JP2002323448A - フルオロメーター検出システム - Google Patents

フルオロメーター検出システム

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JP2002323448A
JP2002323448A JP2002065185A JP2002065185A JP2002323448A JP 2002323448 A JP2002323448 A JP 2002323448A JP 2002065185 A JP2002065185 A JP 2002065185A JP 2002065185 A JP2002065185 A JP 2002065185A JP 2002323448 A JP2002323448 A JP 2002323448A
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time
fluorometer
histogram
laser diode
detector
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Robert M Studholme
ロバート・マーリン・スタッドホルム
David A Blau
デビッド・アーサー・ブラウ
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
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    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
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    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging

Abstract

(57)【要約】 【課題】 システムの感度および精度を増大させるため
の高速検出エレクトロニクスを備えた、比較的高出力
で、比較的高繰返し速度の光源（１０）を利用する改良
された蛍光検出システムを提供する。 【解決方法】 １の具体例において、時間ウィンドウの
位置を変更させて、発蛍光団の減衰プロフィールを編集
する。もう１つの具体例において、光量子の検出の時間
を用いて、減衰プロフィールを編集する。本発明の１の
態様において、形状の予備ヒストグラムを測定し、それ
に事象の合計数の比を乗じ、予備ヒストグラムからなる
事象数で除することによって、蛍光減衰のヒストグラム
を発生させる。本発明のもう１つの態様において、それ
までの事象を検出し、データを貯蔵した後のごとく、光
量子の励起の後に検出の時間をランダム時間から出発す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、溶液または表面からの蛍光の検出に関する。
さらに詳しくは、本発明は、過渡状態イムノアッセイの
測定に適する。
【０００２】発明の背景 蛍光は分析、特徴付けまたはイメージング（imaging)の
ために、対象からの蛍光放射をモニタする過程である。
典型的には、放射の励起パルスは、試料の表面または内
部に向けられ、続いて、試料の蛍光が発せられ、次いで
蛍光放射が検出される。検出した蛍光は試料の分析、特
徴付けまたはイメージングに使用される。イムノアッセ
イの場合、試料の分析は、典型的には、蛍光性タッグで
所望の種をマークし、試料を励起し、該タッグからの蛍
光をモニタすることによってなされる。
【０００３】理論的には、フルオロメトリーは、すべて
の分析器具のうちで最も感度のあるものとされ得る。単
一の光量子事象を検出することができ、また発蛍光団を
再励起し、分析を確認することが可能である。しかしな
がら、蛍光に不利益を与えてきた問題は、注目する蛍光
信号を系におけるバックグラウンド放射から識別するこ
とにあった。しばしば、「バックグラウンド」放射から
の信号は、注目する蛍光信号の強度の１０,０００倍も
大きくなり得る。望まないバックグラウンド放射の検出
は、画像の質および検出の精度を低下させる。
【０００４】バックグラウンド放射によって引き起こさ
れる問題は生物学的系において特に鋭敏である。例え
ば、血漿の分析において、ビリベルジンのごとき天然に
存在する蛍光性物質の存在は、実質的なバックグラウン
ド放射を引き起こす。望ましくないバックグラウンド放
射の他の源は、周囲の放射、速蛍光発光性物質からの放
射（一般に、１ないし１.５ナノ秒のオーダーの減衰半
減期であると考えられている）、およびラマン散乱バン
ドのごとき種々の散乱機構を包含する。
【０００５】バックグラウンド放射の問題を克服するた
めの初期の試みは、少ししか成功しなかった。第１の技
術は、波長に基づいてバックグラウンド放射から区別す
ることを含む。一般に、フィルタを用いて、すべてであ
るが、狭く規定される波長バンドにおいて検出される放
射を除く。この技術は、一義的に成功したというもので
は到底なかった。何故ならば、バックグラウンド放射は
所望の蛍光信号と同一の波長におけるものでもあり得る
ものであり、従って、フィルタを通過し、検出されるか
らである。
【０００６】バックグラウンドから所望の蛍光信号を区
別しようとする第２の技術は、いわゆる時間ゲートアプ
ローチである。ここに、蛍光信号は励起後の短いタイム
ウィンドウで観察される。該タイムウィンドウは、その
長さおよび開始時間共に変更し得る。種々のタイムウィ
ンドウを使用することにより、検出される放射は、検出
感度に最適の時間において観察され得る。歴史的には、
この技術は、注目する蛍光信号の検出前にバックグラウ
ンド蛍光を実質的に減衰させることを可能とする（１,
０００ナノ秒のごとき）非常に長い減衰時間の発蛍光団
を使用してきた。しかしながら、一般に、長減衰時間の
発蛍光団は、短減衰時間の発蛍光団よりも望ましくな
い。何故ならば、それは比較的感度が低く、総じて解析
に長時間を要するからである。
【０００７】歴史的には、過渡状態蛍光分析について、
２つの励起パルスフォーマットがあった。１のフォーマ
ットは、発蛍光団を励起する単一の比較的高出力パルス
を利用する。過渡状態は、典型的には、時間の関数とし
ての電流を表すアナログ信号をモニタすることによって
高速光電子増倍管によりモニタされる。単一のパルス系
は、非常に多数の蛍光性分子を励起して検出を信頼性の
おけるものとするのに十分な高出力を要する。過渡状態
蛍光分析についての他の主要なフォーマットは、繰返し
励起パルスを利用する。通常、比較的短く、典型的には
ナノ秒間持続するマイクロワット範囲の出力を持つ光の
パルスを、１ないし１０,０００Ｈｚで変化させて試料
に繰返し適用する。通常、励起源はキセノンランプのご
ときランプである。しばしば、減衰曲線は、フォトンの
受容に対する時間を測定することによってデジタル的に
決定される。１の商業的に入手可能な系は、(５,０００
