nedre mesenteri- I alarterie. Et tredje kateter blev indført i det nedre vena ca va gennem den højre dybe omkringbøjede bækkenvene og placere-25 (jes distalt for renalvenen. Alle katetre blev fastgjort og ført ud gennem stiksår i flanken. Bugen blev derefter lukket, og dyret vendt over på dets venstre side. De ydre katetre blev skåret til passende længde, proppedes til med stumpe nåle forbundet med intermitterende injektionsporte (Jelco®, Critikon, 30 Inc., Tampa, FL), skylledes med saltvand, fyldtes med heparin (1.000 enheder/ml) og blev begravet subkutant. Injektionsportene var placeret højt på dyrenes flanker under huden i nær naboskab til hvirvelsøjlen. Dette gav mulighed for adgang til aorta og vena cava ved perkutan punktur af katetrenes injek-35 tionsporte. To yderligere doser af Keflin® (1 g) blev indgivet 8 og 24 timer efter operation gennem venekateteret.

Efter operationsproceduren blev dyret anbragt på dets side, og legemstemperaturen holdtes ved hjælp af varmelamper og tæpper.

H DK 175711 B1 H mens dyret kom sig fra bedøvelsen. Ca. 4 timer efter infusio- nens start blev dyret anbragt i en Pavlov-forsøgsopsti11ing, og der infunderedes en opløsning af para-aminohippursyre (PAH, 0,5¾ vægt/rumfang i saltvand) ved en hastighed på 0,76 ml/min.

j 5 med en Harvard-pumpe ind i den distale aorta gennem kateteret i den mediale sacral arterie. Efter 40 minutters farvestof i nfu-sion blev der opnået samtidige arterie- og veneprøver til må-ling af koncentrationerne af aminosyre og PAH. Tre sæt prøver blev udtaget med 10 minutters mellemrum over en periode på 20 10 minutter. Derefter blev katetrene skyllet, fyldt med heparin II og dyret blev holdt i en Pavlov-slynge. 23 timer efter forsegl gets start blev undersøgelser af strømning i bagpartiet genta- get. Efter 24 timer blev opsamlingen af urin afsluttet. Dyret H modtog intravenøst natriumthiopental, som tidligere beskrevet, H 15 og der blev udført biopsi af vastus lateralis musklen i det H ben, hvor der ikke tidligere var foretaget biopsi. Den intra- H venøse infusion blev afsluttet, og dyret blev anbragt i et me- I tabolismebur i de efterfølgende 24 timer, hvor det fik vand ad libitum og ingen føde.

i

Eksempel 2 I nfusionsopløsninger I Alle dyr modtog en infusion med en hastighed på 4 ml/time/kg.

25 5 kontroldyr modtog 0,9% saltvand. Andre dyr fik indgivet en i handelen tilgængelig aminosyreopløsning (FreAraine III®, Ameri- can McGaw) i to forskellige koncentrationer udformet til at I give ca. 0,312 (N=2) eller 0,624 (N=6) g nitrogen/24 timer/kg I legemsvægt. Den højere dosis var udformet til at give ækviva- 30 lenten af 4 g protein/24 timer/kg legemsvægt. 3 dyr modtog en I oplcsningi ndehoIdende glutamin på 0,312 g nitrogen/24 timer/ I kg. En sidste gruppe (N=6) modtog en lige blanding af glutamin og FreAmine®, hvilket giver nitrogen på 0,624 g/24 timer/kg.

I Glutaminopløsningerne fremstilledes ved at opløse L-glutamin I 35 (Sigma, St. Louis, M0) i destilleret vand til dannelse af en 0,157 M opløsning, som derefter indstilledes til pH 6,8 med natriumhydroxid. Denne opløsning steriliserede ved filtrering I gennem en 0,22 pm membran og opbevaredes ved 4eC i mindre end Η

DK 175711 B1 I

15 I

24 timer. Om morgenen på anvende 1 sesdagen formuleredes opløs- I

ningerne i de ønskede koncentrationer i 2 liters poser (Ameri- I

can McGaw) og holdtes ved 4°C indtil anvendelsen. En 10 ml I

prøve blev udtaget fra hver pose ved infusionens afslutning og I

5 opbevaredes ved -20®C til analyse for nitrogenindhold. En I

yderligere 10 ml prøve indstilledes til pH 4,75 som beskrevet I

I nedenfor og opbevaredes i frossen tilstand til analyse for I

g 1 u t am inindho1d. I

10 Eksempel 3 ' I

Fremstilling og analyse af prøver I

Helblod og plasmaprøver afproteini seredes ved at kombinere med I

lige så store rumfang iskold 10% (vægt/rumfang) perchlorsyre I

15 0g derefter centrifugere ved 3000 o/m ved 4°C i 20 minutter. I

En portion på 2 ml af den ovenstående væske pufredes med 0,2 I

ml 0,2M natriumacetatpuffer (pH 4,90), indstilledes til pH I

4,75-4,90 med 5N kaliumhydroxid og blev bragt til et s 1 u t rum-fang på 4 ml med destilleret vand. Prøverne opbevaredes ved 20 -20eC til senere portionsanalyse af koncentrationerne af glu- tamin og glutamat under anvendelse af en enzymatisk mikroflu-orometrisk bestemmelse modificeret i forhold til den metode, der er angivet af Lund, "L-glutamine Determination with Glu-taminase and Glutamate Dehydrogenase" i Methods of Enzymatic 25 Analysis, bind 4, Bergmeyer (red.), Academic Press, New York, 1974, side 1719-1722.

Under muskelbiopsiproceduren startedes et stopur øjeblikkeligt, da vævet blev fjernet. Musklen blev dissekeret fri for 30 fedt og bindevæv og deltes i to ikke lige store portioner.

Begge prøver afvejedes mindst 4 gange i løbet af de efterfølgende 2 minutter, og vægten og tiden efter biopsi registreredes. Den aktuelle muske1 vådvægt på tidspunktet 0 beregnedes ud fra den bedst tilpassede lineære regression af vægt opstillet 35 i forhold til tid. Den mindre prøve (ca. 15 mg) tørredes til en konstant vægt i en 90eC ovn, og vægten af de tørre, fedtfrie faste stoffer bestemtes efter ekstraktion i petroleums-ether. Denne prøve blev derefter fordøjet i 250 μΐ IN salpe- I DK 175711 B1 t • tersyre, og chloridindholdet måltes ved titrering med sølvni trat under anvendelse af en semiautomatisk titrator (Radiometer, København). Plasmachlorid blev også bestemt, og intra- og ekstracellulært vand beregnedes ved metoden anvist af Berg-5 strøm et. al., supra. Den anden muskelprøve (ca. 100 mg) homogeniseredes i 0,5 ml iskold perchlorsyre (10% vægt/rumfang) med en Polytron Homogenizer (Brinkman, Westbury, NY). Homoge-natet centrifugeredes, og den ovenstående væske præpareredes til enzymatisk analyse af glutamin og glutamat.

Ved denne undersøgelses start bestemtes plasmakoncentrationen og den intracel1ulære koncentration af glutamin og glutamat ved hjælp af en enzymatisk metode, der tidligere er beskrevet (Muhlbacher et al., American Journal of Physiology, 247: E75-i5 E.83 (1984)). Koncentrationer af andre aminosyrer bestemtes ved en automatiseret højtydende væskekromatografi (HPLC) efter derivatdannelse med o-phthalaldehyd før kolonnen. Alle aminosyrer, der almindeligvis findes i proteiner, bestemtes kvantitativt bortset fra glutamin, glutamat, prolin, cystein og ly-2o sin. Da undersøgelsen skred fremad, udvikledes der metoder til giutamin-glutamat-måling under anvendelse HPLC. Prøver målt ved de to metoder (enzymatisk og HPLC) gav sammenlignelige glutamin-glutamat-koncentrationer,· derfor anvendtes kun HPLC-analyse i den sidste del af undersøgelsen. Koncentrationen af 25 PAH i arterie- og vene-prøverne bestemtes spektrofotometrisk efter deprotei n isering med 5% trichloreddikesyre (Muhlbacher I et al,, supra).

i

Urin, udskilt under de 24 timers infusion, opsamledes i lukkede urinopsamlingssystemer og opbevaredes i syrnede, afkølede 30 beholdere. Portioner opbevaredes i frossen tilstand ved -20eC til portionsanalyse. Nitrogenindholdet i infusionsopløsningen og urinen bestemtes i den samme portion ved makro-Kjeldahl-me-toden (Peters et al., Quantitative Clinical Chemistry, bind II, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1932, side 516-538).

j 35

Statistiske beregninger udførtes på en IBM 4341 computer under anvendelse af en statistisk standardpakke (Minitab, The Pennsylvania State University, State College, PA, 1983). Resulta- • 1 DK 175711 B1 17 terne er udtrykt som middelværdi ± SEM. Parret og uparret Student's t-test anvendtes, hvor det var passende. Analyse af varians anvendtes til sammenligninger mellem flere grupper. Regressionsanalyse gennemførtes under anvendelse af de mindste 5 kvadraters metode. På grund af den lille prøvestørrelse for de grupper, der modtog 0,312 g nitrogen/24 timer/kg, blev de fleste statistiske sammenligninger kun udført mellem de andre grupper.

|10 Blodstrømningen i bagpartiet beregnedes som tidligere beskrevet (Muhlbacher et al., supra) og hastigheden udtryktes pr. kg legemsvægt til at tage højde for variationer i dyrenes størrelse. Aminosyrestrømningshastighederne beregnedes som produktet af blodstrømmen og arterie-vene-koncentrationsforskelle.

15 Tre prøvesæt blev udtaget, strømningen beregnedes for hvert sæt og middelværdien for de tre værdier bestemtes (Muhlbacher et al., supra). Totalt aminosyrenitrogen i helblod, plasma og intracellulsrt vand beregnedes ved at tage højde for nitrogenindholdet for hver aminosyre og opsummere de individuelle kon-,ø cent rat i oner.

Eksempel 4 PIasmakoncentration og intracellulær koncentration af aminosyrer .

Plasmaaminosyrekoncentrationer måltes præoperativt og 24 timer I

efter standardoperationen. Hos saltvandsbehandlede dyr var det samlede nitrogenindhold i plasma uændret af operationsproceduren (tabel I). G1 utaminkoncentrat ionen forblev konstant, men 3Q mængden af aminosyrer med forgrenet kæde steg, idet summen af deres koncentrationer steg fra 326 ± 21 til 501 ± 9 pmol/l (p< 0,01). Hos de dyr, der modtog 0,624 g N/24 timer/kg, var der en opadgående tendens i p1 asmani trogenkoncent rat i onen, som kun var statistisk signifikant hos den gruppe, der modtog blandin-35 gen af aminosyrer plus glutamin. PI asmag 1utam inkoncentrationen steg også i denne gruppe. Aminosyrer med forgrenet kæde blev også bestemt hos alle dyr, der modtog aminosyrei nfusi oner .

H DK 175711 B1

Skeletmuskulaturnitrogenkoncentrationen faldt under saltvands-infusion (tabel II). Dette fald i totalt aminosyrenitrogen reflekteredes primært af et fald i glutamin fra 21,48 ± 3,21 pmol/l intracel1u1 ært vand til 15,86 ± 3,80 (p< 0,05). Skønt 5 summen af koncentrationer af ikke-essentiel le aminosyrer faldt, forblev summen af totale essentielle aminosyrer i det intracellulære forråd uændret. Der skete ingen forandring i H intracellulært nitrogen eller glutamin hos dyr, der modtog 0,624 g aminosyrenitrogen/24 timer/kg (tabel II). Oer var en H 1° opadgående tendens i den intracellulære koncentration af ami - nosyrer med forgrenet kæde med infusion af de højere ami nosy-reladninger, skønt der kun blev opnået statistisk signifikans hos de dyr, der modtog blandingen af aminosyrer og glutamin.

Der var ingen signifikant ændring i de totale koncentrationer 15 af essentielle og ikke-essentielle aminosyrer hos disse to grupper efter operation. I modsætning til de dyr, der modtog den højere nitrogendosis, bibeholdt de 5 dyr, der blev infun- H deret med 0,312 g N/24 timer/kg, ikke konsekvent skeletmusku- laturens intracellulære nitrogenforråd til trods for den in- 20 funderede opløsning. Intracellulært glutamin faldt hos 3 af dyrene, forblev uændret hos 1 og steg hos 1 (resultater ikke vist).

Ved tilvejebringelse af aminosyrer ved 0,624 g N/24 timer/kg 25 som en aminosyreblanding med eller uden glutamin opretholdes således skeletmuskulaturens intracellulære aminosyreforråd. Et fald i det intracellulære forråd, hvilket karakteriseredes ved et fald i intracel1ulær glutamin, fremkom konsekvent hos dyr, I der modtog saltvand og var variabel hos dyr, der modtog den 30 lavere dosis aminosyrer.

S Nettoaminosyrestrømningen i bagpartiet beregnet som summen af nitrogenstrømningen for de individuelle aminosyrer var gennem- I snitlig -19,5 ± 4,06 pmol N/mi-n/kg, når det måltes 6 timer ef- I ter operation hos dyr, som modtog saltvand. Dette var signifi- 35 kant større end udstrømningshastighederne på -7,70 ± 5,9 og I -6,50 ± 1,18 pmol N/min/kg iagttaget hos de to grupper af dyr, I der modtog 0,624 g aminosyrer/24 timer/kg (tabel III). Imid- DK 175711 B1 i lert id var udstrømningen af glutamin fra bagpartiet uændret blandt disse tre grupper. I modsætning hertil blev aminosyrer med forgrenet kæde frigjort hos de hunde, der kun modtog saltvand, men det blev optaget i begge de grupper dyr, der modtog 5 de højere doser af aminosyrer. Bagpartiets udveksling af aminosyrer med forgrenet kæde så ud til at være forbundet hastigheden for indgivelse af aminosyre med forgrenet kæde; bagpartiet viste frigivelse af aminosyre med forgrenet kæde i den saltvandsbehandlede gruppe, balance med den opløsning der in-10 deholdt aminosyrer plus glutamin og større optagelse i den gruppe, der modtog den højeste dosis af aminosyrer med forgrenet kæde. Hos de 5 dyr, .der modtog 0,312 g N/24 timer/kg, var der ingen signifikant ændring i bagpartiets nitrogenudstrom-ning sammenlignet med de saltvandsbehandlede hunde. Imidlertid 15 var der betydelig variation i disse strømningsresultater, og antallet af undersøgte dyr var lille. Undersøgelse af amino-syrestrømning i bagpartiet 24 timer efter operation viste ingen forskelle mellem grupper (tabel III).

