JP2018501195A

JP2018501195A - 脂肪細胞分化およびインスリン抵抗性を阻害するための薬物

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Publication number: JP2018501195A
Application number: JP2017524040A
Authority: JP
Inventors: ヨンチャン、ルオ; ホイ、ワン; ホイ、リー; シンアン、ルー; ヤン、フー; シュンリ、ジャン; ダイフ、チョウ
Original assignee: Tsinghua University; Protgen Ltd
Current assignee: Tsinghua University; Protgen Ltd
Priority date: 2014-11-03
Filing date: 2015-11-03
Publication date: 2018-01-18
Also published as: CN107148277A; EP3246043A4; CA3003760A1; EP3246043A1; AU2015342324A1; EP3246043A9; CN114558111A; US20180015148A1; WO2016070798A1; US20220409703A1; CN107148277B; JP2020172546A; AU2015342324B2; JP7227197B2

Abstract

本発明は、食事性肥満、非アルコール性脂肪肝疾患、インスリン抵抗性またはブドウ糖不耐症を治療するための薬剤の調製におけるエンドスタチンまたはその機能的変異体の使用を提供する。本発明の実施形態では、前記機能的変異体は、ＹＨ−１６、ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７、またはｍＺ１０１などであり得る。

Description

本発明は、エンドスタチンの新規な機能に関する。具体的には、本発明は、エンドスタチンが著しく脂肪細胞分化を阻害し、インスリン抵抗性を緩和することを開示する。本発明はまた、食事性肥満、非アルコール性脂肪肝疾患、インスリン抵抗性、ブドウ糖不耐症、およびその他の疾患の治療におけるエンドスタチンの新規な使用を提供する。

脂肪の蓄積は脂肪組織の拡大を招くことがあり、これは血管新生を伴う脂肪細胞の数および体積の増大を意味する(Cristancho AG et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2011; 12:722-734; Daquinag AC et al., Trends Pharmacol Sci 2011; 32:300-307)。

１９９７年に、Ｆｏｌｋｍａｎの研究室は、内因性の血管阻害剤であるエンドスタチン（ＥＳ）を発見し、これは血管内皮細胞を直接標的とすることができ、血管新生阻害活性および腫瘍治療活性を有する(O’Reilly MS et al., Cell 1997; 88:277-285; Boehm T. et al., Nature 197; 390:404-407)。

ＹＨ−１６は、ＥＳのＮ末端に９個の付加的アミノ酸（ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ）を付加することによって得られるＥＳ変異体であり、非小細胞肺癌の治療のための２００５年ナショナル・ファースト・イン・クラス新薬証明書(Fu Y et al., IUBMB Life 2009; 61:613-626; Wang J et al., Zhongguo fei ai za zhi 2005; 8:283-290; Han B et al., J Thorac Oncol 2011; 6(6):1104-1109)を取得した。ＰＥＧ修飾ＥＳおよびＹＨ−１６はそれぞれｍＥＳおよびｍＹＨ−１６と呼称され、ＥＳまたはＹＨ−１６分子を２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られたものである。カップリング部位は、ｍＰＥＧ−ＡＬＤの活性化アルデヒド基とＥＳまたはＹＨ−１６のＮ末端α−アミノ基であった。

血管新生阻害剤は脂肪組織の血管新生を阻害することで肥満を阻害することができることが報告されている(Rupnick MA et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99:10730-10735; Kim MY et al., Int J Obes (Lond). 2010; 34:820-830)。２００２年、Ｆｏｌｋｍａｎの研究室は、ＥＳを含む、マウスの遺伝性肥満を阻害することができる数種の異なる血管阻害剤を報告している(Rupnick MA et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99:10730-10735)。

脂肪細胞の数の増加は直接的に脂肪細胞分化に依存し(Cristancho AG et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2011; 12:722-734)、これは極めて複雑な調節プロセスである。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）は脂肪細胞分化の調節の中心的調節因子であることを示した研究があり(Tang QQ et al., Annu Rev Biochem 2012; 81:715-736)、これは下流の脂肪細胞表現型調節遺伝子（ＣＤ３６、ａｐ２、Ｇｌｕｔ４、ＬＰＬおよびＬＸＲなどを含む）の発現を調節することによって脂肪細胞分化を調節することができる(Cristancho AG et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2011; 12:722-734; Lee J et al., J Cell Biochem 2012; 113:2488-2499)。

多くの疫学研究により、肥満は代謝障害を引き起こすことが示されており、代謝症候群の重要な臨床症状であるが、非アルコール性脂肪肝疾患、インスリン抵抗性、ブドウ糖不耐症、およびＩＩ型糖尿病を引き起こす重要なリスク因子でもある(Malik VS et al., Nat Rev Endocrinol 2013; 9:13-27)。

本発明は、既知の血管阻害剤タンパク質としてのエンドスタチン（ＥＳ）の新規な機能、すなわち、脂肪細胞分化の阻害における活性に関し、この新規な機能に基づいて、食事性肥満、非アルコール性脂肪肝疾患、インスリン抵抗性、およびブドウ糖不耐症などの代謝障害の治療におけるＥＳの新規な使用を提供する。

本発明者らは、ＥＳが前駆脂肪細胞に直接作用して脂肪細胞分化における中心的調節因子としてのＰＰＡＲγ１および／またはＰＰＡＲγ２の発現を阻害することにより、脂肪細胞分化を阻害できることを発見した。

本発明者らは、ＥＳが、マウスにおいて高脂肪食により誘導された体重増加を、マウスにおける脂肪の蓄積を阻害することによって阻害できることを発見した。

本発明者らは、ＥＳが、マウスにおいて高脂肪食により誘導された肝臓重量および脂肪沈着の増加を阻害し、それにより、肝臓の脂肪浸潤を予防および治療できることを発見した。

本発明者らはまた、ＥＳが、マウスにおけるインスリン抵抗性およびブドウ糖不耐症を改善するために、Ａｋｔのリン酸化を増大させることによりマウスのインスリン応答を増強できることを発見した。

本発明者らはまた、ＹＨ−１６、００３、００７およびＺ１０１などのＥＳ変異体が、上記の試験においてＥＳに匹敵する活性を有することを発見した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６、００３、００７およびＺ１０１（ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７およびｍＺ１０１）は、非修飾タンパク質と同等の活性を有する。