Ｈｚのごとき）繰返しパルスを使用し、時間依存性強度
信号を得るために、フラッシュ後に時間を徐々に増大さ
せて、光電子増倍管をストローブする。かかる系におけ
る検出は、非常に時間がかかり、かつ感度が低いことが
判明している。単一の分析は、比較的高い蛍光性染料濃
度においてさえ（例えば、１０−６Ｍ）、１時間のオー
ダーかかり得る。
【０００８】最近、蛍光性染料の領域において、重要な
進展がなされた。１の態様において、赤色および赤外波
長におけるごとく、長波長放射によって励起され得る染
料が今や入手できる。出願人は、１９９１年５月１５日
に出願され、発明の名称が「蛍光マーカー構成要素およ
び蛍光プローブ（Fluoresacent Marker Components and
Fluorescent Probes)」であるアレニウス（Arrhenius)
の（１９９０年５月１５日に出願され米国特許出願第５
２３,６０１号の一部継続出願である）米国特許出願第
７０１,４４９号、および１９９１年５月１５日に出願
され、発明の名称が「凝集および血清結合の無い蛍光染
料(Fluorescent Dyes Free of Aggregation and Serum
Binding)」であるダンドライカー（Dandlinker)および
シュー（Hsu)の（１９９０年５月１５日に出願された米
国特許出願第５２４,２１２号の一部継続出願である）
米国特許出願第７０１,４６５号を引用して本明細書の
一部とみなす。感度における重要な改良が、以前の染料
よりも優れたこれらのモダンな染料の使用を通じて達成
されている。
【０００９】さらに重要な進歩が、データ収集および解
析技術を通じて感度の増大においてなされた。ダンドラ
イカー（Dandlinker)の、発明の名称が「フルオロメー
ター（Fluorometer)」である米国特許第４,８７７,９６
５号に記載されているごとく、時間ゲート技術が、デー
タ収集および解析技術と組み合わせて用いられて、バッ
クグラウンドに対する信号が改良されている。一般に、
ダンドライカー（Dandliker)らは、所望の信号源、およ
び種々の望まないバックグラウンド源を含めた、種々の
源からの信号から構成されるべき時間の関数としての検
出強度を考慮している。所望の信号の最適化は、データ
収集および解析技術を介して達成されている。
【００１０】イムノアッセイにおいて関連材料を測定す
る能力において、さらに重要な進歩がなされている。例
えば、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす、１
９９０年３月６日に出願され、発明の名称が「過渡状態
ルミネッセンスアッセイ（Transient State Luminescen
ce Assays)」であるダンドライカー（Dandliker)らの
（１９８９年６月１３日に出願された米国特許出願第３
６５,４２０号の一部継続出願である）米国特許出願第
４９０,７７０号においては、ホモジニアスアッセイに
おける物質の結合形および遊離形が決定できる。一般
に、該技術は、平行および垂直偏光成分の強度の時間依
存性減衰を測定することを必要とする。種々の偏光状態
の時間依存性減衰を測定することによって、ホモジニア
ス解析フォーマットにおいてハプテン、ペプチド、また
は小蛋白のごとき物質の結合形および遊離形を測定する
ことができる。重要なことには、結合物質と遊離物質と
の分離は必要とされない。
【００１１】蛍光性染料の分野においてなされた重要か
つ有望な改良にもかかわらず、データ解析の局面におい
て、蛍光を達成しそれを検出する現実の方法および装置
は、従来、比較的変化しないままであった。最も感度が
良好で優れた装置を使用しても、物質の高濃度において
さえ、解析には１時間あるいはそれ以上の時間を要す
る。フルオロメトリーを臨床におけるイムノアッセイに
用いる場合、解析および適当な診断のための時間は、絶
対的に重要であり得る。患者の生存は、正確で適宜な解
析に依存し得る。加えて、迅速なテストは、患者を長時
間待たせることなく再テストすることを可能とし、その
結果、より迅速で正確な診断ができる。感度に関して
は、微量の蛍光性物質を検出できるのが極めて望まし
い。しかしながら、試料中の蛍光性物質の量が増加する
につれて、所望の信号に対する望まないバックグラウン
ド信号の大きさの比は増加する。さらに、解析のための
時間は、検出器から受容した蛍光放射の量に依存するの
で、一般に、低濃度は解析に実質的により長い時間を要
する。
【００１２】従来、解析に要する時間はかなり長かっ
た。公知の方法および装置は、試料の迅速で正確な診断
ならびに解析を供することができなかった。これは、フ
ルオロメトリーの明確で知られた要望の使用にも拘わら
ずそうであった。
【００１３】発明の概要 改良された蛍光検出システムは、系の感度および精度を
高めるために、高速検出エレクトロニクスを装備した、
比較的高出力で、比較的高い繰返し速度の光源を利用す
る。好ましくは、該光源はレーザダイオードである。高
速検出エレクトロニクスは、単一事象光量子の計数を可
能とする。
【００１４】１の具体例において、光源、好ましくは、
レーザダイオードを用いて、タイムウィンドウの位置を
変更することによって、発蛍光団の減衰プロフィールが
得られる。過渡状態検出は、発蛍光団を反復して励起
し、はっきりとしたタイムウィンドウ内で検出器によっ
て受容された事象数をモニターすることによって達成さ
れる。レーザダイオードは、有利には、（５ないし１０
０ミリワットのごとく）比較的高出力、長寿命を有し、
（１０ＭＨｚのごとく）比較的高繰返し速度でパルスを
発生できるするものを用いる。比較的高出力の励起パル
スと比較的高繰返し速度とを組み合わせると、実質的に
迅速でより正確な蛍光測定ができることとなる。
【００１５】好ましい具体例において、高出力の光源、
好ましくは、レーザダイオードを用いて、光量子の受容
に対する時間を測定し、そのデータからのヒストグラム
を編集することによって、発蛍光団の減衰プロフィール
が得られる。ハードウェアのカウンタは、モニタ時間内
の合計検出事象数を測定する。蛍光減衰曲線の形状は、
光量子の受容の時間のヒストグラムを発生させることに
よって決定される。好ましい具体例において、事象検出
の時点においてランプ電圧をサンプリングし、該電圧を
保存してヒストグラムを編集する。一旦、それまでの事
象が検出され、かつデータが貯蔵されたならば、次の事
象の検出のために、モニタリングを再開する。減衰曲線
の形を決定した後、検出された合計事象数の比を乗じ、
ヒストグラムからなる合計事象数で除することによっ
て、正しい強度を決定できる。好ましくは、暗電流を測
定し、該比を決定する前に、合計カウントおよびヒスト
グラムカウントから減じる。この技術は、ダンドライカ
ー（Dandliker)らの米国特許第４,８７７,９６５号のデ
ータ解析技術を直接適用できるヒストグラムの直接的発
生を可能とする。
