NO871935L - Fremgangsmaate for behandling av katabolisk dysfunksjon. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse ble understøttet av forsknings-bevilgninger fra the National Institutes of Health, Trauma Center, Grant No. GM29327-05, og the United States Department of the Army, Contract No. DAMD-17-81-C-1201, som gir the United States Government visse rettigheter i oppfinnelsen.

TVERRHENVTSNING TIL BESLEKTET SØKNAD

Dette er en delvis fortsettelse av søknad nr. 775.214, innlevert 12. september 1985.

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for behandling eller hindring av vevødeleggelse i et dyr som er plaget av katabolisk dysfunksjon.

Kataboli ske-dysfunksjoner er de fysiologiske tilstander i hvilke det opptrer nedbrytning av en anatomisk struktur. Anatomiske strukturer som vanligvis påvirkes på denne måten er skjelettmuskler og tarmepitel. Slik katabolisk aktivitet forekommer ofte etter kirurgi, sepsis, brannsår, cancer-kjemoterapi, strålingsterapi/skade, glukokortikoidterapi eller, ofte, utilstrekkelig næringsinntak. Slike kataboliske dysfunksjoner er en hovedårsak til død og funksjonshemming og erkarakterisert vedunormal glutaminmetabolisme.

Glutamin er en ikke-essensiell aminosyre som kan syntetiseres av de fleste vev. Til forskjell fra de fleste aminosyrene har glutamin to amingrupper, en cx-aminosyre og en amiddddgruppe. Det er nærværet av amidgruppen som gjør glutamin i stand til å fjerne ammoniakk fra det perifere vevet i legemet og transportere nitrogen til innvol1sorganene. I tillegg er det vanlig for vev som fjerner glutamin fra sirkulasjonen å anvende karbonskjelettet til energi.

Glutaminase og glutaminsyntetase er de to viktigste enzymene som er innbefattet i reguleringen av glutaminmetabolismen. Glutaminase katalyserer hydrolysen av glutamin til glutaminat og ammoniakk, mens glutaminsyntetase katalyserer syntesen av glutamin fra glutamat og ammoniakk. Mens de fleste vev har begge disse enzymene, er vanligvis den ene mer aktiv enn den andre, avhengig av det spesielle vevet.

Glutaminsyntese og -avgivelse opptrert primært i skjelettmuskelen og hjernen. I sin tur forbrukes glutamin av slike reproduserende celler som fibroblaster, lymfocytter, tumor-celler og tarmepitelceller. Det er karakteristisk at disse cellene har høye nivåer av glutaminaseaktivi tet og lave nivåer av intracellulært glutamin. Dette faktum kan også være klinisk signifikant for pasienter med store sår, inflammasjon forbundet med infeksjon eller en gastrointestinal dysfunksjon som utelukker normal enteral nærringstilførsel, siden den ønskelige utvikling av celler i disse celletypene og under disse tilstandene kan avhenge av tilgjengeligheten av tilstrekkelige mengder glutamin.

I mage/tarmkanalen anvendes glutamin som respirasjonsbrensel. Den enterale administrasjonen av glutamin resulterer i øket opptak av- luminalt glutamin av tarmslimhinnen fulgt av en øyeblikkelig minskning i opptak av glutamin fra sirkulasjonen. Tarmens forbruk av glutamin balanseres mellom disse to glutaminkilder.

Det meste av det glutamin som opptas av mage/tarmkanalen foregår via de epitelceller som vekker tynntarmens villi. Den glutaminmetabolisme som foregår i tynntarmen utgjør hoved-energikilden for tarmene og produserer forløpere for hepatisk ureagenese og glukonogenese ved å utnytte nitrogen og karbon fra andre vev.

Bevis for glutaminets essensielle rolle ved bibehold av normal tarmstruktur og -funksjon ble gitt av Baskerville et al., British Journal of Experimental Pathology, 61.: 132

(1980). Disse forskerne senket konsentrasjonen av plasma-glutamin til upåvisbare mengder ved å infusere renset glutaminase i rhesus-aper, silkeaper, kaniner og mus. Som et resultat av denne behandling oppviste disse dyrene oppkast, diaré, villus atrofy, slimhinnesår og tarmnekrose.

Martin et al., (US patent 2.283.817) beskriver et preparat som inneholder glutamin og som anvendes som et avgiftnings-middel istedenfor som et diettsupplement. I patentet kombi-neres glutaminsynergistisk med andre aminosyrer for å virke direkte på et toksin for å hindre enhver skadelig effekt.

I Shive et al. (US patent 2.868.693) beskriver patenthaverne glutaminholdige preparater for behandling av magesår.

Ytterligere bevis på den potensielle beskyttende effekten til glutamin blé"*vist av Okabe et al., Digestive Disease, 20: 66

(1975), som fant at glutamin kunne beskytte mot aspirin-induserte magesår hos mennesker.

Dette glutaminbehovet hos innvollene kan være enda større under kritisk sykdom, når det er kjent at glutaminmetabolismen t tynntarmen økes (Souba et al., Surgery, 94( 2): 342

(1983)).

Næringsbehovet hos pasienter som ikke på tilfredsstillende måte kan tilføye seg selv næring, tilfredsstilles for tiden ved administrasjon av enterale eller parenterale dietter. Enterale dietter administreres vanligvis ved bruk av rør med liten diameter som plasseres gjennom nesen inn i mage- eller dé duodenåle områdene, eller ved kirurgisk implantering som f.eks. i gastrostomi eller jujunostomi. De enterale blandingene som for tiden er tilgjengelige, kan oppdeles i fire grunnkategorier: elementære, polymere, modulære og forandrede aminosyrer.;Disse blandingene inneholder' glutamin."De mengder av næringsmidler som er tilstede i de enterale diettene er imidlertid generelt basert på diettbehovet til et normalt individ og ikke til en pasient som lider av en katabolisk sykdom. •' " '-•'- '"■ ■'-" '- Elementærblandinger krever minimal fordøyelses innsats og består primært av små peptider og/eller aminosyrer, glukose-oligosakkarider og vegetabilsk olje eller triglyserider med middels kjedelengde.

I polymere blandinger anvendes komplekse næringsmidler som f.eks. soyaprotein, laktalbumin eller kasein som en kilde for protein, maltodekstriner eller maissirup-faststoffer som karbohydratkilde og vegetabilske oljer eller melkefett som fettkilde.

Modulære dietter kan fremstilles ved å kombinere protein, karbohydrat eller fett med en monomer eller polymer blanding for å tilfredsstille spesielle ernæringsmessige krav.

Blandinger som er sammensatt av forandrede aminosyreforbin-delser anvendes primært for pasienter med genetiske feil ved nitrogenmetabolism eller ervervede forstyrrelser ved nitrogenakkumulasjonen, idet formålet her er å begrense pasientens- inntak av visse aminosyrer som kan være skadelige.

Parenterale dietter administreres vanligvis intravenøst. Disse intravenøse væskene er sterile løsninger bestående av enkle kjemikalier som f.eks. sukkere, aminosyrer og elektro-lytter, som lett kan assimileres.

Uttrykket "total parenteral ernæring" (TPN) anvendes for å beskrive blandinger for bruk hos pasienter som får tilfreds-stilt hele sitt diettbehov intravenøst. Blandinger for total parenteral ernæring, til forskjell fra enterale blandinger, inneholder normalt ikke glutamin. Fraværet av glutamin fra parenterale blandinger er delvis forårsaket av dets instabi-litet ved romtemperatur, og den resulterende generering av ammoniakk og pyroglutaminsyre. Det har også vært en del bekymring når det gjelder generering av glutaminsyre fra glutamin på grunn av den potensielle toksisiteten til glutaminsyre som en neurotransmitter. Disse bekymringene later imidlertid ikke til å være berettigede. Ved et pH like\inder nøytralitet nedbrytes glutatmin meget langsomt (Souba, S.C.D. Thesis in Harvard Medical School Library, Juni 1984).

Total parenteral ernæring resulterer i villus atrofi, et fenomen som generelt er reversibelt når tilførsel av ernæring gj ennom munnen gjenopptas. Siden TPN-blandinger mangler glutamin, må kroppens behov når det gjelder denne aminosyren tilfredsstilles ved syntese i kroppsvev.

Hos pasienter med kritiske sykdommer, er netto proteinkatabolisme forbundet med markert forminskede muskelglutamin-lagre (Askanazi et al., Annals of Surgery, 192: 78 (1980); Askanazi et al., Annals of Surgery, 191: 465 (1980 )), reduserte glutaminplasmanivåer (Askanazi et al., Annals of Surgery, 192: 78 (1980); Askanazi et al., Annals of Surgery, 191: 465 (1980)), og en forventet økning i tarmens glutamin-utnyttelse (Souba et al., Archives of Surgery, 120: 66

(1985); Souba et al., Surgery, 94( 2): 342 (1983)). Det er kjent at glukokortikoider øker glutaminforbruket i tynntarmen (Souba et al., Surgical Forum, 34: 74 (1983)).

Ingen av de kjente undersøkelsene har vist at nedbrytningen av skjelettmuskelen, atrofien i tarm-villi eller andre kataboliske dysfunksjoner , som forekommer under total parenteral ernæring, kan hindres ved administrasjon av høye nivåer av glutamin..

I oppfinnelsen,, hvis et dyr som har, eller har en risiko for å ha, en katabolisk dysfunksjon, en terapeutisk effektiv mengde glutamin." Denne mengden glutamin er større enn den som normalt -forekommer i dietten til friske individer. Denne økede mengden glutamin er nødvendig for å kompensere for det større behovet for glutamin som forekommer under visse kataboliske dysfunksjoner. I fravær av eksogent glutamin under disse kataboliske dysfunksjonene, ville glutamin dannes ved nedbrytning: av muskelvev. Minskning av glutaminkonsen- trasjoner i plasma på tross av akselerert glutaminfrigjøring fra muskelen under kataboliske dysfunksjoner, indikerer systemisk glutaminmangel. På tross av akselerert glutamin-frigjøring fra muskelen, overstiger behovet hos cellene i tarmslimhinnen tilførselen. Dette predisponerer i sin tur for tarm-villus-atrofi.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte for behandling av kataboliske dysfunskjoner hos et dyr som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde glutamin eller funksjonelle analoger derav til dyret.

Tilveiebringelse av eksogent glutamin til en stresset pasient kan bedre understøtte de metaboliske behovene i tynntarmen og muligens minske hastigheten ved systemisk proteinkatabolisme. Tilveiebringelse av glutamin hos pasienter med inflammatorisk innvollssykdom kan også være nyttig.

Det antas at den terapeutiske effektiviteten til glukokortikoider ved inf 1 ammator 1 sk innvollssykdom ikke bare er forbundet med deres anti-inflammatoriske egenskaper, men også til deres rolle ved å øke substratmetabolisme i enterocyttene i tarmepitelet. Administrasjon av eksogent glutamin kan tilveiebringe enda mer substrat for enterocyttene og kan også hindre glutaminmangel i plasma og skjelettmuskel. På lignende måte kan glutamin bedre overlevelsesevnen til transplantert tynntarm eller understøtte tarmmetabolisme hos barn med tarmumodenhet.

Figur 1 viser nitrogenbalansen avsatt som en funksjon av

nitrogeninntaket.

Figur 2 viser grafisk data som er generert i eksempel 5, som sammenligner totalmengden forgrenet aminosyre (BCAA) i arterielt blod med administrasjonshastigheten for BCAA. Data som representerer middels ± SEM. Data fra dyr som mottar saltløsning er ikke Inkludert. Figur 3 viser grafisk data generert i eksempel 5, som sammenligner forholdet mellom BCAA-strøm (bakdel) og

BCAA-infusjon.