7q Nitrogenudskillelsen hos de 5 dyr, der infunderedes med salt-. vand, var 0,492 ± 0,022 g N/24 timer/kg. I de 6 dyr, der modtog den højeste dosis af kommerciel aroinosyreblanding, måltes en nitrogenindtagelse på 0,632 t 0,001 g N/24 timer/kg og en gennemsnitlig nitrogenudskillelse på 0,684 t 0,031 (tabel IV).

25 I de 6 dyr, der modtog opløsningen fremstillet af en halvdel i handelen tilgængelig aminosyreopløsning og en halvdel glutamin, var nitrogenindtagelsen sammenlignelig, men udskillelsen var større, med et gennemsnit på 0,775 ± 0,019 g N/24 timer/kg (p< 0,05). Nitrogenbalancen hos disse to grupper var signifi-3Q kant mindre negativ end for de dyr, der modtog saltvand med et gennemsnit på henholdsvis -0,052 ± 0,031 og -0,140 + 0.022 g N/24 timer/kg. I de 5 dyr, der modtog ca. 0,312 g N/24 timer/ kg, var den gennemsnitlige nitrogenudskillelse på en værdi mellem det, der blev iagttaget for sa1 tvandskontrol dyrene og 35 de dyr, der modtog den storre mængde infunderet nitrogen. Taget ialt viste disse undersøgelser, at nitrogenbalancen nærmer sig ligevægt, når mængden af indgivet nitrogen forøges (fig.

1). Når glutamin kombineredes med en kommerciel glutaminfri DK 175711 B1 aminosyreopløsning, var virkningerne på nitrogenbalancen ad-ditiv. Når de blev lagt sammen, gav den nitrogen, der bibe-holdtes som reaktion på infusion af kommercielle aminosyrer eller glutamin alene, den nitrogen, der bibeholdtes, når op-5 løsningerne kombineredes.

Disse undersøgelser viser, at operationsstress hos hunde sti-mulerer en nettonedbrydelse af skeletmuskulaturens protein, hvilket ses ved den negative nitrogenbalance og den forøgede 10 aminosyre udstrømning fra bagpartiet i forbindelse med et fald i skeletmuskulaturens frie aminosyreforråd. Tidligere studier har demonstreret, at proteintab ikke er forbundet med faste eller anæsti, men tydeligt er en reaktion på operationsstress (Kapadia et al., Surgical Forum, 33: 19-21 (1982)). Frigørel-15 sen af aminosyrer fra bagpartiet 6 timer efter operation i den H saltvandsbehandiede gruppe var ca. 6-8 gange det, der iagtta- H ges hos post-absbrpti ve hunde med kroniske katetere undersøgt under grundbetingelser (Muhlbacher et al., American Journal of Physiology, 247: E75-E83 (1984)). Denne hastighed for frigi- 20 velse af nitrogen fra bagpartiet kan ikke tilskrives udtømning af det i ntracel 1 ulære frie ami nosyref orråd og må derfor re-flektere en nettoproteolyse af skeletmuskulatur.

Tilvejebringelse af aminosyrer i den perioperative periode ud- H lignede nitrogentabet, opretholdte eller forøgede plasroaamino- 5 syrekoncentrationer og nedsatte tabet af skeletmuskulaturens H intracel1 ulære frie aminosyrefor råd. Disse virkninger ses at H være forbundet med mængden af i nfunderet aminosyreni trogen.

Hele legemets og bagpartiets nitrogentab nedsattes i stort om- fang ved de højeste aminosyredoser, som også opretholdte de 30 intracellulære forråd af glutamin og andre aminosyrer. Disse resultater afviger fra de opdagelser, der er rapporteret af

Askanazi et al., Annals of Surgery, 191: 465 (1980), som beskrev et fald i de intracel1 ulære koncentrationer af glutamin og andre aminosyrer hos patienter efter hofteudskiftning, som ikke kunne vendes ved infusion af dextrose og aminosyrer. Resultater opnået i forbindelse med den foreliggende opfindelse viser, at denne tidligere opdagelse kan være forbundet med 35 21 DK 175711 B1 mængden af infunderede aminosyrer og/eller manglen af glutamin

Il infusionsvæsken. Infusion af lavere koncentrationer af aminosyrer (0,312 g N/24 timer/kg) enten som glutamin alene eller som FreAmine® kunne ikke opretholde det intracellulære amino-5 syreforråd hos 3 af de 5 undersøgte dyr. I modsætning hertil

stabiliserede eller forøgede en højere aminosyreinfus i onsha- I

stighed det intracellulære forråd. Det ses således, at en passende mængde indgivet nitrogen kan opretholde skeletmuskulaturens intracellulære aminosyreforråd efter operationer.

Forandringen i det intracellulære frie aminosyreforråd hos sa 1 tvandsi nf underede dyr, der i høj grad kan tilskrives et hurtigt giutaminf aid, blev forhindret, når der blev tilvejebragt passende nitrogen. Dette skete selv, når der ikke var glutamin til stede i den i handlen ti 1 gænge 1ige opløsning. Den mekanisme, hvormed intracellular glutamin opretholdtes under disse omstændigheder, er uklar, selv om det er muligt, at glutam i nsubstratet til giutaminsyntese blev udvundet fra aminosyrer med forgrenet kæde ved transaminering. Af uforklarede 2ø grunde var nettoudstrømni ngen af glutamin ens for alle grupper. Bagpartiets frigivelse af glutamin accelereredes ikke med aminosyrer med forgrenet kæde eller dæmpedes ved tilvejebringelse af glutamin i ami nosyreop1øsni ngen. Resultaterne i denne postoperative model afviger fra de rapporterede virkninger af 25 aminosyrer med forgrenet kæde hos normale mennesker, hos hvilke underarmens optagelse af aminosyrer med forgrenet kæde efter oral indgivelse af leucin, var forbundet med accelereret g 1utaminfrigi vel se (Aoki et al., Journal of Clincal Investigation, 65: 1522 (1981)).

30

Skønt der var udtalte forskelle i sammensætningen af. de to aminosyreopløsninger, der blev indgivet med hastigheden 0,624 g N/24 timer/kg, var bagpartiets nitrogenudstrømning sammenlignelig i de to dyregrupper. Oette forekom, selv om mængden af essentielle aminosyrer og aminosyrer med forgrenet kæde i den afbalancerede opløsning, var det dobbelte af denne mængde i den glutam i nholdige opløsning. Ved denne forsøgsmodel med operationsstress var g 1utaminti 1 skud til en afbalanceret ami- 35 H DK 175711 B1 Η nosyreformulering mindst lige så effektiv som den dobbelte koncentration af den afbalancerede standardformulering til at formindske bagpartiets tab.

5 Hos de hunde, der modtog saltvand, blev aminosyrer med forgre-net kæde også frigivet fra skeletmuskulaturen. Kvantitative overføringshastigheder beregnet ud fra disse resultater anty-der, at der må være sket en udtalt optagelse af aminosyrer med H forgrenet kæde i de indre organer, mest sandsynligt i leveren, H 10 under den tidlige postoperative periode. Tilvejebringelsen af aminosyrer med forgrenet kæde sås at opveje den overføring, H muligvis ved både at opfylde de indre organers behov og ved at vende udstrømningen fra skeletmuskulaturen. Der var også et kvantitativt forhold mellem bagpartiets nitrogenbalance og be-^R 15 vareisen af det intracellulære nitrogenforråd. Når de intra- ^R cellulære forråd blev opretholdt, var bagpartiet nær ved ni- trogeniigevægt; når der blev indgivet saltvand, blev aminosy-rekoncentrationerne i det intracellulære forråd mærkbart ud-H tomt, og der var et udtalt tab af nitrogen fra bagpartiet.

H 20 Skønt forholdet mellem skeletmuskulaturens proteolyse og ni- H trogenkoncentrationen i det fri aminosyreforråd er ukendt, an- tyder disser resultater, at skeletmuskulaturens nitrogenbalan- H ce er forbundet med den intracel1ulære aminosyrekoncentration, og at glutamin kan spille en essentiel rolle til opretholdelse 25 af en> homøostatisk balance i legemet. 1 I 35 30 DK 175711 B1 23 « *-> « * . i—( * σι rsj _ < 6 v σ>, σ\ eo E 2 c »h + + + 3 Q Q Q ή r- om 05 ffix g o vo os 9 v m r- m <= o

•H

M ·* — « ' t; * »-i o m °o 2 &ύ> f, ϊι ?

0) p C O N 1-1 OM

H U O £ ^ n <» 0 M »" S +> , +J w

^ 0} 0) - I

0 tU +) -y 4J i M-t «, I +1 ® σι -π σ\ 4-· N ΙΟ V +1

r-l · · · 4-> <D

1 5 8¾ ?' ?i S, ' s ij 5 O M O \£> r- om TI EHjJfcinm σι H ro 4J -r! c ·-- — (0 CXi C — «9· in m Q, is· I cm rø 0 0 > c > o c ti) •η Λ C O Ό Ή · _# j _j __j o —n w < ϋ \ (n m m -h-u^; ^ — ES ch +1+1 +| +» <0

PS 50 D Q ID σι r- ro Η -P

C ω lOCQ^gtNrn σ\ h ø ø

0 W 3'^° ™ Q) Cu C

o α o 0

C Ht o H

O H D>

H Jtf ·Η H H

<U Ό «1 +t O

rH H H IH IH

0 >1 rø * r> C

.Q CO > * . rH Ctl)O

ro o ή i£ 0 -h 0 ^ c ø 3 n g +1 +1 +! ^ ·σ e

C £ o e in' σχ «V τ3 H

6 Ό C 3. « in vr π æ H

(0 -H O H' 00 00 ic (¾ > <U

Ό g -H > H

S —' -P Ό >1

0) (0 Ό <U W

(OH 0 E O

1—i 0 g c a α _ ~ t fS £ d> -h λ c ή ri m om χ c o φ\ . . tj> C 5 (0 Dir-H 00 o C *h ro

ϋ ϊ p Q +1 +1 +1 -H C

t& O Η E r-ι 10 e D> 1! fe «*.*'£"'’ ® «L & -η rn Ή Ti < c rH C <

— C 0 U

tr> tu g ta

C .* g E

dm h \ g ro - c d> E h ro t n c -η ro 0 in -h

c ^ ii e roi E

tn cn 3 -h o ji ro

•Q. 10 Ή -P 0 > -P

rH - Di >9

Q, O Dl ^ rH H

O ^ J4 + nj i-HOtTi

\ \ O O

4J HH U Z --li

(1) Ot ti) 0 O O

Η Ό Η E H D> 2

0 C >1 -H >1 * ' iJ

'DroW+’W'^H'HiOU C >0 O no 9 JJ C M1 C VO itr U-t Η -Η N -H - tt- * C ro §<=> «3 h cn < z 2w i j i I24 DK 175711 B1 _ tf O1 E tf ino r- o r- o- 3 w *-r~ *-rr «λ W Z iH ·- VD *- 0\ ·.

γί "<r ro in ro <sj S ±1 +1 +| uj o (n r-· vn ru «Μ cn ro r*. ro r- ru E ·· ·► ♦· ·* *» *v

3 HO N O (NO

C

o

Ti c $ ±,in +1 +1 P g < hid m ro ιλ «3 j5 W O' ·—I ffl V Γ*·(Ν Λ p 01 a in o p* h r- h

Tg* fli r-**.*. *.

H a oooooo c/i o +t — p «, Ό (U 2* ±· +t +1

>nS ϋ §| OD O (N in VO OD 4J4J

^5 J *P U| *»Co »O 0} 01 P > Q1 m ·- CD * ,p *» 010»

ftj rtn Hn NN +)4J

> -P M ||

>—I P 0) C -P -P

oi « e ® * p ΌΗ Η · H CT * . 4J .p φ 2 = ^ -..3 2 i1 · s1 # g> o) p £ "* h· E-1-H r>T(N^ ceT^· P P 01 w Q) <n Ζιηοονοσ» «« ro ro o , o α a c

P (0 -H

G) P «σ Ό E ' C 4J tf +1 +| +i 0) 0) Π3 O C E tt (N o' o > > •p -p D w σ\ co o o in ru oi ^ H * o-T- βΓΊ rT°L e e 2 P\ ^^^rovr. roro £ 3 φ

•P rp * 4-1 -P -P

H C O *. (0 (0 -P

w μ i < +i +i +i p p c ^ C 5 S H ro *τ σ\ σΐ σ, o n m v 5 _ _ ®N (MN σι (N a ft Kl 0) OS P k. ^ *· k »· #* O O tø -Ω Λ O 9 HO (NO HO 0) (d 0 « w p p i HP S S 0) · >1 -P u-ι ip m

01 Pi M

o >1 pi il. +1 +1 C G -P

G P SS h 21 ni ru ο, ω -pjJ /S y “ h η- Γ~~ »r γν p £ WO^ro-vo rr o £ £ 11 «2 - > — — - .. fl ti 8 0 oooo oo ρ p tf H ~ « f« tf

Q> > > W

X Z

2 +1 +! +1 Ό Ό 3 Z od en m dl dl —

S C W ’»rj «5 co r- EEP

O * ni vr* *-rP <D

Tj ni ro iH ro 2 ro ? ? il -P C C >i Π3 .p -p ui

PC C C O

0) dl tn tn C

Gj tn -P -p -p O *h 0 i—i »ρ

. <8 P C C (S

p +-* -+3 -t-1 I O-I OQJ

"Θ- O -P cx) in (N ro in o 6 § (U

ti HZ cbh cn co m o ro r· «5π3η i vo oh io 01 oi di !

