DE69824750T2

DE69824750T2 - Methoden zur regulierung der grösse und des wachstums von durchblutetem normalem gewebe

Info

Publication number: DE69824750T2
Application number: DE69824750T
Authority: DE
Inventors: Maria Rupnick; S. Robert LANGER; Judah Folkman
Original assignee: Childrens Medical Center Corp; Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Childrens Medical Center Corp; Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1997-10-31
Filing date: 1998-10-30
Publication date: 2005-07-07
Anticipated expiration: 2018-10-31
Also published as: WO1999039702A3; CA2307792A1; DE69824750D1; JP2011026332A; CA2307792C; EP1024801B1; WO1999039702A2; EP1024801A2; ES2224465T3; US6306819B1; JP2002502814A; ATE269699T1; AU3352799A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Behandlung von Fettsucht und weiteren durch Proliferation von normalem vaskularisierten Gewebe gekennzeichneten Störungen durch die Verabreichung einer wirksamen Menge von Angiogenese-Inhibitoren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Überhandnehmen von Übergewicht hat in den meisten entwickelten Ländern epidemische Ausmaße angenommen und wird von niederschmetternden Statistikwerten für Sterblichkeitsraten und Krankenstand begleitet. Fettsucht ist ein hinlänglich anerkannter Risikofaktor für eine Anzahl von möglicherweise lebensbedrohenden Krankheiten, wie beispielsweise Atherosklerose, Bluthochdruck, Diabetes, Schlaganfall, Lungenembolie und Krebs. (Meisler J., St. Jeor S., 1996, Am J Clin Nutr., 63: 4095–411S). (Bray G., 1996, Endocrin Metab Clin North Amer., 25: 907–919). Des Weiteren werden dadurch zahlreiche chronische Krankheitszustände, wie beispielsweise Erkrankungen der Atemwege, Osteoarthritis, Osteoporose, Gallenblasenerkrankungen und Dyslipödem verkompliziert. Das ganze Ausmaß dieses Problems wird am Besten durch die Tatsache reflektiert, dass die Sterblichkeitsraten mit zunehmendem Körpergewicht ansteigen. Mehr als 50% aller Todesursachen sind auf Zustände zurückzuführen, die mit Fettsucht zusammenhängen, sobald der Index der Körperfettmasse (BMI, Body Mass Index) 30 kg/m² übersteigt, wie bei 35 Millionen Amerikanern zu sehen ist. (Lee L., Paffenbarger R., 1992, JAMA, 268: 2045–2049).
Da mehr als 300.000 Todesfälle pro Jahr auf Fettsucht zurückzuführen sind, rangiert sie nach Rauchen von Tabak an zweiter Stelle als der häufigste Grund für Todesfälle, die möglicherweise verhindert werden könnten. (McGinnis J., Foege W., 1993, MA, 270: 2207–2212).
Die verheerenden medizinischen Konsequenzen dieses Problems werden durch die enorme finanzielle Belastung begleitet, die auf dem Gesundheitssystem der Vereinigten Staaten von Amerika lastet. Die geschätzte wirtschaftliche Auswirkung von Fettsucht und die mit ihr verbundenen Krankheiten, durch medizinische Aufwendungen und durch Einkommensverlust, werden mit mehr als 68 Milliarden US-Dollar/Jahr beziffert. (Colditz G., 1992, Am J Clin Nutr., 55: 503S–507S). (Wolf A., Colditz G., 1996, Am J. Clin Nutr., 63: 466S–4695). (Wolf A., Colditz G., 1994, Pharmacoeconomics, 5: 34–37). Darin sind noch nicht die über 30 Milliarden US-Dollar pro Jahr eingeschlossen, die für Lebensmittel, Produkte und Programme zur Gewichtsabnahme ausgegeben werden. (Wolf A., Colditz G., 1994, Pharmacoeconomics, 5: 34–37). (Ezzati, et al., 1992, Vital health Stat [2], 113).
In 1990 reagierte die US-Regierung auf die Krise, indem sie die Reduzierung der überhandnehmenden Fettsucht bis zum Jahre 2000 auf 20% der Bevölkerung als ein wichtiges Ziel der nationalen Gesundheit erklärte (Public Health Service, Healthy people 2000: national health promotion and disease prevention objectives. Öffentliches Gesundheitssystem.
Gesunde Menschen 2000: Ziele zur Förderung nationaler Gesundheit und Krankheitsvorbeugung, 1990, (US Department of Health and Human Services Publication PHS 90-50212.)).
Trotz dieser Bestrebungen ist das weit verbreitete Übergewicht in den Vereinigten Staaten von Amerika ständig weiter angestiegen und hat überraschende 33,0 Prozent bei der neuesten Untersuchungserhebung der nationalen Gesundheit und Ernährung erreicht (1988 bis 1991). (Kuczmarski, et al., 1994, JAMA, 272: 205–211). Des Weiteren ist der durchschnittliche Index der Körperfettmasse in diesem Zeitraum um 0,9 kg/m² angestiegen. Das Auftreten dieses alarmierenden Trends ist nicht das Ergebnis mangelnder Anstrengung.
Ganz im Gegenteil, es wird geschätzt, dass 25% der Männer, 50% der Frauen und 44% der Jugendlichen jederzeit versuchen, ihr Gewicht zu reduzieren. (Robinson, et al., J Amer Diabetic Assoc., 93: 445–449). Es sieht eher so aus, dass die 31% Zuwachsrate und 8% Anstieg in der Überhandnahme im letzten Jahrzehnt ein Beweis für die Tatsache ist, dass Fettsucht gebräuchlichen Eingriffen notorisch widersteht.
(NIH Technology Assessment Conference Panel, 1993, Ann Intern Med., 119: 764–770).
Ein Hauptgrund für den langandauernden Misserfolg anerkannter Methoden liegt in der falschen Vorstellung und in dem geringen Verständnis der Mechanismen von Fettsucht begründet. Laut herkömmlichem Wissen wird behauptet, dass Fettsucht eine durch Esssucht selbstzugefügte Krankheit.
Umfassende Behandlungsprogramme konzentrierten sich deswe gen auf Verhaltensveränderungen, um die Kalorienaufnahme zu reduzieren und die körperliche Aktivität unter Verwendung unzähliger Systeme zu erhöhen. Diese Verfahren sind begrenzt wirksam und sind mit Rückfälligkeitsraten von mehr als 95% verbunden.
Das Fehlschlagen von kurzfristigen Lösungsangängen zusammen mit kürzlichem Fortschritt, der beim Aufklären der Pathophysiologie von Fettsucht erzielt wurde, hat zu einer neuen Bewertung von Pharmakotherapie als einer möglichen langfristigen Adjuvansbehandlung geführt. (National Task Force on Obesity, 1996, JAMA, 276: 1907–1915). (Ryan, D., 1996, Endo Metab Clin N Amer., 25: 989–1004). Die Prämisse besteht darin, dass das Körpergewicht ein physiologisch gesteuertes Parameter ähnlich wie der Blutdruck ist, und dass Fettsucht eine chronische Krankheit ähnlich wie Bluthochdruck ist. Das Ziel langfristiger (vielleicht lebenslanger) medizinischer Therapie würde darin bestehen, sowohl Gewichtsverlust als auch anschließendes Beibehalten des Gewichtes zusammen mit einer gesunden Ernährung und körperlicher Bewegung zu unterstützen. Um diesen Lösungsangang zu bewerten, muss die langfristige Wirksamkeit von aktuell verfügbaren Arzneimitteln, verglichen mit der von ausschließlich nicht pharmakologischen Interventionen beurteilt werden. Der letztere Lösungsangang erzielt einen durchschnittlichen Gewichtsverlust von 8,5 kg in 21 Behandlungswochen und nur 50% der Gewichtsabnahme wird bei 10 bis 30% der Patienten nach vier Jahren aufrecht gehalten.
(Wadden T., 1993, Ann Intern Med., 119: 688–693). (Kramer, et al., 1989, Int J Obes., 13: 123–136). Die wenigen Studien, in welchen langfristige Therapie (länger als sechs Monate) mit einzelnen Arzneimitteln (Guy-Gran, et al., 1989, Lancet, 2: 1142–1144) (Goldstein, et al., 1994, Int J Obes., 18: 129–135) (Goldstein, et al., 1993. Obes Res. 2: 92–98) oder Kombinationstherapie (Weintraub M., 1992, Clin Pharmacol. Ther., 51: 581–585) bewertet wurden, zeigen verglichen mit Plazebos mäßige Wirkung bei der Reduzierung von Körpergewicht.
Alle gegenwärtig verwendeten Medikamente, um Fettsucht zu behandeln oder um ihr vorzubeugen, sind auf das Adipozyten-Kompartiment des Gewebes gerichtet und funktionieren entweder dadurch, dass sie die Energieverfügbarkeit abbauen oder indem sie die Energieabgabe erhöhen. Diese Wirkstoffe können auf der Grundlage ihrer Mechanismen in drei Kategorien unterteilt werden. (National Task Force on Obesity, 1996, JAMA, 276: 1907–1915).
Reduzierung von Energieaufnahme
Dieser Lösungsangang ist darauf gerichtet, Nahrungsaufnahme zu reduzieren, indem Appetit reduziert oder das Sättigungsgefühl erhöht wird.
Diese „appetitzügelnden" Arzneimittel beeinflussen die Neurotransmitteraktivität, indem sie entweder auf das katecholaminergische System (Amphetamine, Benzphetamine, Phendimetrazine, Phentermine, Mazindol, Diethylpropion, und Phenylpropanolamine) oder auf das Serotonin-System einwirken (Fenfluramin, Dexfenfluramin, Fluoxetin, Sertralin und weitere Antidepressiva selektive Serotonin Wiederaufnahme Inhibitoren [SSRI, selective serotonin reuptake inhibitors]).
Reduzierung der Absorption von Nährstoffen
Arzneimittel dieser Kategorie blockieren die Wirkung von Verdauungsenzymen oder die Absorption von Nährstoffen. Ein Beispiel für diesen Arzneimitteltyp ist Orlistat, welches die Lipaseaktivität des Magens oder des Pankreas hemmt.
(Drent M., van der Veen E., 1995, Obes Res. 3 (suppl 4): 623S–625S). In den Vereinigten Staaten von Amerika befinden sich diese Medikamente in der experimentellen Phase und stehen zur Behandlung von Fettsucht nicht zur Verfügung.
Erhöhung der Energieabgabe
Eine Erhöhung der Energieabgabe kann durch Erhöhung der metabolischen Rate erzielt werden, beispielsweise durch Veränderungen des Tonus des sympathischen Nervensystems oder durch Entkoppelung von oxidativer Phosphorylierung. Zu den Arzneimitteln, welche den Thermogenesemetabolismus beeinflussen, gehören Ephedrin allein und in Kombination mit Kaffeein und/oder Aspirin (Passquali R., Casimirri F., 1993, Int J Obes., 17 (suppl 1): 565–S68) und BRL 26830A. a (-Adrenozeptoragonist. (Connacher, et al., 1992, Am J Clin Nutr., 55: 258S–261S).
Diese Klasse von Medikamenten ist durch die FDA nicht zur Gewichtssteuerung anerkannt.
Zurzeit ist kein einziges herausragendes Arzneimittelprogramm weder zur Förderung noch zur Unterstützung von Gewichtsabnahme in Sicht.
Chirurgische Eingriffe, wie beispielsweise Verfahren zur Teilung des Magens, jejuno-ilealer Bypass und Vagotomie sind ebenfalls entwickelt worden, um schwerwiegende Fettsucht zu behandeln. (Greenway F., 1996, Endo Metab Clin N Amer., 25: 1005–1027). Obwohl sie auf lange Sicht vorteilhaft sind, hat, gemäß der NIH Konsens-Konferenz über Fettsucht-Chirurgie, das bedenkliche Nutzen-/Risikoverhältnis diese invasiven Maßnahmen krankhaft fettsüchtigen Patienten vorbehalten (Index der Körperfettmasse von mehr als 40 kg/m²). (NIH Conference, 1991, Ann Intern Med., 115: 956–961). Deswegen ist dies keine Alternative für die Mehrheit der übergewichtigen Patienten, es sei denn, bis sie vollkommen fettsüchtig werden und unter den damit zusammenhängenden Komplikationen leiden.