図１Ａは、ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される体重増加を有意に阻害したことを示す。^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図１Ｂは、ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される脂肪組織重量の増加を有意に阻害したことを示す。^＊はＰ＜０．０５を意味し、^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図１Ｃは、ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６は、高脂肪食のマウスにおける肺、心臓および腎臓の重量に影響を及ぼさなかったことを示す。図２Ａは、ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される肝臓重量の増加を有意に阻害したことを示す。^＊はＰ＜０．０５を意味し、^＊＊はＰ＜０．０１を意味する。図２Ｂは、ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６処置群マウス肝臓組織切片を示す。図２Ｃは、ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される肝臓脂肪沈着を有意に阻害したことを示す。^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図３Ａは、ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６は、マウスにおいてインスリン抵抗性を有意に改善したことを示す。^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図３Ｂは、ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６は、マウスにおいて糖耐性を有意に改善したことを示す。^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図３Ｃは、ＥＳはインスリンシグナル伝達経路の下流因子であるＡｋｔのリン酸化レベルを有意に増大させたことを示す。図４Ａは、ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６、ＰＥＧ修飾ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６（ｍＥＳおよびｍＹＨ−１６）は、脂肪細胞分化を直接的に阻害したことを示す。図４Ｂは、ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６、ＰＥＧ修飾ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６（ｍＥＳおよびｍＹＨ−１６）による脂肪細胞分化の阻害の定量的統計結果を示す。^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図４Ｃは、ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６、ＰＥＧ修飾ＥＳおよびその変異体ＹＨ−１６（ｍＥＳおよびｍＹＨ−１６）は、脂肪細胞分化の中心的調節因子ＰＰＡＲγ１／２のタンパク質発現を有意に阻害したことを示す。図４Ｄは、ＥＳは脂肪細胞分化の中心的調節因子ＰＰＡＲγ１／２のｍＲＮＡ発現レベルを阻害したことを示す。^＊はＰ＜０．０５を意味し、^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図５Ａは、ＰＥＧ修飾ＥＳおよびその変異体００３、００７（ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７）は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される体重増加を有意に阻害したことを示す。^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図５Ｂは、ＰＥＧ修飾ＥＳおよびその変異体００３、００７（ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７）は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される脂肪組織重量の増加を有意に阻害したことを示す。^＊はＰ＜０．０５を意味し、^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図５Ｃは、ＰＥＧ修飾ＥＳおよびその変異体００３、００７（ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７）は、高脂肪食マウスの肺、心臓および腎臓の重量に対して効果を持たなかったことを示す。図６Ａは、ＰＥＧ修飾ＥＳおよびその変異体００３、００７（ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７）は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される肝臓重量の増加を有意に阻害したことを示す。^＊はＰ＜０．０５を意味し、^＊＊はをＰ＜０．０１意味する。図６Ｂは、ＰＥＧ修飾ＥＳおよびその変異体００３、００７（ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７）処置群マウス肝臓組織切片を示す。図６Ｃは、ＰＥＧ修飾ＥＳおよびその変異体００３、００７（ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７）は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される肝臓脂肪沈着を有意に阻害したことを示す。^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図７Ａは、ＰＥＧ修飾ＥＳおよびその変異体００３、００７（ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７）は、脂肪細胞分化を直接的に阻害したことを示す。図７Ｂは、ＰＥＧ修飾ＥＳおよびその変異体００３、００７（ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７）による脂肪細胞分化の阻害の定量結果を示す。^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図８Ａは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体Ｚ１０１（ｍＺ１０１）は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される体重増加を有意に阻害したことを示す。^＊＊はＰ＜０．０１を意味し、^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図８Ｂは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体Ｚ１０１（ｍＺ１０１）は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される脂肪組織重量の増加を有意に阻害したことを示す。^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図８Ｃは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体Ｚ１０１（ｍＺ１０１）は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される肝臓重量の増加を有意に阻害したことを示す。^＊はＰ＜０．０５を意味する。図８Ｄは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体Ｚ１０１（ｍＺ１０１）は、高脂肪食マウスの肺、心臓および腎臓の重量に対して効果を持たなかったことを示す。図９Ａは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体Ｚ１０１（ｍＺ１０１）は、脂肪細胞分化を直接的に阻害したことを示す。図９Ｂは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体Ｚ１０１（ｍＺ１０１）による脂肪細胞分化の阻害の定量結果を示す。^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図１０Ａは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体００９およびＳ０３（ｍ００９およびｍＳ０３）は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される体重増加を有意に阻害したことを示す。^＊＊はＰ＜０．０１を意味し、^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図１０Ｂは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体００９およびＳ０３（ｍ００９およびｍＳ０３）は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される脂肪組織重量の増加を有意に阻害したことを示す。^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図１０Ｃは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体００９およびＳ０３（ｍ００９およびｍＳ０３）は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される肝臓重量の増加を有意に阻害したことを示す。^＊はＰ＜０．０５を意味する。図１０Ｄは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体００９およびＳ０３（ｍ００９およびｍＳ０３）は、高脂肪食マウスの肺、心臓および腎臓の重量に対して効果を持たなかったことを示す。図１１Ａは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体００９およびＳ０３（ｍ００９およびｍＳ０３）は、肪細胞分化を直接的に阻害したことを示す。図１１Ｂは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体００９およびＳ０３（ｍ００９およびｍＳ０３）による脂肪細胞分化の阻害の定量結果を示す。^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図１２Ａは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体３６および２４９（ｍ３６およびｍ２４９）は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される体重増加を有意に阻害したことを示す。^＊＊はＰ＜０．０１を意味し、^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図１２Ｂは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体３６および２４９（ｍ３６およびｍ２４９）は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される脂肪組織重量の増加を有意に阻害したことを示す。^＊はＰ＜０．０５を意味し、^＊＊はＰ＜０．０１を意味し、^＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図１２Ｃは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体３６および２４９（ｍ３６およびｍ２４９）は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される肝臓重量の増加を有意に阻害したことを示す。^＊はＰ＜０．０５を意味し、^＊＊はＰ＜０．０１を意味する。図１２Ｄは、ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体３６および２４９（ｍ３６およびｍ２４９）は、高脂肪食マウスの肺、心臓および腎臓の重量に対して効果を持たなかったことを示す。図１３は、ＥＳ変異体００３のアミノ酸配列を示す。図１４は、ＥＳ変異体００７のアミノ酸配列を示す。図１５は、ＥＳ変異体Ｚ１０１のアミノ酸配列を示す。図１６は、ＥＳ変異体００９のアミノ酸配列を示す。図１７は、ＥＳ変異体Ｓ０３のアミノ酸配列を示す。図１８は、ＥＳ変異体３６のアミノ酸配列を示す。図１９は、ＥＳ変異体２４９のアミノ酸配列を示す。図２０は、ＥＳのアミノ酸配列を示す。図２１は、ＥＳ変異体ＹＨ−１６のアミノ酸配列を示す。図２２は、ＥＳ変異体３８１、５７、１１４、および１２４のアミノ酸配列を示す。図２３は、ＥＳ変異体１２５、１６０、１６３、および１１９のアミノ酸配列を示す。