【００１６】本発明のもう１つの態様において、改良さ
れた感度は、励起パルス後直ちに受容されたデータを無
視することによって達成される。１の具体例において、
データ獲得ウィンドウを、最初の過渡事象が終わった後
の時点で始まるように設定する。もう１つの具体例にお
いて、データは獲得されるが、データ解析の間には使用
されない。
【００１７】従って、大いに促進された感度を有する改
良されたフルオロメーターを提供するのが本発明の主目
的である。本発明のさらにもう１つの目的は、しばしば
数秒以内の、迅速で正確な測定を実現できるフルオロメ
ーターを提供することにある。
【００１８】本発明のさらにもう１つの目的は、極端に
低濃度の蛍光性物質を測定できるシステムを提供するこ
とにある。本発明の目的は、比較的コンパクトで、比較
的低コストであって比較的厳格である点で、臨床にて有
用なフルオロメーターを提供することにある。本発明の
さらなる目的は、新しい世代のより長波長の蛍光性染料
を開発するのに特に適したフルオロメーターを提供する
ことにある。
【００１９】詳細な記載 本発明によると、時間の関数としての蛍光強度は迅速か
つ正確に測定され得る。該システムは、時間の関数とし
ての合計強度を測定するか、あるいは時間の関数として
の信号の種々の偏光成分の強度を測定するよう設計でき
る。さらに、定常状態および過渡状態分析共に可能であ
る。しかしながら、好ましい具体例において、過渡状態
蛍光は定常状態蛍光よりも優先的にモニタされる。過渡
状態蛍光測定は、散乱バンドおよび速蛍光発光体からの
寄与を減じる傾向にある。
【００２０】一般的に言えば、本発明のシステムは、試
料の表面または内部に向けられるべき励起放射源、およ
び試料からの蛍光を測定するための検出系からなる。当
業者によく知られたように、フィルタおよび偏光子のご
とき通常のオプティックスを本発明のシステムと組み合
わせて使用することができる。
【００２１】励起放射源は、比較的高出力であって、比
較的高繰返し速度で操作できることによって特徴付けら
れる。レーザダイオードはこの両要件に適合する。一般
に、通常の閃光ランプフルオロメーターよりおおざっぱ
に言って１０００倍高出力の１００ミリワットの範囲ま
での出力を持つ通常のレーザダイオードを利用できる。
かかるデバイスの出力レベルは増大し続けると期待され
る。さらに、通常のレーザダイオードは１０ＭＨｚ範囲
またはそれ以上にて容易に操作でき、閃光ランプシステ
ムおよびレーザシステムと比較して、１０００倍を超え
る繰返し速度の増加を提供する。現在、レーザダイオー
ドは、いずれの数の離散的出力波長にても利用でき、こ
れは商業的に入手可能な蛍光染料に匹敵する。例えば、
６７０ｎｍ、６８５ｎｍ、７２０ｎｍ、７５０ｎｍおよ
び７８０ｎｍの波長を有するレーザダイオードが利用で
きる。これらの範囲の蛍光性染料は、前記にて出典明示
して本明細書の一部とみなしたアレニウス（Arrhenius)
およびダンドライカー（Dandliker)およびシュー（Hsu)
の出願、および出典明示して本明細書の一部とみなす、
本出願と同日に出願された「凝集および血清結合の無い
蛍光染料を用いる蛍光イムノアッセイ（Fluorescence I
mmunoassays Using Fluorescent DyesFree of Aggregat
ion and Serum Binding)」に提供されている技術に従っ
て製造される。一般に、これらの染料はケージド・ジカ
ルボキシシリコンフトシアニン（caged dicarboxy soli
con phthocyanine)をいい、ジゴキシンプローブを用い
る場合、ケージド・ジカルボキシシリコンフトシアニン
−ジゴキシゲニンをいう。さらに、それらの出力を増大
させるために、レーザダイオードをオーバーライドさせ
ることも可能であるが、それらをオーバーヒートさせて
該ダイオードを損傷させないものとする。さらに、本発
明と組み合わせて、チューナブルレーザダイオードを用
いることもできる。例えば、量子井戸ダイオードは出力
波長のチューニング性を与える。
【００２２】一般に、当該検出システムは、単一の光量
子事象の検出を可能とする。高バンド幅デバイスが商業
的に入手可能であり、検出された事象をモニタするのに
使用される。後記する特別の具体例は、本明細書中に記
載する検出方法と組み合わせて有利であることが判明し
た。重要なことには、超高速事象は、かなり低い操作ス
ピードの検出エレクトロニクスでもって測定できる。
【００２３】本発明の重要な態様は、バックグラウンド
事象によって比較的影響されない試料についての蛍光測
定を行うことである。極端に一時的な事象を考慮から排
除することによって、所望の蛍光信号の検出において重
要な改良がなされ得る。後記する実験結果セクションに
詳細に記載するごとく、通常の方法のほぼ１００倍の改
良が達成される。この排除はいずれの方法で行うもので
あってもよい。例えば、極端に一時的な事象が実質的に
終わった後に開始するように時間ゲートを設定すること
により、時間ゲート技術によって当該データを排除する
ことができる。別法として、該データを収集するが、デ
ータの解析の間には考慮しないとすることができる。さ
らに、放射の偏光もモニタすることができ、それによ
り、データ解析を可能とすることができる。該システム
の感度における重要な改良が本発明のシステムによって
達成され得る。
【００２４】総じて、解析の速度および感度における重
要な改良が本発明のシステムによって達成される。各々
がほぼ１０００のオーダーだけ繰返し速度および励起パ
ルスの出力を増大させることによって、実質的改良が検
出感度においてなされ、解析のための時間を劇的に減少
させる。検出は、従前は数時間かかっていたのを数秒間
でなすことができる。さらに、速検出エレクトロニクス
の使用は、単一光量子事象の計数を可能とし、なおさら
にシステムの感度および精度を増大させる。
【００２５】第１図は本発明の１の具体例の概略を示
す。その開始時間またはその持続のいずれか、あるいは
双方に関して、タイムウィンドウを変更することによっ
て、発蛍光団の減衰プロフィールが得られる。構造的に
は、主要構成要素は励起源、試料ホールダ、関連オプテ
ィックス、および検出器からなる。例えば、コンピュー
タによって、随意のプロセッシングおよびディスプレイ
の可能性が供される。
【００２６】好ましい具体例においては、３つの主要な
印刷回路ボード、レーザ駆動機ＰＣＢ１０、検出器ＰＣ
Ｂ１２、および主要ＰＣＢ１４がある。レーザ駆動機Ｐ
ＣＢ１０は、好ましくは、レーザダイオードおよびある
種のオプティックスを含有する。レーザ駆動機ＰＣＢ１
０は、好ましくは、ダイオードレーザの偏光の向きを変
更できるように回転可能とする。レーザ駆動機ＰＣＢ１
０上のレーザダイオード（示さず）は、反応セル１６内
に含有される物質の励起を引き起こすために該反応セル
１６に向けられる。蛍光放射は検出器ＰＣＢ１２によっ
て検出される。好ましくは、検出器は出力放射から直角