Es gibt keine medizinische oder chirurgische Behandlung von Fettsucht, welche auf das vaskuläre Kompartiment des Gewebes gerichtet ist.
Deswegen besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, eine Behandlung zur Verfügung zu stellen, um Fettsucht zu verringern.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Zusammensetzungen zur Behandlung von Fettsucht zur Verfügung zu stellen.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Verfahren zum Hemmen oder zum Verminderen übermäßiger Zellproliferation von weiteren normalen, vaskularisierten Geweben zur Verfügung zu stellen.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Angiogenese-Inhibitoren werden Patienten in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die Größe und/oder das Wachstum von normalem, nicht transformierten, vaskularisierten Gewebe zu regulieren, indem sein vaskuläres Kompartiment reguliert wird. Beispiele von Geweben, welche kontrolliert werden können, schließen Fettgewebe, Darmpolypen, Muskelgewebe (einschließlich Herz) und endometriales Gewebe ein. Das Ansprechen dieser Gewebe auf die Angiogenese-Inhibitoren hängt von der Dosis ab, ist umkehrbar, und für eine Vielzahl von unterschiedlichen Angiogenese-Inhibitoren gemeinsam (in Beispielen werden TNP-470, Angiostatin, und Endostatin verwendet), auf der Grundlage von Versuchen, die an Tiermodellen mit Fettsucht, Darmpolypen, Herzhypertrophie und Endometriose durchgeführt wurden. Anfängliche Versuche, die an einem Fettgewebemodell durchgeführt wurden (genetisch fettsüchtige Mäuse und normale Mäuse als Kontrolle) zeigten, dass das Wachstum und die Masse von Fettgewebe der Steuerung von mikrovaskulärem Endothel unterliegt. Die Ausbreitung von Fettgewebe wurde mit Endothelzellproliferation in Verbindung gebracht. Die Inhibition von Angiogenese führte zur Reduzierung von Fettgewebemasse.
Gewichtszunahme bei Tieren, welche Angiogenese-Inhibitoren erhielten, war deutlich eingeschränkt, trotz des Appetitanstiegs, der ausreichte, um Gewichtszunahme bei paarweise gefütterten Mäusen zu verursachen. Das Absetzen des Inhibitors führte zu einer schnellen Ausbreitung des Fettgewebes.
Die Wirkung war dosisabhängig, war wiederholt umkehrbar und erfolgte als Reaktion auf alle der getesteten Inhibitoren.
Bedeutende Inhibition wurde außerdem sowohl bei den Tiermodellen mit Darmpolyp als auch mit Herzhypertrophie beobachtet, wobei Dosierungen von zwei Dritteln oder weniger als die Dosierungen verwendet wurden, die zur Behandlung von Tumoren verwendet wurden. Vorläufige Ergebnisse bei einem Endometriose-Modell zeigten außerdem einen deutlichen Trend in Richtung Entwicklungsabnahme von Endometriose bei Tieren, die mit Angiogenese-Inhibitoren mit einer Dosierung von einem Drittel der zur Behandlung von Tumoren verwendeten Dosierung behandelt wurden. Neben dem Fettgewebe wurde an normalem Gewebe, das nicht proliferierte, keine Wirkung beobachtet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1a ist ein Kurvendiagramm von Körpergewicht im Verhältnis zur Zeit (Tage) von ob/ob (fettsüchtigen) Mäusen, die mit TNP-470 bei entweder 5 mg/kg täglich oder 10 mg/kg täglich behandelt wurden, verglichen mit ob/ob Mäusen, die mit Fenfluramin [40 mg/kg intraperitoneal täglich] behandelt wurden und verglichen mit Kochsalzlösung bei den Kontrollen.
1B ist ein Kurvendiagramm von Körpergewicht im Verhältnis zurzeit (Tage) von ob/ob Mäusen, die mit TNP-470 (10 mg/kg täglich) bei paarweiser Fütterung [erklären] behandelt wurden und mit Kochsalzlösung bei den Kontrollen.
2 ist ein Kurvendiagramm von Körpergewicht (Gramm) versus Behandlungstage, von Mäusen bei Dosen von 2,5, 5,0, 7,5 und 10 mg TNP-470 mg/kg/Tag versus Kontrolle. n = 4 pro Gruppe, die nicht 10 mg erhält, bei der n = 8.
3 ist ein Kurvendiagramm von Körpergewicht (Gramm) versus Behandlungstage von Mäusen mit Angiostatin (20 mg/kg/Tag), Endostatin (50 mg/kg/12 Std.) und Angiostatin (50 mg/kg/12 Std.), verglichen mit der Kontrolle, die mit Kochsalzlösung behandelt wurde, n = 3 pro Gruppe.
4A ist ein Kurvendiagramm von Körpergewicht (Gramm) versus Behandlungstage von ob/ob Mäusen, die mit 10 mg TNP-470/kg/Tag (n = 6) behandelt wurden, versus mit Kochsalzlösung behandelter ob/ob Kontrolle (n = 4), und normalen Mäusen C57B1/6, die mit Kochsalzlösung behandelt wurden (n = 5).
4B ist ein Kurvendiagramm von Körpergewicht (Gramm) versus Behandlungstage von ob/ob Mäusen, die mit 10 mg TNP-470/kg/Tag behandelt wurden, verglichen mit der Kochsalzlösungsbehandlung bei der Kontrolle. n = 6 für jede Gruppe.
4C ist ein Kurvendiagramm von Körpergewicht (Gramm) versus Tage für ob/ob Tiere, die mit TNP-470 bei einer Dosis von 10 mg/kg/Tag (n = 15) behandelt wurden, versus normale C57/B1/6 Tiere, die mit Kochsalzlösung (n = 5) behandelt wurden, und ob/ob Tiere, die mit Kochsalzlösung (n = 4) behandelt wurden.
5 ist ein Kurvendiagramm von Körpergewicht (Gramm) versus Behandlungstage für ob/ob Tiere, die nur mit Fenfluramin (40 mg/kg/Tag, n = 4) und anschließend mit TNP-470 (10 mg/kg/Tag, n = 4) behandelt wurden.
6A und 6B sind Kurvendiagramme von Körpergewicht (Gramm) versus Behandlungstag mit TNP-470 (10 mg/kg/Tag) versus Kochsalzlösung bei den Kontrollen, bei Experimenten mit paarweiser Fütterung.
6C ist ein Kurvendiagramm der Anzahl von Zellen/Loch (× 103) versus TNP-470 (pg/ml), wenn die Wachstumsfaktoren BCE und FGF oder 3T3 und FGF zu den Zellen hinzugefügt wurden.
7 ist ein Kurvendiagramm des ventrikulären Gewichtes als Körpergewichtsprozent von Tieren mit ventrikulärer Hypertrophie, die durch Thyronin induziert wurde, die mit T3 (leitet Hypertrophie ein), T3 und TNP-470 mit 10 mg/kg täglicher Menge, und T3 und TNP-470 mit 20 mg/kg täglicher Menge behandelt wurden.
8A ist ein Kurvendiagramm der Anzahl von Polypen in Min/+ Mäusen, Kochsalzlösungskontrollen versus Tiere, die mit TNP-470 bei einer Dosis von 10 mg/kg täglicher Menge, behandelt wurden, nach einer und nach drei Wochen.
8B ist ein Kurvendiagramm der Größenverteilung von Polypengröße bei Min/+ Mäusen, dargestellt als die gesamte Anzahl von Polypen jeder Größe (Durchmesser in mm) für Tiere, die mit TNP-470 mit 10 mg/kg täglicher Menge behandelt wurden, versus Kochsalzlösung bei den Kontrollen.
9 ist ein Kurvendiagramm von Gewebedurchmesser (mm) bei einem Tiermodell von Endometriose für Kontrolltiere und Tiere, die mit TNP-470 behandelt wurden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Angiogenese ist der Vorgang, bei welchem neue Blutgefäße gebildet werden. Sie ist eine wesentliche Voraussetzung für die Reproduktion, die Entwicklung und die Wundheilung und wird bei diesen normalen Ereignissen sehr gut reguliert.
Unregulierte und beständige Angiogenese trägt allerdings zu vielen Krankheitszuständen, wie beispielsweise Arthritis, okuläre Neovaskularisation und Wachstum von soliden Tumoren bei. Seit 1983 sind verschiedene Moleküle identifiziert worden, welche Angiogenese entweder stimulieren oder hemmen. Diese Moleküle haben zu klinischen Anwendungen und Versuchen auf Gebieten der diagnostischen Studien, Beschleunigung von Angiogenese bei Wundheilung und Hemmung von Angiogenese bei Neoplasie geführt.
Angiogenese ist auf dem Gebiet des Wachstums von soliden Tumoren ausgiebig untersucht worden und viele regulierende Faktoren sind aus diesen Geweben isoliert worden. Es gibt bedeutende Beweise dafür, dass die Größe und das Wachstum von soliden Tumoren von der Angiogenese abhängen. Einfach ausgedrückt, sobald ein Tumor entsteht, muss jedem Anstieg der Tumorzellenpopulationen ein Anstieg von Bildung neuer Kapillaren vorausgehen, um diesen Tumor zu versorgen. Diese Assoziation ist niemals zwischen Angiogenese und „normalen" Geweben oder Organen, wie beispielsweise Fettgewebe gemacht worden.
Fettgewebe ist ein hochgradig vaskularisiertes Gewebe und ist jahrhundertelang zur Unterstützung der Wundheilung benutzt worden, (Ball J., 1928., The sack-'em-up men: an account of the rise and fall of the modern resurrectionists. Die plündernden Männer: Ein Bericht über Aufstieg und Fall der modernen Leichenräuber. Oliver und Boyd, Edinburgh, London. S. 73), vorwiegend auf Grund seiner Fähigkeit, erneute Vakuskularisierung von betroffenem Gewebe zu fördern. Aufgrund dieser Eigenschaft wird Fettgewebe weiterhin bei chirurgischen Maßnahmen eingesetzt, bei denen vielfältige Gewebe beteiligt sind, bei welchen eine vaskuläre Versorgung lebensnotwendig ist, wie beispielsweise Eingeweide, Myokard und transplantierte Lungen. (Silverman, et al., 1988, Angiogenic activity of adipose tissue, Angiogene Aktivität von Fettgewebe. Bioch Biophy Res Com., 153: 347–352).
Genauere Untersuchungen der angiogenen Aspekte von Fettgewebe ergaben eine Wachstumsabhängigkeit von der Entwicklung einer vaskulären Versorgung. Während der Embryogenese sind Vaskularisation und Adipozytendifferenzierung leicht koordinierte Ereignisse. Neugebildetes Fettgewebe erfordert kontinuierliche Angiogenese für weiteres Wachstum und Entwicklung. (Wasserman F., 1965, The development of adipose tissue. In: Handbook of Physiology. Die Entwicklung von Fettgewebe. In: Handbuch der Physiologie, Band 5, Renold A., Cahill G., (eds.), Washington, DC, USA. Am Physiol Soc., Seiten 87–100). Obwohl die beteiligten Mechanismen immer noch nicht vollständig aufgeklärt sind, ist bekannt, dass bidirektionale parakrine Interaktionen zwischen Adipozyten und mikrovaskulären Endothelzellen (EC) eine Schlüsselrolle bei der Regulierung spielen. (Lau D., et al., 1996, Intern J Obes., 20 (Suppl 3) S16–S25). Dies wird durch in-vitro Studien unterstützt, bei denen die Interaktionen von EC bewertet werden, die mit 3T3-Zellen aus Fettgewebe isoliert werden, eine Adipozytenlinie, welche die meisten Eigenschaften von lebenden Fettzellen beibehält. (Green H., 1978, The adipose conversion of 3T3 cells. In: 10th Miami Symposium on Differentiation and Development, Die Fettumwandlung von 3T3 Zellen, 10. Miami Symposium über Differenzierung und Entwicklung. Ahead F., Schultz J., Russe T., Wagner R. (ed.), New York, Academic Press, Seiten 13–33). Diese Versuche belegen, dass sowohl EC als auch Präadipozyten mitogene Faktoren freisetzen, welche die gegenseitige Zellproliferation in einer zellenspezifischen Weise verbessern. Diese symbiotische Beziehung kann bei gemeinsamen Kulturen beobachtet werden, in welchen sich Präadipozyten in „Inselchen" um Gruppen von EC herum vermehren (Lau, et al., 1996, Intern J Obes., 20 (Suppl 3) S16–S25).