発明の具体的説明

本発明は、食事性肥満、非アルコール性脂肪肝疾患、インスリン抵抗性またはブドウ糖不耐症を治療するための薬剤の調製におけるエンドスタチンまたはその機能的変異体の使用を提供する。

本発明は、脂肪細胞分化の回避のための薬剤の調製におけるエンドスタチンまたはその機能的変異体の使用を提供する。

いくつかの実施形態では、前記機能的変異体は、ＹＨ−１６、００３，００７、Ｚ１０１、ＥＳ００６、ＥＳ００８、ＥＳ０１１、Ｓ０２、Ｓ０９、Ｚ００６、Ｚ００８、ＺＮ１、００９、Ｓ０３、３６、２４９、３８１、５７、１１４、１２４、１２５、１６０、１６３、１１９、ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７、ｍＺ１０１、ｍＥＳ００６、ｍＥＳ００８、ｍＥＳ０１１、ｍＳ０２、ｍＳ０９、ｍＺ００６、ｍＺ００８、ｍＺＮ１、ｍ００９、ｍＳ０３、ｍ３６、ｍ２４９、ｍ３８１、ｍ５７、ｍ１１４、ｍ１２４、ｍ１２５、ｍ１６０、ｍ１６３、またはｍ１１９であり得る。本発明の好ましい実施形態では、前記機能的変異体は、ＹＨ−１６、００３、００７、Ｚ１０１、００９、Ｓ０３、３６、２４９、ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７、ｍＺ１０１、ｍ００９、ｍＳ０３、ｍ３６、またはｍ２４９であり得る。

本明細書で使用する場合、用語「機能的変異体」には、アミノ酸配列に１以上の（例えば、１〜５、１〜１０または１〜１５、具体的には、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２またはさらにはそれを越える）アミノ酸の置換、欠失または付加を有するエンドスタチン変異体、およびエンドスタチンまたはその変異体の化学的な修飾、例えば、ＰＥＧ修飾により得られる誘導体を含む。これらの変異体および誘導体は、エンドスタチンと実質的に同じ脂肪細胞分化阻害活性を有する。例えば、ＰＥＧ修飾ＥＳおよびＹＨ−１６は、それぞれｍＥＳおよびｍＹＨ−１６と呼称され、ＥＳまたはＹＨ−１６の、２０ｋＤａモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）による修飾によって得られる。カップリング部位は、ｍＰＥＧ−ＡＬＤの活性化アルデヒド基およびＥＳまたはＹＨ−１６のＮ末端α−アミノ基である（他のＥＳ変異体およびその変異体のＰＥＧ修飾誘導体も同様に修飾され、呼称される）。例えば、本発明の実施形態では、ＹＨ−１６、００３、００７、Ｚ１０１、００９、Ｓ０３、３６および２４９は、エンドスタチンの特に好ましい変異体であり；ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７、ｍＺ１０１、ｍ００９、ｍＳ０３、ｍ３６およびｍ２４９は、それぞれＥＳ、ＹＨ−１６、００３、００７、Ｚ１０１、００９、Ｓ０３、３６および２４９の好ましい誘導体である。ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１２／０８１２１０（引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる）は、ＥＳ００６、ＥＳ００８、ＥＳ０１１、Ｓ０２、Ｓ０９、Ｚ００６、Ｚ００８、およびＺＮ１などのようなエンドスタチンの種々の変異体を提供する。本明細書で、用語「機能的変異体」、または「変異体」は、エンドスタチンの変異体および誘導体を包含する。

本発明はまた、治療上有効な量のエンドスタチンまたはその機能的変異体を対象に投与することを含んでなる、食事性肥満、非アルコール性脂肪肝疾患、インスリン抵抗性またはブドウ糖不耐症を治療するための方法を提供する。

本明細書で使用する場合、用語「治療上有効な量」は、対象において臨床家が望む生物学的または医学的応答を生じさせるのに十分な活性化合物の量を意味する。エンドスタチンまたはその機能的変異体の「治療上有効な量」は、投与経路、対象の体重、年齢および状態などの因子に応じて当業者により決定され得る。例えば、典型的な一日用量は、体重ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの有効成分の範囲であり得る。

本発明で提供される薬剤は、散剤および注射などの臨床上許容可能な投与形に調製することができ、注射などの従来の手段によって投与することができる。

本発明はまた、治療上有効な量のエンドスタチンまたはその機能的変異体を対象に投与することを含んでなる、脂肪細胞分化を阻害するための方法を提供する。

本発明はまた、有効成分としてエンドスタチンまたはその機能的変異体を含む、食事性肥満、非アルコール性脂肪肝疾患、インスリン抵抗性またはブドウ糖不耐症の治療のための薬剤を提供する。

食事性肥満は、食事中のカロリーが身体のエネルギー消費を越える場合に余剰カロリーが体内に脂肪の形で貯蓄されることによって引き起こされる肥満を意味する。

非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、インスリン抵抗性および遺伝的感受性と密接に関連する代謝ストレス誘導性の肝障害を意味する。その病理表現型はアルコール性肝疾患（ＡＬＤ）の場合と同じであるが、患者には過剰飲酒の履歴がない。

インスリン抵抗性は、インスリン耐性とも呼ばれ、インスリンに対する身体の不感受性、従って、ブドウ糖の取り込みおよび利用に対するインスリンの促進効果が通常レベルを下回ることを意味する。言い換えれば、身体は、インスリンに応答するためにより高濃度のインスリンを必要とする。インスリン抵抗性は高レベルのインスリンを誘導し、血漿中の高ブドウ糖は通常、代謝症候群、痛風およびＩＩ型糖尿病をもたらす。

ブドウ糖不耐症は、身体のブドウ糖代謝の低下による血糖値調節能の低下であり、ブドウ糖が多量に取り込まれた後に血糖値は適時に調節されて通常に戻ることができないということで現れる。ブドウ糖不耐症は、適時に介入されなければ糖尿病へと進展することがある。