•P

I Ό Ό -P

01 0) 0) C

Ό· > > 01 ^ (N ^ 2 2* vo tn o· - - oi O * cn m >—f d)

O \ , VD O O

_p '--P +^p »k|| di UP uS2 oo ϋ Ή S-3 al %. < dl C P J-) PC 4-1 NVti Ό rd >, >,.p ft & y c > 01 H· 01 E -3· 3σ·υ3ί^θ3(Ν if

•w c H -S Z ·§ 5 s » -H

C-Pid i-p » x

HCWl <Dii<cntn X

DK 175711 B1 I

25 I

u < +\ -H + l I

m < ον ·η com σι γμ

gQ^rinomocM

£« flj r ·» » *« *· *· H

Η O H Csi *H O O _ 4J tT>

^ I

^+1+1+1¾ Z *-t rr vo S'

ClJr-OiNO-rHCSiE

_ ni R sfs. ^ TT *-00 -Η I

tp u i o i o (o . m •p m m 1 1

+» \ <u I

i_i c ^ I

rC -H 01- > I

CL, E c i .2

t7> \ ·Η QJ c - I

(8 rH C H 0) ^ Λ O E «-j >ί $7 +1 +) E -q. ro rn O o O in +1 "^r , g ΡΓ .p o c, inH rr o £ ΓΜ ^ “v ” o c D -- -os o m „ 4-) rn r\i cd- » r- w

Cn ·* W EZ I·—i ( (Μ m ·- v H C S « I m o

H ·>-> w 5, u I

H c LO ” " I

E >4 o) cu I

ih «. +1 οι ^ +1* , ,, Η1 ^ I

^ ±J -H -H 5* 5 i A .£> »2 +J W I

•S S S « g p'-t "·"·· b g h S , = 00 I 5 g· S »i M 0) O +1 +| +| ® * -UO4J σ\ m σι ^

•Η Ό Ή Z vo r- σι cr> H id C

IZ ·Η <U J -O sin *>T s -H

g C> n* ·- ή * ·-* h S

S σ, i *“* 10 10 >, s

C T3 -U

H = C 0) ή

El <-* Cn ^ Φ c ^ ^ >-i M3 « +

Ui *(5 in 5 in* +1 +| OH

4J Q ij O * o m Cl Q) O C iJ s\o ΙΌ in H U4 Li -Η ·Η SI O *Ol SCO Γ E2 ,-r ► c s 10 ·· ., j < i rr i in I <H M t n Φ O cn C Ή -H > £ iw (0 ”σ> ό ό

CM C C

tj Ή \ rO ro C Cn £ M > >

-H tO φ -U -U

C ^ O £ -H

C/j cm d 1-1 <0 r0 1) ©. lo rH4-> tntntno) rH ~ — cr> w tn cl o t? ^ ... ... a) r-i η ^ M + nj m -η > tu \ \ o o -H Cn 4J Cl Cl Cl Z s . Cn ro

(U (UQItU O O H -P

ΜΌ Ci E Cl O' , Ci Q.

Q)C >,·Η>ι V v'lwo

Ό ro in 4J W ftCL

C > O O (N II II

2 -P Co· C 10 I

IWrl ·ΗΝΗ» 4IM

dio e\£o m i + w æ < z I DK 175711 B1 J « c u m -H Q) c

J fM 00 ID rH CM E U -H

o in cd ro cm m >, P

I ω ° ° 0„ ®. ® £ » I

m O O O O O O 3 O -P

5? 5 ά1 i* +· +* +l TL C 3

* 05 ΓΜ CM VD fM O CP -H rH

. H cn ro oo in rr £ cn

M 0 CO CO O H + S

ø {Q r~ w r· H Tiu C O O O O o , ^ .5 I I I i I 5-1 »T 0

Ti ' ø <m ε

5-1 ID

_ >1 * iH

^ * 10 O 0 ™ <n vo m h cn o V Ό ^ cd n h G > cn .· o o o o o -hg h C Λ o. o O O cT m P 2 o) tJ e* Æ* i* i* +i +1 10 § -^ m .X cn γμ r- cn ·<τ in <0 X « h ro o co r- nr 4-> c 0 g ø or io r- vo r~ cm g ø +1 OOOOO * * * 2 ° ° y ! . .V 0

ø M ' I J-l W G

OM 0 0 -H

c ! 1 u u B

-> j^*1 J 5 o22£ WWØ ·> <“· I Ό o o o σ nou Hø-Η i C O o O O rr· c,

. ΐ u , 0 O O, O o O -Η -H

ø m W ! +* “» +! +1 +1 +1 £ £ Ό S Si. P r HH ^ ro cm in øm ø J2 &<> i « o) o cm m ro u ^ ID OH I Sen Ή m ID ID rnm e SI ° ° ° ° < < % 2 !3 5-i m m

S c 0 0 S-I

C· 1 21 in cm ro id id k É Λ •Η -H 0 .—. +4 4J -ro

i 5* P

λ o -*· ·» > % ø ir i C" C ^ P cn ø . \ N. η HIH P ' 2 2 4->

C jU -H

tx> J3 -ej* cm cm rr »r -P

(CJ T3 CM r? Ή (Μ (Μ M" rr 0

H C \ cn ΓΟ ID ID CM CM C

§1 2 ·" o o*' o- o- o- « ^ ® s: & s o o S1 v * ϋ

Ό Ό -H

C C c x øm X > > iw X D» 4-1 H m

X i—I rH M

m m h h „ «1 U) CO 0 X X 3 0 Ό X X i—l **..·.£

X X Dj tn 140 -H rH

, o o E m

rr, % 5hH ' - < JZ

cn ø øø o o ø CO 54 ' U 54 , 54 c -PC >1 C >t >, ν^ίΗ0 cmw-Hmm a α to > o i o o c 3 c c ifcifcfcx o « c 3 'ί ‘ί $ » * ; Λ(°ζ»ΗΕε λ» οι w 1 s o a < H ! j

DK 175711 B1 I

27 I

Eksempel 5 I

Forudsigelse af postoperativ muskelnitroqenbalance ud fra op- I

taqelse af aminosyrer med forgrenet kåde og koncentrationer af I

5 muskulaturens fri aminosyre I

For at undersøge effektiviteten af BCAA-i nfus i on til reduktion I

af proteinkatabolisme i skeletmuskulatur og hele legemet blev I

am inosyreformu1 er i nger indeholdende forskellige koncentrat i o- I

ner af BCAA indgivet perioperativt ved denne undersøgelse til I

10 I

3 grupper hunde, som blev underkastet standard laparotomi og

retroperi tonea 1 dissektion. En fjerde gruppe fik givet salt- I

i vand alene. Ved anvendelse af metoder til bestemmelse af bag- I

partiets strømning måltes dé individuelle og totale aminosyre- I

nitrogenudvekslingshastigheder, og disse blev benyttet til be- I

dømmelse af skeletmuskulaturens proteinkatabo1 isme. Intracel- I

lulære koncentrationer af fri aminosyre måltes i perkutane muskelbiopsiprøver. Arbejdet er fokuseret på virkningerne af intravenøse aminosyreopløsninger, der indeholder varierende koncentrationer af BCAA på reguleringen af skeletmuskulaturens aminosyremetabolisme efter en standardiseret kirurgisk procedure hos hunde. Ved at måle bagpartiets aminosyrestrømning og koncentrationerne af fri aminosyre i plasma og skeletmuskulatur under de første 24 timer efter operation, har det været muligt at bestemme den antikataboliske reaktion på infusion af BCAA og andre aminosyrer.

Materialer og-metoder

Praparerinq af dyr og sekvensundersogelse 27 hunde af blandet race omfattende hanner og ikke-gravide hunner blev leveret fra en gård, hvor de var blevet tilpasset og sorteringsundersøgt for parasitter. Hundene vejede mellem 18 og 40 kg, og de blev holdt i mindst 1 uge før undersøgelsen under dyreplejefaci1 iteter ifølge The Harvard Medical School.

Alle foranstaltninger var i overensstemmelse med retningslinierne fra The Committee of Animals at Harvard Medical School og The Committe on Care and Use of Laboratory Animals of the In- H DK 175711 B1

H

H stitute for Laboratory Animal Resources, The National Research

Council, supra. Dyrene holdtes i individuelle hundehuse med 24 timers udsættelse for lys, og de motioneredes hver morgen. Der blev givet vand ad libitum og en enkelt daglig fodring af 5 "Pro-Pet Respond 2000" tørhundefoder (Syracuse, New York, H mindst 25 vægt% protein) blev givet mellem kl. 13,00 og 15,00.

Dyrene trænedes til at hvile roligt i en Pavlov-slynge før un-dersøgelsen.

20 Al foder fjernedes fra hundehusene kl. 17,00 aftenen før grundundersøgelser eller operation. Grundundersøgelserne ud-førtes kl. 8,00 efter at dyrene havde fået motion og var ble-vet anbragt i slyngen. Oisse undersøgelser bestod i opsamling af en blodprøve fra en forbensvene med kanyle til bestemmelse 25 af plasmaaminosyre og en perkutan nålebiopsi af vastus laterals lis musklen udført under natriumthiopentalbedøvelse (Abbott,

North Chicago, Illinois, 5 mg/kg legemsvægt, i.v. til kvanti- tativ bestemmelse af intracellulære frie aminosyrer. Efter bi- H opsien, mens hunden stadig var bedøvet, blev der udtaget en 5 H 20 01Ί prøve af arterieblod ved perkutan punktur af lårarterien til analyse af helblodets aminosyrer.

Dyret fik lov til at komme sig i 3 dage, før der udførtes yderligere undersøgelser. Kl. 7,00 på dagen for operation, at- ter efter faste natten over, fik dyret motion, og det blev 25 bragt til operationsrummet, hvor det bedøvedes med natriumpen- I tobarbital (Abbott, North Chicago, Illinois, 30 mg/kg legems- I vægt, i.v.) gennem en forbenskanyle. En endotracheal slange anbragtes, og dyret fik lov til spontant at indånde en blanding af stueluft og oxygen tilvejebragt med 5 1/min. Hunden 30 blev anbragt på et operationsbord i rygleje og et 16-Fr. kateter placeredes perkutant ind i den øvre vena cava gennem den eksterne halsvene. Efter at starttid var noteret begyndte infusion af enten saltvand eller en passende prøveaminosyreop- løsning gennem dette centrale kateter med en IMEO-pumpe (San 35

Oiego, Californien). Cephalotin (Lilly, Indianapolis, Indiana, .

1 g, iv.) blev indgivet umiddelbart før og efter færdiggørelse af operationen. Urinblæren blev forsynet med kateter, og

DK 175711 B1 I

29 I

efter bortkastelse af resturin begyndte en lukket dræningsop- I

i samling ved infusionens start, og denne fortsattes i 24 timer. I

Urin opsamledes også i en yderligere 24 timers periode med dy- I

ret i et metabolismebur efter afslutning af i.v.-infusionen. I

Hundens bug og flanker barberedes, vaskedes med sæbe og vand I

og præpareredes med en povidonjodoplosning. Dyret draperedes I

sterilt, og bugen blev åbnet ved inf. raumbi 1 ical midteri iniein- I

cision hos hunnerne og højre paramedian incision hos hannerne. I

2ø Tarmen blev trukket til side, og retroperitonium blev blottet I

til fuldstændig dissektion omkring den distale aorta og nedre I

vena cava. Den højre dybe omkringbøjede bækkenarterie og bæk- I

kenvene såvel som den højre internale bækkenarterie isolere- I

des. De to arterier blev forsynet med kanyler med specielt I

25 fremstillede katetre bestående af et 6 cm segment af polyethy- I

lenslange (ydre diameter 2,08 mm) forbundet til en polyethy- I

lenslange med en ydre diameter på 2,8 mm. Det ene arteriekate- I

ter, var placeret 6 cm proximalt ind i aorta gennem den om- I

kringbøjede bækkenar ter ie, og det andet kateter var placeret 1 I

20 cm proximalt til aortas gaffeldeling, men distalt til den eau- I

dale mesenterialarterie gennem den internale bækkenarterie. Et I

tredje kateter indsattes i den nedre vena cava gennem den dybe I

omkringbøjede bækkenvene og placeredes distalt til renalvenen. I

Alle katetre fastgjordes og førtes ud gennem stiksår i den I

25 højre flanke. Bugen lukkedes i lag, og dyret blev vendt på I

dets venstre side. De udførte katetre blev skåret til passen- I

de længder, tilproppedes med stumpe nåle, forsynet med hætter med intermitterende injektionsporte (Jelco, Crit ikon, Tampa,

Florida), skylledes med saltvand, fyldtes med heparin (100 μϋ/ 3ø ml) og begravedes subkutant. Injektionsportene var placeret højt i flankerne, hvilket gav let adgang til arterieblod (aorta) og veneblod (vena cava) ved perkutan punktur.

Efter disse procedurer, der almindeligvis tog 2 timer, anbragtes dyret på dets side, og legemstemperaturen holdtes ved. hjælp af tæpper, mens dyret vendte tilbage fra bedøvelsen. 5 timer efter start af infusion og operation anbragtes dyret i Pavlov-slyngen, og en opløsning af 0,5% paraaminohippurat DK 175711 B1

H

(PAH) infunderedes med en hastighed på 0,7 ml/min. med en Har- var-pumpe ind i det distale aortakateter. Efter 40 minutters I farveinfusion blev der udtaget 3 sæt samtidige artie- og vene- prøver med 10 minutters mellemrum til måling af koncentrat io-5 nen af aminosyre og af PAH. Katetrene blev derpå skyllet og fyldt med heparin. Dyret holdtes i slyngen under konstant overvågning, indtil strømningsundersøgelserne i bagpartiet var gentaget 24 timer efter infusionens start. På dette tidspunkt afsluttedes de første 24 timers urinopsamling, og en gentaget 10 perkutan bagbensbiopsi udførtes på det ben, hvor der ikke tid-H ligere var foretaget biopsi, atter under kort generel bedøvel- H se. Derpå afsluttedes infusionen, og dyret blev anbragt i et H metabolismebur i en periode på yderligere 24 timer.