Ein Fortschritt ist bei der Identifizierung vieler beteiligter Verbindungen ist erzielt worden. 3T3-Adipozyten produzieren potente Faktoren, welche die EC-Zellproliferation und in-vitro Migration und Angiogenese bei der Chorion-Allantoismembrane von Kücken stimulieren. (Cystolith, et al., 1982, Proc Natl Acad Sci USA, 77: 6007–6011).
(Cystolith, et al., 1982. Proc Natl Acad Sci USA, 7: 5597–5601). Eine dieser Verbindungen ist als 1-Butyryl-Glycerol identifiziert worden, ein angiogener Faktor, dessen Spiegel während der Adipozytendifferenzierung mindestens zweihundertfach ansteigen. (Dobson, et al., 1990, Cell, 61: 223–230). Adipozyten produzieren außerdem weitere Faktoren mit bekannter angiogener Aktivität einschließlich PGE1, PGE2, TNF-, bFGF, und FGF-9. (Form D., Auerbach R., 1983, Proc Soc Exp Biol Med., 172: 214–218). (Smith S., 1996, Endo Metab Clin N Amer., 25: 921–942). (Teichert-Kuliszewska, et al., 1992, J Clin Invest., 90: 1225–1231). (Samagh, et al., 1995, Obes Res., 3: 370S). Wechselseitig setzt EC, das aus Fettgewebe isoliert wurde, Mitogene in das Kulturmedium frei, welche die Vervielfältigung von Präadipozyten auf eine von der Dosis abhängigen Weise stimuliert. (La, et al., 1996, Intern J Obes., 20 (Suppl 3) S16–S25). Teilweise Reinigung der von den EC abgeleiteten Mitogenen hat mehrere aktive Proteine mit Molekulargewichten in der Größenordnung von 18 bis 67 kDa gezeigt, von denen einige zu der Heparin bindenden FHF-Familie gehören können. (Lau, et al., 1990, Int J Obes., 14: 193–201). Die komplexen autokrinen/parakrinen Kommunikationen zwischen Fettgewebe und EC bleiben ein aktives Forschungsgebiet.
Die in den Untersuchungen beschriebenen Beispiele stellen unwiderlegbare Beweise zur Verfügung, dass Adipogenese von dem Wachstum neuer Blutgefäße abhängig ist. In Ausweitung und analog zum Wachstum von soliden Tumoren – wird die Vorbeugung vor Neovaskularisation unter Verwendung von Anti-Angiogenesewirkstoffen im Gegenzug das Wachstum von Fettgewebe verhindern. Überraschenderweise wird durch die Beispiele auch offensichtlich gezeigt, dass Angiogenese bei normalen Tieren Gewichtsverlust hervorrufen kann, nicht nur bei Tieren, bei denen eine verstärkte Zellproliferation von Fettgewebe auftritt. Diese Ergebnisse liefern einen starken Beweis dafür, dass die Verabreichung von Angiogenese verwendet werden kann, um die Größe als auch das Wachstum von Fettgewebe zu regulieren.
Zusätzliche Untersuchungen bei den Tiere, die beschrieben worden sind, liefern des Weiteren einen Beweis dafür, dass die Verabreichung von Angiogenese verwendet werden kann, um die Größe und/oder das Wachstum von normalen vaskularisierten Geweben ohne Nachteil für die Gewebe zu regulieren. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „normale" Gewebe auf Gewebe, welche nicht von Krebs befallen sind, d. h. verändertes oder vernarbtes Gewebe, das aus Wundheilung stammt. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „vaskularisiertes Gewebe" auf Gewebe, wie beispielsweise Muskeln, Darm, Fettgewebe, Endometrium, welche normalerweise durch eine Blutversorgung gekennzeichnet sind, die Nährstoffe und Gasaustausch durch das Gewebe hindurch zur Verfügung stellt. „Gefäßanordnung" im Gegensatz zu vaskularisiertem Gewebe, bezieht sich auf die Blutgefäße selbst.
I. ZUSAMMENSETZUNGEN ZUM VERMINDERN VON FETTGEWEBE
A. VERBINDUNGEN, DIE ANGIOGENESE-MECHANISMEN HEMMEN
Jede Anti-Angiogenese-Verbindung kann verwendet werden, um die Größe und/oder das Wachstum von normalem, vaskularisierten Gewebe zu regulieren. Bevorzugte beispielhafte Anti-Angiogenese-Verbindungen schließen TNP-470, beschrieben in US-Patentschrift Nr. 5,290,807; Angiostatin, beschrieben in US-Patentschrift Nr. 5,639,725: Endostatin und Thalidomide ein. Weitere Verbindungen sind den Fachleuten bekannt. Die nachfolgende Liste von Angiogenese-Inhibitoren wurde am 1. Oktober 1998 in Genetic Engineering News veröffentlicht:
B. TRÄGER/WEGE/MITTEL ZUR VERABREICHUNG
Arzneimittel können parenteral oder enteral verabreicht werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform werden die Arzneimittel oral verabreicht, falls notwendig in einem darmlöslichen Träger, um das Arzneimittel während des Durchgangs durch den Magen zu schützen. Alternative Abgabeverfahren schließen intravenöse, transbukkale oder weitere transmembrane Abgabe und gesteuerte Freisetzungsformeln ein.
C. DOSIERUNGEN
Die Anti-Angiogenese-Zusammensetzung wird in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die Größe und/oder das Wachstum eines vaskularisierten Gewebes zu regulieren. Die wirksame Menge wird typischerweise aus einer Menge bestehen, die wirksam ist, um die Zellproliferation des Gewebes zu beschränken oder die Gewebegröße zu vermindern, insbesondere in dem Fall, wenn es sich bei dem Gewebe um Fettgewebe handelt. Die hier verwendeten Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge des Angiogenese-Inhibitors zur Behandlung eines Patienten, um die gewünschte Regulierung bei im Wesentlichen ausbleibender systemischer Vergiftung zu erreichen.
II. BEHANDLUNGSVERFAHREN
A. VORGESCHLAGENE BEHANDLUNGSPROGRAMME
Wie durch die Beispiele veranschaulicht, wird der Angiogenese-Inhibitor in einer Menge und über einen Zeitraum verabreicht, welche zu Blutspiegeln führen, die die Größe und/oder das Wachstum des zu behandelnden vaskularisierten Gewebes regulieren. Bei der bevorzugten Ausführungsform zur Behandlung von Fettsucht werden die Patienten einmal täglich Arzneimittel in einer wirksamen Dosierung erhalten, um das Gewicht auf ein Niveau zu senken, das gehalten werden kann.
B. PATIENTENTYPEN
Das Behandlungsverfahren hat sich sowohl für normale übergewichtige Personen als auch für Personen mit genetischen Defekten als anwendbar erwiesen. Das Verfahren sollte außerdem in den meisten Fällen nützlich sein, bei denen Gewichtszunahmen auf Grund von hormonalen oder metabolischen Defekten oder von Nebenwirkungen der Arzneimittel vorkommen. Zusätzlich zur Förderung des Verlustes an Körperfett bei gleichzeitiger Erhaltung von fettfreier Körpermasse und der Fähigkeit, den Gewichtsverlust bei gleichzeitiger chronischer Verabreichung beizubehalten, zählen die Normalisierung der Blutzuckerspiegel bei mit Fettsucht verbundener Diabetes, und in dem Fall einiger Arzneimittel, wie beispielsweise TNP-470, die Reduzierung des Appetits (d. h. als ein anorektischer Wirkstoff) zu weiteren Vorteilen der Behandlung. Diese Ergebnisse können ohne unerwünschte Nebenwirkungen erreicht werden, ohne die Möglichkeit des Missbrauchs oder der Abhängigkeit.
Angiogenese-Abhängigkeit von normaler Organgröße und -wachstum zeigt Auswirkungen auf den Gebieten, in welchen exzessives oder unzureichendes Gewebewachstum zu klinischen Folgeerscheinungen führt, als auch auf dem Gebiet von Gewebe-Engineering. Die Beispiele zeigen die Wirksamkeit bei Tiermodellen mit Endometriose, Polypose, Herzhypertrophie als auch Fettsucht. Diese Ergebnisse sind Anzeichen für die Wirksamkeit bei der Behandlung von Störungen, zu denen erhöhte Größe oder erhöhtes Wachstum von weiteren Arten normalen Gewebes gehören, wie beispielsweise Uterusfibroide, Prostatahypertrophie und Amyloidose. Diese Störungen treten typischerweise bei Patienten auf, bei denen die erhöhte Größe oder das erhöhte Wachstum von Gewebe zwar nicht normal ist, aber das Gewebe sich nicht verändert hat oder von einer vollständig unterschiedlichen Gewebeart als das ursprüngliche Gewebe ist, obwohl die Stelle (wie in dem Fall von Endometriose) oder das Wachstum (Organhypertrophie) krankhaft ist.
III. BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird durch Bezugnahme auf die nachfolgenden, nicht einschränkenden Beispiele besser verstanden werden.
BEISPIEL 1: BEHANDLUNG MIT TNP-470 VON GENETISCH FETTSÜCHTIGEN MÄUSEN
Die erste Serie von Experimenten wurde an ob/ob Mäusen durchgeführt, d. h. Mäusen mit einer Erbanlage, welche aufgrund einer spontanen Mutation des Leptingens eine krankhafte Fettsucht entwickelt. (Zhang, et al., 1994, Na ture, 372: 425–432). Tierversuche wurden in der Tierabteilung des Children's Hospital von Boston, USA, gemäß den Richtlinien des Instituts durchgeführt. Männliche ob/ob Mäuse (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) im Alter von sieben Wochen bis sechs Monaten und Gewichten in einem Bereich von zwischen 35 bis 70 Gramm wurden vor dem Experiment akklimatisiert, in individuellen Käfigen untergebracht und hatten während der Versuche freien Zugang zu Wasser.
Die Tiere wurden durch eingeatmetes Methoxyfluran (Pitman-Moore, Inc., Mundelein. IL, USA) vor allen Behandlungen (Rasieren und Fotografieren) anästhesiert und bis zum vollständigen Aufwachen überwacht. Die Tiere wurden am Ende der Experimente durch kontinuierliches Einatmen von Methoxyfluran geopfert.
Die Rücken der Mäuse wurden zur Erleichterung der Injektionen abrasiert. Alle Injektionen und Messungen wurden zwischen 16:00 Uhr und 18:00 Uhr täglich durchgeführt.
Den Mäusen wurde subkutan 5 oder 10 mg/kg TNP-470 (AGM-1470) oder Kochsalzlösung bei der Kontrolle unter Verwendung einer 30G-Nadel über Behandlungszeiträume von bis zu 30 Tagen injiziert (bis dahin). Es wurde beobachtet, dass das subkutane Fett an der Stelle der TNP-470-Injektionen abnahm, so dass die Stelle entlang des Rückens gewechselt wurde. Zum Vergleich erhielt eine Tiergruppe Fenfluramin (40 mg/kg, intraperitoneal, täglich). Das Gewicht von jedem Tier und das verbleibende Futter wurden täglich gemessen.
Eine Tiergruppe wurde paarweise gefüttert, um zu bestimmen, ob die gesamte Wirkung des Gewichtsverlustes durch TNP-470, oder ein Teil davon, das Ergebnis von unterdrücktem Appetit war. Dies geschah durch Paarbildung einer unbehandelten Maus mit jeder behandelten Maus und indem die unbehandelte Maus dieselbe Nahrungsmenge zu essen bekam, wie ihr behandelter Partner an dem Tag zuvor gegessen hatte.
1A zeigt die Gewichtsverlustreaktion von Mäusen, die mit TNP-470 behandelt wurden. Die behandelten Mäuse verloren das Gewicht auf eine von der Dosis abhängigen Weise. Der Gewichtsverlust bei den mit TNP-470 behandelten Gruppen war deutlich größer als derjenige, der durch Fenfluramin bei maximaler Dosis erreicht wurde. Der Gewichtsverlust der Gruppe, die 10 mg/kg TNP erhielt, verlief kontinuierlich mit durchschnittlich 1 g pro Tag bis sie eine fettfreie Körpermasse von ungefähr 22 bis 24 Gramm erreichten. Dieser Gewichtsverlust war unabhängig von dem Gewicht des Tieres zu Beginn des Versuchs erreichbar. Die Gewichte der Tiere stabilisierten sich bei diesen Niveaus, obwohl das Arzneimittel weiterhin verabreicht wurde. Die Tiere, die eine geringere Dosis von TNP-470 erhielten, stabilisierten sich bei einem höheren Gewicht. Die Tiere verblieben während des Versuchs gesund und aktiv.