マウス体重の阻害率＝（１−薬物処置群の体重増加／高脂肪食群の体重増加）×１００％

マウス脂肪貯蔵の阻害率＝（１−薬物処置群の脂肪組織重量／高脂肪食群の脂肪組織重量）×１００％

マウス肝臓重量の阻害率＝（１−薬物処置群の肝臓重量／高脂肪食群の肝臓重量）×１００％

マウス肝臓脂肪沈着の阻害率＝（１−薬物処置群の肝細胞質液胞率／高脂肪食群の肝細胞質液胞率）×１００％

本発明の実施例で使用されるＥＳおよびその変異体は総てベイジンプロトゲンリミテッド（Beijing Protgen Ltd）により提供された。

実施例１ＥＳおよびＹＨ−１６はマウスにおいて高脂肪食により誘導される体重増加を有意に阻害した
合計２４個体の健康なＣ５７ＢＬ／６マウス（７週齢、雄、ＢｅｉｊｉｎｇＶｉｔａｌＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｍｐａｎｙから購入）を各群マウス８個体として４群に分け、次のように処置した：
第１群：通常食群；
第２群：高脂肪食群；
第３群：高脂肪食＋ＥＳ処置群（薬物処置群）；
第４群：高脂肪食＋ＹＨ−１６処置群（薬物処置群）。

通常食群のマウスには、１０％のカロリーが脂肪成分に由来する飼料（Ｄ１２４５０Ｊ、ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ、ＵＳＡ）を与え、高脂肪食群マウスには、６０％のカロリーが脂肪成分に由来する飼料（Ｄ１２４９２Ｊ、ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ、ＵＳＡ）を与えた。

投与経路：６０日の注射期間で、第３群および第４群には、１日１回、ＥＳまたはＹＨ−１６（Ｐｒｏｔｇｅｎ）を１２ｍｇ／ｋｇ／日の用量で腹膜内注射し、第２群には等量の生理食塩水を腹膜内注射し、第１群には注射しなかった。注射の初日を０日目とし、最後の投与は５９日目に行った。マウスの体重を３日に１回測定し、最後の測定は６０日目（すなわち、最終投与の翌日）に行い、体重曲線をプロットした（図１Ａ）。結果は、ＥＳおよびＹＨ−１６は両方とも高脂肪食による体重増を有意に阻害し、その阻害率はそれぞれ３７．５％、および３０．６％であったことを示した（表１）。

６１日目に糖負荷試験の完了後、マウスを犠牲にし、総体脂肪組織を単離し、重量を測定した（図１Ｂ、表１）。これらの結果は、ＥＳまたはＹＨ−１６処置群のマウスの脂肪組織重量は、薬物処置無しの高脂肪食群よりも著しく低かったことを示した。マウスにおいて高脂肪食により誘導される脂肪蓄積に対するＥＳおよびＹＨ−１６の阻害率は、それぞれ４７．７％および４２．２％であった（表１）。

肺、心臓および腎臓をマウスから単離し、重量を測定した（図１Ｃ、表１）。結果は、４群の総てでマウス間の肺、心臓および腎臓の重量に有意差は無かったことを示し、ＥＳおよびＹＨ−１６はマウスの肺、心臓および腎臓に対して影響が無かったことを示唆する。

実施例２ＥＳおよびＹＨ−１６はマウスにおいて高脂肪食により誘導される肝臓重量増加および脂肪沈着を有意に阻害した
実施例１のマウスから、６１日目の糖負荷試験の完了後、肝臓組織を摘出し、重量を測定した（図２Ａ、表１）。ＥＳおよびＹＨ−１６はマウスにおいて高脂肪食により誘導される肝臓重量の増加を阻害し、阻害率はそれぞれ２３．８％および２０．５％であった。

肝臓組織を固定し、パラフィンに包埋した後、８μｍの薄層切片とした。これらの肝臓組織サンプルをヘマトキシリンおよびエオジン（ＨＥ）で染色した。主な工程として、除パラフィンおよび再水和の後、切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色し、次いで、従来の脱水および封止を行い、その後、従来の光学顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７１顕微鏡）で観察し、写真撮影を行った（図２Ｂ）。ＨＥ染色結果は、高脂肪食群のマウス由来の肝臓組織切片には肝細胞質液胞が存在したことを示し、高脂肪食が肝臓において脂肪沈着を引きおこし得たことを示唆し、一方、ＥＳおよびＹＨ−１６処置群のマウス由来の肝臓の脂肪沈着は、薬物投与無しの高脂肪食群よりも有意に低く、阻害率はそれぞれ７８．９％および７５．２％であった（図２Ｃ）。これはＥＳおよびＹＨ−１６が非アルコール性脂肪肝疾患に対して有意な阻害効果を有することを示唆した。

実施例３ＥＳおよびＹＨ−１６はマウスのインスリン抵抗性およびブドウ糖不耐症を有意に改善した
実施例１のマウスに、５９日目の投与が完了して６時間後にインスリン負荷試験を行った。具体的な工程としては、マウスの尾を切り、血液を採取し、基本血糖値を測定し（ロッシュ手持ち血糖計）、モニタリング時間を０分に設定した。生合成ヒトインスリン（ＮｏｖｏｌｉｎＲ、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）を０．５Ｕ／ｋｇで腹膜内注射し、インスリン注射後２０分、４０分、６０分、８０分に血液サンプルを採取し、血糖値を測定し、曲線をプロットした（図３Ａ）。インスリン注射後、通常食群マウスの血糖値は経時的に急速に低下したが、高脂肪食群マウスの血糖値はゆっくり低下したことが判明し、高脂肪食がインスリン抵抗性を引き起こし得たこと、ならびにＥＳおよびＹＨ−１６が高脂肪食により引き起こされたインスリン抵抗性を有意に緩和し得たことが示唆された。

実施例１のマウスを、６０日目の体重測定後、一晩飢餓状態とし、６１日目に糖負荷試験を行った。具体的な工程としては、マウスの尾を切り、血液を採取し、基本血糖値を測定し（ロッシュ手持ち血糖計）、モニタリング時間を０分に設定した。マウスに強制経口投与によってブドウ糖溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を、各マウスの体重１グラム当たりブドウ糖１ｍｇの用量で与えた。ブドウ糖の強制経口投与後２０分、４０分、６０分、８０分に血液サンプルを採取し、マウスの血糖値を測定し、曲線をプロットした（図３Ｂ）。ブドウ糖の強制経口投与後、時間の経過とともに、マウスの血糖値は急速に増大し、通常食群に比べて高脂肪食群では回復速度が緩慢であったことが判明し、高脂肪食がマウスにおいてブドウ糖不耐症をもたらし得たが、ＥＳおよびＹＨ−１６処置群のマウスのブドウ糖不耐症は有意に改善されたことが示唆された。

