JPH0726912B2 - 蛍光分析方法及び装置 - Google Patents

蛍光分析方法及び装置

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JPH0726912B2
JPH0726912B2 JP23794686A JP23794686A JPH0726912B2 JP H0726912 B2 JPH0726912 B2 JP H0726912B2 JP 23794686 A JP23794686 A JP 23794686A JP 23794686 A JP23794686 A JP 23794686A JP H0726912 B2 JPH0726912 B2 JP H0726912B2
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哲也 松井
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6491Measuring fluorescence and transmission; Correcting inner filter effect

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  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、試料液体中に含まれる共存物質が被測定物質
の蛍光強度に及ぼす影響を補正可能な蛍光分析方法及び
装置に関する。
〔従来の技術〕
従来、蛍光分析における共存物質の影響補正方法につい
ては、特開昭55-43461号公報において論じられているよ
うに、濁度補正式を用いるようになっていた。
〔発明が解決しようとする問題点〕
上記従来技術は、濁度補正式y=x−kz(y:懸濁液にお
ける補正をした蛍光物質濃度、x:蛍光物質濃度の測定
値、z:濁度、k:予め求めた定数)により測定試料中の濁
度を補正する方法であるが、前記濁度補正式が成り立つ
溶質及び溶媒は限られ、また、被測定物質と共存物質が
相互作用を起こすと補正式が成り立たなくなる問題があ
った。
本発明の目的は、共存物質が励起光や蛍光を吸収するよ
うな透明度の低い測定試料においても、共存物質の種類
や濃度が未知のままで、被測定物質の蛍光強度を補正
し、定量することにある。
〔問題点を解決するための手段〕
上記目的は、測定試料の蛍光寿命を測定して、共存物質
と被測定物質との相互作用による蛍光の量子収率の減少
を補正すると同時に、測定試料の励起波長及び蛍光波長
における吸光度を測定して、共存物質による励起光及び
蛍光の吸収に基づく蛍光減衰分を補正することにより、
達成される。
〔作用〕
パルス光源からの励起光を試料セルに照射し、その励起
光により励起された被測定物質が発するパルス状の蛍光
のピーク強度と、蛍光強度の時間的減衰を時間分解能の
良い検出器により測定し、蛍光強度及び蛍光寿命を測定
する。また、その励起光が試料セル中を透過した透過光
をもう一つの検出器で測定し、励起波長における試料液
体の吸光度を求め、更に、蛍光波長と等しい波長の光を
試料セルに照射し、その透過光を検出して、蛍光波長に
おける試料液体の吸光度を求める。測定した蛍光寿命、
励起波長及び蛍光波長における吸光度から演算処理によ
り蛍光強度を補正する。
〔実施例〕
以下、本発明の一実施例を第1図により説明する。まず
本発明の全体構成について記す。本発明は蛍光強度及び
蛍光寿命の測定に用いるパルス光源2、吸光度の測定に
用いる吸光度測定用光源5、測定試料を入れる容器であ
り、光源からの光を照射し、被測定物質の蛍光73を発生
させる試料セル1、試料セル1から発生する蛍光73を集
光する集光レンズ52、集光した蛍光73を分光する分光器
3、分光された光を検出する時間分解能の良い検出器
4、試料セル1を通過した光を検出する検出器6とそれ
らの検出器からの測定値を演算処理するデータ処理装置
7から成る。
次に個々の構成要素の特徴並びに動作について説明す
る。まずパルス光源2に用いられる光源としては、蛍光
寿命を測定するためにはパルスレーザ或いはフラッシュ
ランプが用いられる。フラッシュランプを用いる場合
は、別途に分光器を設置して光を分光して励起光を取り
出す必要があり、光の強度もパルスレーザに比べ弱いの
で、パルスレーザを用いる方が検出感度が高くなる。そ
して、例えば、N2レーザ等の励起用パルスレーザに色素
レーザを組合せて用いることによって、色素レーザによ
り波長を変えられるので使用範囲を広くすることができ
る。パルス光源2からのパルス発振のトリガ信号がデー
タ処理装置に送られ、被測定物質の蛍光73を検出する検
出器4の出力と同期をとり、蛍光の時間的減衰を計測し
て蛍光強度が励起光入射直後の強度の1/eに減少するま
での時間を蛍光寿命とする。この蛍光寿命は、計測可能
であり、「蛍光・りん光分析法」、共立出版株式会社、
1984年11月25日発行の23頁の(1.24)式の下の行から8
〜11行に記載されている蛍光の平均寿命である。何故な
らば、「蛍光・りん光分析法」の23頁の(1.24)式の下