Wie in 1B gezeigt, zeigten die mit TNP-470 behandelten Mäuse, verglichen mit den Tieren aus der Kontrolle, einen Verlust an Appetit, der alleine zu Gewichtsverlust führte. Allerdings war der Gewichtsverlust, der aus der verminderten Nahrungaufnahme resultierte, wesentlich geringer als derjenige, der durch TNP-470 erreicht wurde.
Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass TNP-470 über zwei Mechanismen funktioniert, um Gewicht zu reduzieren – eine zentrale Unterdrückung des Appetits und eine periphere Angiogenese-Inhibition. Über die Wirkung der Unterdrückung von Appetit durch TNP-470 ist niemals zuvor berichtet worden.
BEISPIEL 2: BEHANDLUNG VON NORMALEN MÄUSEN, UM FETT DURCH DIE VERABREICHUNG VON TNP-470 ZU VERMINDERN
Das Experiment des paarweisen Fütterns wurde mit normalen Mäusen ohne die Leptingenmutation wiederholt, die keine Fettsucht entwickelten. Bei diesen Tieren, welche zu Beginn des Versuchs wesentlich näher an ihrer fettfreien Körpermasse waren, wurde ein kleiner Gewichtsverlust beobachtet, der bei den behandelten und den paarweise gefütterten Gruppen ähnlich war. Dies lässt darauf schließen, dass bei einem mageren Tier, bei dem die in dem langsam wachsenden Fettgewebe stattfindende Angiogenese angenommenermaßen beschränkt ist, der größte Teil des mit TNP-470 erreichten Gewichtsverlustes das Ergebnis von unterdrücktem Appetit ist. Auch diese Tiere zeigten keine Anzeichen von Vergiftung.
Proben von Fettgewebe wurden histologisch auf Anzeichen von Endothelzellproliferation, die auf Bildung von neuen Blutgefäßen sowohl in behandelten als auch unbehandelten Tieren hinweisen, unter Verwendung der PCNA- und BrdU-Färbungsmethoden untersucht. Es gab eine deutlich größere Endothelzellproliferation bei den unbehandelten Tieren im Vergleich zu denen, die TNP-470 erhielten. Dies unterstützt die Hypothese, dass Angiogenese in dem Fettgewebe von diesen Mäusen stattfindet, und dass sie durch TNP-470 gehemmt werden kann.
Die Schlussfolgerung daraus ist, dass TNP-470 sowohl bei fettsüchtigen als auch normalen Mäusen einen von der Dosis abhängigen Gewichtsverlust verursacht, bis zu einem Niveau an fettfreiem Körpergewicht als dem Ergebnis von sowohl einer Appetitunterdrückung als auch einer Inhibition der Angiogenese, unabhängig von dem Ausgangsgewicht des Tieres.
Der mit TNP-470 erreichte Gewichtsverlust ist bei weitem höher als derjenige, der mit Fenfluramin erreicht wird.
Diese Ergebnisse unterstützen die Anwendung von Angiogenese-Inhibition zur Behandlung von Fettsucht.
Darüber hinaus ist außerdem eine Wirkung der Unterdrückung des Appetits von TNP-470 bewiesen worden.
EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Tierversuche
Tierversuche wurden im Children's Hospital von Boston, USA, gemäß den Richtlinien des Instituts durchgeführt. Männliche ob/ob (C57BL/6J) und C57 (C57BL/6J) Mäuse wurden im Alter von sieben Wochen gekauft und eine Woche lang vor dem Experiment akklimatisiert (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA). Die Mäuse waren individuell bei freiem Zugang zu Wasser und standardmäßigem Futter untergebracht.
Die Eingriffe erfolgten zwischen 16:00 Uhr und 18:00 Uhr, um die Fütterungsroutine so wenig wie möglich zu unterbrechen. Die Tiere wurden durch eingeatmetes Methoxyfluran (Pitman-Moore, Inc., Mundelein, IL, USA) vor allen Behandlungen, die Unbehagen und Stress verursachen, anästhesiert und bis zum vollständigen Aufwachen überwacht.
Die Haare wurden zur Vereinfachung der Injektionen abrasiert. TNP-470 wurde großzügigerweise von Takeda Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan) zur Verfügung stellt und trocken bei 40°C gelagert. Die Lösungen wurden täglich in normaler Kochsalzlösung zubereitet und subkutan an wechselnden Stellen entlang des Rückens verabreicht. Das Körpergewicht und das in den Futternäpfen verbleibende Futter wurden täglich gemessen. Die Tiere wurden durch kontinuierliches Einatmen von CO₂ geopfert.
Versuch zur Dosisreaktion
Im Alter von acht Wochen wurden die ob/ob Mäuse 21 Tage lang mit 2,5, 5,0, 7,5, oder 10 mg/kg/Tag TNP-470 behandelt. Eine Kontrollgruppe erhielt 0,1 ml/Tag Kochsalzlösung. Die Gruppe, welche 10 mg/kg/Tag TNP-470 erhielt, bestand aus acht Mäusen, alle anderen Gruppen bestanden aus jeweils vier Mäusen.
Behandlung krankhaft fettsüchtiger Mäuse
Im Alter von acht Wochen wurden die ob/ob Mäuse untergebracht, bis sie ihre schnelle Wachstumsphase abgeschlossen hatten und mehr als 60 g wogen. Im Alter von ungefähr fünf Monaten (n = 6) wurde mit der Behandlung von 10 mg/kg/Tag TNP-470 begonnen und über 67 Tage fortgesetzt. Eine altersgleiche Kontrollgruppe von ob/ob/Mäusen (n = 6) erhielt 0,1 ml/Tag Kochsalzlösung.
Langzeitbehandlungsversuch
Im Alter von acht Wochen (n = 6) wurden die ob/ob Mäuse 138 Tage lang mit 10 mg/kg/Tag TNP-470 behandelt. Eine Kontrollgruppe (n = 4) erhielt 0,1 ml/Tag Kochsalzlösung. Die Körpergewichte von normalen, altersgleichen C57 Mäusen (n = 5) wurden zum Vergleich täglich aufgezeichnet.
Vergleich mit Fenfluramin
Im Alter von acht Wochen wurde den ob/ob Mäusen 45 Tage lang (n = 12) 40 mg/kg/Tag Fenfluramin in 0,1 ml Kochsalzlösung intraperitoneal injiziert.
Die Mäuse wurden dann gleichmäßig in drei Gruppen aufgeteilt und dann wurde entweder 1) die Therapie beendet, 2) weiter mit Fenfluramin behandelt, oder 3) es wurde zu 10 mg/kg/Tag TNP-470 für die verbleibende Zeit des 168 Tage dauernden Versuchs gewechselt. Eine Kontrollgruppe von ob/ob/Mäusen (n = 4) erhielt 0,1 ml/Tag Kochsalzlösung.
Versuche paarweiser Fütterung
Im Alter von acht Wochen wurden die ob/ob Mäuse, die freien Zugang zum Futter hatten, mit 10 mg/kg/Tag TNP-470 (n = 4) behandelt. Das in dem Futternapf verbleibende Futter wurde täglich gewogen und die von jeder Maus pro Tag konsumierte Menge wurden berechnet. Diese Futtermenge wurde dann an eine Partnermaus in einer zweiten unbehandelten Gruppe (n = 4) verfüttert. Der Nahrungsverzehr einer Kontrollgruppe von unbehandelten Mäusen mit freiem Zugang zum Futter wurde ebenfalls aufgezeichnet. Die Körpergewichte wurden täglich gemessen. Das Experiment wurde mit normalen, altersgleichen C57 Mäusen (n = 5/Gruppe) wiederholt. Paarweise Fütterungsversuche wurden ebenfalls mit Mäusen durchgeführt, die mit Angiostatin und Endostatin behandelt wurden, wobei dieses Protokoll befolgt wurde.
Zyklusmäßige Behandlung mit TNP-470
Im Alter von acht Wochen wurden ob/ob Mäuse (n = 15) in unterbrochenen Zyklen mit 10 mg/kg/Tag TNP-470 behandelt. Die Mäuse hatten zu Beginn ein Gewicht von 45 g und wurden behandelt, bis sie bis zu dem Körpergewicht von altersgleichen C57 Mäusen abnahmen. Die Behandlung wurde dann unterbrochen und es wurde den Mäusen gestattet, wieder bis zu dem Ausgangsgewicht von 45 g zuzunehmen. Dieser Zyklus wurde zweimal wiederholt. Da hier Reproduzierbarkeit und die Wirksamkeit bei den ob/ob Mäusen, die mehr als 60 g wogen, bewiesen wurde, wurde der behandelten Gruppe dann ermöglicht, in dem dritten Zyklus (Tag 135) bis zu einem durchschnittlichen Gewicht von 59 g zuzunehmen, bevor die Behandlung erneut gestartet wurde.
Anschließend durchliefen die Mäuse Zyklen zwischen den Gewichten der ob/ob und der C57 Kontrollgruppen. Alle Mäuse wurden täglich gewogen.
Behandlung von fettsüchtigen Mäusen mit Angiostatin und Endostatin
Murines Endostatin- und Angiostatin-Rekombinant wurden durch Escherichia coli produziert, wie von O'Reilly et al., 1994. Cell. 79: 315–328; O'Reilly, et al., 1997.
Cell. 88 277–285 beschrieben. Im Alter von acht Wochen erhielten die ob/ob Mäuse (n = 3/Gruppe) subkutane Injektionen von Antiostatin bei 20 mg/kg/Tag oder 50 mg/kg zweimal täglich, oder Endostatin bei 50 mg/kg zweimal täglich über 22 Tage. Eine Kontrollgruppe von ob/ob/Mäusen (n = 3) erhielt 0,1 ml/Tag Kochsalzlösung.
Körperzusammensetzungassay
Die Körperzusammensetzung der Mäuse wurde unter Verwendung einer Verdünnungstechnik mit Tritiumwasser bewertet (Logsdon, 1972, Radiologic Technology, 44: 146–149). Im Alter von fünf Monaten wurden behandelte Tiere (n = 6) und Tiere aus der Kontrolle (n = 3) aus dem Langzeitbehandlungsversuch mit TNP-470 (90 Tage) und normale altersgleiche C57 Mäuse (n = 3) für diesen Versuch verwendet. Die Mäuse mussten 12 Stunden lang bei freiem Zugang zu Wasser fasten. Sie wurden danach mit 200 μl Tritiumwasser (100 μCi/ml) zwangsernährt und verblieben zwei weitere Stunden fastend, damit sich das Tritium innerhalb der Wasserkompartiments gleichmäßig verteilen konnte. Danach wurden die Tiere anästhesiert und zwei Minuten lang unter eine Wärmelampe gelegt, um eine Gefäßerweiterung des Schwanzes einzuleiten. Ein 0,5 mm tiefer Einschnitt, 5 mm von dem Ansatz entfernt, wurde mit einem chirurgischen Skalpell Nr. 10 senkrecht zu der ventralen Längsachse des Schwanzes vorgenommen. Es wurde darauf geachtet, eine Verletzung der zentralen Schwanzarterie zu vermeiden. Eine Blutprobe von 50 μl wurde von den Schwanzvenen in Serumseperierungsfläschchen entnommen und auf Eis gelegt. Die Blutung wurde durch leichte Kompression über dem Einschnitt gestoppt. Die spezifische Aktivität des Tritiumwassers wurde unter Verwendung eines Wallac 1409 Flüssigkeit-Szintillationszählers in Proben gemessen, die 10 μl Plasma und 3 ml Ecolume Szintillationsflüssigkeit (ICN, Costa Mesa, CA, USA) enthielten. Die Veränderlichkeit zwischen doppelten Proben betrug im Durchschntitt weniger als 10%. Die folgenden Formeln wurden angewendet, um die gewünschten Parameter zu berechnen.