６１日目の糖負荷試験の完了後、マウスを犠牲にし、総体脂肪組織を単離した後、脂肪組織のＡｋｔのリン酸化レベルをウエスタンブロットにより検出した（図３Ｃ）。結果は、通常食群に比べて、高脂肪食群ではＡｋｔのリン酸化レベルが低かったが、ＥＳ処置群のＡｋｔのリン酸化レベルは高脂肪食群よりも高かったことを示した。Ａｋｔ経路は、インスリンの下流の重要な血糖調節経路である。インスリン抵抗性には多くの場合、Ａｋｔのリン酸化レベルの低下が伴う。このことは、ＥＳがインスリン抵抗性およびブドウ糖不耐症を有効に改善し得たという事実と一致する。

実施例４ＥＳおよびＹＨ−１６は前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を有意に阻害した
良好な状態の３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を選択し、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地に再懸濁させた後、６ウェルプレートに播種し、従来通りにインキュベーター内、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。細胞を２日間増殖させた後、分化誘導を開始した：工程１誘導のためにＭＤＩ誘導培地を添加し（この時を細胞分化１日目と定義）；工程２２日後に培地をインスリン誘導培地に変更し、さらに２日間培養を続け；工程３培地を、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地に変更し、８日目まで培養を続け、３Ｔ３−Ｌ１を脂肪細胞に分化させた。この実験を５群に分けた：
第１群：対照群；
第２群：ＥＳ処置群；
第３群：ＹＨ−１６処置群；
第４群：ｍＥＳ処置群；
第５群：ｍＹＨ−１６処置群。

それらのうち、薬物処置群には、誘導中（すなわち、１日目〜８日目）に５０μｇ／ｍｌのＥＳ、ＹＨ−１６、ｍＥＳまたはｍＹＨ−１６を添加し、対照群には等量のタンパク質バッファーを加えた。前記の薬物添加および対照処置は、各培地交換時に行った。

ＭＤＩ誘導培地は１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地に１μＭデキサメタゾン、０．５ｍＭ３−イソブチル−１−メチルキサンチンおよび１０μｇ／ｍｌウシインスリンを加えることにより調製した。インスリン誘導培地は、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地に１０μｇ／ｍｌウシインスリンを加えることにより調製した。

誘導後、６ウェルプレートの培地を除去し、細胞を固定し、オイルレッドで１０分間染色した。次いで、細胞を脱色し、ＰＢＳで３回すすいで余分な色素を除去した。脂肪細胞中の脂肪はオイルレッドにより識別でき、その後、赤く染まった。デジタルカメラで６ウェルプレートの写真を撮影し、また、倒立顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７１顕微鏡）を用いて観察および写真記録を行った（図４Ａ）。結果は、ＥＳ、ＹＨ−１６、ｍＥＳおよびｍＹＨ−１６は総て、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を阻害し得たことを示した（図４Ｂ）。

誘導過程の６日目に細胞を採取し、培地を除去した。１００μｌの２×ＳＤＳ電気泳動ローディングバッファーを加え、細胞を１００℃で１５分間加熱した。電気泳動およびフィルム転写後、各群からの全細胞溶解液中の、脂肪細胞分化の中心的制御因子であるＰＰＡＲγ１およびＰＰＡＲγ２の発現レベルを免疫ブロット法により検出した（図４Ｃ）。脂肪細胞分化において、ＥＳ、ＹＨ−１６、ｍＥＳおよびｍＹＨ−１６は総てＰＰＡＲγ１およびＰＰＡＲγ２のタンパク質発現レベルを阻害することができ、これらは両方とも脂肪細胞分化の中心的制御転写因子であることが判明した。

ＰＰＡＲγ１およびＰＰＡＲγ２ｍＲＮＡ発現レベルの検出：誘導前（０日目）および誘導６日目に、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）プロトコールの標準プロトコールに従って、３Ｔ３−Ｌ１の全ＲＮＡを抽出した。Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ逆転写キット（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）ＦｉｒｓｔＳｔａｎｄｃＤＮＡ合成キット）を標準プロトコールに従って逆転写に使用した。

脂肪細胞分化の中心的制御因子であるＰＰＡＲγ１／２は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅキット（ＢｒｉｌｌｉａｎｔＩＩＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＱＲＴ−ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ）、蛍光定量的ＰＣＲ装置としてのＭＸ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入）、蛍光色素としてのＳＹＢＲＧｒｅｅｎを用いる蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより、ＰＣＲ反応系２０μｌ、および反応サイクル４０回として検出した。

ＰＣＲ手順：９５℃で１０秒の変性；６０℃で３０秒のアニーリングおよび伸長；２０μｌの反応系、４０回の反応サイクル；最後に７５℃で５分の保持。ＧＡＰＤＨを内部参照として用いた。反応プライマーは次の通りであった：
ＰＰＡＲγ１フォワードプライマー（５’−３’）：ＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＴＧＡ
ＰＰＡＲγ１リバースプライマー（５’−３’）：ＧＣＴＴＧＡＴＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＧＣＧＡＡＧＧＡ
ＰＰＡＲγ２フォワードプライマー（５’−３’）：ＣＧＣＴＧＡＴＧＣＡＣＴＧＣＣＴＡＴＧＡＧ
ＰＰＡＲγ２リバースプライマー（５’−３’）：ＴＧＧＧＴＣＡＧＣＴＣＴＴＧＴＧＡＡＴＧＧＡＡ
ＧＡＰＤＨフォワードプライマー（５’−３’）：ＣＣＡＧＣＣＴＣＧＴＣＣＣＧＴＡＧＡＣＡ
ＧＡＰＤＨリバースプライマー（５’−３’）：ＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＧＴＧＡＧＴＧＧＡＧＴＣ

内部参照としてＧＡＰＤＨを用い、装置によって与えられた蛍光ダイアグラムに従ってΔＣｔ値を得た後、相対的Δ（ΔＣｔ）を計算し、その後、ＰＰＡＲγ１およびＰＰＡＲγ２のｍＲＮＡレベルの相対的変化を計算した（図４Ｄ）。ＥＳは脂肪細胞分化の中心的制御転写因子であるＰＰＡＲγ１およびＰＰＡＲγ２のｍＲＮＡ発現レベルを阻害し得たことが判明した。