15 Infusionsopløsn i noer

Alle opløsninger blev infunderet med en hastighed på 4 ml/min/ kg. 5 kontroldyr modtog 0,9% saltvand. Aminosyreopløsninger (tabel V) indeholdende BCAA’er i tre forskellige koncentratio- ner (11%, 22% eller 44% af de samlede aminosyrer) fremstille- des ved at sætte aminosyrer til en 8,5% standardaminosyrefor- mulering, FreAmine III (American McGaw, Irvine, Californien).

De samlede BCAA-infusionshastigheder var henholdsvis 0,46, 0,92 og 1,84 g/24 timer/kg. Alle tre aminosyreopløsninger var isonitrogenholdige og gav ca. 0,624 g nitrogen/24 timer/kg med I 2 5 et konstant forhold mellem val in: leucin*. isoleucin på 1: 1,38: I 1,05. 9 dyr modtog en 11% BCAA-opløsning, der var fremstillet I ved opløsning af en blanding af ikke-essentielle aminosyrer I (NEAA) i 2,13% FreAmine III til fremstilling af en opløsning, der gav 0,624 g nitrogen/24 timer/kg. Til 6 dyr bestod NEAA af 30 L-glutamin alene og til 3 bestod NEAA af en blanding af alle I de NEAA'er, der findes i FreAmine III (alanin, glycin, argi- I nin, histidin, serin og prolin) i de samme forhold som i Fre- I Amine III. 6 dyr modtog 4,25% FreAmine III alene (22% BCAA).

I De sidste 7 dyr modtog 2,13% FreAmine III suppleret med til- 35 strækkeligt BCAA’er til at give en 44% opløsning. Denne sidste

formulering blev gjort isonitrogenholdig ved at tilsætte NEAA

I som L-glutamin alene (n=4) eller en blanding af de NEAA'er,

DK 175711 B1 I

der findes i FreAmine III (n=3). Alle oplosninger sterilisere- I

des ved passage gennem et 0,22 μm filter {Millipore, Millis, I

I MA) og opbevaredes natten over ved 4eC før indgift. En 10 ml I

prøve af hver opløsning blev taget ved afslutningen af infu- I

5 sionsperioden og opbevaredes ved -20eC til analyse for nitro-

gen ved makro-Kje1dah1-metoden . I

Præparering oq anlvse af blod-, vævs- og urinprøver. I

Helblodsprøver og plasmaprøver afprotei ni seredes ved at til- 10 sætte et lige så stort rumfang iskold 10$ perchlorsyre (PCA)

I og derefter centrifugere ved 7000 o/m ved 4eC i 20 minutter. I

En portion på 2 ml af den ovenstående væske pufredes med 0,3 I

I ml 0,2M natriumacetatpuffer (pH = 4,90) indstillet til pH I

I 4,75-4,90 med 5N kaliumhydroxid og bragt til et slutrumfang på I

I 4 ml med destilleret vand, hvorpå der påny centrifugeredes. I

I Den resulterende ovenstående væske opbevaredes ved -20eC til I

I senere portionsanalyse. I

I ; Under muske1 biopsi proceduren startedes et stopur på tidspunk- I i 20 tet for vævsfjernelse. Musklen dissekeredes fri for fedt og I bindevæv og blev delt i to ikke lige store portioner. Vægten H registreredes flere gange for hver prøve med intervaller på 15 I sekunder i et minut, og den indledende våde muskel vægt på I tidspunktet 0 beregnedes ud fra den bedst tilpassede lineære 25 regression af vægten afbilledet i forhold til tiden. Den min- dre prøve (ca. 15-20 mg) tørredes til en konstant vægt i en I ovn ved 90°C, og vægten af de tørre fedtfrie faste stoffer blev bestemt efter ekstraktion i petro1eumsether. Prøven blev derefter gennemvædet i 250 ml IN sa1petersyre, og chloridind- 30 holdet måltes ved titrering med søvlnitrat under anvendelse af en halvautomati seret titrator (Radiometer, København). Plasma- chlorid bestemtes også ved en lignende metode. Intracellulært H og ekstracellulært vand blev derefter beregnet under anvendel- H se af chloridteknikken, som beskrevet tidligere. Den anden mu- H 35 skelprøve (ca. 80-100 mg) vejedes og homogeniseredes i 0,5 ml iskold PCA under anvendelse af en Polytron homogenisator (Brinkman, Westbury, New York). Homogenatet centrifugeredes og H den ovenstående væske præpareredes til analyse ved tilsætning H DK 175711 B1

H

af puffer og ved pH-indsti 11ing til pH 4,75-4,90, som beskre- H vet for blod- og p1asmaprøver.

Helblodskoncentrationen, plasmakoncentrationen og den intra- 5 cellulære muskel koncentrat ion af glutamin og glutamat bestem- tes ved en enzymatisk mi krof 1uorometri sk metode modificeret ud fra metoden beskrevet af P. Lund, "L-glutamine determination with glutaminase and glutamate dehydrogenase," i Methods of Enzymatic Analysis, Bergmeyer HU, red., bind 4, New York: Aca-demic Press 1719-1722 (1974) eller ved en automatiseret højtal ydende væskekromatografi (HPIC) efter derivatdannelse med o- phtha1 a 1dehyd før kolonnen, R. J, Smith et al., "Automated analysis of ophtha1 a 1dehyde derivatives of amino acids in phy-H siological fluids by reverse phase high performance liquid H 15 chromatography,” J. Liq. Chromatog. 8:1783-1795 (1985). De to H metoder gav sammenlignelige resultater, Andre aminosyrer bort- H set fra protein, cystin og lysin bestemtes ved en tilsvarende HPLC-metode. Koncentrationen af PAH i arterieblod og venebl od H bestemtes spektrofotometri sk efter deproteinisering med 5% 20 trich1oreddikesyre,· F. Muhlbacher et al., "Effects of gluco- corticoids on glutamine metabolism in skeletal muscle", Am. J.

H Physiol. 247: E75-E83 (1987).

Urin udskilt under de 24 timers infusion opsamledes i et luk- H ket urindræningssystem og opbevaredes i syrnede, afkølede be- 25 holdere. Portioner opbevaredes frossent ved -20eC til senere portionsanalyse af nitrogen ved makro-Kjeldahl-metoden, J. P.

Peters et al., "Total and non-protein nitrogen," i Quantitati- ve Clinical Chemistry, bind II, 516-538, Baltimore: Williams & I Williams, (1932). En anden del centrifugeredes i 10 minutter 30 ved 2000 o/m og blev frosset til senere analyse for urinstof og creati nin på en Technicon Auto-analyzer (Tarrytown, New

York).

Beregninger og statistisk anlyse.

I 35 I Blodstrømning i bagpartiet beregnedes som tidligere beskrevet (F. Muhlbacher et al., supra). Strømningshastigheder for en- I kelte aminsyrer beregnedes som produktet af blodstrømningen og Η

DK 175711 B1 I

33 I

arterie-vene-koncentrationsforskel. 3 sæt prover blev udtaget I

på hvert tidspunkt, strømningen beregnedes for hvert sæt og I

middelværdien for de tre værdier blev bestemt. Den totale ami- I

nosyrenitrogenstrømning såvel som plasmakoncentration, hel- I

5 blodskoncentration og intracellulær koncentration af nitrogen I

beregnedes som den millimolære sum af ni trogengrupperne for I

alle de målte aminosyrer. Skeletmuskulaturens frie intracel- I

lulære aminosyrekoncentrationer udtryktes pr. liter intracel- I

lulært vand. I

1° I

„Statistiske beregninger blev udformet under anvendelse af en I

statistisk standardpakning (Minitab, The Pennsylvania State I

University, State College, PA, 1983). Resultaterne udtryktes I

som middelværdi ± SEM. Parret og uparret Students t-test blev I

anvendt efter behov. Variansanalyse blev benyttet til sammen- I

ligning mellem flere grupper. Regressionsanalyse blev gennem- I

ført under anvendelse af de mindste kvadraters metode. I

Resul tater I

120 Alle dyr overlevede operationsproceduren bortset fra én hund, I

som døde kort efter indgivelsen af natri umpentobarbi ta 1 før I

start af den intravenøse infusion. Dette dyr er ikke taget med I

i undersøgelsen. Blodtab under proceduren var ensartet mini- I

mal. Alle prøvekatetre var åbne på tidspunkterne efter 6 og I

25 24 timer bortset fra et venekateter på tidspunktet 24 timer hos et dyr i 22% BCAA-gruppen.

Bagpartiets blodstrømning ved 6 timer var 36,1 ± 6,8 ml/min/ kg hos saltvandskontrolgruppen og blev ikke påvirket af be-30 handling (11% BCAA, 33,3 ± 4,9; 22% BCAA, 42,4 ± 8,0; 44% BCAA, 28,7 i 3,5; forskellene er ikke signifikante). Strømning ved 24 timer var uændret (henholdsvis 57,9 i 10,2, 38,6 ± 8,2, 54,9 ± 6,5 og 49,7 ± 13,2). Tendensen mod højere strømningshastigheder og forøget variation ved 24 timer kan tilskrives 35 større motorisk aktivitet hos dyrene, efter at de er kommet sig fra bedøvelsen.

H DK 175711 B1

Urinnitroqenudski1lelse og nitroqenba1ance

Efter operation var rumfanget af udskilt urin sammenlignelig for de fire behandlingsgrupper, skant de dyr, der kun modtog 5 saltvand, havde tendens til at udskille mindre urinrumfang (tabel VI). Den urinære nitrogenudskillelse var gennemsnitlig 0,492 ± 0,20 g/24 timer/kg for saltvandsgruppen. De aminosyre-behandlede dyr udskilte 35-65% mere nitrogen end saltvands-gruppen primært i form af urinstof. De hunde der var infunde-2 0 ret med 22% BCAA-opløsn i ngen udskilte signifikant mindre urinal stofnitrogen og mindre total nitrogen end grupperne med 11% eller 44% BCAA. Udskillelse af creatinin og ammoniak var sam-H menlignelig hos alle grupper.

Blodurinstofnitrogen og p1asmacreatinin måltes før og 24 timer H efter operation hos udvalgte dyr fra alle grupper. Disse kon- centrationer var normale hos alle dyr før operation og faldt svagt eller ændrede sig ikke efter operationen. Således var hastigheden for urinudskillelse af urinstof lig med hastighe- den for urinstofproduktion; den højere urinstofproduktion, der 20 blev iagttaget hos de dyr, der modtog opløsningerne 11% og 44% BCAA, var signifikant forbundet (p< 0,05) med den ekstra ni- trogen, der blev tilvejebragt med 8CAA eller NEAA til den af- balancerede aminosyreblanding.

25 Nitrogenbalancen var mindre negativ med aminosyreindgivelse; ca. 50% af det infunderede aminosyrenitrogen blev tilbage- holdt. Da nitrogenindtagelsen var den samme hos alle dyr, som modtog aminsyrer, var de allerede omtalte ændringer i nitro- I genudskillelsen reflekteret i nitrogenbalancen (tabel VI). Så- I 30 ledes opnåede de dyr, der modtog den 22% afbalancerede amino- syreopløsning, signifikant større nitrogentilbageholdelse i I forhold til de hunde, der modtog de opløsninger, der indeholdt I 11% eller 44% BCAA.

I 35 Helblodsam i nosvrekoncentrationer I Hos de saltvandsbehandlede dyr faldt helblodsaminosyrenitroge- I net ved 6 timer efter operation, men det vendte tilbage til de DK 175711 B1 35

normale præoperative niveauer efter 24 timer (tabel VII). Oen- I

ne forbigående hypoaminosyreæmi fremkom i stort omfang ved en I

nedsættelse i koncentrationen af ikke-essentielle aminosyrer I

(glutamin, alanin, arginin, serin og asparagin), selv om der I

5 også fremkom signifikant nedsættelse af nogle essentielle ami- I

nosyrer (threonin og tyrosin). I modsætning hertil opretholdt de dyr, der modtog ami nosyrei nfusi oner, hel bl odsam inosyren i -trogenkoncentrationerne ved 6 timer efter operationen. Disse I

koncentrationer steg til over kontrolniveauerne fra før opera-10 tiuonen efter 24 timer (p< 0,05). * I

Koncentrationerne af specifikke aminosyrer i blodet hos de I

I dyr, der modtog aminsyreinfusioner,, reflekterede sammensætningen af de infunderede opløsninger. F.eks. var BCAA-koncentra- I

' 15 tionerne relateret til hastigheden for BCAA-indgift både efter I

6 og efter 24 timer (f i g. 2). Generelt var hel bl odsgiutamin-koncentrationerne efter 6 timer lavere end de præoperative koncentrationer (tabel VII). Undtagelsen var den gruppe, der modtog en glutaminberiget 11¾ BCAA-opløsning, hvori blodgluta-9 q minkoncentrationen blev opretholdt. Hos disse dyr omfattede glutamin mere end halvdelen af det ikke-essentielle nitrogen og udgjorde mere end 40¾ af de totale indgivne aminosyrer.

Efter 24 timer havde de dyr, der modtog glutaminholdige infusioner, tendens til at have højere he 1b 1 odsg1utaminkoncentra-25 tioner end normalt. 9

Skeletmuskulaturs intracellulære frie aminosyrer

Hos saltvandsbehandlede dyr faldt det intracellulære frie ami-nosyrenitrogenindhold signifikant 24 timer efter infusion, når 30 de sammenlignedes med de præoperative niveauer (tabel VIII).