Der Faktor von 1,064 wird verwendet, um die Tatsache zu korrigieren, dass das Serum zu ungefähr 94% aus Wasser besteht. Der Faktor von 2.000 ist der Verdünnungsfaktor, der benötigt wird, um die gesamte Tritiumaktivität in der verabreichten Dosis zu berechnen.
Der Faktor vor 0,73 ist der mittlere Prozentsatz des gesamten Körperwassers, das in fettfreier Körpermasse gefunden wird, wie aus der Analyse von Kadavern abgeleitet (Widdowson, et al., 1968). Fettmasse = Gesamtes Körpergewicht – fettfreie Körpermasse (3)
Serumglukosemessungen
Die Serumglukosespiegel von neun Monate alten, behandelten (n = 5) und unbehandelten (n = 13) ob/ob Mäusen wurden am Ende des Gewichtsreaktionsversuches gemessen. Blutproben (100 μl) wurden aus den Schwanzvenen von anästhesierten Mäusen, wie vorstehend beschrieben, entnommen. Die Serumglukosespiegel wurden von dem klinischen Chemielabor im Children's Hospital, Boston, USA, gemessen und in mg/dl ausgedrückt.
Zellkulturversuche
Bovine Kapillarendothelzellen (BCE, bovine capillary endothelial cells) wurden erhalten, wie vorstehend von Folkman et al., 1979, Proc Natl Acad Sci. USA, 76: 5217–5221 beschrieben. BCE wurden auf Gewebenährbodenschalen aufgetragen, die mit 1,5% Gelatine überzogen waren, und wurden in DMEM kultiviert, das 10% Rinderkalbserum (BCS, bovine calf serum), 1% Glutamine/Antibiotika (GPS), und 3 ng/ml humanes basisches Fibroblastenwachstumsfaktor-Rekombinant (bFGF; Scios Nova, Mountainview, CA, USA) enthielt. BCE wurden bei 37°C in 10% CO₂ aufbewahrt und wurden konfluierend unter Verwendung einer 0,5%igen Trypsinlösung übertragen. 3T3-L1-Zellen wurden von ATCC erhalten und gemäß den beigefügten Anweisungen aufbewahrt. 3T3-L1 wurden in DMEM kultiviert, das 10% BCS ohne Antibiotika enthielt, und wurden auf unbeschichtete Gewebenährbodenschalen aufgetragen. Die Zellen wurden unter Verwendung einer 0,5%igen Trypsinlösung übertragen, wenn sie zu 70% konfluierend waren, um eine Differenzierung in Adipozyten zu vermeiden.
Assay der bovinen Kapillarendothelzellproliferation
BCE wurden fünf Tage lang konfluierend vor der Verwendung in den Zellproliferationsassays aufbewahrt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und in einer 0,05%igen Trypsinlösung dispergiert. BCE wurden in DMEM resuspendiert, das 10% BCS und 1% GPS enthält (25.000 Zellen/ml) und auf gelatinierte 24-Loch-Nährbodenschalen bei einer Dichte von 12.500 Zellen/Loch (0,5 ml/Loch) aufgetragen. Die Schalen wurden 24 Stunden lang inkubiert. Das Medium wurde mit 0,25 ml Assaymedium (DMEM + 5% BCS + 1% GPS) ersetzt, welches die Versuchsprobe mit zweifacher Endkonzentration enthielt. Nach 30 Minuten Inkubationszeit wurden 0,25 ml des Assaymediums, das 2 ng/ml an bFGF enthielt, hinzugefügt. Die Löcher enthielten dann 0,5 ml Assaymedium mit der Versuchsprobe bei einfacher Konzentration und 1 ng/ml bFGF. Nach 72 Stunden Inkubationszeit wurden Zellen in Trypsin dispergiert, in Hematall (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA) resuspendiert und unter Verwendung eines Coulter-Zählers gezählt.
Assay der 3T3-L1 Zellproliferation
Subkonfluierende Kulturen von 3T3-L1 Zellen wurden mit PBS gewaschen und in einer 0,05%igen Trypsinlösung dispergiert. Die Zellen wurden in DMEM resuspendiert, das 10% BCS (16.000 Zellen/ml) enthält, und auf 24-Loch-Nährbodenschalen bei einer Dichte von 8.000 Zellen/Loch (0,5 ml/Loch) aufgetragen. Die Schalen wurden 24 Stunden lang inkubiert. Das Medium wurde mit 0,25 ml Assaymedium (DMEM + 5% BCS) und der Versuchsprobe bei zweifacher Endkonzentration ersetzt. Nach 30 Minuten Inkubationszeit wurden 0,25 ml des Assaymediums, das 2 ng/ml bFGF enthielt, hinzugefügt. Die Löcher enthielten dann 0,5 ml Assaymedium mit der Versuchsprobe bei einfacher Konzentration und 1 ng/ml bFGF. Nach 72 Stunden Inkubationszeit wurden Zellen in Trypsin dispergiert, in Hematall resuspendiert und unter Verwendung eines Coulter-Zählers gezählt.
Immunohistochemie
Eine doppelte fluoreszierende Markierungstechnik wurde verwendet, um gleichzeitige Identifikation von proliferierenden Zellen (BrdU) und Endothelzellen (von Willebrand Faktor; vWF) in Fettgewebeschnitten zu ermöglichen.
Fettgewebe wurde vier Stunden lang in kaltem Carnoy's Fixiermittel fixiert und in 100% Ethanol transferiert. Gewebe wurden gemäß standardmäßigen histologischen Verfahren in Paraffin eingebettet. Schnitte (5 μm dick) wurden mit 10 μg/ml Proteinase K bei 37°C für 20n Min. durchlässig gemacht und mit PBS gewaschen. Um die proliferierenden Zellen zu kennzeichnen, wurden Schnitte mit einer Anti-BrdU/Nukleasemischung (BrdU Markierungs- und Nachweiskit 1; Boehringer Mannheim, Deutschland) bei Raumtemperatur 60 Min. lang inkubiert und anschließend mit PBS gewaschen. Objektträger wurden bei 4°C über Nacht in fluoreszierendem Pferd Anti-Maus IgG (Vector; Burlingane, CA, USA) inkubiert. Um das Endothel zu markieren, wurden Schnitte mit 5%igem Pferdeserum 30 Min. lang blockiert und anschließend mit Kaninchen Antiserum gegen humanen von Willebrand Faktor (DAKO) in 5%igem Ziegenserum verdünnt in PBS inkubiert.
Die Antikörperbindung wurde durch Texas-Rot konjugiertes Ziegen Anti-Kaninchen IgG (Vector Laboratories) nachgewiesen. Gefärbte Schnitte wurden mit Fluoromount G (Southern Biotechnology Associates, Inc.) konserviert. Objektträger wurden unter Verwendung eines fluoreszierenden Zeiss Axiophot Mikroskops (Zeiss, Oberkochen, ehemalige DDR) mit blauem Licht bei 485 nm für die FITC Erregung (BrdU) und grünem Licht bei 510 bis 560 nm für die Texas Rot-Erregung (Endothel) analysiert. Fotografien wurden mit 40-facher Vergrößerung auf einem Ektachrome p1600 Film (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA) aufgenommen. Proliferierendes Endothel war auf dem Film als gelbe Zellen (grün + rot) nachweisbar.
Statistische Analyse
Ein einseitiger Studenten t-Versuch wurde als Vergleich von Körpergewichten, Körperfettanteil, Serumglukosespiegeln zwischen den behandelten und unbehandelten Gruppen verwendet. Der Vergleich zwischen den behandelten und paarweise gefütterten Gruppen wurde unter Verwendung eines paarweisen Studenten t-Versuchs durchgeführt.
Ergebnisse
Gewichtszunahme bei fettsüchtigen und nicht fettsüchtigen Mäusen
Sowohl die fettsüchtigen (ob/ob) als auch die nicht-fettsüchtigen (C57) Mäuse, die in diesen Versuchen verwendet wurden, erlebten während der ersten wenigen Monate ihres Lebens einen Zeitraum von schnellem Wachstum und Gewichtszunahme, der sich mit zunehmendem Alter der Tiere verlangsamte. Die ob/ob Mäuse nahmen allerdings wesentlich schneller zwei- bis dreimal so viel an Gewicht zu, verglichen mit den altersgleichen Kontrollen. Dieser Unterschied war weitgehend auf die Anhäufung von überschüssigem Fettgewebe zurückzuführen. Bei diesen Versuchen wogen acht Wochen alte ob/ob Mäuse 44,6 ± 0,7 g und nahmen mit einer durchschnittlichen Rate von 0,4 g/Tag (n = 12) zu. Zum Vergleich wogen normale, altersgleiche C57 Mäuse 23,0 ± 0,6 g und nahmen mit einer durchschnittlichen Rate von 0,1 g/Tag (n = 5) zu. Die fettsüchtigen Mäuse erreichten maximale Gewichte von mehr als 70 g im Alter von acht bis neun Monaten, verglichen mit ihren normalen Artgenossen, die maximale Gewichte von mehr als 30 g im Alter von drei bis vier Monaten erreichten.
Körpergewichtsreaktionen von fettsüchtigen Mäusen auf Angiogenese-Inhibitoren
Die Wirkung von Angiogenese-Inhibitoren auf die Fähigkeit von ob/ob Mäusen, an Gewicht zuzunehmen, wurde untersucht.
TNP-470, ein selektiver Angiogenese-Inhibitor, wurde fettsüchtigen Mäusen 21 Tage bei Dosen von 2,5, 5,0, 7,5, und 10 mg/kg/Tag verabreicht. Fettsüchtige Mäuse, welche TNP-470 erhielten, verloren an Gewicht bei einer Rate, über eine Zeitdauer, und zu einem Ausmaß, die von der Dosis abhingen (2). Die Raten des Gewichtsverlusts bewegten sich zwischen 0,5 g/Tag bei einer Dosis von 2,5 mg/kg/Tag bis zu einem Maximum von 1,2 g/Tag bei Dosen, die gleich oder mehr als 10 mg/kg/Tag (p < 0,00001) betrugen. Im Vergleich fand die höchste Rate an Gewichtsverlust von 1,2 g/Tag bei Mäusen statt, die vier Tage lang ohne Kalorienzufuhr blieben. Trotz weiterer Behandlung stagnierten die Mäuse oder erreichten einen Tiefstpunkt mit Körpergewichten, die sich zwischen 40,5 ± 0,9 g nach 10 Tagen bei 2,5 mg/kg/Tag (p < 0.000001) beliefen. Bezogen auf das durchschnittliche Ausgangsgewicht von 45 g beläuft sich dies, abhängig von den TNP-470 Dosen, auf Gewichtsverluste von 4 bis 25 g. Im Gegensatz dazu nahmen die unbehandelten Mäuse durchschnittlich 9 g zu, und erreichten am Ende dieses Versuchs ein Gewicht von 53,8 ± 0,6 g. Bezogen auf die Endgewichte der Kontrollmäuse wogen die mit TNP-470 behandelten Mäuse 13 bis 34 g weniger.
Die Körpergewichte von fettsüchtigen Mäusen wurden außerdem als Reaktion auf spezifische Angiogenese-Inhibitoren bewertet. Die Mäuse wurden mit Angiostatin bei Dosen von 20 mg/kg/Tag oder 50 mg/kg zweimal täglich, oder Endostatin bei einer Dosis von 50 mg/kg/Tag über 21 Tage behandelt (3). Die Kontrollmäuse nahmen 0,4 g/Tag zu, ausgehend von einem durchschnittlichen Ausgangsgewicht von 45 g, wobei sie am 22. Tag 54,6 ± 0,2 g erreichten. Im Gegensatz dazu nahmen die Mäuse, welche Angiogenese-Inhibitoren erhielten, relativ wenig an Gewicht zu oder verloren an Gewicht. Die Reaktionen auf Angiostatin waren von der Dosis abhängig. Bei 20 mg/kg/Tag war die Gewichtszunahme auf ein Drittel derjenigen der Kontrollen beschränkt und die Mäuse erreichten am Ende des Versuchs 48,5 ± 1,1 g (p < 0,03).
Bei 50 mg/kg Angiostatin zweimal täglich nahmen die Mäuse auf 41,7 ± 0.2 g ab und stagnierten dort (p < 0,0004).