実施例５ＰＥＧ修飾ＥＳおよびその変異体００３および００７（ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７）はマウスにおいて高脂肪食により誘導される体重増加を有意に阻害した
合計４０個体の健康なＣ５７ＢＬ／６マウス（７週齢、雄、ＢｅｉｊｉｎｇＶｉｔａｌＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｍｐａｎｙから購入）を各群マウス８個体として５群に分け、次のように処置した：
第１群：通常食群；
第２群：高脂肪食群；
第３群：高脂肪食＋ｍＥＳ処置群（薬物処置群）；
第４群：高脂肪食＋ｍ００３処置群（薬物処置群）；
第５群：高脂肪食＋ｍ００７処置群（薬物処置群）。

各群の食餌は実施例１と同様であった。

投与経路：８週間の期間で、第３群、第４群および第５群には、１週間に１回、５０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で尾静脈からｍＥＳ、ｍ００３またはｍ００７（Ｐｒｏｔｇｅｎ）を注射し、第２群には等量の生理食塩水を注射し、第１群には注射しなかった。注射の初日を０週目とし、最後の投与は７週目に行った。マウスの体重を週に１回測定し、８週目の最後の測定の後に、体重曲線をプロットした（図５Ａ）。結果は、ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７は高脂肪食による体重増加を有意に阻害し、その阻害率はそれぞれ３３．７％、２２．９％、および４２．９％であったことを示した（表２）。

８週目の最後のマウスの体重測定の後に、マウスを犠牲にし、総体脂肪組織を単離し、重量を測定した（図５Ｂ、表２）。結果は、ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７群のマウスの脂肪組織重量は、薬物処置無しの高脂肪食群よりも有意に低かったことを示した。マウスにおいて高脂肪食により誘導される脂肪蓄積に対するｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７の阻害率はそれぞれ４１．４％、３１．９％、および４０．５％であった（表２）。

肺、心臓および腎臓をマウスから単離し、重量を測定した（図５Ｃ、表２）。結果は、５群の総てでマウス間の肺、心臓および腎臓の重量に有意差は無かったことを示し、ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７はマウスの肺、心臓および腎臓に対して影響が無かったことを示唆する。

実施例６ＰＥＧ修飾ＥＳおよびその変異体００３および００７（ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７）はマウスにおいて高脂肪食により誘導される肝臓重量増加および脂肪沈着を有意に阻害した
実施例５のマウスから、８週目の最後のマウスの体重測定後に、肝臓組織を摘出し、重量を測定した（図６Ａ、表２）。結果は、ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７は、マウスにおいて高脂肪食により誘導される肝臓重量の増加を阻害し、阻害率はそれぞれ２１．３％、２１．３％、および２５．２％であったことを示す（表２）。

実施例２のプロトコールに従い、肝臓組織を固定し、パラフィンに包埋し、ＨＥで染色し、従来の光学顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７１顕微鏡）で観察し、記録した（図６Ｂ）。ＨＥ染色結果は、ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７処置群のマウス由来の肝臓の脂肪沈着は薬物投与無しの高脂肪食群よりも有意に低く、阻害率はそれぞれ７０．６％、５６．１％、および７３．１％であったことを示した（図６Ｃ）。このことはｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７が非アルコール性脂肪肝疾患に対して有意な阻害効果を有することを示唆した。

実施例７ＰＥＧ修飾ＥＳおよびその変異体００３および００７（ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７）は前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を有意に阻害した
実施例４と同様に、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を培養し、誘導を行った。実験は４群に分けた：
第１群：対照群；
第２群：ｍＥＳ処置群；
第３群：ｍ００３処置群；
第４群：ｍ００７処置群。

それらのうち、薬物処置群には、誘導中（すなわち、１日目〜８日目）に付加的な５０μｇ／ｍｌのｍＥＳ、ｍ００３またはｍ００７を添加し、対照群には等量のタンパク質バッファーを加えた。前記薬物添加および対照処置は、各培地交換時に行った。

誘導後、実施例４の実験方法に従って、細胞をオイルレッドで染色した。デジタルカメラで６ウェルプレートの写真を撮り、また、倒立顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７１顕微鏡）を用いて観察および写真による記録を行った（図７Ａ）。結果は、ｍＥＳ、ｍ００３、およびｍ００７は総て、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を直接阻害することができ、ｍＥＳおよびｍ００７はｍ００３よりも良好な阻害効果を有していたことを示した（図７Ｂ）。このことは実施例６の動物実験の結果と一致しており、なぜｍＥＳおよびｍ００７が高脂肪食動物の体重増加の阻害においてｍ００３よりも効果的であったかという理由も説明した。

実施例８ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体Ｚ１０１（ｍＺ１０１）はマウスにおいて高脂肪食により誘導される体重増加を有意に阻害した
実験マウスの準備（各群マウス８個体）、食餌（飼料）、投与経路、投与サイクルおよびマウスの体重測定は実施例５と同様であった。実験は次のように群を分けた：
第１群：通常食群；
第２群：高脂肪食群；
第３群：高脂肪食＋ｍＺ１０１処置群（薬物処置群）。
ここで、用量は１２ｍｇ／ｋｇ／週であった。

８週目の最後のマウスの体重測定後に、体重曲線をプロットした（図８Ａ）。結果は、ｍＺ１０１は高脂肪食による体重増加を有意に阻害し、阻害率は３１％であったことを示した（表３）。

８週目の最後のマウスの体重測定の後に、マウスを犠牲にし、総体脂肪組織を単離し、重量を測定した（図８ＢおよびＣ、表３）。結果は、ｍＺ１０１群のマウスの脂肪組織重量は薬物処置無しの高脂肪食群よりも有意に低く、脂肪蓄積の阻害率は７７．２％であったことを示した（表３）。ｍＺ１０１はまたマウス肝臓重量の増加も阻害することができ、阻害率は２１．５％であった（表３）。

肺、心臓および腎臓をマウスから単離し、重量を測定した（図８Ｄ、表３）。結果は、３群の間でマウスの肺、心臓および腎臓の重量に有意差は無いことを示し、ｍＺ１０１はマウスの肺、心臓および腎臓に対して効果を持たなかったことを示唆した。

実施例９ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体Ｚ１０１（ｍＺ１０１）は前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を有意に阻害した
実施例４と同様に、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を培養し、誘導を行った。実験は２群に分けた：
第１群：対照群；
第２群：ｍＺ１０１処置群。