Denne ændring tilskrives for størstedelens vedkommende (65%) det udtalte fald i den intracellulære glutami nkoncentration, der omfattede en større del af det samlede intracellulære ami-nosyrefor råd. Hos dyr, der modtog aminosyreinfusioner, opret-35 holdtes det intracellulære nitrogen, skønt den intracellulære glutamin faldt hos dyr, som modtog den glutam i nfrie 11¾ BCAA-oplosning. Intracellulært glutamin havde tendens til at stige hos de dyr, der modtog glutaminberigede opløsninger, og H DK 175711 B1 BCAA-koncentrationer steg i forhold til hastigheden af 8CAA-infusion.

H Aminosvrestrømning i bagparti

Hos de saltvandsbehandlede dyr var der en nettof r igi vel se af H aminosyren i trogen fra bagpartiet 6 timer efter operation (tabel IX). Denne forøgede am inosyreudstrømning reflekterede accelereret frigivelse af næsten alle de målte aminosyrer, indbefattet BCAA'erne. I denne tidsperiode var glutamat og as- partat de eneste aminosyrer, der bibeholdt balance over bag-partiet. 24 timer efter operation var hastigheden for frigi-velse af aminosyrenitrogen fra bagpartiet faldet, og skønt det var meget variabelt kunne arterie-vene-forskellene for næsten alle aminosyrer ikke skelnes fra 0. Glutaminudstrømningen va- rede ved på dette tidspunkt.

Hos alle grupper af dyr, som modtog aminosyreinfusioner, var aminosyrenitrogenudstrømning fra bagparti efter 6 timer ens og H signifikant mindre end fra de saltvandsbehandlede dyr (p<

H 20 0,05). Både giutaminudstrømning og a 1 an inudstrømning efter S

timer havde tendens til at være mindre i de dyr, der modtog aminosyrer, end i saltvandskontroldyrene. Mens BCAA'er blev H frigivet efter 5 timer hos de sa1 tvands i nfunderede dyr, blev disse aminosyrer optaget i de hunde, der modtog aminosyrei nfu- 25 sioner. BCAA-bagpartisoptage1 se var forbundet med hastighed- den af BCAA-indgift (fig. 3) og he 1-BCAA-koncentrationer I . (fig. 4> I Efter 24 timer var aminosyrenitrogenudstrømningen fra bagpar- 30 tiet lige stor for alle de ami nosyrei nf underede grupper og uændret sammenlignet med efter 6 timer. Efter 24 timer var ud- I vekslingen af BCAA i bagpartiet svagt positivt roed tendens til at blive større i grupperne med 22% og 44% BCAA. På dette tidspunkt var BCAA-optagelsen ikke relateret til blodkoncen- 35 trationerne og hastigheden for BCAA-indgift.

DK 175711 B1 I

• Forhold mellem BCAA-i nfusi on . BCAA-optaqelse i bagparti og a- I

minosyreni troqenfriqivelse i bagparti H

Hos sal tvands i nfunderede hunde efter 6 timer var BCAA-frigi- I

5 velsen fra bagpartiet forbundet med accelereret aminosyreud- I

strømning. Hos de dyr, der modtog am i nosyre infusioner, var ni-

trogenbalancen i bagpartiet korreleret med BCAA-optagelse I

(fig. 5). Saltvandskontroldyr var ikke indbefattet i denne a- I

na.lyse, da de ikke modtog nitrogen; indføjelse af kontroldyr I

ville have givet en regressionslinie med en mere positiv hæld- I

ning. Korrelationen opretholdtes, selv hvis BCAA-strømningen ikke var indbefattet i opsummeringen af bagpartiets aminosyre-nitrogenstrøm (p< 0,02, r = 0,49). Således var nitrogenstrøm eksklusiv BCAA-strøm også relateret til BCAA-optage1 se. Nitro-2g genstrømmen var ikke korreleret med total BCAA-koncentration i blodet eller hastigheden for BCAA-i ndg i ft. Ingen af disse forhold eksisterede på tidspunktet efter 24 timer.

Bagpartiets aminosyrenitrogenfri g i vel se efter 6 timer var også korreleret med ændringer i det intracel1 ulære frie aminosyre- , .20 j nitrogenforråd (fig. 6). Ændringer i i ntrace 11ulært glutamin var tæt relateret til forandringer i det samlede frie aminosyren! trogenf orråd (p< 0,001, r = 0,90), og således var foran-

Idringer i glutaminforrådet også signifikant relateret til bagpartiets nitrogenudstrømning (p< 0,05; r = 0,66). Disse mate-25 matiske forhold opretholdtes når bagpartiets aminosyrenitro-genudstrømning blev korrigeret for forandringer i det intra-cellulære nitrogenforråd. Da målingerne af strømmen og forrådet blev foretaget på forskellige tidspunkter, blev denne korrektion foretaget ved at antage to forskellige hastigheder for forandringen i det i ntrace 11 ulære aminosyreforråd. Først blev det antaget, at forandringen i det intracel1 ulære forråd forekom i de første 6 timer efter operationen. Alternativt blev det antaget, at forandringen skete med en konstant hastighed over de 24 timer. Ingen af korrektionerne ændrede forholdet mellem forandringen i det intracel1 ulære nitrogenforråd og aminosyrenitrogenudstrømni ngen.

BCAA-optagelse blev ikke relateret til forøget g 1utaminfri gi -velse fra bagpartiet efter 6 og 24 timer. BCAA-optagelse var Η DK 175711 B1 Η heller ikke relateret til forandringer, som fremkom i skeletal muskulaturens intracellulære frie aminosyreforråd (r = 0,11, ikke signifikant). Bagpartiets nitrogenstrømning kunne forud-siges, og de fleste af resultaternes variabilitet kunne der 5 gøres rede for, når man anvendte både BCAA-strøm efter 6 timer og forandringen i det frie aminosyrenitrogenfor råd. Forholdene H y = -9,58 + 0,27x j + 3,02X2 jo hvor y = aminosyrenitrogenstrøm efter 6 timer, pmol/nnn/kg H xj = BCAA-strøm efter 6 timer H (pmol/min/kg) 15 X2 = forandring i skeletmuskulaturens H i ntrace 11ulære frie aminosyrenitrogen (efter operation - før operation, mmol/1/24 timer) H?0 n = 22, p< 0,05, r = 0,86

Oi skussion

Det er vist, at en standardiseret laparotomi på bedøvede hunde starter mange af de kataboliske reaktioner, der iagttages hos 25 kritisk syge mennesker. Legemets samlede proteinkatabolisme målt ved ur innitrogenudski1lel se forøges. Kontroldyrene, der I modtog saltvand, udskilte ca. 12-15 g nitrogen i de første 24 I timer efter operation. Tidligere undersøgelser med denne mo- I del har vist, at nitrogenbalancen forbliver negativ i 3 dage I 30 efter den operative procedure til trods for fødeindtagelse. C.

I R. Kapadia et al., "Alternations in glutamine metabolism in I response to operative stress and food deprivation," Surg. Fo- I rum 33:19-21 (1982). I modsætning hertil opnåede parvis fodre- I de, simu1eret-opererede dyr nitrogenligevægt på den første dag 35 efter operationen. I overensstemmelse med og bidragende til I det forøgede urinære nitrogentab var frigivelsen af totalt a- I minosyreni trogen fra bagpartiet 6 timer efter operation 6 til 8 gange det, der blev iagttaget hos kontroldyr efter faste

DK 175711 B1 I

natten over (F. Muhlbacher et al., supra). Andre forandringer I

hos saltvandsbehandlede hunde såsom et fald i blodets og ske-

letmuskulaturens aminosyrekoncentration er ligesom de ændrin- I

ger, der rapporteres under kataboliske tilstande hos mennesker

5 j. Askanazi et al., "Muscle and plasma amino acids following I

injury: influence og intercurrent infection" Ann. Surg. I

192:78-85 (1985). Således udviser hundemodellen postoperative I

reaktioner, der er ligesom ændringerne hos kritisk syge menne- I

sker, og derfor er denne model velegnet til at undersøge virk- I

10 ningerne af exogene aminosyrer på nitrogenmetabolismen og skeletmuskulaturens ami nosyreudveks1 ing.

Hos saltvandsbehandlede dyr var bagpartiets frigørelse af aminosyren i trogen mærkbart forøget 6 timer efter operation. Dette 15 var forbundet med en nettofrigivelse hos skeletmuskulaturen af alle BCAA'erne. Samtidigt var he 1b1ods-BCAA-koncentrat i oner uændrede, hvilket viser, at de indre organers forbrug af BCAA stort set var ækvivalent med den accelererede frigivelseshastighed fra skeletmuskulaturen. Hos de dyr, der modtog amino-2o syrer, var den totale aminosyrefrigivelse fra bagpartiet svækket, helblodets og skeletmuskulaturens nitrogenforråd var bibeholdt, bagpartiet var omdannet fra et organ med BCAA-frigi-velse til et, der optog samme. BCAA-optagelse og nærmere bestemt leucinoptagelse var ikke forbundet med den forøgede ske-25 letmuskulaturfrigivelse af glutamin.

Denne undersøgelse viser, at skelemuskul aturens aminosyrefri-givelse og derved nettoomsætningen af muskeprotein kan forudsiges ud fra to uafhængige målinger. Disse er hastigheden af BCAA-strømning gennem skeletmuskulaturens vaskulære leje og 30 koncentrationen af nitrogen i skeletmuskulaturens forråd af fri aminosyre. Da glutamin er den mest rigeligt forekommende aminosyre i det frie forråd, er ændringer i koncentration deraf i høj grad bestemmende for ændringerne i det samlede forråd. Faktisk forudsiger ændringer af den frie glutamin muskel-nitrogenbalancen såvel som forandringer af de samlede frie aminosyrer.

I DK 175711 B1 I

σ I

x I

m I

© I

k I

?! f- γί cm γμ γμ rvi 'P I

5? μ . «ο <o «o o o 5 I

N 2 ·»*►..·.- ·Η

-p O O O o O O I

ω J (D I

m i w I

Op I

Ό {- I

c cl

p η I

fel ^ I

c o ''W o I

•P l-i· «wr*.i*.-«©C-M I

© Ό Orv O O θ' -Η M & I

s g o - « ~ - - ϊ a .

E o o c I

O Ή «—( Q) -<-t I

W P 0 C Ό I

CM cn -η ·ρ I

P o O -P £ P I

λ: cn m f£ cn I

>i cn >i ' * o -Η I

M o cn c Μ Λ I

P ΙΟ·'; -h fe ^ I

Ό © C z OS 4¾) I

P X -H *- C C^s I

-- λ; E X <r ΓΜ © ·Ρ ·Η © I

H.fl Ό ® r-COC I

O 3 ° ^ ° ° o* ' ° - O S E I

ty p l? c Ό tn < I

c © ή c o I

•P ^ r-4 -i-C ·" M I

C >, (0 fee C fe I

« oi > ·ρ = I

·& n © — M c I

i—i cP o © -p £Ξ I

QJ -hO Ln u~i O « ui J) fl p O I

° H g o o" o o~ o % u £ w I

O X O P I

Ό Q) M - © I

O r-i P >i G Μ I

m © in ·ρ © I

© o c o c > I

Ό % O C CO O I

C i) Μ ·Ρ r—I rH I

P c Cn E (0 I

fel © Μ (0 — Μ I

C tf) < \0 40 (N ·? >9 O © I

•P ©c <j*c O' oo»PO— M I

m C? - - *- · *—i 5 >i I

fe cao o o o ^ H u η B w I

cO © © C? O I

E -w O C I

tn p s -p I

C M C E I

-P in »o o »O <rn©©cm I

C M W cO Ό I

p >i in υ u I

fy a. © © -p co I

ω £ -c o i Μ Ό I

© 5«£5«-p.*Eco I

> i I

E -??ί<ϊ?^(θ·Η'-ω I

© ri S < “ m ° 2 w * II II π

" CO *, *, < < I

> •Pc:*'*' «««<<< I

α © 5< < 5 3 υ 3 <d

Τι UPUPpOZW I

© ; Ό P α © as © ec . _ I

Λ H rP ! X *

ta q u! k k I

fe 1 o t/1· H H N Μ I

'-’t ”* ή cm <r «β I

t 41 DK 175711 B1 m -7 m m o o o o

O O O O

IL’*®« +1 4H 4-1 41 O £ ,* t n fs. o· tn *« E 3 »H«k n -7 -7 -7 E ·Η Ό tu et o o o o 0- o o ο ι

Cl (NI r-t CM (NI

-HH O O O O

-PHOJ'-'O © O O

(i) tn H^ 5 S S i! P T3 0) o< n ni η n U C Hw o o o o d” o d~ o~

ii e S

'o r-1 -4 n -7

O *H O O O O

4-> Λί "n — — - tn tn o) oi 4i 4i 4i 4i

01 e *5 tnJf g S: s S

tn hch^^j o iq I—i P I G) - Q) O 3 H o o o o

H

IX C -s % W <u 0) cm cm n m in

Ό Dl O O O O O O

rj r\ C* ·** * C Γ C OC 41 41 41 41 o η -P i—: o \o m o ^ l-l -H ni oc -7 ·-* O (ni -Ov C Z £1 ^ ~ w - 'Qj O O O O o 0) · i i · ^ k l-ι Oj 5-1 qj <D 01 £ tn * * Q< -H _i -fe -s 1-1 Qj

Ti .> I I m (Nt (NI n m m H

P -P I I 01 O o O o X? •<3> Η P 3 H 6C 41 41 41 41 Dl O'

Cnj E 4J c -H J< n « m m 3 ®-h ”5 5 S S S £,£ ή tn c t? » “ , _ _ ^ ti» Ό c o o o o Qi