Mäuse, die mit Endostatin behandelt wurden, verloren zunächst ungefähr 2 g, anschließend nahmen sie bis zum 22.
Tag schrittweise bis auf 48,9 ± 0,8 g zu (p < 0,002). Im Vergleich zu den Endgewichten der Kontrolle wogen die behandelten Mäuse 5 bis 13 g weniger.
Langzeitbehandlung mit TNP-470
Langzeitversuche wurden durchgeführt, um das Muster der Körpergewichtsreaktion auf chronische Therapie zu bestimmen. Die Mäuse wurden mit 10 mg/kg/Tag TNP-470 über insgesamt 138 Tage behandelt und die Körpergewichte wurden täglich gemessen (4A). Am Anfang verloren die Tiere bei einer durchschnittlichen Rate von 1,2 g/Tag an Gewicht, wobei sie am 20. Tag bis zu einem Tiefstpunkt von 20,2 ± 0,5 g abnahmen. Darauf folgte ein begrenzter Zeitraum von schneller Gewichtszunahme. Die Körpergewichte pendelten sich am 54. Tag des Versuchs bei ungefähr 32 g ein und verliefen anschließend parallel zu der Wachstumskurve von normalen, altersgleichen C57 Mäusen.
Die Tiere mussten für Zeiträume von insgesamt 24 Stunden an den Tagen 89 und 90 des Versuches fasten, um Verdünnungsexperimente mit Tritiumwasser durchzuführen.
Dies führte zu einem Gewichtsverlust bei allen Gruppen. Die behandelten Mäuse nahmen allerdings dieses verlorene Gewicht nicht wieder zu, obwohl sie wieder zu einer Nahrung nach freier Wahl zurückkehrten. Dies wird durch ein Absinken der Kurve reflektiert, gefolgt von einem Wiederansteigen der Kurve bei einem niedrigeren Körpergewicht.
Bei Abschluss des Versuches wogen behandelte Mäuse 34,8 ± 1,1 g, verglichen mit ob/ob Kontrollmäusen, welche 71,0 ± 0,9 g (p < 0,00001) wogen, und normalen, altersgleichen C57 Mäusen, welche 33,1 ± 0,7 g wogen. Behandelte Mäuse wogen 36 g weniger als unbehandelte ob/ob Mäuse.
Körpergewichtsreaktionen von fettsüchtigen Mäusen auf TNP-470 im Alter von fünf Monaten
Wenn fettsüchtige Mäusen älter werden, bleiben sie zwei bis dreimal so schwer wie normale C57 Mäuse und die Rate der Gewichtszunahme nimmt ab, und wird derjenigen von chronisch fettsüchtigen Menschen ähnlicher (Chlouverakis und Hojnicki, 1974). Um zu bestimmen, ob TNP-470 unter diesen Bedingungen ähnlich wirksam sein würde, wurden ob/ob Mäuse untergebracht, bis sie ihre schnelle Wachstumsphase abgeschlossen hatten. Die Mäuse waren fünf Monate alt und wogen zu Beginn des Experiments mehr als 60 g. Unbehandelte Mäuse nahmen mit einer Rate von 0,1 g/Tag an Gewicht zu und erreichten 73,0 ± 1,0 g am Ende des Versuches. Im Gegensatz dazu nahmen die behandelten Mäuse mit einer Rate von 0,2 g/Tag auf 39,0 ± 1,90 g am 40. Tag der Behandlung ab und pendelten sich für die Dauer der 67 Tage des Versuches auf diesem Niveau ein (p < 0,00001) (4). Normale C57 Mäuse wogen in diesem Alter ungefähr 34 g. Folglich sprachen diese älteren, sehr fettsüchtigen, und gewichtsstabileren Tiere gleichermaßen auf TNP-470 an.
Körperzusamensetzung von fettsüchtigen mit TNP-470 behandelten Mäusen
Da Fettgewebe das einzige ausgewachsene Organ und Ort von Angiogenese bei normalen Tieren ist, wurde die Hypothese aufgestellt, dass es selektiv für Anti-Angiogenese-Therapie empfänglich sein würde. Die Beobachtung, dass sich das Körpergewicht von behandelten Tieren ungefähr bei dem Gewicht von normalen, altersgleichen C57 Mäusen unabhängig von dem Ausgangsgewicht oder der Dauer der Therapie einpendelte, stimmte mit dieser Hypothese überein (4A und 4B).
Eine Verdünnungstechnik mit Tritiumwasser wurde verwendet, um die Körperzusammensetzung der Mäuse zu bewerten und um zu bestimmen, ob der Gewichtsverlust mit einer Abnahme des Körperfettanteils verbunden war (Logsdon, 1972). Mäuse, die 90 Tage lang mit TNP-470 behandelt wurden (4A), und altersgleiche, ob/ob und normale C57B1/6 Mäuse wurden verwendet. Gewichtsverlust als Reaktion auf Anti-Angiogenese-Therapie wurde mit einer 46%igen Reduzierung an Körperfettanteil, von 35% auf 19%, in Verbindung gebracht (Tabelle 2; p < 0,001).
Tabelle 2
Behandelte Mäuse (TNP-470; 10 mg/kg/Tag mal 90 Tage) und ob/ob Kontrollmäuse und altersgleiche, normale C57 Mäuse mussten fasten und wurden mit einer bekannten Menge von Tritiumwasser zwangsernährt. Die Markierung mit radioaktiven Atomen konnte sich gleichmäßig in den Wasserkompartiments des Tieres verteilen. Die Markierungsmenge wurde anschließend in einem kleinen Plasmavolumen gemessen und der Verdünnungsfaktor wurde verwendet, um das gesamte Körperwasser zu bestimmen, aus dem der Körperfettanteil berechnet wurde.
Serumglukosespiegel von fettsüchtigen mit TNP-470 behandelten Mäusen
Die krankhafte Fettsucht bei ob/ob Mäusen wird mit der Entwicklung von Insulinresistenz und Hyperglyklämie in Verbindung gebracht (Coleman und Hummel, 1973). Um zu bestimmen, ob der aus der Anti-Angiogenese-Therapie resul tierende Gewichtsverlust gegen den Ausbruch von Diabetes schützt, wurden die Serumglukosespiegel bei ob/ob Mäusen, die 115 Tage lang mit TNP-470 behandelt wurden, und bei den unbehandelten Kontrollen gemessen. Die unbehandelten Mäuse (73 g) wiesen einen mittleren Glukosespiegel von 224 ± 16 mg/dl auf. Im Gegensatz dazu wiesen die mit TNP-470 (41 g) behandelten ob/ob Mäuse einen mittleren Glukosespiegel von 158 ± 12,6 mg/dl (p < 0,05) auf. Dies liegt innerhalb des normalen Bereichs von 62 bis 175 mg/dl, der für diese Gattung verzeichnet wird (Harkness und Wagner, 1995, The biology and medicine of rabbits and rodents, Biologie und Medizin von Kaninchen und Nagetieren, Lea & Febiger Books, Media, PA, S. 93).
Tabelle 3
Blutproben wurden aus den Schwanzvenen von behandelten (TNP-470; 10 mg/kg/Tag mal 115 Tage) und von ob/ob Kontrollmäusen entnommen. Die Serumglukosespiegel wurden in Serumproben von dem klinischen Chemielabor im Children's Hospital, Boston, USA, gemessen.
Zyklusartige Behandlung von fettsüchtigen Mäusen mit TNP-470
Um die Umkehrbarkeit und Reproduzierbarkeit von Anti-Angiogenese-Therapie in diesem Modell von normalem Ge webewachstum zu demonstrieren, wurden ob/ob Mäuse in unterbrochenen Zyklen mit TNP-470 bei einer Dosis von 10 mg/kg/Tag behandelt (4C). Die Mäuse hatten zu Beginn ein Gewicht von 45 g und wurden behandelt, bis sie auf das Körpergewicht von altersgleichen C57 Mäusen abgenommen hatten. Die Behandlung wurde dann unterbrochen und es wurde den Mäusen gestattet, wieder bis zu dem Ausgangsgewicht von 45 g zuzunehmen. Dieser Zyklus wurde zweimal wiederholt. Da hier Reproduzierbarkeit und Wirksamkeit bei den ob/ob Mäusen, die mehr als 60 g wogen (4B), bewiesen wurde, wurde der behandelten Gruppe dann ermöglicht, in dem dritten Zyklus (135. Tag) bis auf ungefähr 60 g zuzunehmen, bevor wieder mit der Behandlung begonnen wurde. Dies ist ein laufender Versuch und die Mäuse durchliefen die Zyklen zwischen den Gewichten der ob/ob und der C57 Kontrollgruppen.
Die Rate der Gewichtszunahme bei abgesetzter Therapie war größer als diejenige der Kontrollen. Auf Versuche mit Kalorienbeschränkung folgend, war zuvor für diese Tiere über eine beschleunigte Gewichtszunahme berichtet worden, bis das normale fettsüchtige Gewicht hergestellt war (Chlouverakis, 1970). Die behandelten Mäuse haben auf ähnliche Weise und wiederholt abgenommen, während sie TNP-470 erhielten, und wieder zugenommen, wenn das Arzneimittel abgesetzt wurde.
Vergleich von TNP-470 zu Fenfluramin
Die Gewichtsverlustreaktion auf TNP-470 wurde mit derjenigen von Fenfluramin, einem Serotonin-Aufnahme-Inhibitor mit anorektischen Wirkungen verglichen (5).
Fettsüchtige Mäuse, die mit einer hohen therapeutischen Dosis (40 mg/kg/Tag) Fenfluramin behandelt wurden, verloren 4 bis 5 g in den ersten fünf Tagen der Therapie (p < 0,005).
Danach fingen Sie wieder an, schrittweise an Gewicht zuzunehmen, obwohl die Behandlung weiter fortgesetzt wurde. Am 45. Tag des Versuchs wurden die mit Fenfluramin behandelten Mäuse in drei Gruppen aufgeteilt und entweder wurde 1) die Therapie abgesetzt, 2) sie wurden weiter mit Fenfluramin behandelt, oder 3) es wurde auf 10 mg/kg/Tag TNP-470 gewechselt. Am 94. Tag wogen die Kontrollmäuse 65,8 ± 1,4 g; die Mäuse, bei denen Fenfluramin abgesetzt wurde, wogen 65,6 + 1,4 g; und die Mäuse, die weiter auf Fenfluramin blieben, wogen 62,4 + 1,9 g. Es gab keinen deutlichen Unterschied zwischen diesen Gruppen. Im Gegensatz dazu, führte das Ersetzen von Fenfluramin mit TNP-470 in einer Untergruppe von Mäusen zu einer Reduzierung auf das Gewicht von normalen C57 Mäusen, 38,5 ± 0,7 g (p < 0,000001). Dies ist ferner durch das Aussehen der Mäuse dargestellt. Unbehandelte ob/ob Mäuse können nicht einfach von denjenigen unterschieden werden, die mit Fenfluramin behandelt wurden, wohingegen Mäuse, welche TNP-470 erhielten, dieselbe Größe wie ihre C57 Artgenossen aufweisen.
Verträglichkeit von Langzeitbehandlung mit TNP-470 bei fettsüchtigen Mäusen
Bis dahin war die Behandlung mit TNP-470 in Dosen von bis zu 10 mg/kg/Tag über Zeiträume von bis zu 138 Tagen sehr gut verträglich. Dies macht ungefähr 1/5 der Lebenserwartung der Tiere aus. Die einzige Nebenwirkung wird als schwach eingestuft; oberflächliche Vernarbung an der Stelle der wiederholten Injektionen des Arzneimittels. Der Appetit wird in den ersten 10 bis 20 Tagen der Behandlung mittelmäßig unterdrückt und normalisiert sich danach schrittweise.
Das Aktivitätsniveau der behandelten Mäuse war ähnlich desjenigen von C57 Mäusen und gegensätzlich zu den ob/ob Kontrollmäusen, welche inaktiv wurden, sobald sie an Gewicht zunahmen.