の行から11行に「実際に観察される放射寿命(平均寿
命)」と記載されているように蛍光の平均寿命は、計測
可能である。以下、蛍光の平均寿命を端に蛍光寿命とい
う、ここで用いられる検出器4は、時間分解能の高いも
のが必要であるが、必要となる時間分解能は被測定物質
の蛍光寿命によってピコ秒の分解能を要するものから、
マイクロ秒オーダーのものまであるので、被測定物質に
よって検出器4の時間分解能を選択して測定を行なう。
吸光度測定に用いる吸光度測定用光源5は、パルス光源
である必要はない。被測定物質の蛍光波長があらかじめ
わかっている場合には、その波長の光を発する色素レー
ザが用いられる。また、分光器を用いればタングステン
ランプや重水素ランプ等の連続スペクトルを持つ光源を
用いることもできる。これらのランプは、ランプのコス
トは安価であり、また光の強度はレーザに劣るが、安定
性にすぐれており、吸光度測定用として好敵な光源であ
るといえる。この吸光度測定用光源5の光が試料セル1
中を透過し、その透過光を測定することにより、蛍光波
長での測定試料の吸光度を求めるが、ここで用いる検出
器6は、時間分解能は高くなくても良い。この検出器6
は、パルス光源2の励起光71が試料セル1中を透過する
透過光強度も測定するような光学的手段を有し、測定値
をデータ処理装置に送り、励起波長及び蛍光波長におけ
る測定試料の吸光度を求める。
次に、本発明の原理について、第2図を用いて説明す
る。第2図は或る蛍光性物質を被測定物質としその濃度
を一定にして、その蛍光を減衰させる共存物質の濃度を
変化させたときの、蛍光強度比F/F0(F:試料の蛍光強
度、F0:共存物質がないときの試料の蛍光強度)を示し
たものである。F/F0値は共存物質濃度の増加とともに指
数関数的に減少し、共存物質濃度がある濃度(図2のC
L)を超えると検出強度はバックグラウンド以下となり
蛍光検出不能となる。共存物質による蛍光強度の減衰の
原因としては2つあり、1つは共存物質により励起光及
び蛍光が吸収されてしまうことにより蛍光強度が減少す
る作用(図中ΔQA)であり、もう1つは共存物質と被測
定物質が相互作業を起こし、蛍光の量子収率φが減少す
る消光作用(図中ΔQI)である。
まず、ΔQAについて検討すると、いま試料セル1の形状
が第3図のような四角セルでその光路長をlとし、励起
光をI0、透過光をIt、蛍光をFとすれば、励起光I0は光
路長lの間で、共存物質により吸収を受け、蛍光Fは光
路長l/2の間で共存物質による吸収を受ける。共存物質
の励起波長での吸光係数をεi、蛍光波長での吸光係数
をεfとし、共存物質濃度をMとすると、ΔQAは、 となる。ここで、透過光強度測定により求められる吸光
度をAi,Af(Aiは励起波長の吸光度、Afは蛍光波長の吸
光度)とすると、 Ai=εiMl ……(2) Af=εfMl ……(3) であるから、(1)式は となり、Ai,Afの測定によりΔQAが求められる。
一方、ΔQIは、蛍光の量子収率の変化であるから、共存
物質がないとき及びあるときの量子収率をφ,φとす
れば、ΔQIは、 となる。量子収率φは蛍光寿命τに比例するので ここで、τは共存物質がないときの蛍光寿命、τは共
存物質があるときの蛍光寿命である。したがって、あら
かじめτを知っておくことにより、τを測定してΔQI
を求められる。
以上をまとめると、蛍光強度比F/F0は F/F0=1−ΔQA−ΔQI ……(7) であるから、(4),(6)式により、 となる。Ai,Af,τ,Fはすべて測定可能な量であるから、
求める真の蛍光強度F0は、 となる。τは一定であるから、τ=k(k:定数)と
すると(9)式は、 となる。また、a1,a2をセルの形状により決まる定数と
して、(10)式を一般化すると、 となる。したがって、共存物質の種類,濃度が未知のま
まで、蛍光強度を補正することが可能となる。
ところで共存物質濃度が図2のCLを超えたときは、蛍光
検出不能となるが、希釈溶液により希釈し、検出可能な
共存物質濃度まで下げてやればよい。但し、このとき、
被測定物質の濃度も同時に下がるので、測定可能な検出
限界濃度をLdとすると、N倍希釈のときの検出限界濃度
はN・Ldとなり、検出限界濃度が高くなるという問題が
ある。しかしながら、希釈なしではもともと検出できな
いのであるから、検出限界濃度以上なら測定可能となる
利点がある。通常希釈率は2〜3倍で良い。
本発明の別な実施例を第4図に示す。この実施例は試料
セル1,1′を2つ設け、前段の試料セル1′において、
測定試料の励起波長及び蛍光波長での吸光度を測定し、
その結果、 の値が、予め設定したCLに基づくF′/F値を超えるか否
かを、制御装置8により判断し、超えたときには、ある
一定の希釈溶液を希釈液注入装置9に指示し、希釈槽10
において測定試料の希釈を行なう。その後、後段の試料
セル1において、蛍光強度、蛍光寿命を測定し、共存物
質濃度の影響を補正する。したがって、この実施例で
は、蛍光強度が検出不能なほどに共存物質濃度が高いと
き、希釈により蛍光検出可能とし、共存物質の影響を補
正できるという効果を有する。
本発明の更に別な実施例について次に説明する。
第1図,第4図に示す実施例において、光源2,5から試