Figur 4 viser grafisk data generert i eksempel 5, som sammenligner BCAA-strøm (bakdel) 6 timer etter operasjon og økningen i konsentrasjon av BCAA når det gjelder arterielt blodnivå. Figur 5 viser grafisk data som er generert i eksempel 5, som sammenligner nitrogenstrøm (bakdel) og BCAA-strøm (bakdel) seks (6) timer etter operasjon. Figur:. 6 viser grafisk data generert i eksempel 5, som ;..'„ ■r sammenligner, nitrogenstrøm (bakdel) seks (6) timer ; etter operasjon og forandringen i intracellulært

aminosyrenitrogen i muskelen målt 24 timer etter

..operasjon.

Figur 7 viser grafisk effekten av oral diett på plasma--glutaminnivåene etter subtotal tynntarmreseksjon. Figur 8 viser grafisk data som demonstrerer virkningen av oral diett på distal ileum-vekt etter subtotal /.tynntarmreseksjon. Figur -9 viser grafisk data som demonstrerer virkningene av oral diett på muskularis-tykkelse i distal ileum etter subtotal reseksjon av tynntarmen. Figur .10 viser grafisk data som demonstrerer virkningen av r>.'- y:r- •'■ oral diett på slimhinnetykkelse i distal ileum etter

subtotal reseksjon av tynntarmen.

Figur 11 viser grafisk virkningen av oral diett på villus- høyde i distalt ileum etter subtotal reseksjon av tynntarm.

Oppfinnerne har oppfunnet en ny fremgangsmåte for behandling av kataboliske dysfunksjoner. Foreliggende oppfinnelse omfatter administrasjon til et dyr som lider av, eller sannsynligvis vil utvikle, en katabolisk dysfunksjon, en terapeutisk effektiv mengde glutamin eller en funksjonell analog derav. Denne terapeutisk effektive mengden er større enn den som er tilstede i en normal diett. Det normale diettinntaket for mennesker er ca. 2-4 g/dag.

Et katabolisk dysfunksjon er en tilstand som induserer en katabolisk, biokjemisk reaksjonsmåte i hvilken det opptrer en nedbrytning av en anatomisk struktur. Diettadministrasjonen av glutamin later til å tilfredsstille de biokjemiske behovene ved disse kataboliske tilstandene, slik at det ikke er nødvendig for kroppen å syntetisere glutamin eller å oppnå glutamin ved nedbrytning av skjelettmuskler.

Foreliggende oppfinnelse er tenkt brukt ved alle kataboliske dysfunksjoner hvor det er et øket behov for. glutamin. Disse kataboliske dysfunksjonene kan enten være enterale eller parenterale. Atrofien av vill i i tynntarmen som eksempelvis opptrer når TPN-dietter administreres, er en enteral, katabolisk dysfunksjon. Villi-atrofi opptrer vanligvis ikke på grunn av direkte katabolisk aktivitet på enterocyttene, men er heller forårsaket av mangelen på glutamin i dietten til pasienter på en parenteral diett.

Parenterale, kataboliske dysfunksjoner som oppviser øket behov, for glutamin, opptrer under etter kirurgi, sepsis, brannsår, anoreksi og ukontrollert diabetes.

Oppfinnelsen er effektiv hos de dyr som vanligvis klassi-fiseres som pattedyr, inkludert mennesker.

Uttrykket "enteral" menes å indikere den del av fordøyelses-kanalen som ligger mellom magen og anus.

Uttrykket "parenteral" betegner området utenfor fordøyelses-kanalen.

Uttrykket "i det vesentlige forbundet med" når det anvendes på de kataboliske dysfunksjoner for hvilke fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er effektiv, betyr de der det biologiske behovet for glutamin forekommer under eller etter den kataboliske dysfunksjonen, og er forbundet med denne.

Administrasjonen av glutamin kan foregå både med enterale og parenterale Midler.

Et eksempel på. hvordan den enterale administrasjonen av glutamin gjennomføres, er ved å bruke rør med liten diameter plassert via nesen inn i mage- eller de duodenale områdene, eller ved kirurgiske implantering som f.eks. i gastrostomi eller jejunostomi.

Eksempler på parenterale administrasjonsmåter inluderer, men er ikke begrenset til, slike måter som subkutan, intramuskulær eller intravenøs injeksjon, nasofaryngeal eller mukosal adsorpsjon eller transdermal absorpsjon. I de fleste til-fellene administreres glutaminet intravenøst. Ved intravenøs administrasjon foreligger den terapeutisk effektive mengden glutamin i en yæskefprm som administreres fra et reservoar direkte .via plassering av en nål i en stor vene hos pasienten, hvori nålen forbindes med reservoaret ved hjelp av Tør.

Uavhengig av hvilken administrasjonsmåte som anvendes, kan glutaminet administreres enten alene eller som et diettsupplement. Når det anvendes som et diettsupplement, kan glutaminet blandes med en eksisterende enteral eller parenteral diett før administrasjonen til pasienten. Det er også mulig å administrere glutaminet uten å blande det direkte med andre bestanddeler i en diett som, f.eks., ved intravenøs mating, hvor glutaminet ikke direkte tilsettes til hoved-intravenøsflasken, men isteden tilsettes til et vanlig reservoar ved bruk av en "ri på ryggen"-flaske.

Funksjonelle analoger, derivater, substitusj onsprodukter, isomerer eller homologer av glutamin som bibeholder glutaminets egenskaper anses å være ekvivalente. Foretrukket er de analoger som kan donere en aminogruppe og metaboliseres i Krebs-cyklusen.

Mest foretrukket er forbindelser som har aminosyreresten på en ende av ert karbonkjede og en amindel på den andre enden av karbonk j eden .-

De terapeutisk effektive doseringsområdene for administrasjonen av glutamin er de som er store nok til å hindre katabolisme eller atrofi av kroppsvevene for å bibeholde metabolisk homeostase. I en enteral diett vil glutamin administreres i en mengde som er større eller lik 0,3 g/kg kroppsvekt/dag. Slike administrasjonsmengder kan være 0,3 til 2,0 g/kg kroppsvekt/dag, fortrinnsvis 0,3 til 1,5 g/kg kroppsvekt/dag, og mere foretrukket 0,4 til 1,0 g/kg kroppsvekt/dag. Administrasjonsmengden for glutamin når det administreres intravenøst, vil være større enn eller lik med 0,1 g/kg kroppsvekt/dag. Slike administrasjonsmengder kan være 0,2 til 3,0 g/kg kroppsvekt/dag, fortrinnsvis 0,3 til 2,5 g/kg kroppsvekt/dag, mere foretrukket 0,4 til 2,0 g/kg kroppsvekt/dag.

Overensstemmende med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan glutamin administreres ved ganske enkelt å modifisere foreliggende diettblandinger slik at de inneholder den riktige glutaminkonsentrasjonen . Mest foretrukket vil glutaminet forbli i en tørr form som f.eks. et sterilt, lyofilisert pulver som hydratiseres aseptisk på administra- sjonstidspunktet og blandes i riktig konsentrasjon med de andre bestanddelene i diettblandingen. Alternativt kan glutaminet forhåndsblandes med de andre bestanddelen i en tørr blanding som rehydratiseres aseptisk ved administra-sjonstidspunktet, eller lagres som et frossent konsentrat som tines og blandes til riktig konsentrasjon ved brukstids-punktet.

Bruken av glutamin ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er ideelt egnet for fremstilling av blandinger. Disse blandingene kan omfatte glutamin alene eller i kombinasjon med andre kjemikalier. Disse andre kjemikaliene kan være farmasøytisk godtagbare bærere, så vel som andre aktive substanser 1 dietten som f.eks. frie aminosyrer, protein-hydrolysater-eller oljer.

Preparater for parenteral administrasjon omfatter sterile, vandige eller ikke-vandige løsninger, suspensjoner og emulsjoner. Bærere eller oppsugende dressinger kan anvendes for å øke-hudpermeabiliteten og øke absorpsjonen.

Oppfinnelsen gjelder også et medikament eller et farmasøytisk preparat omfattende bestanddelene Ifølge oppfinnelsen, Idet medikamentet anvendes for inhibering av kataboliske dysfunksjoner.

Oppf innel sen . gj el der også glutamin-r ike blandinger for hindring eller forbedring av kataboliske dysfunksjoner. Blandinger som er glutamin-rike inneholder glutamin i mengder som er terapeutisk effektive og er større enn de som foreligger i en normal diett.

Beholdere som inneholder blandingen ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å lette administrasjonen av glutamin overensstemmende med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Disse beholderne er eksempelvis beregnet på å inneholde den daglige dosering av glutamin som skal administreres til pasienten. Beholdere som er tilpasset for intravenøs administrasjon av glutamin alene eller i kombinasjon med andre aminosyrer er spesielt anvendbare. Slike beholdere kan omfatte en beholder for den flytende glutaminholdige blanding og en væskeledende anordning som kan festes til en nål. Den væskeledende anordningen kan være et hvilket som helst formål som kan overføre væskeblandingen i beholderen til nålen som f.eks. et plastrør.

Nålen som er festet til den ledende anordningen kan enten innføres direkte i et blodkar hos pasienten eller kan innføres i en beholder for å muliggjøre blanding med en annen løsning før den administreres til pasienten.

Den ovenstående beskrivelse beskriver oppfinnelsen generelt. En mer fullstendig forståelse kan oppnås med henvisning til de følgende, spesielle eksemplene som bare gis her for illustrerende formål og ikke er ment å være begrensende om ikke annet- er angitt.

Eksempel 1

Stell av dyr og operative prosedyrer

22 bastardhunder som veide mellom 20 og 40 kg ble kjøpt fra en gård der de var trenet regelmessig og hvor parasitter var fjernet fra dem. Alle hunndyrene var ikke-drektige. Mens de var i kennelen, ble dyrene stelt overensstemmende med retningslinjene til the Committee on Animals at Harvard Medical School and the Committee on Care and Use of Laboratory Animals of the Institute for Laboratory Animal Resources, the National Research Council (DHEW Publication #NIH 78-23, gjennomgått 1978). Dyrene ble holdt I individuelle kenneler ved en konstant temperatur på 20° C med 24 timers lyseksponering. De ble trent i 2 timer hver morgen, gitt vann ad libitum, og fSret en gang om dagen mellom kl. 1.00 og 3.00 på ettermiddagen med Agway Respond 2000 Dry Dog Chow® (inneholder minst 25% protein, 10% fett og de gjen værende kalorier som karbohydrat). Hundene fikk akklimatisere seg til kennelbetingelser i 5 ti 7 dager, i løpet av hvilken tid de ble trenet til å hvile rolig i en Pavlov-stilling. På dagen før hovedprøvene ble tatt, ble all næring fjernet fra kennelen kl. 5.00 på ettermiddagen. Etter faste over natten ble det gått med hunden i minst 20 minutter, den ble plassert i en Pavlov-stilling og venen på forbenet ble kanylert. Etter at hunden hadde hvilt i stillingen i minst 20 minutter, ble det oppnådd en venøs blodprøve for aminosyrebestemmelse. Etter rask induksjon av anestesi med Intravenøs natriumtiopental (Abbott Laboratories, 5 mg/kg kroppsvekt), ble det gjort en biopsi av vastus lateralis-muskelen ved hjelp av metoden til Bergstrøm et al., Journal of Applied Physiology, 36; 693-697 (*1974). Dyret ble så tatt ut av stillingen og en 5 ml prøve av arterielt blod ble oppnådd fra den femorale arterien via perkutan punktur.