の角度に配置する。主要ＰＣＢ１４はレーザ駆動機ＰＣ
Ｂ１０および検出器ＰＣＢ１２に連結され、それとコン
ピュータ１８と連絡する。所望により、フィルタ２０、
レンズ２２、および／または開口２４のごときオプティ
ックスを光の経路内に置くことができる。当業者によく
知られたごとく、偏光子の種々の組合せを利用すること
ができ、共に主要ＰＣＢ１４から制御される回転可能偏
光子２６を含む。所望により、反応セル１６にはスター
ラー、最も好ましくは電磁タイプのスターラーを設ける
こともできる。
【００２７】コンピュータ１８は、使用者が制御、プロ
セッシング、およびディスプレイ機能についてのシステ
ムと干渉できる１の方法を提供する。コンピュータ１８
は、当業者に知られているごとく、スタンド−アローン
型であるか、あるいはその必要な機能を別々の構成要素
の集合として設置することもできる。第１図におけるコ
ンピュータ１８は、時間の関数としての発蛍光団の過渡
状態減衰の特徴的ディスプレイを備える。コンピュータ
１８は、多数の機能を制御することができるが、それ
は、レーザのオン−タイム、レーザ出力、レーザのオン
−オフ制御、ＰＭＴ高電圧設定点、ＰＭＴ電流検出閾値
設定点、ＰＭＴのオン−オフ、検出ウィンドウの開始の
遅延、検出ウィンドウの終了の遅延、実験当たりのサイ
クル数、偏光子の平行−垂直、スターラーのオン−オ
フ、およびレーザダイオードの操作温度のごとき機能の
制御を提供する。
【００２８】第２図は、主要ＰＣＢ１４の詳細なブロッ
クダイアグラムを示す。マイクロプロセッサー３０はボ
ードの操作を制御する。好ましい具体例において、マイ
クロプロセッサー３０は８０Ｃ３２プロセッサーであ
り、メモリ３２は３２ＫバイトのＲＯＭおよび３２Ｋバ
イトのＲＡＭである。所望により、ＲＳ２３２ポートの
ごときインターフェース３４により、ディスプレイ３６
用のコンピュータへの接続を可能とすることもできる。
直接的には示さないが、マイクロプロセッサー３０は、
高電圧出力供給制御、閾値コンパレーター電圧制御、お
よび偏光子モーターを供する。該偏光子モーター（示さ
ず）は、偏光子を回転させて、種々の偏光の向きの検出
を可能とするために供される。
【００２９】励起源はレーザおよびオプティックスブロ
ック４０によって供される。励起光は試料４２を照射
し、蛍光放射はオプティックスおよび偏光子４４を通過
して検出器４６に至る。
【００３０】操作では、マイクロプロセッサー３０はタ
イマ／マスタカウンタ５０をセットして、レーザ４０に
ついてオンタイムを設定し、レーザオフカウンター５２
をセットしてレーザ４０をオフとする時間を決定する。
さらに、マイクロプロセッサー３０は、ウィンドウオー
プンカウンタ５４をセットしてデータ獲得ウィンドウの
開口に対応させ、ウィンドウクローズドカウンタ５６を
セットしてデータ獲得ウィンドウの閉鎖に対応させる。
ゲート５８は検出器４６の出力を受容し、データ獲得ウ
ィンドウの間にそれを該カウンタ６０へと通過させる。
ゲート５８についての制御は、ウィンドウオープンカウ
ンタ５４から到来し、それは検出器４６からのパルス
の、該カウンタ６０、およびゲート５８を閉じるウィン
ドウクローズドカウンタ５６への通過を可能とし、検出
器４６からカウンタ６０へ通過するデータを排除する。
後のプロセッシング、解析、およびディスプレイのた
め、マイクロプロセッサー３０の制御下に、カウンタ６
０におけるカウント値をメモリ３２に移す。
【００３１】第３図は、第２図の回路の一般的タイミン
グ態様を示す。システムクロック６２は、全体としての
システムの同調および制御を供する。システムクロック
振動数の例は１０ＭＨｚとすることができる。その振動
数において、サイクル時間は１００ｎｓであり、最大５
０ｎｓの周期を与える。レーザパルスの持続は、タイマ
／マスタカウンタ５０およびレーザオフカウンター５２
によって制御される。好ましくは、システムクロック６
２の立ち上がりはレーザパルス６４の発生をトリガす
る。レーザパルスの立ち下がりは、レーザオフカウンタ
ー５２に設定された時間によって決定される。第３図の
波形６６は、レーザオフカウンター状態を示し、レーザ
パルス６４を終了させるべき場合は低く変化させる。ウ
ィンドウオープンカウンタパルス６８は、データ獲得ウ
ィンドウ７２の開始まで一定時間作動させる。ウィンド
ウクローズドカウンタパルス７０はウィンドウオープン
カウンタパルス６８よりも長く作動させ、ウィンドウク
ローズドカウンタパルス７０の立ち下がりはデータ獲得
ウィンドウパルス７２の立ち下がりを決定する。データ
獲得ウィンドウパルス７２は、データが検出器４６(第
２図)からカウンタ６０に供給される時間周期を決定す
る。複合蛍光信号７４は、最初の定常状態部分７６、続
いての強度減衰部分７８を有する。現実には、いずれの
所与の単一レーザパルスについても、光量子はいずれの
データ獲得ウィンドウについても検出されないというの
でないよりもあり得る。従って、蛍光信号７４は、多数
のレーザパルスが種々のデータ獲得ウィンドウ時間内に
発っせられた後は、事象の編集となろう。
【００３２】第４図は、検出器ＰＣＢ１２の詳細を示
す。好ましくは、単一の光量子事象を検出できる検出エ
レクトロニクスを用いる。好ましい具体例において、光
電子増倍管（「ＰＭＴ」）８０は、試料（示さず）から
の蛍光を検出する向きとする。最適には、ＰＭＴ８０
は、低い暗電流および１００ＭＨｚのごとき高いバンド
幅を有する。高電圧出力供給８２は、ＰＭＴ８０へ出力
を供給する。主要ＰＣＢ１４（第２図に示す）からの高
電圧出力供給制御信号８４は、出力供給８２からＰＭＴ
８０への高電圧供給値を決定する。ＰＭＴ８０の出力
は、要すれば、増幅する。好ましくは、コンパレータ８
８は、所望のパルス振幅の選択を可能とし、増幅器８６
におけるオフセットを補償する。コンパレータ８８は、
好ましくは、（第２図からの）閾値コンパレータ電圧制
御によって制御される。コンパレータ８８の出力はゲー
ト５８を介してカウンタ６０（第２図）に至る。好まし
くは、主要ＰＣＢ１４から検出器ＰＣＢ１２へのケーブ
ル接合は、その長さが１２インチ未満に保たれた６５オ
ームの保護されたリボンケーブルである。
【００３３】第５図は、レーザＰＣＢ１０の詳細を示
す。レーザダイオード９０は、好ましくは、ビームコリ
メータ９５に収容され、レーザＰＣＢ１０に直接取り付
けられる。便宜には、ソケットアセンブリを用いてレー
ザダイオードの交換を容易とすることができる。好まし
くは、コリメータアセンブリ９２およびレーザダイオー
ド９０は、さらに、乾燥剤（示さず）を入れた密封した
区画９４に収容される。温度制御回路９６は、サーミス
タ９８を介してレーザダイオード９０の温度をモニタす
る。ヒータ１００は、レーザダイオード９０を加熱する
ために温度コントロール９６によって制御される。（第
２図からの）温度設定点コントロールは、温度コントロ
ール９６が調節する温度を決定する。レーザダイオード
９０の温度を変化させることによって、ダイオードの発