(U H

Cn Ό Ό

C <D C

h t O m —t «η d 3

C I Ό II) OOO Ό -C

-P o C H *-N © O O CO) « μ h <u « * .r „7 2 λ tn -P c.t^^ ° i! i, i! x „

C Ί ¢, ® ji r-ι n (Nt 0) O

0) Z Di -P ^ to Ό <o Λ -P

§ OOO ro <u (0 P Ρ tn r>i 04 xj

—4 · O H CM C

Di OC O - - p (0 o i ^ ϋ H £ 4i 3 οι

§ C ,-ι CO m CM O 5*rS

Di 3 Π3 ε *- — * -Η Ό C CC Η >-4 n r-~ -7 -» > (5 -7 m IO Cn 44 (0

44 ni ^P

3 2| tn ot »o η» Ό « c p η Ό -P "S' > § g 3 2 S ^ £ Ή n;>^ea « « £J £ Η Μ N N Λ * 3 2 Π3 -4 cm -7 £4 l-H yj *M CM *7

I DK 175711 B1 I

I I

S °c -. r« - ~ . .... . . ~ -- r ..-.·.·. *??!„_ I

^· W »O ·4Α «» Μ* ·« QM Ο« « «Λ MA d« "* Ο·» Ν- Μ· A« , , I

(Λ ^·Ι ΟΜ «·Ι M« ΜΙ·Ι Μ*« Μ»· λΐ< >·· 4«· <«·· «« Μ«· ^«· ··· Aw #(«< 9|| I

+ 1 Ο 4 # « Λ Γ* Ν ο Ν « »« Μ__« *» *» 4» »·. ο » I

^· < 0*Α4>4··0©*».......η . . . 4Μ . > < · · W« <· . ΜΜ «· ηΜ I

Λ · Οκ* mm mø* mm mm mø* Gø* mm mørn mm* mm mm mm mm øøøm~m mm I

Μ <φ #« *«φ« AM W« <·« Μ«ι M« ««· Μ*| <««< 4«· ΝΜ «»· m« η·< Α·Ι 5» Μ* I

Ό -----------------**“- I

^· lj α Μ «Μ mm m « ··« «Λ ** Μ I

Η « a ϊ ϊ5 si i i -- 5- Ζ~ "ϋ *" Ζ* ΖΖ ΐή “s iZ ΖΖ άύ Ζ2 ήΖ s- "s. I

Η > n Si SS SS - ·· SS Si SS rt SS SS SS SS 22 SS SS S S SS £Γ. .·- I

*“I H mrnmm - MM MBM ^βββ I

Λ1 ^ * 4o ^ O «* m <* « fk ««MOP«** sj -4 00«»4*— •^^ooM^otr'Bi^Ooo^^PO'Oo^OoikMdPmPpoo·*«»*’.

rri 4o mø· mm ømm øøm mm mm + ø* mm m+» + ^ ø+m mm ø+mø+a· mm nm*mmm mm

-H .--------------------- I

«-« «Μ H« ·· · ^ · M 4*» » « ·►· O· ·* « ft ___ I

4* _ ..... <· ·» ··< ο» n· * » mm » » «* *» . * mm · · * · S* I

^· 1 · M# Pt» C· « · M · ....... · · · Q« .·ί(Ι '··(*ΝΛΛβ««« o·· I

^· s « C* Sw S* ** "** 55** S™ 3^ S- 2Λ λ ”*ί 5# β* I

v B O e» M« « Μ Λ ·« *k N Λ m__ I

^· ^s. hl · D * .· >A<a>«4lsO· ··«« .·»*♦ ..MM .#*«f»ee··«· I

^· 7 « ΜΛ·ΜΛ».Ν^»»β. ·Ν ·· .<. ..«. .. ••««B*'· I

«*η a.

^ B Μ «VI «I a Μ ·Ν Μ η «I «Α (I ^ ·· M »! · w «< η « N *1 4 ·· a·«· 4 « » *« £«·. < ·*

S Ok 0% Ο 4» p PO Ik 4* mM AA 4 «*> O I

Π « ... wa *k^ · · «<« «η ·· ·¥> ·· ·» ·· · 5 · © m m ο m p mt m o m a· · · « * · . g © .· ♦..-*». -··»·*. 0*4*©^

H rn 3 ”'" ' ™ " “ ““ _ '"' ^"'“ """'' ' 1 —— — —— — I

w u ο·νο*ορο*>««ρ < *« · r- *>« ··· m· «*« e I

pi m · > m . g m m m m m .-mm o - · <· —....... · ·· w · η» » «η 4 . η»......-»*%. .ao© .«»*<· ..poo.«·««*** ο-* -j m m mø* mm 0mm +>,m +m mm mm mm mm «m mm m— om m·* mm ' · κ 4*> λι·» «ο* ·ο*< «*ι «λ ο< — *ι «*) .. fi μ λ·. <^*ι m ·ι «·( -*·« m +· mm m

Λ ___________________1- I

m m o m *· m n m p* mm mm *\ m -+ * I

U> m m mm m øm pø w* m m m * · · . - · - o· ..·<«· . r* + I

^· f— k ^ »* « ·« o·· ·* * Λ * <·4 Q»t Μ«« 4« M« Λ« ΛΛ Λβ *β β ** ♦*> I

^· ,1^ φ«| ΟΙ»ι #)·< Μ«< Μ»ι Λ*| Μ»ι ·*ι β·· 0**1 Ο»·· ·)«! #♦> ·«» <*« "*· «*< 4*<

Η Ή m pm ο ο ι* ** m m — & I

_, mm m*m mm mm prnmpm.m mmm+mm+k+mtcpm.mp'****·-*·*^'·*-; · r“1 4** 4*< «Am o« n*i N« 4« 4N ··« ^*< «·< m*> ** " *»·**.·* +* 7\ mm·

Η Ή I — - 1— I— — - —“- 7—— —— ' —— 1 - 1 ““ '" " " '" — ‘ I

U-f ο«ο «Μ«·<«ο%·>· + m mm β—ι I

0 3 40 4 0 #4 |I*i *»« *“ "* ^ . V. «Α« · *5 ^ · · 2 « £ £ © *"* I

Μ ^ ^·ι^μ«1·> tm *· Pm m* rm mt m mi mm mm ^ mm ^ m, + m fmm· Pm·· mm·** mi m—·» ·* m mm

a ------------------- I

<u - s ss -.· ·>- _. e~ «ο rr -o rr .- ~.m. .- »*: r® s2 I

^· P 2 at Op* + rn rnm pmrmømømmmm+mmmrn mrn ømmmmmmp**f+~mm*~mmmm~*^‘ · t· · »I M *4 M «< M ο« Λ*. 4*1 4t) Otl «· «♦' «·· *« "* <·' **'

c - . S2 o.· .'o .-j -.· r- «d ·;- .. rn .-^ ~s ~2 H is *: I

^ ^ «« «4 «X* »··* βη β« «fl Λ- ·*« «· 4» Ο« ·4> 2? ? ϊ- Λ·· I

m **. mw ««· 04«· a··* «*» ιΛ·. ^·) —·« + m· m ·· mm· ··* rm m* M*. ** m* ^ mm*

g? *>· O rn^pm m mm ο I

N( ... > · *» ·· # · >« b · · mo · kw «.λ. ' ·»

m ^trt ΛΛ MM 44« k *4 ···* * · e^ 4 <Λ Λ k · · I

#4 1) k«| Μ·Ι «Μ MV «·*! MW «*» 4·· — ·· 44· Λ·* w** Μ·( ·· ^**.

H -----------------------= I

Ο Ο· Ο k# ·« · ο »-β I

_ au* ... ·· ·*η«»ο··4η ·<η· c* · 4 ‘ ‘ · · · ^ Λ ? I

- m + mm rn m m rn rm m m P* . . . . ..mm . + m m © m + ..mm · · ** ‘ 2 S « ** ^ -44·«^··4·-©25*Λ·7·^*^2*2Ζΐ,*·

»—( IMM^M I Π ®M* -^M- μμμ I

.. Op mm o *· e— mm mm. mm m mm φ · . . .»» ·4 ΛΙ4 *»4 k* · · k· · · «4 · · «»* * - *" * ‘

^ ^ A a a a .. q η β mø m mP 44 4.0 k Λ m 4 Ol I

rn 3« n. *k» 4· »« «Μ *«R k- 44 4k Of « »4 -· Λ*. 4^ ·· I

)((,^).)10^)1011(110^00^-(.40 4040()040^44^404444

I H S 0--.--:-:. .- .. .- e~ °.n .. «» .. -:- .. n, .. nn =g I

^1 *> · Ϊ5 λ" 2ί Sk «* k* ··· «4* O- 4* *4 4«4 3m «4 4· 4Λ 4k ·- ^ · I

*J I rn ·· røm· pm·· mmmrn·· øm— øøm· mm mmm*· mm· øømøøøtm*··· ο Λο »o oo JZ^l· I

*~i 0400044^ I

H m ... .Λ «4 04 40 ·* ·* . · 1^4 _ ^O · *U — 4ft 40 4(1 O at, ,, <·4Β ,··μ <>M<^Mk^

rn {. I

H u k(. 4*. 4ΐ·ο(·-(·οοΛο4ο-θ(»οοο-ο».ο4ο-οΛο-ο m m t m »«

I 3 U I: Is Is la Is 131: Ie li Ιί Is Ie 1^ la Is lliiif . I

DK 175711 B1 I

I Tabel VIII ί Aminosyreprofil for skeletmuskulatur (mmol/1, middel- I

værdi - SEM) I

. c^U-trand_1 It BCAA_ 222 BCAA_iiXiZtJ. _ I

CLN HEAA CLN HLAA I

m fost m post pre post m post m post pre post ' I

CLN 21.AB 15.86 19.85 21.?B 30.25 21.04 18.69 18.15 24.83 26.20 22.55 21.66 I

13.21 ¢3.80 13.17 12.01 il.63 11.92 13.74 *3.76 *2.72 *3.86 *3.57 *2.27

AU 5.35 5.58 4.81 5.62 5.5 9 8.11 4.71 4.69 Πβ 5715 ΖΤΤδ 4.01 I

1.55 1.88 1.44 1.39 1.23 *2.35 1.46 1.79 1.95 1.89 1,27 *1.67

CLY 2.85 2.28 4.30 3.22 3.67 3.63 4.06_ 4.52 575(1 5755 ΓΤοΒ 2.33 I

1.31 1.51 1.65 1.42 1.37 1,25 1.74 *1.15 1.31 1.17 1.63 *.82 I

ARC 1.17 0.73 0.91 0.78 1.45 2.06 1.21 1.14 1.06 0.59 1.10 0.95 I

1.24 1.08 1.21 1.03 1.41 1.51 1.14 1.15 1.20 1.13 1.39 i.35 I

SER 1.42 1.10 1.42 1.65 1.52 2.33 2 10 1.38 7755 7755 Γ55 1.34~ I

1.16 1,19 1.26 1.13 1.09 1.22 1.60 1.22 1,12 1.21 1.32 1.57 I

^j, 0.93 1.04 0.50 0.80 1.63 1.95 0.85 0.62 1.15 2.66 1.29 1.69 I

1.20 1.13 1.19 1.21 1.16 1.41 1.52 1.15 1.12 1.34 1.31 1.76 I

• c,, 0.43 0.50 0.51 0.67 0.53 0.43 0.43 0.45 0.66 9,60 0.42 0.36 I

1.05 1.07 1.07 1.08 1.04 1.06 1.09 1.08 1.15 1.18 1.09 r.09 I

6.30 3.91 4.48 4.38 11.23 9.08 I 5.96 ' 4.97 10.29 9.29 9.00 8.98 I

1.B6 1.30 1.98 1.84 1.75 11.25 1.83 11.30 1.83 *1.03 »2.08 11.98 I

„IS 0.81 0.39 0.45 0.59 0.69 0.96 0.79 D.50 0.79 0.62 0.71 0.46 I

I 1.28 1.02 1.12 1.11 1.01 1.14 «.18 1.03 1.14 1.08 1.18 1.23 I

0.17 0.13 0.27 0.24 0.36 0.36 0.32 0.27 0.33 0.22 0^29 |o,15 I

TYR t.02 1.02 1.09 1.05 1.20 1.09 1.09 l.CS 1.11 1-10 1.11 t.04 I

0."06 0.04 0.30 0.06 0.07 0.13 0.04 0.06 0.08 0.12 0.06 0.09_ I

1.03 1.02 1.02 1.04 1.01 1.01 1.03 1.04 1.0] 1.01 1.01 1.01 I

1.20 1.11 1.36 1.62 2.24 2.25 1.59 1.70 5757 5755 Ϊ75β 1.43 I

^ 1.23 1.17 1.30 1.18 1.27 1.21 1.23 1.26 1.48 1.42 1.30 1.09 0.11 0.14 0.11 0.17 0.12 0.16 0.09 0.14 I 0.13 0.16 0.10 0.15 ΎΈ£ 1.02 1.05 1.03 1.02 1.03 1.01 1.02 1.02 1.02 1.01 1.01 1.01 0.19 0.21 0.20 0.37 0 20 0.32 0.22 0.37 οΤΪΊ θ7βΟ 5755 1.01 VAL --01 S·®4 i.01 1.05 1.04 1.04 1.03 1.07 1.03 1.04 i.01 1.06 0.09 0.11 0.09 0.17 0.11 0775 0.10 0.17 θ7ΤΪ 0.27 0.10 0.29 ILE 1.003 1.02 1.01 1.03 1.03 * 02 1,02 1.03 1.02 1.03 1.003 1.02 0.16 0.28 0.16 0.23 0.18 0.21 0.16' 0.26 077? 0.42 0775 0.44 1.01 1.12 1.01 1.05 1.05 1.03 1.02 1.04 1.02 1.05 1.001 i.01 °·44 °*59 0,42 °·77 °·50 °·69 0,47 °·80 °·49 *·49 0 48 i·75 ΚΚλ 1.02 1.17 1.02 1.13 1.12 1,16 1,07 1.14 1.07 1.11 «.01 i. 07 TOTAL 69.8 52.8 63.5 68.3 96.4 82.8 65.2 62.5 B3.6 85.9 75.9 70.8 ΚΠ8ΠΖΝ 18.5 18.4 ±7.0 14.4 *5.2 *5.9 110.3 19.6 17.0 18.9 111.8 18.4 DK 175711 B1