それらのうち、薬物処置群には、誘導中（すなわち、１日目〜８日目）に付加的な５０μｇ／ｍｌのｍＺ１０１を添加し、対照群には等量のタンパク質バッファーを加えた。前記薬物添加および対照処置は、各培地交換時に行った。

誘導後、実施例４の実験方法に従って、細胞をオイルレッドで染色した。デジタルカメラで６ウェルプレートの写真を撮り、また、倒立顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７１顕微鏡）を用いて観察および写真による記録を行った（図９Ａ）。結果は、ｍＺ１０１は前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を直接阻害し得たことを示した（図９Ｂ）。

実施例１０ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体００９およびＳ０３（ｍ００９およびｍＳ０３）はマウスにおいて高脂肪食により誘導される体重増加を有意に阻害し、ｍＳ０３の阻害効果はｍ００９よりも良好であった
実験マウスの準備（各群マウス８個体）、食餌（飼料）、投与経路、投与サイクルおよびマウスの体重測定は実施例５と同様であった。実験は次のように群に分けた：
第１群：通常食群；
第２群：高脂肪食群；
第３群：高脂肪食＋ｍ００９処置群（薬物処置群）；
第４群：高脂肪食＋ｍＳ０３処置群（薬物処置群）。

ここで、用量を１２ｍｇ／ｋｇ／週であった。

８週目の最後のマウスの体重測定後に、体重曲線をプロットした（図１０Ａ）。結果は、ｍ００９およびｍＳ０３は高脂肪食による体重増加を有意に阻害し、阻害率はそれぞれ１０．６％、および１９．０％であったことを示した（表４）。

８週目の最後のマウスの体重測定後に、マウスを犠牲にし、総体脂肪組織を単離し、重量を測定した（図１０ＢおよびＣ、表４）。結果は、ｍ００９およびｍＳ０３群のマウスの脂肪組織の重量は薬物処置無しの高脂肪食群より有意に低く、脂肪蓄積の阻害率はそれぞれ４５．７％および５９．５％であったことを示した（表４）。ｍ００９およびｍＳ０３はまたマウスの肝臓重量の増加も阻害することができ、阻害率はそれぞれ１６．７％および２５．７％であった（表４）。

肺、心臓および腎臓をマウスから単離し、重量を測定した（図１０Ｄ、表４）。結果は、４群間でマウスの肺、心臓および腎臓の重量に有意差は無かったことを示し、ｍ００９およびｍＳ０３はマウスの肺、心臓および腎臓に対して効果を持たなかったことを示唆した。

実施例１１ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体００９およびＳ０３（ｍ００９およびｍＳ０３）は前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を有意に阻害した
実施例４と同様に、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を培養し、誘導を行った。実験を３群に分けた：
第１群：対照群；
第２群：ｍ００９処置群；
第３群３：ｍＳ０３処置群。

それらのうち、薬物処置群には、誘導中（すなわち、１日目〜８日目）に付加的な５０μｇ／ｍｌのｍ００９またはｍＳ０３を添加し、対照群には等量のタンパク質バッファーを加えた。前記薬物添加および対照処置は、各培地交換時に行った。

誘導後、実施例４の実験方法に従って、細胞をオイルレッドで染色した。デジタルカメラで６ウェルプレートの写真を撮り、また、倒立顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７１顕微鏡）を用いて観察および写真による記録を行った（図１１Ａ）。結果は、ｍ００９およびｍＳ０３は両方とも、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を直接阻害することができ、ｍＳ０３はｍ００９より良好な阻害効果を有していたことを示した（図１１Ｂ）。このことは実施例９の動物実験の結果と一致しており、なぜｍＳ０３が高脂肪食動物の体重増加の阻害においてｍ００９よりも効果的であったかという理由も説明した。

実施例１２ＰＥＧ修飾ＥＳ変異体３６および２４９（ｍ３６およびｍ２４９）はマウスにおいて高脂肪食により誘導される体重増加を有意に阻害した
実験マウスの準備（各群マウス８個体）、食餌（飼料）、投与経路、投与サイクルおよびマウスの体重測定は実施例５と同様であった。実験は次のように群に分けた：
第１群：通常食群；
第２群：高脂肪食群；
第３群：高脂肪食＋ｍ３６（６ｍｇ／ｋｇ／週）処置群（薬物処置群）；
第４群：高脂肪食＋ｍ３６（１２ｍｇ／ｋｇ／週）処置群（薬物処置群）；
第５群：高脂肪食＋ｍ２４９（６ｍｇ／ｋｇ／週）処置群（薬物処置群）；
第６群：高脂肪食＋ｍ２４９（１２ｍｇ／ｋｇ／週）処置群（薬物処置群）。

８週目の最後のマウスの体重測定後に、体重曲線をプロットした（図１２Ａ）。結果は、低用量ｍ３６（６ｍｇ／ｋｇ／週）および高用量ｍ２４９（１２ｍｇ／ｋｇ／週）は高脂肪食による体重増加を有意に阻害し、阻害率はそれぞれ３０．３％および５０．３％であったことを示した（表５）。

８週目の最後のマウスの体重測定後に、マウスを犠牲にし、総体脂肪組織を単離し、重量を測定した（図１２ＢおよびＣ、表５）。結果は、低用量ｍ３６（６ｍｇ／ｋｇ／週）群および高用量ｍ２４９（１２ｍｇ／ｋｇ／週）群のマウスの脂肪組織の重量は薬物処置無しの高脂肪食群よりも有意に低く、マウスにおいて高脂肪食により誘導される脂肪蓄積に対する低用量ｍ３６（６ｍｇ／ｋｇ／週）および高用量ｍ２４９（１２ｍｇ／ｋｇ／週）の阻害率はそれぞれ３０％および３８．４％であったことを示した（表５）。低用量ｍ３６（６ｍｇ／ｋｇ／週）および高用量ｍ２４９（１２ｍｇ／ｋｇ／週）はまたマウス肝臓重量の増加も阻害することができ、阻害率はそれぞれ１８．４％および２２．９％であった（表５）。

肺、心臓および腎臓をマウスから単離し、重量を測定した（図１２Ｄ）。結果は、６群間で肺、心臓および腎臓の重量に有意差は無かったことが示され、ｍ３６およびｍ２４９はマウスの肺、心臓および腎臓に対して効果を持たなかったことを示唆した。