Dyret fikk komme seg fra biopsien i minst 2 dager før standardoperasjonen. Dagen før operasjonen ble all næring igjen fjernet fra kennelen kl. 5.00 på ettermiddagen. Ved kl. 7.00 om formiddagen fikk hunden gå i 20 minutter og ble så tatt til operasjonssalen der den ble anestetisert med intravenøs natriumpentobarbital (Abbott Laboratories, 30 mg/kg kroppsvekt). Et endotrakealt rør ble plassert og dyret fikk lov til spontant å puste en blanding av oksygen og romluft. Hunden ble plassert på et operasjonsbord på ryggen og en kanyle ble plassert ved perkutan punktur i den ytre halsvenen og rettet inn i den øvre vena cava. Etter notering av starttiden, ble infusjonsløsningen administrert via denne kanylen ved konstant Infusjon (IMED pumpe®, San Diego, CA) ved 4 ml/time/kg. Penicillin G (E.R. Squibb, Princeton, NJ, 600 mg) og Keflln® (Eli Lilly, Indianapolis, IN, 1 g) ble gitt intravenøst. Urinblæren ble kateterisert, den første urinprøven ble kastet og kateteret ble forbundet med en lukket urinpose for oppsamling i 24 timer. Buken og sidene på hunden ble barbert og huden ble vasket med såpe og vann og preparert med en povidonjod-prepareringsløsning (Clinipad Corporation, Guilford, CT). Hunden ble drapert med sterile ark og bukhulen entret via et vertikalt infra-umbilikalt innsnitt hos hunndyr og et høyre paramedialt innsnitt hos hanndyr. Tarmene ble trukket inn i den øvre bukhulen og det ble gjort snitt i det eksponerte retroperitoneum. Den høyre arterie og vene iliacea circumflexa profunda og arterie sacralis media ble isolert ved skarp og sløv disseksjon. Et spesielt preparert kateter bestående av et 6 cm segment av polyetylenrør (2,08 mm OD) belagt med silastikk og bundet til et 2,8 mm OD polyetylenkateter ble innført 6 cm kranialt i aorta via en høyre arterie iliacea circumflexa profunda. Et lignende kateter ble innført i arterie sacralis media, idet dets tupp ble plassert omtrent 1 cm proksimalt til forgreningen av aorta, men distalt til arteria mesenterica inferior. Et tredje kateter ble innført i vena cava inferior via høyre vena iliace circumflexa profunda og plassert distalt til vena renalis. Alle katetere ble festet og ført til det ytre gjennom stikkesår i siden. Bukhulen ble så lukket og dyret snudd på sin venstre side. De ytre katetrene ble skåret til passende lengder, plugget med sløve nåler forbundet til intermitterende injeksjonsporter (Jelco®, Citikon, Inc., Tampa, FL), renset med saltløsning, fylt med heparin (1000 enheter/ml), og begravet subkutant. Injeksjonsportene ble plassert høyt på dyrets side under huden og i omtrentlig nærhet av ryggraden. Dette muliggjorde adgang til aorta og vena cava ved perkutan punktur av injeksjonsportene til katetrene. To ytterligere doser av Keflin® (1 g) ble gitt 8 og 24 timer etter operasjonen via det venøse kateteret.

Etter operasjonsprosedyren ble dyret plassert på sin side og kroppstemperaturen ble vedlikeholdt med varmelamper og tepper under.gjenvinning av bevisstheten. Omtrent 5 timer etter start av Infusjonen, ble dyret plassert i en pavlov-stilling og en løsning av para-aminohippursyre (PAH, 0,5$, vekt/volum i saltløsning) ble infusert med en hastighet på 0,76 ml/minutt med en Harvard-pumpe i det distale aorta gjennom kateteret i aorta sacralis media. Etter 40 minutter farge- infusjon ble det samtidig oppnådd arterielle og venøse prøver for måling av aminosyre- og PAH-konsentrasjoner. Tre prøve-sett ble trukket ut ved 10 minutters intervaller i en periode på 20 minutter. Katetrene ble så renset, fylt med heparin og dyret ble holdt i et pavlov-bind. 23 timer etter starten på forsøket, ble bakdelsstrømningsundersøkelsene gjentatt. Etter 24 timer var urInoppsamlingen avsluttet. Dyret fikk Intra-venøs natriumtiopental, som tidligere beskrevet, og det ble utført biopsi og vastus lateralis-muskelen i det benet som det ikke tidligere var utført biopsi på. Den intravenøse infusjonen ble avsluttet og dyret plassert i et metabolisk bur i de følgende 24 timer, der det ble gitt vann ad llbltum og intet for.

Eksempel 2

lnfus. 1 onsløsnlnger

Alle dyr fikk en infusjon med en hastighet på 4 ml/time/kg. Fem kontrolldyr fikk 0,9$ saltløsning. Andre dyr ble gitt kommersielt tilgjengelig aminosyreløsning (FreAmine III®, American McGaw) i to forskjellige konsentrasjoner beregnet på å avgi omtrentlig 0,312 (N=2) eller 0,624 (N=6) g nitrogen/24 timer/kg kroppsvekt. Den høyeste dosen var beregnet på å gi ekvivalenten av 4 g protein/24 timer/kg kroppsvekt. Tre dyr fikk en løsning inneholdende glutamin tilsvarende 0,312 g nitrogen/24 timer/kg. Til slutt fikk en gruppe (N=6) en blanding av like mye glutamin og FreAmine®, hvilket ga nitrogen i en mengde på 0,624 g/24 timer/kg. Glutamin-løsningene ble fremstilt ved å oppløse L-glutamin (Sigma, St. Louis, MO) i destillert vann for å danne en 0,157 M løsning som så ble justert til pH 6,8 med nat r iumhydr oksyd. Denne løsningen ble sterilisert ved filtrering gjennom en 0,22 jjM membran og lagret ved 4°C i mindre enn 24 timer. Den morgen de skulle anvendes, ble løsningene sammenblandet i ønskede konsentrasjoner i 2-liters poser (American McGaw) og holdt ved 4°C inntil de skulle brukes. En 10 ml prøve ble tatt fra hver pose ved slutten av infusjonen og lagret ved -20° C for analyse av nitrogeninnhold. En ytterligere 10 ml prøve ble justert til pH 4,75 som beskrevet nedenfor og lagret frossen for analyse av glutamininnhold.

Eksempel 3

Fremstilling og analyse av prøver

Prøver av helt blod og plasma ble avproteinisert ved kombinasjon med like store volumer iskald, 10$ (vekt/volum) perklorsyre og så sentr i fuger ing ved 3000 omdr./min. ved 4°C i 20 minutter. En 2 ml aliquot av supernatanten ble bufret med 0,2 ml 0,2M natrlumacetatbuffer (pH 4,90), justert til pH 4,75-4,90 med 5N kaliumhydroksyd og bragt til et sluttvolum på 4 ml med destillert vann. Prøvene ble lagret ved -20°C for senere satsanalyse av glutamin- og glutamatkonsentrasjoner, ved bruk av "en enzymatisk, mikrofluorometrisk prøve modifisert fra metoden til Lund, "L-glutamine Determination with Glutaminase and Glutamate Dehydrogenase" , i Methods of Enzymatic Analysis, vol. 4, Bergmeyer (utgiver), Academic Press, New York, 1974, s. 1719-1722.

Under muslielbiopsiprosedyren ble en stoppeklokke startet umiddelbart da vevet var fjernet. Muskelen ble dissekert fri for fett og bindevev og delt i to ulike deler. Begge prøver ble veiet minst fire ganger i løpet av de følgende to minutter og vekten og tiden etter biopsi ble nedtegnet. Aktuell våt muskelvekt ved tiden null ble beregnet fra den best passende lineære regresjonen av vekt avsatt mot tid. Den minste prøven (ca. 15 mg) ble tørket til en konstant vekt i en 90° C ovn, og vekten av tørre, fettfrie faststoffer ble oppnådd etter ekstraksjon i petroleter. Denne prøven ble så fordøyet i 250 pl av IN salpetersyre og kloridinnholdet ble målt ved titrering med sølvnitrat ved bruk av en semi-automatisk titrater (Radiometer, København). Plasmaklorid ble også bestemt og intra- og ekstracellulært vann beregnet ved hjelp av metoden til Bergstrøm et al., se ovenfor. Den andre muskelprøven (omtrent 100 mg) ble homogenisert i 0,5 ml iskald perklorsyre (10$, vekt/volum) med'en Polytron Homogenizer (Brinkman, Westbury, NY). Homogenatet ble sentrifugert og supernatanten preparert for enzymatisk glutamin- og glutamatanalyse.

Ved starten av denne undersøkelsen ble plasma- og intracellulære glutamin- og glutamatkonsentrasjoner bestemt ved en enzymatisk metode som tidligere er beskrevet (Muhlbacher et al., American Journal of Physiology, 247: E75-E83 (1984)). Konsentrasjoner av andre aminosyrer ble bestemt ved automatisert høy-ytelses væskekromatografi (HPLC) etter pre-kolonne-derivatisering med o-ftalaldehyd. Alle aminosyrer som vanligvis ble funnet i proteiner ble kvantifisert bortsett fra glutamin, glutamat, prolin, cystein og lysin. Etter hvert som undersøkelsen fortsatte, ble det utviklet teknikker for glutamin-glutamat-måling ved bruk av HPLC. Prøver som ble målt ved hjelp av de to teknikker (enzymatisk og HPLC) ga sammenlignbare glutamin-glutamat-konsentrasjoner. Derfor ble bare HPLC-analyse anvendt i den siste delen av undersøkelsen. Konsentrasjonen av PAH i de arterielle og venøse prøvene ble bestemt spektrofotometrisk etter avproteinisering med 5 %- lg trikloredd-iksyre (Muhlbacher et al., se ovenfor).

Urin som ble utskilt i løpet av de 24 timene med infusjon ble oppsamlet i de lukkede urinoppsamlingssystemet og lagret i surgjorte, avkjølte beholdere. Aliquoter ble lagret frossent ved -20° C for satsanalyse. Nitrogeninnholdet i infusjons-løsningen og urin ble bestemt i samme sats ved hjelp av makro-Kjeldahl-metoden (Peters et al., Quantitative Clinical Chemistry, vol. II, William & Wilkins, Baltimore, MD, 1932, s. 516-538). ,

Statistiske beregninger ble utført på en IBM 4341 computer ved bruk av en standard statistisk pakke (Minitab, The Pennsylvania State University, State College, PA, 1983). Resultatene er uttrykt som middel ± SEM. Parede og uparede Student's t-tester ble brukt slik det passet. Analyse av variasjon ble brukt for multiple gruppesammenligninger. Regresjonsanalyse ble utført ved bruk av metodene med de minste kvadratene. På grunn av den lille prøvestørrelsen i de gruppene som fikk 0,312 g nitrogen/24 timer/kg, ble det fleste statistiske sammenligningene bare utført mellom de andre gruppene.

Bakdelsblodstrøm ble beregnet som tidligere beskrevet (Muhlbacher et al., se ovenfor), og hastigheten ble uttrykt pr. kg kroppsvekt for å ta i betraktning variasjoner av størrelsen på dyrene. Aminosyrestrømningshastigheter ble beregnet som produktet av blodstrøm og forskjeller i arterien og venøs konsentrasjon. Tre sett prøver ble tatt ut, strømning ble beregnet for hvert sett og middeltallet for de tre verdiene bestemt (Muhlbacher et al., se ovenfor). Totalt aminosyrenitrogen i helt blod, plasma og intracellulært vann ble beregnet ved å ta i betraktning nitrogeninnhold i hver aminosyre og oppsummere de enkelte konsentrasjonene.