光波長のチューニングを行うことができる。一般には、
波長は１度摂氏当たり０.３ナノメーターシフトする。
温度を変化させることによって、レーザ波長は、個々の
蛍光性染料について最も有利な波長へ変化させることが
できる。通常、個々のレーザダイオードおよび所望の波
長に応じて、レーザは２５℃から５０℃で作動させる。
しかしながら、所望により、通常の冷蔵技術を用いてレ
ーザを冷却することもできる。レーザダイオード駆動機
１０２は、レーザダイオード９０への駆動出力を供す
る。レーザダイオード駆動機１０２への制御入力は、レ
ーザオンオフ制御およびレーザ出力レベル設定を含み、
その両者共に主要ＰＣＢ１４から到来する。典型的に
は、レーザダイオード９０は１０ＭＨｚのパルス繰返し
速度および平均定格出力のほぼ６ないし７倍のピーク出
力にて作動させる。ピークベースに基づく定格出力を超
えることも可能である。何故ならば、レーザーパルスは
短くて、通常の失敗のメカニズム、熱ミラーの失敗は、
平均出力が典型的な連続作動出力未満であるので起こら
ないからである。
【００３４】第６図は、全操作についてのフローチャー
トを示す。マイクロプロセッサー３０はレーザのオンタ
イム１０４およびレーザのオフタイム１０６を設定す
る。データ獲得ウィンドウの開始への遅延時間は、マイ
クロプロセッサー３０によって設定され、出発減衰１０
８として標識される。一旦データ獲得ウィンドーが開か
れたならば、マイクロプロセッサー３０によって設定さ
れた閾値レベルを超えるパルスがステップ１１０にてカ
ウントされる。これらの事象はカウント１１２として合
計される。データ獲得についての時間が終了していない
と、決定ブロック１１４がサイクルの再度の開始を指示
し、もう１つのレーザパルスおよびカウンティングの開
始を引き起こす。該決定ブロック１１４がデータ獲得時
間が完了したことを示すと、結果は、コンピュータまた
は他のデータ処理デバイスに提供される。
【００３５】データ獲得ウィンドウの位置を変更するこ
とによって、時間の関数としての強度のヒストグラムを
編集することができる。所望により、好ましくは、ダン
ドライカー（Dandliker)の米国特許第４,８７７,９６５
号のデータ収集および解析技術を用いてデータの質をさ
らに改良することもできる。
【００３６】システムのタイミング分解能を正確に望む
ように設定することができる。好ましい具体例におい
て、４００ピコ秒のタイミング分解能を選択して２ナノ
秒もの短い蛍光減衰時間の正確な形成を可能とすること
ができた。従って、データ獲得ウィンドウはタイミング
分解能値の倍数として採られる。
【００３７】第７図は、光量子の検出の時間を決定する
ように設計した本発明のフルオロメーターのシステム幅
の図である。検出サイクルの多数の反復の後、時間の関
数としての事象の数のヒストグラムを得る。好ましい具
体例において、７５ナノ秒を超える１,０２４の時間ビ
ンまたは間隔の結果、７５ピコ秒のビン幅となる。レー
ザＰＣＢおよび入力オプティックスボード１２０は、レ
ーザビームを反応セル１２４へ向ける。反応セル１２４
からの蛍光は検出器ＰＣＢ１２６によって検出され、そ
の入力は増幅器ＰＣＢ１３０によって増幅され、その信
号はコンパレータＰＣＢ１３２に供給され、最終結果は
データ獲得ＰＣＢ１２８に供給される。データ獲得ＰＣ
Ｂ１２８からの結果は、コンピュータ１３４または他の
機能が同様のデータ処理デバイスに供給することができ
る。所望により、インターフェースＰＣＢ１３６はデー
タ獲得ＰＣＢ１２８とレーザＰＣＢ１２０との間の接合
に供する。さらに、熱コントロールＰＣＢ１３８はレー
ザダイオードの温度をモニタし、制御する（示さず）。
加えて、当業者に公知のごとく、かつ前記した具体例に
関連して述べたごとく、光学フィルタ１４０、偏光子１
４２、レンズ１４４、および開口１４６を用いることが
できる。
【００３８】操作において、レーザＰＣＢ１２０は反応
セル１２４へのレーザパルス列を供する。検出器ＰＣＢ
１２６は、もしあれば、フォトンの受容を検出し、増幅
器ＰＣＢ１３０によって増幅された後、コンパレータＰ
ＣＢ１３２につき設定されたレベルを超える信号につい
ては、事象はデータ獲得ＰＣＢ１２８によって検出され
ると考えられる。一般的に言えば、次いで、事象の検出
は２つの方法で用いられる。第１に、事象の合計数の実
行カウントは注目する時間周期の間になされる。好まし
い具体例において、注目する時間周期は、検出周期の間
連続して実行される。第２に、事象の検出は事象が起こ
った時間を決定するのに用いられる。
【００３９】本明細書にて利用する装置および方法をよ
り詳細に理解するために、第８図および第９図を参照さ
れたい。マイクロプロセッサー１４０およびメモリ４２
はデータ獲得ＰＣＢ１２８に基づいて作動してシステム
を制御する。好ましくは、ＲＳ２３２ポートのごときイ
ンターフェース１４４は、コンピュータ１４６または他
のデータ処理デバイスまたはディスプレイデバイスとの
連結を可能とする。マイクロプロセッサー１４０は、典
型的にはデジタルからアナログへのコンバータ１５０を
介して、偏光子コントロール１２８に対する制御、ＰＭ
Ｔ高電圧制御、およびＩＣＯＮＴ信号のごとき多数の制
御信号を供する。
【００４０】総括クロック信号１５２は、好ましくは、
１０ＭＨｚのオーダのものとする。これは、１００ナノ
秒のサイクル時間を提供する。タイミング回路１５４は
レーザ駆動パルス１５６を発生し、これは、形状１６０
を有するレーザパルスの発生を引き起こす。さらに、タ
イミング回路１５４は遅延回路１５６の活性化を引き起
こし、これは、所定の遅延の後、ランプ発生器１５８を
活性化する。ランプ電圧１６２は一定時間の遅延で始ま
り（第９図参照）、次いで、ランプ部分を開始させる。
好ましい具体例において、遅延時間は２５ナノ秒であ
る。検出事象信号１６４の受容に際し、ランプ電圧１６
２の値はフリップ−フロップ１６６によるごとくにラッ
チされる。ランプ発生器１５８からの電圧のラッチされ
た値はアナログからデジタルへのコンバータ１６８で変
換され、メモリ１４２での貯蔵のためにマイクロプロセ
ッサー１４０に提供される。加えて、検出事象信号１６
４はカウンタ１７０に提供され、これはすべての検出さ
れた事象のカウント実行を維持する。
【００４１】好ましい具体例において、いずれのサイク
ルにて検出されたかに拘わらず、カウンタ１７０は検出
されたすべての事象をカウントする。特に、カウンタ１
７０は、暗電流周期の間、レーザパルス時間の間、また
は過渡状態蛍光周期の間いずれかに拘わらず、検出され
た事象をカウントする。別法として、カウンタ１７０は
所望の時間の間でのみ活性化でき、例えば、暗電流時間
の間は活性化されない。
【００４２】操作において、検出された事象１６４がデ
ータ獲得ＰＣＢ１２８によって受容されると（第８
図）、検出事象の時間を測定し、それを処理し、それを
蓄えるのにある量の時間を要する。このプロセスを続け
つつ、時間検出システムは、従前に受容された光量子時