Als Schlussfolgerung haben diese Versuche bewiesen, dass Anti-Angiogenese-Therapie bei genetisch fettsüchtigen Mäusen zu einem deutlichen Gewichtsverlust und Reduzierung an Körperfett führt, wenn drei unterschiedliche Angiogenese-Inhibitoren verwendet werden. Dies wurde des Weiteren durch den Beweis unterstützt, dass inaktive Präparate von Angiostatin und Endostatin das Körpergewicht nicht beeinflusste. Die nachfolgende Reihe von Experimenten richtete sich darauf, den Mechanismus (die Mechanismen) zu bestimmen. Die Auswirkungen auf Appetit und auf die peripheren Gewebe werden untersucht. Die Ergebnisse werden nachstehend zusammengefasst.
Versuche paarweiser Fütterung bei mit Angiogenese-Inhibitoren behandelten fettsüchtigen Mäusen
Die Auswirkung von Appetit auf das Körpergewicht bei Mäusen, die mit TNP-470 behandelt wurden, wurde in Experimenten mit paarweiser Fütterung herausgearbeitet. Die genaue Menge von Futter, die täglich von jeder behandelten Maus verzehrt wurde, wurde an eine Partnermaus in einer unbehandelten Gruppe verfüttert (6A und 6B). Die Kör pergewichte der Partnermäuse wurden verwendet, um die Auswirkungen von Appetitveränderungen bei den behandelten Tieren getrennt darzustellen und zu messen. Fettsüchtige Mäuse, welche TNP-470 erhielten, aßen in ungefähr den ersten 18 Tagen der Behandlung weniger. Dies machte ungefähr 56% des ursprünglichen Gewichtsverlustes aus. Danach normalisierte sich der Appetit schrittweise, obwohl die Behandlung fortgesetzt wurde (bis zu 138 Tagen), wie durch eine ständige Zunahme bei den Partnermäusen bis zu annähernden Gewichten der Kontrolle reflektiert wird. Um zu bestimmen, ob die anorektische Wirkung bei denselben Tieren umkehrbar und reproduzierbar war, wurde eine Mäusegruppe in unterbrochenen Zyklen mit TNP-470 behandelt und eine paarweise gefütterte Gruppe wurde verwendet, um die Auswirkung von Appetitveränderungen nachzuverfolgen (6A). Die Mäuse erhielten 20 Tage lang TNP-470, wurden für 15 Tage von der Therapie genommen, und wurden dann ein zweites Mal 36 Tage lang behandelt. Die anorektische Wirkung war nur während der anfänglichen Behandlung mit TNP-470 vorhanden.
Während des zweiten Therapiezyklus verloren die behandelten Tiere an Gewicht, behielten allerdings ihren Appetit, was sich in der ständigen Zunahme der Gewichte bei den paarweise gefütterten Mäusen widerspiegelt. Der Appetit machte nur 17% des Gewichtsunterschiedes zwischen den behandelten und unbehandelten Mäusen während des zweiten Zyklus aus. Der anorektische Mechanismus ist noch nicht bestimmt worden.
Es wurde keine anorektische Wirkung mit Endostatin und Angiostatin bei (20 mg/kg/Tag) in Verbindung gebracht.
Angiostatin bei 50 mg/kg zweimal täglich wurde mit einer geringen Appetitabnahme in Verbindung gebracht, die weniger als 20% des gesamten Gewichtsverlustes ausmacht.
Versuche paarweiser Fütterung bei mit TNP-470 behandelten normalen C57 Mäusen
Normale C57 Mäuse, die mit TNP-470 behandelt wurden, verloren ebenfalls an Gewicht (6B). In diesem Fall wurde annähernd der gesamte anfängliche Gewichtsverlust einer Appetitabnahme zugeschrieben, wie durch die paarweise gefütterten Mäuse reflektiert wird. Die anorektische Wirkung dauerte ungefähr 8 Tage lang, wonach der Appetit der behandelten Mäuse schrittweise anstieg und die Partnermäuse an Gewicht zunahmen. Die behandelten Mäuse fielen auf einen Durchschnitt von 85% des Gewichtes der Kontrolle ab (p < 0,00001). Dies ist bedeutend weniger, als bei den fettsüchtigen Mäusen bei derselben Dosierung von TNP-470 beobachtet (56% des Gewichtes der Kontrolle).
Dies mag die Tatsache reflektieren, dass diese normalen Tiere einen wesentlich niedrigeren Prozentsatz an Körperfett aufweisen, was ja das erklärte Ziel dieser Therapie ist.
Der Gewichtsverlust der behandelten Tiere, der nicht durch Appetit erklärt werden kann, ist höchstwahrscheinlich das Ergebnis einer peripheren Wirkung auf Gewebeebene. Diese Schlussfolgerung wird des Weiteren durch die Beobachtung unterstützt, dass Gewichtszunahme von sowohl den ob/ob als auch den C57 Mäusen durch die Angiogenese-Inhibitoren eingeschränkt war. Die behandelten Mäuse nahmen relativ wenig zu, trotz eines erhöhten Nahrungsverzehrs, der ausreichend war, um Gewichtszunahme bei den paarweise gefütterten Gruppen zu verursachen.
Endothelzellproliferation im Fettgewebe von fettsüchtigen und normalen Mäusen
Um zu bestimmen, ob das Wachstum von Fettgewebe mit der Endothelzellproliferation in Verbindung stand, wurden subkutane Fettgewebeschnitte von behandelten und unbehandelten ob/ob Mäusen und normalen C57 Mäusen untersucht. Eine doppelte fluoreszierende Färbungsmethode wurde verwendet, um gleichzeitig sowohl das Endothel als auch irgendwelche proliferierenden Zellen zu identifizieren. Die Endothelzellenmarkierung, von Willebrand Faktor (vWF), wurde mit einem roten fluoreszierenden Marker gefärbt und BrdU wurde bei den proliferierenden Zellen mit einem grünen fluoreszierenden Marker gefärbt. Proliferierende Endothelzellen wurden mit beiden Markern gefärbt und erschienen gelb.
Das Fettgewebe von normalen C57 Mäusen enthielt relativ kleine Adipozyten und eine hohe Dichte an Endothelzellen, wie durch den Überfluss von rot gefärbten Zellen bewiesen.
Proliferierende Endothelzellen wurden außerdem gelegentlich entdeckt (gelbe Zellen). Das Fettgewebe von unbehandelten fettsüchtigen Mäusen enthielt zahlreiche proliferierende Endothelzellen. Die Dichte der Endothelzellen wurde durch die große Größe intervenierender Adipozyten in den fettsüchtigen Mäusen abgeschwächt. Das Fettgewebe von behandelten ob/ob Mäusen enthielt geweitete, gedrehte Mikrogefäße mit einem geringeren Prozentsatz an Endothelzellen und kaum proliferierende Zellen, was mit der Inhibition von Angiogenese übereinstimmt. Gewebeschnitte von fettsüchtigen Mäusen, bei denen TNP-470 eine Woche lang abgesetzt wurde, wurden ebenfalls untersucht. Diese Tiere nahmen mit schnelleren Raten an Gewicht zu als die Kontrolle. Die Endothelzellendichte war bedeutend niedriger als diejenige von normalem Fettgewebe. Allerdings gab es einen Überfluss an proliferierenden Zellen. Proliferierende Endothelzellen (gelb) als auch Nicht-Endothelzellen (grün) waren vorhanden. Geweitete Mikrogefäße, ähnlich denjenigen, die bei den behandelten Tieren zu sehen waren, wurden außerdem beobachtet.
Endothelzellproliferation und 3T3-L1-Zellproliferation als Reaktion auf TNP-470
Um zu bestimmen, ob TNP-470 eine direkte Auswirkung auf Präadipozyten haben könnte, wurden Zellproliferationsassays unter Verwendung von 3T3-L1-Zellen durchgeführt. Diese Zelllinie weist die meisten Merkmale von Fettzellen im lebenden Organismus auf (Green, 1978, The adipose conversion of 3T3 cells, Die Fettumwandlung von 3T3-Zellen.
In: 10th Miami Symposium on differentiation and development, 10. Miami Symposium über Differenzierung und Entwicklung. Ahmad F, Schultz J, Russell T, Werner R (eds), Academic Press, New York, S. 13). Zellen wurden in einem Bereich von TNP-470-Konzentrationen für 72 Stunden inkubiert und anschließend gezählt. Vergleiche mit bovinen Kapillaren dothelzellen (BCE) wurden erstellt. Die halb-maximale zytostatische Inhibition von Endothelzellproliferation lag bei ungefähr 100 pg/ml. Im Gegensatz dazu waren 10 μg/ml an TNP-470 für einen ähnlichen Inhibitionsgrad bei den 3T3-L1-Kulturen erforderlich.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
Diese Versuche beweisen, dass Fettgewebewachstum und -masse von der Angiogenese abhängen; Angiogenese-Inhibitoren das Körpergewicht und die Fettgewebemasse reduzieren; die Reduzierung des Körpergewichtes mit Angiogenese-Wirkstoffen dosisabhängig ist, umkehrbar ist, und unabhängig von dem Ausgangsgewicht stattfindet; die Gewichtsreduzierung mit jedem getesteten Angiogenese-Inhibitor erreicht wurde; TNP-470 zu einer vorübergehenden Abnahme des Appetits führt; Langzeitbehandlung mit Angiogenese-Inhibitoren gut verträglich ist; die Behandlung krankhafter Fettsucht mit Angiogenese-Inhibitoren Hyperglykämie verhindert.
BEISPIEL 3: BEHANDLUNG VON TIEREN MIT HERZHYPERTROPHIE UNTER VERWENDUNG VON ANGIOGENESE-INHIBITOREN
MODELL
Chronisch erhöhte Schilddrüsenhormonspiegel führen zu einer Volumenüberbelastung des Herzens, die sowohl bei Tieren als auch beim Menschen zu einer exzentrischen Herzhypertrophie führt (Osler W., 1892, The principles and practice of medicine, Prinzipien und Praxis der Medizin, D. Appelton and Company, New York, S. 712–714). Myokardiale Hypertrophie wird gewöhnlich mit krankhaften Erscheinungen des koronaren Gefäßsystems und möglichem Verlust der ventrikulären Funktion, verbunden (Tomanek und Hovanec, 1981, J Mol Cell Cardiol., 13: 471–488; Friberg, 1988, Cardiovasc. Res., 22: 329–339). Allerdings ist durch Schilddrüsenhormone induzierte Herzhypertrophie insofern einzigartig, da sie häufig die ventrikuläre Funktionen und eine Zellproliferation des unterstützenden mikrovaskulären Systems verbessert (Tomanek, et al., 1998, Circ Res., 82: 587–593).
Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass das vaskuläre Endothel für das Wachstum von Herzgewebe bei diesem Modell myokardialer Hypertrophie zwischengeschaltet sein könnte und durch die Verwendung von Angiogenese-Inhibitoren unterdrückt werden könnte. Die Implikationen von derartigen Erkenntnissen beziehen sich auf die Rolle des vaskulären Endothels als einem Regulator normaler Herzmasse und -funktion.
VERFAHREN
Tierversuche wurden im Children's Hospital von Boston, USA, gemäß den Richtlinien des Instituts durchgeführt. Männliche C57BL/6J Mäuse wurden im Alter von sechs Wochen gekauft und wurden eine Woche lang vor dem Experiment akklimatisiert (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA). Die Mäuse waren zusammen in Käfigen untergebracht und hatten freien Zugang zu Wasser und standardmäßigem Futter. Die Tiere wurden durch eingeatmetes Methoxyfluran vor allen Behandlungen, die Unbehagen und Stress verursachen, anäs thesiert und bis zum vollständigen Aufwachen überwacht. Die Haare wurden zum Vereinfachen der Injektionen abrasiert.
Zur Einleitung von Herzhypertrophie wurden die Mäuse 12 Tage mit Thyronin (0,2 mg/kg/Tag, i. p.) behandelt. Darüber hinaus erhielten die Mäuse jeden zweiten Tag gleichzeitig subkutane Injektionen von Kochsalzlösung oder TNP-470 von entweder 10 mg/kg oder 20 mg/kg (n = 3/Gruppe). Die Ergebnisse wurden mit Kontrollen verglichen, die nur mit Kochsalzlösung behandelt wurden (kein Thyronin). Die Tiere wurden am Ende des Versuchs gewogen und durch zervikale Dislokation geopfert. Die Herzen wurden sofort entfernt und, während sie noch schlugen, in warme Pufferlösung gelegt, um das verbleibende Blut aus dem Organ abzulassen. Die Ventrikel wurden von den großen Gefäßen, den Vorhöfen und Bindegewebe glatt abgetrennt und die Kammern wurden geöffnet.