Eksempel 4

Plasma- og intracellulære amlnosyrekonsentras. 1 oner

Plasmaaminosyrekonsentrasjoner ble målt pre-operativt og 24 timer etter standardoperasjonen. I de salt-behandlede dyrene var total-nitrogeninnholdet i plasma uforandret ved den operative prosedyren (tabell 1). Glutaminkonsentrasjonen forble konstant, men de forgrenede aminosyrene steg, idet summen av deres konsentrasjoner økte fra 326 ± 21 til 501 ± 9 pmol/1 (p < 0,01). I de dyrene som fikk 0,624 g N/24 timer/- kg, var det oppadgående tendens i plasmanitrogenkonsentra-sjonen som var statistisk signifikant bare i den gruppe som fikk blandingen av aminosyrer pluss glutamin. Plasma-glutaminkonsentrasjonen steg også i denne gruppen. Forgrenede aminosyer ble øket hos alle dyrene som fikk aminosyreinfusj.oner.

Konsentrasjonen av nitrogen i skjelettmuskelen avtok under infusjon av saltløsning (tabell II). Denne minskning i total aminosyrenitrogen ble reflektert primært med et fall i glutamin fra 21,48 ± 3,21 jjmol/1 intracellulært vann til 15,86 ± 3,80 (p < 0,05). Selv om summen av konsentrasjonene av lkke-essensielle aminosyrer avtok, forble summen av totale essensielle aminosyrer i det intracellulære lageret uforandret. Ingen forandring i intracellulært nitrogen eller glutamin forekom hos dyr som fikk 0,624 g aminosyre-nitrogen/24 timer/kg (tabell II). Det var en oppadgående tendens i den intracellulære konsentrasjonen av forgrenede aminosyrer ved infusjon av de høyere aminosyreladningene, selv om statistisk signifikans bare ble oppnådd hos de dyrene som fikk blandingen av aminosyrer og glutamin. Det var ikke en signifikant forandring i totalkonsentrasjonene av essensielle og ikke-essensielle aminosyrer i disse to gruppene etter operasjonen. I motsetning til de dyrene som fikk den høyeste dosen nitrogen, bibeholdt ikke de fem dyrene som ble Infusert med 0,312 g N/24 timer/kg det intracellulære skjelettmuskel-nitrogenlageret konsekvent, uavhengig av den infuserte løsning. Intracellulært glutamin falt hos tre av dyrene, forble uforandret hos et, og øket hos et (data ikke vist).

Ved tilførsel av aminosyre tilsvarende 0,624 g N/24 timer/kg som en aminosyreblanding med eller uten glutamin, ble således det intracellulære skjelettmuskel-aminosyre-lageret bibeholdt. En minskning i det intracellulære lageret, som varkarakterisert vedet fall i intracellulært glutamin, opptrådte konsekvent hos de dyrene som fikk saltløsning og var varierende hos de dyrene som fikk den lavere dose av aminosyrer. '•"

Netto bakdels-aminosyrestrøm, beregnet som summen av nitrogenstrømmen av de enkelte aminosyrene, hadde et gjennomsnitt .på"-19,05 ± 4,06 pmol N/min/kg når den ble målt 6 timer etter operasjonen hos de dyrene som fikk saltløsning. Dette var signifikant større enn de utstrømningshastigheter på-7,70 ± 5,9 og -6,50 ± 1,18 pmol N/min/kg som ble observert hos de grupper av dyr som fikk 0,624 g aminosyrér/24 timer/kg (Tabell III). Glutaminutstrømning fra bakdelen var Imidlertid uforandret innen disse tre gruppene. I motsetning til dette ble forgrenede aminosyrer frigjort hos de hundene som fikk bare saltløsning, men opptatt I begge grupper av dyr som fikk den høyere dose av aminosyrer. Bakdels-utvekslingen av forgrenede aminosyrer lot til å være forbundet med hastigheten for administrasjon av forgrenede aminosyrer. Den demonstrerte avgivelse av forgrenede aminosyrer fra bakdelen i den saltløsningsbehandlede gruppen, balanserer med den løsning som inneholder aminosyrer pluss glutamin og større opptak i den gruppen som mottar den høyeste dose av forgrenet aminosyre. Hos de fem dyrene som fikk 0,312 g N/24 timer/kg, var det ikke en signifikant forandring i bakdelsnitrogen-utstrømning sammenlignet med de saltløsningsbehandlede hundene. Det var imidlertid betydelig variasjon i disse strømningsdata og antallet dyr som ble undersøkt var lite. Undersøkelser av bakdels-aminosyre-strømning 24 timer etter operasjonen oppviste ingen forskjeller mellom grupper (Tabell

III).

Nitrogenutskillelse hos de fem dyrene som ble infusert med saltløsning var 0,492 ± 0,022 g N/24 timer/kg. Hos de seks dyrene som fikk den høyeste dose av kommersiell aminosyreblanding, var målt nitrogeninntak 0,632 ± 0,001 g N/24 timer/kg og nitrogenutskillelse var i gjennomsnitt 0,684 0,031 (Tabell IV). Hos de seks dyrene som fikk den løsningen som er laget av en halvpart kommersiell aminosyreløsning og en halvpart glutamin, var nitrogeninntaket sammenlignbart, men utskillelsen var større, og var i gjennomsnitt 0,775 ± 0,019 g N/24 timer/kg (p < 0,05). Nitrogenbalansen hos disse to gruppene var signifikant mindre negativ enn hos de dyrene som fikk saltløsning, og oppgikk til i gjennomsnitt henholdsvis -0,052 0,031 og - 0,140 ± 0,022 g N/24 timer/kg. Hos de fem dyrene som fikk omtrent 0,312 N/24 timer/kg, var den gjennomsnittlige nitrogenutskillelsen midt mellom den som ble observert hos saltløsningskontrollene og hos de dyrene som fikk den største mengden av infusert nitrogen. Alt i alt demonstrerte disse undersøkelsene at nitrogenbalansen nærmet seg likevekt når mengden av administrert nitrogen øket (figur 1). Når glutamin ble kombinert med en kommersiell, glutamin-fri aminosyreløsning, var effektene på nitrogenbalansen additive. Når de ble summert sammen, svarte det nitrogen som ble tilbakeholdt som respons på infusjonen av kommersielle aminosyrer eller glutamin alene for det nitrogen som ble tilbakeholdt når løsningene ble kombinert.

Disse undersøkelsene viser at operativ stress hos hunder stimulerer netto protein-nedbrytning i skjelettmuskelen, slik det fremgår av den negative nitrogenbalansen og øket aminosyre-utstrømning fra bakdelen i forbindelse med et fall i det frie aminosyrelageret i den Intracellulære skjelettmuskelen. Tidligere undersøkelser har vist at proteintap ikke er forbundet med faste eller anestesi, men er klart en respons på operativt stress (Kapadia et al., Surgical Forum, 33: 19-21 (1982)). Frigjøringen av aminosyrer fra bakdelen 6 timer etter operasjonen i den saltløsnings-behandlede gruppen var omtrent 6 til 8 ganger større enn den som ble observert hos kroni-sk-kateteriserte, post-absorptive hunder undersøkt under basalbetingelser (Muhlbacher et al., American Journal of Physiology, 247: E75-E83 (1984)). Denne hastigheten for frigjøring av nitrogen fra bakdelen kan ikke forklares ved uttømming av det intracellulære, frie aminosyrelageret og må derfor reflektere en netto skjelettmuskelproteolyse.

Tilførsel av aminosyrer i den perioperative perioden utligner nitrogentapet,bibeholdte eller økede, plasma-aminosyre-konsentråsjoner og minsker fallet i det intracellulære, frie aminosyrelageret i skjelettmuskelen. Disse effekter synes å være relatert til mengden aminosyre-nitrogen som infuseres. Nitrogentap i hele legemet og i bakdelen ble minsket mye ved de høyeste aminosyredosene, hvilke også vedlikeholdt intracellulære lågere av glutamin og andre aminosyrer. Disse resultatene skiller seg fra de funn som er rapportert av Askanazi et al,, Annals of Surgery. 191:. 465 (1980), som beskrev en minskning i de Intracellulære konsentrasjonene av glutamin og andre aminosyrer hos pasienter etter hofte-erstatning som ikke kunne reverseres ved infusjon av dekstrose og aminosyrer. Resultater som ble oppnådd ved bruk av metoden ifølge oppfinnelsen indikerer at disse tidligere funnene kan være relatert til mengden infuserte aminosyrer og/eller mangelen på glutamin i infusatet. Infusjon av lavere konsentrasjoner av aminosyrer (0,312 g N/24 timer/kg), enten som glutamin alene eller som FreAmine®, klarte ikke å vedlikeholde det intracellulære aminosyrelageret hos tre av de fem undersøkte dyrene. I motsetning til dette stabiliserte eller økte den høyere graden av aminosyre-infusjon det intracellulære lageret. Det synes således at en adekvat mengde administrert nitrogen kan vedlikeholde det intracellulære ami-nosyrelageret i skjelettmuskelen post-operativt.

Forandringen i det intracellulære, frie aminosyrelageret hos saltløsnings-infuserte dyr, som i stor grad kan tilbakeføres til et raskt fall av glutamin, ble hindret når det ble tilført adekvat nitrogen. Dette forekom selv når glutamin ikke var -tilstede i den kommersielt tilgjengelige løsning. Den mekanisme ved hvilken intracellulært glutamin ble vedlikeholdt under disse omstendigheter er uklar, selv om det synes sannsynlig at glutaminsubstrat for glutaminsyntese ble oppnådd fra de forgrenede aminosyrene via transaminering. Av uforklarte grunner var netto glutaminutstrømning lik i alle grupper. Bakdelsfrigjøring av glutamin ble ikke akselerert av forgrenede aminosyrer eller minsket ved tilførsel av glutamin i aminosyreløsningen. Resultatene i denne post-operative modellen skiller seg fra rapporterte effekter av forgrenede aminosyrer hos normale mennesker, i hvilke forarmopptak av forgrenet aminosyre etter administrasjon av leucin oralt var forbundet med akselerert glutaminavgivel se (Aoki et al., Journal of Clinical Investigation, 65: 1522 (1981)).

Selv det var markerte forskjeller i sammensetningen, til de to aminosyreløsningene som ble administrert i; en mengde på 0,624 g N/24 timer/kg, var bakdelsnitrogen-utstrømning sammenlignbar i begge grupper av dyr. Dette forekom selv om mengden av essensielle aminosyrer og forgrenede aminosyrer i den balanserte løsningen var to ganger så stor som i den glutaminholdige løsningen. I denne forsøksmodellen for operativt stress var således glutaminsupplementering av en balansert aminosyreblanding minst like effektiv som en to ganger så stor konsentrasjon av standard balansert blanding i å minske bakdelstap.

Hos de hundene som fikk saltløsning, ble forgrenede aminosyrer avgitt fra skjelettmuskel. Kvantitative overførings-mengder beregnet fra disse data antyder at det må ha fore-kommet et markert opptak av forgrenede aminosyrer i innvolls-organer, mest" sannsynlig i leveren, under den tidligere post-operative perioden. Tilførselen av forgrenede aminosyrer synes å utligne denne translokasjonen, kanskje både ved å tilfredsstille lnnvollskrav og reversering av skjelettmuskel-utstrømning. Et kvantativt forhold foreligger også mellom bakdelsnitrogenbalanse og beskyttelse av det intracellulære nitrogenlageret. Når intracellulære lågere ble vedlikeholdt, var det nesten nitrogenlikevekt i bakdelen. Når saltløsning ble administrert, ble aminosyrekonsentrasj onene i det intracellulære lageret markert uttømt og det var et markert tap av bakdelsnitrogen. Selv om forholdet mellom skjelettmuskelproteolyse og nitrogenkonsentrasjon i det frie aminosyrelageret er ukjent, antyder disse data at skjelettmuskel-nitrogenbalansen er relatert til den intracellulære aminosyrekonsentrasj onen og at glutamin kan spille en avgjørende rolle i å vedlikeholde en riomeostatisk balanse i legemet.