間が完了するまで新しい光量子または事象を無視する。
選択した個々のハードウェアに応じて、新しい光量子が
無視される間の時間は３０マイクロ秒のオーダーとでき
る。もしクロック振動数が１０ＭＨｚであると、ほぼ３
００のレーザパルスが無視される。一般に、これは最高
濃度の発蛍光団を除いたすべてにおいて重要でない。通
常の濃度において、ＰＭＴからの光量子事象の典型的な
入力速度は１秒当たりほぼ１０,０００である。従っ
て、光量子はおおざっぱに言って毎１,０００パルスご
とに検出される。より高濃度の発蛍光団については、パ
ルス速度は大きさのオーダーによって増大させ得る。直
線性を維持するためには、レーザダイオードピーク出力
を低下させるか、あるいは開口を検出経路中にに置くこ
とができる。別法として、より大きいパルス速度につい
ては、カウンター１７０は、検出される事象のタイミン
グとは独立して、すべての検出された事象をモニタす
る。
【００４３】この方法を通じて、ヒストグラムの形状
を、非常に多数の試料についての検出事象の時間を測定
することによって決定できる。しかしながら、ある事象
はプロセッシング時間の間は無視できるので、カウンタ
１７０は、時間の関数としての発蛍光団減衰の強度の真
実の測定を与えるために、スケールファクターの計算を
与える。好ましい方法において、暗電流信号レベル（レ
ーザパルスまたは蛍光減衰が無い場合にさえ存在する電
流または検出事象のレベル）を検出する。次に、暗電流
の値を、各ビンにおけるカウントの合計数から差し引
く。このようにして、その時間ビンの間に起こる検出事
象の数の真実の測定を設定する。次に、時間ビンにおけ
るカウントの合計数を合わせて、検出事象の合計数の測
定が得られる。次に、カウンタ１７０によりカウントさ
れた事象およびビンカウント（暗電流未満）のすべてを
統合することによって見い出された事象の数の比を各ビ
ンの値に乗ずる。このようにして、カウンタ１７０によ
って貯蔵された検出事象によって示されるごとく、解析
の間に起ったが、（恐らくは、事象が処理されつつあっ
たので）ランプ電圧１６２からの値のサンプリングによ
って検出されたヒストグラムの一部を形成しなかった事
象について補償がなされる。
【００４４】すべての時間ビンについての事象の検出に
等しい重みを与えることが必要である。もしシステムが
レーザパルスの後に最初に検出された事象を常に記録す
るならば、不釣合な数の事象がヒストグラムに初期に検
出され、それにより、ヒストグラムの結果をゆがめてし
まう。ヒストグラムにおけるかかる歪みを回避する１の
方法は、検出につきランダム開始時間を採用することで
ある。好ましい具体例において、この時間は、それまで
の事象の貯蔵に直接的に続いてのいずれかの時間に対す
るランプ電圧１６０を測定する能力を再度可能ならしめ
ることによって測定できる。このようにして、休止時間
は発生せず、データの獲得および貯蔵のための比較的長
い周期が与えられたならば、引き続いて検出された事象
についてのモニターリングの再開の正確な時間は実質的
にランダムである。
【００４５】レーザＰＣＢ１２０についての詳細なブロ
ックダイアグラムは第１０図に示す。レーザＰＣＢ１２
０はデータ獲得プロセッサーボード（第８図）からレー
ザ駆動パルス１５８を採り、レーザ光パルスを発生す
る。好ましい具体例において、パルスの持続は数ナノ秒
のオーダーであり、比較的高出力である。レーザ駆動パ
ルス１５８における次の上昇端はレーザフラッシュの発
生を引き起こす。入力ロジック１７０、１７４、および
１７６は、非常にシャープな上昇端を発生させ、これは
高出力デジタル駆動機１７８に供給される。デジタル駆
動機１７８はレーザダイオード１７８にパワーを供給す
る。レーザダイオード１８０によって使用される電流
は、データ獲得ＰＣＢからの信号ＩＣＯＮＴによって設
定される(第８図)。レーザパルスの持続は遅延１７２を
変更することによって変えることができる。さらに、レ
ーザパルスの振幅は電流値ＩＣＯＮＴを設定することに
よって変更される。参照ダイオード１８２はレーザ出力
の長期安定性をモニタする。好ましくは、参照ダイオー
ド１８２はレーザビームが通過するオプティックスおよ
びフィルタの下流に位置させる。このようにして、試料
に向けられる合計入力をモニタすることができる。合計
入力に影響する種々の因子は、レーザの性能または質低
下、光学構成要素のクリーンさまたはレーザフィルタの
質低下を包含する。光電流モニタ１８４はレーザダイオ
ード１８０の光電流をモニタする。パルスの長さおよび
繰返し速度は分かっているので、レーザダイオード１８
０によって発生されるべき平均出力は計算できる。この
出力の読み、標識されたＶＭＯＮはデータ獲得ＰＣＢに
フィードバックされる（第８図）。
【００４６】加えて、随意のヒータ１８６ならびにサー
ミスタおよび温度制御１８８は、レーザダイオード１８
０に対する温度制御を供する。温度設定点はデータ獲得
ＰＣＢからヒータ１８６および制御１８８に供給され
る。第１の具体例に関連して記載したごとく、温度を変
化させると、レーザダイオード１８０の波長を変化させ
る。
【００４７】検出器ＰＣＢ１２６は第１１図に詳細に記
載する。光電子増倍管１９０は試料からの蛍光放射を受
容する。増幅器１９６としてのＰＭＴ高電圧制御信号１
９４の制御下、高電圧発生器１９２はＰＭＴ１９０に対
して高電圧を供する。ＰＭＴ１９０の出力は増幅器１９
２を通過し、コンパレータ１９４を通って送られる。も
し検出され増幅された値が参照値を超えると、コンパレ
ータは該信号をデータ獲得ＰＣＢへの出力として通過さ
せる。好ましくは、微分シグナルを与えるデュアル共軸
ケーブルによって、増幅器１９２はコンパレータ１９４
に接続する。コンパレータ１９４は同様に共軸ケーブル
を介してデータ獲得ＰＣＢに接続される。
【００４８】第１２図は、操作の好ましい方法について
のフローチャートを示す。初期化相２００の間、以下の
事項：ＰＭＴ電圧、レーザ強度、データ獲得時間、液晶
偏光子（「ＬＣＰ」）サイクル、およびＬＣＰを平行し
て設定する。次に、データ獲得は２０２をスタートさせ
る。レーザパルス２０４および遅延２０６の後、ランプ
２０８が開始する。光量子が検出されたならば（２１
０）、ランプ電圧は凍結され（２１２）、高さを測定
し、デジタルに変換する（２１４）。該データは適当な
ビンを更新する（２１６）。データ獲得時間決定が許容
される時間を超えると（２１８）、ハードウェアカウン
タは停止する。データ獲得時間がそのままであると、レ
ーザパルス列が再度開始される。データ獲得時間が完了
すると、カウンタからのデータが貯蔵される（２２
０）。所望により、偏光子を代わりに他の向きに変更す
ることもできる（２２２）。
【００４９】実験結果 本明細書に記載したデバイスおよび方法を、多数の系、
特に生物学的系からの蛍光測定で用いた。本明細書で報
告するデータは、検出システムの時間にて得られたもの
である。
【００５０】アレニウス（Arrhenius)およびダンドライ