Die Gewebe wurden trocken getupft und gewogen. Die Ventrikulärgewichte wurden zum Körpergewicht normiert und als Prozentsatz des Körpergewichtes dargestellt.
ERGEBNISSE
Thyroninbehandlung führt zu Herzhypertrophie, erhöht das ventrikuläre Gewicht von 0,38% auf 0,58% des Körpergewichtes. Diese Auswirkung wurde durch TNP-470 in einer von der Dosis abhängigen Weise gemildert (7).
Bei einer TNP-470 Dosis von 20 mg/kg betrug das ventrikuläre Gewicht, das mit Thyroninbehandlung erreicht wurde, bei 0,51% des Körpergewichtes (p < 0,05) deutlich weniger als bei den Kontrollen. Darüber hinaus können diesen Zahlen dazu führen, die Auswirkungen von TNP-470 aufgrund der Tatsache zu unterschätzen, dass ein Gewichtsverlust von 1 bis 2 g bei den Mäusen auftrat, die während des 12-Tage-Versuchs TNP-470 erhielten. Die Gewichtsabnahme resultierte aus einer Abnahme von Fettgewebemasse. Es wird allerdings erwartet, dass die Herzgröße der behandelten Tiere ihrem höheren Ausgangsgewicht entsprechend ist. Es laufen Versuche, um dies zu belegen. Die bisher getesteten Dosen betrugen zwei Drittel weniger, als diejenigen, die typischerweise zur Behandlung von Krebs bei Mäusen verwendet werden.
Eine größere Reduzierung bei der Hypertrophie wird mit höheren Dosen erwartet.
BEISPIEL 4: BEHANDLUNG VON DARMPOLYPOSE MIT ANGIOGENESE-INHIBITOREN
MODELL
Apc^Min Mäuse dienen als Modell für adenomatöse Darmpolypen. Min (multiple intestinal neoplasia, mehrfache Darmneoplasie) ist eine durch Ethylnitroso-Harnstoff (ENU) induzierte Mutation des murinen Apc-Gens (adenomatösen Polypose-Koli) (Moser et al., 1990). Dies ist ähnlich wie die Keimlinenmutationen in dem APC-Gen der Menschen mit adenomatöser Familienpolypose oder Gardnersyndrom (Joslyn et al., 1991, Cell, 66: 601–613). Dies sind vererbte Veranlagungen, die durch Darmpolypen gekennzeichnet sind, die sich letztendlich in Krebs umwandeln. APC ist ebenfalls das am häufigsten mutierte Gen bei gelegentlichem menschlichen Kolonkrebs, (Nishisho, et al., 1991, Science, 253: 665–668).
Heterozygote C57B1/6J Min/+ Mäuse entwickeln im Verlaufe der Zeitspanne ihres Lebens spontan 30 bis 60 Adenome im gesamten Darm (Moser, et al., 1990, Science, 247: 322–324).
Die Polypen wachsen größenmäßig weiter und führen schließlich zum Tod der Tiere im Alter von ungefähr 120 Tagen.
Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass das Wachstum dieser präneoplastischen Läsionen von dem vaskulären Endothel abhängt und mit der Anwendung von Angiogenese-Inhibitoren unterdrückt werden könnte.
VERFAHREN
Tierversuche wurden im Children's Hospital von Boston, USA, gemäß den Richtlinien des Instituts durchgeführt. Männliche Min/+ (C57BL/6J) Mäuse wurden im Alter von sechs Wochen gekauft und wurden eine Woche lang vor dem Experiment akklimatisiert (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA).
Die Mäuse waren zusammen in Käfigen untergebracht und hatten freien Zugang zu Wasser und standardmäßigem Futter.
Die Tiere wurden durch eingeatmetes Methoxyfluran (Pitman-Moore, Inc., Mundelein, IL, USA) vor allen Behandlungen, die Unbehagen und Stress verursachen, anästhesiert und bis zum vollständigen Aufwachen überwacht. Die Haare wurden zum Vereinfachen der Injektionen abrasiert.
TNP-470 wurde trocken bei 40°C aufbewahrt. Die Lösungen wurden frisch in normaler Kochsalzlösung zubereitet und subkutan an wechselnden Stellen entlang des Rückens verabreicht. Die Mäuse wurden jeden zweiten Tag über eine oder drei Wochen mit 10 mg/kg TNP-470 behandelt (n = 3/Gruppe). Eine Kontrollgruppe (n = 3) erhielt jeden zweiten Tag 0,1 ml Kochsalzlösung.
Futter wurde 12 Stunden vor Beendigung eines jeden Versuches vorenthalten, um den Darmtrakt zu leeren. Die Tiere wurden durch kontinuierliches Einatmen von CO₂ geopfert. Der gesamte Darmtrakt wurde entfernt und mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung gespült. Der Darm wurde in Längsrichtung geöffnet und die luminale Oberfläche wurde auf Anzahl, Größe und Stelle von Polypen unter Verwendung eines Präpariermikroskops (18-fache Vergrößerung) untersucht. Gewebeproben wurden in gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Schnitte wurden mit H&E zur histologischen Bewertung eingefärbt.
ERGEBNISSE
Die Anzahl und Größe von Darmpolypen war bei mit Angiogenese-Inhibitor behandelten Min/+ Mäusen deutlich reduziert. Nach drei Wochen Behandlung wiesen die Kontrollmäuse 23 ± 1,5 Polypen auf, wohingegen die mit TNP-470 handelten Mäuse 8 ± 1,7 Polypen aufwiesen (8A). Dies ist eine Reduzierung von 66% (p < 0,05). Der Durchmesser der Polypen lag bei den Kontrollmäusen bei 1,90 ± 0,86 mm (Bereich 0,075 bis 0,425 mm) (8B). Im Gegensatz dazu lag der Durchmesser der Polypen bei den behandelten Mäusen im Durchschnitt bei 1,02 ± 0,40 mm (Bereich 0,05 bis 0,175 mm).
Histologische Untersuchung von Polypen der Kontrollmäuse bewiesen markierte zelluläre Dysplasie und zahlreiche kavernöse Gefäße. Die Läsionen waren polyploid, wobei sie sich von der Schleimhaut bis zu dem Lumen erstreckten und gelegentlich nach außen durch die viszerale Oberfläche. Im Gegensatz dazu behielten die Polypen von behandelten Mäusen morphologische Ähnlichkeit mit der umgebenden Schleimhaut, mit weniger dysplastischen Zellen und weniger kleineren Gefäßen.
SCHLUSSFOLGERUNG
Das Vorkommen, das Wachstum und die mögliche Transformation von adenomatösen Darmpolypen hängt von der Angiogenese ab und wird durch das vaskuläre Endothel reguliert.
BEISPIEL 5: BEHANDLUNG VON TIEREN MIT ENDOMETRIOSE UNTER VERWENDUNG VON ANGIOGENESE-INHIBITOREN
MODELL
Bis zu 50% aller menstruierenden Frauen können von Endometriose betroffen sein (Williams und Pratt, 1977, Am J Obstet Gynecol., 129: 245). Menschliche Endometriose kann in einem Nagetiermodell mit einem chirurgischen Eingriff imitiert werden (Cummings und Metcalf, 1996, PSEBM, 212: 332). Es wurden Versuche aufgebaut, um zu testen, ob das Wachstum dieser Gewebeimplantate von dem vaskulären En dothel abhängt und mit der Anwendung von Angiogenese-Inhibitoren unterdrückt werden könnte.
VERFAHREN
Tierversuche wurden im Children's Hospital von Boston, USA, gemäß den Richtlinien des Instituts durchgeführt. Weibliche (B6C3F1) Mäuse wurden im Alter von acht Wochen gekauft und wurden eine Woche lang vor dem Experiment akklimatisiert (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA). Die Mäuse waren zusammen in Käfigen untergebracht und hatten freien Zugang zu Wasser und standardmäßigem Futter. Die Tiere wurden durch eingeatmetes Methoxyfluran (Pitman-Moore, Inc., Mundelein, IL, USA) vor Behandlungen, die Unbehagen und Stress verursachen, anästhesiert und bis zum vollständigen Aufwachen überwacht. Die Haare wurden zum Vereinfachen der Injektionen abrasiert.
TNP-470 wurde trocken bei 40°C aufbewahrt. Die Lösungen wurden frisch in normaler Kochsalzlösung zubereitet und subkutan an wechselnden Stellen entlang des Rückens verabreicht. Die Mäuse wurden jeden zweiten Tag über drei Wochen mit 10 mg/kg TNP-470 behandelt (n = 4/Gruppe). Eine Kontrollgruppe erhielt jeden zweiten Tag 0,1 ml Kochsalzlösung (n = 3).
Unter Verwendung aseptischer Techniken wurden die Mäuse anästhesiert und die Bauchhaare wurden abrasiert. Ein mittelventraler Einschnitt wurde vorgenommen und das linke Uterushorn freigelegt und an beiden Enden abgebunden. Das Uterushorn wurde herausgeschnitten, in ein warmes Medium (Ham's F12) gelegt und in Längsrichtung geöffnet. Es wurden Gewebestücke von 2 mm Durchmesser unter Verwendung eine Hautstanzungsbiopsie geschnitten. Die Gewebestücke wurden auf dem Darmmesenterium angeordnet (4 Stücke/Tier). Die Implantate wurden mit einer Fibrinklebstoffzubereitung am Platz gehalten. Die Baucheinschnitte wurden geschlossen und die Mäuse konnten sich 48 Stunden lang erholen. Anschließend wurden die Mäuse in zwei Gruppen zu je vier Mäusen aufgeteilt. Die Kontrollgruppe wurde mit Kochsalzlösung behandelt. Die Behandlungsgruppe erhielt TNP-470 (10 mg/kg jeden zweiten Tag). Drei Wochen nach dem chirurgischen Eingriff wurden die Tiere durch kontinuierliches Einatmen von CO₂ geopfert. Die peritoneale Höhle wurde auf endometriales Gewebe untersucht. Das Gewebe wurde gezählt und die Durchmesser wurden in der x- und y-Richtung unter Verwendung von Tastzirkeln gemessen und gemittelt.
ERGEBNISSE
Die Größe des endometrialen Gewebes war bei mit einem Angiogenese-Inhibitor behandelten Mäusen reduziert. Im Anschluss an drei Wochen Behandlung betrug das endometriale Gewebe von Kontrollmäusen 2,9 ± 0,4 mm, während das endometriale Gewebe von mit TNP-470 behandelten Mäusen 1,9 ± 0,5 mm betrug, wie in 9 gezeigt. Die Anzahl von Gewebeimplantaten war zwischen den beiden Gruppen ähnlich.
SCHLUSSFOLGERUNG
Die Daten lassen darauf schließen, dass das Wachstum von endometrialem Gewebe, das in die Bauchhöhle implantiert wurde, durch Angiogenese-Inhibitoren unterdrückt wird. Die in diesem Pilotversuch verwendete Dosis von TNP-470 betrug ein Drittel der für Tumor festgestellten Dosis.

Claims

Verwendung eines Angiogenese-Inhibitors bei der Herstellung eines Medikamentes zum Regulieren der Größe und/oder des Wachstums des vaskularisierten normalen Fett-, Herz-, Nieren-, Darm- und Reproduktionsgewebes bei einem Menschen oder Tier.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Inhibitor ein Kollagenase-Inhibitor ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus TNP-470, Angiostatin, Endostatin und Thalidomid.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das normale vaskularisierte Gewebe Fettgewebe ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Tier oder der Mensch einen genetischen Defekt hat, der Fettsucht zur Folge hat.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Inhibitor Appetit unterdrückt.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Inhibitor TNP-470 ist, das in einer Menge verwendet wird, die wirksam ist, um Appetit zu unterdrücken.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das TNP-470 in einer Menge verwendet wird, die wirksam ist, um die vaskuläre Versorgung zum Fettgewebe zu verringern.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Gewebe aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Herz-, Nieren-, Darm- und Reproduktionsgewebe besteht.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Tier oder der Mensch Polyposis hat.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Tier oder der Mensch Endometriose hat.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Tier oder der Mensch eine vergrößerte Prostata hat.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Tier oder der Mensch eine Herz- oder Nierenhypertrophie hat.