Eksempel 5

Opptak av forgrenet aminosyre og konsentrasjoner av fri aminosyre i muskelen forutsier post- operativ nitrogenbalanse i muskelen.

For å undersøke effektiviteten ved BCAA-infusjon for å redusere proteinkatabol isme i skjelettmuskelen og hele legemet ble aminosyreblandinger inneholdende forskjellige konsentrasjoner av BCAA gitt perioperativt i denne under-søkelsen til tre. grupper av hunder som underkastes en standard laparotomi og retroperitoneal disseksjon. En fjerde gruppe ble gitt bare saltløsning. Ved bruk av bakdels-strømningsteknikker, ble individuelle og totale aminosyre-nitrogen-utvekslingshastigheter målt og brukt ved bestemmelse av proteinkatabolisme i skjelettmuskelen. Konsentrasjoner av intracellulær, fri aminosyre ble målt i perkutane muskel-biopsiprøver. Arbeidet fokuserer på virkningene av intrave-nøse aminosyreløsninger som inneholder forskjellige konsentrasjoner av BCAA og aminosyremetabolismen i skjelettmuskelen etter en standardisert, kirurgisk prosedyre på hunden. Ved å måle bakdelsaminosyrestrøm og fri aminosyrekonsentrasjoner i plasma og skjelettmuskel under de første 24 timene etter operasjonen, har det vært mulig å evaluere den anti-kataboliske responsen på infusjonen av BCAA og andre aminosyrer.

Materialer og metoder

Preparering av dyr og undersøkelsessekvens

27 hann- og ikke-drektige hunn-bastardhunder ble kjøpt fra en gård der de var trenet og holdt fri for parasitter. Hundene veide mellom 18 og 40 kg og ble holdt i minst en uke før undersøkelsen i anlegget for dyrehold i Harvard Medical School. Alle prosedyrer foregikk overensstemmende med retningslinjene til Committee on Animals at Harvard Medical School og Committee on Care and Use of Laboratory Animals ved Institute for Laboratory Animal Reseources, National Research Council, se ovenfor. Dyrene ble holdt enkeltvis med 24 timers lyseksponering og ble trent hver morgen. Vann ble tilført ad libitum, og en enkelt daglig mating med Pro-Pet Respond 2000 tørt hundefSr (Syracuse, New York, minst 25 vekt-$ protein) ble gitt mellom kl. 1.00 og.3.00 på ettermiddagen. Dyrene ble trenet slik at de hvilte rolig i en Pavlov-slynge før undersøkelsen.

Alt for ble fjernet fra kennelen kl. 5.00 på ettermiddagen før basalundersøkelsene eller operasjon. Basalundersøkelsene ble utført kl. 8,00 om morgenen etter at dyret var mosjonert og plassert i slyngen. Disse undersøkelsene besto i oppsamling av én blodprøve fra en kanylert forbensvene for bestemmelse av plasma-aminosyre og en perkutan nålbiopsi av vastus lateralis-muskelen ble utført under natriumtiopental-anestesl (Abbott, North Chicago, Illinois, 5 mg/kg kroppsvekt, IV) for å bestemme intracellulære frie aminosyrer. Etter biopsien, mens hunden fortsatt var bedøvet, ble en 5 ml prøve av arterielt blod ble oppnådd ved perkutan punktur av lårarterien for analyse av aminosyrer i helt blod.

Dyret fikk komme seg i 3 dager før ytterligere undersøkelser ble utført. Kl. 7.00 om morgenen på operasjonsdagen, igjen etter faste over natten, ble dyret mosjonert og ført til operasjonsrommet hvor det ble bedøvet med natriumpento-barbltal (Abbott, North Chicago, Illinois, 30 mg/kg kroppsvekt, IV) via en forbenskanyle. Et endotrakealt rør ble plassert og dyret fikk lov å puste inn spontant en blanding av romluft og oksygen tilført med en hastighet på 5 l/min. Hunden ble plassert på et operasjonsbord liggende på ryggen og et 16-Fr. kateter'ble plassert perkutant i øvre vena cava via den ytre halsvenen. Etter notering av starttiden, ble infusjon av enten saltløsning eller den passende test-aminosyreløsningen begynt via dette sentrale kateter med IMED-pumpe (San Diego, California). Cephalothin (Lilly, Indianapolis, Indiana, 1 g, IV) ble gitt umiddelbart før og etter fullføring av operasjonen. Urinblæren ble kateterisert, den etter å kaste resturin, ble en lukket dreneringsopp-samling begynt, ved starten av infusjonen og -fortsatt i 24 timer. Urin ble også oppsamlet i en andre 24 timers periode, med dyret i et metabolisk bur eller avslutning av IV-infusjonen.

Hundens buk og sider ble barbert, vasket med såpe og vann og preparert med en povidonjod-løsning. Dyret ble drapert sterilt og buken ble entret via et infra-umbilikalt midt-linjeinnsnitt i tisper og et høyre paramediant innsnitt hos hannhunder. Innvollene ble trukket til side og retroperitoneum eksponert fo fullstendig disseksjon rundt det distale aorta og nedre vena cava. Den høyre arterie og vene iliacea circumflexa profunda så vel som den høyre indre arterie iliacea ble isolert. De to arteriene ble kanylert med spesielt preparerte katetere bestående av et 6 cm segment av polyetylenrør (2,08 mm OD) forbundet med et 2,8 mm OD polyetylenrrør. Et arterielt kateter ble plassert 6 cm proksimalt inn i aorta via arterie iliacea circumflexa og det andre kateteret ble plassert 1 cm proksimalt til den aortiske forgreningen, men distalt til arterie mesenterica caudale, via arteria iliacea interna. Et tredje kateter ble innført i vena cava- inferior via vena iliace circumflexa profunda og plassert distalt til nyrevenen. Alle katetere ble festet og ført ut gjennom stikksår i den høyre siden. Buken ble lukket i sjikt og dyret snudd på sin venstre side. De utlagte katetrene ble oppdelt til passende lengder, plugget med sløve nåler påsatt intermitterende injeksjonsporter (Jelco, Critikon, Tampa, Florida), renset med saltløsning, fylt med heparin (100 pU/ml), og begravet subkutant. Injeksjonsportene ble plassert høyt på sidene, for å tillate lett tilgang til arterielt (aortisk) og venøst (fra vena cava) blod ved perkutan punktur.

Etter .disse prosedyrene, som generelt tok 2 timer, ble dyret plassert på siden og kroppstemperaturen ble vedlikeholdt med tepper under oppvåkning fra bedøvelsen. 5 timer etter start av infusjon og operasjon, ble dyret plassert i Pavlov-slyngen og en løsning på 0,5$ para-amino-hiipurat (PAH) ble infusert med en hastighet på 0,7 ml/minutt med en Harvard-pumpe 1 det distale, aortiske kateteret. Etter 40 minutters fargestoff-infusjon, ble tre sett av samtidige arterie- og veneprøver oppnådd i 10-minutters intervaller for måling av aminosyre-og PAH-konsentrasjoner. Katetrene ble så skilt og fylt med heparin. Dyret ble holdt i slyngen under konstant overvåkning inntil bakdelsstrømsundersøkelsene ble gjentatt 24 timer etter starten av infusjonen. På dette punkt ble den første 24-timers urinoppsamlingen avsluttet og en gjentatt perkutan baklemsbiopsi ble utført på det benet som det ikke tidligere var utført biopsi på, igjen under kort generell anestesi. Infusjonen ble så avsluttet og dyret plassert i et metabolisk bur i en den andre 24-timers perioden.

Infusjonsløsnlnger

Alle løsninger ble infusert ved en hastighet på 4 ml/min/kg. Fem kontrolldyr fikk 0,9$ saltløsning. Aminosyreløsninger (Tabell V) inneholdende BCAA 1 tre forskjellige konsentrasjoner (11$, 22$ eller 44$ av totale aminosyrer) ble fremstilt ved tilsetning av aminosyrer ti en 8,5$ standard aminosyreblanding, FreAmine III (Amercian McGaw, Irvine, California) .. De. totale BCAA-inf us j onshast ighetene var henholdsvis 0,46, 0,92 og 1,84 g/24 timer/kg. Alle tre aminosyreløsninger var isonitrogene, og ga omtrent 0,624 g nitrogen/24 timer/kg, med et konstant forhold mellom valin og leucln og isoleucin (1:1,38:1,05). Ni dyr fikk en 11 $-ig BCAA-løsning som ble fremstilt ved å oppløse en blanding av ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) i 2,13$ FreAmine III for å få. en løsning som ga 0,624 g nitrogen/24 timer/kg. Hos 6 dyr besto NEAA av L-glutamin alene og 1 tre, besto NEAA av en blanding av alle de NEAA som finnes i FreAmine III (alanln, glysln, arginin, histidin, serin og prolin) i samme forhold som 1. FreAmine III. Seks dyr fikk 4,25$ FreAmine III alene (22$ BCAA). De siste 7 dyrene fikk 2,13$ FreAmine III tilsatt nok BCAA til å danne en 44 $-ig løsning. Denne siste blandingen ble gjort isonitrogent ved å tilsette NEAA som L-glutamln alene (n = 4) eller en blanding av NEAA som finnes i FreAmine III (n = 3). Alle løsningene ble sterilisert ved passasje gjennom et 0,22 jjM filter (Millipore, Millis, MA) og lagret over natten ved 4°C før administrasjon. En 10 ml prøve av hver løsning ble uttatt ved slutten av infusjonsperioden og lagret ved -20°C for analyse av nitrogen ved makro-Kj eldahl-metoden.

Preparering og analyse av blod-, vev- og urinprøver

Prøver av helt blod og plasma ble avproteinisert ved å tilsette et like stort volum av iskald 10 $-ig perklorsyre (PCA) og så sentrifugere ved 7000 omdr./min. ved 4°C i 20 minutter. En 2 ml aliquot av supernatanten ble bufret med 0,3 ml 0.2M natriumacetatbuffer (pH = 4,90), justert til pH 4,75-4,90 med 5N kaliumhydroksyd, bragt til et sluttvolum på 4 ml med destillert vann og sentrifugert igjen. Den resulterende supernatanten ble lagret ved -20°C for senere satsanalyse.

Under muskelbiopsiprosedyren ble en stoppeklokke startet ved tiden for vevsfjerning. Muskelen ble dissekert fri for fett og bindevev og delt i to ulike deler. Flere vekter av hver prøve ble nedtegnet med 15 sekunders intervaller i et minutt, og den opprinnelige våtmuskelvekten ved tiden = 0 ble beregnet fra den best passende lineære regresjonen av vekt avsatt mot tid. Den mindre prøven (omtrent 15-20 mg) ble tørket til en konstant vekt i en ovn ved 90° C og vekten av tørkede, fettfrie faststoffer ble oppnådd etter ekstraksjon med petroleter. Prøven ble så neddykket i 250 ml IN salpetersyre og kloridinnholdet ble målt ved titrering med sølvnitrat ved bruk av en semi-automatisk titrator (Radiometer, København). Plasmaklorid ble også bestemt ved hjelp av en lignende mtode. Intracellulært og ekstracellulært vann ble så beregnet ved bruk av kloridteknikken, slik som beskrevet tidligere. Den andre muskelprøven (omtrent 80-100 mg) ble velet og homogenisert i 0,5 ml iskald PCA ved bruk av en Polytron homogenisator (Brinkmann, Westbury, New York). Homogenatet ble sentrifugert og supernatanten ble preparert for analyse ved tilsetning av buffer og pH-justering til pH 4,75-4,90 som beskrevet for blod- og plasmaprøver. Intracellulære glutamin- og glutamatkonsentrasjoner i helt blod, plasma og muskler ble bestemt ved en ezymatlsk, mikrofluoromtrisk metode som er modifisert fra metoden til Lund, P., "L-glutamine determinatlon with glutaminase and glutamat dehydrogenase," i "Methods of Enzymtic ANalysis", Bergmeyer, H.U., utgivere, vol. 4, New York: Academic Press 1719-1722 (1974), eller ved automatisert høyytelses-væskekromatografi (HPLC) etter pre-kolonné-derivatisering med o-ftalaldehyd,^derivatisering med o-ftalaldehyd, Smith, R.J., et al., "Automated analysis of o-phthaladehyde derivatives of amino acids in physiological fluids by reverse phase high performance liquid chromatography," J. Lig. Chromatog. 8: 1783-1795 (1985). De to teknikkene ga sammenlignbare resultater. Andre -aminosyrer bortsett fra prolin, cystein og lysin ble bedømt med en lignende HPLC-metode. Konsentrasjonen av PAH i arterielt og venøst blod ble bestemt spektrofotometrisk etter deproteinisering med 5 % trikloreddiksyre, Muhlbacher, F., -et.al., "Effects of glucocorticolds on glutamlne metabolism- in skeletal muscle," Am. J. Physlol. 247: E75-E83

(1984).