カー（Dandliker)およびシュー（Hsu)に対する同時係属
出願に記載されている蛍光性染料と組み合わせて用いた
場合、本明細書に記載したフルオロメトリーシステム
は、通常の技術の１００倍を超える信号検出の改良とな
る。以下の表は、所望の信号の強度がバックグラウンド
の強度と等しくなる時点における染料の検出可能な濃度
レベルをリストする。使用した緩衝液は１％のウシ血清
アルブミンを含有する。データは以下の通りである。
【００５１】
【表１】
【００５２】長波長を持つ染料を選択することによっ
て、および本明細書に記載した時間ゲートおよび検出の
時間の技術を利用することによって、検出シグナル強度
における重要な改良が達成される。
【００５３】直線性に関し、第１３図はジゴキシンプロ
ーブ濃度の関数としての強度のｌｏｇ−ｌｏｇプロット
を示す。結果は、システムが４桁の大きさにわたって直
線性であることを示す。さらに、１リットル当たりほぼ
１０−１３モルもの低い濃度が検出され得る。正確なシ
ステムはかかる直線性応答を有するはずである。という
のは、蛍光性物質の濃度が減少するにつれ、検出される
カウント数の対応する直線的減少があるはずだからであ
る。
【００５４】試料からの現実のデータを第１４図に示
す。強度（１０秒当たりのカウント数）を１０００単位
にてｙ軸に示す。ｘ軸は時間ビン数を示し、各ビンは７
５ピコ秒間隔に対応する。散乱曲線は蛍光曲線のピーク
の左側にわずかにピークを持つ。暗電流カウントは、一
般に、ビン数２００からビン数約３００の時間の内に示
される。時間の関数としての蛍光曲線の減衰は、ダンド
ライカー（Dandliker)らの米国特許第４,８７７,９６５
号に開示されているごときデータ解析技術を組み合わせ
て用いることができるヒストグラムを与える。
【００５５】前記にて詳細に記載したごとく、検出シス
テムの時間は、強度曲線の形状を正確に描き、従ってそ
の形状が時間の関数としての強度の絶対的測定を与える
ヒストグラムを形成する。好ましい具体例において、用
いる方法は、高速ハードウェアカウンタでカウントの合
計数をモニタすること、およびそれらのカウントを統合
することによって形状ヒストグラムからなるカウントの
合計数を決定することである。次いで、ヒストグラム形
状曲線に、合計統合カウントに対するハードウェアカウ
ントの比を乗じる。第１５図は高速カウンタのカウント
の関数としての統合したタイミングシステムのカウント
を示す。１秒当たり最大３３,０００のカウントをタイ
ミングシステムカウンタによって検出することができ
る。しかしながら、これは、選択された特別のハードウ
ェアの関数である。当業者がデザインを選択できるごと
く、専用のプロセッサーまたはより速いプロセッサーを
選択するならば、事象の受容の時間を貯蔵するのに必要
な時間が減少し、従って、１秒当たりのカウント数を増
大させることができる。
【００５６】第１６図は、２つの曲線につき、（リット
ル×１０１０当たりのモルで表した）プローブ濃度の関
数としての（１００万単位での）強度を示す。上側の曲
線は正規化したカウントを示し、下側の曲線は生のカウ
ントを示す。前記した技術の使用を通じて、生のカウン
トを正規化したカウントに変換し、それにより、プロー
ブ濃度の関数としての強度の直線性を得ることができ
る。
【００５７】受容システムの時間において、ハードウェ
アカウンタ補償と組み合わせたレーザーダイオードの高
繰返し速度は、最良に有用なデータを与えた。好ましく
は、光量子のフラックスは比較的低い。光量子フラック
スが比較的低いと、２つの光量子が同時にＰＭＴにヒッ
トする確率は実質的に減少し、それにより、システムの
非直線性は回避される。発蛍光団の濃度が減少するに従
い、レーザ出力および／または繰返し速度は速度データ
獲得まで増大させることができる。
【００５８】第１７図は、過渡状態偏光−対−ジゴキシ
ン濃度のグラフを示す。既知レベルのジゴキシンを含有
する２０マイクロリットルの試料を、１００マイクロリ
ットルの緩衝液中、２５マイクロリットルのウサギ抗ジ
ゴキシン抗体と共に５分間インキュベートした。次い
で、蛍光標識したジゴキシンプローブ２０マイクロリッ
トル（濃度５×１０−１１Ｍ）を添加し、さらに５分間
インキュベートした。最終的に、溶液を緩衝液１ミリリ
ットルで希釈した。次いで、蛍光信号を検出ハードウェ
ア装置の時間を用いて読み取った。特別の好ましい具体
例に関連して本発明を記載してきたが、多くの変形およ
び修飾は当業者に直ちに明らかであろう。従って、添付
の請求の範囲は、多くのかかる変形および修飾を含むよ
うに、先行技術を考慮して、できる限り広く解釈される
べきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 時間ゲート過渡状態蛍光減衰測定システムの
概略を示す。
【図２】 時間ゲートシステムのブロックダイアグラム
を示す。
【図３】 時間ゲートシステムの態様についての代表的
なタイミングダイアグラムを示す。
【図４】 時間ゲートシステムのための検出器印刷回路
ボードについてのブロックダイアグラムの詳細を示す。
【図５】 時間ゲートシステムにおけるレーザ印刷回路
ボードについてのブロックダイアグラムの詳細を示す。
【図６】 時間ゲートシステムにおける検出系について
のフローチャートを示す。
【図７】 事象の受容の時間の検出についてのフルオロ
メーターシステムの概略図を示す。
【図８】 検出システムの時間についてのデータ獲得プ
ロセッサーボードのブロックダイアグラムの詳細を示
す。
【図９】 検出システムの時間についてのタイミングダ
イアグラムを示す。
【図１０】 検出システムの時間のレーザーＰＣＢにつ
いての詳細なブロックダイアグラムを示す。
【図１１】 検出システムの時間についての検出器印刷
回路ボードの詳細なブロックダイアグラムを示す。
【図１２】 検出システムの時間についての検出システ
ムの操作のフローチャートである。
【図１３】 検出システムの時間を利用する感度および
直線性を示すグラフであり、ジゴキシンプローブ濃度の
対数値の関数としての、計数強度の対数値を示す。
【図１４】 検出システムの時間を利用するジゴキシン
血清アッセイを示すグラフであり、散乱および蛍光曲線
についての生データを示し、時間ビン数に対し、１００
０単位で表した強度（カウント／秒）を示す。
【図１５】 検出システムの時間についての１００万単
位で表した高速カウンタ（カウント／１０秒）に対し
て、１０００単位で表したタイミングシステムカウンタ
（カウント／１０秒）のグラフを示す。
【図１６】 検出システムの時間についての生カウント
および正規化したカウントのグラフを示し、プローブ濃
度（１×１０−１０リットル当たりのモル）に対して、
１００万単位で表した強度を示す。
【図１７】 ジゴキシン濃度に対する過渡状態偏光のグ