Tabel IX:' Aminosyre strøm i bagparti (^imol/min/kg, middelværdi - SEH) I Saltvand _m bcaa 221 bcaa_uz bcaa_ CIS ΚΙΛΑ CLK ΚΙΛΑ Η 6* 34’ 6· 34· 6· 24· 6· 24* 6* 24· 6* 24· H rTU *2.69 -1.71 -1.19 -0.16 -2.10 -1.92 -1.92 -1.24 -0.73 +0.74 -2.00 -4.13 ^ CLH ti.07 i.70 t.46 1.82 1.62 11.72 60 1.44 1.60 11.76 1.32 13.45

H -2.19 -0.72 " -0.92 -0.73 -Ϊ.08 *0^95 0.98 -2.55 -0.97 -1.99 ΤΓΪ7 TTF

^ 1.32 11.26 1.23 1.44 1.28 1.2S .84 1.84 1.22 1.98 1.09 1.67 H -1.38 -0.56 ' -0^66 -θϋβ -0.86 +0.47 0.05 -0.89 -0.44 -0.78 -0.39 -0.25 ^ *· 1.36 11.05 1.20 1.31 1.19 1.72 :.40 1.53 1.14 4.39 1.21 1.25 „ -6.83 +6.12 -0.29 -0.09 ^0?T3 +0.28 -0.2B -0.26 ^Ol ^Όβ -0.13 +0.02 1.14 1.72 i.13 1.25 1.07 1.18 i.38 1.22 1.24 4.24 *0.06 1.16 H -0.49 +0.09 ' -0.11 +0.1) -0.14 +0.37 0:50 +0.65 -0.14 -0.13 " -0.22 +0.16 5EK 4.11 1.49 1.28 1.23 1.07 1. 29 :.45 1.50 1.10 4.22 1.11 1.06 +0.04 +d! 19 -0.01 +0.02 -0.00 -0.03 " -0.02 +0.00 +0.03 r0T24 70) hd709~ 1.04 1.12 1.01 4.05 4.01 4.11 :.04 4.08 1.03 4.21 1.03 1.11 I ASK *0·22 *0·14 *0.07 ‘0.14 *0.11 ·°·38 '0.15 *0·12 *0·&' ·°·32 ·°·06 *0.12 to.9 1.11 1.04 1.04 4.04 1.29 :.09 4.13 1.05 1.13 1.05 1.03 Η I CLU +0.10 +0.21 +0.06 +θΤθ8 +05 -+0.17 -0.11 +0.23 +0.16 +θ77ί ^070) -0.10 1.18 4.11 1.07 4.02 1.07 4.09 :.06 1.13 1.04 1.15 1.03 1.09 Η -.44 -0.19 -0.09 +0.08 -0 03 -0.03 -0.34 -D.24 -0.03 -0.25 -0.06 -^0.03 | HIS +,09 4.44 +.17 1.20 1.14 1.19 :.27 1.36 1.10 1.22 1.12 r.01 Η -0.26 -0.08J -0.13 -6.11 -0.13 -0.04 -θ!ΐ9~ -0.14 -0.10 -θ1ΐβ -0."’07 -0.06 Τϊ* ♦. 09 4.40 1.02 4.04 1.04 +.08 :.06 1.05 1-01 4,09 +.03 +.0 Η _ 0.05 +0.78 -0.23 +0.18 -0.27 +1.39 -0-06 +0.24 -0.08 -6.48 +0.21 -0.30 I 1Αυ +.33 42.18 +.28 4.51 +.10 +.74 ;.61 +.39 1.15 1.34 +.07 1.1 Η -0.32 -0.33 -0.23 -0 59 -0.61 -2.13 -0.74 -1.66 -D.21 -Γ.69 -0.26 -0.56 I 1.09 +.33 +.11 1.28 1.40 +1.08 :.41 +.86 1.06 +.35 1.16 1.21 Η _„Β -1.06 +0.72 -0.30 -0.27 -0.07 +1.28 -0.19 -0.13 -0.06 +0.57 +0.28 +0.27 | 1.10 1.Β6 +.13 1.32 1.43 +.67 :.37 4.46 4.13 4.35 +.17 +.1 Η -0.37 -0.20 -0.12 -0.19 -0.13 -0.12 -0.14 -0.13 -0.14 -0.27 -0.07 -0.16 ΡΗΣ +0.5 4.36 +.04 +.08 +.03 4.03 :.09 4.15 4.0Β +.15 4.03 +.12 I VA? ·°·*6 +0.33 40,14 +0·02 +0,31 +0·4® *°·62 4112 *0·67 +0.37 41,34 41,26 ! “· 4.17 +.68 1.08 4.11 4.26 1.23 1.46 +1.01 1-23 4.45 4.17 1.65 Η I ... -6.24 +0.12 +0.66 +0.06 +0.27 +0.42 +0.49 +0.39~ +0.42 +675Ϊ +775 +0.97 AU- 1.03 1.30 1.02 4.08 4.19 1.15 1.21 4.15 4.04 +.21 1.07 +.48

I -0.43 +0.04 ' +0.06 -0.08 +0.30 +0.50 +0.51 +0.57 +d'.61 +0.69 '+1.14 +J.+A

4.09 1.54 +.07 1.08 1.25 4.24 1.33 +.39 1.06 +.33 +.13 1-68 I TOTAL -1.14 +0.49 +0.28 -0.03 +0.88 +1.40 +1.64 +2.09 +1.71 +1.57 +3.28 +3.67 BCAA 4.26 11.51 +.14 1.19 1.57 4.50 1.86 11.54 +.22 +.83 1.18 11.43 I i TOTAL -19.05 -3.59 -6.52 0?25 ^7735 ΠΤβδ -7.70 -8.42 ””-2TS0 ^7776 oTT? · 7.60 <Π$ΟΣΝ 14.06 412.1 41.81 43.07 1.52 46.40 |ι5.«0 41.90 +2.50 *8.70 41.62 42.91 45

Eksempel 6 DK 175711 B1

Virkningen af glutaminberiget oral kost på tyndtarm efter intestinal resektion 5

Inledni na

Kompenserende vækst af tyndtarmen efter partiel resektion involverer alle belægninger af tarmvæggen, men er dominieret af villus-hyperplasi . Forøget højde af tarmtrævler (villi) og 10 kryptdybde er ledsaget af en udspil ing og forlængelse af den tilbageværende tarm, R. C. N. Williamson, "Intestinal adaption," N. Engl. J. Med., 298: 1393-1444 (1978). Resektion af tyndtarmen er efterfulgt af tilpassende morphologiske og funktionelle ændringer. Oral indtagelse har vist sig at være en 15 vigtig stimulans til reguleringen af siimhindehyperplasi efter intestinal resektion, 6. M. Levine et al., "Smal 1-bowel resection, oral intake is the stimulus for hyperplacia," Dig. Dis.

21: 542-544 (1975). Luminale næringsstoffer er vigtige til opretholdelse af normal slimhindevækst, og hvis der ikke opret-20 holdes oral indtagelse efter resektion af tyndtarmen, taber den tilbageværende tarm sin vægt og bliver hyperplasi sk. Patienter med kort tarm efter resektion af tyndtarmen understøttes ved parenteral ernæring; deres overlevelse afhænger af det tilbageværende tarmsystems tilpasningskapacitet. Anvendelsen 25 af elementær kost og parenteral ernæring giver tilstrækkelig tid til udviklingen af tarmens tilpasning og en langsomt tilbagevenden til fuldstændig oral indtagelse E. Weser, "The management of patients after small bowel resection," Gastroenterology 71: 146-150 (1976).

3 0

Glutamin er et vigtigt brændstof for enterocytter, og dens udnyttelse af tarmen ses at stige efter kirurgisk stress, W. W. Souba et al., "Postoperative alteration of arteriovenous exchange of amino acids across the gastrointestinal tract," 35 Surgery 94(2): 342 (1983). Glutamin kunne tjene som en lokal trofisk faktor, der fremmer slimhindevækst, når der udvikler sig intestinal hypoplasi. Denne undersøgelse viste, hvorvidt t i 1 sætni ngen af glutamin til en elementær kost var forbundet

I DK 175711 B1 I

I I

med nogen fordele med hensyn til tilpasning og restitution af I

tyndtarmen efter subtotal resektion. Undersøgelsen var udfor- I

met til at fodre rotter med en glutaminberiget elementer kost I

efter resektion af to tredjedele af tyndtarmen. Slimhindens I

5 tilpasning i den tilbageværende tarm sammenlignedes med grup- I

per med kontrolleret kost og simuleret operation. I

I Materialer oq metoder I

H Hanwi starrotter med en vægt på 175-200 g blev købt fra The I

10

Charles River Breeding Laboratories, Inc., og fik lov til at

I akklimatisere i 5 dage. Rotterne blev forsynet med fri adgang I

tilvand og fodredes med Purinafoderkost. De blev holdt i in- I

I dividuelle bure og blev vejet hver anden dag. Efter akklimati- I

sering blev rotterne med normal vægttilvækst fordelt tilfæl- I

15 I

digt i 4 grupper.

På den første undersøgelsesdag blev rotterne bedøvet med in- I

I traperitoneal indsprøjtning af pentobarbital (50 mg/kg). Bugen I

I blev åbnet ved midteriinieincision, hele tyndtarmens længde I

I 20 fpa Treitzes ligament til den bauhinske klap blev udtaget og I

I målt to gange uden strækning med en lang sort tråd. Middelvær- I

dien af de to målinger blev bestemt. Derefter udførtes en re- I

I sektion af to tredjedele af tyndtarmen begyndende 5 cm distalt I

I fra Treitzes ligament ved den metode, der er beskrevet af R. I

I 25 Lambert, "Surgery of the digestive system of the rats," Char- I

I les C. Thomas, Springfield, Illinois, side 32-35, 413-416 I

(1965). Resektionsrandene blev anastomoseret ende mod ende med I

I 6-0 prolene. Tarmen blev igen placeret i bughulen, og bughule- I

I væggen lukkedes med 2-0 prolene. Kontrolgruppen blev Simula- I

I 30 tionsopereret, idet de underkastedes transektion og genanasto- I

I mose af tyndtarmen på det distale sted to tredjedele af den I

I samlede længde målt begyndende 5 cm distalt for Treitzes liga- I

ment. Rotterne holdtes i individuelle bure efter operation og I

I fik lov til at drikke vand på den første dag efter operatio- I

I 35 nen. I

I Oral fodring startedes fra den anden dag efter operationen. I

I Rotter i gruppe I blev forsynet oralt med glutaminberiget ele- I

47 DK 175711 B1 mentarkost (4,18%), og rotter i gruppe II blev forsynet med glycinberiget elementarkost (4,18%). Rotter i gruppe III (rotter underkastet resektion) og rotter i gruppe IV (rotter underkastet s imulat ionsoperati on) fodredes med en ordinær foder-5 kost. Fodringen fortsattes i 7 dage, og deres daglige legemsvægt blev registreret, indtil dagen for indhøstning af prøver.

Fremstilling af qlutamin- og g 1 ve in-e1ementarkost

Eleme’ntarkosten (NBCn B i ochemi ca 1 s, Inc., Cleveland, Ohio) in- 10 deholder 0,2% cho1 inch1 or id, 10% majsolie, 46,9% dextrinhvidt, 23,4% saccharose, 5% saltblanding, 0,5% vitaminblanding og 9,82% af 17 slags essentielle og ikke-essentielle aminosyrer.

Glutamin- eller glycinpulver blev sat til den elementære kost for at give 41,8% glutamin- eller glycinberiget elementarkost, 15 dvs. 28% af de samlede aminosyrer.

Procedurer til indhøstninq af prøver

Efter 7 dages fodring blev rotterne aflivet. De var bedøvede 9Q med intraperi toneal indsprøjtning af pentobarbital (50 mg/kg). Bugen blev åbnet, og incisionen blev udstrakt til brysthulen.

5 ml blod blev udtrukket ved punktur af højre ventrikel til bestemmelse af koncentrationen af blodammoniak og plasmaglu-tamin. Tarmen blev udtaget straks efter udtrækning af blod.

25 Hele tyndtarmen fjernedes med omhyggelig fraskillelse af me-senteriet holdt tæt til tarmslimhinden. Den fjernede tarm ophængtes under fast træk på 4,5 g og 9 punkter markeredes. For rotterne med tarmresekti on afmærkedes punkter 5, 10 og 12,5 cm proximalt af anastomosen, der repræsenterede det proximale je-3Q junom og distale duodenum, og punkter 2, 5 og 10 cm distalt for anastomosen, der repræsenterede, det tilbageværende proximale ileum tæt ved anastomosen, og punkter 5, 10 og 15 cm proximalt til den bauhinske klap, som repræsenterede det tilbageværende distale ileum ved hjælp af lige nåle ført gennem tar-35 men. De seks tarmsegmenter blev adskilt. For rotter i den simulationsopererede gruppe blev de proximale to segmenter mærket fra 1 cm distalt til Treitzes ligament og målt opad. Segmenter la, 2a og 3a skylledes i afkølet saltvand og blev lagt

DK 175711 B1 I

i 10% pufret formalin i 4 timer og derefter overført til 70% H

ethanol til fiksering. Segmenterne lb, 2b og 3b skylledes i H

afkølet saltvand, deres lumen blev åbnet, og deres våde vægt H

blev vejet. Tarmsegmenterne overførtes til 5 ml afkølet salt- H

5 vand og hakkedes med en skarp saks. Oer fremstilledes et homo-

genat under anvendelse af to 15 sekunders perioder på en Poly- H

tron homogenizer (Brinkman Instruments, Westbury, NY), efter- H

fulgt af lydbehandling med en sonikator (Heat System Laborato- H

ries, Plainview, NY) ved en kraftindsti 11 ing på 2 i 30 sekun- I

10 der. Saltvandshomogenaterne til analyse for DNA og protein H

blev opbevaret med -30°C. H

Analytiske metoder H

Tarmhomogenaterne analyseredes for totalt proteinindhold ved H

15 metoden ifølge 0. H. Lowry et al., "Protein measurement with

the Folin phenol reagent," J. Biochem., 193: 265-275 (1951). H

DNA bestemtes ved metoden ifølge K. Burton, "A study of the H

conditions and mechanism of the di phenyl am ine reaction for the H

colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid" Biochem., H

20 62: 315-323 (1965). Histologiske snit blev nedlagt i paraffin,

farvet med hematoxylin og eosin og undersøgt i et lysmikroskop H

ved en forstørrelse på 40 gange. 20 repræsentative, store, H

velorienterede fuldstændige tarmtrævler udvalgtes til at måle H

s 1 imhindetykke 1 se og tarmtrævlehøjde under anvendelse af et H

okularmikrométer, og der blev opnået en gennemsnitsværdi.