Urin utskilt under de 24 timene med infusjon ble oppsamlet i et lukket urlndreneringssystem og lagret i surgjorte, avkjølte beholdere. Aliquoter ble lagret frossent ved -20°C for senere satsanalyse av nitrogen ved hjelp av makro-Kjeldahl-metoden, Peters J.P., et al., "Total and non-protein nitrogen", i Quantitative Clinical Chemistry, vol. II, 516-538, Baltimore: ; Williams & Wi 11 lams , (1932 ). En annen porsjon ble sentrifugert i 10 minutter: ved 2000 omdr./min. og frosset for senere analyse av urea og kreatinin på Technicon Auto-analysatoren (Tarrytown, New York).

Beregninger og statistisk analyse

Bakdelsblodstrøm ble beregnet som beskrevet foran (Muhlbacher, F. et al. , se ovenfor). Strømnlngshastigheter for de enkelte aminosyrene ble beregnet som produktet av blodstrøm og arteriovenøs konsentrasjonsforskjell. Tre sett av prøver ble tatt ut ved hvert tidspunkt, strømmen ble beregnet for hvert sett og middelet av de tre verdiene ble bestemt. Total aminosyre-nitrogenstrøm så vel som plasma-, helt blod- og intracellulære nitrogenkonsentrasjoner ble beregnet som den millimolare summen av nitrogengruppene av alle målte aminosyrer. Konsentrasjoner av frie, intracellulære aminosyrer i skjelettmuskelen ble uttrykt pr. liter intracellulært vann.

Statistiske beregninger ble utført ved bruk av en standard statistisk pakke (Minitab, The Pennsylvania State University, State College, PA, 1983). Resultatene er uttrykt som midlet ± SEM. Parede og uparede Student's t-tester ble brukt slik det passet. Analyse av forskjell ved brukt for sammenligning av flere grupper. Regresjonsanalyse ble utført ved bruk av minste kvadraters metode.

Resultater

Alle dyr overlevde den operative prosedyre bortsett fra en hund som døde like etter administrasjon av natriumpentobarbital, før starten av den Intravenøse infusjonen. Dette dyret ble ikke inkludert i undersøkelsen. Blodtap under prosedyren var jevnt minimal. Alle prøvekatetere var lorden ved 6- og 24-timers tidspunktet, med unntagelse av et venøst kateter ved 24-timers tidspunktet i et dyr i gruppen méd 22$

BCAA.

Bakdelsblodstrøm ved 6 timer var 36,1±6,8 ml/minutt/kg i kontrollgruppen med saltløsning og var ikke påvirket av behandling (11$ BCAA, 33,3±4,9; 22$ BCAA, 42,4±8,8; 44$ BCAA, 28,7±3,5-; forskjellene var ikke signifikante). Strøm ved 24 timer var uforandret (henholdsvis 57,9±10,2, 38,6±8,2, 54,9±6,5, 49,7±13,2). Tendensen mot høyere strømnings-hastigheter og øket variasjon ved 24 timer kan tilbakeføres til større bevegelsesaktivitet hos dyrene etter oppvåkning fra bedøvelsen. Utskillelse av nitrogen gjennom urinen og nltrogenbalanse Etter operasjonen var volumet av utskilt urin sammenlignbar i de fire behandlingsgruppene, selv om de hundene som mottok saltløsning alene hadde en tendens til å utskille mindre urinvolum (Tabell VI). Gjennomsnittlig utskillelse av nitrogen gjennom urinen var 0,492±0,20 g/24 timer/kg i gruppen med saltløsning. De aminosyrebehandlede dyrene utskilte 35-65$ mer nitrogen enn saltløsningsgruppen, primært i form av urea. De hunder som var infusert med 22$ BCAA-løsning utskilte signifikant mindre urea-nitrogen og mindre totalt nitrogen enn gruppene med 11$ eller 44$ BCAA. Utskillelse av kreatlnin og ammoniakk var sammenlignbar i alle grupper.

Blodurea-nitrogen og plasma-kreatlnin ble målt før og 24 timer etter operasjonen i utvalgte dyr fra alle grupper. Disse konsentrasjonene var normale hos alle dyrene før operasjonen og falt noe eller forandret seg ikke etter operasjonen. Således var hastigheten for utskillelse av urea gjennom urinen lik hastigheten for ureaproduksjonen. Den høyere ureaproduksj onen som ble observert hos de dyrene som fikk løsninger med 11$ og 44$ BCAA var signifikant relatert (p < 0,05) til det ekstra nitrogen som tilveiebringes ved tilsetning av BCAA eller NEAA til den balanserte aminosyre-blandingen.

Nitrogenbalansen var mindre negativ ved aminosyreadministra-sjon. Omtrent 50$ av det infuserte aminosyre-nitrogen ble tilbakeholdt. På grunn av at nltrogenintaket var det samme hos alle dyr som fikk aminosyrer, var de forandringer i nitrogenutskillelse som allerede er diskutert reflektert i nitrogenbalansen (Tabell VI). Således oppnådde de dyrene som fikk løsningen med 22$ balansert aminosyre signifikant større nitrogenretensjon enn de hundene som fikk løsninger som Inneholdt 11$ eller 44$ BCAA..

Konsentrasjoner av aminosyre i helt blod

Hos de dyrene som var behandlet med saltløsning, falt aminosyre-nitrogenet i helt blod 6 timer etter operasjonen, men gikk tilbake til normale, preoperative nivåer etter 24 timer (Tabell VII). Denne forbigående hypoaminoacidemi kom for en stor del av en minskning i konsentrasjonen av de ikke-essensielle aminosyrene (glutamin, alanin, arginin, serin og asparagin), selv om signifikante minskninger av noen essensielle aminosyrer også forekom (treonin og tyrosin). I motsetning til dette bibeholdt de dyrene som fikk aminosyreinfusjoner, konsentrasjonene av aminosyre-nitrogen i helt blod 6 timer etter operasjonen. Disse nivåene økte over preoperative kontrollnivåer etter 24 timer (p < 0,05).

Konsentrasjonene av spesielle aminosyrer i blodet til de dyrene som fikk aminosyreinfusjoner, reflekterte sammensetningen av de infuserte løsningene. BCAA-konsentrasjonene var eksempelvis relatert til graden av BCAÅ-admini strås jon både etter 6 og 24 timer (figur 2). Generelt var glutamin-konsentrasjoner i helt blod etter 6 timer lavere enn preoperative nivåer (tabell VII). Unntagelsen var den gruppe som fikk glutamin-anriket, 11 $-ig BCAA-løsning, i hvilken konsentrasjonen av glutamin i blodet ble bibeholdt. Hos disse dyrene omfattet glutamin mer enn halvparten av det ikke-essensielle nitrogenet og utgjorde mer enn 40$ av de totalt avgitte aminosyrene. Etter 24 timer hadde de dyrene soih fikk glutaminholdige infusjoner en tendens til å ha konsentrasjoner av glutamin i helt blod som var høyere enn normalt.

Intracellulære, frie aminosyrer 1 skjelettmuskel Hos de dyrene som var behandlet med saltløsning, falt intracellulært, fritt aminosyre-nitrogen signifikant 24 timer etter operasjonen når det ble sammenlignet med preoperative nivåer (Tabell VIII). Denne forandring kunne for en stor del (65 $) tilbakeføres til det markérte fallet 1 intracellulært glutamin, som omfattet en hoveddel av det totale lageret av intracellulær, fri aminosyre. Hos de dyrene som.fikk amino syre-infusjoner, ble Intracellulært nitrogen bibeholdt, selv om intracellulært glutamin falt hos de dyrene som fikk den glutaminfrie løsningen med 11$ BCAA. Intracellulært glutamin hadde en tendens til å øke hos de dyrene som fikk glutamin-anrikede løsninger og BCAA-konsentrasjonene økte i forhold til graden av BCAA-infusjon.

Bakdelaminosyrestrøm

Hos de dyrene som var behandlet med saltløsning, var det en netto frigjøring av aminosyre-nitrogen fra bakdelen 6 timer etter operasjonen (Tabell IX). Denne økede aminosyreutstrøm-ning reflekterte akselerert frigjøring av nesten alle målte aminosyrer, inkludert BCAA. Ved denne tidsperioden var glutamat og aspartat de eneste aminosyrene som bibeholdt balanse gjennom bakdelen. 24 timer etter operasjonen var hastigheten for frigjøring av bakdelsaminosyre-nitrogen minsket og, selv om de var meget varierende, kunne de arteriovenøse forskjellene for nesten alle aminosyrene ikke skilles fra null. Glutaminutstrømning fortsatte på dette tidspunkt.

Hos alle grupper av dyr som fikk aminosyreinfus joner, var utstrømning av bakdelsaminosyre-nitrogen etter 6 timer lik og var signifikant mindre enn hos de dyrene som var behandlet med saltløsning (p < 0,05). Både glutamin- og alanin-utstrøm-ning etter 6 timer' hadde en tendens til å være mindre hos de dyrene som fikk aminosyrer enn hos saltløsningskontrollene. Mens. BCAA ble frigjort ved 6 timer hos de dyrene som var infusert med saltløsning, ble disse aminosyrene tatt opp hos de hundene som fikk aminosyreinfus joner. Bakdelsopptak av BCAA var relatert til administrasjonsgraden av BCAA (figur 3) og hele BCAA-konsentrasjoner (figur 4).

Etter 24"-timer var utstrømning av bakdelsaminosyre-nitrogen lik hos alle aminosyreinfusj bnsgruppene og uforandret sammenlignet med 6 timer. Etter 24 timer var BCAA-bakdels-utvekslingen svakt positiv, med en tendens til å. være større hos gruppene med 22$ og 44$ BCAA. På denne tiden var BCAA-opptaket ikke relatert til blodkonsentrasjoner og hastigheten for BCAA-administrasjon.