料セル1までの励起光の光伝送、そして、試料セル1か
ら検出器4,6までの光伝送を光ファイバで行うことによ
り、プラント内部のインライン分析を行うことができる
という効果がある。
本発明の他の実施例を第5図に示す。本実施例では、回
転ステージ102上にミラー51と波長交換セル101とを設置
し、回転ステージを回転させ、第5図(a)の状態のと
きには、ミラー51により、励起光71が試料セル1に照射
されるので、蛍光強度、蛍光寿命、励起波長における吸
光度が測定される。回転ステージが180°回転すると、
励起光71は、波長変換セル101により波長が変えられ被
測定物質の蛍光波長とし、試料セル1に照射されて、蛍
光波長での吸光度が求められる。波長変換セルとして
は、レーザ用色素等を入れたものが用いられる。本実施
例では、簡便な装置を用いることにより、吸光度測定用
の光を得ることができるという効果がある。
〔発明の効果〕
本発明によれば、共存物質による蛍光及び励起光の吸収
作用を吸光度測定により補正でき、共存物質と被測定物
質の相互作用による消光作用を蛍光寿命測定によって補
正できるので、共存物質の種類や濃度が未知のままで、
共存物質の影響を補正でき、蛍光定量が可能となる効果
がある。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の一実施例の装置構成図、第2図は共存
物質濃度によるF/F0値の変化を示すグラフ、第3図は試
料セルのモデル図、第4図は本発明の別な一実施例の装
置構成図、第5図は本発明の更に他の一実施例になる装
置構成図である。 1……試料セル,2……パルス光源,3……分光器,4……検
出器,5……吸光度測定用光源,6……検出器,7……データ
処理装置,8……制御装置,9……希釈液注入装置,10……
希釈槽,51……ミラー,52……集光レンズ,53……バルブ,
71……励起光,72……吸光測定用入射光,73……蛍光,101
……波長変換セル,102……回転ステージ。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】測定物質及び共存物質を含む試料液体に励
    起光を照射することによって発生した前記測定物質の蛍
    光の強度、及びこの蛍光強度の減衰時間に基づいて前記
    測定物質の蛍光の平均寿命を測定し、前記試料液体への
    前記励起光の照射によって生じる第1透過光の強度を測
    定し、更に前記蛍光と同じ波長の光を前記試料液体に照
    射してその蛍光波長に対する第2透過光の強度を測定
    し、その後、前記第1透過光強度及び前記第2透過光強
    度に基づいて、前記共存物質の吸収による前記励起光の
    第1減少率及び前記蛍光の第2減少率を求め、前記蛍光
    の平均寿命、前記第1減少率及び前記第2減少率に基づ
    いて前記測定された蛍光強度を補正することにより、真
    の前記蛍光強度を求め、この真の蛍光強度に基づいて前
    記測定物質の濃度を求めることを特徴とする蛍光分析方
    法。
  2. 【請求項2】前記測定された蛍光強度をF、前記蛍光の
    平均寿命をτ、前記第1減少率をAi及び前記第2減少率
    をAfとしたとき、真の蛍光強度F0を次式により (ここで、kは定数、a1及びa2は試料セルの形状による
    定数)を求める特許請求の範囲第1項記載の蛍光分析方
    法。
  3. 【請求項3】前記試料液体として希釈液で希釈された液
    体を用いる特許請求の範囲第2項記載の蛍光分析方法。
  4. 【請求項4】測定物質及び共存物質を含む試料液体が充
    填された試料セルと、励起光源と、吸光度測定用光源
    と、前記励起光源からの励起光を前記試料液体に導く第
    1光フアイバと、前記測定物質に前記励起光を照射する
    ことによって発生する蛍光を分光する分光器と、前記吸
    光度測定用光源から前記蛍光と同じ波長の光を前記試料
    液体に導く第2光フアイバと、前記試料液体への前記励
    起光の照射によって生じる第1透過光の強度、及び前記
    蛍光と同じ波長の光を前記試料液体に照射してその蛍光
    波長に対する第2透過光の強度をそれぞれ測定する第1
    光検出器と、前記第1透過光を前記第1光検出器に導く
    第3光フアイバと、前記第2透過光を前記第1光検出器
    に導く第4光フアイバと、分光された前記蛍光の強度、
    及びこの蛍光強度の減衰時間に基づいて前記測定物質の
    蛍光の平均寿命を測定する第2光検出器と、前記第1透
    過光強度及び前記第2透過光強度に基づいて、前記共存
    物質の吸収による前記励起光の第1減少率及び前記蛍光
    の第2減少率を求める演算装置、前記蛍光の平均寿命、
    前記第1減少率及び前記第2減少率に基づいて前記測定
    された蛍光強度を補正することにより、真の前記蛍光強
    度を求める演算装置を備えたことを特徴とする蛍光分析
    装置。
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