Claims

食事性肥満、非アルコール性脂肪肝疾患、インスリン抵抗性またはブドウ糖不耐症を治療するための薬剤の調製における、エンドスタチンまたはその機能的変異体の使用。
前記機能的変異体が、ＹＨ−１６、００３、００７、Ｚ１０１、ＥＳ００６、ＥＳ００８、ＥＳ０１１、Ｓ０２、Ｓ０９、Ｚ００６、Ｚ００８、ＺＮ１、００９、Ｓ０３、３６、２４９、３８１、５７、１１４、１２４、１２５、１６０、１６３、１１９、ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７、ｍＺ１０１、ｍＥＳ００６、ｍＥＳ００８、ｍＥＳ０１１、ｍＳ０２、ｍＳ０９、ｍＺ００６、ｍＺ００８、ｍＺＮ１、ｍ００９、ｍＳ０３、ｍ３６、ｍ２４９、ｍ３８１、ｍ５７、ｍ１１４、ｍ１２４、ｍ１２５、ｍ１６０、ｍ１６３、およびｍ１１９からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
前記機能的変異体が、ＹＨ−１６、００３、００７、Ｚ１０１、００９、Ｓ０３、３６、２４９、ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７、ｍＺ１０１、ｍ００９、ｍＳ０３、ｍ３６、およびｍ２４９からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
脂肪細胞分化を阻害するための薬剤の調製における、エンドスタチンまたはその機能的変異体の使用。
前記機能的変異体が、ＹＨ−１６、００３、００７、Ｚ１０１、ＥＳ００６、ＥＳ００８、ＥＳ０１１、Ｓ０２、Ｓ０９、Ｚ００６、Ｚ００８、ＺＮ１、００９、Ｓ０３、３６、２４９、３８１、５７、１１４、１２４、１２５、１６０、１６３、１１９、ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７、ｍＺ１０１、ｍＥＳ００６、ｍＥＳ００８、ｍＥＳ０１１、ｍＳ０２、ｍＳ０９、ｍＺ００６、ｍＺ００８、ｍＺＮ１、ｍ００９、ｍＳ０３、ｍ３６、ｍ２４９、ｍ３８１、ｍ５７、ｍ１１４、ｍ１２４、ｍ１２５、ｍ１６０、ｍ１６３、およびｍ１１９からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
前記機能的変異体が、ＹＨ−１６、００３、００７、Ｚ１０１、００９、Ｓ０３、３６、２４９、ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７、ｍＺ１０１、ｍ００９、ｍＳ０３、ｍ３６、およびｍ２４９からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
治療上有効な量のエンドスタチンまたはその機能的変異体を対象に投与することを含んでなる、食事性肥満、非アルコール性脂肪肝疾患、インスリン抵抗性またはブドウ糖不耐症を治療するための方法。
前記機能的変異体が、ＹＨ−１６、００３、００７、Ｚ１０１、ＥＳ００６、ＥＳ００８、ＥＳ０１１、Ｓ０２、Ｓ０９、Ｚ００６、Ｚ００８、ＺＮ１、００９、Ｓ０３、３６、２４９、３８１、５７、１１４、１２４、１２５、１６０、１６３、１１９、ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７、ｍＺ１０１、ｍＥＳ００６、ｍＥＳ００８、ｍＥＳ０１１、ｍＳ０２、ｍＳ０９、ｍＺ００６、ｍＺ００８、ｍＺＮ１、ｍ００９、ｍＳ０３、ｍ３６、ｍ２４９、ｍ３８１、ｍ５７、ｍ１１４、ｍ１２４、ｍ１２５、ｍ１６０、ｍ１６３、およびｍ１１９からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
前記機能的変異体が、ＹＨ−１６、００３、００７、Ｚ１０１、００９、Ｓ０３、３６、２４９、ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７、ｍＺ１０１、ｍ００９、ｍＳ０３、ｍ３６、およびｍ２４９からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
治療上有効な量のエンドスタチンまたはその機能的変異体を対象に投与することを含んでなる、脂肪細胞分化を阻害するための方法。
前記機能的変異体が、ＹＨ−１６、００３、００７、Ｚ１０１、ＥＳ００６、ＥＳ００８、ＥＳ０１１、Ｓ０２、Ｓ０９、Ｚ００６、Ｚ００８、ＺＮ１、００９、Ｓ０３、３６、２４９、３８１、５７、１１４、１２４、１２５、１６０、１６３、１１９、ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７、ｍＺ１０１、ｍＥＳ００６、ｍＥＳ００８、ｍＥＳ０１１、ｍＳ０２、ｍＳ０９、ｍＺ００６、ｍＺ００８、ｍＺＮ１、ｍ００９、ｍＳ０３、ｍ３６、ｍ２４９、ｍ３８１、ｍ５７、ｍ１１４、ｍ１２４、ｍ１２５、ｍ１６０、ｍ１６３、およびｍ１１９からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
前記機能的変異体が、ＹＨ−１６、００３、００７、Ｚ１０１、００９、Ｓ０３、３６、２４９、ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７、ｍＺ１０１、ｍ００９、ｍＳ０３、ｍ３６、およびｍ２４９からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
エンドスタチンまたはその機能的変異体を有効成分として含んでなる、食事性肥満、非アルコール性脂肪肝疾患、インスリン抵抗性またはブドウ糖不耐症を治療するための薬剤。
前記機能的変異体が、ＹＨ−１６、００３、００７、Ｚ１０１、ＥＳ００６、ＥＳ００８、ＥＳ０１１、Ｓ０２、Ｓ０９、Ｚ００６、Ｚ００８、ＺＮ１、００９、Ｓ０３、３６、２４９、３８１、５７、１１４、１２４、１２５、１６０、１６３、１１９、ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７、ｍＺ１０１、ｍＥＳ００６、ｍＥＳ００８、ｍＥＳ０１１、ｍＳ０２、ｍＳ０９、ｍＺ００６、ｍＺ００８、ｍＺＮ１、ｍ００９、ｍＳ０３、ｍ３６、ｍ２４９、ｍ３８１、ｍ５７、ｍ１１４、ｍ１２４、ｍ１２５、ｍ１６０、ｍ１６３、およびｍ１１９からなる群から選択される、請求項１３に記載の薬剤。
前記機能的変異体が、ＹＨ−１６、００３、００７、Ｚ１０１、００９、Ｓ０３、３６、２４９、ｍＥＳ、ｍＹＨ−１６、ｍ００３、ｍ００７、ｍＺ１０１、ｍ００９、ｍＳ０３、ｍ３６、およびｍ２４９からなる群から選択される、請求項１３に記載の薬剤。