ラフを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート・マーリン・スタッドホルム アメリカ合衆国カリフォルニア州95070、 サラトガ、スコットランド・ドライブ 19661番 (72)発明者 デビッド・アーサー・ブラウ アメリカ合衆国カリフォルニア州95014、 キューパーティノ、スタンディング・オー ク・コート23005番 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 DA01 EA01 FA03 GA25 GB21 HA01 HA07 JA02 KA01 KA02 KA05 KA08 KA09 LA02 MA01 MA03 MA12 NA02 NA04 NA05

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 蛍光の事象を検出し、 検出した事象の合計数をカウントし、 ヒストグラムの形状の予備ヒストグラムを決定し、 該予備ヒストグラムを含む事象の数をカウントし、次い
    で、 該予備ヒストグラムに、事象の合計数のカウントおよび
    該予備ヒストグラムを含む事象の数のカウントの比を乗
    じる工程からなることを特徴とする過渡態蛍光測定につ
    いての時間の関数として強度のヒストグラムを発生させ
    る方法。
  2. 【請求項２】 さらに、暗電流を測定し、カウンティン
    グおよび乗じる工程に先立って、予備ヒストグラムから
    暗電流の寄与を減じる工程を含む請求の範囲第１項記載
    の方法。
  3. 【請求項３】 ａ）検出された事象をモニタし、 ｂ）事象に際し、検出された事象の発生の時間を測定
    し、 ｃ）工程ｂで測定した時間を貯蔵し、工程ｂの目的のた
    めに、この工程を行う間、他の検出された事象を無視
    し、 ｄ）工程ｃの完了に際し、励起パルスの時間に関係しな
    い工程ｃの完了後の時点で工程ａにおけるモニタリング
    を再度行い、 ｅ）工程ｃで貯蔵した時間を用いてヒストグラムを発生
    させる工程からなることを特徴とする過渡態フルオロメ
    トリーシステムにおいて励起パルスから検出された事象
    のヒストグラムを発生させる方法。
  4. 【請求項４】 工程ｄにおいて、工程ａにおけるモニタ
    リングを工程ｃの完了後直ちに測定する請求の範囲第３
    項記載の方法。
  5. 【請求項５】 ａ）検出された事象をモニタリングし、 ｂ）事象に際し、ランプ電圧をサンプリングすることに
    よって検出された事象の発生の時間を測定し、 ｃ）工程ｂで測定した時間を貯蔵し、工程ｂの目的のた
    めに、この工程を行う間、他の検出された事象を無視
    し、 ｄ）工程ｃの完了に際し、工程ｃの完了後の時点で工程
    ａにおいてモニタリングを再度行い、次いで ｅ）工程ｃで貯蔵した時間を用いてヒストグラムを発生
    させる工程からなることを特徴とする過渡態フルオロメ
    トリーシステムにおいて検出された事象のヒストグラム
    を発生させる方法。
  6. 【請求項６】 ランプ電圧をサンプリングした後に、該
    電圧をデジタル表示に変換する請求の範囲第５項記載の
    方法。
  7. 【請求項７】 工程ｃの完了後の時間がランダム時間で
    ある請求の範囲第３項記載の方法。
  8. 【請求項８】 試料を励起するためのレーザダイオー
    ド、 蛍光発光を受容するように位置させた検出器、および蛍
    光発光の受容の時間を測定するための手段からなり、こ
    こに該手段は遅延発生器を含むことを特徴とする発蛍光
    団を含有する試料を励起させ、該試料からの蛍光発光を
    検出するためのフルオロメーター。
  9. 【請求項９】 さらに、遅延蛍光ならびにレーザダイオ
    ードによる励起の間および直後に生じるバックグラウン
    ドを無視するための手段を含む請求の範囲第８項記載の
    フルオロメーター。
  10. 【請求項１０】 時間ゲートを用いて、遅延蛍光および
    放射のパルスの直後のバックグラウンドを排除する請求
    の範囲第９項記載のフルオロメーター。
  11. 【請求項１１】 さらに、該検出器の出力を受容するよ
    うに検出器に作動可能に連結したカウンタを含む請求の
    範囲第８項記載のフルオロメーター。
  12. 【請求項１２】 さらに、時間ゲート発生器を含む請求
    の範囲第１１項記載のフルオロメーター。
  13. 【請求項１３】 該時間ゲート発生器が検出器の出力を
    ゲートする請求の範囲第１２項記載のフルオロメータ
    ー。
  14. 【請求項１４】 さらに、検出器の出力を入力として受
    容し、時間ゲート発生器の出力によって制御されるゲー
    トを含む請求の範囲第１２項記載のフルオロメーター。
  15. 【請求項１５】 該時間ゲート発生器がカウンタを含む
    請求の範囲第１２項記載のフルオロメーター。
  16. 【請求項１６】 該時間ゲート発生器がウィンドウオー
    プンカウンタおよびウィンドウクローズドカウンタを含
    む請求の範囲第１５項記載のフルオロメーター。
  17. 【請求項１７】 該検出器が光電子増倍管である請求の
    範囲第１６項記載のフルオロメーター。
  18. 【請求項１８】 該検出器が赤色感受性である請求の範
    囲第１１項記載のフルオロメーター。
  19. 【請求項１９】 該検出器が赤外線感受性である請求の
    範囲第１１項記載のフルオロメーター。
  20. 【請求項２０】 該レーザダイオードが試料に対して回
    転可能である請求の範囲第１１項記載のフルオロメータ
    ー。
  21. 【請求項２１】 該レーザダイオードが赤色ないし赤外
    線範囲で放射する請求の範囲第１１項記載のフルオロメ
    ーター。
  22. 【請求項２２】 該レーザダイオードが可変波長を有す
    る請求の範囲第１１項記載のフルオロメーター。
  23. 【請求項２３】 さらに、温度変更デバイスを含む請求
    の範囲第２２項記載のフルオロメーター。
  24. 【請求項２４】 該レーザダイオードがチューナブルレ
    ーザダイオードである請求の範囲第２２項記載のフルオ
    ロメーター。
  25. 【請求項２５】 該レーザダイオードが量子井戸レーザ
    ダイオードである請求の範囲第２４項記載のフルオロメ
    ーター。
  26. 【請求項２６】 さらに、オプティックスを含む請求の
    範囲第１１項記載のフルオロメーター。
  27. 【請求項２７】 さらに、ディスプレイを含む請求の範
    囲第１１項記載のフルオロメーター。
  28. 【請求項２８】 該蛍光発光が、ケージド・ジカルボキ
    シシリコンフタロシアニン−ジゴキシゲニン染料を含む
    染料からである請求の範囲第８項記載のフルオロメータ
    ー。
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