Forhold mellom BCAA- infusjon. BCAA- bakdelsopptak og bakdelsaminosyre- nitrogen- f rigjøring

Hos de hundene som var infusert med saltløsning, var bakdels BCAA-frigjør Ingen etter 6 timer forbundet med akselerert aminosyreutstrømning. Hos de dyrene som fikk aminosyreinfusjoner, korrelerte bakdelsnitrogenbalansen med BCAA-opptaket (figur 5). Saltløsningskontroller ble ikke inkludert i denne analysen, siden de ikke mottok nitrogen. Inkludering av kontrolldyr ville ha resultert i en regresjonslinje med en mer positiv helning. Korreleringen ble bibeholdt selv om BCAA-strømni-ngen ikke ble inkludert i oppsummeringen av bakdelsaminosyre-nltrogenstrømmen (p < 0,02, r = 0,49). Nitrogenstrøm uten BCAA-strøm var således også relatert til BCAA-opptak. Nitrogenstrømmen korrelerte ikke med den totale BCAA-konsentrasj onen i blodet eller hastigheten for BCAA-administrasjonen. Ingen av disse forholdene forelå ved 24 timers-tidspunktet.

Frigjøring av bakdelsaminosyre-nitrogen etter 6 timer korrelerte også med forandringer i det intracellulære lageret av fritt aminosyre-nitrogen (figur 6). Forandringer i intracellulært glutamin var nær relatert til forandringer i det totale lageret av fritt aminosyre-nitrogen (p < 0,001, r = 0,90) og således var forandringer i glutaminlageret også signifikant relatert til bakdelsnitrogenutstrømningen (p < 0,05, r = 0,66). Disse matematiske forholdene ble bibeholdt når utstrømningen av bakdelsaminosyre-nitrogen ble korrigert for forandringer i det intracellulære nitrogenlageret. Siden strømnings- og lagermålingene ble utført på forskjellige tidspunkter, ble denne korreksjonen gjort ved å anta to forskjellige hastigheter for forandring av det intracellulære aminosyrelageret. For det første ble det antatt at forandringen av det intracellulære lageret opptrådte i de første

6 timene etter operasjonen. Alternativt ble det antatt at

forandringen forekom ved en konstant hastighet i løpet av 24 timer. Ingen av korreksjonene forandret forholdet mellom forandringen i det intracellulære nitrogenlageret og amlno-syre-nitrogenutstrømningen.

BCAA-opptaket var ikke relatert til øket glutamin-avgivelse fra bakdelen etter 6 eller 24 timer. BCAA-opptaket var heller ikke relatert til de forandringer som forekom 1 det intracellulære lageret av fri aminosyre i skjelettmuskelen (r = 0,11, ikke signifikant). Bakdelsnitrogenstrømning kunne forutsies og det meste av variasjonene i dataene kunne det finnes dekning for når både strømningen av BCAA etter 6 timer og forandringen i lageret av fritt aminosyre-nitrogen ble anvendt. Forholdet var:

hvor,

y = aminosyre-nitrogenstrøm etter 6 timer, pmol/min/kg,Xj[= BCAA-st rømning etter 6 timer (jjmol/min/kg),

X2= forandring i intracellulært, fritt aminosyre-nitrogen i

skjelettmuskel (postop - preop, mmmol/1/24 timer),

n = 22, p < 0,05, r = 0,86.

Diskusj on

Det er vist at en standardisert laparotomi av bedøvede hunder starter mange av;de kataboliske responser som observeres hos kritisk syke mennesker. Total kroppsprotein-katabolisme, slik den måles ved utskillelse av nitrogen gjennom urinen, økes. De kontrolldyrene som fikk saltløsning, utskilte omtrent 12-15 g nitrogen i de første 24 timer etter operasjonen. Tidligere undersøkelser i denne modellen har vist at nltrogenbalanseri forblir negativ i 3 dager etter operasjonsprosedyren på tross av næringsinntak. Kapadia, C.R., et al., "Alterations in glutamine metabolism in response to operative stress and food déprivation", Surg. Forum 33: 19-21 (1982 ). I motsetning til dette oppnådde par-matede, skinn-opererte dyr nitrogenlikevekt i løpet av den første dagen etter operasjonen. Overensstemmende med og medvirkende til det økede nitrogentapet gjennom urinen, var bakdelsfrigjøring av totalt aminosyre-nitrogen 6 timer etter operasjonen 6 til 8 ganger større enn det som ble observert hos kontrolldyrene etter faste over natten (Muhlbacher, F., et al., se ovenfor). Andre forandringer hos hunder som var behandlet med saltløsning, som f.eks. en minskning av konsentrasjonene av aminosyre i blod og skjelettmuskel er lik de forandringer som er rapportert under kataboliske tilstander hos mennesker, Askanazi J., et al., "Muscle and plasma amino acids following injury: influence of intercurrent infection", Ann. Surg. 192: 78-85

(1980). Således oppviser hundemodellen postoperative responser som er lik forandringer hos kritisk syke mennesker og, er derfor egnet for undersøkelse av virkningene av eksogene aminosyrer på nitrogenmetabolismen og aminosyre-utvekslIngen i skjelettmuskelen.

Hos de dyrene som var behandlet med saltløsning, ble bakdels-avgivelse av aminosyre-nitrogen markert øket 6 timer etter operasjonen. Dette var forbundet med en netto skjelettmuskel-avgivelse av alle BCAA. På samme tid var BCAA-konsentrasjonene i helt blod uforandret, hvilket indikerer at for-bruket av BCAA i innvollsorganene var grovt sett ekvivalent med den akselererte hastigheten ved skjelettmuskelavgivelse. Hos de dyrene som fikk aminosyrer, ble den totale bakdelsaminosyre-avgivelsen minsket, nitrogenlagrene i helt blod og skjelettmuskel ble bibeholdt, bakdelen ble omdannet fra et organ med BCAA-avgivelse til et organ med opptak. BCAA-, og mer spesielt, leucinopptak var ikke forbundet med øket skjelettmuskel-avgivelse av glutamin.

Denne undersøkelse viser at skj elettmuskel-aminosyre-avgivelse og derfor netto-omsetningen av muskelprotein, kan forutsies fra to uavhengige målinger. Disse er hastigheten for BCAA-strømning gjennom det vaskulære lag. i skjelett muskelen og konsentrasjonen av nitrogen i skjelettmuskelens frie aminosyrelager. Siden glutamin er den mest rikelige aminosyren i det frie lageret, bestemmer forandringer i dets konsentrasjon stort sett forandringer i det totale lageret. Forandringer av fritt glutamin forutsier faktisk muskel-nltrogenbalansen så vel som forandringer av de totale frie aminosyrene.

Eksempel 6

Virkninger av glutamin- anrlket. oral diett på tynntarmen etter tarmreseksjon

Introduksjon

Kompenserende vekst av tynntarmen etter delvis reseksjon omfatter alle belegg i tarmveggen, men domineres av villus hyperplasi. Øket villus høyde og kryptdypde følges av utvidelse og forlengelse av den gjenværende tarm, Williamson, R.C.N., "Intestinal adaption", N. Engl. J. Med., 298:1393-1444 (1978). Reseksjon av tynntarmen følges av adaptive, morfologiske og funksjonelle forandringer. Oralt inntak har vist seg å være en viktig stimulus ved regulering av slim-hinnehyperplasi etter tarmreseksjon, Levine, G.M. , et al., "Small-howel resection, oral intake is the stimulus for hyperplasia", Dig. Dis. 21:542-545 (1976). "Luminal"-næringsmidler er viktige når det gjelder å bibeholde normal slim-hinnevekSo og dersom oralt inntak fortsettes etter reseksjon av tynntarmen, mister den gjenværende tarm vekt og blir hypoplasisk. Pasienter med kort tarm etter tynntarmreseksjon understøttes ved parenteral ernæring. Deres overlevelse avhenger av kapasiteten hos det gjenværende tarmsystemet til å tilpasse seg. Bruken av elementærdietter og parenteral ernæring gir tilstrekkelig tid for utvikling av tarmtil-pasning og en langsom retur til fullstendig oralt inntak, Weser, E. , "The management of patients after small bowel resection", Gastroenterologi, 71:146-150 (1976).

Glutamin er et viktig brensel for enterocytter og utnyttelse av det i tarmen synes å øke etter kirurgisk stress, Souba, W.W. , et al., "Postoperative alteration of arter iovenous exchange of amino acids across the gastrointestinal tract", Surgery 94,(2): 342 (1983). Glutamin kan tjene som en lokal tropisk faktor, og fremmer slimhinnevekst når det utvikles t armhypopl as i . Dette forsøk undersøker om tilførsel av glutamin til en elementær diett var forbundet med noen fordel når det gjelder tilpasning og helbredelse av tynntarmen etter subtotal reseksjon. Forsøket foregikk ved å fore rotter med en glutamin-anriket elementærdiett etter 2/3 reseksjon av tynntarmen. Slimhinnetilpasningen til den gjenværende tarmen ble sammenlignet med kontrolldietter og skinn-opererte grupper.

Materialer og metoder

Wistar-hannrotter som veide 175-200 g, ble kjøpt fra Charles River Breeding Laboratories, Inc., som fikk 5 dager til akkl imat i ser ing. Rottene fikk fri adgang til vann og ble matet med Purina-grøtdiett. De ble holdt i Individuelle bur og veiet annenhver dag. Etter akklimatisering ble rotter med normal vektøkning delt 1 fire grupper.

På forsøkets første dag, ble rottene bedøvet med intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (50 mg/kg). Buken ble åpnet via et midtlinje innsnitt, hele lengden av tynntarmen fra Treitz-senen til den ileocaeale-ventilen ble trukket ut fra buken og målt to ganger uten strekking med en lang svart tråd. Middeltallet av de to målingene ble bestemt. Så ble det utført en 2/3 reseksjon av tynntarmen med begynnelse 5 cm distalt til Treitz-senen ved hjelp av metoden ti Lambert, R., "Surgery of the digestive system of the rats",, Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, s. 32-35, 413-416 (1965). Reseksjonskantene ble anastomosert ende mot ende med 6-0 prolen. Tarmen ble gjeninnsatt i bukhulen og bukhuleveggen ble lukket med 2-0 prolen. En kontrollgruppen ble skinn-operert ved å underkastes transeksjon og reanastomose av tynntarmen ved den distale ende, Idet 2/3 av totallengden ble målt med begynnelse 5 cm distalt til Treitz-senen. Rottene ble holdt 1 Individuelle bur etter operasjonen og fikk lov å suge vann første dag etter operasjonen.

Oral f6ring ble startet fra den andre dagen etter operasjonen. Rotter 1 gruppe I ble foret oralt med glutamin-anriket elementærdiett (4,18$) og rotter i gruppe II ble foret med glysin-anriket elementærdiett (4,18$). Rotter i gruppe III (resekterte rotter) og rotter i gruppe IV (skinn-opererte rotter) ble matet med ordinær grøtdiett. Foringen ble fortsatt 1 7 dager og deres daglige kroppsvekter ble nedtegnet inntil forsøkets siste dag.

Fremstilli- ng av glutamin- og glysln- elementærdletter

Elementærdietten (NBCq Biochemicals, Inc., Cleveland, Ohio) inneholder 0,2$ kolinklorld, 10$ maisolje, 46,9$ dekstrln-hvitt, 23,4$ sukrose, 5$ saltblanding, 0,5$ vitaminblanding og 9,82$ av 17 slag essensielle og ikke-essensielle aminosyrer. Glutamin- eller glysinpulver ble tilsatt til elementærdietten for å fremstille 41,8$ av glutamin- eller glysin-anriket elementærdiett, dvs. 28$ av de totale aminosyrene.