Tarmt ræv 1eanta 11 et taltes med tarmen anbragt i den centrale H

vandrette linie i feltet med 40 gange forstørrelse. H

Resul tater H

Fig. 7 viser, at den glutam i ntilførte kost giver højere plas- H

mag 1 utam inniveauer. Baseret på målinger af vægt/cm (fig. 8) H

ses der at være en lille forskel mellem den g 1utaminsupp1erede H

(+GLN) og glutaminfri kost, idet de begge understøtter mindre H

35 tarmhypertrofi end normalt foder. Ved undersøgelse af tarm- H

slimhinden ved måling af slimhindetykkelsen (fig. 10) og tarm- H

trævlehøjde (fig. 11) viste den giutaminti 1 førte kost sig H

imidlertid at være overlegen. H

Eksempel 7 49 DK 175711 B1

Bevarelse af tyndtarmens slimhinde under anvendelse af olutaminberiqet parenteral ernærino 5

Parenteral ernæring giver slimhindeatrofi i tyndtarmen (L. R.

Johnson et al., Gastroenterology 68: 1177-1183 (1975)). Denne reaktion kan være forbundet med fald i gastrointestinale sekreter og trofiske hormoner og også en relativ mangel på specifikke næringsstoffer, der kræves til formering af enterocyt- 10 ter. Glutamin er et oxidativt hovedbrændstof for tyndtarmen, men er ikke til stede i parenterale standardopløsninger. Til bestemmelse af g 1utaminkosts indflydelse bedømtes tyndtarmens reaktion på indgivelse af parenterale opløsninger beriget med varierende koncentrationer af denne aminosyre.

15

Materialer og metoder

Tilpassede hanwistarrotter (n=42, vægt 210-230 g) underkastedes indføring af kateter i halsvenen, og de blev forsynet med ,0 et svingarrangement, der muliggør langvarig infusion til ikke-fastholdte dyr (Μ. E. Burt et al., J. Physiol. 238: H599-603 (1980)). Alle rotter blev holdt i individuelle metabolismebure og fik adgang til drikkevand. Kontroldyr modtog 0,9¾ saltvandsinfusion og Purina rottefoder ad libitum. Tre grupper 25 rotter modtog intravenøs ernæring. Alle næringsopløsningerne var isonitrogenholdige (0,9 g nitrogen/100 ml) og isokalorie-holdige (98 Kcal/100 ml) og indeholdt lige store koncentrationer af essentielle aminosyrer, ikke-essentiel le aminosyrer og dextrose. Bestanddelen af ikke-essentielle aminosyrer i hver 3Q opløsning blev indstillet for at give g 1 utam inkoncentrat i oner på 0,2 eller 3 g/100 ml. Parenterale opløsninger blev infun-deret med en hastighed på 48 ml/24 timer. Urinudskillelse og nitrogenudskillelse måltes dagligt. Dyrene aflivedes efter 7 dage med parenteral ernæring, og blod blev udvundet til be-35 stemmelse af glutamin- og ammoniak-koncentrationer. Der blev opnået fuld tykkelse af jejunalsegmenter og siimhindeprøver ud fra afgrænsede sektioner af tarmen. Alle prøver vejedes, og homogenater analyseredes for DNA og protein. Histologiske pa- ___,_

I DK 175711 B1 I

Η I

raffinsnit med en tykkelse på 5 μ blev præpareret. Målinger af I

jejunal villushøjde, antal og slimhindetykkelse udførtes som I

blindprøver, dvs. uden kendskab til de enkelte prøvers oprin- I

delse. I

H 5 I

Resultater og diskussion I

Vådvægt, DNA, protein og villushøjde faldt hos alle rotter, I

der modtog intravenøs ernæring, sammenlignet med kontroldyr, I

der var fodret oralt (tabel X). P1 asmag 1 utam i nkoncentrat ionen I

io I

steg efter infusion af opløsninger, der indeholdt glutamin. I

Jejunalslimhindevægt steg signifikant sammenlignet med rotter, I

der modtog glutaminfrie opløsninger. Vægten af jejunum i fuld I

H tykkelse havde tendens til at stige med glutaminindtagelse, I

skønt reaktionen ikke var statistisk signifikant. DNA både i I

15 I

slimhinde og i den fulde tykkelse af jejunum steg efter gluta-

mininfusion i koncentrationer på 2 og 3%. Disse ændringer var I

ledsaget af histologiske tegn på slimhindevækst. Villushøjden I

og slimhindetykkelsen steg på en dosisafhængig måde proporti- I

onalt med mængden af indgivet glutamin. Alle dyr havde positiv I

20 I

nitrogenbalance, men rotter som modtog opløsninger med 2% glu- I

tamin bibeholdte den største mængde nitrogen under hele under- I

søgelsen. I

Tilvejebringelse af glutamin i parenterale opløsninger giver I

25 en forøgelse af den jejunale slimhindevægt, DNA-indhold og I

villushøjde, når dyrene holdes på intravenøs ernæring. En for- I

øgelse af slimhindemassen i tyndtarmen kan forbedre tyndtar- I

I mens funktion og lette indføringen af enteral ernæring. Gluta- I

H min kan være et næringsstof, der er nødvendig til understøt- I

H 30 telse af slimhinden, som ikke for tiden er til stede i paren- I

I terale standardopløsninger. I

35 I

Tabel X

DK 175711 B1 51 _o SIN_2% GLN_3¾ GLN Foder 5 (n110) (n = ll) (n = 10) (n = ll)

Plasma GLN 890,3+42,4 1105,8+98,81 717,1+46 (amol/1) Vægt af fuld 30,6±0,8 31,411,0 32,0+0,6 46,6+3,6 tykkelse 10 (mg/cm) SIimhindevægt 17,7+0,7 20,4+1,12 20,311,02 29,3+2,3 (mg/cm)

Jejunalt-DNA 252,8±9,5 279,9±7,32 303,1±19,41 370,2±33,0 (pg/cm) 15 SI imhinde-DNA 101,7 + 5,9 134,0±7,13 125,1±7,62 171,0±12,7 (Mg/cm)

Villushøjde 266,5±8,4 294,017,92 306,419,93 405,6+17,3 (Mm)

Slimhinde- 422,6+9,7 448,1+8,91 452,6+11,51 589,6120,9 20 tykkelse (Mm)

p< 0,05, 2 p< 0,025, 3 p<0,005 overfor O GLN

2 GLN s glutamin.

25

Eksempel 8

Virkning af qlutaminberiqet parenteral ernær i na efter behandling med 5-fluorurici1 30 3

Tilsætning af aminosyren glutamin (GLN) til ernæringsopløsninger forøger signifikant tarmens cellularitet under parenteral fodring. For at bestemme GLN’s virkning på siimhinderegnere-ring efter skade blev 5-fluoruricil (5FU) indgivet til rotter, der modtog parenteral ernæring (PN). Efter indføring af kate- 3 5 ter i halsvenen modtog hanwistarrotter (n=40, vægt 200-230 g) en kontinuerlig infusion af isonitrogenholdige, isokaloriehol-dige opløsninger med (+) eller uden (-) GLN. 5FU blev indgivet

I DK 175711 B1 I

I 52 I

i stigende doser (0, 100, 150 mg/kg i.p.) til 24 dyr ved star- I

I ten af PN (kort tid) og til yderligere 16 dyr (150 mg/kg), som I

havde modtaget PN i 5 dage før behandlingen (lang tid). Ved I

I forsøgets afslutning, 4 dage efter 5FU måltes WBC, Hb, blod- I

I 5 plader og plasma-GLN, jejunomprøver afvejedes, analyseredes

H for DNA og protein, og der fremstilledes histologiske snit. En I

I del af resultaterne er vist (middelværdi ± SEM, * p< 0,05, ** I

I p< 0,025 sammenlignet med -GLN). I

jo Kortvarig parenteral Langvarig paren- I

ernæring teral ernæring I

I 0 mg/kg 5FU 150 mo/ko 5FU 150 mg/kg SFU I

-GLN tGLN -GLN + GLN -GLN +GLN I

I Overle- 100% 100% 85% 85% 25% 75% I

I 15 velse I

I Slim- 22,6+1,1 28,1±1,8* 15,6±1,4 22,7+3,1** 10,7+1,0 15+1,0** I

hinde- I

vægt I

(mg/cm) I

20 Slim- 151,7±7,4 188 + 13,5* 79,9±6,7 113,7±19,7* 59,218,3 72,7 + 5,2 I

I I

I pg/cm I

I Slim- 2,56+0,1 2,94+18 1,3+0,06 1,9610,3** 0,75+0,3 1,11+0,1 I

hinde- I

25 protein I

5FU-behandling formindskede tarmvægten, DNA og protein. Rot- I

ter, som modtog GLN, havde signifikant større slimhindemasse I

sammenlignet med dyr, som modtog standardopløsning. Tilsætning I

af GLN var forbundet med en forøget overlevelse hos dyr under I

30 den langvarige behandling. Tilvejebringelsen af GLN i nærings-

opløsninger forbedrer tyndtarmens cellular itet og modificerer I

den gastroentestinale giftighed af 5FU. En sådan behandling I

kan formindske sygeligheden og dødeligheden hos patienter,

hvis gastrointestinale barriereforsvar er beskadiget. I

I

Idet opfindelsen nu er fuldt beskrevet, vil det være klart for I

fagfolk, at der kan foretages mange forandringer og modifika- I

tioner deraf, uden at man derved går uden for opfindelsens ånd I

og rammer. I

Claims (14)

1. Anvendelse af glutamin eller en funktionel analog deraf som bibeholder gluta-5 mins egenskaber ved fremstilling af et middel til behandling af atrofi i skeletmuskulatur og/eller i tarmens slimhinde, hvilken atrofi er forårsaget af katabolisk dysfunktion.

2. Anvendelse ifølge krav 1 hvor indholdet af glutamin eller en funktionel analog deraf i det fremstillede middel er større end den, der normalt er til stede i normal kost. 10

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2 hvor indgivelsen af en terapeutisk effektiv mængde glutamin eller glutaminanalog er enteral eller parenteral.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvor den forekommende atrofi i tarmens slimhinde 15 er væsentligt forbundet med intravenøs fodring.

5. Anvendelse ifølge krav 1, 2 eller 3, hvor atrofien forekommer efter fysisk trauma.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor det fysiske trauma er forbundet med kirurgi, sepsis, brandsårslæsioner, anoreksi, kemoterapi, strålebehandling eller ukontroleret diabetes.

7. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1 - 6, hvor indgivelsen sker 25 ved anvendelse af et kosttilskud.

8. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 3-6, hvor den parenterale indgift er ved subkutan, intramuskulær eller intravenøs injektion, nasepharyngal eller mukosal absorption eller ved transdermal absorption. 30 DK 175711 B1 I

9. Anvendelse ifølge krav 3, hvor midlet tilvejebringes i en form velegnet til en- I teral administration af 0,3 - 2,0, fortrinsvis 0,3 - 1,5, og især 0,4 - 1,0 g glutamin eller I giutaminanalog per kg legemsvægt per dag.

10. Anvendelse ifølge krav 3, hvor midlet tilvejebringes i en form velegnet til pa- I renteral administration af 0,2 - 3,0, fortrinsvis 0,3 - 2,5, og især 0,4 - 2,0 g glutamin I eller glutaminanalog per kg legemsvægt per dag. H

11. Anvendelse ifølge krav 1, til fremstilling af en beholder til et flydende præpa- I 10 rat tilpasset til intravenøs indgift, hvilken beholder omfatter et reservoir for præparatet I og væskeoverføringsorganer forbundet med reservoiret, hvilke væskeoverføringsorga- I ner er i stand til at blive fastgjort til en nål til intravenøs indgivelse, hvilket præparat I omfatter en mængde glutamin eller glutaminanalog, der er i stand til at inhibere katabo- I lisk dysfunktion. H

12. Anvendelse ifølge krav 1, til fremstilling af et dyrefoder til normal fodring el- H ler til enteral eller parenteral fodring, hvor foderet indeholder glutamin eller glutamina- H nalog i en mængde, der er større end den, der er indeholdt i normalt foder. I

13. Anvendelse ifølge krav 12, hvor dyrefoderet til enteral administration indehol- I der 0,3 - 2,0, fortrinsvis 0,3 - 1,5, og især 0,4 - 1,0 g glutamin eller glutaminanalog per I kg legemsvægt per dag eller til parenteral administration indeholder 0,2 - 3,0, fortrins- vis 0,3 - 2,5, og især 0,4 - 2,0 g glutamin eller glutaminanalog per kg legemsvægt per I dag.. · I

25 I