Innhøstnlngsprosedyrer

Etter 7 dagers foring ble rottene drept. De ble bedøvet med intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (50 mg/kg). Buken ble åpnet og innsnittet utvidet til brysthulen. 5 ml blod ble tatt ut ved punktur av høyre ventrikkel for bestemmelse av ammoniakk- og plasmaglutamlnnivåer i blodet. Tarmen ble tatt ut like etter bloduttaket. Hele tynntarmen ble fjernet med omsorgsfull separering av mesenteriet, ved å holde seg nær til den serøse tarmen. Den fjernede tarmen ble hengt under fast spenning på 4,5 g og 9 punkter ble markert. For rottene med tarmreseksjon ble punktene som var 5, 10 og 12,5 cm proksimalt til den anastomose som representerte det proksimale jejunum og distale duodenum og punkter på 2, 5 og 10 cm distalt til den anastomose som representerte det gjenværende, proksimale ileum nær anastomosen, og punkter på 5, 10 og 15 cm proksimalt til den ileocaecale ventilen som representerte det gjenværende distale ileum, markert med rette pinner ført gjennom tarmen. De seks tarmsegmentene ble separert. For rottene i den skinn-opererte gruppen ble de proksimale to segmentene markert fra 1 cm distalt til Treitz-senen og målt oppover. Segmenter la, 2a og 3a ble skylt i avkjølt saltløsning og lagt ned i 10$ bufret formalin i 4 timer, og så overført til 70$ etanol for fiksering. Segmenter lb, 2b og 3b ble skylt i avkjølt saltløsning, deres hulrum ble åpnet og deres våtvekt fastslått. Tarmsegmentene ble overført til 5 ml avkjølt saltløsning og oppdelt med en skarp saks. Et homo-genat ble fremstilt, ved bruk av to 15 sekunders perioder på en Polytron-homogenisator (Brinkman Instruments, Westbury, NY), fulgt av ultralysbehandllng med et ultralydapparat (Heat system Laboratories, Plalnview, NY) med en styrke på 2, i 30 sekunder. Homogenatet i saltløsning for DNA- og protein-analyse ble lagret ved -30"C.

Analytiske metoder

Tarmhomogenatene ble analysert på totalt protein ifølge metoden til Lowry, O.H. et al., "Protein measurement wlth the Folin phenol reagent", J. Biochem., 193: 265-275 (1951). DNA ble bestemt ifølge metoden til Burton, K. , "A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the c.olorlmetric estimation of deoxyribonucleic acid", Biochem, 6^:315-323 (1965). Histologiske snitt ble lagt i parafin, farget med hematoksylin og eosin og undersøkt under et lysmikroskop i 40 gangers forstørrelse. Tyve representa-tive, store, velorienterte, komplette vllli ble valgt for å måle sl imhinnetykkel se og villus-høyde ved bruk av et okularmikrometer og en gjennomsnittlig verdi oppnåd. Villus-antallet ble tellet med tarmen lagt i den sentrale, horison-tale linjen i et 40 ganger forstørret felt.

Resultater

Figur 7 viser at den glutamin-tilsatte dietten resulterer i høyere plasmaglutaminnivåer. Basert på målinger a vekt/cm (figur 8), lot det til å være liten forskjell mellom den glutamin-tilsatte (+GLN) og glutaminfrie dietten, som begge understøttet mindre tarmhypertrofi enn normalt f6r. Ved undersøkelse av tarmslimhinnen ved målinger av slimhinnetykkelse (figur 10) og villus-høyde (figur 11) viste imidlertid den glutamin-tilsatte dietten seg overlegen.

Eksempel 7

Konservering av tynntarmslimhinne ved bruk av glutamin-anriket parenteral ernæring

Parenteral ernæring resulterer i slimhinneatrofi i tynntarmen (Johnson, L.R. et al., Gastroenterology 68:1177-1183 (1975)). Denne responsen kan være relatert til en minskning i gastrointestinale utskillelser og trofiske hormoner og også en relativ mangel på spesielle næringsmidler som kreves for entrocyttvekst. Glutamin er et viktig oksyderende brensel for tynntarmen, men er ikke tilstede i standard parenterale løsninger. For å bestemme innvirkningen av diettglutamin ble tynntarmresponsen på administrasjon av parenterale løsninger anriket med varierende konsentrasjoner av denne aminosyren evaluert.

MATERIALER OG METODER

Kondisjonerte hann-Wistar-rotter (n = 42, vekt 210-230 g) ble underkastet halsvene-kateterisering og ble utstyrt med en svingeanordning som tillater langstidsinfusjon i ubundne dyr (Burt, M.E. et al., J. Physiol., 238:H599-603 (1980)). Alle rottene ble holdt i individuelle metaboliske bur og tillatt adgang til drikkevann. Kontrolldyr fikk infusjon av 0,9$ saltløsning og Purine-rottefor ad libitum. Tre grupper av rotter fikk intravenøst ernæring. Alle næringsmiddelløsninger var isonitrogene (0,9 g nitrogen/100 ml) og isokaloriske (98Kcal/100 ml), og inneholdt like konsentrasjoner av essensielle aminosyrer, ikke-essensielle aminosyrer og dekstrose. Den ikke-essensielle aminosyrebestanddelen 1 hver løsning ble justert for å tilveiebringe glutaminkonsentra-sjoner på 0,2 eller 3 g/100 ml. Parenterale løsninger ble •infusert med en hastighet på 48 ml/24 timer. Urinutskillelse og nltrogenutskillelse ble målt daglig. Dyrene ble drept etter 7 dagers parenteral ernæring og blod ble oppnådd for bestemmelse av glutamin- og ammoniakkonsentrasjoner. Både jejunale segmenter i full tykkelse og slimhinneprøver ble oppnådd fra definerte seksjoner av tarmen. Alle prøver ble veiet, og homogenater ble undersøkt på DNA og protein. Histologiske paraf f inseksj oner av 5 pm tykkelse ble fremstilt. Målinger av jejunal villus-høyde, antall og slimhinnetykkelse ble utført i en blindprøve.

RESULTATER OG DISKUSJON

Våtvekt, DNA, protein og villus-høyde avtok hos alle rotter som fikk intravenøs ernæring sammenlignet med oralt f6rede kontroller (tabell X). Plasmaglutaminkonsentrasjon økte etter infusjon av løsninger inneholdende glutamin. Jejunal-slim-hinnevekt økte signifikant sammenlignet med to rotter som fikk glutaminfrie løsninger. Jejunalvekt i full tykkelse hadde ingen tendens til å øke med glutamininntak, selv om responsen ikke var statistisk signifikant. DNA både i slimhinne og full tykkelse av jejunum økte etter glutamin-infusjon i 2 og 3$ konsentrasjoner. Disse forandringer var fulgt av histologisk bevis på slimhinnevekst. Villus-høyde og slimhinnetykkelse økte på en doseavhengig måte i forhold til mengden av administrert glutamin. Alle dyr var i positiv nitrogenbalanse, men rotter som fikk 2$ glutaminløsning bibeholdt den største mengde nitrogen gjennom hele undersøkelsen.

Tilførselen av glutamin i parenterale løsninger resulterer i en økning i jejunalslimhinnevekt, DNA-innhold og villus-høyde når dyr holdes på intravenøs ernæring. En økning i slimhinne-massen i tynntarmen kan forbedre funksjonen av tynntarmen og lette innføringen av enteral ernæring. Glutamin kan være et næringsstoff som er nødvendig for understøttelse av slim-hinnen som ikke er tilstede i standard parenterale løsninger for tiden.

Eksempel 8

Effekt av glutamin- anriket . parenteral ernæring etter behandling med 5- fluorurlcil

Tilsetning av aminosyren glutamin (GLN) til næringsmiddel-løsninger øker tarmcellulariteten signifikant under paren teral mating. For å vurdere virkningen av GLN på slimhinne-regenerering etter skade ble 5 fluoruricil (5FU) administrert til rotter som fikk parenteral ernæring (PN). Etter halsvene-kateterisering fikk hann-Wistar-rotter (n=40, vekt 200-230 g) en kontinuerlig infusjon av isonitrogene, isokaloriske løsninger med (+) eller uten (-) GLN. 5FU ble administrert i økende dose (0, 100, 150 mg/kg i/p) til 24 dyr ved starten av PN (korttids) og til ytterligere 16 dyr (150 mg/kg) som hadde fått PN i 5 dager før behandlingen (langtids). Ved forsøkets slutt 4 dager etter 5FU ble WBC, Hb, blodplater og plasma-GLN målt, jejunale prøver ble veiet, undersøkt på DNA og protein og det ble preparert histologiske snitt. En del av resultatene er vist (middel ± SEM,<*>p < 0,05,<**>p < 0,025 sammenlignet med -GLN).

5FU-behandling minsket tarmvekten, DNA og protein. Rotter som fikk GLN hadde signifikant større slimhinnemasse sammenlignet med dyr som fikk standardløsning. Tilsetning av GLN var forbundet med øket overlevelse hos langtidsdyrene. Tilførsel av GLN i næringsløsninger forbedrer tynntarmcellulariteten og modifiserer den gastrointestinale toksisiteten til 5FU. En slik terapi kan minske sykelighet og dødelighet hos pasienter hvis gastrointestinale barriereforsvar er skadet.

Beskrivelsen er nå fullstendig beskrevet og det vil være klart for fagmannen at mange forandringer og modifikasjoner kan gjøres uten å påvirke dens ånd og område.

Claims (18)

1. Fremgangsmåte for behandling av katabolisk dysfunksjon hos et dyr, karakterisert ved at det til dyret administreres en terapeutisk effektiv mengde glutamin eller en analog derav i en mengde som er større enn den som er tilstede i dyrets normale diett.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den kataboliske dysfunksjonen er enteral eller parenteral.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den enterale dysfunksjonen i det vesentlige opptrer forbundet med intravenøs mating.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at den enterale dysfunksjonen påvirker tynntarmen.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den parenterale dysfunksjonen i det vesentlige opptrer i forbindelse med et fysisk traume.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det fysiske traumet er forbundet med kirurgi, sepsis, brannskade, anoreksi, kjemoterapi, strålingsterapi eller ukontrollert diabetes.

7. Fremgangsmåte Ifølge krav 1, karakterisert ved at administrasjonen av en terapeutisk effektiv mengde glutamin er enteral eller parenteral.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at administrasjonen foregår ved bruk av et diettsupplement.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at den parenterale administrasjonen er ved subkutan, intramuskulær eller intravenøs injeksjon, nasofaryngeal eller slimhinneabsorpsjon eller transdermal absorpsjon.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert v ed at den enterale administrasjonen skjer i en mengde på 0,3 til 2,0 g glutamin eller glutaminanalog pr. kg kroppsvekt pr. dag.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at den enterale administrasjonen skjer i en mengde på 0,3 til 1,5 g glutamin eller glutaminanalog pr. kg kroppsvekt pr. dag.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at den enterale administrasjonen skjer i en mengde av 0,4 til 1,0 g glutamin eller glutaminanalog pr. kg kroppsvekt pr. dag.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at den parenterale administrasjonen skjer i en mengde på fra 0,2 til 3,0 g glutamin eller glutaminanalog pr. kg kroppsvekt pr. dag.

14. Fremgangsmåte Ifølge krav 13, karakterisert ved at den parenterale administrasjonen skjer i en mengde fra 0,3 til 2,5 g glutamin eller glutaminanalog pr. kg kroppsvekt pr. dag.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at den parenterale administrasjonen skjer i en mengde fra 0,4 til 2,0 g glutamin eller glutaminanalog pr. kg kroppsvekt pr. dag.

16. Blanding, karakterisert ved at den omfatter en glutamlnrik blanding for å hindre eller forbedre en katabolisk dysfunksjon.

17. Beholder-for en flytende blanding som er tilpasset for Intravenøs administrasjon av blandingen, karakterisert ved at den omfatter en beholder for blandingen, og en væskeledende anordning forbundet med beholderen som kan festes til en nål for intravenøs dispensering, hvor blandingen omfatter en mengde glutamin som kan inhibere en katabolisk dysfunksjon hos et dyr.

18. Beholder ifølge krav 17, karakterisert ved at den kataboliske dysfunksjonen er forbundet med skjelettmuskel tap.